o papel dos receptores de adenosina na resposta de células ... · natural killer (nk) cells are...
TRANSCRIPT
IVE MENDES OLIVEIRA
O papel dos receptores de adenosina na resposta de células NK durante a infecção por Leishmania amazonensis
Ouro Preto 2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
O papel dos receptores de adenosina na resposta de células NK durante a infecção por Leishmania amazonensis
AUTORA: IVE MENDES OLIVEIRA ORIENTADOR: PROF. DR. LUÍS CARLOS CROCCO AFONSO CO-ORIENTADORA: DRA. AMANDA BRAGA DE FIGUEIREDO
Ouro Preto
2017
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas, área de
concentração: Imunobiologia de
Protozoários.
O41p Oliveira, Ive Mendes.
O papel dos receptores de adenosina na resposta de células NK durante a infecção por Leishmania amazonensis [manuscrito] / Ive Mendes Oliveira. - 2018.
74f.: il.: color; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Crocco Afonso. Coorientadora: Profª. Drª. Amanda Braga de Figueiredo.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Imunobiologia de Protozoários.
1. Células Killer. 2. Leishmaniose. 3. Adenosina. I. Afonso, Luis Carlos Crocco. II. Figueiredo, Amanda Braga de. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 616.993.161
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
AGRADECIMENTOS
Ao professor Luís Carlos Crocco Afonso, pela confiança depositada em
mim e por estes dois anos de grande aprendizado.
Aos colegas do Laboratório de Imunoparasitologia, pela amizade,
disponibilidade e pausas para o café. À Amanda por me ensinar tanto. Ao
Marcorélio e Leandro, por todo o apoio técnico. E, especialmente, a
Luana, Flávia e Míriam, por me ouvirem, apoiarem e me fazerem acreditar
que este sonho era possível.
Aos funcionários do NUPEB que direta ou indiretamente ajudaram na
realização deste trabalho, principalmente aos técnicos dos laboratórios
multiusuários, por toda a paciência e ajuda.
À minha família, pelo amor incondicional e por acreditarem em mim nos
momentos que nem eu mesma acreditava. Nada disso seria possível sem
vocês na minha vida. Dedico a vocês este trabalho.
Ao Leandro, pelo companheirismo, pela compreensão com as minhas
ausências e por me fazer sorrir todos os dias.
Aos meus amigos, que de longe ou de perto, sempre torceram por mim.
À Deus, que guia todos os meus passos.
ÍNDICE Agradecimentos......................................................................................................... 2
Resumo....................................................................................................................... 5
Abstract................................................................................................................... ... 7
Lista de figuras........................................................................................................... 9
Lista de tabelas........................................................................................................ 11
Lista de siglas e abreviaturas.................................................................................. 12
1. Introdução............................................................................................................ 13
1.1. Leishmaniose...................................................................................................... 13
1.2. Leishmania amazonensis.................................................................................... 16
1.3. Resposta imune frente à leishmaniose................................................................ 16
1.4. Células Natural Killer........................................................................................... 19
1.5. Resposta da célula NK frente à infecção por Leishmania................................... 20
1.6. Sinalização purinérgica e resposta imune a leishmaniose tegumentar............... 23
2. Objetivos............................................................................................................... 30
2.1. Objetivo geral...................................................................................................... 30
2.2. Objetivos específicos.......................................................................................... 30
3. Material e métodos............................................................................................... 31
3.1. Animais experimentais........................................................................................ 31
3.2. Parasitos............................................................................................................. 31
3.3. Infecção de animais experimentais..................................................................... 32
3.4. Obtenção de células dendríticas derivadas de medula óssea............................. 32
3.5. Purificação de células NK.................................................................................... 32
3.6. Co-culturas.......................................................................................................... 34
3.7. Taxa de infecção................................................................................................. 35
3.8. Cultivo e estimulação das células de linfonodo.................................................... 35
3.9. ELISA.................................................................................................................. 35
3.10. Citometria de fluxo............................................................................................. 36
3.11. Microscopia de fluorescência............................................................................ 37
3.12. Análise estatística............................................................................................. 38
4. Resultados e discussão....................................................................................... 39
4.1. A presença de L. amazonensis altera o perfil de expressão do receptor de adenosina A2a na célula NK...................................................................................... 39
4.2. A inibição do receptor A2a altera o perfil de produção de IFN-γ por células NK co-cultivadas com DC e infectadas por L. amazonensis.................................................. 42
4.3. Inibição do receptor A2a leva a diminuição da taxa de infecção de DC em co-culturas com NK e infectadas por L. amazonensis..................................................... 45
4.4. A inibição do receptor de adenosina A2a in vivo leva a um aumento do perfil pró-inflamatório da resposta imunológica com aumento da porcentagem de células NK produtoras de IFN-γ................................................................................................... 48
4.5. A inibição do receptor de adenosina A2a in vivo leva ao aumento do perfil Th1, com aumento da produção de IFN-γ por células CD4................................................ 55
5. Sumário dos resultados....................................................................................... 61
6. Conclusão............................................................................................................. 62
Referências bibliográficas...................................................................................... 63
Anexos...................................................................................................................... 74
1. Certificado de aprovação do CEUA/UFOP n° 2015/62........................................... 74
RESUMO
As células Natural Killer (NK) são importantes células efetoras na imunidade inata e
participam ativamente da resposta imune do hospedeiro contra infecções, inclusive
durante a infecção por Leishmania amazonensis. Células NK secretam IFN-γ após a
estimulação por IL-12 produzida por macrófagos e células dendríticas (DC). Esta
citocina é crucial para a eliminação de L. amazonensis por meio da ativação de
fagócitos e para o desenvolvimento de respostas adaptativas subsequentes,
especialmente do tipo Th1. O ATP liberado por células sob estresse, é capaz de
auxiliar no estabelecimento de resposta inflamatória, enquanto a adenosina, produto
da hidrólise de ATP por ecto-nucleotidases, leva as células a um estado anti-
inflamatório. L. amazonensis expressa enzimas capazes de degradar ATP extracelular
a adenosina, induzindo assim a resposta anti-inflamatória de várias células, incluindo
macrófagos, DC e possivelmente células NK. O objetivo deste estudo foi avaliar o
papel dos receptores de adenosina em células NK durante a infecção por L.
amazonensis. Para isso, avaliamos a presença dos receptores A2a e A2b de
adenosina na superfície da célula NK por microscopia de fluorescência, e observamos
que estes receptores estão presentes na superfície da célula NK, e que há o aumento
da expressão do receptor A2a na superfície celular quando a célula NK é cultivada na
presença de L. amazonensis. Além disso, DC derivadas de medula óssea de
camundongos C57BL/6 infectadas por L. amazonensis foram co-cultivadas com
células NK recém-isoladas de baço, na presença de antagonistas dos receptores A2a
e A2b, e a produção de IFN-γ foi medida por ELISA. Observamos que a inibição do
receptor A2a leva ao aumento da produção de IFN-γ e a inibição de ambos os
receptores leva à diminuição da taxa de infecção de DC presentes na co-cultura.
Analisamos, por citometria de fluxo, a produção de IFN-γ e IL-10 por células NK,
linfócitos T CD4 e linfócitos T CD8, em camundongos C57BL/6 infectados por L.
amazonensis e tratados com antagonistas dos receptores A2a e A2b e dosamos por
ELISA a produção de IFN-γ por células de linfonodos estimuladas com antígeno
particulado de Leishmania amazonensis. Mostramos que a inibição do receptor A2a
aumenta a porcentagem de células NK e linfócitos T CD4 produtoras de IFN-γ sem
haver aumento da produção de IL-10, além de levar ao aumento da produção de IFN-
γ por células de linfonodos estimuladas in vitro. Com estes resultados, podemos
concluir que o receptor de adenosina A2a, presente na célula NK, tem um papel de
grande importância na infecção por L. amazonensis e seu bloqueio leva ao aumento
da produção de citocinas pró-inflamatórias durante a infecção, tanto em modelo in
vitro, quanto in vivo.
Palavras-chave: Natural Killer, leishmaniose, adenosina.
ABSTRACT
Natural Killer (NK) cells are important effector cells in innate immunity and actively
participate in host immune responses against infections, including during Leishmania
amazonensis infection. NK cells secrete IFN-γ after stimulation by IL-12 produced by
macrophages and dendritic cells (DC). This cytokine is crucial for the elimination of L.
amazonensis through the activation of phagocytes and for the development of
subsequent adaptive responses, especially Th1 response. The ATP released by cells
under stress is able to aid in the establishment of inflammatory response, whereas
adenosine, the product of the hydrolysis of ATP by ecto-nucleotidases, leads the cells
to an anti-inflammatory state. L. amazonensis expresses enzymes capable of
degrading extracellular ATP to adenosine, thus inducing the anti-inflammatory
response of several cells, including macrophages, DC and possibly NK cells. The
objective of this study was to evaluate the role of adenosine receptors in NK cells
during L. amazonensis infection. For this, we evaluated the presence of adenosine
A2a and A2b receptors on the NK cell surface by fluorescence microscopy, and we
observed that these receptors are present on the surface of the NK cell, and that there
is increased A2a receptor expression on the cell surface when the NK cell is cultured
in the presence of L. amazonensis. In addition, marrow-derived DCs from C57BL/6
mice infected with L. amazonensis were co-cultured with newly isolated spleen NK
cells in the presence of A2a and A2b receptor antagonists, and IFN-γ production was
measured by ELISA. We observed that inhibition of the A2a receptor leads to increased
IFN-γ production and inhibition of both receptors leads to a decrease in the rate of DC
infection present in the co-culture. We analyzed, by flow cytometry, IFN-γ and IL-10
production by NK cells, CD4 T lymphocytes and CD8 T lymphocytes, in C57BL/6 mice
infected with L. amazonensis and treated with A2a and A2b receptor antagonists and
assayed for IFN-γ production by ELISA by lymph node cells stimulated with
Leishmania amazonensis particulate antigen. We have shown that A2a receptor
inhibition increases the percentage of NK cells and IFN-γ producing CD4 T
lymphocytes without increasing IL-10 production, in addition to increasing IFN-γ
production by lymph node cells stimulated in vitro. With these results, we can conclude
that the A2a adenosine receptor, present in the NK cell, plays a very important role in
L. amazonensis infection and its blockade leads to increased production of
proinflammatory cytokines during infection in the model in vitro and in vivo.
Keywords: Natural Killer, leishmaniasis, adenosine.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de vida da Leishmania........................................................................ 13
Figura 2: Metabolismo do ATP extracelular e ativação de receptores purinérgicos... 23
Figura 3: Obtenção de células NK purificadas de baço de camundongo
C57BL/6..................................................................................................................... 33
Figura 4: Expressão dos receptores A2a e A2b na célula NK de camundongos
C57BL/6 na presença de L. amazonensis.................................................................. 39
Figura 5: Teste de concentração dos inibidores dos receptores de adenosina, A2a e
A2b............................................................................................................................ 42
Figura 6: Produção de IFN-γ em co-culturas de células NK e DC durante a infecção
por L. amazonensis na presença de inibidores seletivos dos receptores de adenosina
A2a e A2b.................................................................................................................. 43
Figura 7: Taxa de infecção em co-culturas de células NK e DC durante a infecção por
L. amazonensis na presença de inibidores seletivos dos receptores de adenosina A2a
e A2b.............................................................................................. ............................ 45
Figura 8: Recrutamento de células NK para os linfonodos drenantes e sua produção
de IFN-γ após diferentes tempos de infecção por L. major e L.
amazonensis.............................................................................................................. 48
Figura 9: Quantidade de células NK e sua produção de IFN-γ no linfonodo de
camundongos C57BL/6 após um dia de infecção por L. amazonensis...................... 50
Figura 10: Produção de IL-10 por células NK no linfonodo de camundongos C57BL/6
após um dia de infecção por L. amazonensis............................................................. 51
Figura 11: Quantidade de células CD4 e sua produção de IFN-γ no linfonodo de
camundongos C57BL/6 após um dia de infecção por L. amazonensis...................... 52
Figura 12: Produção de IFN-γ em células de linfonodo de camundongos C57BL/6,
estimuladas com antígeno particulado de L. amazonensis........................................ 53
Figura 13: Quantidade de células CD4 e sua produção de IFN-γ no linfonodo de
camundongos C57BL/6 após sete dias de infecção por L. amazonensis................... 55
Figura 14: Produção de IL-10 por células CD4 no linfonodo de camundongos C57BL/6
após sete dias de infecção por L. amazonensis......................................................... 56
Figura 15: Quantidade de células CD8 e sua produção de IFN-γ e IL-10 no linfonodo
de camundongos C57BL/6 após sete dias de infecção por L. amazonensis
................................................................................................................................... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Anticorpos utilizados na realização da citometria de fluxo ......................... 36
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADA: Adenosina deaminase
ADP: Adenosina difosfato
AMP: Adenosina monofosfato
AMPc: Monofosfato cíclico de adenosina
ATP: Adenosina trifosfato
BSA: Albumina de soro bovina
BSF: Soro fetal bovino
CFSE: Éster de succinimidil-carboxifluoresceína
DAPI: 4',6-diamino-2-fenilindol
DC: Células dendríticas
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
GM-CSF: Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos
IFN: Interferon
IL: Interleucina
LPG: Lipofosfoglicano
MHC: Complexo principal de histocompatibilidade
MIP: Proteína inflamatória de macrófagos
NK: Natural Killer
PBS: Tampão fosfato-salino
PKA: Proteína quinase A
TCR: Receptor de células T
Th: T helper
TNF: Fator de necrose tumoral
UDP: Uracila difosfato
13
1. Introdução
1.1. Leishmaniose
As leishmanioses são antropozoonoses consideradas um grande problema de saúde
pública. Representam um complexo de doenças com grande variação clínica e
diversidade epidemiológica (AKHOUNDI et al, 2017). As leishmanioses estão
presentes em todos os continentes, exceto a Antártida, e são causadas por parasitos
do gênero Leishmania (BAÑULS et al, 2007).
Leishmania é um protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, parasito
intracelular obrigatório de células do sistema fagocitário mononuclear, com duas
formas principais: uma flagelada, chamada promastigota, encontrada no tubo
digestivo do inseto vetor, e outra, que não possui o flagelo visível, chamada
amastigota, observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados (GARNHAM, 1971).
O ciclo biológico do parasito começa quando uma fêmea de flebotomíneo parasitada,
faz o repasto sanguíneo em um hospedeiro vertebrado (Figura 1) (SACKS e NOBEN-
TRAUTH, 2002). No intestino do inseto vetor, as formas promastigotas passam pela
metaciclogênese, que é o processo pelo qual estas formas deixam de se reproduzir e
tornam-se infecciosas (promastigotas metacíclicas) (SACKS e PERKINS, 1984).
À medida que o inseto se alimenta, as promastigotas metacíclicas são inoculadas no
hospedeiro vertebrado através da probóscide do inseto (BAÑULS et al, 2007). Após a
inoculação, as promastigotas precisam sobreviver aos mecanismos inatos de defesa
do hospedeiro. Algumas moléculas de superfície expressas na promastigota
metacíclica, como o gp63 e o LPG, auxiliam na resistência aos mecanismos de lise
pelo sistema do complemento, além de participarem dos mecanismos de interação
com as células do hospedeiro e posterior fagocitose (SACKS e NOBEN-TRAUTH,
2002; KAMHAWI, 2006; SÉGUIN e DESCOTEAUX, 2016).
14
Figura 1: Ciclo de vida da Leishmania (Fonte: SACKS E NOBEN-TRAUTH, 2002 - Adaptada)
Quando as promastigotas metacíclicas são introduzidas na pele, encontram neste
local células do sistema imunológico. O neutrófilo é a primeira célula a migrar para o
sitio de infecção, porém estudos demostram seu papel como “cavalo de troia” durante
a infecção por leishmaniose, permitindo a continuação da infecção de uma maneira
silenciosa. Os neutrófilos infectados podem liberar parasitos melhor adaptados para
infecção e sobrevivência no interior de macrófagos e estes macrófagos podem
apresentar uma função microbicida comprometida em um ambiente em que estão
fortemente envolvidos no processo anti-inflamatório de degradação de neutrófilos
apoptóticos (ZANDBERGEN et al, 2004; AFONSO et al, 2008; PETERS et al, 2008).
Por um mecanismo ainda não totalmente esclarecido, envolvendo receptores e
ligantes em ambas superfícies, o parasito adere à superfície dos macrófagos
passando para o meio intracelular por meio de um processo de fagocitose mediada
por receptores, onde se transforma na forma amastigota e se multiplica (UENO e
WILSON, 2012).
15
Embora os macrófagos sejam células fagocitárias especializadas no combate a
agentes infecciosos, os parasitos do gênero Leishmania desenvolveram mecanismos
de defesa capazes de subverter sua capacidade microbicida, conseguindo sobreviver
neste ambiente potencialmente tóxico e multiplicar-se até a ruptura da célula, quando
são liberadas para infectar outras células do sistema mononuclear fagocitário,
propagando a infecção (BERMAN et al, 1979; SHAW, 1997).
Inicialmente, a classificação das espécies de Leishmania baseava-se em critérios
extrínsecos, tais como características clínicas e geográficas. Desde a década de
1970, critérios intrínsecos, como dados imunológicos, bioquímicos e genéticos, foram
utilizados para definir as espécies de Leishmania, estes novos dados resultaram em
um aumento maciço no número de espécies descritas. Hoje, 30 espécies são
conhecidas e aproximadamente 20 são patogênicas para humanos (AKHOUNDI et al,
2017).
A leishmaniose visceral é causada pelas espécies L. donovani ou L. infantum, no
Velho Mundo, e L. infantum, no Novo Mundo. Na leishmaniose visceral os parasitos
se disseminam por órgãos internos, como baço, fígado e medula óssea. São
geralmente assintomáticas, no entanto, podem surgir sintomas como febre, fadiga,
anorexia, perda de peso, caquexia, hepatoesplenomegalia e pancitopenia, podendo
levar à morte (CARVALHO et al, 2012).
Já as leishmanioses tegumentares, que acometem pele e mucosas, são divididas em
três grupos principais, de acordo com suas manifestações clínicas. A leishmaniose
cutânea localizada é causada pelas espécies L. tropica, L. major e L. aethiopica, no
Velho Mundo, e L. mexicana, L. amazonensis e L. braziliensis, no Novo Mundo.
Tipicamente, estas espécies causam lesões localizadas, que curam
espontaneamente. A leishmaniose cutânea difusa é causada principalmente por L.
amazonensis e caracteriza-se pela presença de diversas lesões não-ulceradas, com
alto parasitismo. A leishmaniose mucosa, causada principalmente por L. braziliensis,
é uma forma grave e desfigurante da doença, devido ao comprometimento das
mucosas do nariz, boca e garganta, provocando lesões onde são encontrados intenso
infiltrado inflamatório e escasso parasitismo (BAÑULS et al, 2007; CARVALHO et al,
2012)
16
Aparentemente, as diferentes formas clínicas estão intimamente relacionadas com a
resposta imunológica do hospedeiro, especialmente o equilíbrio entre a imunidade
celular e humoral. A natureza do patógeno, especialmente a espécie, parece ser
também um fator determinante para as diferentes formas clínicas (BAÑULS et al,
2007).
1.2. Leishmania amazonensis
No Brasil, uma das afecções dermatológicas que merece grande atenção, devido à
sua magnitude, risco de ocorrência de deformidades e envolvimento psicológico, com
reflexos no campo social e econômico, é a leishmaniose tegumentar. Esta doença
apresenta ampla distribuição com registro de casos em todas as regiões brasileiras
(BRASIL.MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
As três principais espécies existentes no Brasil, causadoras de leishmaniose
tegumentar são L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis
(BRASIL.MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007; SILVEIRA et al, 2009).
No Brasil, L. amazonensis é responsável por uma menor proporção de casos de
leishmaniose tegumentar em comparação à L. braziliensis, mas também apresenta
ampla distribuição geográfica, ocorrendo em diversos Estados brasileiros
(BRASIL.MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). Porém, a L. amazonensis está associada
a distintas manifestações clínicas em humanos, como a forma cutâneo localizada, a
cutâneo difusa e até a visceral, o que lhe confere importância clínica destacada no
Novo Mundo (SILVEIRA et al, 2009).
1.3. Resposta imune frente a leishmaniose
Os macrófagos são as principais células hospedeiras a serem parasitadas por
Leishmania (SHAW, 1997). O fato das amastigotas se encontrarem no interior de
macrófagos faz com que o controle da infecção seja dependente da resposta imune
mediada por células. A principal célula que atua na eliminação das amastigotas é o
próprio macrófago, após sua ativação por linfócitos T CD4. Nas leishmanioses, os
macrófagos são ao mesmo tempo células hospedeiras, apresentadoras de antígeno
para as células do sistema imune e efetoras para a destruição do parasito (MAUEL et
al, 1978; GREEN et al, 1991; REINER et al, 1994).
17
As células do sistema imune comunicam-se por meio da secreção de citocinas.
Linfócitos T ativam macrófagos, por meio da secreção de interferon-γ (IFN-γ),
tornando-os capazes de destruir os parasitas. Os mecanismos de eliminação das
amastigotas pelos macrófagos ativados envolvem a síntese de intermediários reativos
de oxigênio e nitrogênio, como o óxido nítrico (GREEN et al, 1991).
Os linfócitos T CD4 têm uma função central no sistema imune, promovendo respostas
adaptativas adequadas a patógenos específicos. De acordo com as citocinas que
produzem após serem estimuladas estas células podem ser divididas em diversas
classes, principalmente, T helper 1 (Th1) e T helper 2 (Th2) (MOSMANN et al, 1986).
As células Th1 têm como principal citocina produzida o IFN-γ. Em contraste, as células
Th2 produzem principalmente IL-4, IL-5 e IL-13 (ZHU et al, 2010).
Em diversos estudos realizados com espécies de Leishmania, foi proposto o
paradigma Th1/Th2, definindo-se papeis protetores (IFN-γ) e nocivos (IL-4, IL-5 e IL-
13) para diversas citocinas (SCOTT, 1991; SACKS e NOBEN-TRAUTH, 2002). O que
já está bem estabelecido é que, para o controle da infecção, é necessária a
predominância da resposta imune celular com características de tipo 1, envolvendo
linfócitos CD4 e CD8 e citocinas como IL-12, IFN-γ, TNF-α, linfotoxina e algumas
quimiocinas produzidas por macrófagos (REIS et al, 2006).
Esta resposta Th1 tem como resultado a ativação de macrófagos, tornando-os
capazes de eliminar o parasito, controlando a infecção. Dentro desta perspectiva, a
diminuição do número de parasitos leva a uma redução do estímulo da resposta imune
pelo menor aporte de antígenos, retornando o organismo a homeostase (SILVEIRA et
al, 2009).
Por muito tempo a resposta Th1 foi considerada uma resposta leishmanicida e a
resposta Th2 favoreceria o estabelecimento da infecção, porém já se sabe que apesar
do modelo Th1/Th2 ser um modelo experimental útil para estudo, a resposta à
Leishmania é muito mais complexa, variando de acordo com o modelo e a espécie do
parasita estudados (AWASTHI, 2004).
Na leishmaniose cutânea localizada, a imunidade celular está preservada. Esta
resposta é específica e bem modulada, com predominância de citocinas do tipo 1,
18
podendo evoluir à cura espontânea e boa resposta ao tratamento (SILVEIRA et al,
2004).
A leishmaniose cutânea difusa, caracterizada pela ausência de resposta celular
específica (anergia) para antígenos de Leishmania, está associada à acentuada
proliferação dos parasitos e à disseminação da infecção. No Brasil, está associada
exclusivamente à infecção causada por L. amazonensis (SILVEIRA et al, 2009).
Nesses casos, o teste cutâneo de Montenegro é caracteristicamente negativo, assim
como os testes de proliferação celular e produção de IFN-γ em culturas de células
mononucleares de sangue periférico estimuladas com antígenos de Leishmania.
Apesar da ausência de resposta celular específica os níveis de anticorpos anti-
Leishmania circulantes são altos. Ocorre uma predominância da resposta humoral em
detrimento da resposta celular. O perfil de citocinas da resposta imune nestes casos
é caracterizado por baixa produção de IFN-γ e níveis altos de IL-10 (SILVEIRA et al,
2004; SILVEIRA et al, 2009).
Já a leishmaniose mucosa, tem como agente etiológico principal a L. braziliensis. Se
caracteriza imunologicamente pela exacerbação da resposta celular e pela escassez
de parasitos (SILVEIRA et al, 2009). A resposta proliferativa e a produção de IFN-γ e
TNF-α estimuladas por antígenos de Leishmania em culturas de células
mononucleares de sangue periférico são significativamente maiores do que as
observadas na leishmaniose cutânea localizada. Esta resposta exacerbada do tipo 1
promove a destruição de grande parte dos parasitos e do tecido onde houver depósito
de partículas antigênicas, gerando as lesões características da doença (SILVEIRA et
al, 2004).
Trabalhos já demonstraram que a resposta das células T in vivo para Leishmania
amazonensis é diferente da descrita para outras espécies de Leishmania. As lesões
crônicas características da infecção por L. amazonensis em camundongos C57BL/10
são independentes da expressão de IL-4 (AFONSO e SCOTT, 1993). Além disso, a
infecção por L. amazonensis em camundongos C3H resulta em baixos níveis de
produção de IL-12 e IFN-γ por células T CD4 específicas. A infecção crônica por L.
amazonensis em camundongos C3H e C57BL/6 é persistente mesmo após a
administração de IL-12 exógena. A incapacidade da IL-12 para gerar uma resposta
imune efetiva mediada por células durante a infecção por L. amazonensis sugere que
19
o parasita pode gerar um mecanismo imunomodulador potente para evitar a morte
generalizada de parasitas e promover uma infecção crônica (JONES et al, 2002).
1.4. Células Natural Killer
As células Natural Killer (NK) foram originalmente descritas como grandes linfócitos
granulares com citotoxicidade natural contra células tumorais. As células NK foram
mais tarde reconhecidas como uma linhagem de linfócitos que tem características
próprias, com funções efetoras de citotoxicidade e produção de citocinas (VIVIER et
al, 2008). O estudo da função da célula NK na tumorigênese é focado principalmente
na sua capacidade lítica. No entanto, em doenças infecciosas, a principal função das
células NK pode ser a produção de citocinas, tais como IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-
3 (WU et al, 2017).
As NK são conhecidas por fornecer um sistema de defesa do hospedeiro durante as
fases iniciais da infecção por uma variedade de vírus, fungos, bactérias e parasitas,
sendo responsáveis por desencadear mecanismos de resistência. Estas células não
possuem receptores específicos de antígenos clonotípicos convencionais, mas são
capazes de matar espontaneamente células tumorais e células infectadas que têm
uma diminuição na expressão de uma ou mais moléculas do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) e/ou expressam certos antígenos de estresse na sua
superfície (VANCE et al, 1998). As células NK também reconhecem ligantes de
receptores do tipo Toll. A exposição in vitro de células NK a ligantes de receptores do
tipo Toll induz a produção de IFN-γ e aumenta a sua citotoxicidade. Elas também
expressam receptor Fc de baixa afinidade, permitindo-lhes detectar células alvo
revestidas com anticorpos e exercer citotoxicidade celular dependente de anticorpos
(LANIER, 2005). As células NK também demonstram um papel importante durante a
gravidez, a autoimunidade e a inflamação dos tecidos (SHI et al., 2000; MOFFETT-
KING, 2002; HOMANN et al., 2002).
Consistente com a sua função como sentinelas inatas, as células NK são amplamente
distribuídas em todos os tecidos linfoides e não linfoides. Na maioria dos tecidos, as
células NK representam uma fração pequena dos linfócitos totais (cerca de 2% em
baço de camundongos, por exemplo). O turnover de células NK humanas no sangue
é de cerca de 2 semanas, consistente com os dados em camundongos (VIVIER et al,
2008; WU et al, 2017).
20
A intensidade e a qualidade das respostas citotóxicas e das citocinas das células NK
dependem do microambiente de citocinas, bem como das interações com outras
células do sistema imunológico, como células T, células dendríticas (DC) e
macrófagos. IFN-γ, IL-12, IL-18 e IL-15 são potentes ativadores da função efetora de
células NK. Também é bem conhecido que a IL-2 promove a proliferação de células
NK, a citotoxicidade e a secreção de citocinas (FEHNIGER et al, 2003; LUCAS et al,
2007). A função das células NK pode ser regulada pelo Fator de transformação do
crescimento beta (TGF-β) e por células T reguladoras através de um mecanismo
dependente de TGF- β em humanos e camundongos (SMYTH et al, 2006).
Estudos recentes demonstraram que as células NK podem adquirir memória
imunológica de maneira semelhante aos linfócitos T e B, sendo importantes,
principalmente, para o combate a infeções virais (SULLIVAN et al. 2015).
O reconhecimento da célula alvo e a estimulação por citocinas são os dois principais
mecanismos efetores das células NK. Avanços consideráveis foram feitos na
compreensão dos receptores que ativam e inibem as células NK, levando à regulação
da sua produção de citocinas e atividade citolítica (LANIER, 2005; MAROOF et al,
2008).
1.5. Resposta da célula NK frente à infecção por Leishmania
O papel das citocinas durante a infecção por Leishmania tem sido claramente
demonstrado em modelo murino de leishmaniose cutânea, em que uma única
administração de anticorpos anti-IFN-γ antes da infecção por L. major aumenta a
susceptibilidade e inibe o desenvolvimento de células Th1. Além disso, a inoculação
de parasitas na presença de IFN-γ altera o padrão de citocinas presentes no início da
infecção, em camundongos BALB/c que são naturalmente suscetíveis a doença,
alterando a formação do perfil Th2, e gerando um perfil Th1. É importante considerar
que as alterações no padrão de citocinas, após o tratamento com anti-IFN-γ ou IFN-
γ, são evidentes após 3 dias da infecção, sugerindo que o ambiente de citocinas no
momento da apresentação de antígeno é crítica para o desenvolvimento do
subconjunto de células T helper (SCHARTON e SCOTT, 1993).
Existem duas fontes principais de IFN-γ durante uma infecção: linfócitos T CD4 e
células NK. No entanto, enquanto as células T produzem IFN-γ tardiamente, as células
21
NK agem na produção precoce de IFN-γ após infecção bacteriana, protozoária e viral
em camundongos (SCHARTON e SCOTT, 1993; COOK et al, 2014; HAMILTON et al,
2016). Uma vez que as células NK são importantes na produção de IFN-γ e
influenciam o desenvolvimento de Th1, elas podem desempenhar um papel na
resistência e susceptibilidade à infecção por Leishmania (SCHARTON e SCOTT,
1993; AWASTHI et al, 2004).
As células NK participam da resposta imune inata contra a infecção por Leishmania,
mas o papel exato dessas células na defesa do hospedeiro ainda é uma questão em
discussão. Como já foi dito, essas células são uma importante fonte de IFN-γ com o
potencial de ativar mecanismos leishmanicidas em macrófagos infectados e
desencadear resposta do tipo 1 (SCHARTON e SCOTT, 1993; ARANHA et al, 2005).
Há também relatos que sugerem um papel direto das células NK no controle do
número de parasitas e no tamanho da lesão na leishmaniose cutânea experimental
(LAURENTI et al, 1999). Porém, poucos estudos discutem o papel das células NK no
controle da doença (ARANHA et al, 2005).
Já foi demonstrado que as células NK induzem a resposta protetora precoce mediada
por IFN-γ em camundongos C3H/HeN resistentes a infecção por L. major e possuem
atividade diminuída em camundongos BALB/c suscetíveis, sugerindo o possível papel
das células NK em resistência ou susceptibilidade do hospedeiro. Além disso, uma
marcada exacerbação da infecção foi encontrada em camudongos C57BL/6 com
células NK depletadas nas primeiras duas semanas de infecção, com menor produção
de IFN-γ (SCHARTON e SCOTT, 1993). Tratamento com poli I:C para ativar a célula
NK in vivo em camundongos BALB/c, que são suscetíveis a infecção por L. major,
levou a sintomas mais leves e a uma carga parasitária significativamente menor no
início da infecção, além de induzir à maior produção de IFN-γ (AWASTHI et al, 2004).
Foi visto ainda que o papel protetor da célula NK em camundongos C57BL/6,
resistentes a doença, foi perdido ao se neutralizar a IL-12 do meio (SCHARTON-
KERSTEN et al, 1995).
A depleção de células NK ou a neutralização de IFN-γ em camundongos C57BL/6
antes da infecção levaram a uma rápida dispersão de parasitas com cinética
semelhante à observada em animais suscetíveis (LASKAY et al, 1995). Todas essas
observações sugeriram que células NK são participantes ativos na fase não específica
22
ou fase celular pré-T da imunidade contra a infecção por Leishmania e no controle da
multiplicação parasitária no início da infecção em camundongos (AWASTHI et al,
2004).
Dados evidenciaram a capacidade das células NK in vitro de eliminarem
promastigotas de Leishmania (ARANHA et al, 2005; LIEKE et al., 2011). A incubação
de células NK com promastigotas de Leishmania leva também a um impacto drástico
na expressão de certos receptores de superfície na célula NK, como CD16, enquanto
outros permanecem inalterados, como NKG2D. Além disso, células NK co-cultivadas
com promastigotas de Leishmania exibiram uma diminuição da sua atividade citolítica
geral em comparação com células NK não expostas, uma inibição que não depende
da perda de expressão de receptores (LIEKE et al., 2008). Esses resultados
confirmam a habilidade das células NK para matar promastigotas de Leishmania antes
que estes parasitas sejam fagocitados (LIEKE et al., 2008).
A IL-12 estimula células NK a produzirem IFN-γ e pode, desta forma, ajudar a ativar
macrófagos infectados durante fases iniciais da infecção. Camundongos susceptíveis
à Leishmania produzem baixas quantidades de IL-12, enquanto os resistentes
produzem quantidades maiores desta citocina. A administração de IL-12 a
camundongos susceptíveis conduz a uma redução na carga de parasitas, ao aumento
da produção de IFN-γ e à redução da produção de IL-4. Além disso, a administração
de anticorpo anti-IL-12 conduz a um aumento da carga parasitária, mesmo em
camundongos resistentes, presumivelmente através de uma redução na produção de
IFN-γ. Assim, as células NK podem ser um componente crucial para impulsionar a
resposta imune celular do tipo Th1, por meio da secreção de IFN-γ em resposta à
produção de IL-12 (SYPEK et al, 1993; AFONSO et al, 1994; ARANHA et al, 2005).
As células NK podem também ser ativadas após a ligação de receptores do tipo Toll
2 ao lipofosfoglicano (LPG) de Leishmania (FERNÁNDEZ-FIGUEROA et al, 2016).
Já está claro que a geração de imunidade protetora de longa duração contra uma
infecção requer interações coordenadas entre respostas imunes inatas e adaptativas
e entre as DC e células NK, dois componentes principais no sistema imunológico inato
(FEHNIGER et al, 2003). As interações entre DC e células NK podem resultar em
ativação celular, maturação e produção de citocinas por ambos os tipos de células,
esta cooperação desempenha um papel crítico nas defesas iniciais contra câncer e
23
infecções virais. A ativação de DC por células NK pode ocorrer tanto através do
contato celular quanto através de fatores solúveis. O papel da interação entre DC-NK
na infecção por Leishmania permanece pouco compreendido, embora estudos
sugiram a participação de células NK no controle da infecção em humanos e em
modelo murino (SANABRIA et al, 2008).
Em humanos, uma inibição importante da célula NK com expressão reduzida de genes
que levam a produção de TNF-α, IFN-γ e receptores do tipo Toll 2 já foi identificada
em pacientes com leishmaniose cutânea difusa infectados por L. mexicana. Foi visto
também que genes importantes envolvidos na resposta imune inata à leishmaniose
são regulados negativamente em células NK de pacientes com leishmaniose cutânea
difusa, particularmente receptores do tipo Toll. Esta regulação mostrou-se
independente de LPG (FERNÁNDEZ-FIGUEROA et al, 2016).
1.6. Sinalização purinérgica e resposta imune a leishmaniose tegumentar
ATP e outros nucleotídeos e nucleosídeos são encontrados em todos os sistemas de
órgãos de animais onde produzem efeitos tanto por mecanismos intracelulares quanto
extracelulares. O ATP intracelular é utilizado principalmente para impulsionar
processos que requerem energia, como transporte ativo, motilidade celular e
biossíntese, enquanto o ATP extracelular é considerado uma molécula de sinalização
poderosa (YEGUTKIN, 2008).
24
Figura 2: Metabolismo do ATP extracelular e ativação de receptores purinérgicos. Dano celular e
morte podem levar a liberação de ATP pela célula (1). O ATP extracelular estimula receptores P2X e
P2Y (2). O ATP extracelular é hidrolisado até AMP pela CD39 (3) e o AMP hidrolisado até adenosina
pela CD73 (4). A adenosina estimula os receptores do tipo P1 (5). A adenosina é neutralizada a inosina
pela enzima adenosina deaminase (ADA) (6). A adenosina e a inosina podem ser recicladas a partir da
captação por transportadores (7). (Fonte: FERRARI et al, 2015 – Adaptada)
O ATP pode ser liberado para o meio extracelular de vários modos, um deles é dano
celular e morte. Células necróticas e apoptóticas liberam ATP e outros nucleotídeos
que, assim, constituem "sinais de perigo" ou padrão molecular associado a dano
(DAMP). O ATP também pode ser liberado por estimulação mecânica, hipoxia ou
invasão de patógenos, mesmo na ausência de morte celular (BURNSTOCK e
BOEYNAEMS, 2014).
Uma vez nos fluidos extracelulares, os nucleotídeos são rapidamente degradados por
uma variedade de ectonucleotidases. Ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolases
(ENTPDases) como o CD39 degradam ATP em adenosina 5'-difosfato (ADP) e ADP
em adenosina monofosfato (AMP), e 5'-nucleotidase/CD73 converte AMP em
adenosina. Os receptores para nucleotídeos extracelulares e seus produtos de
degradação, como a adenosina, foram caracterizados progressivamente. A
subdivisão de receptores purinérgicos entre P1 (adenosina) e P2 (ATP, ADP) foi
proposta por Burnstock em 1978. Uma subdivisão adicional dos receptores P2 entre
P2Y e P2X foi feita em 1985 (BURNSTOCK, 2007).
(1)
(2)
(3)
(5)
(6)
(7)
(4)
25
A adenosina se acumula em resposta a inflamação e isquemia. Existem vários meios
pelos quais a adenosina é produzida, começando pelo metabolismo do ATP, ADP e
AMP intracelulares pela ação de nucleotidases citoplasmáticas. Em segundo lugar,
ela pode ser gerada por adenosil homocisteinase. Finalmente, a adenosina pode ser
gerada extracelularmente a partir de ATP, ADP e AMP através da ação combinada de
ecto-nucleotidases. As concentrações de adenosina também são influenciadas pela
adenosina desaminase (ADA), uma enzima da via de resgate de purina que degrada
a adenosina à inosina, e à adenosina quinase, que fosforila a adenosina ao AMP
(ERNST et al, 2010).
A adenosina se liga à receptores P1 para exercer as suas funções. Existem quatro
subtipos de receptores de adenosina conhecidos e que são codificados por genes
separados. O receptor A2a é um receptor acoplado à proteína Gs de alta afinidade
que estimula diretamente a adenilato ciclase, aumentando os níveis intracelulares de
AMPc. Os eventos intracelulares que ocorrem em seguida a esta estimulação incluem
a ativação de sensores de AMPc, como a proteína quinase dependente de AMPc
(PKA). O receptor A2a é expresso por diferentes células inflamatórias, incluindo
neutrófilos, células apresentadoras de antígenos e células T e B e, em geral, confere
um perfil anti-inflamatório, sendo os mais expressos nas células do sistema
imunológico (DRYGIANNAKIS et al, 2011).
O A2b é um receptor de baixa afinidade que parece estar ausente nas células T
periféricas e mucosas. Este receptor pode ser acoplado a duas proteínas G diferentes:
Gs e Gq. A proteina Gs ativa a adenilato ciclase, levando a formação de AMPc e a
proteina Gq, que ativa a enzima fosfolipase C, levando a formação de outros segundos
mensageiros. O A2b é o subtipo mais proeminente em células dendríticas após a
maturação in vitro usando GM-CSF e IL-4, mas a expressão de subtipos de receptores
de adenosina é modificada por vários fatores, incluindo o estimulo por LPS
(DRYGIANNAKIS et al, 2011).
Os outros dois receptores do tipo P1 são chamados de A1 e A3, e estão geralmente
associados a regulação dos receptores A2a e A2b (CEKIC e LINDEN, 2016).
Os nucleotídeos extracelulares e a adenosina exercem uma variedade de efeitos em
subconjuntos distintos de células imunes. Essas ações podem ser tanto
estimuladoras, associadas ao ATP, quanto inibidoras, causadas pela adenosina. Isso
26
é consistente com o papel do ATP como sinal de perigo, estimulando a resposta imune
após lesão, mas modula essa resposta quando ela se torna excessiva, através da
formação de adenosina (BURNSTOCK e BOEYNAEMS, 2014; CEKIC e LINDEN,
2016).
O ATP age nos neutrófilos aumentando a sua atração por sinais quimiotácticos
através do receptor P2Y2, e a adenosina, age através de receptores A3 desta célula,
estimulando a sua migração. Além disso, o ATP e a adenosina têm efeitos opostos na
produção de espécies reativas de oxigênio nos neutrófilos, o ATP leva ao aumento da
produção de ROS em neutrófilos, enquanto a adenosina leva a inibição da produção.
O receptor P2Y2 também está envolvido no recrutamento de eosinófilos no pulmão
durante a inflamação alérgica (CHEN et al, 2004; GRASSI, 2010).
O ATP liberado de células apoptóticas constitui um sinal de perigo que atrai monócitos
e macrófagos, uma ação mediada pelo receptor P2Y2. Através do receptor P2X7, o
ATP estimula a ativação do inflamasomo NLRP3 e a secreção de IL-1β por
macrófagos, estimulando sua ativação e podendo levar a sua apoptose (PETROVSKI
et al, 2011). O ADP que atua no receptor P2Y12 estimulando a migração de
macrófagos e o UDP que atua no receptor P2Y6 estimulando sua atividade fagocítica.
ADP e UDP têm, portanto, uma ação complementar de “find-me” e “eat-me”,
respectivamente, envolvendo uma cooperação entre dois diferentes subtipos de
receptores P2Y (HASKÓ e PACHER, 2012; BURNSTOCK e BOEYNAEMS, 2014;
CEKIC e LINDEN, 2016). Já a adenosina tem um papel anti-inflamatório nos
macrófagos, agindo no receptor A2a e levando a diminuição da liberação de TNF-α
(EZEAMUZIE e KHAN, 2007).
O ATP pode exercer um efeito estimulador nas DC por meio da ativação do receptor
P2X7. Mas também pode ativar o receptor P2Y11 que leva a um estado de semi-
maturação caracterizado pela regulação positiva de moléculas co-estimuladoras e
pela inibição de IL-12, o que prejudica a resposta Th1 e favorece a tolerância ou uma
resposta Th2. O equilíbrio entre esses efeitos opostos de sinalização purinérgica
depende da quantidade de ATP liberada e o tempo de exposição da célula (FERRARI
et al, 2007; BURNSTOCK e BOEYNAEMS, 2014; CEKIC e LINDEN, 2016). A
adenosina exerce efeitos complexos em DC prejudicando a polarização Th1 e
27
favorecendo Th2 (CHARLLIER et al, 2011), mas também favorece o desenvolvimento
de células Th17 (WILSON et al, 2011).
A liberação de ATP através de canais de pannexina ou exocitose vesicular amplifica
de forma autócrina a ativação mediada por TCR de linfócitos T. Esta amplificação é
mediada pelos receptores P2X1, P2X4 e P2X7. Por outro lado, as células Treg
expressam uma grande quantidade de ectonucleotidases CD39 e CD73 que
sequencialmente convertem ATP em AMP e adenosina, que se liga aos receptores
A2a em células T efetoras e suprimem sua função (GESSI et al, 2007; BURNSTOCK
e BOEYNAEMS, 2014; CEKIC e LINDEN, 2016).
Priebe e colaboradores (1990), demonstraram a ação de análogos de adenosina na
modulação da resposta de células NK tanto em modelo humano quanto murino, e
suspeitaram, mesmo sem haver a demonstração da presença dos receptores de
adenosina na superfície da célula NK, que esta ação seria mediada por receptores A1
e A2, levando ao seu estímulo e inibição, respectivamente. Esta suposição se dava
ao fato de que conseguiam imitar o efeito dos análogos de adenosina com agonistas
destes receptores e bloquear parcialmente este efeito com o uso de inibidores.
Estudos mostraram um papel central para os receptores A2a no efeito inibitório da
adenosina na atividade citotóxica das células NK (RASKOVALOVA et al, 2005). A
ativação desse subtipo de receptor resultou na inibição da lise mediada por perforina
e ligante CD95 (CD95L, também conhecida como FASL) de células tumorais por
células NK e na supressão da produção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-γ,
IL-2, TNF; fatores de crescimento, como o GM-CSF e proteína inflamatória de
macrófagos (MIP)-1α (LOKSHIN et al, 2006). Foi demonstrado que a adenosina inibe
a função das células NK interferindo no processo de exocitose dos grânulos e
reduzindo a capacidade das células NK para aderir à células neoplásicas via
receptores A2a (ANTONIOLI et al, 2013).
Devido à sua incapacidade de realizar a síntese “de novo” de purinas, os parasitas do
gênero Leishmania precisam obter purinas extracelulares para alimentar a via de
salvação de purinas para a síntese de nucleotídeos. Isto é conseguido através da ação
de enzimas extracelulares, entre elas, a ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-
NTPDase ou apirase) que hidrolisará ATP para ADP e depois para AMP e 5’-
nucleotidase monofosfato fosfohidrolase (5’-nucleotidase ou 5’- NT), que produz
28
adenosina, removendo o grupo fosfato da AMP. A adenosina é então internalizada
através de transportadores específicos (PERES-SAMPAIO et al, 2001; LANDFEAR et
al, 2004; PINHEIRO et al, 2006).
Vários fatores de virulência foram associados ao estabelecimento da infecção por
Leishmania, incluindo LPG, gp63 e outras proteases. Esses fatores estão envolvidos
no estabelecimento do parasitismo intracelular, bem como na inibição da resposta
imune do hospedeiro (CHANG e MCGWIRE, 2002). Os componentes da via do
metabolismo do ATP extracelular são candidatos emergentes para determinar a
virulência desses parasitas, uma vez que o ATP e a adenosina, são capazes de
influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, consequentemente, o
estabelecimento do parasita (DE SOUZA et al, 2010; GUIMARÃES-COSTA et al,
2014; CEKIC e LINDEN, 2016).
A ação combinada das ecto-nucleotidases das promastigotas pode contribuir para o
atraso na resposta imune, tanto pela diminuição da concentração extracelular de ATP
quanto pelo aumento dos níveis de adenosina extracelular. Demonstrou-se que a
hidrólise de ATP e ADP extracelular por ecto-NTPDases reduz a concentração desses
nucleotídeos diminuindo a ativação de receptores P2 que são estimuladores
importantes do sistema imunológico. Além disso, o aumento subsequente na
concentração de adenosina pode aumentar a estimulação dos receptores P1,
especialmente os receptores A2a e A2b, o que gera uma resposta imunossupressora
(MARQUES-DA-SILVA et al, 2008; GOMES et al, 2015).
Estudos sugerem que a adenosina tem um papel importante durante a infecção por
Leishmania. A inoculação de adenosina em conjunto com promastigotas de L.
braziliensis causa aumento do tamanho da lesão e parasitismo e também atraso na
resolução da lesão (MARQUES-DA-SILVA et al, 2008). Além disso, a adição de
adenosina ao meio de cultura de promastigotas de L. amazonensis diminui a atividade
ecto-nucleotidásica do parasita que se correlaciona com a diminuição do tamanho da
lesão e parasitismo (DE SOUZA et al, 2010).
Já foi demonstrado que as promastigotas de L. amazonensis apresentam uma
atividade ecto-nucleotidásica que se correlaciona com a virulência da espécie (MAIOLI
et al, 2004; MARQUES-DA-SILVA et al, 2008). Além disso, L. amazonensis leva ao
aumento da expressão de CD39 e CD73 na superfície de DC, e controla tanto a sua
29
maturação como sua produção de citocinas (FIGUEIREDO et al, 2012; FIGUEIREDO
et al, 2017).
A L. amazonensis é capaz de induzir uma supressão da resposta imune em animais
infectados (JONES et al, 2002). O aumento da concentração de ATP extracelular,
causado por danos aos tecidos, induz a produção de citocinas inflamatórias, como IL-
12 e TNF-α. Para evitar uma reação inflamatória excessiva, as células de vários
tecidos possuem ecto-enzimas capazes de degradar os nucleotídeos de adenosina,
como CD39 e CD73. CD39 hidroliza ATP via ADP em AMP, que é então convertido
em adenosina por CD73. A adenosina, ao contrário do ATP, demonstrou diminuir a
produção de citocinas inflamatórias e aumentar a liberação de IL-10 por macrófagos
(GODING E HOWARD, 1998). É possível então, que L. amazonensis use este
aumento da produção de adenosina no meio extracelular como mecanismo de
modulação da resposta imunológica, favorecendo assim o estabelecimento da
infecção.
Considerando que a L. amazonensis possui a capacidade de aumentar a expressão
de enzimas que degradam o ATP à adenosina nas DC, aumentando assim a sua
concentração no organismo durante a infecção, nossa hipótese é que esta adenosina
estaria agindo nos receptores A2a das células NK, sendo assim um possível
mecanismo de inibição do sistema imune por este parasito.
30
2. Objetivo
2.1. Objetivo geral
Avaliar o papel dos receptores de adenosina A2a e A2b na resposta de células NK
durante a infecção por L. amazonensis.
2.2. Objetivos específicos:
Avaliar a expressão dos receptores de adenosina em células NK durante a infecção
por L. amazonensis.
Avaliar o papel de receptores de adenosina de células NK na produção de citocinas e
parasitismo em DC infectadas por L. amazonensis in vitro.
Avaliar o papel de receptores de adenosina de células NK em relação ao acúmulo
dessas células e produção de citocinas em linfonodos de camundongos C57BL/6
infectados por L. amazonensis.
Avaliar o papel de receptores de adenosina de células NK na diferenciação de células
Th1 em camundongos C57BL/6 infectados por L. amazonensis.
31
3. Material e métodos
3.1. Animais experimentais
Camundongos C57BL/6 com idade média entre quatro e oito semanas, foram obtidos
do Centro de Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto, onde receberam
água e alimentação ad libidum. Todos os procedimentos aos quais os animais foram
submetidos foram aprovados pela Comissão de ética no uso de animais da UFOP,
registrado sob o número de protocolo 2015/62 (Anexo 1).
3.2. Parasitos
Promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, cepa PH8
(IFLA/BR/67/PH8) foram cultivadas a 25 °C, em meio Grace (Sigma Aldrich Inc, St.
Louis, MO, USA) suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB – LGC
Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil), 2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich Inc) e 100 U/mL
de penicilina, pH 6,5. Promastigotas metacíclicas foram obtidas utilizando-se o
protocolo descrito por Späth e Beverley (2001) e adaptado e modificado por Marques-
da-Silva e cols (2008). As culturas foram lavadas duas vezes com salina tamponada
com fosfato (PBS) por meio de centrifugação a 1540 x g, a 4°C, por 10 min, foram
então ressuspendidas em DMEM (Sigma Aldrich Inc), pH 7.2, e distribuídas em tubos
de fundo cônico. Sob esta suspensão foi adicionado 2mL de Ficoll 10% (Sigma
Aldrich) e o gradiente formado foi centrifugado a 1070 x g, a 25°C, por 15 min. O
sobrenadante enriquecido de formas promastigotas metacíclicas foi coletado e
novamente lavado duas vezes com PBS.
Para os experimentos in vitro de co-cultura as formas promastigotas metacíclicas
foram ressuspendidas em meio RPMI1640 (Sigma Aldrich) suplementado com 10 %
de soro fetal bovino (SFB – LGC Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil), 2 mM de L-
glutamina (Sigma Aldrich), 100 U/mL de penicilina e β-mercaptoetanol (Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Suécia) 50μM, pH 7,2. Para os experimentos de microscopia de
fluorescência as promastigotas metacíclicas foram ressuspendidas em PBS/ 5% SFB,
pH7,2, e incubadas com éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE - Sigma
Aldrich), 5μM, a 37°C, por 10min, ao abrigo da luz. Após o tempo de marcação os
parasitas foram lavados duas vezes com PBS.
32
3.3. Infecção de animais experimentais
Camundongos C57BL/6 foram inoculados em ambas as orelhas, por via intradérmica,
com 1 x 103 promastigotas metacíclicas de L. amazonensis suspensas em PBS, pH
7,2, em um volume de 10 μL por orelha. Os animais haviam sido tratados, uma hora
antes do inóculo, por via intraperitoneal, com soluções dos inibidores dos receptores
de adenosina SCH 58261 (Sigma Aldrich), inibidor do receptor A2a, PSB1115 (Sigma
Aldrich), inibidor do receptor A2b, ambos ou com o veículo utilizado (PBS 2% DMSO).
Após um, três ou sete dias animais foram eutanasiados para a retirada dos linfonodos
drenantes da orelha. Foram utilizados quatro animais por grupo experimental.
3.4. Obtenção de DC derivadas de medula óssea
As DC foram diferenciadas a partir de células da medula óssea, como previamente
descrito (LUTZ et al., 1999). Fêmures e tíbias de camundongo C57BL/6 foram
retirados e os ossos foram imersos em álcool 70°GL por 2 minutos. Após este tempo,
os ossos foram imersos em PBS / 5% SFB, pH 7,2. Cortaram-se as duas epífises e 5
mL de PBS / 5% SFB, pH 7,2, foi injetado pela extremidade para a retirada da medula.
A suspensão de células foi homogeneizada e centrifugada a 210 x g / 4°C por 10
minutos. As células foram ressuspendidas em meio RPMI-1640 (SigmaAldrich)
suplementado com 10% de SFB, L-glutamina 2 mM, penicilina G 100 U/mL e β-
mercaptoetanol (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) 50 µM, pH 7,2. A
concentração de células foi ajustada para 3 x 105 células/mL, e as células foram
colocadas em placas de Petri e incubadas a 37°C / 5% CO2. O GM-CSF (ImmunoTools
GmbH, Germany) foi adicionado a cada placa nos dias 0, 3, 6 e 8, a uma concentração
de 4 ng/mL. No 9° dia as células não aderentes foram coletadas.
3.5. Purificação de células NK
Camundongos C56BL/6 foram eutanasiados por deslocamento cervical e
mergulhados em álcool 70°GL. Os baços foram retirados e colocados em tubo de
fundo cônico de 15 mL contendo cerca de 2mL de meio de lavagem e mantidos em
gelo. Os baços foram macerados com auxílio de macerador de vidro. As células foram
centrifugadas a 210 x g / 4°C por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi
ressuspendido em 5 mL de solução de lise composta por 10mM 2-Amino-2-
(hydroxymethyl)-1,3-propanediol / 140mM Cloreto de amônio por 2 minutos e em
33
seguida lavado com meio de lavagem. A separação das células Natural Killer foi então
realizada utilizando o Kit de separação NK Cell Isolation Kit II, mouse (Miltenyi Biotec.),
cujo protocolo foi adaptado para melhor rendimento de células. As células foram
lavadas duas vezes com PBS, a concentração de células foi determinada, e as células
foram ressuspendidas em tampão PBS / 2mM EDTA/ 0,5% BSA, utilizando-se 40μL
para cada 107 células. Em seguida 10 µL do NK Cell Biotin-Antibody Cocktail foi
adicionado para cada 10⁷ células, e estas células foram incubadas em geladeira, ao
abrigo de luz, por 15 minutos. As células foram então lavadas com 2mL de tampão
para cada 10⁷ células e ressuspendidas em 80 µL tampão por 10⁷ células. Em seguida
20 µL de Anti-Biotin MicroBeads foi adicionado para cada 10⁷ células, e foram
incubadas por 15 minutos, em geladeira, ao abrigo de luz. O volume foi acertado para
500 µL por 10⁷ células no mesmo tampão e procedeu-se então a separação
magnética. Colunas MS foram encaixadas no campo magnético do separador para
MACS e 500 µL de suspensão de células foi adicionado por vez na coluna. As células
que passaram pela coluna foram coletadas e a coluna foi lavada uma vez, utilizando
500 µL de tampão, que também foi coletado. As colunas foram retiradas do campo
magnético e as células ligadas foram retiradas com auxílio de embolo e de 1mL de
tampão e em seguida descartadas. As células NK purificadas foram lavadas com PBS
e ressuspendidas no meio apropriado. O perfil de células obtidas pode ser visto na
figura 3. A citometria de fluxo para caracterização destas células foi feita utilizando-se
anticorpos específicos para célula NK (NK1.1 e CD49b). Conseguimos observar um
percentual de pureza de 78.7% quando se analisam as células marcadas
positivamente para NK1.1, 81.52% de pureza quando se analisam as células
marcadas para CD49b e 76.9% quando se consideram ambas as marcações. Dentro
das células negativas, 27.4% são CD3+ e 11,2% são CD4+, ou 4.57% e 1.87% do
total de células, respectivamente. Foram encontradas ainda 2.34% de células
marcadas positivamente para F4/80 e 10.34% para MHCII.
34
Figura 3: Obtenção de células NK purificadas de baço de camundongo C57BL/6. Células NK foram
purificadas de baço de camundongo C57BL/6 por meio de MACS. Foi feita a citometria de fluxo após marcação com anticorpos Anti-mouse NK1.1, CD49b, CD4, CD3, MHCII e F4/80 e analise com programa Flowjo.
3.6. Co-culturas
As co-culturas foram feitas através de adaptação do método descrito por Sanabria e
colaboradores, (2008). As DC derivadas de medula óssea foram adicionadas a placas
de 24 poços, contendo lamínulas revestidas com 100 µg/mL de poli-L-lisina
(SigmaAldrich), em meio RPMI-1640 (SigmaAldrich) suplementado com 10% de SFB,
L-glutamina 2 mM, penicilina G 100 U/mL e β-mercaptoetanol (Pharmacia Biotech AB,
Uppsala, Suécia) 50 µM, pH 7,2. As células foram infectadas com L. amazonensis
numa proporção de 3 parasitos por DC por 3 horas a 33°C / 5% CO2, na presença ou
ausência dos inibidores dos receptores de adenosina SCH 58261 (Sigma Aldrich),
PSB1115 (Sigma Aldrich) e grupo controle positivo contendo IL-12 a 100pg/mL. A
35
proporção de DC e células NK foi equivalente. A cultura foi mantida por 48h à 37°C /
5% CO2. O sobrenadante foi então coletado e armazenado à -20°C até o momento da
dosagem de citocinas. As lamínulas foram utilizadas para a realização da contagem
de células infectadas.
3.7. Taxa de infecção
Lamínulas utilizadas durante os experimentos de co-cultura foram fixadas com
Metanol por 2 minutos. Após a fixação foram coradas com solução de Giemsa por 10
minutos, lavadas e fixadas em lâminas utilizando-se Entellan como meio de
montagem. Após a completa secagem do meio de montagem, fez-se a contagem de
cerca de 200 células em microscópio óptico em objetiva de imersão com aumento de
100X.
3.8. Cultivo e estimulação das células de linfonodo
Após um dia de infecção os animais foram submetidos à eutanásia e tiveram os
linfonodos drenantes da orelha coletados. Os linfonodos foram processados em
macerador de tecidos de vidro. A suspensão celular obtida teve sua concentração
ajustada para 5 x 106 células/mL, em meio de cultura completo para células e tecidos
(CTCM), composto por DMEM suplementado com 10 % de SFB (LGC Biotecnologia),
2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich Inc.), 100 U/mL de penicilina, 50μM β-
mercaptoetanol e 25 mM de HEPES (Sigma Aldrich), pH7,2. 2,5 x 106 células foi
distribuída em placas de 48 poços e estimulada com 25 μg/mL de antígeno particulado
de Leishmania amazonensis (AFONSO E SCOTT, 1993). O sobrenadante foi coletado
48 horas após a incubação a 37°C / 5% CO2 e armazenado a -20°C até o momento
da dosagem de citocinas. O restante das células foi utilizado para análise por
citometria de fluxo.
3.9. ELISA
Os sobrenadantes das culturas de células de linfonodos e das co-culturas foram
coletados e os níveis de IFN-γ foram dosados utilizando kit comercial (BD OptEIA, San
Diego, CA, EUA), que possui limite de detecção de 3pg/mL, seguindo instruções dos
fabricantes. Placas de 96 poços foram sensibilizadas com os anticorpos de captura
overnight, a 4°C; lavadas com PBS / 0,05% Tween 20 e secas em papel toalha.
Adicionaram-se o padrão e as amostras foram incubadas por 2 horas à temperatura
36
ambiente. As placas foram novamente lavadas e foi adicionado o anticorpo de
detecção juntamente com o reagente enzimático, durante 1 hora à temperatura
ambiente. As placas foram lavadas e foram adicionados o substrato enzimático,
peróxido de hidrogênio, juntamente com o reagente de cor composto por ácido 2,2'-
azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS – Sigma Aldrich) diluídos em
tampão citrato-fosfato 0,1 M, pH 4. Após 30 minutos de incubação a 37°C, a reação
foi interrompida com SDS 1%. A leitura das placas foi feita a 415 nm, utilizando o leitor
SpectraMax 340PC Molecular Devices e software SoftMax Pro 6 (Molecular Devices
Corporation, Sunnyvale, CA, EUA).
3.10. Citometria de fluxo
A concentração de células de linfonodo foi ajustada para 107 células/mL, em PBS /
1% albumina sérica bovina (BSA), pH 7,2. Foram separadas alíquotas de 25μL para
cada marcação desejada e nestas células foi realizado o bloqueio do receptor para
Fcγ com o anticorpo anti-CD16/CD32 de camundongo (produzido em nosso
laboratório), em uma diluição de 1:200, por 5 minutos. Após o bloqueio as células
foram incubadas com a combinação dos anticorpos de interesse para a marcação da
superfície celular a 4°C, por 30 minutos, ao abrigo da luz (FIGUEIREDO et al, 2012).
Para a marcação intracelular as células foram permeabilizadas utilizando reagentes
da linha BD Phosflow (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA), seguindo instruções do
fabricante. As células foram fixadas com 0,5mL de Lyse / Fix buffer previamente
aquecido a 37°C. Foram homogeneizadas por inversão e incubadas por 12 minutos,
a 37°C. Foram em seguida lavadas com PBS, pH 7,2 e ressuspendidas em 0,5mL de
Stain buffer. Em seguida centrifugaram-se as suspensões de células, desfez-se o
pellet em vórtex e permeabilizaram-se as membranas adicionando 0,5mL de Perm
buffer III, previamente resfriado a -20°C, e as células foram incubadas por 30 minutos,
em gelo. Lavaram-se as células duas vezes com PBS, pH 7,2. Ajustou-se a
concentração de células novamente para 107 células/mL, em Stain buffer, e repetiram-
se as etapas de bloqueio e marcação com os anticorpos de interesse. As suspensões
foram centrifugadas e as células lavadas com PBS, pH 7,2 e ressuspendidas em Stain
buffer. As amostras foram analisadas no citômetro de fluxo BD FACSCaliburTM e a
aquisição de células realizada com o auxílio do programa BD CellQuestTM Pro. A
análise dos dados foi realizada utilizando o programa FlowJo. Os anticorpos utilizados
estão agrupados na tabela abaixo.
37
Tabela 1: Anticorpos utilizados na realização da citometria de fluxo.
Anticorpo Clone Fabricante Isotipo
controle Fluorocromo
Concentração
de uso
(/106células)
Anti-mouse CD3ε 145-2C11 BioLegend Hamster IgG PE 0,25 μg
Anti-mouse CD4 RM4-5 eBiosciente Rat IgG2a FITC 0,025 μg
Anti-mouse CD49b DX5 eBioscience IgM APC 0,04 μg
Anti-mouse CD8 53-6.7 BD Pharmingen Rat IgG2a PE-Cy7 0,125 μg
Anti-mouse IFN-γ XMG1.2 eBioscience Rat IgG1 FITC 0,6 μg
Anti-mouse IL-10 JeS5-16E3 eBiosciente Rat IgG2b APC 0,125 μg
Anti-mouse MHC II M5/114.15.2 BD Pharmiingen Rat IgG2b Alexa Fluor 647 0,03
Anti-mouse NK1.1 PK136 eBioscience Mouse IgG2a PE-Cy7 0,04 μg
Fc Block anti-mouse
CD16/CD32 2.4G2 - Rat IgG2b - 0,5 μg
3.11. Microscopia de fluorescência
Células NK foram incubadas com L. amazonensis em placas de 48 poços contendo
lamínulas revestidas com poli-L-lisina. Após o período de infecção, retirou-se todo o
meio de cultura e os poços foram lavados três vezes com PBS, pH 7,2. As células
foram fixadas com PBS pH 7,2 / 4% formaldeído durante 15 minutos, à temperatura
ambiente, e após este tempo os poços foram novamente lavados com PBS. As
membranas celulares foram permeabilizadas, durante 10 minutos, com a adição de
PBS pH 7,2 / 0,2% Triton X-100, à temperatura ambiente e lavadas novamente com
PBS. O bloqueio foi feito em seguida, adicionando-se a solução PBS pH 7,2 / 3% BSA
/ 5% soro de jumento (Sigma Aldrich) por 1 hora, à temperatura ambiente, seguido de
lavagem dos poços. Os anticorpos de interesse foram adicionados, diluídos em PBS
pH 7,2 / 3% BSA, por 2 horas, à temperatura ambiente. Os poços foram lavados e foi
adicionado o anticorpo secundário, anti-IgG de coelho (Molecular Probes), conjugado
a Alexa Fluor 546 e diluídos 1:400 em PBS pH 7,2 / 3% BSA, por 1 hora, à temperatura
ambiente, ao abrigo da luz, e os poços foram novamente lavados. Em seguida foi feita
a marcação do núcleo, com solução de PBS pH 7,2 / 0,02% DAPI por 10 minutos, à
temperatura ambiente, ao abrigo da luz, e em seguida os poços foram lavados
(FIGUEIREDO, 2016). As lâminas foram então montadas com Fluorescence Mounting
38
Medium (Dako, Carpinteria, CA, EUA), as preparações foram examinadas ao
microscópio de fluorescência Zeiss Imager Z2 equipado com câmera AxioCam HRm
e objetiva PlanApochromat 63x/1.40 Oil DIC M27, e as imagens adquiridas com o
auxílio do software AxioVision LE64 (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Alemanha).
As imagens foram analisadas utilizando o programa ImageJ 1.48v (NIH, Bethesda,
MD, EUA).
Os anticorpos utilizados foram: anticorpo de coelho anti-receptor de adenosina A2a
(Alomone Labs, Jerusalém, Israel), anticorpo de coelho anti-receptor de adenosina
A2b (Alomone Labs, Jerusalém, Israel), a uma diluição de 1:200.
3.12. Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística por two-way ANOVA ou one-way
ANOVA seguidas do pós-teste de bonferroni com auxílio do programa Prism 5.0
(GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Valores de p inferiores a 0,05 foram
considerados estatisticamente significantes. (*) indica valor de p<0,05, (**) indica valor
de p<0,01 e (***) indica valor de p<0,001.
39
4. Resultados e discussão
4.1. A presença de L. amazonensis altera o perfil de expressão do receptor de
adenosina A2a na célula NK
Em 1990, Priebe e colaboradores demonstraram a ação de análogos de adenosina
na modulação da resposta de células NK e desde então surgiram trabalhos
demonstrando esta ação e sua importância em diversos modelos. Porém, não existe
nenhum trabalho que de fato mostre a presença destes receptores na superfície da
célula e não apenas a sua ação.
Além disso, já foi mostrado que em pacientes com leishmaniose visceral existe um
aumento na quantidade de receptores A2b expressos em monócitos CD14+ durante
a fase ativa da doença, que retorna aos níveis normais após o sucesso do tratamento.
Resultados que foram repetidos in vitro utilizando-se infecção de monócitos com L.
donovani (VIJAYAMAHANTESH et al. 2016).
Com base nessas informações, e o comprovado papel da célula NK durante a infecção
por Leishmania, investigamos então a expressão dos receptores de adenosina (A2a
e A2b) na célula NK e o papel da infecção por L. amazonensis na modulação da
expressão destes receptores (Figura 4).
Conseguimos, por meio de microscopia de fluorescência, comprovar a presença de
ambos os receptores de adenosina na superfície da célula NK (Figura 4: a, b).
Provamos ainda que o cultivo com L. amazonensis leva a um aumento da expressão
do receptor A2a na superfície da célula NK ao medirmos as intensidades de
fluorescência média (Figura 4e), mínima (Figura 4f) e máxima (Figura 4g) emitidas.
Conseguimos observar ainda que a área da superfície celular não é alterada com a
presença da L. amazonensis no meio (Figura 4d).
40
Figura 4: Expressão dos receptores A2a e A2b na célula NK de camundongos C57BL/6 na presença de L. amazonensis.
(Continuação e legenda na próxima página)
41
Figura 4: Expressão dos receptores A2a e A2b na célula NK de camundongos C57BL/6 na presença de L. amazonensis. A expressão dos receptores A2a e A2b (a,b) foi analisada na ausência (a) ou presença (b) de L. amazonensis marcada com CFSE (verde), por microscopia de fluorescência. Os grupos foram marcados com Anticorpo anti A2a ou A2b (vermelho) e DAPI (azul). Foram dosadas as intensidades de fluorescência média (e), mínima (f) e máxima (g), além da área da célula (d). São apresentados os desvios padrões da média de dois experimentos independentes. One-way ANOVA. (***) indica valor de p<0,001.
Estudos já demonstraram a capacidade de L. amazonensis de modular a expressão
de receptores P2Y2 e P2Y4 em macrófagos infectados, podendo induzir a apoptose
mediada por UTP (MARQUES-DA-SILVA et al, 2011), mecanismo que pode ser
utilizado para evasão do sistema imunológico. Já foi visto ainda que a L. amazonensis
tem a capacidade de aumentar a expressão das enzimas CD39 e CD73 na superfície
de DC, o que pode levar ao aumento da concentração de adenosina no ambiente com
consequente modulação da resposta imune (FIGUEIREDO et al, 2012).
Em estudos realizados com diferentes modelos de células tumorais, foi provado o
aumento da expressão de CD39 e CD73 nestas células, levando ao aumento da
concentração de adenosina no ambiente. Esta adenosina formada age nos receptores
A2a da célula NK levando a inibição da atividade citotóxica desta célula, impedindo
assim o combate às células tumorais (BEAVIS et al, 2013; CEKIC et al, 2014;
HATFIELD e SITKOVSKY, 2016).
f)
e)
d)
g)
42
Considerando que a ativação dos receptores do tipo A2, presentes na célula NK,
podem levar a inibição desta célula (PRIBE et al, 1990), suprimindo a produção de
citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ e TNF-α e a sua ação citolítica (LOKSHIN et
al, 2006), podemos supor que o aumento na expressão do receptor de adenosina A2a
na superfície da célula NK após a infecção por L. amazonensis tenha um papel
importante durante o estabelecimento da infecção. Passamos então a investigar o
papel deste receptor in vitro e in vivo durante a infecção por L. amazonensis.
4.2. A inibição do receptor A2a altera o perfil de produção de IFN-γ por células
NK co-cultivadas com DC e infectadas por L. amazonensis
Para a realização dos experimentos de co-cultura, precisamos definir a dosagem mais
adequada dos inibidores dos receptores de adenosina que seriam utilizadas. Para o
receptor A2a foi escolhido o antagonista SCH58261 e para o receptor A2b foi
escolhido o inibidor PSB1115, ambos da Sigma-Aldrich, e com extensa literatura
comprovando a sua eficácia e seletividade (FRICK et al, 2009; BEAVIS et al, 2013;
ANTONIOLI et al, 2014; YOUNG et al, 2016). Os inibidores foram adicionados as co-
culturas de células NK e DC, infectadas com L. amazonensis, em concentrações
crescentes (0,1, 0,5, 1, 5, 10 e 50μM). Foi utilizado 100pg/mL de IL-12 como controle
positivo, visto que esta citocina tem a capacidade de ativar as células NK a produzir
IFN-γ (Figura 5).
43
0
25
50
75
100
125500
1000
IFN
- p
g/m
L
NK X X X X X X X X X X X X X X X X X
DC X X X X X X X X X X X X X X X X X
La X X X X X X X X X X X X X X
SCH μM 0,1 0,5 1 5 10 50
PSB μM 0,1 0,5 1 5 10 50
IL-12 X X
Figura 5: Teste de concentração dos inibidores dos receptores de adenosina, A2a e A2b. O IFN-γ foi dosado através de ELISA em sobrenadante de co-cultura de células NK e DC, infectadas por L. amazonensis e na presença de concentrações crescentes de inibidores seletivos dos receptores de adenosina A2a (SCH58261) e A2b (PSB1115) após 48 horas. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes.
Com a realização deste experimento pudemos notar que ao adicionarmos diferentes
concentrações dos inibidores conseguíamos diferentes produções de IFN-γ, indicando
uma ação dose-dependente. Efeito que foi observado para ambos os inibidores. Após
a realização deste experimento e com os dados obtidos, escolhemos trabalhar com
as concentrações de 1μM para o inibidor de A2a (SCH58261) e 5μM para o inibidor
de A2b (PSB1115).
Seguimos então com a realização dos experimentos de infecção in vitro com os
resultados representados na Figura 6. Neste momento, utilizando-se a concentração
escolhida anteriormente, os inibidores foram adicionados separadamente ou em
conjunto em co-culturas de células NK e DC, infectadas com L. amazonensis. Em
seguida estas culturas foram incubadas por 48h à 37°C e 5% de CO2 e após este
tempo o sobrenadante foi coletado e a quantidade de IFN-γ foi dosada por ELISA.
44
Figura 6: Produção de IFN-γ em co-culturas de células NK e DC durante a infecção por L. amazonensis na presença de inibidores seletivos dos receptores de adenosina A2a e A2b. O
IFN-γ foi dosado por de ELISA em sobrenadante de co-cultura de células NK e DC, infectadas por L. amazonensis na proporção de 3 parasitas por DC e na presença de inibidores seletivos dos receptores de adenosina A2a (SCH58261) e A2b (PSB1115) após 48 horas. Foram analisadas a concentração de IFN-γ no meio (a), a produção de IFN-γ em relação ao controle (b) e a produção de IFN-γ após estimulo com IL-12 (barras brancas) (c) e a porcentagem da produção de IFN-γ após estimulo com IL-12 (barras pretas) (c). São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. One-way ANOVA. (*) indica valor de p<0,05.
Devido à variabilidade entre os experimentos não conseguimos encontrar uma relação
direta entre a média de produção de IFN-γ entre os grupos infectados na ausência ou
presença dos inibidores (Figura 6a), porém, quando olhamos a porcentagem de
produção de IFN-γ em relação ao grupo controle infectado (Figura 6b) podemos
observar um aumento significativo nesta produção no grupo que teve o receptor A2a
inibido.
Nos grupos estimulados com ambos os inibidores não houve aumento da produção
de IFN-γ, acreditamos que a perda do efeito gerado pela inibição do receptor A2a
a)
b)
c)
45
individualmente seja devido a ação da adenosina em outros receptores, como o
receptor A3, considerando que os receptores A2a e A2b estão inibidos. Já foi descrito
que o receptor A3 tem a capacidade de inibir a produção de citocinas pró-
inflamatórias, como o IFN-γ (HASKO et al, 1998; LEE et al, 2011; ANTONIOLI et al,
2014).
Considerando a alta produção de IFN-γ no grupo infectado após a estimulação com
IL-12 (Figura 6c) podemos perceber que não há perda de função nos receptores para
esta citocina na célula NK durante a infecção por L. amazonensis, não sendo este o
motivo para a falta de ativação da célula NK durante a infecção.
Como dito anteriormente, o IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória essencial para o
controle da leishmaniose e não é produzida em grande quantidade em modelos de
infecção por L. amazonensis (JONES et al, 2002), e a principal produtora desta
citocina no início de uma infecção é a célula NK (SCHARTON e SCOTT, 1993).
O receptor A2a é o principal alvo da adenosina expresso pelas células NK, e sua
ativação leva perda das suas funções como célula citolítica e produtora de citocinas
(DRYGIANNAKIS et al, 2011). Considerando que a inibição deste receptor durante a
infecção por L. amazonensis levou a restauração da função da célula NK como
produtora de IFN-γ (Figura 6b), podemos imaginar que a infecção por L. amazonensis
leve ao aumento da produção de adenosina e que esta adenosina ao agir nos
receptores A2a da célula NK faça com que esta célula perca a sua capacidade de
produzir citocinas pró-inflamatórias como o IFN-γ, impedindo assim, a formação de
uma resposta imunológica eficaz contra o parasita.
4.3. Inibição do receptor A2a leva à diminuição da taxa de infecção de DC em co-
culturas com NK e infectadas por L. amazonensis
Para sabermos se a inibição dos receptores de adenosina poderia influenciar no perfil
de infecção de DC co-cultivadas com células NK durante a infecção in vitro por L.
amazonensis, realizamos as co-culturas, na presença ou ausência dos inibidores de
adenosina como descrito anteriormente e após 48 horas as lamínulas foram retiradas
e coradas para a contagem do número de células infectadas ao microscópio (Figura
7).
46
Figura 7: Taxa de infecção em co-culturas de células NK e DC durante a infecção por L.
amazonensis na presença de inibidores seletivos dos receptores de adenosina A2a e A2b. A taxa
de infecção de DC foi calculada após a contagem ao microscópio de laminas coradas com Giemsa de
co-culturas de células NK e DC, infectadas por L. amazonensis na proporção de 3 parasitos por DC, e
na presença de inibidores seletivos dos receptores de adenosina A2a (SCH58261) e A2b (PSB1115)
após 48 horas. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes.
One-way ANOVA. Os grupos foram comparados com o grupo controle. (*) indica valor de p<0,05 e (**)
indica valor de p<0,01.
Como podemos observar na figura 7 a porcentagem de células infectadas é
significativamente menor em todos os grupos tratados, quando se comparou com o
grupo controle infectado sem a presença do inibidor. Mais uma vez foi usada a citocina
IL-12 como controle positivo, devido ao seu papel conhecido de estimular a célula NK
e assim aumentar a concentração de IFN-γ no meio, levando a ativação das células
dendríticas. Observamos ainda, que a presença dos inibidores dos receptores de
adenosina em infecção de DC, na ausência da célula NK, não diminui a taxa de
infecção destas células (Dados não mostrados).
As DC são de extrema importância na resposta imunológica e para a conexão entre
as respostas imunológicas inata e adquirida, inclusive durante a infecção por
Leishmania (BRANDONISIO et al, 2004). Sua interação com as células NK leva a
ativação de ambas as células, tanto através do contato celular, como através de
fatores solúveis (SCHLEICHER et al, 2007; SANABRIA et al, 2008). Estudos já
47
demonstraram que L. amazonensis controla a maturação e a produção de citocinas
das células dendriticas, impedindo assim que consiga exercer as suas funções na
imunidade no organismo (FAVALI et al, 2007; VASQUEZ et al, 2008; XIN et al, 2008;
FIGUEIREDO et al, 2012). Também já foi demonstrado que a adenosina atuando nos
receptores A2b das DC pode levar a diversos efeitos inibitórios nesta célula,
prejudicando a polarização Th1 e favorecendo Th2, além de favorecer o
desenvolvimento de células Th17 (PANTHER et al, 2001; PANTHER et al, 2003).
Já estão bem estabelecidas as funções das DC como célula fagocíticas e
apresentadoras de antígenos, porém a sua ação como célula microbicida ainda é
pouco clara. Porém diversos estudos já mostraram a ação da DC como produtora de
intermediários reativos de nitrogênio atuando no combate inicial de infecções, como
na infecção por Listeria monocytogenes (SERBINA et al, 2003; AUFFRAY et al, 2009;
SCHIMID et al, 2012). Além disso, Sanabria e colaboradores (2008) mostram que
células NK ativadas com IL-2 são capazes de produzir IFN-γ e levar a diminuição de
taxa de infecção de DC, infectadas com L. amazonensis, em co-culturas.
Considerando os resultados de diminuição da taxa de infecção tanto na presença do
inibidor do receptor A2a quanto A2b, podemos imaginar que a adenosina de fato tenha
um papel importante durante a infecção por L. amazonensis. Uma possibilidade é que
a adenosina presente no meio está se ligando ao receptor A2a da célula NK,
impedindo a produção de IFN-γ, e ao bloquearmos este receptor a célula NK consegue
ser ativada levando a produção de IFN-γ (Figura 6b) com consequente ativação das
DC e eliminação do parasita (Figura 7).
Além disso, a adenosina no meio pode se ligar no receptor A2b da DC inibindo as
suas funções, e ao utilizarmos um inibidor do receptor A2b conseguimos permitir que
esta célula seja ativada pela célula NK levando a eliminação do parasito (Figura 7).
Considerando que ao inibirmos o receptor A2b não houve aumento da produção de
IFN-γ (Figura 6b), é possível que nesta situação a ativação da DC ocorra através de
mecanismos contato-dependentes.
Apesar de não ter sido demonstrado, podemos ainda supor que o aumento da
quantidade de IFN-γ produzida pela célula NK na presença do inibidor do receptor
A2a poderia levar a uma ativação de macrófagos infectados, da mesma forma que fez
com as DC e diminuição da sua taxa de infecção. Estudos já demonstraram que as
48
células NK ativadas tem a capacidade de ativar macrófagos infectados por L.
amazonensis, levando a diminuição da sua taxa de infecção (ARANHA et al, 2005) e
que essa ativação dos macrófagos é feita através da liberação de citocinas pró-
inflamatórias e não através do contato célula-célula (PRAJEETH et al, 2011). Como
já foi dito anteriormente os macrófagos são as principais células fagocitárias do
organismo e após a sua ativação por IFN-γ, os macrófagos produzem grandes
quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio levando a destruição dos
parasitos fagocitados (GREEN et al, 1991; REINER et al, 1994).
Em resumo, estes resultados mostram que a ativação dos receptores A2a e A2b
podem ser importantes mecanismos de modulação da resposta imune pela L.
amazonensis, levando tanto a uma diminuição da resposta imunológica inata através
das células NK e DC, quanto impedindo que a DC desempenhe a sua função como
célula apresentadora de antígenos, ativando assim a resposta imunológica adaptativa.
4.4. A inibição do receptor de adenosina A2a in vivo leva a um aumento do perfil
pró-inflamatório da resposta imunológica com aumento da porcentagem de
células NK produtoras de IFN-γ
Para realizarmos a avaliação do papel dos receptores de adenosina na resposta de
células NK in vivo, primeiro seria importante definir o momento em que esta célula é
recrutada para o local da infecção, de modo a conseguirmos obter e analisar estas
células.
Para analisar as células NK in vivo, Scharton e Scott (1993) realizavam a eutanásia e
análises subsequentes em camundongos C3H/HeN e BALB/c, infectados por L. major,
em 1, 2 ou 4 dias após a infecção, enquanto que Sanabria e colaboradores (2008),
realizavam as suas análises in vivo em camundongos C57BL/6, infectados por L.
amazonensis, 1 ou 3 semanas após o inoculo. Devido à grande variedade de modelos
encontrados na literatura e para que nossos resultados fossem fieis ao curso da
infecção em nosso modelo, realizamos assim uma curva de recrutamento de células
NK, analisando ainda o seu estado de ativação em diferentes momentos.
Para isso inoculamos L. major, L. amazonensis ou PBS, usado como controle, por via
intradérmica na orelha de camundongos C57BL/6, e após 1, 3 e 7 dias realizamos a
49
eutanásia seguida de marcação para citometria (Figura 8). Nessa análise
quantificamos as células NK no linfonodo drenante da orelha dos camundongos por
diferentes marcadores, além da produção de IFN-γ por estas células.
Ao analisarmos a quantidade de células NK no linfonodo (Figura 8a) pudemos
observar que no primeiro dia há cerca de 2% de células NK no linfonodo após a
infecção por L. amazonensis (󠆆), e que esta quantidade tem uma grande diminuição
no terceiro dia de infecção, tendo em seguida um leve aumento no sétimo dia de
infecção. Enquanto que para o grupo controle (●) e o grupo infectado com L. major (
▼) essa alteração não é perceptível. Podemos notar o mesmo perfil ao analisarmos
a quantidade de células NK produtoras de IFN-γ (Figura 8b).
Figura 8: Recrutamento de células NK para os linfonodos drenantes e sua produção de IFN-γ após diferentes tempos de infecção por L. major e L. amazonensis. O recrutamento de células NK
(a) e a sua produção de IFN-γ (b) foi analisado por citometria de fluxo após 1,3 e 7 dias de infecção por L. major ou L. amazonensis, e grupo controle inoculado com veículo (PBS). Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células NK foram utilizados dois anticorpos anti-mouse NK1.1 e anti-mouse CD49b, e o IFN-γ foi dosado através de marcação intracelular com anticorpo anti-mouse IFN-γ. São apresentados os resultados de experimento único.
Considerando que as espécies de Leishmania interagem com o sistema imunológico
do hospedeiro de formas particulares levando a respostas imunológicas e doenças
com características diferentes (KEDZIERSKI e EVANS, 2014), era esperado haver
diferenças nos perfis de recrutamento de células NK para o linfonodo, além das
variações no seu estado de ativação, quando comparamos a infecção por L. major e
L. amazonensis.
Em posse dos dados descritos acima, passamos para a investigação in vivo do papel
dos receptores de adenosina durante a infecção por L. amazonensis em
camundongos C57BL/6. Para isso escolhemos trabalhar no primeiro dia após a
a)
b)
50
infecção, por ser o momento em que havia uma maior quantidade de células NK no
linfonodo.
Camundongos foram tratados por via intraperitoneal com inibidores dos receptores de
adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, na concentração de 1mg/Kg,
e grupo controle tratado com veículo (PBS 2%DMSO), e em seguida os grupos foram
infectados com L. amazonensis em ambas as orelhas por via intradérmica. Os
linfonodos foram retirados e processados para a realização de citometria de fluxo e
cultivo celular com estimulação antigênica.
Através dos dados de citometria de fluxo (Figuras 9, 10 e 11) pudemos visualizar perfil
de células NK e CD4 presentes no linfonodo após um dia de infecção.
Na figura 9, podemos ver que não houve alteração em relação ao número total de
células do linfonodo quando comparamos os diferentes tratamentos (Figura 9a). O
número (Figura 9b) e porcentagem de células NK (Figura 9c) presentes do linfonodo
também não se alterou. Quando olhamos a produção de IFN-γ pelas células NK
vemos que, apesar do tratamento com o inibidor de A2a não levar a um aumento
significativo no número de células NK produtoras de IFN-γ (Figura 9d) houve um
aumento significativo na porcentagem de células NK produtoras de IFN-γ (Figura 9e).
Nos grupos controle não infectados tratados com os inibidores dos receptores de
adenosina não houveram alterações em nenhuma das análises realizadas.
51
Figura 9: Quantidade de células NK e produção de IFN-γ no linfonodo de camundongos C57BL/6 após um dia de infecção por L. amazonensis. A quantidade total de células do linfonodo (a) e a quantidade de células NK (b,c) e sua produção de IFN-γ (d, e) foi analisada por citometria de fluxo após 1 dia de infecção por L. amazonensis, após tratamento com inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/kg via intraperitoneal, e grupos controle não infectados. Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células NK foi usado o anticorpo anti-mouse NK1.1 e o IFN-γ foi dosado através de marcação intracelular com anticorpo anti-mouse IFN-γ. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. One-way ANOVA. (*) indica valor de p<0,05.
Avaliamos ainda a produção de IL-10 pelas células NK, uma citocina anti-inflamatória
que tem o potencial de inibir a resposta imunológica (figura 10).
a)
b)
c)
d)
e)
52
Figura 10: Produção de IL-10 por células NK no linfonodo de camundongos C57BL/6 após um dia de infecção por L. amazonensis. O número (a) e a porcentagem (b) de células NK produtoras de
IL-10 foi analisada por citometria de fluxo após 1 dia de infecção por L. amazonensis, após tratamento com inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/Kg via intraperitoneal, e grupos controle não infectados. Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células NK foi usado o anticorpo anti-mouse NK1.1 e o IL-10 foi dosado através de marcação intracelular com anticorpo anti-mouse IL-10. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. One-way ANOVA.
Como podemos ver não houve alterações no número ou porcentagem de células NK
produtoras de IL-10, independentemente do tratamento utilizado.
A produção de IFN-γ é essencial para a formação de uma resposta Th1, assim como
para a ativação de macrófagos (SCHARTON e SCOTT, 1993; AWASTHI et al, 2004;
ARANHA et al, 2005). Como vimos o aumento da porcentagem de células NK
produtoras de IFN-γ in vivo, ao inibirmos o receptor A2a, resolvemos analisar se além
do seu potencial de ativar a imunidade inata, haveria também o aumento da produção
de IFN-γ por linfócitos CD4, um passo importante para a formação de uma resposta
imune adaptativa do tipo Th1 (Figura 11).
a)
b)
53
Figura 11: Quantidade de células CD4 e sua produção de IFN-γ no linfonodo de camundongos C57BL/6 após um dia de infecção por L. amazonensis. A quantidade de células CD4 (a, b) e sua produção de IFN-γ (c, d) foi analisada por citometria de fluxo após 1 dia de infecção por L. amazonensis, após tratamento com inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/Kg via intraperitoneal, e grupos controle não infectados. Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células CD4 foi usado o anticorpo anti-mouse CD4+ e o IFN-γ foi dosado através de marcação intracelular com anticorpo anti-mouse IFN-γ. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. One-way ANOVA.
Podemos observar que não houve alteração no número (Figura 11a) ou porcentagem
de células CD4 (Figura 11b) presentes do linfonodo. Além disso, quando olhamos a
produção de IFN-γ por estas células, podemos observar que não houve um aumento
no número de células produtoras de IFN-γ (Figura 11c) e na sua porcentagem (Figura
11d).
Analisamos ainda a produção de IFN-γ in vitro após a estimulação das células do
linfonodo por antígeno particulado de L. amazonensis. As células foram cultivadas por
a)
b)
c)
d)
54
48 horas em estufa a 37°C e 5% CO2 e o sobrenadante destas culturas foi coletado e
a quantidade de IFN-γ foi dosada por ELISA (Figura 12).
Figura 12: Produção de IFN-γ em células de linfonodo de camundongos C57BL/6, estimuladas com antígeno particulado de L. amazonensis. As células do linfonodo drenante foram coletadas após 1 dia de infecção por L. amazonensis, após tratamento com inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/Kg via intraperitoneal, e estimuladas por 48h com antígeno particulado de L. amazonensis. Foram utilizados 4 animais por grupo. O sobrenadante de cultura foi coletado e a quantidade de IFN-γ foi dosada por ELISA. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. two-way ANOVA. (*) indica valor de p<0,05
Como podemos observar na figura 12, os resultados de estimulação in vitro seguem
o mesmo padrão apresentado in vivo em relação à produção de IFN-γ das células NK,
com aumento de IFN-γ no grupo tratado com o inibidor do receptor de adenosina A2a,
indicando que o bloqueio deste receptor leva ao aumento de uma resposta com perfil
pró-inflamatório no hospedeiro.
Sabemos que as células NK podem ser um componente crucial para impulsionar a
resposta imune celular do tipo Th1 através da secreção de IFN-γ em resposta à
estimulação de IL-12, além de agir ativando as células da imunidade inata com a
liberação desta mesma citocina (SYPEK et al, 1993; AFONSO et al, 1994; ARANHA
et al, 2005).
55
É interessante notar, que quando ambos os inibidores foram usados, houve a perda
da produção de IFN-γ gerada pela inibição do receptor A2a individualmente (Figuras
9d, 9e, 12). Uma hipótese para este resultado é que, quando ambos os receptores
estão inibidos, a adenosina disponível no meio possa estar agindo sobre o receptor
A3. Como já foi dito antes, este receptor, ao ser estimulado por adenosina, pode levar
a diminuição do potencial pró-inflamatório de células do sistema imunológico, levando
a diminuição da produção de IL-12, IFN-γ, IL-1β e TNF-α e aumento da produção de
IL-10 (HASKÓ et al,1998; ANTONIOLI et al, 2014; LEE et al, 2016). Esta hipótese é
compatível com os resultados que obtivemos nos grupos onde ambos os inibidores
foram usados, justificando a falta de produção de IFN-γ nas células de linfonodo
estimuladas com antígeno de Leishmania (Figura 12) e a falta de aumento na
porcentagem de células NK produtoras desta citocina (Figuras 9e)
Os resultados apresentados acima mostram claramente um aumento do perfil de
produção de IFN-γ por células NK no linfonodo durante o início da infecção após o
bloqueio do receptor de adenosina A2a. Com estes resultados podemos supor um
aumento da atividade das células da imunidade inata, aumentando assim o combate
ao parasito, além disso podendo levar a formação de uma resposta adaptativa Th1
melhorando assim o combate tardio a infecção.
4.5. A inibição do receptor de adenosina A2a in vivo leva ao aumento do perfil
Th1, com aumento da produção de IFN-γ por células CD4
Após avaliarmos o perfil de resposta de imunológica no primeiro dia após a infecção,
o que reflete o perfil da resposta inata do organismo, avaliamos um momento mais
tardio, 7 dias após infecção, o que poderia nos dar indícios da formação da resposta
imune adaptativa do hospedeiro após o tratamento. Analisamos assim o perfil de
linfócitos CD4 e CD8 no linfonodo dos camundongos após 7 dias de infecção através
de citometria de fluxo.
Podemos observar que os diferentes tratamentos não alteram o número total de
células do linfonodo (Figura 13a). O número (Figura 13b) e a porcentagem (Figura
13c) de linfócitos CD4 presentes no linfonodo também não foram alterados nos
diferentes tratamentos. Porém, quando analisamos a produção de IFN-γ pelas células
56
CD4+ encontramos um aumento significativo tanto no número de células produtoras
de IFN-γ (Figura 13d), quanto na sua porcentagem (Figura 13e) após o tratamento
com o inibidor do receptor A2a.
Figura 13: Quantidade de células CD4 e sua produção de IFN-γ no linfonodo de camundongos C57BL/6 após sete dias de infecção por L. amazonensis. A quantidade de células totais no linfonodo (a), de células CD4 (b, c) e sua produção de IFN-γ (d, e) foi analisada por citometria de fluxo após 7 dias de infecção por L. amazonensis, após tratamento com inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/Kg via intraperitoneal. Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células CD4 foi usado o anticorpo anti-mouse CD4+ e o IFN-γ foi dosado através de marcação intracelular com anticorpo anti-mouse IFN-γ. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. One-way ANOVA. (*) indica valor de p<0,05
Como os linfócitos CD4 são capazes de produzir tanto citocinas pró-inflamatórias,
quanto citocinas anti-inflamatórias, resolvemos analisar também a produção de uma
das principais citocinas anti-inflamatórias, a IL-10 (Figura 14).
a)
b)
c)
d)
e)
57
Figura 14: Produção de IL-10 por células CD4 no linfonodo de camundongos C57BL/6 após sete
dias de infecção por L. amazonensis. A quantidade de células CD4 e sua produção de IL-10 foi
analisada por citometria de fluxo após 7 dias de infecção por L. amazonensis, após tratamento com
inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/Kg via
intraperitoneal. Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células CD4 foi usado o
anticorpo anti-mouse CD4+ e a IL-10 foi dosada através de marcação intracelular com anticorpo anti-
mouse IL-10. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes.
One-way ANOVA.
Podemos observar que não houve alterações significativas na produção de IL-10 por
células CD4 na presença de nenhum dos inibidores dos receptores de adenosina.
Como dito anteriormente, as células T CD4 promovem as respostas adaptativas
adequadas a patógenos específicos (ZHU et al, 2010), com a resposta Th1 sendo
considerada uma resposta predominantemente pró-inflamatória podendo auxiliar no
combate a infecção (REIS et al, 2006).
Neste contexto e observando os resultados descritos acima, podemos ver que o
tratamento com o inibidor do receptor A2a promoveu uma melhora do perfil Th1 do
hospedeiro, levando a um aumento da produção de IFN-γ por células CD4, a principal
citocina pró-inflamatória produzida por estas células, enquanto que não levou a um
aumento da produção de IL-10, citocina anti-inflamatória que poderia contrabalancear
a resposta imune, impedindo assim os efeitos pró-inflamatórios desejados.
É importante lembrar ainda que já foi mostrado que a infecção por L. amazonensis em
camundongos C3H resulta em baixos níveis de produção de IL-12 e IFN-γ por células
a)
b)
58
T CD4 específicas (JONES et al, 2002), e leva também a baixos níveis de produção
de IFN-γ por células de linfonodo de camundongos C57BL/10 (AFONSO E SCOTT,
1993), modelos muito similares ao nosso. Então podemos dizer que está havendo de
fato uma mudança no perfil de resposta a infecção por L. amazonensis quando foi
feito o tratamento prévio com o inibidor do receptor A2a de forma sistêmica.
Pensando ainda na resposta imunológica adaptativa, sabemos que os linfócitos CD8
também possuem um papel importante como produtores de IFN-γ, além de atuarem
como células citotoxicas. Analisamos então a presença e produção de citocinas por
estas células no linfonodo (Figura 15), porém não encontramos diferenças no número,
porcentagem ou produção de citocinas por estas células após o período de infecção.
59
Figura 15: Quantidade de células CD8 e sua produção de IFN-γ e IL-10 no linfonodo de camundongos C57BL/6 após sete dias de infecção por L. amazonensis. A quantidade de células
CD8 e sua produção de citocinas foi analisada por citometria de fluxo após 7 dias de infecção por L. amazonensis, após tratamento com inibidores dos receptores de adenosina A2a (SCH58261), A2b (PSB1115) ou ambos, 1mg/Kg via intraperitoneal. Foram utilizados 4 animais por grupo. Para a marcação de células CD8 foi usado o anticorpo anti-mouse CD8+ e as citocinas foram dosadas através de marcação intracelular com anticorpos anti-mouse IFN-γ e anti-mouse IL-10. São apresentados os desvios padrões da média de três experimentos independentes. One-way ANOVA.
c)
d)
e)
f)
a)
b)
60
Embora a Leishmania resida dentro de vacúolos parasitóforos em fagócitos
mononucleares, seus antígenos são apresentados através de MHC de classe I a
linfócitos T CD8, o que contribui para a formação de uma resposta Th1 através da
produção de TNF e IFN-γ (OVERATH e HARBECKE, 1993). Além disso, a atividade
citotóxica por células T CD8 é importante para a eliminação do parasita. Enquanto a
atividade citotóxica induz a morte da célula alvo, citocinas como IFN-γ e TNF
participam no desenvolvimento de uma resposta inflamatória que modula a atividade
de macrófagos e DC (PIRMEZ et al, 1993; JORDAN et al, 2014).
Apesar de não termos encontrado diferenças na produção de citocinas por estas
células, é possível que sua atividade citolítica esteja preservada, auxiliando na
resolução da infecção por meio da morte das células infectadas.
61
5. Sumário dos resultados
No nosso trabalho demonstramos a presença dos receptores de adenosina A2a e A2b
na superfície da célula NK e o aumento da expressão do receptor A2a nesta célula
durante infecção por L. amazonensis, sugerindo a importância deste receptor na
célula NK durante a infecção.
Mostramos ainda que a inibição do receptor A2a leva ao aumento da produção de
IFN-γ por células NK co-cultivadas com DC e infectadas por L. amazonensis, citocina
que é extremamente importante para a ativação das respostas imunológicas inatas e
adaptativas. A inibição do receptor A2a leva também a diminuição da taxa de infecção
de DC em co-culturas com NK e infectadas por L. amazonensis.
Pudemos mostrar que diferentes espécies de Leishmania levam à diferente perfil de
recrutamento e de produção de IFN-γ pelas células NK. E, por fim, que a inibição do
receptor de adenosina A2a in vivo leva a aumento do perfil pró-inflamatório da
resposta imune inata com aumento da porcentagem de células NK produtoras de IFN-
γ após um dia de infecção, e a aumento do perfil Th1, com aumento da produção de
IFN-γ por células CD4, após sete dias de infecção. Resultados que são condizentes
com os nossos resultados in vitro.
62
6. Conclusão
Com base nos resultados encontrados podemos concluir que o receptor A2a, presente
na célula NK tem um papel de grande importância durante a infecção por L.
amazonensis. A ativação deste receptor leva a diminuição da produção de IFN-γ por
esta célula, impedindo a ativação de células da imunidade inata do hospedeiro e a
formação de uma resposta imunológica adaptativa eficiente, favorecendo o
estabelecimento da infecção. O bloqueio deste receptor leva ao aumento do perfil pró-
inflamatório durante a infecção por L. amazonensis, tanto em modelo in vitro quanto
in vivo.
63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AFONSO, L. C., SCOTT, P. Immune Responses Associated with Susceptibility of
C57BL/10 Mice to Leishmania Amazonensis. Infection and Immunity, v. 61, n. 7, p.
2952–2959, 1993.
AFONSO, L. et al. Interactions with apoptotic but not with necrotic neutrophils increase
parasite burden in human macrophages infected with Leishmania amazonensis.
Journal of Leukocyte Biology, v. 84, p. 389-396, 2008.
AFONSO, L.C. et al. The Adjuvant Effect of Interleukin-12 in a Vaccine Against
Leishmania Major. Science, v. 263, n. 5144, p. 235-37, 1994.
AKHOUNDI, M. et al. Leishmania infections: Molecular targets and diagnosis.
Molecular Aspects of Medicine, v. 57, p. 1-29, 2017.
ANTONIOLI, L. et al. Adenosine and inflammation: what’s new on the horizon? Drug
Discovery Today, v. 19, n. 8, p. 1051-1068, 2014.
ANTONIOLI, L. et al. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine.
Nature Reviews Cancer, v. 13, n. 12, p. 842–857, 2013.
ARANHA, F. C. et al. Interleukin-2-activated natural killer cells may have a direct role
in the control of Leishmania (Leishmania) amazonensis promastigote and macrophage
infection. Scandinavian Journal of Immunology, v. 62, p. 334–341, 2005.
AUFFRAY, C. et al. Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with
Dendritic Cells. Annual Review of Immunology, v. 27, p. 669–692, 2009.
AWASTHI, A. et al. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of
Medical Research, v.119, p. 238–258, 2004.
BAÑULS, A.L. et al. Leishmania and the leishmaniases: a parasite genetic update and
advances in taxonomy, epidemiology and pathogenicity in humans. Advances in
Parasitology, v.64, p. 455–458, 2007.
BEAVIS, P.A. et al. Blockade of A2A receptors potently suppresses the metastasis of
CD73+ tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 110, n. 36,
p. 14711–14716, 2013.
64
BERMAN, J.D. et al. Multiplication of Leishmania in human macrophages in vitro.
Infection and Immunity, v. 26, n. 1, p. 375–379, 1979.
BRANDONISIO, O. et al. Dendritic cells in Leishmania infection. Microbes and
Infection, v. 6, n. 15, p. 1402–1409, 2004.
BRASIL. MINISTERIO DA SAUDE. Manual de Vigilância da Leishmaniose
Tegumentar Americana, Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde,
Departamento de Vigilância Epidemiológica. – 2. ed. – Brasília, Editora do Ministério
da Saúde, 2007.
BURNSTOCK, G. Purine and pyrimidine receptors. Cellular and Molecular Life
Sciences, v. 64, p. 1471–1483, 2007.
BURNSTOCK, G., BOEYNAEMS, J.M. Purinergic signalling and immune cells.
Purinergic Signal, v. 10, p. 529–564, 2014.
CARVALHO, L. P. et al. Protective and pathologic immune responses in human
tegumentary leishmaniasis. Frontiers in Immunology, v. 3, p. 301, 2012.
CEKIC, C. et al. Myeloid expression of Adenosine A2A receptor suppresses T and NK
cell responses in the solid tumor microenvironment. Cancer Research, v. 74, n. 24, p.
7250–7259, 2014.
CEKIC, C., LINDEN, J. Purinergic regulation of the immune system. Nature Reviews
Immunology, v. 16, n. 3, p. 177–192, 2016.
CHALLIER, J. et al. Adenosine and cAMP signalling skew human dendritic cell
differentiation towards a tolerogenic phenotype with defective CD8+ T-cell priming
capacity. Immunology, v. 138, p. 402–410, 2013.
CHANG, K.P., MCGWIRE, B.S. Molecular determinants and regulation of Leishmania
virulence. Kinetoplastid Biology and Disease, v.1, n.1, 2002.
CHEN, Y. et al. A putative osmoreceptor system that controls neutrophil function
through the release of ATP, its conversion to adenosine, and activation of A2
adenosine and P2 receptors. Journal of Leukocyte Biology, v. 76, p. 245–253, 2004.
COOK, K.D. et al. NK Cells and Their Ability to Modulate T Cells during Virus
Infections. Critical reviews in immunology, v. 34, n. 5, p. 359-388, 2014.
65
DE SOUZA, M.C. et al. The influence of ecto-nucleotidases on Leishmania
amazonensis infection and immune response in C57B/6 mice. Acta Tropica, v. 115,
p. 262–269, 2010.
DRYGIANNAKIS, I. et al. Immunological alterations mediated by adenosine during
host-microbial interactions. Immunologic Research, v. 50, n. 1, p. 69-77, 2011.
ERNST, P.B. et al. Much Ado about Adenosine: Adenosine Synthesis and Function in
Regulatory T Cell Biology. Journal of immunology, v.185, n. 4, p.1993-1998, 2010.
EZEAMUZIE, C.I., KHAN, I. The role of adenosine A2 receptors in the regulation of
TNF-α production and PGE2 release in mouse peritoneal macrophages. International
Immunopharmacology, v. 7, p. 483–490, 2007.
FAVALI, C. et al. Leishmania amazonensis infection impairs differentiation and
function of human dendritic cells. Journal of Leukocyte Biology, v. 82, n. 6, p. 1401-
1406, 2007.
FEHNIGER, T.A. et al. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes
and are activated by T cell–derived IL-2: a potential new link between adaptive and
innate immunity. Blood, v. 101, p. 3052-3057, 2003.
FERNÁNDEZ-FIGUEROA, E.A. et al. Down-Regulation of TLR and JAK/STAT
Pathway Genes Is Associated with Diffuse Cutaneous Leishmaniasis: A Gene
Expression Analysis in NK Cells from Patients Infected with Leishmania mexicana.
PLOS Neglected Tropical Diseases, v. 10, n. 3, 2016.
FERRARI, D. et al. Purinergic signaling in atherosclerosis. Trends in Molecular
Medicine, v. 21, n. 3, p. 184 – 192, 2015.
FERRARI, D. et al. Shaping immune responses through the activation of dendritic cells
P2 receptors. Purinergic Signalling, v. 3, p. 99–107, 2007.
FIGUEIREDO, A.B. et al. Leishmania amazonensis impairs DC function by inhibiting
CD40 expression via A2B adenosine receptor activation. European Journal of
Immunology, v. 42, p. 1203–1215, 2012.
FIGUEIREDO, A.B. et al. Leishmania amazonensis-Induced cAMP Triggered by
Adenosine A2B Receptor Is Important to Inhibit Dendritic Cell Activation and Evade
Immune Response in Infected Mice. Frontiers in Immunology, v. 8, n. 849, 2017.
66
FIGUEIREDO, A.B. Recrutamento do receptor de adenosina A2B e ativação da via de
AMPc-PI3K-ERK1/2 inibem a resposta de células dendríticas infectadas por
Leishmania amazonensis. 2016. 128f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) -
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro
Preto, 2016.
FRICK, J.S. et al. Contribution of Adenosine A2B Receptors to Inflammatory
Parameters of Experimental Colitis. Journal of Immunology, v. 182, n. 8, p. 4957-
4964, 2009.
GARNHAM, P.C.C. The genus Leishmania. Bulletin of the World Health
Organization, v. 44, n. 4, p. 477-489, 1971.
GESSI, S. et al. Adenosine and lymphocyte regulation. Purinergic Signalling, v. 3, p.
109–116, 2007.
GODING, J.W., HOWARD, M.C. Ecto-enzymes of lymphoid cells. Immunological
Reviews, v. 161, p. 5-10, 1998.
GOMES, R.S. et al. E-NTPDase (ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase)
of Leishmania amazonensis inhibits macrophage activation. Microbes and Infection,
v. 17, p. 295-303, 2015.
GRASSI, F. Purinergic Control of Neutrophil Activation. Journal of Molecular Cell
Biology, v. 2, p.176–177, 2010.
GREEN, S.J. et al. Cytokine-induced synthesis of nitrogen oxides in macrophages: a
protective host response to Leishmania and other intracellular pathogens. Journal of
Leukocyte Biology, v. 50, p. 93-103, 1991.
GUIMARAES-COSTA, A.B. et al. 3’- Nucleotidase/nuclease activity allows Leishmania
parasites to escape killing by neutrophil extracellular traps. Infection and Immunity,
v. 82, p. 1732-1740, 2014.
HAMILTON, C.A. et al. Interactions between natural killer cells and dendritic cells
favour T helper1-type responses to BCG in calves. Veterinary Research, v. 47, n. 85,
2016.
67
HASKÓ, G. et al. An agonist of adenosine A3 receptors decreases interleukin-12 and
interferon-g production and prevents lethality in endotoxemic mice. European journal
of pharmacology, v. 358, p. 261-268, 1998.
HASKÓ, G., PACHER, P. Regulation of Macrophage Function by Adenosine.
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, v. 32, n. 4, p. 865–869, 2012.
HATFIELD, S.M., SITKOVSKY, M. A2A Adenosine Receptor antagonists to weaken
the hypoxiaHIF-1α driven immunosuppression and improve immunotherapies of
cancer. Current Opinion in Pharmacology, v. 29, p. 90–96, 2016.
HOMANN, D., et al. CD40L blockade prevents autoimmune diabetes by induction of
bitypic NK/DC regulatory cells. Immunity, v. 16, p. 403–415, 2002.
JONES, D.E. et al. Early Enhanced Th1 Response after Leishmania amazonensis
Infection of C57BL/6 Interleukin-10-Deficient Mice Does Not Lead to Resolution of
Infection. Infection and Immunity, v. 70, n. 4, p. 2151-2158, 2002.
JORDAN, K.A., HUNTER, C.A. Regulation of CD8+ T cell responses to infection with
parasitic protozoa. Experimental Parasitology, v. 126, n. 3, p. 318-325, 2010.
KAMHAWI, S. Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: friends or foes?
Trends in parasitology, v. 22, n. 9, p. 439 -445, 2006.
KEDZIERSKI, L., EVANS, K.J. Immune responses during cutaneous and visceral
leishmaniasis. Parasitology, v. 141, n. 12, p. 1–19, 2014.
LANDFEAR, S.M. et al. Nucleoside and nucleobase transporters in parasitic protozoa.
Eukaryot Cell, v. 3, p. 245-254, 2004.
LANIER, L.L. NK cell recognition. Annual Review of Immunology, v. 23, p. 225–274,
2005.
LASKAY, T. et al. Early parasite containment is decisive for resistance to Leishmania
major infection. European Journal of Immunology, v. 25, p. 2220-2227, 1995.
LAURENTI, M.D. et al. The role of natural killer cells in the early period of infection in
murine cutaneous leishmaniasis. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, v. 32, p. 323–325, 1999.
68
LEE, H.S. et al. Suppression of inflammation response by a novel A₃ adenosine
receptor agonist thio-Cl-IB-MECA through inhibition of Akt and NF-κB signaling.
Immunobiology, v. 216, p. 997–1003, 2011.
LIEKE, T. et al. Leishmania surface protein gp63 binds directly to human natural killer
cells and inhibits proliferation. Clinical and Experimental Immunology, v. 153, n. 2,
p. 221-230, 2008.
LIEKE, T. et al. The interplay between Leishmania promastigotes and human Natural
Killer cells in vitro leads to direct lysis of Leishmania by NK cells and modulation of NK
cell activity by Leishmania promastigotes. Parasitology, v. 138, n. 14, p. 1898-1909,
2011.
LOKSHIN, A. et al. Adenosine-mediated inhibition of the cytotoxic activity and cytokine
production by activated natural killer cells. Cancer Research, v. 66, p. 7758–7765,
2006.
LUCAS, M. et al. Natural Killer cell-mediated control of infections requires production
of interleukin 15 by type I IFN-triggered Dendritic Cells. Immunity, v. 26, n. 4, p. 503–
517, 2007.
LUTZ, M.B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly
pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods,
v. 223, n. 1, p. 77-92, 1999.
MAIOLI, T.U. et al. Immune response induced by New World Leishmania species in
C57BL/6 mice. Parasitology Research, v. 94, n. 3, p. 207–122, 2004.
MAROOF, A. et al. Post-transcriptional regulation of IL-10 gene expression allows NK
cells to express immunoregulatory function. Immunity, v. 29, n. 2, p. 295-305, 2008.
MARQUES-DA-SILVA, C. et al. Infection with Leishmania amazonensis upregulates
purinergic receptor expression and induces host-cell susceptibility to UTP-mediated
apoptosis. Cellular Microbiology, v. 13, n. 9, p. 1410–1428, 2011.
MARQUES-DA-SILVA, E.A. et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania:
influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes and Infection, v.
10, p. 850–857, 2008.
69
MAUEL, J. et al. Studies on the mechanisms of macrophage activation. I. Destruction
of intracellular Leishmania enriettii in macrophages activated by cocultivation with
stimulated lymphocytes. Journal of Experimental Medicine, v. 148, n. 2, p. 393-407,
1978.
MOFFETT-KING, A. Natural killer cells and pregnancy. Nature Immunology, v. 2, p.
656–663, 2002.
MOSMANN, T.R. et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according
to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of Immunology, v.
136, p. 2348–2357, 1986.
O’SULLIVAN, T.E. et al. Natural killer cell memory, Immunity, v. 43, p. 634-645, 2015.
OVERATH, P., HARBECKE, D. Course of Leishmania infection in beta 2-
microglobulin-deficient mice. Immunology Letters, v. 37, p. 13–17, 1993.
PANTHER, E. et al. Adenosine affects expression of membrane molecules, cytokine
and chemokine release, and the T cell stimulatory capacity of human dendritic cells.
Blood journal, v. 101, p. 3985–3990, 2003.
PANTHER, E. et al. Expression and function of adenosine receptors in human
dendritic cells. FASEB Journal, v. 15, p. 1963–1970, 2001.
PERES-SAMPAIO, C.E. et al. An Ecto-ATPase Activity Present in Leishmania tropica
Stimulated by Dextran Sulfate. Zeitschrift für Naturforschung, v. 56, p 820-825,
2001.
PETERS, N.C. et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in
leishmaniasis transmitted by sand flies. Science, v. 321, p. 970-974, 2008.
PETROVSKI, G. et al. Phagocytosis of cells dying through autophagy induces
inflammasome activation and IL-1β release in human macrophages. Autophagy, v. 7,
p. 321–330, 2011.
PINHEIRO, C.M. et al. Leishmania amazonensis: Biological and biochemical
characterization of ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase activities.
Experimental Parasitology, v. 114, p. 16–25, 2006.
70
PIRMEZ, C. et al. Cytokine patterns in the pathogenesis of human leishmaniasis.
Journal of Clinical Investigation, v. 91, n. 4, p. 1390-1395, 1993.
PRAJEETH, C.K. et al. Leishmania-Infected Macrophages Are Targets of NK Cell-
Derived Cytokines but Not of NK Cell Cytotoxicity. Infection and immunity, v. 79, n.
7, p. 2699–2708, 2011.
PRIEBE, T. et al. Adenosine receptors and modulation of natural killer cell activity by
purine nucleosides. Cancer Research, v. 50, p. 4328–4331, 1990.
RASKOVALOVA, T. et al. Gs protein-coupled adenosine receptor signaling and lytic
function of activated NK cells. Journal of Immunology, v. 175, p. 4383–4391, 2005.
REINER, S.L. et al. Leishmania Promastigotes Evade Interleukin 12 (IL-12) Induction
by Macrophages and Stimulate a Broad Range of Cytoklnes from CD4 + T Cells during
Initiation of Infection. Journal of Experimental Medicine, v. 179, p. 447-456, 1994.
REIS, L.C. et al. Mecanismos imunológicos na resposta celular e humoral na
leishmaniose tegumentar americana. Revista de Patologia Tropical, v. 35, p.103-15,
2006.
SACKS, D., NOBEN-TRAUTH, N. The immunology of susceptibility and resistance to
Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology, v. 2, n. 11, p. 845-858,
2002.
SACKS, D.L., PERKINS, P.V. Identification of an infective stage of Leishmania
promastigotes. Science, v. 223, p. 1417–1419, 1984.
SANABRIA, M.X.H. et al. Role of Natural Killer Cells in Modulating Dendritic Cell
Responses to Leishmania amazonensis Infection. Infection and Immunity, v. 76, n.
11, p. 5100-5109, 2008.
SCHARTON, T.M., SCOTT, P. Natural killer cells are a source of interferon gamma
that drives differentiation of CD4+ T cell subsets and induces early resistance to
Leishmania major in mice. The Journal of Experimental Medicine, v.178, p. 567–
577, 1993.
SCHARTON-KERSTEN, T. et al. IL-12 is required for natural killer cell activation and
subsequent T helper 1 cell development in experimental leishmaniasis. Journal of
Immunology, v. 154, p. 5320-5330, 1995.
71
SCHLEICHER, U. et al. NK cell activation in visceral leishmaniasis requires TLR9,
myeloid DCs, and IL-12, but is independent of plasmacytoid DCs. The Journal of
Experimental Medicine, v. 204, n. 4, p. 893–906, 2007.
SCHMID, M. et al. Characteristics of “Tip-DCs and MDSCs” and their potential role in
leishmaniasis. Frontiers in Microbiology, v. 3, n. 74, p. 1-8, 2012.
SCOTT, P. IFN-gamma modulates the early development of Th1 and Th2 responses
in a murine model of cutaneous leishmaniasis. Journal of Immunology, v. 147, n. 9,
p. 3149-3155, 1991.
SÉGUIN, O., DESCOTEAUX, A. Leishmania, the phagosome, and host responses:
the journey of a parasite. Cell Immunology, v. 309, p. 1–6, 2016.
SERBINA, N.V. et al. TNF/iNOS-Producing Dendritic Cells Mediate Innate Immune
Defense against Bacterial Infection. Immunity, v. 19, p. 59–70, 2003.
SHAW, J. Ecological and evolutionary pressures on leishmanial parasites. Brazilian
Journal of Genetics, v. 20, p. 123–128, 1997.
SHI, F.D., et al. Natural killer cells determine the outcome of B cell mediated
autoimmunity. Nature Immunology, v. 1, p. 245–251, 2000.
SILVEIRA, F. T. et al. Immunopathogenic competences of Leishmania (V.) braziliensis
and L. (L.) amazonensis in American cutaneous leishmaniasis. Parasite Immunology,
v. 31, n. 8, p. 423-431, 2009.
SILVEIRA, F.T. et al. Clinical and immunopathological spectrum of American
cutaneous leishmaniasis with special reference to the disease in Amazonian Brazil.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 99, p. 239–251, 2004.
SMYTH, M.J. et al. CD4+CD25+ T Regulatory Cells Suppress NK Cell-Mediated
Immunotherapy of Cancer. Journal of Immunology, v. 176, p. 1582-1587, 2006.
SPATH, G. F., BEVERLEY, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for
isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient
centrifugation. Experimental Parasitology, v. 99, n. 2, p. 97-103, 2001.
72
SYPEK, J.P. et al. Resolution of cutaneous leishmaniasis: Interleukin 12 initiates a
protective T helper type 1 immune response. The Journal of Experimental Medicine,
v. 177, p. 1797–1802, 1993.
UENO, N., WILSON, M.E. Receptor-mediated phagocytosis of Leishmania:
implications for intracellular survival. Trends in Parasitology, v. 28, n. 8, p. 335-344,
2012.
VANCE, R.E. et al. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the
nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1b. Journal
of Experimental Medicine, v. 188, p. 1841–1848, 1998.
VASQUEZ, R.E. et al. Effects of CXCL10 on dendritic cell and CD4+ T-cell functions
during Leishmania amazonensis infection. Infection and Immunity, v. 76, n. 1, p.
161–169, 2008.
VIJAYAMAHANTESH, A. et al. Up regulation of A2B adenosine receptor on monocytes
are crucially required for immune pathogenicity in Indian patients exposed to
Leishmania donovani. Cytokine, v. 79, p. 38–44, 2016.
VIVIER, E. et al. Functions of natural killer cells. Nature Immunology, v. 9, n. 5, p.
503–510, 2008.
WILSON, J.M. et al. The A2B adenosine receptor promotes Th17 differentiation via
stimulation of dendritic cell IL-6. Journal of Immunology, v. 186, p. 6746–6752, 2011.
WU, Y. et al. Developmental and Functional Control of Natural Killer Cells by
Cytokines. Frontiers in Immunology, v. 8, p. 930, 2017.
XIN, L. et al. Down-regulation of dendritic cell signaling pathways by Leishmania
amazonensis amastigotes. Molecular immunology, v. 45, n. 12, p. 3371-3382, 2008.
YEGUTKIN, G.G. Nucleotide- and nucleoside-converting ectoenzymes: important
modulators of purinergic signaling cascade. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1783,
p. 673–694, 2008.
YOUNG, A. et al. Co-inhibition of CD73 and A2AR Adenosine Signaling Improves Anti-
tumor Immune Responses Cancer Cell, v. 30 n. 3, p. 391-403, 2016.
73
ZANDBERGEN, G.V. et al. Cutting edge: neutrophil granulocyte serves as a vector for
Leishmania entry into macrophages. Journal of Immunology, v. 173, p. 6521-6525,
2004.
ZHU, J. et al. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations. Annual review of
immunology, v. 28, p. 445-489, 2010.
74
ANEXOS
1. Certificado de aprovação do CEUA/UFOP n° 2015/62