experimental ii resumos
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Resumos de Experimental IITRANSCRIPT
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COMPLEXOS DE FERRO
Introduo
Complexos
Tambm designados por compostos de coordenao, so a espcie MLn que se forma
quando um tomo ou io M (metlico) se une a um ou mais ligandos.
O tomo ou io metlico o elemento central, enquanto que os ies ou molculas que
se lhe ligam so os ligandos.
Define-se o elemento central com o estado de oxidao formal (obtm-se somando a
carga de todos os ligandos e subtraindo carga do complexo) e a configurao electrnica.
Os ligandos so molculas ou ies que se ligam ao elemento central que tm de ter
pares de eletres no partilhados ou orbitais moleculares ocupadas, cujos eletres possam ser
doados ao tomo central.
Conforme o modo de coordenao ao metal podem ser monodentados (coordenam-se
por um s tomo) ou bi- - -se por 2, 3 ou mais tomos
respectivamente).
Os ligandos polidentados podem tamm ser designados quelantes, pois forma-se um
anel de quelao que engloba o metal, um dos tomos doadores do ligando, a sua cadeia
respectiva e um outro tomo doador do ligando, sucessivo.
Existem tambm ligandos ambidentados, ou seja, ligandos que tm mais que um
possvel tomo doador, mas s podem usar um deles de cada vez (pelo menos para o mesmo
metal).
O nmero de tomos que se liga directamente ao metal define o nmero de
coordenao.
Consoante este nmero os complexos tm diferentes tipos de geometria: linear
(NC=2), geometria em T, Y ou triangular (NC=3), tetradrica ou quadrangular plana (NC=4),
pirmide quadrangular ou bipirmide trigonal (NC=5), octadrica, prisma trigonal ou hexagonal
(NC=6), entre outras para nmeros de coordenao elevados (7,8 e 9).
O nmero de coordenao 6 dos mais frequentes, sendo a geometria mais comum a
octadrica, pois a preferida do ponto de vista electrnico e estereoqumico.
Quanto ao isomerismo, trata-se da existncia de complexos com a mesma frmula
molecular, mas que diferem entre si de vrias formas possveis. Existem vrios tipos de
isomerismo:
o Geomtrico: Diferem no arranjo dos ligandos;
o ptico: Fazem rodar o plano da luz polarizada em direces opostas um dos
ismeros a imagem no espelho do outro;
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o Ionizao: Os produtos slidos tm a mesma estequiometria, mas originam
diferentes ies ao serem dissolvidos;
o Coordenao: O arranjo dos ligandos volta do elemento central diferente;
o Ligao: Um ou mais dos ligandos coordenam-se por diferentes tomos
doadores.
Ferro
Os metais de transio so moderadamente reactivos, combinando-se muitas vezes
com enxofre, oxignio e hidrognio quando aquecidos.
O ferro um metal de transio cujo nmero atmico o 26 e a configurao
electrnica [Ar]3d64s2.
Apresenta diversos estados de oxidao, +6,+3 e +2. um elemento muito reactivo no
seu estado puro e forma complexos com relativa facilidade.
essencial para a maioria dos seres vivos e sabe-se que num ser humano adulto
(massa de 70kg) existem 4,2 mg de Ferro. Devemos ingerir entre 12 a 18 mg de ferro por dia,
no entanto s parte que absorvida.
Por falta de ferro podem surgir doenas, nomeadamente anemia, mas tambm por
acumuluo deste metal (hemocromatose).
Algumas das funes do ferro nos elementos biolgicos so: funes cataltica, por
exemplo em reaces de oxi-reduo, (h enzimas activados pelo ferro atravs de uma fraca
ligao), metaloenzimas (enzimas com ligaes fortes a metais como o Ferro ou complexos de
metais), transporte de oxignio no sangue (Hemoglobina), armazenamento de oxignio no
sangue (Mioglobina e Ferritina).
Para resumir estas e outras funes do ferro apresenta-se o seguninte esquema que
identifica e classifica as metalobiomolculas de ferro, mostrando tambm os principais
exemplos.
Estas biomolculas de ferro, protenas ou no, que desempenham diversas e
importantes funes na maioria dos seres vivos.
1. Molculas no proteicas
Siderforos - O ferro essencial para todos os organismos vivos mas est pouco diponvel
por se encontrar maioritariamnte no estado de oxidao 3 em compostos qumicos pouco
soluveis em agua; por isso os seres vivos desenvolveram tcnicas para solubilizar e transportar
o Fe 3+ para o seu uso.
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Na realidade esta stecnicas so ligandos que formam complexos deste io com constantes
de estabilidade elevadas; Esses ligandos so agentes complexantes no proteicos para
capturar ferro libertados para o exterior pelas bacterias.
A transferncia do ferro complexado para o microorganismo requer o reconhecimento de
sideroforos.
Como muitos desses microorganismos so patognicos e precisam de ferro para se
propagarem vo busc-lo ao hospedeiro. Para evitar essa captura o hospedeiro impede a
sintese de sideroforos, sendo ujjma das estrategias adoptadas a subida da temperatura
corporal, pois a produao daqueles ligandos diminui para temperaturas de 37 graus.
2. Protenas
-De transporte e armazenamento
a) Transferencia electronica
- Protenas Fe-S
Estas protenas esto envolvidas em processos de transferncia electrnica e so
agregados com a composio FenSm onde n =m = 2=4, ocorrendo nalguns casos o sistema
Fe3S4. So sistemas
A ferredoxina um exemplo de um sistema ferro enxofre. Ferredoxina do tipo
cloroplasto, F2S2.
- Citocromos
So estruturas qumicas de grupos heme presentes em todos os seres vivos que, tal
como as protenas de ferro-enxofre, tambm so responsveis por transferirem electres.
O processo de transferencia de electres envolve a variao do estado de oxidaao do
ferro no centro hmico.
Esto envolvidos na respiraao anaerobia e aerobia, fotossntese das plantas e
cianobactrias, reduo da meta hemoglobina nos eritrcitos para regenerar a forma funcional
da hemoglobina.
Citocromo c- transferencia electrnica do citocromo c1 para a oxidase do citocromo c no
processo finsal de fosforilaao oxidativa (imagem)
b) Coordenao com molculas no metlicas
-Hemeritrina: Hemeritrina- Embora a sobrevivencia da maioria dos organismos
dependa da difusao de O2 e CO2 entre as celulas e o exterior, outros seres vivos necessitam de
metalobiomolculas para o transporte e armazenamento de O2.
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Um exemplo a biomolcula hemeritrina que ocorre no sangue de invertebrados
marinhos geralmente na forma octaedrica. So proteinas no hemicas, em que a captura do
O2 acompanhada pela oxidaao dos centros metalicos e formaao de OOH-.
- Hemoglobina: a hemoglobina est presente nos glbulos vermelhos, capta o
O2 nos pulmes e transporta-o no sangue arterial para os pulmes. Nos musculos vermelhos o
O2 transferido da hemoglobina para a mioglobina, que, ao ter maior afinidade para o O2
consegue armazen-lo e /ou transport-lo para os mitocondrios.
A hemoglobina desoxigenada e parcialmente oxigenada tem diferenas estruturais,
estado tenso e relaxado respectivamente; o estado relaxado tem maior afinidade pelo O2,
explicando o conhecido efeito de cooperatividade, pois aumenta a afinidade para o O2 das
subunidades desoxigenadas.
Em ambas as formas o estado de oxidao do ferro +2, sendo que o ferro se ajusta
mais ao anel de porfirina na forma oxigenada, pois o numero de coordenaao 6 e a estrutura
octaedrica.
c) Coordenao com ies metlicos
-Ferritina: Como o ferro no est muito disponvel para os seres vivos, existem
protenas como a ferritina que armazenam o ferro no organismo de modo a ficar acessivel e
no ter efeitos txicos. Em bacterias podem ainda ter fosfato e ferro hmico e chamam-se
bacterioferritinas.
Existem ainda protenas transportadoras de ferro, as transferrinas, de vrias classes
que o transportam a vrios tecidos.
Enzimas
comum a presena de ferro em enzimas como Oxidorredutases (catalisam reaces
de transferncia de electres) e Liases (adiao de grupos a duplas ligaes ou formaao de
duplas ligaes por remoao de grupos)
Por exemplo, a regulao do enzima acotinase, que participa no TCA, feita atravs da
adio de um ferro ao centro de ferro-enxofre, convertendo uma forma inactiva (trs ferros)
numa forma activa (quatro ferros).
Em resumo, o ferro est presente nos vrios organismos em vrias formas
desempenhando papeis importantes para manter as funes de algumas biomolculas.
Complexo Tris(oxalato) ferrato(III) de potssio
um complexo de ferro com 3 ligandos bidentados, o oxalato, C2O42- .
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Desta forma este complexo assume a estrutura octadrica, visto que o seu nmero de
coordenao 6.
Uma das suas propriedades o paramagnetismo.
Aplicaes: Pode ser utilizado como catalisador ou estabilizador em processos e
produtos qumicos, como revestimento para vidro, para processos sintticos de acrlicos,
adesivos acrlicos, resinas de epxido,poliuretanas, combustveis, borrachas de silicone, entre
outros, processos de polimerizao, oligomerizao e transesterificao de olefinas.
Procedimento
Para a realizao desta actividade experimental utilizou-se o sulfato ferroso amoniacal
que um sal duplo (2 caties). Escolheu-se este sal porque solvel em gua e mais
barato que o sulfato de ferro. Para alm disso este sal tem menos tendncia a ser
oxidado ao ar a Ferro (III). A oxidao de solues de Ferro (II) muito dependente do
pH, ocorrendo mais rapidamente a pH elevado. Os ies de amnio fazem com que a
soluo fique ligeiramente acdica, o que desacelera o processo de oxidao.
O primeiro passo do procedimento consistiu na dissoluo de sulfato ferroso
amoniacal em gua quente acidificada com cido sulfrico diludo. O aumento da
temperatura facilitou a dissoluo do sal e a gua acidificada favoreceu o equilbrio de
OH- e H+, impedindo a formao de precipitado (hidrxido de ferro).
Seguidamente adicionou-se uma soluo quente de cido oxlico em gua, para
formar oxalato de ferro (FeC2O4.2H2O ). Aqueceu-se a mistura at ferver e deixou-se
precipitar o slido amarelo (oxalato de ferro).
Lavou-se o precipitado repetidamente com gua, com o objectivo de retirar o excesso
de cido e sais.
Adicionou-se oxalato de potssio monohidratado em gua, que levou desacidificao
do meio para que os grupos OH- resultantes da adio de perxido de hidrognio se
ligassem ao ferro (passo seguinte). A adio excessiva de cido oxlico levaria a uma
acidificao do meio, o que impossibilitaria a oxidao do ferro, uma vez que este s
se oxida em pH neutro.
Gota a gota, adicionou-se perxido de hidrognio agitando continuamente a soluo e
mantendo a temperatura abaixo dos 40 0C. A adio de perxido de hidrognio oxidou
o Ferro II a Ferro III. A temperatura foi mantida abaixo dos 40 0C para evitar a
formao de xidos por decomposio do perxido.
Aps ter sido adicionado todo o perxido de hidrognio, aqueceu-se a mistura at
quase fervura, o que levou formao de um precipitado castanho de hidrxido
frrico indesejado.
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Adicionou-se, ento, gota a gota, uma soluo saturada de cido oxlico para
redissolver o precipitado formado. A contnua adio do cido levou formao do
complexo. Redissolveu o precipitado de hidrxido de ferro que se formou durante a
adio de perxido de hidrognio.
Filtrou-se a soluo quente e adicionou-se etanol, que diminuiu a solubilidade do sal,
levando estabilizao do complexo.
Deixou-se cristalizar o complexo no escuro, pois este complexo fotossensvel.
Filtraram-se os cristais verdes e lavaram-se os mesmos com acetona, que eliminou o
etanol anteriormente adicionado e ajudou a secar rapidamente os cristais.
Deixaram-se secar os cristais ao ar e no escuro.
Determinou-se o rendimento.
Seguidamente realizaram-se diversas reaces com os ies Fe(II) e Fe(III) e outros
reagentes como o hidrxido de sdio, amnia, tiocianato de amnio e oxalato de sdio
e observou-se a cor das solues e se havia ou no precipitado.
Realizaram-se tambm reaces com hexacianoferrato (II) e (III) e observaram-se os
resultados.
Adicionaram-se reagentes como tiocianato de amnio e hidrxido de sdio a
complexos de fluoreto de ferro e observou-se se houve mudana de cor e/ou
formao de precipitado.
Por fim fizeram-se reaces com iodeto.
Resultados
Sntese do complexo tris (oxalato) ferrato (II) de potssio
1) Dissoluo de sulfato ferroso amoniacal
Aps este passo e at nova indicao consideramos que o ferro em soluo ferro (II).
2) Adio de cido oxlico
O precipitado amarelo o complexo oxalato de ferro (II) dihidratado.
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3) Adio de oxalato de potssio
Considera-se que as guas que rodeavam o complexo esto agora dispersas no meio.
O precipitado laranja o complexo tris (oxalato) ferrato (II).
4) Adio gota-a-gota de perxido de hidrognio
Obteve-se o complexo tris(oxalato) ferrato (III) e, devido oxidao do perxido de
hidrognio obteve-se tambm hidrxido de ferro (III).
Reaces redox
5) Adio de cido oxlico saturado
Adio de soluo saturada de cido oxlico de forma a redissolver o precipitado de
hidrxido de ferro que se formou durante a adio de perxido de hidrognio.
O complexo de tris(oxalato)ferrato (III), em que o ferro est ligado a trs oxalatos
apresentando ismeros pticos.
Clculo do reagente limitante
Reagente Massa (g) Massa Molecular
(g/mol) Estequiometria Nmero de moles
Sulfato de ferro amoniacal
15,15 392,14 1 0,0386
cido oxlico 7,54 126,07 1 0,0838
Oxalato de potssio
10,06 184,24 2 0,0273
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Perxido de hidrognio
0,02 dm3 1,667 mol/dm3 0,5 0,08335
Uma concentrao de peroxide de hidrognio 20 volumes equivalente a
1.667 mol/dm3. Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm3).
Isto prova que o reagente limitante o oxalato de potssio;
O oxalato de potssio doa ies oxalato, tal como o cido oxlico, que posteriormente
adicionado na forma concentrada no h controlo sobre a quantidade de ies
oxalato (a quantidade de ies oxalato pode advir de vrias espcies, sendo mais
impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante);
Para maior preciso, no clculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal.
Clculo do rendimento
Reaces caractersticas dos ies ferro (II) e ferro (III)
1) Reaces dos ies ferro (II) e ferro (III)
NaOH - Verifica presena de ferro em soluo e qual a espcie
Tiocianato - Providencia um teste extremamente sensvel para ies de Ferro (III)
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Reagente Fe (II) Fe(III)
Cor Precipitado Cor Precipitado
NaOH Verde escuro* Sim Laranja Sim
Excesso NaOH Verde escuro* No dissolve Laranja + escuro No dissolve
Amnia Verde sujo Sim Laranja escuro Sim
Excesso amnia Verde sujo No dissolve Laranja escuro No dissolve
Tiocianato de amnio - - Vermelho sangue No
Oxalato de potssio - - Amarelo esverdeado No
+ tiocianato de amnio - - Amarelo esverdeado No
* este composto branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxignio
(produto maioritrio)
Como o ligando ambidentado pode gerar complexos do tipo
Nada acontece com a adio de mais tiocianato de amnio, j que o complexo formado
(tris(oxalato) ferrato (III)) muito estvel (a sua formao favorvel). No se consegue
deslocar a esfera de coordenao do ferro.
Existem algumas justificaes para o facto do tiocianato no conseguir substituir o oxalato
na ligao ao ferro.
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De acordo com as posies relativas dos ligandos na srie espectroqumica, pode inferir-se
que o ligando C2O42- forma uma ligao mais estvel que o SCN-, uma vez que um ligando
mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os dois ligandos isto
confirmado.
Ligando Fora inica
log (K) (25C)
C2O42- 0,5 7,53 0,1
SCN- 0 0,9 0,1
F- 0 6,0
OH- 0 11,81 0,03
oxignio ao ferro efeito entrpico.
2) Reaces com
Reagente Fe (II) Fe(III)
Cor Precipitado Cor Precipitado
K4[Fe(CN)6] Azul escuro*
No
(mas deveria ter
precipitado)**
Azul escuro ++
(azul da Prssia) Sim
K3[Fe(CN)6] Azul escuro +
(azul de Turnbull)*** sim
Amarelo
(amarelo da Prssia) Dissolveu
*este composto branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxignio
**no se ter observado precipitado por no se ter adicionado quantidade suficiente de
reagente
***com o tempo este azul transforma-se em azul da Prssia
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Amarelo da Prssia um oxidante poderoso.
K4[Fe(CN)6] - ferrocianeto de potssio, gera ies Fe2+
Aps oxidao do ferro, formou-se ferrocianeto frrico (azul da Prssia), a partir de
ferrocianeto ferroso.
Forma-se o complexo ferrocianeto frrico.
K3[Fe(CN)6] ferricianeto de potssio, gera ies Fe3+
Primeiro formou-se um complexo azul, muito instvel, conhecido como azul de
ferricianeto ferroso. Este complexo rapidamente convertido em
ferrocianeto frrico (azul da Prssia).
Forma-se um complexo chamado amarelo da Prssia, ferricianeto frrico.
3) Complexo de fluoreto com ferro (III)
Reagente Fe(III)
Cor Precipitado
NaF Transparente No
+ tiocianato de amnio Laranja escuro No
+ NaOH Laranja Sim
NaF:
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Obteve-se hexafluoro ferrato(III).
+SCN-:
no reage
A cor laranja registada (quando a soluo se deveria ter mantido incolor) deve-se ao
facto de algum do fluor no ter reagido com o ferro formando o complexo, reagindo antes com
o tiocianato.
+NaOH:
A adio de NaOH leva formao de precipitado (hidrxido de ferro (III)) e leva o meio a
ficar de novo incolor.
complexo formado.
De acordo com as posies relativas dos ligandos na srie espectroqumica, pode-se inferir
que o ligando OH- possui a capacidade de substituir o F-, formando um complexo mais estvel,
sendo um ligando mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os
dois ligandos isto confirmado.
Ligando Fora inica
log (K) (25C)
C2O42- 0,5 7,53 0,1
SCN- 0 0,9 0,1
F- 0 6,0
OH- 0 11,81 0,03
4) Reaco com o iodeto
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Reagente Fe(III)
Cor Precipitado
KI Laranja No
CHCl3 2 fases: aquosa superior amarela, orgnica inferior roxa Sim (fase orgnica)
NaF + KI Incolor No
CHCl3 Incolor (evidncia de separao por fases) No
Reaces redox
no reagiu
Fe(III)+KI+CHCl3:
A adio de CHCl3 provoca uma separao por fases, distinguindo-se uma fase aquosa
superior e uma fase orgnica inferior;
Extraiu-se o iodo para a fase orgnica pois este apolar - ocorre formao de
precipitado na soluo violeta da fase orgnica, correspondente ao iodo;
Em fase aquosa, observa-se o aparecimento de uma cor amarelo torrado diferente da
caracterstica do Fe(III), que corresponde forma aquosa do Iodo molecular (I3-).
Adio de Fe(III)+NaF+KI+CHCl3:
Em primeiro lugar, o flor liga-se ao ferro formando um complexo incolor e muito
estvel ( );
A modificao do estado de complexao do ferro faz com que se crie uma resistncia
reduo: modificado o potencial de reduo do ferro, aumentando-o para superior
ao do iodeto e assim o iodeto no consegue reduzir o Fe3+.
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Concluso
Clculo do reagente limitante
Reagente Massa (g) Massa Molecular
(g/mol) Estequiometria Nmero de moles
Sulfato de ferro amoniacal
15,15 392,14 1 0,0386
cido oxlico 7,54 126,07 1 0,0838
Oxalato de potssio
10,06 184,24 2 0,0273
Perxido de hidrognio
0,02 dm3 1,667 mol/dm3 0,5 0,08335
Uma concentrao de peroxide de hidrognio 20 volumes equivalente a
1.667 mol/dm3. Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm3).
Isto prova que o reagente limitante o oxalato de potssio;
O oxalato de potssio doa ies oxalato, tal como o cido oxlico, que posteriormente
adicionado na forma concentrada no h controlo sobre a quantidade de ies
oxalato (a quantidade de ies oxalato pode advir de vrias espcies, sendo mais
impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante);
Para maior preciso, no clculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal.
Clculo do rendimento
Composto modelo
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A estrutura do complexo sintetizado pode de certa forma ser um modelo para
simulao das propriedades do ferro em sistemas biolgicos, dado que o complexo est
coordenado com oxignios (ambiente idntico ao que rodeia as molculas transportadoras de
oxignio). Encontram-se semelhanas entre o complexo sintetizado e os siderforos.
A formao de complexos de Ferro est dependente da fora dos ligandos (posio na
srie espectroqumica)
Quanto mais elevada a constante de estabilidade do complexo com dado ligando mais
favorecida a sua formao.
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MIOGLOBINA: EXTRACO, PURIFICAO E DOSEAMENTO DE PROTENA
Introduo:
Protena em estudo:
Mioglobina:
Protena hmica monomrica (uma s cadeia polipeptdica);
Massa molecular de 16,7 kDa;
A sua estrutura secundria consiste maioritariamente em hlices (cerca de 70%);
Encontra-se no msculo cardaco e esqueltico;
Funo primria armazenamento de oxignio (O2) e fornecimento do mesmo em
caso de necessidade energtica;
Possui 153 aminocidos e um nico grupo hmico (protoporfirina IX de ferro), que
consiste na associao de uma porfirina com um tomo de ferro.
Grupo heme:
o O heme um grupo prosttico contendo um tomo de ferro,
componente de muitas protenas.
o O grupo heme constitudo por uma parte orgnica (protoporfirina) e
por um tomo de ferro. A protoporfirina constituda por 4 anis
pirrlicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel
tetrapirrlico. O tomo de ferro liga-se protoporfirina atravs de
interaces com os tomos de azoto dos anis pirrlicos.
o Em condies normais, o ferro encontra-se no estado de oxidao 2+,
podendo formar duas ligaes extra, uma de cada lado do plano do
grupo heme (5 e 6 posies de coordenao). Na mioglobina, a 5
posio de coordenao vai ser ocupada pelo anel imidazole de um
resduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptdica
(proximal histidine) e a 6 posio pode garantir a ligao ao oxignio.
In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),
sem oxignio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). Fora de um sistema biolgico, a
forma oxi-Mb (Fe2+-O2-Mb) pode ser convertida a met-Mb (Fe3+-H2O-Mb), atravs da
libertao de uma molcula de O2 e ligao de H2O.
Objectivo: Extrair e purificar a mioglobina a partir de tecido animal. Calcular a quantidade de
mioglobina no tecido de partida.
Tcnicas utilizadas:
Centrifugao
Uso da fora centrfuga para sapara partculas por sedimentao;
Partculas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;
Espectroscopia UV-Visvel
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Trata-se da espectroscopia de absoro em que so utilizados comprimentos de onda
da regio do ultra violeta regio do visvel.
Este mtodo consiste na medio da quantidade de radiao absorvida, traduzindo-se
esta medio em valores de absorvncia. A maior aplicao deste mtodo a
determinao de concentraes de compostos, e para esse efeito, utilizada a lei de
Lambert-Beer, que nos d a concentrao da substncia em funo da absorvncia
num determinado intervalo de linearidade (A=lc).
Cromatografia de excluso molecular
Separao dos agentes redox da mioglobina; Separao de molculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das
molculas; Uso do Gel Sephadex G-25; Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.
Mtodo de Lowry
Usado para a determinao da concentrao proteica, atravs da construo de rectas de calibrao;
O princpio do mtodo baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido
fosfrico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com
protenas, na presena do catalisador cobre(II), e produz um composto com absoro
mxima em 750nm.
um mtodo muito sensvel.
Procedimento:
Colocar 10 g de carne picada e 20 mL de tampo fosfatos
(20mM pH 5,6) num tubo de centrfuga
Misturar com uma vareta,
durante cerca de 1 minuto.
Centrifugar a 5000 rpm, durante 60
minutos (Rotor JA-20)
Remover e guardar o sobrenadante (S) com uma pipeta de
Pasteur.
Traar espectro UV/Vis (250-800 nm) de S, diluindo S 1:3
com o tampo inicial
Ler Abs a 635, 580, 542 e 505 nm. O restante
sobrenadante dividido em duas
partes
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1. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertao da mioglobina. Deve
evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar cidos gordos e/ou
cidos nucleicos, o que indesejvel
2. A centrifugao separa as partculas por sedimentao; devem equilibrar-se cada dois
tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar.
3. No pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que
no interessa aproveitar.
4. Os picos de absoro para os complexos de mioglobina so para a 635 e 505 nm (para
a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina
reduzida), na regio do visvel.
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Resultados:
Tubos Absorvncias
BSA Protena ( diluda 1:20) F1+F2*
1 0,810 0,431 1,007
2 0,742 0,383 0,902
3 0,539 0,310 0,608
4 0,327 0,258 0,341
*Fraces recolhidas da coluna de filtrao em gel.
1. Clculo da massa de protena total na carne
Massa da carne: 10,07g
[BSA] = 0,5 mg/mL
BSA
1- 200 L de BSA [] = 0,5 mg/mL Massa = 100 g
2- 150 L de BSA + 50 L de gua [] = 0,375 mg/mL Massa = 75 g
3- 100 L de BSA + 100 L de gua [] = 0,25 mg/mL Massa = 50 g
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4- 50 L de BSA + 150 L de gua [] = 0,125 mg/mL Massa = 25 g
TOTAL: 200 L + 2 mL de reagente C + 200 L de reagente D = 2,4 mL
Ex. Clculo da massa do tubo 2:
Curva de calibrao:
Atravs da recta de calibrao calcula-se a massa de protena:
Diluies:
1
2
y = 0.0081x + 0.0766 R = 0.9525
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 20 40 60 80 100 120
Ab
s
Massa (mg)
Curva de calibrao - BSA
-
21
3
4
Mdia dos valores de concentrao calculados: (0,219 + 0,252 + 0,288 + 0,448) / 4 = 0,3 mg/mL
Na cuvette colocou-se 1 mL de uma soluo anterior com 2,4 mL. Calculou-se ento a massa
de protena nessa soluo:
0,3 mg 1 mL
X 2,4 mL
X = 0,72 mg de protena.
0,1 mL da soluo de 2,4 mL foram retirados do sobrenadante diludo, que tinha 20 mL. Assim,
no sobrenadante diludo tem-se:
0,72 mg 0,1 mL
Y 20 mL
Y = 14,4 mg de protena.
O sobrenadante tinha sofrido uma diluio de 1:20, logo a massa de protena no sobrenadante
:
14,4 mg 1 mL
Z 20 mL
Z = 288 mg de protena no sobrenadante.
-
22
2. Clculo da massa de mioglobina
No clculo da massa de mioglobina, considera-se que toda a mioglobina que se aplicou na
coluna cromatogrfica foi oxidada, logo a mioglobina oxidada equivale mioglobina total
presente.
Massa de protena na cuvette:
Diluies:
1
2
3
4
Mdia dos valores de concentrao calculados: (0,574 + 0,68 + 0,656 + 0,652) / 4 = 0,64 mg/mL
-
23
Na cuvette colocou-se 1 mL de uma soluo anterior com 2,4 mL. Calculou-se ento a massa
de mioglobina nessa soluo:
0,64 mg 1 mL
X 2,4 mL
X = 1,536 mg
0,2 mL da soluo de 2,4 mL foram retirados de uma soluo de 10 mL. Assim, tem-se:
1,536 mg 0,2 mL
Y 10 mL
Y = 76,8 mg
Na coluna inseriu-se 1mL de sobrenadante diludo, da qual se retiraram 2 mL, pelo que a
massa de protena no sobrenadante diludo :
76,8 mg 1 mL
Z 2 mL
Z = 152,4 mg
O sobrenadante tinha sofrido uma diluio de 1:20, logo a massa de mioglobina no
sobrenadante :
-
24
152,4 mg 1 mL
W 20 mL
W = 3048 mg de mioglobina.
Concluses:
Massa de protena em 10g de carne: 288 mg
Massa de mioglobina em 10g de carne: 3048 mg
O resultado obtido no coerente, o que pode dever-se a erros experimentais e ao facto de
nenhum valor de absorvncia da mioglobina estar contido na recta de calibrao com BSA,
podendo estar o valor da massa de mioglobina sobrestimado.
Dado que ocorreram erros experimentais e os valores das massas obtidos no so correctos,
nada se pode concluir a partir do grau de pureza.
-
25
MIOGLOBINA: ESPECTROSCOPIA UV-VISVEL
Introduo:
Protena em estudo:
Mioglobina:
Protena hmica monomrica (uma s cadeia polipeptdica);
Massa molecular de 16,7 kDa;
A sua estrutura secundria consiste maioritariamente em hlices ;
Encontra-se no msculo cardaco e esqueltico;
Funo primria armazenamento de oxignio (O2) e fornecimento do mesmo em
caso de necessidade energtica;
Possui 153 aminocidos e um nico grupo hmico (protoporfirina IX de ferro), que
consiste na associao de uma porfirina com um tomo de ferro.
Grupo heme:
o O heme um grupo prosttico contendo um tomo de ferro,
componente de muitas protenas.
o O grupo heme constitudo por uma parte orgnica (protoporfirina) e
por um tomo de ferro. A protoporfirina constituda por 4 anis
pirrlicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel
tetrapirrlico. O tomo de ferro liga-se protoporfirina atravs de
interaces com os tomos de azoto dos anis pirrlicos. Em
condies normais, o ferro encontra-se no estado de oxidao 2+,
podendo formar duas ligaes extra, uma de cada lado do plano do
grupo heme (5 e 6 posies de coordenao). Na mioglobina, a 5
posio de coordenao vai ser ocupada pelo anel imidazole de um
resduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptdica
(proximal histidine).
In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),
sem oxignio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). No primeiro estado, a 6 posio de
coordenao do ferro do heme encontra-se desocupada sendo que a ligao de uma
molcula de O2 causa uma ligeira alterao conformacional, alterando o estado da
mioglobina para oxi-Mb. Fora de um sistema biolgico, a forma oxi-Mb (Fe2+-O2-Mb)
pode ser convertida a met-Mb (Fe3+-H2O-Mb), atravs da libertao de uma molcula
de O2 e ligao de H2O.
Oxi e Met Mioglobina
Oxi-Mb
Forma reduzida de Mb;
Presente na superfcie da carne fresca - cor vermelha;
O O2 liga-se na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme;
Apresenta picos a 542 nm e 580 nm
-
26
Na regio de Soret os picos so a 417nm e 348nm.
Met-Mb
Forma oxidada de Mb;
cor castanha;
O H2O liga-se na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme;
Forma-se nas zonas com baixa concentrao de O2 ;
Apresenta picos a 504 nm e 635 nm;
Na regio de Soret o pico a 409nm.
Os picos da regio de Soret permitem encontrar a razo oxi-Mb/met-Mb.
Reaces redox
Pode ocorrer interconverso das formas Oxi a Met, por aco de agentes
oxidantes (1), numa reaco onde um electro do ferro doado ao agente
oxidante, ou de Met a Oxi por aco de agentes redutores (2), que doam um
electro ao ferro.
Objectivo: Extrair e identificar a oxi-Mb e a met-Mb atravs das suas propriedades espectrais.
Estudo da reaco redox de interconverso.
Tcnicas utilizadas:
Centrifugao
Uso da fora centrfuga para sapara partculas por sedimentao;
Partculas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;
Espectroscopia UV-Visvel
Trata-se da espectroscopia de absoro em que so utilizados comprimentos de onda
da regio do ultra violeta regio do visvel.
Este mtodo consiste na medio da quantidade de radiao absorvida, traduzindo-se
esta medio em valores de absorvncia. A maior aplicao deste mtodo a
determinao de concentraes de compostos, e para esse efeito, utilizada a lei de
Lambert-Beer: A= lc, que nos d a concentrao da substncia em funo da
absorvncia num determinado intervalo de linearidade.
-
27
Cromatografia de excluso molecular
Separao dos agentes redox da mioglobina; Separao de molculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das
molculas; Uso do Gel Sephadex G-25; Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.
Procedimento:
5. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertao da mioglobina. Deve
evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar cidos gordos e/ou
cidos nucleicos, o que indesejvel
6. A centrifugao separa as partculas por sedimentao; devem equilibrar-se cada dois
tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar.
7. No pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que
no interessa aproveitar.
8. Os picos de absoro para os complexos de mioglobina so para a 635 e 505 nm (para
a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina
reduzida), na regio do visvel.
Colocar 10 g de carne picada e 20 mL de tampo fosfatos
(20mM pH 5,6) num tubo de centrfuga
Misturar com uma vareta,
durante cerca de 1 minuto.
Centrifugar a 5000 rpm, durante 60
minutos (Rotor JA-20)
Remover e guardar o sobrenadante (S) com uma pipeta de
Pasteur.
Traar espectro UV/Vis (250-800 nm) de S, diluindo S 1:3
com o tampo inicial
Ler Abs a 635, 580, 542 e 505 nm. O restante
sobrenadante dividido em duas
partes
-
28
-
29
Resultados:
Espectro experimental da mioglobina:
Os picos 33, 35 e 36 so caractersticos da forma reduzida da mioglobina, Oxi-Mb,
sendo que pico 33 corresponde zona de Soret.
O pico 34 caracteristico da forma oxidada da Mioglobina, Met-Mb, correspondendo
ao seu pico na zona de Soret.
Espectro experimental da mioglobina oxidada (Met-Mb):
Os picos observados, 405, 575 e 623, so os correspondentes aos tericos nos
comprimentos de onda 409, 504 e 635.
Foi ainda medida a absorvncia a 409 nm, correspondente ao pico terico da zona de
Soret da Met-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,945.
Espectro experimental da mioglobina reduzida (Oxi-Mb):
Os picos observados, 411, 539 e 577, so os correspondentes aos tericos nos
comprimentos de onda 417, 542 e 580.
Foi ainda medida a absorvncia a 417 nm, correspondente ao pico terico da zona de
Soret da Oxi-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,386.
-
30
Comprimento de onda Abs sobrenadante Abs Oxi-Mb Abs Met-Mb
409 1,870 1,392 1,945
417 1,848 1,386 1,412
505 0,455 0,215 0,332
542 0,488 0,244 0,272
546 - 0,239 0,266
580 0,451 0,221 0,222
635 0,311 0,109 0,194
Clculo da concentrao de Oxi-Mb e Met-Mb na amostra inicial
Primeiro foram calculadas as concentraes para a Oxi-Mb e Met-Mb que foram
isoladas a partir da cromatografia de excluso molecular. Os valores de para a Oxi-Mb e
de para a Met-Mb foram retirados do protocolo experimental.
[Oxi-Mb] a 417 nm
Como se realizou previamente uma diluio 1:3, a concentrao de Met-Mb na
amostra inicial ser ento trs vezes a calculada acima
[Met-Mb] a 409 nm
Como se realizou previamente uma diluio 1:3, a concentrao de Met-Mb na
amostra inicial ser ento trs vezes a calculada acima
[Oxi-Mb] e [Met-Mb] na amostra inicial (sobrenadante)
Valores de
Oxi-Mb
-
31
Os valores utilizados so correspondentes absorvncia da Oxi-Mb a 409 nm e [Oxi-
Mb] calculada anteriormente.
Met-Mb
Os valores utilizados so correspondentes absorvncia da Met-Mb a 417 nm e
[Met-Mb] calculada anteriormente.
Clculo das concentraes na amostra inicial
Valores de absorvncia do sobrenadante a 409 e 417 nm.
Como se realizou previamente uma diluio 1:3, as concentraes na amostra inicial
sero ento trs vezes a calculada acima
-
32
Razo Oxi-Mb/Met -Mb
A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma
molcula de O2 se liga na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme.
Concluses:
A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma
molcula de O2 se liga na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme.
Pelos espectros obtidos verificou-se um sucesso parcial da extraco da mioglobina
reduzida e oxidada;
No espectro da mioglobina oxidada os picos de absoro so aos comprimentos de
onda 575 e 623 nm e deveriam ser a 504 e 635 nm;
No espectro da mioglobina reduzida os picos de absoro so aos comprimentos de
onda 539 e 577 nm e deveriam ser a 542 e 580 nm;
Os picos das bandas de Soret da mioglobina oxidada so: Terico - 409, prtico 405;
Os picos das bandas de Soret da mioglobina reduzida so: Terico - 417, prtico 411;
Apesar dos valores no corresponderem exactamente , verificou-se para o espectro da
Met-Mb o desaparecimento dos picos de absoro da Oxi-Mb e vice-versa, revelando
que no h contaminao das fraces obtidas.
-
33
FTIR E FLUORESCNCIA
Introduo:
Luminescncia: Emisso de luz a partir de uma substncia que ocorre a partir de estados
excitados. formalmente dividida em duas categorias Fosforescncia e Fluorescncia
dependendo da natureza do estado excitado.
A fosforescncia a emisso de luz a partir da excitao de um electro para um
estado de tripleto excitado. O electro excitado tem o mesmo spin que o seu par da
orbital do estado fundamental. As transies para o estado fundamental so proibidas
- no tem - e as taxas de emisso so muito lentas, por isso os
tempos de vida da fosforescncia so tipicamente entre milissegundos e segundos.
A fluorescncia a emisso de luz a partir da excitao de um electro para um estado
de singuleto excitado. O electro excitado tem spin oposto do seu par do estado
fundamental. Consequentemente, o regresso ao estado fundamental permitido h
e ocorre rapidamente pela emisso de um foto. As taxas de
emisso so tipicamente de 108 s-1, pelo que o tempo de vida tpico da fluorescncia
cerca de 10 ns (10 x 10-9 s).
Fluorescncia
Serve para o estudo de molculas biolgicas (estado das membranas
biolgicas, vesculas, protenas clulas vivas, etc.).
um processo com grande sensibilidade de deteco, sendo possvel trabalhar
a muito baixas concentraes.
Quando comparado com o doseamento espectrofotomtrico mais sensvel j
que reflecte as propriedades do microambiente da molcula no estado
excitado sendo que este influenciado pelo pH, temperatura, presso,
ligaes de hidrognio.
A fluorescncia ocorre tipicamente a partir de compostos aromticos, como os
apresentados na figura abaixo.
-
34
O processo que ocorre entre a absoro e emisso de luz usualmente descrito pelo
diagrama de Jablonski:
S0, S1 e S2 correspondem respectivamente ao estado fundamental, primeiro e segundo
nveis de energia. Em cada um destes nveis electrnicos os fluorforos (molcula ou parte de
uma molcula que emite fluorescncia seguindo a excitao com a luz) podem existir em
diferentes nveis de energia vibracionais (0, 1, 2, etc.). As transies entre estados so
representadas como linhas verticais.
Um fluorforo geralmente excitado para nveis vibracionais elevados de S1 ou S2.
Com algumas excepes, as molculas so rapidamente relaxadas para o estado vibracional
mais baixo de S1. Este processo denominado converso interna e ocorre em cerca de 10-12s
ou menos. Como os tempos de vida da fluorescncia so geralmente cerca de 10-8s, a
converso interna completada antes da emisso.
O regresso ao estado fundamental ocorre tipicamente de um estado excitado
vibracional baixo de S1 para os nveis vibracionais altos de S0, com a emisso de fotes.
Rapidamente o electro passa para os nveis vibracionais baixos de S0, voltando ao estado
fundamental.
-
35
As molculas do estado S1 podem sofrer uma converso de spin para o primeiro estado
tripleto (T1). A emisso a partir de T1 a fosforescncia. A converso de S1 para T1
denominada cruzamento inter-sistemas (ocorre entre dois estados vibracionais isoenergticos
pertencentes a estados electrnicos com diferentes multiplicidades).
Caractersticas da Fluorescncia:
Efeito da polaridade do solvente
A polaridade do solvente e o microambiente tm profundos efeitos nos espectros de
emisso dos fluorforos.
o Desvio de Stokes
Geralmente o comprimento de onda de emisso maior do que o de excitao.
Uma causa habitual para o desvio de Stokes o rpido decaimento para o nvel
vibracional mais baixo de S1. Os fluorforos geralmente passam para os nveis vibracionais
mais elevados de S0, resultando numa posterior perda de energia de excitao. Para alm
destes efeitos, os fluorforos podem sofrer desvios de Stokes devido a efeitos dos solventes,
reaces do estado excitado, formaes de complexos e transferncia de energia.
Os efeitos do solvente diminuem a energia de emisso devido estabilizao do
estado excitado pelas molculas do solvente polar. O fluorforo tem um maior momento
dipolar no estado excitado (E) do que no estado fundamental (G). Depois da excitao os
dipolos do solvente podem reorientar-se ou sofrer relaxao volta de E, o que diminui a
energia do estado excitado. medida que a polaridade do solvente aumenta, este efeito
tambm aumentado, resultando numa emisso a menor energia. Por esta razo, quando se
altera a polaridade do solvente, os espectros de emisso sofrem desvios. Em geral, apenas
fluorforos que so polares tm uma grande sensibilidade a solventes polares. Os fluorforos
apolares no sofrem desvios de Stokes com a variao da polaridade do solvente.
O tempo de vida de fluorescncia geralmente muito maior do que o tempo
necessrio para a relaxao do solvente. Por esta razo, as molculas do solvente reorientam-
se volta do dipolo do fluorforo, e do-se desvios nos espectros de emisso. Assim, estes
espectros so muito mais sensveis ao ambiente e polaridade do solvente do que os
espectros de absoro/excitao.
A absoro/excitao ocorre a uma velocidade muito grande, pelo que no h tempo
para que as molculas do solvente se reorganizem, no havendo desvios nos espectros que se
obtm.
-
36
Excepes Regra da Imagem no Espelho
Geralmente os espectros de absoro e emisso so a imagem um do outro no
espelho. No entanto, existem vrias excepes a regra que se devem aos seguintes factores:
o A emisso d-se a partir duma espcie diferente da espcie que absorveu o foto (isto
, d-se uma reaco no estado excitado). A emisso d-se sempre a partir da espcie
protonada, logo, no caso desta excepo, a espcie protonada no a que recebeu o
foto;
o A emisso d-se a partir dum estado diferente daquele que resultou da absoro (a
emisso d-se geralmente a partir de S1, logo, neste caso, a molcula pode ter sido
excitada para S2);
o O espectro de absoro corresponde a duas transies quase iso-energticas (como
por exemplo o caso do Triptofano, em que ocorre transio entre dois estados
singuletos excitados de baixa energia).
-
37
Tempos de vida de Fluorescncia e Rendimento Quntico
O tempo de vida (tempo que a molcula passa no estado excitado antes de regressar
ao estado fundamental) e o rendimento quntico (nmero de fotes emitidos por nmero de
fotes absorvidos) so caractersticas muito importantes de um fluorforo. Substncias com
maiores rendimentos qunticos tm maiores emisses (mais brilhantes). O tempo de vida
determina o tempo disponvel para o fluorforo interagir ou difundir-se no meio e por isso
fornece informao sobre a sua emisso.
Espectrofluormetro
Com a maior parte dos espectrofluormetros possvel registar os espectros de
emisso e excitao. Estes espectros podem ser apresentados em escalas de comprimentos de
onda ou de nmeros de onda.
Para a maior parte dos fluorforos os rendimentos qunticos e os espectros de
emisso so independentes do comprimento de onda de excitao.
Num caso ideal, os espectros de excitao e emisso devem representar a intensidade
componentes individuais devem ter as seguintes caractersticas:
A fonte de luz deve produzir uma emisso constante de fotes a todos os
comprimentos de onda;
O monocromador deve passar fotes de todos os comprimentos de onda com a
mesma eficincia;
A eficincia do monocromador deve ser independente da polarizao;
O detector (tubo fotomultiplicador) deve detectar fotes de todos os comprimentos
de onda com igual eficcia.
-
38
Espectros de excitao e emisso
O espectro de fluorescncia geralmente apresentado como espectro de emisso (intensidade de fluorescncia vs. nmero de onda). Este espectro varia muito e depende da estrutura qumica do fluorforo e do solvente no qual se dissolve.
Espectro de emisso
Representa a frequncia de fotes emitidos ou energia emitida a cada
comprimento de onda.
Para o traar, escolhido um comprimento de onda de excitao fixo, e de
seguida percorrido toda a gama de comprimento de onda pelo
monocromador de excitao.
Razes de distoro do espectro:
o Dependncia da eficincia da emisso da energia por parte do
monocromador de emisso e do fotomultiplicador;
o Absoro de radiao por parte da amostra.
Espectro de excitao
Representa a emisso relativa do fluorforo a cada comprimento de onda de
excitao.
-
39
Para o traar, o monocromador de emisso calibrado ao comprimento de
onda de emisso mximo da amostra, e faz-se correr a gama de comprimentos
de onda pelo monocromador de excitao.
Razes de distoro do espectro:
o A intensidade da luz da fonte de excitao est dependente da gama
de comprimentos de onda;
o A eficincia da transmisso do monocromador de excitao deve-se
tambm gama de comprimento de onda;
o A substncia pode ter absorvncia superior.
Fluorescncia de protenas - O triptofano como composto modelo
Nas protenas h trs aminocidos fluorescentes: fenilalanina, tirosina e triptofano.
Estes aminocidos so relativamente raros nas protenas. O triptofano o fluorforo
intrnseco dominante. O nmero reduzido de resduos de triptofano provavelmente o
resultado do custo metablico da sua sntese. Uma protena pode ter apenas um ou alguns
resduos de triptofano, o que facilita a interpretao dos dados do espectro.
Um factor importante a sensibilidade do triptofano ao seu microambiente.
Alteraes no espectro de emisso do triptofano ocorrem frequentemente devido a
modificaes conformacionais, ligao a substratos ou desnaturao. Este resduo sensvel a
ligae
laterais.
Um factor que complica a interpretao da fluorescncia das protenas a presena
dos vrios aminocidos fluorescentes na maioria das protenas. No entanto os espectros de
emisso das protenas so dominados pelo triptofano que absorve e emite a maiores
comprimentos de onda e numa gama de comprimentos de onda maior. O triptofano tem um
maior coeficiente de absortividade molar. A energia absorvida pela fenilalanina e tirosina
muitas vezes transferida para os resduos de triptofano da mesma protena.
A excitao das protenas geralmente ocorre a um mximo prximo de 280 nm.
Consequentemente, a fenilalanina no excitada nesta experincia, e como o seu rendimento
quntico muito pequeno, a emisso deste resduo raramente observada para protenas. A
absoro de protenas a 280 nm deve-se aos resduos de tirosina e triptofano. A comprimentos
de onda de 295 nm ou superior, a absoro deve-se principalmente ao triptofano. Este resduo
pode ser selectivamente excitado a comprimentos de onda entre 295 e 305 nm. Por esta
-
40
razo, efectuou-se a excitao da mioglobina a 295 nm e no no mximo de excitao do
triptofano, evitando-se a excitao da tirosina e da fenilalanina (os outros resduos
fluorescentes). Assim, a 295 nm apenas o triptofano emite e por isso evita-se coalescncia de
espectros.
H, no entanto, um problema quando existem vrios resduos de triptofano em
soluo: os espectros de emisso dos diferentes resduos ficam sobrepostos, cada um com um
microambiente nico.
Fluorescncia da Mioglobina
A mioglobina uma protena com dois resduos de triptofano (Trp-7 e Trp-14) que se
encontram no interior hidrfobo da protena. Quando a protena desnaturada, estes resduos
so expostos ao solvente e como so fluorforos polares, sofrem desvio de Stokes, havendo
desvios nos espectros de emisso da mioglobina quando esta se encontra no estado nativo e
desnaturado.
FTIR
FTIR - tcnica
Apesar de existirem tcnicas que fornecem informao mais detalhada sobre a
estrutura de protenas (como a cristalografia de raios X), estas muitas vezes no podem ser
aplicadas visto que as protenas nem sempre formam um cristal de qualidade suficiente para
anlise. A tcnica de FTIR d tambm informao sobre a estrutura secundria, enquanto que
a cristalografia de raios X e outras tcnicas fornecem informaes sobre a estrutura terciria.
-
41
FTIR (Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier) uma tcnica que
realiza a medio do comprimento de onda e da intensidade de absoro em infravermelho
por uma amostra. Compostos diferentes tm bandas de absoro caractersticas no espectro
IV.
Um monocromador desnecessrio, pois faz-se uso de um interfermetro que encripta
todas as frequncias da radiao IV num sinal nico. A radiao incidente divida em dois
feixes (beamsplitter) e o espelho mvel provoca a alterao da distncia percorrida que leva
interferncia entre os dois feixes.
A radiao infravermelha passa pela amostra, com alguma a ser absorvida e outra a ser
transmitida. O interferograma resultante representa todas as frequncias medidas
simultaneamente e todos os seus pontos tm informao codificada.
Por fim, aplica-se a transformada de Fourier no interferograma final, obtendo-se o
espectro.
Bandas do espectro
As bandas observadas nos espectros IV devem-se aos movimentos vibracionais dos tomos
nas molculas que faam variar o seu momento dipolar permanente,
Existem vrias bandas caractersticas de aminocidos especficos, no entanto as mais
importantes referentes s ligaes peptdicas e que permitem um estudo da estrutura
secundria so a Amida I e a Amida II, pois relacionam-se com as ligaes por pontes de
hidrognio estabelecidas.
A banda amida I deve-se s vibraes stretching (elongamento) da ligao C dupla O do
grupo amida; o nmero de onda dos fotes absorvidos 1600-1690 cm-1
A banda amida II - deve-se s vibraes bending (dobramento) da ligao NH ; o nmero
de onda dos fotes absorvidos 1480-1575 cm-1
Ambos os grupos esto envolvidos em ligaes por pontes de hidrognio, que ocorrem
entre diferentes elementos de estrutura secundria. Assim, a existncia deste tipo de bandas e
sua posterior anlise em certos nmeros de onda especficos indicam que tipo de estrutura
secundria est presente.
Amida I vs Amida II
A regio do espectro mais sensvel estrutura secundria das protenas a banda da
Amida I (1700-1600 cm-1), resultante inteiramente do stretching da ligao C=O das ligaes
peptdicas. As frequncias dos componentes esto relacionados com cada tipo de motivo
estrutural secundrio.
-
42
Por outro lado, a banda Amida II deriva maioritariamente do bending da ligao no
plano NH e da vibrao do stretching do CN, o que mostra muito menos sensibilidade
conformao proteica.
Mtodos de melhoramento dos espectros
H dificuldades na anlise da banda de amida I para identificao de estruturas
secundrias, devido s diferenas de frequncia serem muito pequenas em relao largura
da banda; assim obtm-se um s pico irregular em vez de vrios para cada tipo de estrutura
secundria. Tm vindo a ser desenvolvidos mtodos para melhorar este aspecto como o
mtodo de desconvoluo de Fourier e o das segundas derivadas.
FTIR e mioglobina e -globulina
Nesta actividade experimental pretendia-se identificar as bandas da Amida I que
permitissem identificar as estruturas secundrias da mioglobina e comparar com as da -
globulina.
A mioglobina uma protena cuja estrutura secundria constituda maioritariamente por
hlices , portanto, no espectro de FTIR esperado que o mnimo de absoro seja para
nmero de onda 1656 cm-1 (nmero de onda atribudo estrutura de hlices em H2O).
A -globulina uma protena cuja estrutura secundria constituda maioritariamente por
folhas ; no espectro de FTIR esperado que os valores mnimos de absoro sejam para
nmeros de onda: 1624, 1627, 1633, 1638, 1642, 1691 e 1696 cm-1 e 1642 (nmeros de onda
atribudos estrutura de folhas em H2O).
Procedimento:
Espectros de excitao e emisso de fluorescncia do triptofano e da mioglobina
-
43
-
44
Resultados:
Espectros de fluorescncia do triptofano
No se observaram diferenas significativas nos espectros de excitao do triptofano.
-
45
O espectro de emisso do triptofano em etanol tem um mximo a 335 nm e o do
triptofano em tampo fosfatos a 350 nm. Estes espectros sofrem o efeito de relaxao do
solvente.
A relaxao do solvente consiste na estabilizao das molculas no estado excitado
por interaco com as molculas do solvente, sendo este efeito maior quanto maior for a
polaridade do composto em causa. Como o tampo de fosfatos mais polar que o etanol o
estado excitado do triptofano em tampo menos energtico e por isso o espectro de
emisso a comprimentos de onda maiores, sendo o do etanol a comprimentos de onda
menores.
Isto s acontece porque o momento dipolar da molcula no estado excitado maior
do que no estado fundamental.
Por a emisso em fluorescncia ser mais lenta que a excitao, pode dizer-se que os
espectros de emisso so mais sensveis ao ambiente, permitindo, por exemplo, a
reorientao do solvente (efeito de relaxao do solvente).
Espectros de fluorescncia da mioglobina
No intervalo de comprimentos de onda utilizado, apenas o triptofano (dos trs
aminocidos aromticos) fluorescente - causa a fluorescncia da mioglobina.
O mximo da mioglobina nativa semelhante ao mximo de triptofano em etanol,
pois quando a protena se encontra no estado nativo os resduos de triptofano (os dois que a
mioglobina possui) esto num microambiente relativamente apolar, no interior da protena.
O espectro de emisso da mioglobina desnaturada semelhante ao do triptofano em
tampo, pois ocorre desnaturao da mioglobina, ficando os resduos de triptofano sujeitos a
um microambiente polar, semelhante ao triptofano em tampo.
Variao da intensidade de fluorescncia da mioglobina com o pH
Existe um mximo de intensidade de fluorescncia em redor do pH 4, um mnimo de
intensidade de fluorescncia em redor de pH 6 e a partir da uma nova subida da
intensidade.
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46
pH 3.5: a diminuio da fluorescncia pode dever-se protonao de um carboxilo
prximo, j que os dados no indicam que ocorram mudanas conformacionais;
pH 4: mximo de fluorescncia
pH 6: mnimo de fluorescncia porque o pKa da histidina prximo de 6 e a este pH
a cadeia lateral do resduo protonada; quando isto ocorre a intensidade da
fluorescncia diminuda;
pH 7 : estabilizao devido desprotonao de outros resduos de aminocidos;
Diminuindo o pH: aumento da fluorescncia, devido ao desenrolamento da protena,
que leva ao afastamento dos resduos de histidina e triptofano; os resduos de
triptofano ficam mais expostos, havendo um aumento da intensidade de
fluorescncia.
Comparao com grfico para a apomioglobina
As observaes feitas na aula so semelhantes s obtidas por Irace e colaboradores,
embora no artigo de Irace se tenha usado apomioglobina.
Comparao com grfico de Gryczynski e colaboradores
O grfico de Gryczynski e colaboradores foi feito para a mioglobina de corao de
cavalo
O desvio que se observa entre os espectros de pH 7 e pH 4,5 na zona do IV prova o
desenrolamento da protena, verificado tambm para o grfico de Gryczynski .
Ao dar-se o desenrolamento, os resduos ficam mais expostos, havendo um aumento
na intensidade de fluorescncia.
FTIR
Ftir mioglobina
Nmero de onda ( Banda caracterstica
1536.99 Amida II
1656.56 Amida I (hlice )
3299.92 Amida A
Ftir globulina
Nmero de onda ( Banda caracterstica
615,18 Amida V
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47
1236.15 Amida III
1531.21 Amida II
1643.06 Amida I (folha )
3286.12 Amida A
Comparao da estrutura secundria das protenas obtida atravs de FTIR e de cristalografia
de raio-X
A -globulina uma imunoglobulina pelo que foi usada a informao relativa
imunoglobulina G para comparao.
Os resultados obtidos por FTIR esto consistentes com a tabela apresentada, no entanto
no se encontraram folhas na mioglobina
Concluso:
A -globulina uma imunoglobulina pelo que foi usada a informao relativa
imunoglobulina G para comparao;
Os resultados obtidos por FTIR esto consistentes com a tabela apresentada, no
entanto no se encontraram folhas na mioglobina.
As tcnicas de fluorescncia e de FTIR complementam-se;
A primeira fornece informao acerca da constituio em resduos de aminocidos da
protena e o microambiente onde se encontram inseridos;
A segunda garante uma viso sobre a estrutura secundria da protena, conseguindo
assim atravs da utilizao destas duas tcnicas uma viso nica sobre a estrutura
tridimensional da protena em estudo.
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48
RESPIRAO MITOCONDRIAL RAZO ADP/O E RAZO DE CONTROLO RESPIRATRIO
1. Introduo
Transporte electrnico e fosforilao oxidativa
A fosforilao oxidativa uma via metablica que utiliza a oxidao final de glcidos,
lpidos e protenas (e a energia libertada nestas reaces de oxidao-reduo) para produzir
ATP, atravs da fosforilao de ADP. Este processo ocorre nos mitocndrios. Nesta via ocorre
transferncia de electres a partir de doadores electrnicos at aceitadores electrnicos finais,
como o oxignio transporte electrnico.
A cadeia respiratria pode ser separada em 4 complexos enzimticos:
NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I)
Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II)
Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III)
Citocromo c Oxidase (Complexo IV)
Em plantas, so ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais
complexos da cadeia respiratria duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada
zona interna da membrana interna e outra zona externa da membrana interna) e uma
actividade alternativa de oxidase.
Estes complexos, na presena de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidao
aerbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferncia electrnica para
a ubiquinona a partir de dois doadores de electres diferentes: NADH (complexo I) e sucinato
(complexo II). O complexo III leva electres da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o
complexo IV completa a sequencia transferindo os electres do citocromo c para o O2.
Fosforilao oxidativa o acoplamento do transporte electrnico com a sntese de
ATP
Os complexos I, III e IV so centros de acoplamento de energia. Nestes centros de
acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrnico conservada atravs da sua
converso numa fora motriz protnica utilizada para bombear protes para fora da matriz
mitocondrial (espao intermembranar), ocorrendo assim uma translocao vectorial de
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49
protes e a formao de um potencial electroqumico protnico de membrana, podendo
ento essa energia ser usada para a sntese do ATP. Esta sntese catalisada por um complexo
multienzimtico, Complexo V ou ATPsintase.
Inibidores e desacopladores
A fosforilao oxidativa pode ser inibida directamente por uma srie de agentes qumicos.
Uma classe destes compostos (caso do antibitico oligomicina) inibe a fosforilao oxidativa e
a respirao. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilo-
hidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibio da fosforilao por
desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respirao e fluxo de electres mas no ocorre
sntese de ATP (h inibio da fosforilao oxidativa mas no da respirao). Uma terceira
classe inclui os inibidores especficos da cadeia de transporte electrnico (rotenona, antimicina
A, cianeto).
Controlo respiratrio
O sistema de fosforilao oxidativa exerce um efeito regulador na velocidade de
respirao. Com efeito, as concentraes de ADP e de fosfato limitam a velocidade de
transporte electrnico. Uma vez que na maioria das clulas o fosfato inorgnico se encontra
presente em excesso, o ADP que controla a velocidade de respirao. Nos organismos
intactos, existe um alto grau de controlo respiratrio e os mitocndrios dizem-se fortemente
acoplados. Quando ocorre dano estrutural no mitocndrio perde-se este controlo.
RC (respiratory control) refere-se razo entre as velocidades de consumo de O2 no estado e no estado 4.
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50
O controlo respitatrio pode ser ilustrado por uma srie de cinco estados que se
podem repetir ciclicamente.
estado 1 mitocndrios sozinhos (na presena de Pi)
estado 2 - adio de substrato, respirao baixa devido falta de ADP (no h reentrada
de protes atravs do ATP sintase e qualquer respirao deve-se fuga de protes atravs
da membrana)
estado 3 uma quantidade limitada de ADP adicionada, permitindo uma respirao
rpida
estado 4 - todo o ADP foi convertido em ATP (fosforilao) e a respirao torna-se lenta
estado 5 anoxia (ausncia de O2)
Se a quantidade de ADP adicionado for conhecida ento a captao de oxignio
durante o estado 3 pode ser quantificada permitindo o clculo de uma razo P/O.
Razo ADP/O
A razo ADP/O o nmero de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electres
fluindo por um segmento da transferncia electrnica para o oxignio. No clculo desta razo
o oxignio o terminal aceitador.
Razes P/O podem ser determinadas atravs da extenso do estado trs acelerado,
obtido por adio de ADP no estado 2. Quase todo o ADP fosforilado a ATP: a razo ATP:ADP
normalmente de 100:1 quando o estado 4 atingido e a razo moles de ADP
adicionado/moles de O2 consumido pode ser calculada.
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51
Tcnicas
O elctrodo de oxignio
Este elctrodo consiste num elctrodo de referncia de Ag/AgCl e um elctrodo de Pt,
ambos imersos em KCl aquoso e separados da cmara onde se inserem as amostras apenas
atravs de uma membrana permevel a O2. Este reduzido a H2O no elctrodo de Pt, gerando
uma voltagem referente ao elctrodo de Ag/AgCl que proporcional [O2] na cmara
reaccional.
Ctodo:
O2 + 4e- 2H2O
nodo:
4Ag+ + 4Cl- 4AgCl + 4e-
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52
Objectivos:
1. A extenso da fosforilao obtida com diferentes substratos (razo ADP/O)
2. O grau de controlo respiratrio
3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrnico
2. Procedimento
Isolamento dos mitocndrios de batata
importante ter em conta que, sendo uma experincia em que se pretende manter a
actividade mitocondrial, todas as operaes devem ser feitas entre 0 e 4C e o processo no
deve demorar mais que 1h.
Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de
batata, comeando por se pesar 300g de batata e cort-la em cubos pequenos.
De seguida efectuou-se a homogeneizao em 250 mL de meio de isolamento num
batedor elctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de
actividade.
Procedeu-se filtrao num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior
centrifugao.
Aps a 1centrifugao aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a
8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em
meio de lavagem, juntando-se o contedo de diferentes tubos (dos vrios grupos).
Centrifugou-se novamente nas mesmas condies, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em
meio de ressuspenso e prosseguiu-se ltima centrifugao tambm a 8000g, 4 graus e
durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio
de ressuspenso.
Obteve-se assim a fraco mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte.
Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspenso. Estes meios
contm alguns componentes com concentraes adequadas para manter a actividade
mitocondrial.
O pH 6,5 o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manuteno da osmoralidade
do meio, a cistena previne a oxidao de produtos fenlicos prejudiciais ao mitocndrio, a BSA
(soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratrio pelo ADP e o EDTA remove
metais catalisadores de reaces indesejveis, mas inibe a respirao induzida pela cistena,
pelo que adicionado em concentrao baixa.
-
53
Determinao das razes ADP/O
Para determinar as razes ADP/O prepararam-se vrias solues: meio recacional,
substratos, ADP e o inibidor CCP.
Procedeu-se calibrao do elctrodo de oxignio temperatura ambiente. De
seguida saturou-se o meio de reaco com ar, num agitador magntico a 20 graus.
Depois deste processo adicionou-se cmara reaccional 1,6 mL do meio reaccional e
0,2 mL de suspenso mitocondrial. Colocou-se de seguida a tampa para que o tampo subisse
1cm no canal de injeco e iniciou-se o registo at obteno de uma linha de base
estacionria.
Iniciou-se o primeiro ensaio com a adio de 20 L de succinato de sdio (substrato),
registou-se uns minutos e adicionou-se 20 L ADP, prosseguindo com o registo at o seu
consumo, quando se adiciona novamente 20 L ADP. Regista-se mais um minuto e adiciona-se
CCP (inibidor). Por fim removeu-se a mistura da cmara por aspirao, limpando e enchendo a
cmara com gua desionizada.
No ensaio seguinte o processo o mesmo mas com a adio de + 20 L de ascorbato
de sdio+ 20 L de citocromo c 10 mg/mL como substratos.
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54
3. Resultados
Calibrao do elctrodo
Calibrou-se o elctrodo de oxignio e determinaram-se as concentraes de oxignio
correspondentes a 0% e 100% de O2. Foi calibrado a 100% com o meio reaccional oxigenado
por agitao e a 0% com o reagente ditionito de sdio.
No protocolo fornecida uma tabela que nos d informao sobre contedo em O2 de
gua saturada com ar:
Tabela 1 - Contedo em O2 de gua saturada com ar.
Temperatura (oC) O2 (ppm) O2 (
0 14,16 0,442 5 14,37 0,386 10 10,92 0,341 15 9,76 0,305 20 8,84 0,276 25 8,11 0,253 30 7,52 0,230 35 7,02 0,219
Sabendo que a temperatura ambiente aproximadamente
25 0C, a concentrao de O2 na cmara reaccional 0,253 mol/mL.
O volume da cmara 2 mL, pelo que possvel calcular o nmero
de moles de O2:
Contam-se 77 quadrculas entre o ponto equivalente a
100% de O2 e o ponto equivalente a 0%. Assim sabe-se que 77
quadrculas equivalem a 506 nmol de O2, logo, uma quadrcula
corresponde a 506/77 nmol = 6,57 nmol.
Quadrculas n (O2) /nmol
77 506 1 6,57
100% O2
0% O2
-
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Razo ADP/O
1. Ensaio do Succinato (Complexo II)
1.
2.
Como se quer calcular a razo ADP/O, necessrio calcular as moles de O consumidas,
pelo que se tem de multiplicar por dois o nmero de moles calculado para O2:
1. 59,13 x 2 = 118,26 nmol de O consumidas.
2. 32,85 x 2 = 65,7 nmol de O consumidas.
A soluo preparada de ADP tinha uma concentrao de 10 mM (0,01M = 0,01 mol/L =
10-8 mol/ L). Adicionaram-se 20 L, logo pode calcular-se o nmero de moles:
1.
2.
-
56
2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sdio (Complexo IV)
91,98 x 2 = 183,96 nmol de O consumidas
Substrato Razo ADP/O
experimental
Razo ADP/O
terica*
Succinato (1) 1,7 1,6
Citocromo c + Ascorbato 1,1 1
*Valores apresentados nos slides de Processos de Oxidao-Reduo em Bioqumica fornecidos pela professora da cadeira.
Observou-se que quando se adicionou ADP a um substrato ocorreu sempre consumo
de O2, pelo que se pode concluir que houve respirao. Os valores obtidos da razo ADP/O so
muito semelhantes aos valores tericos, pelo que se pode admitir que a experincia foi bem
sucedida.
Ao adicionar CCP continuou a haver respirao porque, sendo este um desacoplador,
provoca a inibio da fosforilao por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respirao
e fluxo de electres mas no ocorre sntese de ATP.
A razo ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque
ao longo da cadeia so transportados para fora da matriz menos protes, havendo menos
energia disponvel para a sntese de ATP. Assim, para que esta no seja diminuda, a actividade
da cadeia transportadora de electres aumenta, levando ao aumento do consumo de O2.
No complexo II no ocorre transporte de protes, pelo que no h contribuio para o
gradiente electroqumico, o que leva a que a razo ADP/O seja pequena.
-
57
No complexo IV a razo ADP/O inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai
ser necessrio um maior consumo de oxignio para produzir a mesma quantidade de ATP
(consumir a mesma quantidade de ADP).
Controlo Respiratrio
egulao da velocidade de transporte electrnico pelo ADP;
2 no estado 3 e no estado 4.
o Estado 3 Uma quantidade limitada de ADP adicionada, permitindo uma respirao
rpida;
o Estado 4 Todo o ADP foi convertido em ATP e a respirao torna-se lenta.
1. Ensaio do Succinato (Complexo II)
-
58
Cada quadrcula (horizontal) do grfico equivale a 1 cm e a velocidade a que o papel
corre 1cm/min, logo, sabendo que passa um tempo equivalente a 4 quadrculas na presena
de ADP (4 min) e equivalente a 2,8 quadrculas na ausncia de ADP pode calcular-se a
velocidade de consumo de O2 com e sem ADP. Como h dois declives correspondentes a cada
caso (dois declives para presena e ausncia de ADP) necessrio fazer a mdia dos dois
valores obtidos para calcular a razo de controlo respiratrio neste ensaio.
RC mdio: (6,23 + 3,6)/2 = 4,92
2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sdio (Complexo IV)
-
59
Esta razo permite determinar a extenso do acoplamento dos mitocndrios assim
como a sua integridade funcional.
Para esta parte do trabalho no foi possvel encontrar valores tericos, mas, no
entanto, sabe-se que se RC>1, os mitocndrios esto acoplados, no tendo sofrido alteraes
na sua funcionalidade. Nos ensaios observa-se que todos os resultados so maiores que 1, pelo
que se conclui que os mitocndrios estavam acoplados.
4. Concluso
A razo ADP/O o nmero de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electres
fluindo por um segmento da transferncia electrnica para o oxignio.
A razo ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque
ao longo da cadeia so transportados para fora da matriz menos protes, havendo menos
energia disponvel para a sntese de ATP, o que faz com que a actividade da cadeia
transportadora de electres aumente, levando ao aumento do consumo de O2.
No complexo II no ocorre transporte de protes, pelo que no h contribuio para o
gradiente electroqumico, o que leva a que a razo ADP/O seja pequena.
No complexo IV a razo ADP/O inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai
ser necessrio um maior consumo de oxignio para produzir a mesma quantidade de ATP
(consumir a mesma quantidade de ADP).
-
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Uma vez que na maioria das clulas o fosfato inorgnico se encontra presente em
excesso, o ADP que controla a velocidade de respirao. Nos organismos intactos, existe um
alto grau de controlo respiratrio e os mitocndrios dizem-se fortemente acoplados. Quando
ocorre dano estrutural no mitocndrio perde-se este controlo.
A razo de controlo respiratrio permite determinar a extenso do acoplamento dos
mitocndrios assim como a sua integridade funcional.
Como RC>1, os mitocndrios estavam acoplados, no tendo sofrido alteraes na sua
funcionalidade.
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RESPIRAO MITOCONDRIAL SEQUENCIAO DA CADEIA RESPIRATRIA
1. Introduo
Transporte electrnico e fosforilao oxidativa
A fosforilao oxidativa uma via metablica que utiliza a oxidao final de glcidos,
lpidos e protenas (e a energia libertada nestas reaces de oxidao-reduo) para produzir
ATP, atravs da fosforilao de ADP. Este processo ocorre nos mitocndrios. Nesta via ocorre
transferncia de electres a partir de doadores electrnicos at aceitadores electrnicos finais,
como o oxignio transporte electrnico.
A cadeia respiratria pode ser separada em 4 complexos enzimticos:
NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I)
Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II)
Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III)
Citocromo c Oxidase (Complexo IV)
Em plantas, so ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais
complexos da cadeia respiratria duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada
zona interna da membrana interna e outra zona externa da membrana interna) e uma
actividade alternativa de oxidase.
Estes complexos, na presena de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidao
aerbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferncia electrnica para
a ubiquinona a partir de dois doadores de electres diferentes: NADH (complexo I) e sucinato
(complexo II). O complexo III leva electres da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o
complexo IV completa a sequencia transferindo os electres do citocromo c para o O2.
Fosforilao oxidativa o acoplamento do transporte electrnico com a sntese de
ATP
Os complexos I, III e IV so centros de acoplamento de energia. Nestes centros de
acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrnico conservada atravs da sua
converso numa fora motriz protnica utilizada para bombear protes para fora da matriz
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mitocondrial (espao intermembranar), ocorrendo assim uma translocao vectorial de
protes e a formao de um potencial electroqumico protnico de membrana, podendo
ento essa energia ser usada para a sntese do ATP. Esta sntese catalisada por um complexo
multienzimtico, Complexo V ou ATPsintase.
Inibidores e desacopladores
A fosforilao oxidativa pode ser inibida directamente por uma srie de agentes qumicos.
Uma classe destes compostos (caso do antibitico oligomicina) inibe a fosforilao oxidativa e
a respirao. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilo-
hidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibio da fosforilao por
desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respirao e fluxo de electres mas no ocorre
sntese de ATP (h inibio da fosforilao oxidativa mas no da respirao). Uma terceira
classe inclui os inibidores especficos da cadeia de transporte electrnico (rotenona, antimicina
A, cianeto).
Tcnicas
O elctrodo de oxignio
Este elctrodo consiste num elctrodo de referncia de Ag/AgCl e um elctrodo de Pt,
ambos imersos em KCl aquoso e separados da cmara onde se inserem as amostras apenas
atravs de uma membrana permevel a O2. Este reduzido a H2O no elctrodo de Pt, gerando
uma voltagem referente ao elctrodo de Ag/AgCl que proporcional [O2] na cmara
reaccional.
Ctodo:
O2 + 4e- 2H2O
nodo:
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4Ag+ + 4Cl- 4AgCl + 4e-
Objectivos:
1. A extenso da fosforilao obtida com diferentes substratos (razo ADP/O)
2. O grau de controlo respiratrio
3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrnico
2. Procedimento
Isolamento dos mitocndrios de batata
importante ter em conta que, sendo uma experincia em que se pretende manter a
actividade mitocondrial, todas as operaes devem ser feitas entre 0 e 4C e o processo no
deve demorar mais que 1h.
Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de
batata, comeando por se pesar 300g de batata e cort-la em cubos pequenos.
De seguida efectuou-se a homogeneizao em 250 mL de meio de isolamento num
batedor elctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de
actividade.
Procedeu-se filtrao num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior
centrifugao.
Aps a 1centrifugao aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a
8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em
meio de lavagem, juntando-se o contedo de diferentes tubos (dos vrios grupos).
Centrifugou-se novamente nas mesmas condies, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em
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meio de ressuspenso e prosseguiu-se ltima centrifugao tambm a 8000g, 4 graus e
durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio
de ressuspenso.
Obteve-se assim a fraco mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte.
Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspenso. Estes meios
contm alguns componentes com concentraes adequadas para manter a actividade
mitocondrial.
O pH 6,5 o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manuteno da osmoralidade
do meio, a cistena previne a oxidao de produtos fenlicos prejudiciais ao mitocndrio, a BSA
(soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratrio pelo ADP e o EDTA remove
metais catalisadores de reaces indesejveis, mas inibe a respirao induzida pela cistena,
pelo que adicionado em concentrao baixa.
Efeito de inibidores
Pretende-se agora sequenciar a cadeia respiratrio usando vrios inibidores da
mesma, sendo que os ensaios devem ser adequados para calcular a actividade do oxidase
alternativo/respirao no inibida pelo KCN.
Comeou-se por adicionar na camara reaccional 1,4 mL de meio de reaco + 200 L
de mitocndrios + 20 L de succinato + 50 L de ADP obtendo-se o registo do elctrodo.
Adicionou-se + 10 L de oligomicina antes que o ADP se esgotasse e +20 L de malonato
quando comea a haver declive.
A oligomicina inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protes, que necessrio
para a fosforilao oxidativa de ADP para ATP (produo de energia). A inibio da sntese de
ATP pra tambm a cadeia transportadora de electres.
O malonato um inibidor do complexo II e a oligomicina do complexo ATP sintase.
Adiciona-se agora 20 L de malato + 20 L de glutamato (complexo I) para verificar se a
respirao retoma ou no, confirmando-se pelo registo; adiciona-se rotenona que inibe o
complexo I.
Adicionou-se NADH, registando-se, e + 20 L antimicina A (para assegurar que est
inibido); colocou-se na camara reaccional + 20 L de citocromo c + 20 L de ascorbato de sdio
(substratos), registando-se e 40 L de KCN, 20 de cada vez.
Adicionou-se + 20 L de ADP, registou-se e mais + 20 L de succinato, que estava
inibido devido ao KCN. Comea-se ento um novo registo com adio de 1,4 mL de meio de
reaco + 300 L de mitocndrios + 20 L de succinato + 20 L de ADP, registando-se.
Adicionou-se + 20 L de rotenona, substrato do complexo II e inibidor do complexo I. Registou-
se e adicionou-se +20 L de malonato (inibidor do complexo II).
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Adicionou-se + 20 L de citocromo c + 20 L de ascorbato de sdio, registou-se,
adicionou-se + 20 L de anticimina A, que um substrato para o complexo IV e inibidor do III.
Registou-se e adicionou-se 40 L de KCN (inibidor do complexo V), 20 de cada vez.
-
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3. Resultados
A utilizao de inibidores causa a interrupo do fluxo electrnico, fazendo com que os
complexos fiquem reduzidos e incapazes de aceitar electres dos que o antecedem. O
resultado prtico traduz-se numa reduo do consumo de oxignio.
Complexo I - NADH ubiquinona oxirredutase / NADH desidrogenase
Catalisa a transferncia de 2 electres do NADH (dador de electres) para a
ubiquinona. A este processo est associada a translocao vectorial de 4 protes.
Substrato: Glutamato + Malato
Utiliza-se este substrato por possuir um sistema de transporte prprio para o interior da matriz
mitocondrial, ao contrrio do NADH uma vez que este no consegue atravessar a membrana
interna mitocondrial.
Inibidor: Rotenona
Inibidor do complexo I Inibe a transferncia de electres do NADH para a ubiquinona (o
consumo de O2 pra) ao bloquear a oxidao de NADH a NAD+.
Complexo II Succinato: Ubiquinona oxirredutase / Succinato desidrogenase
Catalisa a transferncia de 1 electro do succinato (dador de electres) para a ubiquinona.
Substrato: Succinato
Inibidor: Malonato
Inibidor do complexo II Inibe competitivamente o succinato desidrogenase impedindo a
transferncia electres do succinato para a ubiquinona.
Complexo III Ubiquinol: Citocromo c oxirretudase / Citocromo bc1
Transporte de 2 electres do ubiquinol (ubiquinona reduzida) para o citocromo c. A este
processo est associada a translocao vectorial de 4 protes.
Substrato: No utilizado substrato para este complexo.
Inibidor: Antimicina A
Inibidor do complexo III Inibe a transferncia de electres do ubiquinol para o citocromo c
pois liga-se ao centro de reduo da quinona no complexo citocromo bc1.
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Complexo IV Ferrocitocromo c: oxigenorredutase / Citocromo c oxidase
Transferncia de 1 electro de cada uma de quatro molculas de citocromo c para o O2,
reduzindo-o a duas molculas de H2O.
Substrato: Ascorbato + Citocromo c
Inibidor: Cianeto
Inibidor do complexo IV Inibe a transferncia de electres do citocromo c oxidase para o O2
devido ao facto de se ligar ao ferro do enzima. A partir daqui a cadeia no pode ser retomada
pelo que o cianeto fatal.
Ensaio 1
Succinato (Substrato do complexo II) + Malonato (Inibidor complexo II)
Malato + Glutamato (Substrato do complexo I) + Rotenona (Inibidor complexo I)
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Ensaio 1 (2)
Antimicina A (Inibidor complexo III Para certificar que estava inibido) + Citocromo c com
ascorbato de sdio (Substrato complexo IV) + KCN (Inibidor complexo IV).
Na presena de Antimicina A ocorre respirao quando adicionado o substrato do
complexo IV. Ocorre inibio quando adicionado KCN - Inibe mas continua a haver
consumo de O2 devido presena de citocromo c oxidase alternativo.
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Ensaio 1 (3)
Succinato (Substrato complexo II) Estava inibido devido ao KCN, pelo que se comeou uma
nova reaco.
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Ensaio 2
Succinato (Substrato complexo II) + Rotenona (Inibidor complexo I) + Malonato (Inibidor
complexo II) + Citocromo c com ascorbato de sdio (Substrato complexo IV) + Antimicina A
(Inibidor complexo III) + KCN (Inibidor complexo IV Inibe mas continua a haver consumo de
O2 devido presena de citocromo c oxidase alternativo).
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Inicialmente adicionou-se Oligomicina que inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal
de protes, que necessrio para a fosforilao oxidativa de ADP para ATP (produo de
energia). A inibio da sntese de ATP pra tambm a cadeia transportadora de electres. Seria
de esperar que no ocorresse respirao, o que no observado, pelo que a soluo deve
estar mal preparada.
Atravs do Ensaio 1 possvel concluir que o Malonato inibe o Succinato, pelo que o
inibidor do complexo II. Adicionando seguidamente Malato + Glutamato (substratos do
complexo I) observa-se a ocorrncia de consumo de oxignio mas em muito pouca quantidade.
Pode concluir-se que o Malonato no inibiu ento o complexo I, pois ao adicionar substratos
do mesmo continuou a haver respirao, mas como foi muito pouco intensa, pode levar a
considerar que houve erros experimentais na preparao de solues. Estes resultados
indicam que os complexos I e II funcionam em paralelo.
Adicionando Rotenona deixa de haver respirao, pelo que se sabe que um inibidor do
complexo I. Adicionou-se depois NADH que substrato do complexo I e das actividades
alternativas do NADH desidrogenase, n