estudo do efeito de ligantes de tlrs em … · receptores das células b (bcr), assim como...

44
ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B. Bárbara José Antunes Baptista Rio de Janeiro 2009

Upload: trinhlien

Post on 19-Nov-2018

214 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM

DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO

DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B.

Bárbara José Antunes Baptista

Rio de Janeiro 2009

ii

BÁRBARA JOSÉ ANTUNES BAPTISTA Aluna do curso de Biotecnologia

Matrícula 0613800170

ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM

DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO

DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B.

Trabalho de Conclusão de Curso,

apresentado ao curso de graduação em

Biotecnologia, da UEZO como parte dos

requisitos para a obtenção do grau de

Tecnólogo em Biotecnologia sobre a

orientação da Dr. ElizeAyumi Hayashi.

Rio de Janeiro

Julho de 2009

iii

Baptista, Bárbara José Antunes

Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do desenvolvimento dos linfócitos B.

Bárbara José Antunes Baptista, Rio de Janeiro, 2009.

Trabalho de Conclusão de Curso – UFRJ/ Instituto de Microbiologia: Prof. Paulo

de Góes, 2009.

Orientadora: Elize Ayumi Hayashi

Co-Orientador: Alberto Félix Antônio da Nóbrega

1. Visão das diferenças fenotípicas entre as subpopulações de linfócitos B de

precursores purificados de medula óssea de camundongos jovens, adultos e idosos. 2.

diferenças dos linfócitos gerados in vitro na resposta ao LPS ao longo da ontogenia.

Trabalho de Conclusão de Curso. I. Elize Ayumi Hayashi. II. Universidade Federal do

Rio de Janeioro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Estudo do efeito de

ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do desenvolvimento dos

linfócitos B.

iv

Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da

ontogenia e do desenvolvimento dos linfócitos B.

Elaborado por Bárbara José Antunes Baptista Aluna do curso de Biotecnologia da UEZO

Este trabalho de Graduação foi assinado e aprovado com

Grau: 10,0

Rio de Janeiro, 30 de julho de 2009.

________________________________________ Maria de Fátima Sarro da Silva, pós – doutorado.

________________________________________

Sérgio Henrique Seabra, pós – doutorado.

________________________________________ Elize Ayumi Hayashi, pós – doutorado.

RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL. JULHO DE 2009

v

AGRADECIMENTOS

• A Deus, pela sua amizade que me sustentou em toda a minha vida, por ter me dado

forças para não desanimar e desistir nos momentos de dificuldades.

• A minha mãe, Odiléa José Antunes, por ter me dado todo o incentivo e apoio

durante toda a sua vida.

• A minha orientadora, Elize Ayumi Hayashi, por ter me ajudado a concluir este

trabalho, pelo acolhimento no laboratório, por toda a paciência em me ensinar, por

acreditar em mim, por não me deixar desistir nos momentos de desespero.

• Ao meu co-orientador Alberto Félix Antônio da Nóbrega, por ter me acolhido no

laboratório, por ter contribuído diretamente com idéias para o meu trabalho de

conclusão de curso, por todo o apoio e ajuda me dedicada.

• A Profa Maria Bellio, pelos ensinamentos nos seminários, por toda a contribuição

nos experimentos.

• Aos amigos de laboratório: Alessandra, Roberta, Marcio, Obrigada por toda a ajuda

no laboratório.

• A banca examinadora desta monografia: Maria de Fátima Sarro, Sérgio Henrique

Seabra Filho, Elize Ayumi Hayashi, por toda a disponibilidade e compreensão.

vi

RESUMO

Os linfócitos B, células da imunidade adaptativa, reconhecem de forma específica

uma gama de antígenos, conferindo ao sistema imune característica de especificidade. Os

receptores das células B (BCR), assim como receptores tipo Toll, desempenham um

importante papel no desenvolvimento dessas células. Trabalhos prévios evidenciaram que

o LPS é capaz de estimular a maturação de linfócitos B. Neste trabalho, foi analisado se

essa resposta dos linfócitos B ao LPS se altera ao longo da ontogenia, utilizando um

sistema de diferenciação in vitro a partir de precursores purificados de camundongos de

diferentes idades. Nossas análises foram realizadas com a utilização de um citômetro de

fluxo, para a identifição de marcadores de linhagem e de maturação.

Observamos que as células de animais jovens são em geral mais responsivas ao

LPS como estímulo de maturação se comparados a animais idosos. Mostramos evidências

de que esse fenômeno não é devido a defeitos intrínsecos da linhagem B, mas sim, à

presença de porcentagens pequenas de células que não pertencem à linhagem B, que tem

efeito inibitório na maturação. Esses resultados sugerem que estudos da ontogenia dos

linfócitos B são importantes para melhor compreensão da fisiologia dessas células e

possíveis causas de falhas em suas funções.

vii

ABSTRACT

B lymphocytes, cells of adaptive immunity, recognize a range of specific antigens,

giving the immune system characteristic of specificity. The B cell receptor (BCR) and Toll

type receptors, play an important role in the development of these cells. Previous studies

showed that LPS is able to stimulate the maturation of lymphocytes B. In this work, it was

examined whether the response of B lymphocytes to LPS changes throughout ontogeny,

using a system of differentiation in vitro of precursors purified from mice of different ages.

Our tests were performed using flow cytometry to identify markers of lineage and

maturation.

We observed that cells from young animals are generally more responsive to LPS

as a maturation stimulus when compared to older animals. We show evidence that this

phenomenon is not due to intrinsic defects of B lineage, but the presence of small

percentages of cells that do not belong to the B lineage, which has an inhibitory effect on

maturation. These results suggest that studies of the ontogeny of B lymphocytes are

important for better understanding of the physiology of these cells and possible causes of

failure in their function.

viii

SUMÁRIO

RESUMO .................................................................................................................... PÁG. VI

ABSTRACT .................................................................................................... ......... PÁG. VII

1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................................... PÁG. 1

1.1 - Desenvolvimento dos Linfócitos B .................................................................. PÁG. 1

1.2 - Subtipos de Células B a partir da diferenciação dos progenitores. ................... PÁG. 3

1.3 - Diferenciação In Vitro do Linfócito B .............................................................. PÁG. 4

1.4 - Papel da Enzima Rag no Desenvolvimento dos Linfócitos B ........................... PÁG. 5

1.5 - Receptores semelhantes a Toll (TLRs) ............................................................. PÁG. 6

1.6 - O sistema imunológico ao longo da ontogenia. ................................................ PÁG. 8

2 - OBJETIVO ........................................................................................................... PÁG. 11

2.1 - Objetivos Específicos: .................................................................................... PÁG. 11

3 - METODOLOGIA ................................................................................................ PÁG. 12

3.1 - Obtenção de células totais da medula óssea ................................................... PÁG. 12

3.2 - Contagem Celular ........................................................................................... PÁG. 12

3.3 - Análise da purificação e comparação das células dos camundongos. ............ PÁG. 12

3.4 - Seleção das células precursoras de linhagem B (B220 + IgM-) .................... PÁG. 12

3.5 - Cultura de diferenciação de precursores de células B ................................... PÁG. 13

3.6 - Análise de células por Citometria de Fluxo (FACS) ...................................... PÁG. 13

ix

4 - RESULTADOS ...................................................................................................... PÁG. 15

4.1 - Caracterização da linhagem B e análise da purificação dos precursores de medula

óssea em animais de diferentes idades. ........................................................................ PÁG. 15

4.2 - Estudo da maturação das células de linhagem B in vitro ................................ PÁG. 16

4.3 - Diferenciação das células B in vitro em resposta ao LPS em camundongos de

diferentes idades. .......................................................................................................... PÁG. 18

4.4 - Menor resposta de células B in Vitro ao LPS não corresponde totalmente com

avanço na idade do animal............................................................................................ PÁG. 21

4.5 - Presença de células que não pertencem à linhagem B inibe a diferenciação dos

precursores B In Vitro. ................................................................................................. PÁG. 22

5 - DISCUSSÃO .......................................................................................................... PÁG. 25

6 - CONCLUSÃO ....................................................................................................... PÁG. 28

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... PÁG. 29

x

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

BCR Receptor de Células B

CDR Regiões Determinantes de Complementaridade

CLP Progenitores Linfóides Comum

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

HSA Antígeno Estável ao Calor

HSCs Células-tronco Hematopoéticas

IFN Interferon

Ig Imunoglobulina

IL-4 Interleucina 4

IL-7 Interleucina 7

LPS Lipopolissacarídeo

PAMPs Padrão Molecular Associado a Patógeno

PBS Tampão Fosfato de Sódio

Pré-BCR Receptor de Células Pre-B

PI Iodeto de Propídeo

RAG Genes Ativantes de Recombinação

SCF Fator de Célula-tronco

SL Cadeia Leve Substituta

TdT Terminal Deoxinucleotidil Transferase

TLRS Receptor tipo Toll

TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa

xi

LISTA DE FIGURA

Figura 1............................................................................................................. PÁG. 16

Figura 2............................................................................................................. PÁG. 18

Figura 3............................................................................................................. PÁG. 20

Figura 4............................................................................................................. PÁG. 21

Figura 5............................................................................................................. PÁG. 22

Figura 6............................................................................................................. PÁG. 24

Figura 7............................................................................................................. PÁG. 25

1

1 - INTRODUÇÃO

O estudo da ontogenia em relação a produção das células de linhagem B é

importante para a compreensão de mecanismos pelos quais ocorrem diferenças

significativas da resposta do sistema imune adquirido ao longo do desenvolvimento e

envelhecimento do organismo. O repertório de linfócitos B, com sua capacidade de

resposta a infinita quantidade de antígenos externos e de auto-antígenos são também são

alvo de estudo de doenças auto-imunes, o que torna essas células foco de muitos estudos

atualmente.

Serão introduzidos alguns temas, a fim de maior compreensão sobre o a formação

da linhagem de células B e da complexidade dos mecanismos envolvidos nesse processo.

1.1 - DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B

As células-tronco hematopoéticas (HSCs) dão origem às células sangüíneas. Tais

células se originam, após o nascimento, na medula óssea. Dentre os vários progenitores de

linhagens da medula óssea, estão os progenitores linfóides comum (CLPs), que originam

as células B e T (ABBAS et al., 2008).

As células B ou linfócitos B, juntamente com os linfócitos T, são responsáveis pela

Imunidade Adquirida ou Adaptativa, resposta desenvolvida após infecção a fim de eliminá-

la, a qual é capaz de ser altamente específica em distinguir diferentes moléculas (diferentes

antígenos), mesmo aquelas que apresentem grandes semelhanças, além de possuir

Memória Imunológia, ou seja, ser capaz de se “lembrar” e dessa forma aumentar a resposta

a infecções posteriores por um mesmo microrganismo (ABBAS et al., 2008).

Os linfócitos B são as únicas células que produzem anticorpos – moléculas cuja

função é neutralização do microrganismo, promover fagocitose e a ativação do Sistema

Complemento. Até chegar ao estágio de secretar anticorpos, os linfócitos B passam por

várias etapas de diferenciação ou estágios de amadurecimento (ABBAS et al., 2008).

As etapas de diferenciação dos linfócitos B podem ser definidas pelo: (I) rearranjo

dos genes de cadeia pesada e leve da Imunoglobulina; (II) As enzimas que atuam na

recombinação e os marcadores de superfícies; (III) A fase do ciclo celular em que a célula

se encontra; (IV) A capacidade de responder a estímulos como determinadas citocinas,

mitógenos e antígenos (HAYASHI et al., 2005).

2

O rearranjo e a expressão dos genes das Imunoglobulinas (Ig), proteínas

formadoras dos receptores dos linfócitos B e/ou dos anticorpos, são os dois eventos

principais que ocorrem no processo de amadurecimento dos linfócitos B. A sobrevivência

dessas células no organismo dependerá da funcionalidade do seu receptor.

Na medula óssea as primeiras células do estágio do desenvolvimento da linhagem

B são pré-progenitoras de células B (pré-pro-B). Essa subpopulação não apresenta HSA

(Heat Stable Antigen) e BP-1, na presença do estímulo IL-7, adquirem o fenótipo B220+,

CD19+, CD43+,CD10+, c-kit+ e passam a ser denominadas células progenitoras de B (pro-

B), já expressam Igα e Igβ – proteínas transmembranas - que fazem parte do receptor de

célula B (BCR) e proteínas Vpre e λ5, que formam a cadeia leve substituta, SL (Surrogate

light chain) (HAYASHI et al., 2005). Na presença de células estromais, de IL-7 e

expressão dos genes ativadores de recombinação 1 e 2 (RAG-1 e RAG-2), ocorre o

prosseguimento para o estágio de célula B-I (pré B-I), que possui fenótipo idêntico as das

células pro-B, sendo distinguidas apenas por apresentarem rearranjo de alguns genes do

BCR, havido rearranjo produtivo (in frame), segue-se para o estágio pré-BII, realiza

rearranjo gênico a formar cadeia µ completa do BCR (MELCHERS & ROLINK, 1999).

As células pré-BII caracterizam-se por serem fenotipicamente c-kit-, CD43-, CD25+

(MELCHERS & ROLINK, 1999; ROLINK et al., 1994), expressam também o receptor pré

– antigênico (pré – BCR) formado pela cadeia µ e cadeia leve substituta. O pré – BCR

fornece sinais para a sobrevivência e proliferação das células para continuação do

desenvolvimento. Na ausência do receptor de célula pré-B (pré – BCR) as células sofrem

morte programada (ABBAS et al., 2008).

A cadeia leve devidamente rearranjada, junto com a cadeia µ e os componentes Igα

e Igβ do receptor dão origem ao receptor de células B (BCR), nesse estágio as células B

são denominadas Células B imaturas, que ainda expressam o marcador AA4 (ROLINK,

ANDERSSON & MELCHERS, 1998). A formação e a funcionalidade de tais receptores

no conhecimento de auto-antígenos são cruciais para que a célula continue seu

desenvolvimento, uma vez que ocorre reconhecimento ávido de auto-antígeno as células

podem ser eliminadas ou levadas a alterar seu receptor.

Na medula óssea as células B imaturas podem ser divididas em dois grupos: (I)

células B imaturas, caracterizadas fenotipicamente com B220low, IgMlow, IgD-; (II) células

B de transição, caracterizadas fenotipicamente com B220intern, igMhigh, IgDlow (CARSETTI

et al., 1995).

3

As células B imaturas deixam à medula óssea via artéria central e vão para o

baço, único órgão periférico que abriga células B imaturas (JANEWAY, TRAVERS et al.,

2002). Dessas células imaturas somente 30 a 50% conseguem sobreviver durante algumas

semanas (ALLMAN et al., 1993; ROLINK, ANDERSSON & MELCHERS, 1998). Essas

células no baço são denominadas células B de transição e são subdivididas em 3 grupos: (I)

T1, com fenótipo B220interm, CD21low, CD23low, IgMhigh,IgDlow; (II) T2, com fenótipo

B220high, Cd21interm/high, CD23+, IgMhigh, IgDhigh ( Lorder et al., 1999); (III) T3, com

fenótipo CD23+, IgMlow e que ainda expressam AA4.1 (ALLMAN et al., 2001).

No baço as células B completam seu amadurecimento e são capazes de responder a

antígenos estranhos, se tornando linfócitos efetores, células secretoras de anticorpos,

denominadas plasmócitos.

1.2 - SUBTIPOS DE CÉLULAS B A PARTIR DA DIFERENCIAÇÃO DOS

PROGENITORES.

Na medula óssea as células tronco hematopoéticas dão origem a maior parte das

células B, denominadas células B-2. Essas passam por uma série de seqüências, como

síntese de proteínas, receptores os quais exigidos para muitas transformações e se

comprometem com o desenvolvimento da linhagem de células B da Zona marginal e

células B Foliculares (ABBAS et al., 2008).

As células B foliculares formam a maior parte das células B chamadas de maduras,

já que apresentam co-expressão de receptores IgM e IgD de membrana e habilidade de

circular.

As células B foliculares são também denominadas células B circulantes, uma vez

que migram de um órgão linfóide para o outro e residem em compartimentos

especializados conhecidos como folículos de células B. O BAFF um ligante trófico da

família de citocinas de necrose tumoral (TNF) mantêm, em parte, as células B nesses

compartimentos (ABBAS et al., 2008).

As células B da zona marginal localizadas próximo ao seio marginal do baço,

expressam IgM e marcador de superfície CD21. Essas células parecem mediar resposta

imunológica dependentes de células T, apesar de mediarem geralmente resposta

imunológicas a antígenos circulantes independente de T, além de se diferenciarem em

plasmócitos secretores de IgM de vida curta (ABBAS et al., 2008).

4

Outro subtipo de células B são as células B-1 desenvolvidas a partir de células-

tronco hematopoéticas no fígado fetal. No adulto são encontradas como população auto-

renovavéis de células B-1 em peritônio e mucosas.

As células B-1 apresentam um repertório de diversidade menor em relação as

células B convencionais. Essas células são fontes de rápida produção de anticorpos contra

microrganismos no peritônio e análogas às células T γδ, pois possuem um repertório

limitado de receptores de antígenos e acredita-se que a resposta imunológica inicial ocorra

de forma parecida em ambas (ABBAS et al., 2008).

1.3 - DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DO LINFÓCITO B

A diferenciação de células B In Vitro, geralmente, utiliza-se células estromais da

linhagem S17 e ST2 obtidas através da clonagem dessas células em culturas de células de

medula e de fígado fetal respectivamente, alem da citocina IL-7 (NAMEN et al., 1988;

CUMANO et al., 1990; HARDY et al., 1991; ROLINK et al., 1991), que pode ser

fornecida pelas células estromais ou purificada de sobrenadante de células transfectadas

com o DNA recombinante contendo o gene para a IL-7 (NAMEN et al., 1988).

A citocina IL-7 é uma glicoproteina de 25 kDa , que tem o papel de potencializar o

crescimento dos precursores linfóides através da ligação com o receptor de IL-7 presente

nas células na fase pro-B, pre-B-I e no início da fase pre-B-II, estimula a proliferação

celular nesses estágios in vivo.

Condições em que IL-7 se encontra saturante na cultura as células nos estágios

pro/pre-B-I crescem em detrimento das outras células presentes na cultura (inclusive as

pre-B-II), e inibem a sua diferenciação para os próximos estágios (HAYASHI et al., 2005).

A cultura em fígado fetal (fetal liver organ culture-FLOC) é outro sistema de

diferenciação In Vitro, que utiliza partes de fígado fetal como suporte para o crescimento

de precursores B, e é capaz de manter um padrão de diferenciação semelhante ao obtido in

vivo (CEREDIG et al., 1998).

Reconhece-se que na medula óssea e outros órgãos linfóides primários, existe um

microambiente formado de diferentes tipos celulares do estroma que fornecem os inúmeros

fatores que atuam na diferenciação das células hematopoiéticas, “mas não se sabe, se um

único tipo celular é capaz de fornecer todos os suportes necessários na diferenciação das

5

células B, nem as fases em que essas interações com as células estromais se fazem

necessária” (HAYASHI et al., 2005).

1.4 - PAPEL DA ENZIMA RAG NO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B

Nos eventos de origem do receptor de célula B (BCR) ocorre recombinação

somática efetuada, principalmente, pela enzima Rag e alguns fatores de transcrição. Os

receptores são gerados por rearranjo em cada linfócito de genes de região variável (V),

com genes da região de diversidade (D) e/ou com genes de região de junção (J) (ABBAS et

al., 2008).

O receptor de células B (Ig) é formado por uma cadeia pesada e uma cadeia leve,

cada uma das cadeias possui uma região constante (C) e uma região variável (V). Os genes

que formam a região variável da cadeia pesada são os V, D, J e os que formam a região

variável da cadeia leve são os: V, J, e ambos contêm, logo após esses segmentos gênicos,

os segmentos que codificam suas respectivas regiões constantes.

As enzimas Rag1 e Rag 2 (recombination activating gene ou Recombination-

activating protein) possuem seus genes localizados no cromossomo 11. Essas enzimas

reconhecem a região de clivagem do DNA nas regiões entre os genes V, D e J (cadeia

pesada) e V e J (cadeia leve) por meio de seqüências de nucleotídeos. Tem por atividade

clivar os segmentos codificadores que são unidos por ligases específicas, gerando uma

seqüência codificadora capaz de ser transcrita em RNAm ( RNA mensageiro), que será

traduzido em polipeptídio nascente, o qual é processado e glicosilado, dando origem a um

polipeptídio maduro (OETTINGER et al.,1990). A junção de dois polipeptídeo, um de

cadeia pesada e outro de cadeia leve por pontes dissulfeto forma um heterodímero e a

junção de dois desses heterodímeros por pontes dissulfeto entre as duas cadeias pesadas

forma uma molécula de Imunoglobulina completa. O processamento do receptor de célula

B (BCR) pelas enzimas Rag 1 e 2 ocorre por etapas. Inicia-se na etapa de diferenciação da

linhagem de linfócitos B: Pré B-I, em que há expressão da enzima TdT (Transferase

desoxinocleotidil terminal), a qual realiza a adição de até 20 nucleotídeos, auxiliando o

mecanismo de diversidade juncional, expressão dos genes ativadores de recombinação 1 e

2 ( RAG1 e RAG 2) e rearranjo dos segmentos DJH. No estágio de precursora de célula B-

II, ocorre rearranjo entre o segmento VH e o rearranjo DJH pela atuação das Rags,

formando uma cadeia µ completa do BCR (ABBAS et al., 2008).

6

O estágio celular pré B-II pode ser dividido em 3: (I) As células estão na fase

mitótica e expressam o pré-BCR, constituído pela cadeia µ e proteínas substitutas de cadeia

leve, SL. Se o BCR for funcional ocorre sinalização para o desligamento da maquinaria

enzimática que age na recombinação somática; (II) As células deixam de expressar as SL e

voltam a expressar o RNAm das enzimas Rags; (III) nesse estágio as enzimas Rags

efetuam o rearranjo da cadeia leve. Existem dois Loci de cadeia leve қ e λ, que parece ser

rearranjados independentes um do outro, entretanto o rearranjo қ é superior ao de λ,

aumentando de 5 a 10 vezes mais as chances de se ter rearranjo қ;

A cadeia leve é definitivamente arranjada e unida a cadeia µ e aos componentes Igα

e Igβ, formando completamente o BCR e causando desativação das Rags, no estágio de

células imaturas (MELCKERS & ROLINK et al., 2000). Depois de formado o receptor as

enzimas podem ser ativadas novamente caso esse receptor faça reconhecimento de auto-

antígeno, ocasionando o “editing” do receptor (MELAMED et al., 1998).

1.5 - RECEPTORES SEMELHANTES A TOLL (TLRS)

Os receptores semelhantes a Toll fazem parte de uma família de receptores

reconhecedores de padrão. Esses receptores são encontrados em uma gama de tipos

celulares e possuem vias de tradução de sinal intracelulares que ativam várias respostas

pró-inflamatórias na célula. O receptor tipo Toll é de uma família conservada de proteínas

que desempenham funções de resposta na imunidade natural a patógenos (ABBAS et al.,

2008), mas recentemente estudos mostram que os receptores tipo Toll também estão

envolvidos no amadurecimento de linfócitos B (HAYASHI et al., 2005), esses receptores

formam uma família de 11 receptores identificados até os presentes estudos (AKIRA,

TAKEDA & KAISHO, 2001). São encontrados em superfície da membrana celular, como

os TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 e em membranas intracelulares, como os TLR3,

TLR7, TLR8, TLR9. Possuem em sua estrutura intracelular domínio de homologia ao

receptor Toll/IL-1 (TIR), importante para a interação com proteínas citoplasmáticas

responsáveis pela cascata de sinalização para os diferentes produtos da estimulação via

TLRs (JENKINS et al., 2009). Estudos indicam que essas proteínas são também

responsáveis pela variação no padrão de resposta a diferentes ligantes desses receptores

(ABBAS et al., 2008). Cada um dos TLRs tem padrão de reconhecimento molecular

característico, por exemplo os receptores intracelulares fazem o reconhecimento de

7

seqüências gênicas não próprias, enquanto os receptores da superfície celular fazem o

reconhecimento de polipeptídeos não próprios (ABBAS et al., 2008).

O TLR4 reconhece LPS bacteriano gram-negativo; mananos fúngicos, fosfolipídeos

parasitários entre outros. Esse receptor é um dos principais focos de estudos entre os

receptores tipo Toll no amadurecimento das células B, tendo em vista que seu agonista, o

LPS é capaz de ativar linfócitos B, estimulando a proliferação e secreção de anticorpo de

forma independente do receptor BCR (ANDERSSON, COUTINHO & MELCHERS,

1977; HOSHINO et al., 1999), além da maturação do mesmo, no entanto, os mecanismos

pelo qual acontece não estão bem estabelecidos.

Estudos demonstram que o LPS seria um co-estimulo para o aparecimento de

células B1, através de doses aplicadas em camundongos deficientes nesse tipo celular

(MURAKAMI et al., 1997) e também agiria de forma peculiar com proteínas ligadas ao

aparecimento do BCR que é sinal de proliferação e amadurecimento para as células B.

O melhor compreendimento da ativação e o amadurecimento de células B permitem

melhor entender o funcionamento de uma das células de defesa do sistema imune com

grande capacidade de identificar antígenos e o/os passos em que essa mesma célula pode

causar dano irreversível ao organismo quando faz reconhecimento de auto-antígenos.

Os sítios de ligação dos ligantes microbianos nos receptores tipo Toll ainda estão

sendo estudados por cristalografia de raio- X e analises de mutações.

Os receptores tipo Toll reconhecem padrões moleculares associados a patógenos

(PAMPs) e a base estrutural para a diversidade de reconhecimento à diferentes moléculas

ainda é desconhecida (ABBAS et al., 2008).

Algumas vias de sinal através de Toll induzem a dimerização do receptor.

Interações homotipicas TIR-TIR são realizadas e fazem o recrutamento de outras proteínas,

através de cascata de sinalização, que iniciam um downstream para ativar de alguns fatores

de transcrição, como: NF-қB e AP-1 estes estimulam a expressão de genes de muitas

moléculas do sistema imune, principalmente citocinas pró-inflamatórias (JENKINS et al.,

2009; JANEWAY et al., 2002).

A proteína Myd88 é uma proteína adaptadora que inicia a cascata de sinalização de

alguns receptores tipo Toll e pode ser a chave para se entender as vias de sinalização

desses receptores, entretanto outras três proteínas adaptadoras são conhecidas: Mal

(Myd88 semelhante à adaptadora) /TIRAP (proteína adaptadora contendo domínio TIR)

8

Trif (adaptadora contendo domínio TIR induzindo interferon-β) e TRAM (molécula

adaptadora relacionada com a Trif).

Estudos demonstram que os ligantes de Toll têm importante participação na

diferenciação de células B, por exemplo: O LPS (agonista de TLR4) e seqüências CpG

(agonista de TLR9) além de possuírem papel na ativação de citocinas pró-inflamatórias

também estão envolvidos na maturação e ativação das células B respectivamente

(AZULAY-DEBBY, 2007; HAYASHI et al., 2005). Contudo, pouco se sabe sobre a

expressão desses receptores e funcionamento dos mesmos no desenvolvimento dessas

células e acredita-se que a sinalização TLR e o BCR podem agir de forma sinérgica na

ativação da maturação das células B (HAYASHI et al., 2005).

1.6 - O SISTEMA IMUNOLÓGICO AO LONGO DA ONTOGENIA.

A ontogenia, formação e desenvolvimento desde a fecundação do óvulo até a morte

do indivíduo vêm sendo estudada, entre outros aspectos, para o entendimento da fisiologia

dos linfócitos B.

É reconhecido que no homem, o sistema imune neonatal tem sido considerado

pouco competente na geração de resposta imune. Seu sistema adquirido não se apresenta

bem desenvolvido e suas defesas são de origem materna, que possui vida curta. No outro

extremo da idade, o sistema imune passa a ter dificuldade de responder a patógenos aos

quais já foi exposto anteriormente, bem como a novos patógenos, levando as várias

doenças infecciosas e neoplásicas.

Em estudos com camundongos idosos saudáveis, anticorpos e respostas

imunológicas são de curta duração, e a hematopoiése da medula é restrita aos ossos

vertebral, esterno, costelas, ossos planos do crânio e pélvis e ao final dos ossos longos. Já

nos jovens existem mais ossos com medula ativa produzindo células B.

O declínio da função imunológica com o envelhecimento tem sido atribuído a

vários fatores inclusive alterações ambientais e uma falha de células senescentes

(THOMAN & WEIGLE, 1989; HODES, 1995; PROUST et al., 1996; BURNS &

GOODWIN, 1997; HODES, 1997), associado também a deficiências de células T-help

(SONG et al., 1997).

A resposta proliferativa de células B humanas purificadas do sangue periférico para

estimulação com anti-IgM, ou anti-M, com o ativador policlonal SAC, ou com MAb contra

9

CD20 ou CD40, tem sido relatada a ser reduzidas nos idosos (WHISLER et al., 1995) e a

auto-imunidade parece aumentar (GOIDL et al.; 1981; ZHAO et al., 1995), entretanto

outros estudos indicam que a resposta proliferativa se mantem com o envelhecimento e a

susceptibilidade e a capacidade de ativação de apoptose modificada (VONGTHIP &

SOUVANNAVONG et al., 1998).

A morte fisiológica celular, Apoptose desempenha importante papel na homeostase

do sistema imunológico e é fundamental seleção negativa e, por conseguinte na supressão

de células auto-reativas (GOLSTEIN et al., 1991; COHEN et al., 1992). Muitos estudos

têm sido realizados sobre a linhagem de células-T, associada ao papel do envelhecimento

de linfócitos B na susceptibilidade à apoptose, mas existem pouca informações a respeito.

A idade se reflete também na diminuição do repertório de diversidade dos linfócitos

B, no entanto, os mecanismos moleculares permanecem obscuros. Em estudos com ratos

de idade avançada observou-se declínio no RNA mensageiro das enzimas Rag1 e Rag 2

(JOSEPH et al., 2009).

Os fotores transcricionais de regulação da linfopoeise de células B, por exemplo:

E2A, EBF, e Pax-5 (ZHUANG et al., 1994; KEE et al., 2000; KEE & MURRE, 1998;

O'RIORDAN & GROSSCHEDL, 1999), estão envolvidos na regulação da mesma e podem

ser significativos em estudos de declínio do repertório de células B no envelhecimento. As

primeiras especificações de linhagem B envolvem a expressão de E2A e sua redução

resulta na inibição da linfopoeiese de células B (ZHUANG et al., 1996; KEE et al., 2000;

KEE & MURRE 1998; O'RIORDAN & GROSSCHEDL, 1999).

Uma importante função do E2A é promover a expressão das cadeias leves

substitutas e facilitar a formação do pré-célula B receptor (preBCR). Outros fatores tais

como: EBF e interferon são críticos na regulação da expressão da cadeia leve substituta.

No entanto, não se sabe que elementos influenciam a expressão de tais moléculas

reguladoras na medula e que elementos são necessários para a manutenção normal da

linfopoeise B ou para provocar linfoipoiese anormal na velhice.

Tem-se reconhecido que o microambiente da medula óssea tem importante papel na

deficiência de B linfopoiese na velhice fato sugerido pelo os estudos de Stephan

(STEPHAN et al., 1997), que têm mostrado que células estromais dentro do

microambiente da medula óssea de camundongos com idade são menos capazes de apoiar

o desenvolvimento B lineage in vitro. Em especial, Labrie (LABRIE et al., 2004)

demonstrou que a senescencia de células da medula desempenha papel importante em

10

limitar a expressão da RAG enzima e recombinação gênica nas células B precursoras.

Postula-se que deficiências nos fatores intrínsecos de células B podem contribuir para o

estado anormal da linfopoiese em organismos envelhecidos.

Experimentos indicam que células B de organismos jovens comparados com

organismos adultos são mais responsivas a estímulos, entretanto os mecanismos e as razões

pelas quais essas respostas são distintas ainda estão em estudo. Na ontogenia dessas

células, a relação dos diferentes acontecimentos de desenvolvimento com os diferentes

receptores celulares ainda não está bem esclarecida, e acredita-se que a sua compreensão

seja a chave para elucidamento das distintas respostas de células B a antígenos.

11

2 - OBJETIVO

Nosso objetivo neste projeto é avaliar os efeitos diretos e indiretos dos ligantes

dos receptores tipo Toll no desenvolvimento de linfócitos B ao longo da ontogenia,

analisando a resposta a estes ligantes na diferenciação de linfócitos B in vitro a partir de

precursores purificados de camundongos em diferentes idades.

2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1) Detectar por citometria de fluxo as diferenças fenotípicas entre as subpopulações de

linfócitos B gerados na presença ou ausência de LPS (agonista de TLR4) em

culturas de precursores purificados de medula óssea de camundongos jovens,

adultos e idosos.

2) Identificar se as diferenças dos linfócitos gerados in vitro na resposta ao LPS ao

longo da ontogenia podem ser conseqüência da influência de outras linhagens

celulares ou de propriedades intrínsecas dos linfócitos B, analisando o papel de

outras linhagens celulares em culturas mistas de precursores B purificados com

outras linhagens celulares.

12

3 - METODOLOGIA

3.1 - OBTENÇÃO DE CÉLULAS TOTAIS DA MEDULA ÓSSEA: Foram obtidos

camundongos fêmeas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, do instituto de

microbiologia, setor imunologia, da linhagem CS7BL/6J de 6 meses, 3 meses e 20 dias de

idade. A suspensão de células totais da medula óssea foi obtida, cortando-se as

extremidades do fêmur e com o auxilio de seringa tamanho 22G para os animais de 3 e 6

meses e de seringa tamanho 27,5G para animais de 20 dias contento PBS (tampão fosfato

de sódio), EDTA 2 mM com 5% de soro fetal bovino, para lavagem das células do canal

medular. As células foram separadas por idade dos camundongos em tubos tipo Falcon de

50 mL. Foram centrifugadas em 1300 rpm a 4°C por 7 minutos. Posteriormente, o

sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 5 mL de ACK, para

causar lise de hemácias, novamente centrifugação nas mesmas condições iniciais e em

seguida, o sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspendidas em 5 mL de PBS,

EDTA 2 mM com 5% de soro fetal bovino para posterior contagem celular.

3.2 - CONTAGEM CELULAR: A contagem das células viáveis foi realizada com Azul de

Tripan utilizando microscópio óptico, em Câmara de Neubauer.

3.3 - ANÁLISE DA PURIFICAÇÃO E COMPARAÇÃO DAS CÉLULAS DOS

CAMUNDONGOS: Para a verificação das subpopulações de medula e da pureza dos

precursores após a separação magnética, foram separadas alíquotas de 0,2 x 106 células de

medula dos camundongos das diferentes idades, e das amostras pós-separação magnética a

fim de observar o padrão do fenótipo celular com marcação por anticorpos acoplados a

fluorocromos por citometria de fluxo.

3.4 - SELEÇÃO DAS CÉLULAS PRECURSORAS DE LINHAGEM B (B220 + IGM-):

Foram utilizados tubo tipo Falcon para centrifugação das células de medula óssea em 1300

rpm a 4°C por 7 minutos, o sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspendidas

num volume determinado de tampão de acordo com o número de células totais recuperadas

para camundongos de diferentes idades. Foi adicionado a cada volume, anticorpo α IgM

acoplado a microbeads magnéticas (Miltenyi Biotec) para uma concentração final do

mesmo de 1:20. As células foram incubadas por 20 minutos em gelo. Após incubação as

células foram centrifugadas e ressuspendidas em 500 µL de PBS, EDTA 2 mM com 5% de

13

soro fetal bovino para serem passadas na coluna magnética seguindo o protocolo do

fabricante.

A separação das células B220+ IgM- da medula óssea por seleção negativa, foi feita

por depleção das células não marcadas com o anticorpo específico, após lavagem indicada

em protocolo.

As células obtidas posterior passagem na coluna foram centrifugadas em 1300 rpm

a 4°C por 7 minutos e ressuspendidas em meio de cultura. Em seguida realizou-se

contagem celular e posteriormente as células foram resuspendidas em volume de acordo

com o número de células totais recuperadas em cada tubo tipo Falcon (6 meses, 3meses, 20

dias) e marcadas com anticorpo α CD19 acoplado a microbeads magnéticas para

concentração final do mesmo de 1:10. As células foram incubadas por 20 minutos em

banho de gelo, centrifugadas e ressuspendidas em 10 mL, novamente centrifugadas e

passadas em coluna magnética para seleção positiva seguindo protocolo de seleção do

fabricante. As células obtidas foram centrifugadas e ressuspendidas em meio OptiMEM,

10% de soro fetal bovino, 5 ×10-5 M de 2-β- mercaptoetanol, 100 U/mL de estreptomicina

e 100 µg/mL de penicilina, centrifugadas e ressuspensas em 1mL para contagem celular e

plaqueadas.

3.5 - CULTURA DE DIFERENCIAÇÃO DE PRECURSORES DE CÉLULAS B: LPS

(Lipopolissacarídeo) foi utilizado, em diferentes concentrações e tempo de cultura, como

estímulo para maturação das células B220+ IgM-, após 3 dias de cultura das mesmas. As

concentrações de LPS utilizadas foram as seguintes: 12,5; 2,5; 0,5 µg/mL. Foram

cultivadas 0,2x106 células / 200 µL / poço (placa de 96 poços) em meio de cultura

OpitMEM suplementado como descrito acima, com os determinados estímulos em estufa

umidificada a 37°C, com CO2 a 7%.

3.6 - ANÁLISE DE CÉLULAS POR CITOMETRIA DE FLUXO (FACS): Para a análise

fenotípica das células por citometria de fluxo, foi realizada a marcação das diferentes

amostras com um “mix” de anticorpos acoplados a fluorocromos. Os anticorpos usados

foram os seguintes: CD23 PE, B220 FITC, IgM Alexa, CD23 APC, CD69 PE, IgM FITC.

Esses anticorpos foram diluídos em tampão PBS suplementado com 5% de soro fetal

bovino e azida a 0.05% para a preparação dos diferentes “mix”. As amostras foram

incubadas em volume de 30µl por 20 min. a 4 °C e lavadas com o mesmo tampão usado

14

para a incubação. Após a lavagem, as células foram ressuspendidas com o tampão para a

separação de alíquotas da amostra para a marcação das células em cultura, a fim de

observá-las em análises de citometria de fluxo.

15

4 - RESULTADOS 4.1 - CARACTERIZAÇÃO DA LINHAGEM B E ANÁLISE DA PURIFICAÇÃO DOS

PRECURSORES DE MEDULA ÓSSEA EM ANIMAIS DE DIFERENTES IDADES.

A fim de se estudar o efeito do LPS como estímulo de maturação para os linfócitos

B, via receptor tipo Toll 4, na linfopoeise de células B dos camundongos de diferentes

idades, foram realizados para obtenção e análise de maturação das células B experimentos

in vitro.

Como passo inicial do estudo, as células hematopoéticas do canal medular do fêmur

dos camundongos C57BL/6 de 20 dias, 3 meses e 6 meses foram retiradas e posteriormente

incubadas com anticorpos monoclonais anti-IgM acoplados a micro-partículas magnéticas

para depletar linfócitos B, e com anticorpos anti-CD19 acoplados a micro-partículas

magnéticas, para a obtenção dos precursores (B220 +IgM-) de células B. A analise

populacional das medulas ósseas dos animais das diferentes idades bem como a avaliação

da pureza dos precursores B purificados foi feita por citometria de fluxo (Figura 1). Na

citometria de fluxo, as células B foram visualizadas a partir da detecção da fluorescência

emitida por anticorpos acoplados a flurocromos, específicos para marcadores de superfície

característicos de diferentes estágios da linfopoiese B.

Antes da purificação, a porcentagem de precursores na medula total dos

camundongos eram de: 36%, 20% e 8,16% para camundongos de 20 dias, 3 meses e 6

meses respectivamente.Tal fato pode ser remetido ao declínio da linfopoiese B ao longo da

ontogenia já descrito em outros trabalhos (CLAIRE-ANNE SIEGRIST*, RICHARD

ASPINALL, 2009). De acordo com o experimento realizado, a porcentagem de precursores

recuperados também varia após a purificação nos camundongos de idades diferentes. Nos

camundongos de 20 dias há 97% de pureza comparada com 95% e 86% de pureza dos

camundongos de 3 e 6 meses respectivamente, ou seja, com o avanço da idade, menor

foram as porcentagens dos precursores. Dessa maneira, a diminuição de células B na

medula óssea dificulta a purificação das mesmas em meio a outras linhagens celulares

presentes na medula.

16

Figura 1: Análise da purificação das células da medula óssea.

Gráfico das Subpopulações de células B B220+ e IgM + da medula óssea total e de precursores B purificados.

Nessa análise foram utilizados camundongos de diferentes idades: 20 dias; 3 meses e 6 meses. As células da

medula óssea total foram incubadas com anti-IgM magnético, passadas na coluna para seleção negativa,

posteriormente as células depletadas foram incubadas com anticorpo anti-CD19 magnético para a seleção

positiva. Amostras de células da medula óssea total e dos precursores purificados foram incubadas com

anticorpo anti-B220 FITC e anti-IgM Alexa 647 para análise por citometria de fluxo.

4.2 - ESTUDO DA MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DE LINHAGEM B IN VITRO

As células obtidas da medula óssea dos camundongos foram colocadas em placas

de cultura contendo meio de cultura e incubadas por 3 dias para diferenciação celular. Nas

primeiras 24 horas surgem os linfócitos IgM+ e em 72 horas passam ser aproximadamente

cerca de 50% da população B220+ presente em cultura, posteriormente a esse período

ocorre aumento da mortalidade celular. Após diferenciação as células foram estimuladas a

maturação in vitro pelo mitógeno LPS.

A transição do estágio das células imaturas para células B maduras inclui mudanças

na expressão de marcadores, como menor expressão do marcador AA4.1 e expressão do

marcador CD23. Utilizamos a expressão de CD23 como leitura para avaliar o nível de

maturação in vitro. A análise do nível de expressão CD23 a partir dos linfócitos

17

estimulados com LPS, por citometria de fluxo, envolve: seleção das células nucleadas,

exclusão das células mortas, identificação das populações B220+, IgM+ e CD23 + de

células B ( Figura 2).

As células nucleadas foram selecionadas em um gráfico de tamanho (forward

scatter) e granulosidade (side scatter) por uma área de estudo previamente delimitada

(gate) que abrange as populações de macrófagos, polimorfonucleares e linfócitos (Figura

2a).

Para exclusão de células mortas foi utilizado iodeto de propideo (PI), um composto

fluorescente que se liga ao DNA e não atravessa membrana celular devido a sua baixa

lipofilicidade. Quando este atravessa a membrana plasmática é sinal que ela esta

danificada, indicando perda de viabilidade celular. O PI fluoresce em canais específicos do

citômetro de fluxo, FL-2 e FL-3, possibilitando a identificação das células marcadas com

esse composto. Normalmente as células com PI são visualizadas formando uma diagonal

na analise de citometria, e assim podem ser excluídas com a delimitação de uma gate

(Figura 2b).

Os marcadores de superfície B220, CD23 e o receptor de células B IgM

caracterizam estágios do desenvolvimento das células B. Em animal adulto três principais

subpopulações de células B são descritas na medula óssea de acordo com o padrão de

expressão de B220 e IgM (CARSETTI et al., 1995): (I) Células B imaturas B220lowIgM low,

que correspondem ao estágio mais imaturo de linfócitos B, IgM+;(II) Células B

transicionais B220interm/highIgMhigh, mais avançadas na maturação; e (III) Células B maduras

foliculares recirculantes B220highIgM low. Na Figura 2c podemos observar que o sistema de

diferenciação in vitro permite a geração de linfócitos B imaturos e transicionais, mas não

maduros.

O marcador de superfície CD23 sugere que as células B estão avançando no estágio

de maturação. Esse marcador é expresso em uma significativa parte das células

transicionais e em todas as células maduras da linhagem B.

18

Figura 2: Abordagem Usada para Análise da Maturação das Células B.

Análise das subpopulações que expressam CD23. (a) seleção das células nucleadas por citometria em gráfico

de tamanho (forward scatter) e granulosidade (side scatter); (b) Padrão de identificação de células viáveis

por fluorescência com utilização de iodeto de propídeo (PI), onde a região R7 corresponde as células viáveis;

(c) identificação das células B precursoras (B220+ IgM-, em R5), imaturas e transicionais ( B220+IgM+, em

R1); (d) identificação das células CD23+, em R8.

4.3 - DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS B IN VITRO EM RESPOSTA AO LPS EM

CAMUNDONGOS DE DIFERENTES IDADES.

No estudo presente foi utilizado sistema experimental in vitro de diferenciação de

células B com meio de cultura e adição do mitógeno LPS. Sistemas experimentais In Vitro

de diferenciação têm sido extensamente utilizados para o estudo dos processos envolvidos

no desenvolvimento da linhagem B (HARDY et al., 1991; CUMANO et al., 1990; RAY et

al., 1998; ROLINK et al., 2000).

Após 2 dias, as culturas de precursores B purificados foram estimuladas com LPS e

incubadas por mais um dia, e posteriormente recolhidas e marcadas com anticorpos anti-

B220, anti-IgM e anti-CD23, a fim de se visualizar a maturação das células B pelo agonista

de TLR4. A presença de diferentes subpopulações foi analisada por citometria utilizando a

abordagem descrita no item 4.3.

A porcentagem das subpopulações de linfócitos B que expressaram CD23 foi

analisada nos camundongos de diferentes idades (Figura 3a).

19

Figura 3 a: Análise Comparativa da Expressão de B220 e CD23 em Resposta ao LPS ao Longo da Ontogenia das Células B.

Os gráficos apresentam a porcentagem de células CD23+ dentro da população IgM+ das culturas de

precursores B de camundongos de diferentes idades: 20 dias, 3 meses e 6 meses, estimuladas por 20 horas

com LPS a 12,5 µg/mL (a direita) comparado com o controle de células não tratadas com LPS (a esquerda),

após 3 dias de cultura celular. As células forma purificadas em coluna magnética, incubadas com anticorpo

anti- B220 e anti- CD23. As amostras foram lidas no citometro de fluxo.

20

Nos camundongos jovens foi observado um aumento de 3 vezes na porcentagem de

CD23 comparado com controle. Em relação aos camundongos adultos também houve

aumento de aproximadamente de 3 vezes da porcentagem de CD23, após as células

receberem o estímulo LPS para maturação.

Os resultados demonstram que o organismo envelhecido tende a responder de

forma igual ao organismo jovem ao LPS. Em camundongos de 20 dias aumentou de 7,5%

para 21,8% a porcentagem de células B CD23+, nos camundongos de 3 meses aumentou de

5,3 para 16% e em camundongos de 6 meses aumentou de 4,2% para 11,5%, significando

que ao longo da ontogenia a resposta ao LPS se mantém. Por outro lado verificamos que a

expressão de CD23 é maior em camundongos de 20 dias em relação aos camundongos de 3

e 6 meses (Figura 3b).

Figura 3b: Análise da expressão de CD23 em camundongos de diferentes idades.

O gráfico mostra a porcentagem de CD23+ em células B de camundongos de 20 dias, 3 meses e 6 meses de

idade tratados com LPS em diferentes concentrações: 0,5µg/mL; 2,5µg/mL; 12,5µg/mL.

21

4.4 - MENOR RESPOSTA DE CÉLULAS B IN VITRO AO LPS NÃO CORRESPONDE

TOTALMENTE COM AVANÇO NA IDADE DO ANIMAL.

Ao relacionar a porcentagem de células CD23+ com o envelhecimento do animal

em um segundo experimento, foi observado que em camundongos de 3 meses a

porcentagem de CD23 em culturas estimuladas com LPS era menor em relação ao

camundongo de 6 meses (Figura 4). Observamos que esse resultado coincidiu com baixa

pureza de precursores (85%) dos animais de 3 meses, menor que na cultura de precursores

de animais de 7 meses (96%) neste caso. A influencia de outras linhagens diferentes de B

na maturação das células B poderia ser a causa pela qual houve pouca diferenciação dos

precursores das células B de camundongos de 3 meses, assim, experimentos com cultura

de células B com outras linhagens celulares foram realizados.

É presente na literatura que a linfopoiese de células B na medula parece diminuir

em virtude do envelhecimento do animal, tendo-se por outro lado um aumento de outras

linhagens celulares, entretanto, ainda não se tem confirmado como essas alterações podem

afetar a diferenciação de células B.

Figura 4: Análise do desenvolvimento das células B In Vitro.

Gráfico de coluna da diferenciação das células B em CD23+ por estimulo de LPS em camundongos de

diferentes idades. Os precursores purificados dos camundongos, após 3 dias de cultura, foram estimulados

com LPS a 12,5 µg/mL por 24 horas, a fim de observar diferenciação celular da linhagem B nos

camundongos. As células da cultura foram incubadas com anticorpo anti-B220 e anti-CD23 acoplados a

fluorocromo e analisadas por citometria.

22

4.5 - PRESENÇA DE CÉLULAS QUE NÃO PERTENCEM À LINHAGEM B INIBE A

DIFERENCIAÇÃO DOS PRECURSORES B IN VITRO.

Os precursores purificados dos camundongos de 20 dias foram utilizados para

observação da diferenciação das células B na presença do agonista LPS e de células de que

não pertencem à linhagem B.

Em cultura celular de camundongos de 20 dias foram adicionadas células de outras

linhagens presentes na medula óssea tanto dos próprios camundongos de 20 dias quanto de

camundongos de 4 meses, em diferentes tempos de estímulo e diferentes concentrações de

LPS para maturação das células B (figura 5 a e 5 b).

Após analise da cultura de células B com outras linhagens celulares foi observado

que em diferentes concentrações de LPS: 12,5 µg/mL e 0,25µg/mL na presença de

linhagens celulares diferentes de B ocorreu um declínio na porcentagem de linfócitos B

CD23+. Em 20 horas de estimulo com LPS foi observado que a porcentagem de CD23

diminui em culturas de linfócitos B com 5% e 20% de linhagens celulares diferentes de B

de camundongos de 20 dias. Com linhagens celulares diferente de B de camundongos de 4

meses, o efeito inibitório de CD23 foi mais acentuado (Figura 5a).

Em 72 horas de estímulo com LPS em diferentes concentrações na presença de

linhagens celulares não-B tanto de camundongos de 20 dias quanto de 4 meses ocorreu

diminuição na porcentagem de células B CD23+ (Figura 5b). Entretanto esse efeito pode

ser mais bem visualizado nas primeiras 20 horas de estímulos em cultura com linhagens

celulares diferentes de B de camundongos de 4 meses.

Visto que a diferenciação das células B ocorre com o agonista LPS independente da

idade dos camundongos e que na presença de outras linhagens celulares ocorre diminuição

da diferenciação das células B em CD23+, acredita-se então não ser um defeito intrínseco

dos linfócitos, mas o microambiente em que esse se encontra que influencia na maturação

dessas células B.

23

Figura 5 a: Análise da diferenciação das células B na presença de linhagem celular diferente de B em 20

horas de estímulo com LPS. Análise da maturação das células B por porcentagem de CD23 em 20 horas de estímulo com LPS. Foram

utilizadas as porcentagens de 5 % e 20% das células não B obtidas de camundongos na cultura das células B.

Células de camundongos de 20 dias foram estimuladas com LPS em diferentes concentrações: 12,5 µg e

2,5µg, após 3 dias de cultura, na presença de linhagem celular diferente de B dos próprios camundongos de

20 dias e de camundongos de 4 meses.

24

Figura 5 b: Análise da diferenciação das células B na presença de linhagem celular diferente de B em 72

horas de estímulo com LPS.

Análise da maturação das células B por porcentagem de CD23 em72 horas de estímulo com LPS. Foram

utilizadas também nesse experimento as porcentagens de 5 % e 20% das células não B obtidas de

camundongos na cultura das células B. Células de camundongos de 20 dias foram estimuladas com LPS em

diferentes concentrações: 12,5 µg e 2,5µg, após 3 dias de cultura, na presença de linhagem celular diferente

de B de camundongos de 20 dias e 4 meses.

25

5 - DISCUSSÃO

As células tronco-hematopoéticas são geralmente menos de uma por 5 x 104 células

da medula óssea (KUBY et al., 2008) e a partir dela originam-se os precursores linfóides

comum (CLPs), desses uma pequena parte se diferenciam em células B. Entretanto a

porcentagem de células B tende a diminuir ainda mais ao longo da ontogenia de um

organismo (CLAIRE-ANNE SIEGRISY* & RICHARD ASPINALL, 2009).

As células B podem se diferenciar em sistemas in vitro até o estágio de células

transicionais (CEREDIG et al., 1998), na presença de células estromais, da citocina IL-7

ou de mitógenos.

Estudos demonstraram que o LPS, agonista de TLR4, promove maturação dos

linfócitos (HAYASHI et al., 2005). Assim, in vitro, o LPS em células imaturas

(AA4 lowIgMhigh) estimula a expressão do marcador de superfície CD23, e as células que

expressam esse marcador passam para novo estágio de desenvolvimento e são chamadas

células B transicionais. No entanto, os fatores envolvidos na regulação da expressão de

CD23 em células B ainda são desconhecidos. Sabe-se que o BAFF é importante fator para

a sobrevivência e maturação dos linfócitos B no baço e é capaz de induzir as células B

transicionais a expressarem o marcador CD23 (GORELIK et al., 2004).

A capacidade de induzir a expressão de CD23 pelo LPS já foi descrita na literatura

também para linfócitos B maduros. Os linfócitos B maduros CD23+ têm os níveis de CD23

aumentados na presença de LPS e IL-4, num fenômeno chamado de superindução de CD23

(CONRAD et al., 1988). A ativação dos linfócitos B pelo LPS também já é descrita, e

ocorre de maneira semelhante à que ocorre em linfócitos B maduros.

Nossos resultados iniciais confirmaram que a linfopoiese de B tende a diminuir

com a idade do animal como descrito em literatura. As causas porque tal fato ocorre ainda

não foram esclarecidas. Assim, no presente trabalho, com camundongos de diferentes

idades, foi estudado se a maturação in vitro dos linfócitos B a partir de precursores

purificados da medula óssea, estimulada ou não por LPS, pode variar ao longo da

ontogenia, verificando o papel de outras linhagens celulares nesse processo.

Vimos que nos camundongos de 20 dias na presença de LPS ocorreu maior

diferenciação dos precursores em células CD23+ comparado com os outros camundongos

de idades adulta. Sugerindo que os linfócitos B de camundongos de 20 dias são capazes de

maior maturação em resposta ao LPS.

26

Em uma segunda avaliação do comportamento das células B da medula óssea em

resposta ao LPS, verificamos que as células B dos camundongos de 3 meses, apresentavam

menor porcentagem de CD23+ em relação as células B dos outros camundongos estudados.

Vale ressaltar que neste experimento em particular, nos animais de 3 meses a porcentagem

de precursores purificados encontrava-se menor em relação aos precursores dos animais de

7 meses, sugerindo que possíveis linhagens celulares diferentes de B poderiam estar

interferindo na maturação dos linfócitos B pelo agonista de TLR4, LPS. A influencia de

outras linhagens estaria inibindo não só a maturação dos camundongos de 3 meses, como

também dos camundongos de 7 meses, uma vez que nesses últimos também foi observado

declínio da porcentagem de CD23 comparado com camundongos jovens.

A fim se confirmar a hipótese que a inibição da maturação dos linfócitos não era

efeito intrínseco dos mesmos, mas o microambiente em que se encontravam, foi realizado

experimento com 20 e 72 horas de estímulo com LPS, na presença de linhagem diferente

de B de camundongos de 20 dias e 4 meses. A inibição da maturação pelo LPS foi

claramente visualizada na presença das linhagens não-B, confirmando a hipótese.

O efeito inibitório de linhagens não-B presentes poderia ser explicado pelos tipos de

linhagens presentes; ou as condições que se encontravam essas linhagens no

microambiente do camundongo antes de serem postas em cultura, ou ainda citocinas

liberadas por essas que estariam fazendo o efeito inibitório.

O LPS é pontencial ativador de macrófagos e outros tipos celulares da medula

óssea levando essas células a secretarem algumas citocinas, como IFN tipo I e TNF-α que

podem também inibir o desenvolvimentos de B (LIN, DONG, COOPER, 1998; UEDA et

al., 2004). Outros estudos mostram que células Natural Killer (NK), bem como presença

de certas citocinas em cultura de células B inibe o desenvolvimento dos linfócitos B

(CLAIRE-ANNE SIEGRISY* & RICHARD ASPINALL, 2009; ANNE, KING,

RICHARD* et al., 2009). Poderiam então essas mesmas células ter uma influencia na

maturação dos linfócitos? Caso tenha, em que proporções seriam capazes de inibir a

maturação? Nossos estudos demonstraram que em 5% de linhagem celular não-B presente

em cultura já é capaz de inibir a maturação dos linfócitos B.

De acordo com os resultados encontrados seria importante identificar que tipo de

linhagem celular estaria realizando o efeito inibitório da maturação dos linfócitos B e

determinar se a inibição ocorre por simples contato ou pela secreção de alguma citocina,

27

esses estudos seriam um acréscimo ao entendimento do comportamento do linfócito B em

meio a outro tipo celular na cultura, entre outros aspectos.

De fato, observamos neste trabalho que em estudos do desenvolvimento de células

B os níveis de pureza são de extrema importância, pois pequena quantidade de outras

linhagens ou citocinas podem influenciar nos resultados finais.

Os conhecimentos adquiridos por esses estudos presentes, além dos já existentes,

possibilita o estabelecimento de cultura de linfócitos B com maiores critérios, levando em

consideração a porcentagem de outras linhagens diferentes B, bem como a influencia do

LPS na maturação dos linfócitos B ao longo da ontogenia, além de refletir em

conhecimento para a imunologia básica.

28

6 - CONCLUSÃO

1) O LPS, agonista de TLR4, é capaz de induzir maturação dos linfócitos B. Resultado

observado através da leitura de CD23 como marcador de maturação.

2) Linfócitos B de camundongos jovens são em geral mais responsivas ao LPS

comparado com os linfócitos B dos camundongos adultos e idosos por

apresentarem maior nível de pureza dos precursores B.

3) Linhagens celulares diferentes de B são capazes de inibir a ação estimulatória do

LPS no desenvolvimento dos linfócitos B mesmo em porcentagens muito pequenas.

29

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• ABUL K. ABBAS, ANDREW H. LICHTMAN, SHIV PILLAI. (2008). Imunologia Celular e Molecular: Amadurecimento, ativação e Regulação dos Linfócitos. 6 ed. Rio de Janeiro. Cap 8.

• ANNE M. KING, PATRICIA KEATING, BLOMBERG, RICHARD L. RILEY (2009). NK cells in the CD19_ B220+ bone marrow fraction are increased in senescence and reduce E2A and surrogate light chain proteins in B cell precursors. Mech Ageing Dev. Jun; 130(6): 384-92. Epub 2009 Mar 24.

• ANNOEK E.C. BROERSA, JULES P.P, MEIJERINK B & JAN J. CORNELISSEN (2002). Quantification of newly developed T cells in mice by real-time quantitative PCR of T-cell receptor rearrangement excision circles. Exp Hematol. Jul; 30(7): 745-50.

• AKIRA S, TAKEDA K, KAISHO T (2001). Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol. Aug; 2(8):675-80.

• AKIRA, S. & TAKEDA, K (2004). Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. Jul; 4(7):499-511.

• ALLMAN DM, FERGUSON SE, CANCRO MP (1993). Peripheral B cell maturation. II. Heat-stable antigen (hi) splenic B cells are an immature developmental intermediate in the production of long-lived marrow-derived B cells. J Immunol. Nov 1;151(9):4431-44.

• ANDERSSON J, COUTINHO A, MELCHERS F (1977). Clonal growth and maturation to immunoglobulin secretion in vitro of every growth-inducible B lymphocyte. Cell. Jan; 10(1): 27-34.

• ANDERSSON J, COUTINHO A, MELCHERS F (1977). Frequencies of mitogen-reactive B cells in the mouse. I. Distribution in different lymphoid organs from different inbred strains of mice at different ages. J Exp Med. Jun 1; 145(6):1511-9.

• ANDERSSON J, COUTINHO A, MELCHERS F (1977). Frequencies of mitogem-reactive C cells in the mouse. II Frequencies of B cells producing antibodies which lyse sheepor horse erythrocytes and trinitrophenylates or nitroiodophenylated sheep erythrocytes. J Exp Med. Jun 1; 145(6):1520-30.

30

• ANDERSSON J, COUTINHO A, MELCHERS F (1977). Growth and maturation of single clones of normal murine T and B lymphocytes in vitro. Cold Spring Harb Symp Quant Biol; 41 Pt 1: 227-36.

• AZULAY-DEBBY H, EDRY E, MELAMED D (2007). CpG DNA stimulates autoreactive immature B cells in the bone marrow. Eur J Immunol. Jun; 37(6): 1463-75.

• BECKY ADKINS*, CLAUDE LECLERC AND STUART MARSHALL-CLARKE (2004). Neonatal Adaptative Immunity Comes of Age. Nature. Jul; 4: 553-564.

• BURNS EA, GOODWIN JS (1997). Immunodeficiency of aging. Drugs Aging.

Nov; 11(5):374-97.

• CARSETTI, R., KÖHLER, G. & LAMERS, M. C (1995). Transitional B cells are the target of negative selection in the B cell compartment. J Exp Med. Jun 1; 181(6):2129-40.

• CEREDING, R., BOEKEL, ROLINK A, MELCHERS F, ANDERSSON, J (1998).

Fetal liver organ cultures allow the proliferative expansion of pre-B receptor-expressing pre- B-II cells and the differentiation of immature and mature cells in vitro. Int. Immunol. Int Immunol. Jan; 10(1):49-59.

• CLAIRE-ANNE SIEGRIST* & RICHARD ASPINALL (2009). B-cell responses to vaccination at the extremes of age. Nat Rev Immunol. Mar; 9(3):185-94.

• COHEN JJ, DUKE RC, FADOK VA, SELLINS KS (1992). Apoptosis and programmed cell death in immunity. Annu Rev Immunol; 10:267-93.

• CONRAD, D.H., KEEGAN, KALLI KR, VAN DUSEN R, RAO M, LEVINE, A.D (1988). Superinduction of low affinity IgE receptors on murine B lymphocytes by lipopolysaccharide and IL-4. J Immunol. Aug 15; 141(4): 1091-7.

• CUMANO, A., DORSHKIND, S. & PAIGE, C. J (1990). The influence of S17 stromal cells and interleukin 7 on B cell development. Eur J Immunol. Oct; 20(10):2183-9.

• ELIZE A. HAYASHI , * SHIZUO AKIRA , ALBERTO NOBREGA2*(2005). Role of TLR in B cell Development: Signaling through TLR4 Promotes B cell Maturation and Is Inhibited by TLR2. J Immunol. Jun 1; 174(11):6639-47.

31

• GOIDL EA, MICHELIS MA, SISKIND GW, WEKSLER ME (1981 Effect of age on the induction of autoantibodies. Clin Exp Immunol. Apr; 44(1):24-30.

• GOLSTEIN P, OJCIUS DM, YOUNG JD (1991). Cell death mechanisms and the immune system. Immunol Rev. Jun; 121:29-65.

• GORELIK, L. CUTLER AH, THILL G, MIKLASZ SD, SHEA DE, AMBROSE C, BIXLER SA, SU L, SCOTT ML, KALLED SL (2004). Cutting edge: BAFF regulates CD21/CD35 and CD23 expression independent of its B cell survival funtion. J. Immunol. J Immunol. Jan 15; 172(2):762-6. Erratum in: J Immunol. Apr 1; 172(7):4646.

• HARDY, RR, CARMACK CE, SHINTON SA, KEMP JD, HAYAKAWA K (1991). Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. J Exp Med. May 1; 173(5):1213-25.

• HILLA AZULAY-DEBBY1, EFRAT EDRY1 AND DORON MELAMED (2007). CpG DNA stimulates autoreactive immature B cells in the bone marrow. Eur J Immunol. Jun; 37(6):1463-75.

• HODES RJ (1995). Molecular alterations in the aging immune system. J Exp Med. Jul 1;182(1):1-3.

• HODES RJ (1997). Aging and the immune system. Immunol Rev. Dec; 160:5-8.

• JANEWAY A, TRAVES (2002). Imunologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. 5 ed. Porto Alegre. Cap 1 e 8.

• KEE BL, QUONG MW, MURRE C (2000). E2A proteins: essential regulators at multiple stages of B-cell development. Immunol Rev. Jun; 175:138-49.

• KRISTIE A. JENKINS, ASHLEY MANSELL (2009). TIR-containing adaptors in Toll-like receptor signaling. Cytokine. Mar 3. [Epub ahead of print].

• LABRIE JE 3RD, SAH AP, GERSTEIN RM (2004). Bone marrow microenvironmental changes underlie reduced RAG-mediated recombination and B cell generation in aged mice. J Exp Med. Aug 16; 200(4): 411-23.

• LIN, * CHEN DONG,* & MAX D. COOPER* (1998). Impairment of T and B cell Development by Treatment with a Type I Interferon. J Exp Med. Jan 5; 187(1): 79-87.

32

• MELAMED D, BENSCHOP RJ, CAMBIER JC, NEMAZEE D (1998). Developmental of B linphocytes Imune Tolerance Compartimentalizes Clonal Selection from Receptor Selection. Cell. 92, 173–182, Jan 23.

• MELCHERS, F. & ROLINK, A (1999). B-lymphocyte development and biology. In Fundamental Immunology. William E. Paul (ed.), fourth ed., Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers, p. 183-224.

• NAMEN AE, NAMEN AE, LUPTON S, HJERRILD K, WIGNALL J, MOCHIZUKI DY, SCHMIERER A, MOSLEY B, MARCH CJ, URDAL D, GILLIS S (1988). Stimulation of B-cell progenitors by cloned murine interleukin-7. Nature. Jun 9; 333(6173):571-3.

• PETER C. SANDEL & JOHN G. MONROE (1999). Negative Selection of Immature B Cells by Receptor Editing or Deletion Is Determined by Site of Antigen Encounter. Immunity. Mar; 10(3): 289-99.

• PROUST JJ, PROUST JJ, QUADRI RA, ARBOGAST A, PHELOUZAT MA (1996). Molecular mechanisms of age-related lymphocyte dysfunction. Pathol Biol (Paris). Oct; 44(8): 729-36.

• RICHARD R. HARDY,1,* PAUL W. KINCADE,2 & KENNETH DORSHKIND (2007). The Protean Nature of Cells in the B Lymphocyte Lineage. Immunity. Jun; 26(6):703-14.

• ROLINK1 1, CHRISTOPH SCHANIEL11, FRITZ MELCHERS2 2 (2000). Fidelity and infidelity in commitment to B-lymphocyte lineage development. Immunol Rev. Jun; 175:104-11.

• ROLINK, A. G., WINKLER, T., MELCHERS, F. & ANDERSSON, J (2000). Precursor B cell receptor-dependent B cell proliferation and differentiation does not require the bone marrow or fetal liver environment. J Exp Med. 2000 Jan 3; 191(1): 23-32.

• OETTINGER MA, SCHATZ DG, GORKA C, BALTIMORE D (1990). RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science. Jun 22; 248(4962):1517-23.

• SONG H, PRICE PW, CERNY J (1997). Age-related changes in antibody repertoire: contribution from T cells . Immunol Rev. Dec; 160:55-62.

33

• STEPHAN RP, LILL-ELGHANIAN DA, WITTE PL (1997). Development of B cells in aged mice: decline in the ability of pro-B cells to respond to IL-7 but not to other growth factors. J Immunol. Feb 15; 158(4): 1598-609.

• THOMAS J. KINDT, RICHARD A. GOLDSBY, BARBARA A. OSBORNE (2008). Imunologia de Kuby: Células e Órgãos do Sistema Imune. 6 ed. Porto Alegre. Cap. 2.

• THOMAN ML, WEIGLE WO (1989). The cellular and subcellular bases of

immunosenescence. Adv Immunol; 46:221-61.

• SOUVANNAVONG V, LEMAIRE C, ANDRÉAU K, BROWN S, ADAM A (1998). Age-associated modulation of apoptosis and activation in murine B lymphocytes. Mech Ageing Dev. Jul 15; 103(3): 285-99.

• WINKLER, T. H., MELCHERS, F. & ROLINK, A (1995). Interleukin-3 and interleukin-7 are alternative growth factors for the same B-cell precursors in the mouse. Blood. Apr 15; 85(8): 2045-51.

• ZHAO KS, WANG YF, GUÉRET R, WEKSLER ME (1995). Deregulations of the humoral immune response in old mice. Int Immunol. Jun; 7(6): 929-34.

• ZHUANG Y, SORIANO P, WEINTRAUB H (1994). The helix-loop-helix gene E2A is required for B cell formation. Cell. Dec 2; 79(5): 875-84.