Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular

Estudo de polimorfismos no locus do gene

CDX2 em Portugal e Moçambique.

Relação com o desenvolvimento da metaplasia

intestinal gástrica

Nuno Miguel Morais Mendes

2008

- 2 -

DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA

AO GRAU DE MESTRE

APRESENTADA À FACULDADE DE

MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO

PORTO

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Artigo 48.º, parágrafo 3:

“A Faculdade não responde pelas doutrinas expendidas na dissertação.”

(Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto – Decreto n.º 19337

29 de Janeiro de 1931)

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AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar um agradecimento muito especial à minha chefe, Prof. Leonor

David, pela forma como me recebeu no grupo, pelo apoio, pela força, pelo incentivo e

pela confiança que sempre depositou em mim ao longo destes quase 6 anos de trabalho

e convívio diários. É uma honra trabalhar consigo…

À Raquel Almeida, minha orientadora, agradeço a amizade e a forma como me ajudou a

“desligar o complicador” e a organizar este trabalho.

Agradeço à Prof. Leonor Gusmão, minha co-orientadora, pela paciência e tempo

disponibilizados durante o procedimento experimental e pela ajuda na análise e

interpretação de resultados. Não foi fácil entrar no mundo da Genética Populacional!

À Sandra Beleza: obrigado pelas horas que “perdeste” comigo, pela forma como me

entusiasmaste e ajudaste numa altura complicada. Parte deste trabalho é teu!

Agradeço à Luísa Azevedo pela ajuda preciosa na fase da discussão dos resultados, pela

disponibilidade que sempre teve e pela forma como me transmitiu muitos conceitos da

Genética Populacional de modo a fazerem sentido.

Agradeço ao Prof. Sobrinho-Simões, Director do Mestrado em Medicina e Oncologia

Molecular e Director do IPATIMUP, pela oportunidade de realizar este Curso.

Agradeço à Fundação Calouste Gulbenkian pelo financiamento do projecto que permitiu

a realização deste trabalho.

Agradeço à Elisabetezinha pela ajuda e apoio constantes ao longo da execução deste

trabalho e pelas conversas animadas de fim de tarde!

A todo o grupo das mucinas e em particular àqueles que me ajudaram, “aturaram” e

ouviram ao longo deste percurso. Obrigado Ana Maria, Ana Carvalho, Bruno (obrigado

pelas imagens!), Salomé, Lara, Natália e Vânia. Obrigado pelas conversas, pela boa

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disposição que sempre transmitiram e pelas “dicas” informáticas que muito me

ajudaram! Não posso deixar de agradecer a algumas pessoas que embora já não estejam

no Instituto, foram muito importantes no início da minha caminhada pelo mundo da

investigação: obrigado Jace, Patrícia e Sandra!

Aos meus pais e irmão que estão sempre do meu lado e me apoiam em tudo. Obrigado

pela força, confiança, carinho e paciência.

Por fim e não menos importante, agradeço a quem esteve comigo nesta última fase e me

apoiou sempre com muito carinho e compreensão.

Este trabalho foi financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian, projecto

n.º FC-68697 – “Estudo de factores biológicos e de estilos de vida que

contribuam para perceber as diferenças entre a incidência de carcinoma

gástrico em dois países com grande prevalência de infecção por

Helicobacter pylori: Moçambique e Portugal”

ÍNDICE

ABREVIATURAS--------------------------------------------------------------------------------9

RESUMO------------------------------------------------------------------------------------------11

ABSTRACT---------------------------------------------------------------------------------------13

CAPÍTULO I – Introdução--------------------------------------------------------------------15

1.1. Carcinogénese gástrica-------------------------------------------------------------15

1.2. Metaplasia intestinal- definição e caracterização-------------------------------17

1.3. Factores de susceptibilidade no desenvolvimento de MI----------------------19

1.4. CDX2 e metaplasia intestinal------------------------------------------------------22

1.5. Situação em África- o “Enigma Africano”--------------------------------------23

CAPÍTULO II – Objectivos-------------------------------------------------------------------25

CAPÍTULO III – Materiais e Métodos------------------------------------------------------27

3.1. Amostragem populacional---------------------------------------------------------27

3.1.1. Selecção das amostras------------------------------------------------------------28

3.1.2. Efectivo amostral-----------------------------------------------------------------29

3.2. Selecção dos “Single Nucleotide Polymorphisms”-----------------------------29

3.2.1. Desenho dos oligonucleótidos para PCR--------------------------------------31

3.3. Amplificação por “PCR Multiplex”----------------------------------------------32

3.3.1. Purificação dos produtos de “PCR multiplex”--------------------------------33

3.4. Desenho dos oligonucleótidos para SBE----------------------------------------34

3.5. Reacção de SnaPshot® multiplex-------------------------------------------------35

3.5.1. Análise das amostras no “ABI PRISM 3100 Genetic Analyser”-----------37

3.6. Análise estatística-------------------------------------------------------------------37

- 8 -

CAPÍTULO IV – Resultados------------------------------------------------------------------39

4.1. Polimorfismos analisados no locus do gene CDX2----------------------------40

4.2. Minisequenciação por SNaPshot multiplex®------------------------------------40

4.3. Frequências alélicas-----------------------------------------------------------------42

4.4. Caracterização e representação haplotípica--------------------------------------44

4.5. Análise do Equilíbrio de Hardy-Weinberg--------------------------------------49

4.6. Análise de Linkage Disequilibrium-----------------------------------------------50

4.7. Análise de Variância Molecular – AMOVA------------------------------------52

4.7.1. AMOVA total---------------------------------------------------------------------52

4.7.2. AMOVA para cada marcador---------------------------------------------------54

CAPÍTULO V – Discussão---------------------------------------------------------------------57

CAPÍTULO VI – Conclusão-------------------------------------------------------------------70

ANEXO I ------------------------------------------------------------------------------------------71

CAPÍTULO VII - Referências Bibliográficas----------------------------------------------72

Abreviaturas

_____________________________________________________________________________________

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ABREVIATURAS

ADN- Ácido desoxirribonucleico

AMOVA- Análise de Variância Molecular

BabA- “Blood-group antigen binding adhesin A”

CagA- “Cytotoxin associated gene A”

CCR- Carcinoma do cólon e recto

DAPI- 4’,6-diamidino-2-fenilindole

FST- Índice de Fixação

H. pylori- Helicobacter pylori

HWE- Equilíbrio de Hardy-Weinberg

IGFBP-3- “Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3”

IL- Interleucina

LD- “Linkage Disequilibrium”

LOH- Perda de Heterozigotia

MI- Metaplasia intestinal

MUC1- Mucina tipo 1

MUC2- Mucina tipo 2

MUC5AC- Mucina tipo 5AC

MUC6- Mucina tipo 6

PCR- “Polymerase Chain Reaction”

SBE- “Single Base Extension”

SNP- “Single Nucleotide Polymorphism”

Tm- Temperatura de “melting”

TNF- “Tumor Necrosis Factor”

Abreviaturas

_____________________________________________________________________________________

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VacA- “Vacuolating associated cytotoxin A”

VNTR- “Variable Number of Tandem Repeat”

Resumo

_____________________________________________________________________________________

- 11 -

RESUMO

O carcinoma gástrico constitui a segunda causa de mortalidade associada ao cancro no

mundo. Uma grande parte dos casos de carcinoma gástrico de tipo intestinal é explicada

pela inflamação crónica da mucosa gástrica provocada pela infecção pela H. pylori. Esta

infecção desencadeia uma série de eventos na mucosa gástrica tais como gastrite,

gastrite crónica atrófica e, em alguns casos, metaplasia intestinal (MI). Entre populações

Europeias e Africanas há uma grande diferença na proporção de indivíduos que

desenvolvem metaplasia intestinal no contexto da infecção pela H. pylori. Um dos

factores envolvidos na infecção e desenvolvimento de lesões gástricas associadas reside

nas características genéticas do hospedeiro. Num indivíduo adulto, o gene CDX2 é o

“master gene” envolvido no estabelecimento e manutenção do epitélio intestinal normal

e o seu papel na transdiferenciação da mucosa gástrica em mucosa de tipo intestinal

encontra-se bem definido e caracterizado. Contudo não há estudos que relacionem

polimorfismos no gene CDX2 com o desenvolvimento de MI. Um dos objectivos deste

trabalho consistiu no estudo da distribuição das variantes alélicas de 8 SNPs no locus do

gene CDX2 em duas populações, Portuguesa e Moçambicana, em indivíduos com e sem

MI. Identificamos um SNP (rs9285356) na população Portuguesa que se associa

significativamente (P≤0,05) com a MI e, na população Moçambicana, um SNP

(rs3812862) no promotor do CDX2 potencialmente associado com a MI. Verificamos

haver, para este SNP, um aumento significativo de indivíduos homozigóticos T no

subgrupo MI- em comparação com o subgrupo MI+. O segundo objectivo deste trabalho

foi estudar a distribuição haplotípica dos 8 SNPs nas duas populações, Portuguesa e

Moçambicana, em indivíduos com e sem MI. Identificamos um haplótipo na população

Moçambicana que se associa significativamente com o subgrupo Moçambicano sem

Resumo ______________________________________________________________________________________________

- 12 -

metaplasia intestinal (haplótipo H23). No último ponto deste trabalho verificamos que

não há indícios de ancestralidade genética europeia no subgrupo Moçambicano MI+ e

que não é este o factor envolvido na maior predisposição destes ao desenvolvimento de

MI, em relação à maioria da população.

Perante estes achados, a realização de estudos funcionais e o aumento do efectivo

amostral do subgrupo Moçambicano com MI são tarefas fundamentais para suportar a

hipótese de que polimorfismos no gene CDX2 poderão ter um efeito “facilitador” ou

“inibidor” do desenvolvimento de MI.

Abstract ______________________________________________________________________________________________

- 13 -

ABSTRACT

Gastric cancer constitutes the second leading cause of cancer-related death in the world.

The majority of intestinal-type gastric carcinomas are explained by chronic

inflammation upon H. pylori infection. This infection undergoes a cascade of events in

the gastric mucosa like gastritis, chronic atrophic gastritis and, in some cases, intestinal

metaplasia (IM). Among European and African populations there is a substancial

difference in the proportion of individuals that develop intestinal metaplasia after H.

pylori infection. The host genetic background constitutes an important factor involved

in the susceptibility to develop gastric alterations associated with the infection. In

adults, CDX2 is a master gene involved in the establishment and maintenance of the

normal intestinal epithelium. It plays a role in the transdifferentiation of the gastric

mucosa into an intestinal phenotype. However there are no studies focusing on CDX2

polymorphisms and the potential to develop gastric IM. The first aim of this work was

to study the allelic distribution of 8 SNPs in the CDX2 locus in two populations,

Portuguese and Mozambican, in subjects with and without intestinal metaplasia. We

identified a SNP (rs9285356) in the Portuguese population which is associated (P≤0.05)

with IM and a different SNP (rs3812862) in the Mozambican population located in the

promoter region of the CDX2 gene, with suggestion of a negative association with the

IM phenotype. We observed, for this SNP, a significant increase in homozygous

subjects with the T variant in the subgroup without IM. The second aim was to evaluate

the haplotypic distribution of the 8 SNPs in the two populations, Portuguese and

Mozambican, in subjects with and without IM. We identified a haplotype in the

Mozambican population associated (P≤0.05) with the subgroup without IM (H23

haplotype). We also show that there is no evidence of European genetic ancestry in the

Abstract ______________________________________________________________________________________________

- 14 -

Mozambican subgroup with IM, and that this factor is not involved in the higher

susceptibility to IM in these subjects, when compared with the majority of the

population. Functional studies and increasing the number of Mozambican subjects with

IM are essential to confirm the hypothesis that CDX2 polymorphisms can have a

“facilitating” or “inhibitory” effect in the metaplastic process.

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 15 -

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO

1.1. Carcinogénese gástrica

O carcinoma gástrico constitui a segunda causa de mortalidade associada a cancro no

mundo (1), embora com taxas de incidência muito variáveis nos 5 continentes (Figura

1).

Figura 1:

Mapa ilustrativo da incidência de cancro do estômago no mundo: incidência maior (laranja e

vermelho) em países em vias de desenvolvimento (países Asiáticos e da América do Sul) e

menor (verde claro e verde escuro) na América do Norte, grande parte do continente Africano,

Índia e Austrália. Portugal é o país da Europa com maior incidência de cancro gástrico.

Adaptado de Nature Reviews Cancer 4, 909-917 (November 2004).

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 16 -

Existem dois subtipos histológicos principais de adenocarcinoma gástrico, o intestinal e

o difuso. O primeiro desenvolve-se na sequência de uma série de lesões que incluem a

gastrite crónica, a gastrite crónica atrófica, a metaplasia intestinal (MI) e a displasia,

alterações estas que foram descritas como precursoras deste tipo de cancro gástrico por

Pelayo Correa (2) (Figura 2). Uma grande parte dos casos de adenocarcinoma gástrico

de tipo intestinal é explicada pela inflamação crónica da mucosa gástrica provocada pela

infecção pela Helicobacter pylori (H. pylori), uma bactéria Gram-negativa capaz de

colonizar o ambiente ácido característico do estômago humano.

Figura 2:

Cascata de eventos envolvidos na carcinogénese gástrica e subtipos histológicos de carcinoma.

A mucosa gástrica normal é negativa para o CDX2. Após infecção pela Helicobacter pylori as

glândulas gástricas metaplásicas expressam “de novo” CDX2 e a progressão para carcinoma de

tipo intestinal ocorre acompanhada de alterações nos padrões de expressão de vários genes tais

como APC (“adenomatous polyposis coli”), TGF-βRII (“transforming growth factor-β receptor

II”), MLH1 (“MutL homolog 1”). Adaptado de Nature Reviews Cancer 3, 592-600 (Agosto de

2003).

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 17 -

São vários os factores capazes de influenciar a possibilidade de, perante a presença de

infecção, haver progressão das lesões associadas à carcinogénese gástrica e, em última

instância, ao desenvolvimento de cancro. Tais factores incluem a susceptibilidade

genética individual do hospedeiro (exemplos: polimorfismos em genes das citoquinas

pró-inflamatórias, genes que codificam estruturas que constituem ligandos para a

bactéria), factores de virulência da estirpe bacteriana (genes associados a citotoxicidade)

e factores ambientais (exemplos: tabaco, dieta). Contudo, apenas uma pequena

proporção (inferior a 1%) dos indivíduos infectados irá desenvolver adenocarcinoma

gástrico (3).

1.2. Metaplasia intestinal- definição e caracterização

Metaplasia é o nome comum utilizado para caracterizar a substituição de um tecido por

outro. Em tecidos epiteliais as formas mais comuns de metaplasia ocorrem a nível

respiratório, esofágico e gástrico, em resposta a diferentes estímulos (4). No caso da

metaplasia do epitélio respiratório há substituição deste por um de tipo escamoso, muito

comum em indivíduos fumadores. Em indivíduos com refluxo gastro-duodenal é

comum o epitélio escamoso do esófago ser substituído por um epitélio glandular de tipo

intestinal, alteração conhecida como esófago de Barrett. Em indivíduos infectados pela

H. pylori é frequente a substituição do epitélio gástrico por um de tipo intestinal. Em

todos estes casos há estudos que indicam haver uma relação entre o desenvolvimento de

metaplasia e a progressão para carcinoma (4).

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 18 -

A metaplasia intestinal pode ser definida como um processo de transdiferenciação

tecidular, que não se sabe com segurança se é reversível e com evidência clara na

progressão para carcinoma numa pequena percentagem de casos (4). De acordo com o

modelo proposto por Pelayo Correa em 1992 a MI gástrica surge após infecção pela H.

pylori (2). Estudos posteriores com modelos animais vieram reforçar este modelo na

medida em que gerbilos da Mongólia infectados com H. pylori desenvolveram lesões de

MI e, após infecções prolongadas, carcinoma gástrico (5, 6, 7).

Após a identificação de novos marcadores de diferenciação gástrica e intestinal,

nomeadamente marcadores para mucinas, a MI passou a ser dividida em 2 subtipos

principais (8, 9): completa (intestinal), caracterizada pela perda de mucinas gástricas

(MUC1, MUC5AC e MUC6) e ganho de mucinas de tipo intestinal (MUC2), e

incompleta (mista gastro-intestinal), caracterizada pela presença quer das mucinas de

tipo gástrico quer da mucina intestinal MUC2 (8) (Figura 3).

Em pacientes com MI o risco de desenvolvimento de cancro gástrico está aumentado,

apesar de só uma pequena proporção de indivíduos infectados pela H. pylori

desenvolver MI (3). Os indivíduos que desenvolvem lesões de MI, em particular

aqueles com MI de tipo incompleto (previamente classificada como MI tipo III) têm o

risco de desenvolvimento de carcinoma gástrico aumentado em 4 vezes. (10, 11).

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 19 -

Figura 3:

Imunofluorescência dupla em corte de mucosa gástrica com metaplasia intestinal de tipo

incompleto – Há co-expressão de MUC2 (vermelho) e de MUC5AC (verde). Marcação de ADN

(azul) com DAPI. Adaptado de Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 54: 585-591, 2006.

1.3. Factores de susceptibilidade no desenvolvimento de metaplasia

intestinal

Um dos factores a ter em conta no que respeita ao desenvolvimento de MI num contexto

de infecção pela H. pylori reside nas características genéticas da bactéria,

nomeadamente nos genes CagA (“cytotoxin associated gene A”), VacA (“vacuolating

associated cytotoxin A”) e BabA (“blood-group antigen binding adhesin A”).

Actualmente sabe-se que indivíduos infectados com estirpes cagA+, vacA s1m1 e

BabA2+ têm maior predisposição para desenvolver lesões de MI (12, 13, 14, 15, 16, 17,

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 20 -

18), em contraste com aqueles infectados por estirpes bacterianas negativas para o

produto dos genes BabA2 e CagA e do subtipo Vac s2m2 (18).

A susceptibilidade genética individual também constitui um importante factor na

predisposição e progressão das lesões associadas à infecção. Estudos “in vivo”

demonstraram que a MI induzida pela radiação X é dependente da estirpe de rato

utilizada na experimentação (19, 20).

Estudos em populações humanas baseados em pesquisa de polimorfismos também

apontam para este facto: polimorfismos no gene que codifica para a mucina MUC1,

nomeadamente indivíduos com as chamadas “mucinas pequenas” (“small” VNTRs,

“Variable Number of Tandem Repeats”) têm maior predisposição para desenvolver MI

de tipo incompleto (21, 22). Ainda relativamente à MUC1, um estudo recente

demonstrou que a adesão da H. pylori a linhas celulares humanas de carcinoma gástrico

está inversamente relacionada com o tamanho dos VNTRs do domínio

extracitoplasmático da proteína (23).

Um aumento no risco de desenvolvimento de MI no antro foi também identificado em

indivíduos portadores de polimorfismos no gene IGFBP-3 (“Insulin-like Growth Factor

Binding Protein-3”) associados a baixos níveis séricos de IGFBP-3 (24).

Polimorfismos em genes pró-inflamatórios (interleucinas, IL) também se associam a

risco variável de MI: SNPs (“Single Nucleotide Polymorphisms”) identificados na IL-

1β RN estão associados a aumento de risco de desenvolvimento de MI (25, 26, 27) e

SNPs na IL-1 estão relacionados com o aumento da prevalência de MI (26, 27, 28, 29).

No caso dos polimorfismos da IL-10 há variantes que conferem aumento de risco e

outras que são “protectoras”: o genótipo 819T/T na IL-10 favorece o desenvolvimento

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 21 -

de MI e carcinoma gástrico (“non-cardia gastric carcinoma”) (30), o “low activity

allele” do SNP IL10-1082 está associado ao aumento em 60% do risco de

desenvolvimento de MI e displasia (31) e o genótipo IL10-592C/A também está

associado ao desenvolvimento de MI enquanto o alelo G da IL-6-576 tem um efeito

protector (32). O alelo IL-8-251A está associado com o desenvolvimento de lesões

gástricas precursoras (incluindo MI), displasia e carcinoma pois promove um aumento

na produção de interleucina-8 intensificando a reacção inflamatória local (33).

Em indivíduos H. pylori positivos o genótipo -463G/G no gene da mieloperoxidase

(MPO) está associado ao aumento na produção de mieloperoxidase e desenvolvimento

de MI no antro gástrico enquanto o alelo A está associado ao desenvolvimento de MI no

fundo (34). A substituição Thr3991leu no gene TLR-4 (“Toll-Like Receptor-4”) pode

também ser considerada como um factor de risco no desenvolvimento de gastrite e MI

(35). Foram também já descritos polimorfismos funcionais em genes envolvidos na

apoptose: em indivíduos H. pylori positivos, os genótipos do FAS e FASL (membros da

família do TNF (“Tumor Necrosis Factor”) do hospedeiro são determinantes na

patogénese da gastrite crónica atrófica e MI (36).

Existe também uma relação de potenciação na associação de polimorfismos em genes

do hospedeiro com polimorfismos em genes bacterianos: a presença do alelo IL-1B-

511T no hospedeiro com o subtipo vacA m1 bacteriano aumenta significativamente o

risco de desenvolvimento de MI, em comparação com indivíduos infectados com o

subtipo de baixo risco vacA m2 (28, 29).

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 22 -

1.4. CDX2 e metaplasia intestinal – regulação do processo de

transdiferenciação

O CDX2 é um gene pertencente à família “homeobox” e a caracterização do seu papel

como factor de transcrição crucial na diferenciação intestinal data de 1996 (37). Está

localizado no cromossoma 13q12.3 (38) e num indivíduo adulto é normalmente

expresso apenas no epitélio intestinal sendo importante no estabelecimento e na

manutenção da arquitectura intestinal normal (37). Estudos com ratinhos

heterozigóticos CDX2+/- demonstraram a importância do seu papel na medida em que

estes desenvolveram lesões polipóides no intestino, como resultado da perda local de

expressão do CDX2 (39, 40). Mais recentemente, estudos experimentais in vivo

utilizando ratinhos transgénicos com expressão ectópica do CDX2 no estômago levaram

a concluir que, para além do seu papel na diferenciação intestinal, o CDX2 está também

envolvido na transdiferenciação da mucosa gástrica em mucosa de tipo intestinal pois

estes desenvolveram lesões de MI no estômago (41, 42). Para além da expressão do

CDX2 nas lesões de MI gástrica (43) esta foi também descrita em outros órgãos sujeitos

ao processo de transdiferenciação intestinal: esófago (44), fígado (45) e vesícula biliar

(46). Estas observações levam a afirmar que o CDX2 não é apenas responsável pela

diferenciação intestinal normal mas também pela diferenciação intestinal em

localizações aberrantes (4).

Um outro gene que parece ser importante na diferenciação intestinal é o CDX1,

homólogo do CDX2 mas, ao contrário do segundo, o seu papel não está tão bem

definido (47, 48). Contudo sabe-se que há expressão de CDX1 nas lesões de metaplasia

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 23 -

intestinal em vários órgãos, incluindo no estômago (43), e que ratinhos transgénicos

para o CDX1 também desenvolvem lesões de metaplasia intestinal gástrica (49).

O CDX2 e/ou o CDX1 actuam como factores de transcrição de diversos genes

envolvidos em processos de diferenciação intestinal tais como sucrase-isomaltase,

proglucagon, receptor da vitamina D, MUC2, entre muitos outros (4).

Neste contexto torna-se evidente o importante papel do CDX2 como um “master gene”

envolvido no processo de transdiferenciação intestinal da mucosa gástrica.

1.5. Situação em África- o “Enigma Africano”

Um estudo publicado em 2005 por Liu et al. (50) revelou, em Portugal, uma taxa de

infecção pela H. pylori de 88,4% (n=221) e uma taxa de desenvolvimento de MI na

ordem dos 34% (n=75). Em Moçambique, um estudo realizado em 2008 revelou uma

taxa de infecção pela H. pylori de 94,5% (n=103) e destes somente 10,1% (n=11)

desenvolveram lesões de MI (51).

Em África, a diferença encontrada entre as taxas de infecção pela H. pylori e o

desenvolvimento de MI e carcinoma gástrico num contexto de infecção é conhecido

como o “Enigma Africano” (52). Este “enigma” traduz uma quebra na cascata de

eventos que ocorre na carcinogénese gástrica, isto é, taxas elevadas de infecção pela H.

Introdução ______________________________________________________________________________________________

- 24 -

pylori e taxas muito reduzidas de desenvolvimento das lesões gástricas associadas à

infecção, nomeadamente lesões de metaplasia intestinal e de carcinoma gástrico (53).

A primeira descrição deste fenómeno data de 1992 (52). Desde então, alguns estudos

foram executados em diferentes populações Africanas e em 1999 Kidd et al, num estudo

de revisão, verificou que a taxa de infecção pela H. pylori no contexto Africano era de

aproximadamente 72%, variando desde os 25% no Uganda e os 97% no Ghana e uma

taxa de desenvolvimento de MI na ordem dos 14% (54). Mais recentemente um estudo

realizado na Etiópia observou uma sero-prevalência de anticorpos anti-H. pylori na

ordem dos 85,6% (55). Esta relação entre índices elevados de infecção pela H. pylori e

baixas taxas de desenvolvimento de MI e de outras lesões gástricas associadas foi

também encontrada na Gâmbia (56) e na Costa do Marfim (57).

Objectivos

_____________________________________________________________________________________

- 25 -

CAPÍTULO II - OBJECTIVOS

O papel do CDX2 no desenvolvimento de MI no contexto de infecção pela H. pylori

encontra-se bem definido e caracterizado. Contudo, não há estudos que envolvam a

pesquisa de polimorfismos no gene CDX2 e os relacionem com o desenvolvimento de

metaplasia intestinal. Este facto levou-nos a averiguar se 8 SNPs localizados no gene

CDX2 e regiões flanqueantes se associavam ao desenvolvimento de MI, no contexto da

infecção pela H. pylori, em duas populações distintas, uma Portuguesa (através do

estudo de uma amostra constituída por 120 indivíduos) e outra Moçambicana (numa

amostra constituída por 101 indivíduos). Um aspecto que esteve na base deste estudo é a

diferença encontrada entre populações Europeias e Africanas, ambas com grande

prevalência de infecção pela H. pylori mas com grandes diferenças no desenvolvimento

de MI e carcinoma gástrico de tipo intestinal.

Os objectivos foram:

1. Estudar a distribuição das variantes alélicas de 8 SNPs no locus do gene

CDX2, em 2 populações, Portugal e Moçambique, em indivíduos com e sem

metaplasia intestinal;

2. Estudar a distribuição dos haplótipos definidos pelos 8 SNPs estudados no

ponto 1, em 2 populações, Portugal e Moçambique, em indivíduos com e sem

metaplasia intestinal;

Objectivos

_____________________________________________________________________________________

- 26 -

3. Verificar se existe alguma associação entre as distribuições estudadas nos

pontos 1 e 2 e a susceptibilidade ou “protecção” ao desenvolvimento de MI nas

duas populações, consideradas em conjunto ou separadamente.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

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CAPÍTULO III. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Amostragem populacional

Foram utilizadas, no presente estudo, amostras de ADN genómico de duas populações,

uma população Portuguesa e uma população Moçambicana, obtidas em dois estudos

anteriores. O primeiro estudo, que permitiu a obtenção das amostras da população

Portuguesa, decorreu em 1998 e intitulou-se “Caracterização das lesões gástricas

associadas à infecção por Helicobacter pylori na população dos Estaleiros Navais de

Viana do castelo (ENVC)” e foi financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian

(Projecto n.ºFC-54918). As amostras da população Moçambicana foram obtidas através

de um estudo realizado em 2004 intitulado “ Estudo de factores biológicos e de estilos

de vida que contribuam para perceber as diferenças entre a incidência de carcinoma

gástrico em dois países com grande prevalência de infecção por Helicobacter pylori:

Moçambique e Portugal”, igualmente financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian

(Projecto n.º FC-68697).

Ambos os estudos incluíram, entre outros, colheita de sangue para posterior extracção

de ADN e colheita de fragmentos de mucosa gástrica, obtidos por endoscopia digestiva

alta, para caracterização histológica das lesões gástricas e determinação do estado de

infecção pela H. pylori e caracterização molecular da estirpe bacteriana em relação aos

genes vacA e cagA, por PCR (“Polymerase Chain Reaction”).

Os resultados destes estudos revelaram taxas de infecção por H. pylori muito

semelhantes entre as duas populações e prevalência de MI muito diferente. Em Portugal,

foram estudados 208 indivíduos, sendo detectada a bactéria em 197 casos (94,7%) e

metaplasia intestinal (MI) em 63 (30,3%) (58). Na população Moçambicana em 109

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 28 -

indivíduos estudados, 103 (94,5%) são H. pylori positivos e 11 (10,1%) desenvolveram

lesões de MI (51).

3.1.1. Selecção das amostras

Para este estudo foram seleccionados apenas indivíduos infectados pela H. pylori. Para

tal foram utilizados os resultados obtidos por caracterização histoquímica tecidular,

após a coloração pela técnica de Giemsa Modificado, e/ou por caracterização molecular

da estirpe bacteriana de H. pylori. Sucintamente, as estirpes bacterianas foram

caracterizadas em relação aos genes vacA e cagA por PCR, seguido de hibridação

reversa (LiPA- Line Probe Assay) com sondas específicas para os diferentes alelos. Para

este fim, foram utilizados fragmentos de biópsias gástricas congeladas ou incluídas em

parafina. A presença dos genes vacA e/ou cagA é indicativo de infecção, condição

major para o desenvolvimento de MI (59). Os indivíduos foram considerados H. pylori

positivos sempre que eram positivos pelo menos por uma das técnicas anteriormente

descritas. No que respeita à presença ou ausência de MI, os indivíduos foram

caracterizados por exame histológico através da técnica de Hematoxilina-Eosina,

método histológico de rotina e pela coloração de “Periodic Acid-Shiff-Alcian Blue, pH

2,5”.

Ambas as condições, presença de infecção pela H. pylori e presença/ausência de MI

foram obtidas por consulta às bases de dados dos dois estudos supracitados.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 29 -

3.1.2. Efectivo amostral

A amostra da população Portuguesa é constituída por 120 indivíduos infectados pela H.

pylori sendo que em 44 casos foi identificada a presença de metaplasia intestinal. No

que respeita à população Moçambicana foram seleccionados 101 indivíduos infectados

pela H. pylori dos quais 9 têm MI.

3.2. Selecção dos “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs)

Foram pesquisados 8 SNPs no locus do gene CDX2: 4 SNPs intragénicos e 4 SNPs

flanqueantes, 2 a 5’ e 2 a 3’ do gene, num limite de 10Kb. Na escolha dos SNPs teve-se

em conta a informação relativa às taxas de heterozigotia em diferentes populações,

nomeadamente em populações Europeias e Africanas, e a distância genómica entre eles,

tentando, sempre que possível, que a distância entre os SNPs fosse semelhante.

Na tabela 1 encontram-se as informações relativas à identificação e localização dos

SNPs seleccionados e a figura 4 representa esquematicamente a região do cromossoma

13 que contém o gene e regiões flanqueantes.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 30 -

Tabela 1: Localização dos 8 SNPs seleccionados no locus do gene CDX2 e no

cromossoma 13

SNP/Marcador

Localização em

relação ao CDX2

Posição no cromossoma

13*

SNP1 rs9554217 6,8 Kb a 5' 27448121

SNP2 rs3812862 1,8 Kb a 5' 27443126

SNP3 rs1805106 1º Exão 27440961

SNP4 rs3742110 1º Intrão 27437186

SNP5 rs2504211 2º Intrão 27435935

SNP6 rs2481952 3º Exão 27434901

SNP7 rs3003954 3,1 Kb a 3' 27431130

SNP8 rs9285356 9,3 Kb a 3' 27424975

*O gene CDX2 está invertido no cromossoma. Baseado no “Genome Browser Ensembl.org”

(http://ensembl.org), Homo sapiens Março 2008

As caixas a azul representam os exões

Identificação dos SNPs a negrito

*distância genómica entre os exões (em cima) e entre os SNPs (em baixo)

Figura 4: Representação esquemática do gene, regiões flanqueantes a 5’ e 3’,

posição relativa dos SNPs e distâncias genómicas entre eles

SNP 1

5’ 3’

SNP 8

5’

4,9 kb*

SNP 4

1 2 3 4,8Kb* 1,4Kb*

sSNP 7

SNP 6

SNP 2

SNP 3 SNP 5

2,1kb* 3,8kb* 1,3kb* 1Kb*

3,7 Kb*

6,1Kb

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 31 -

3.2.1. Desenho das sequências oligonucleotídicas para “Polymerase

Chain Reaction” (PCR)

Foram desenhados 8 pares de sequências oligonucleotídicas (oligos) para amplificar os

fragmentos de ADN que contêm cada um dos polimorfismos escolhidos. Para isso

recorreu-se ao programa “Primer 3”. Na escolha dos oligos teve-se em atenção o

desenho experimental de um PCR “Multiplex”, método que permite a amplificação

simultânea de vários fragmentos de ADN na mesma reacção. Um dos aspectos tidos em

conta foi a escolha de sequências com temperatura de melting (Tm) semelhante. Foi

também utilizado o programa “Primer Dimer” para verificar as taxas de dimerização

entre as sequências oligonucleotídicas seleccionadas. Este passo é de extrema

importância, pois a dimerização entre os pares de oligos que se utilizam em cada

reacção pode afectar e até mesmo comprometer a eficiência do PCR e o “multiplex”

(60). A tabela 2 apresenta as sequências dos 8 pares de oligonucleótidos desenhados, os

tamanhos dos fragmentos de ADN amplificados e as respectivas Tm.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 32 -

Tabela 2: Sequências dos oligonucleótidos utilizados na amplificação dos 8

fragmentos no locus do CDX2

*F, oligonucleótido “forward”; R, oligonucleótido “reverse”

3.3. Amplificação por “PCR Multiplex” e visualização dos fragmentos

Os oligonucleótidos e as condições do PCR foram testadas isoladamente e

posteriormente foram optimizadas as condições para a co-amplificação dos 8

fragmentos numa única reacção (“PCR multiplex”).

As condições de PCR utilizadas foram as descritas no kit “Qiagen Multiplex PCR

System”. Em resumo, para um volume final de 10µl utilizaram-se 5µl de “2x Qiagen

Mix” (mistura de tampão, enzima taq polimerase e dNTPs), 1µl da mistura de oligos,

que corresponde a uma concentração de 0,2 µM de cada um, 3,5µl de água esterilizada e

0,5µl de ADN genómico. A reacção de PCR foi levada a cabo num termociclador da

Par de oligonucleótidos*

Sequência dos oligonucleótidos Amplificado

(pb) Tm (ºC)

1 F CTCTTCCGAAACACCTGAGC 62 rs9554217 R ACCGAGAGCATGTCGCTATT

216 60

2 F GTCTCCCACCTCTTGAGTGC 64 rs3812862 R ATCCCCTGTTTTCTGGTTCC

113 60

3 F CCGCAGAACTTCGTCAGC 58 rs1805106 R GCGTAGCCATTCCAGTCCT

161 60

4 F AGTTGCCTCCACTAGCCTCA 62 rs3742110 R GGATGGTGATGTAGCGACTG

298 62

5 F AAACAGGCCAACTTCACAGC 60 rs2504211 R CTTCAAATGGCAACCTTTGG

115 58

6 F TTCCCATCTGGCTTTTTCTG 58 rs2481952 R CCTTTCCCTTGAGTCCCTCT

192 62

7 F TTTAGGGCCACTCTTTGCAC 60 rs3003954 R AGTGCCTTGCCACTCAAGAT

385 60

8 F GGTTCCAAAGCAGTCCAGAG 62 rs9285356 R TGTTTGTCCAAGCCCTTAGC

278 60

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 33 -

“Applied Biosystems” e consistiu numa desnaturação inicial de 15 min a 95ºC, seguida

de 35 ciclos com desnaturação a 94ºC durante 30s, ligação dos oligonucleótidos a 60ºC

durante 1min30s e extensão a 72ºC durante 1min e uma extensão final a 72ºC durante

10 minutos. Após cada amplificação, os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese

em gel de poliacrilamida (T:9%; C:5%). O processo electroforético foi executado sobre

placa horizontal, com arrefecimento a 9ºC, sob uma diferença de potencial de 150V e

utilizando como controlo da corrida o corante azul de bromofenol. Para visualização dos

fragmentos de ADN, os géis foram sujeitos a coloração com nitrato de prata, de acordo

com o método descrito por Budowle et al (1991) (61).

3.3.1. Purificação dos produtos PCR “multiplex”

Os produtos resultantes da amplificação por PCR multiplex foram purificados com a

enzima EXOSAP-IT (“Exonuclease I/Shrimp Alkaline Phosfatase”, “USB

Corporation”) para eliminação de oligos e dNTPs não incorporados. A purificação

enzimática foi executada adicionando 1µl de EXOSAP-IT a 1 µl de produto de PCR

multiplex, imediatamente seguido por incubação em termociclador durante 15 min a

37ºC para actividade enzimática e 15 min a 85ºC para degradação da enzima.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 34 -

3.4. Desenho dos oligonucleótidos para “Single-Base Extension”

Os oligonucleótidos para genotipagem por “Single-Base Extension” (SBE) foram

desenhados na direcção “sense” ou “antisense”, acabando, cada um, na base

imediatamente anterior ao SNP a ser genotipado. Foram igualmente testados quanto à

dimerização entre eles no programa “Primer Dimer”. O tamanho de cada sequência para

SBE foi ajustado de maneira a distribuir os fragmentos por diferentes tamanhos num

intervalo de 15 a 60pb adicionando, quando necessário, uma sequência neutra (cauda),

de acordo com o descrito por Sanchez et al. (62). O tamanho da” cauda” adicionada foi

determinado de forma a não haver sobreposição de alelos marcados com o mesmo

fluorocromo em SNPs diferentes. A tabela 3 apresenta as sequências dos oligos para

SBE, bem como informações relativas aos mesmos.

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 35 -

Tabela 3: Oligonucleótidos para “single-base extension” utilizados na genotipagem

dos SNPs por SNaPshot® multiplex.

SNP Sequência do oligonucleótido para SBE Tamanho (pb)

Detecção Direcção na cadeia de ADN

Mutação

1 tctgacaa TGGCTCTGACTCTCCCCTTC

28 G/T Forward G/T

2 tcgtgaaagtctgacaa TACCCCACCACCCCCATTT

36 C/T Forward C/T

3 TGCCGGCCAGGATGGCCC 18 C/G Reverse G/C

4 ccacgtcgtgaaagtctgacaa ATGACTGATGGGCTGCCTTG

42 C/T Forward C/T

5 aa TAGAGCTGAAAATGAGATTTAATT

26 T/G Reverse A/C

6 gaaagtctgacaa CTCTTCCTAGATCTGCAGGCT

34 G/A Forward G/A

7 a GGGAAAGGGTTATTCTATCATAAT

50 T/A Reverse A/T

8 gtgccacgtcgtgaaagtctgacaa ACTAGACTTTGCTATGGGAAAAT

48 G/C Reverse C/G

*As caudas adicionadas estão representadas a azul; a preto representa-se a sequência do oligonucleótido

para SBE complementar à região de “annealing”.

3.5. Genotipagem multiplex por minisequenciação – Reacção de

SNaPshot® multiplex

Numa primeira fase os oligonucleótidos para SBE foram testados isoladamente e

posteriormente em multiplex. A reacção para minisequenciação foi executada utilizando

1 µl da mistura reaccional fornecida no kit “ABI PRISM® SNaPshot® Multiplex”

(“Applied Biosystems”), constituída por ddNTPs marcados com fluorocromos (ddATP-

dR6GTM, ddCTP-dTAMRATM, ddUTP-dROXTM e ddGTP-dR110TM, enzima AmpliTaqR

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 36 -

FS TACS/Core e tampão para multiplex), 1,5 µl de produto de PCR multiplex

purificado com EXOSAP-IT, 0,8 µl da mistura de oligonucleótidos para SBE (tabela 4)

e água esterilizada até perfazer um volume de 5 µL.

Tabela 4: Concentração de cada oligonucleótido para SBE utilizada na mistura

por reacção de SNaPshot® multiplex

A reacção de “single-base extension” foi executada num termociclador da “Applied

Biosystems” e consistiu em 25 ciclos a 96ºC durante 10s para desnaturação, 50ºC

durante 5s para ligação do oligonucleótido de SBE e 60ºC durante 30s para extensão.

Após a reacção de extensão os produtos resultantes foram purificados com a enzima

SAP (“Shrimp Alkaline Phosphatase”, “USB Corporation”) de modo a degradar os

ddNTPs fluorescentes não incorporados: aos 5 µl de produto de SBE foi adicionado 1 µl

de SAP seguido de incubação em termociclador à temperatura de 37ºC durante 1hora

para actividade enzimática, e 85ºC durante 15 minutos para degradação da enzima.

Oligonucleótido para SBE

(stock 2,5 µM) Concentração

(µM) 1 0,63 2 0,31 3 0,19 4 0,94 5 0,25 6 0,31 7 0,78 8 0,31

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 37 -

3.5.1. Análise das amostras no “ABI PRISM 3100 Genetic Analyser”

As amostras a submeter a electroforese no ABI PRISM 3100 Genetic Analyser

(“Applied Biosystems”) foram preparadas adicionando 0,5 µl de produto de SBE

purificado a 9 µl de formamida “Hi-Di” (“Applied Biosystems”) e 0,5 µl de

GeneScanTM 120 LIZ® Size Standard (“Applied Biosystems”) e corridas, utilizando o

módulo “GS STR POP4 (1mL) E5” com um tempo de corrida de 15 minutos. As

sequências foram obtidas utilizando o programa “GeneScan Analysis 3.7”.

3.6. Análise estatística

As frequências alélicas para cada SNP/marcador foram calculadas utilizando o software

de análise populacional ARLEQUIN 3.01 (63); a comparação das frequências dos

diferentes alelos de cada SNP entre os subgrupos populacionais, Portugal_MI- versus

Portugal_MI+ e Moçambique_MI- versus Moçambique_MI+, foi calculado pelo Teste

Exacto de Fisher através do software JAVASTAT (64) para um intervalo de confiança

de 95% (correspondendo a um nível de significância de 5%). O programa de análise

ARLEQUIN 3.01 foi também utilizado na análise de Linkage disequilibrium (LD),

Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e Análise da Variância Molecular (AMOVA).

No que respeita à análise de LD foi também utilizado software de análise GOLD (65)

para cálculo dos valores absolutos de D’ como forma de medição da extensão do

desequilíbrio entre os pares de SNPs. Os haplótipos foram inferidos recorrendo ao

programa de análise populacional PHASE v2.1.1 (66). As “Networks” foram calculadas

no programa NETWORK 4.5.0.1 (http://www.fluxus-engineering.com) utilizando a

Materiais e Métodos

_____________________________________________________________________________________

- 38 -

opção “median-joining” (67). O programa de análise estatística WinPepi versão 1.60

utilizou-se na comparação de proporções através da opção “Compare 2, Comparison of

proportions or odds” (68).

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 39 -

CAPÍTULO IV - RESULTADOS

Este trabalho consistiu no estudo de oito polimorfismos (SNPs) localizados no locus do

gene CDX2, em regiões flanqueantes 5’ e 3’ e na região codificante (Figura 4). Foram

estudados dois grupos populacionais, ambos H. pylori positivos, Portugal (120

indivíduos) e Moçambique (101 indivíduos), e dentro destes foram definidos dois

subgrupos, um com metaplasia intestinal (MI+) e outro sem metaplasia intestinal (MI-).

Dos 120 indivíduos que constituem a população Portuguesa, 76 são MI- e 44 são MI+, o

que dá uma prevalência de MI de 37% e dos 101 indivíduos que constituem a amostra

Moçambicana, 92 são MI- e 9 são MI+, o que dá uma prevalência de MI de 9%.

4.1. Polimorfismos analisados no locus do gene CDX2

Em todas as amostras analisadas observaram-se 8 fragmentos com os tamanhos

correspondentes às sequências amplificadas do locus do gene CDX2 (tabela 2).

A figura 5 mostra 11 dos 221 produtos de PCR multiplex obtidos.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 40 -

Figura 5: Visualização em gel de poliacrilamida, corado por nitrato de prata, dos 8 fragmentos

amplificados por PCR multiplex, em 11 amostras incluídas no estudo, de baixo para cima:

SNP7 (385 pb), SNP4 (298 pb), SNP8 (278 pb), SNP1 (216 pb), SNP6 (192 pb), SNP3 (161

pb), SNP5 (115 pb) e SNP2 (113 pb).

4.2. Minisequenciação por SNaPshot® multiplex

Após a amplificação do ADN foi executada a técnica de SNaPshot® multiplex para

genotipagem dos 8 SNPs seleccionados nos 221 indivíduos do estudo. A figura 6 mostra

3 dos electroferogramas obtidos.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 41 -

Figura 6: Electroferogramas obtidos após minisequenciação por SNaPshot® multiplex de 3

indivíduos incluídos no estudo. Da esquerda para a direita, alelos detectados (leitura directa): A)

C/C, G/G, G/T, G/A, T/T, C/T, CC, AA; B) C/C, G/T, G/T, G/G, C/T, C/T, G/C, A/T; C) C/C,

G/G, T/T, A/A; C/C, C/C, A/A

ddNTP Fluorocromo Cor

A dR6G Verde

C dTAMRA Preto

G dR110 Azul

T dROX Vermelho

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 42 -

4.3. Frequências alélicas

No sentido de averiguar se polimorfismos localizados no locus do gene CDX2 estão

relacionados, ou estão localizados em regiões associadas, com o aparecimento de MI e

também com a diferente prevalência de MI nas duas populações, Portugal e

Moçambique, foram estudadas as frequências alélicas dos 8 SNPs nos 4 subgrupos

anteriormente descritos (tabelas 5 e 6). As frequências alélicas foram calculadas usando

o programa de análise populacional Arlequin 3.01 (63).

Tabela 5: Portugal - Frequências alélicas dos 8 marcadores nas duas amostras da

população Portuguesa.

MI - MI +

Marcador Alelo N*=152 N*=88 P**

G 81 (53,29) 49 (55,68) SNP1 rs9554217 T 71 (46,71) 39 (44,32)

0,412

C 9 (5,92) 8 (9,09) SNP2 rs3812862 T 143 (94,08) 80 (90,91)

0,251

G 150 (98,68) 86 (97,73) SNP3 rs1805106 C 2 (1,32) 2 (2,27)

0,467

C 102 (67,11) 63 (71,59) SNP4 rs3742110 T 50 (32,89) 25 (28,41)

0,283

A 28 (18,42) 17 (19,32) SNP5 rs2504211 C 124 (81,58) 71 (80,68)

0,496

G 84 (55,26) 43 (48,86) SNP6 rs2481952 A 68 (44,74) 45 (51,14)

0,205

T 115 (75,66) 65 (73,86) SNP7 rs3003954 A 37 (24,34) 23 (26,14)

0,436

G 139 (91,45) 73 (82,95) SNP8 rs9285356 C 13 (8,55) 15 (17,05)

0,04

* Números em parêntesis representam percentagens ** Valor P calculado pelo Teste Exacto de Fisher

N, número de alelos

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 43 -

Na população Portuguesa (Tabela 5) verificou-se existir uma associação significativa

(P=0,04) do alelo C do SNP rs9285356 C>G (SNP8) com a presença de MI. Dos 152

cromossomas analisados da população MI-, 139 (91,45%) são portadores do alelo G e

13 (8,55%) possuem o alelo C. Na população MI+ num total de 88 cromossomas, 73

(82,95%) são portadores do alelo G e 15 (17,05%) possuem a variante C.

Relativamente aos restantes marcadores não foi observada nenhuma associação

significativa quando comparados os dois subgrupos MI- e MI+.

Na população Moçambicana (Tabela 6) não foi observada nenhuma associação

significativa dos diferentes SNPs com o aparecimento de MI. No entanto para o

marcador rs3812862 C>T (SNP2), o subgrupo MI- tem um predomínio do alelo T

contrariamente ao subgrupo MI+ que tem um predomínio do alelo C. Esta diferença,

ainda que não significativa (P=0,06), pode revelar uma tendência de diferenciação dos

dois subgrupos na população Moçambicana.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 44 -

Tabela 6: Moçambique - Frequências alélicas dos 8 marcadores nas duas amostras

da população Moçambicana.

MI - MI +

Marcador Alelo N* =184 N*=18 P**

G 146 (79,35) 16 (88,89) SNP1 rs9554217 T 38 (20,65) 2 (11,11)

0,27

C 72 (39,13) 11 (61,11) SNP2 rs3812862 T 112 (60,87) 7 (38,89)

0,06

G 183 (99,46) 18 (100) SNP3 rs1805106 C 1 (0,54) 0 (0)

0,91

C 151 (82,07) 16 (88,89) SNP4 rs3742110 T 33 (17,93) 2 (11,11)

0,36

A 100 (54,35) 9 (50) SNP5 rs2504211 C 84 (45,65) 9 (50)

0,46

G 142 (77,17) 11 (61,11) SNP6 rs2481952 A 42 (22,83) 7 (38,89)

0,11

T 76 (41,3) 10 (55,56) SNP7 rs3003954 A 108 (58,7) 8 (44,44)

0,18

G 92 (50) 9 (50) SNP8 rs9285356 C 92 (50) 9 (50)

1

* Números em parêntesis representam percentagens ** Valor P calculado pelo Teste Exacto de Fisher

N, número de alelos

4.4. Caracterização e representação haplotípica

No sentido de averiguar se existe uma associação do conjunto de SNPs estudados com o

aparecimento de MI, definiram-se os haplótipos a partir da genotipagem anteriormente

descrita nas 2 populações e nos 2 subgrupos, recorrendo ao programa de análise

populacional PHASE v2.1.1 (66). A análise global, utilizando todos os indivíduos

Portugueses e Moçambicanos, permitiu a identificação de 26 haplótipos. As tabelas 7 e

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 45 -

8 apresentam os haplótipos que foram identificados nas duas populações, Portuguesa e

Moçambicana, respectivamente.

Tabela 7: Haplótipos observados na população Portuguesa

MI - MI +

Haplótipo* N** N**

H1 TTGCCGTG 4 (2,63) 0

H2 GTGTCGTG 3 (1,97) 3 (3,41)

H3 TTGTCGTG 40 (26,32) 18 (20,45)

H5 TTCTCGTG 1 (0,66) 0

H7 GTGCCATG 47 (30,92) 25 (28,41)

H8 TTGCCATG 18 (11,84) 14 (15,91)

H10 GTCCCATG 1 (0,66) 2 (2,27)

H12 TTGTCATG 0 1 (1,14)

H14 TTGCCGAG 2 (1,32) 2 (2,27)

H16 TTGTCGAG 5 (3,29) 1 (1,14)

H17 GTGCAGAG 16 (10,53) 5 (5,68)

H18 GCGCAGAG 1 (0,66) 0

H20 GTGCCAAG 1 (0,66) 2 (2,27)

H21 TTGTCGTC 1 (0,66) 2 (2,27)

H23 GTGCAGAC 3 (1,97) 4 (4,55)

H24 GCGCAGAC 8 (5,26) 7 (7,95)

H25 TCGCAGAC 0 1 (1,14)

H26 GTGCCAAC 1 (0,66) 1 (1,14)

Total 152 (100,00) 88 (100,00) * Identificação do haplótipo/sequência

** Números em parêntesis representam percentagens

N, número de alelos

Na população Portuguesa foram identificados 18 haplótipos, não se observando

nenhuma diferença estatisticamente significativa (P>0,05) quando comparadas as

frequências haplotípicas individuais nos subgrupos MI- e MI+. Três haplótipos

aparecem exclusivamente no subgrupo MI-, H1, H5 e H18, representando menos de 4%

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 46 -

da diversidade total. Quanto ao subgrupo MI+, os haplótipos exclusivos H12 e H25,

também não ultrapassam os 4% da diversidade haplotípica total. Os haplótipos mais

frequentes são o H3 e o H7 nos dois subgrupos MI- e MI+. O haplótipo H3 aparece em

26,3% das amostras MI- e em 20,5% das amostras MI+, enquanto o haplótipo H7 surge

representado em 30,9% e 28,4% das amostras, respectivamente. Em nenhum dos casos

a diferença de frequência haplotípica entre os 2 subgrupos se revelou significativa

(P>0,05).

Tabela 8: Haplótipos observados na população Moçambicana

MI - MI +

Haplótipo* N** N**

H2 GTGTCGTG 14 (7,61) 1 (5,56)

H3 TTGTCGTG 17 (9,24) 0

H4 GCGTCGTG 1 (0,54) 1 (5,56)

H6 GCGCAGTG 2 (1,09) 0

H7 GTGCCATG 34 (18,48) 4 (22,22)

H8 TTGCCATG 5 (2,72) 2 (11,11)

H9 GCGCCATG 1 (0,54) 1 (5,56)

H10 GTCCCATG 1 (0,54) 0

H11 GTGTCATG 1 (0,54) 0

H13 GTGCCGAG 2 (1,09) 0

H14 TTGCCGAG 7 (3,80) 0

H15 GCGCCGAG 1 (0,54) 0

H17 GTGCAGAG 1 (0,54) 0

H18 GCGCAGAG 3 (1,63) 0

H19 TCGCAGAG 2 (1,09) 0

H22 GCGCAGTC 0 1 (5,56)

H23 GTGCAGAC 30 (16,30) 0 ***

H24 GCGCAGAC 55 (29,89) 8 (44,44)

H25 TCGCAGAC 7 (3,80) 0

Total 184 (100,0) 18 (100,0) * Identificação do haplótipo/sequência ** Números em parêntesis representam percentagens

*** P=0,048, Teste Exacto de Fisher, “WiniPepi, Comparison of proportions or odds”

N, número de alelos

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 47 -

Em relação à população Moçambicana foi possível observar um total de 19 haplótipos.

A comparação entre as frequências haplotípicas individuais nos subgrupos MI- e MI+

revelou uma diferença estatisticamente significativa para o haplótipo H23 (P≤0,05). De

facto, nenhum cromossoma do subgrupo MI+ apresentou esta combinação, enquanto a

mesma é encontrada em cerca de 16% da amostra do subgrupo MI-. Ambos os

subgrupos partilham os mesmos haplótipos mais frequentes, H7 e H24. O haplótipo H7

aparece em 18,48% das amostras MI- e em 22,22% das amostras MI+, enquanto o

haplótipo H24 surge representado em 29,89% e em 44,44% das amostras,

respectivamente. Em nenhum dos casos a diferença de frequência entre os 2 subgrupos

se revelou significativa (P>0,05).

De modo a perceber a forma como as diferentes combinações haplotípicas se

relacionam do ponto de vista filogenético, foi desenhada a representação filogenética

para ambas as populações e para cada subgrupo (MI- e MI+). A representação gráfica é

apresentada na figura 7 (A-D).

A árvore filogenética representativa da população Portuguesa mostrou que os haplótipos

exclusivos de cada um dos subgrupos MI- e MI+ se originam de haplótipos mais

frequentes apenas por um passo mutacional. A árvore filogenética para a população

Moçambicana revelou um elevado grau de reticulação sendo que os haplótipos de

menor frequência se encontram ligados aos mais representativos por poucos passos

mutacionais (mutação ou recombinação). De realçar que o haplótipo H23 (exclusivo do

subgrupo MI-), apenas difere da combinação H24 (possivelmente ancestral e

representada nos dois subgrupos) na posição correspondente ao SNP2, que já tinha

revelado tendência de diferenciação entre os dois subgrupos no cálculo das frequências

alélicas.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 48 -

A

B

C

D

Figura 7: Representação filogenética da distribuição haplotípica dos 4 subgrupos em estudo. Os

haplótipos inferidos estão representados por círculos, com áreas proporcionais à

representatividade numérica de cada um. M1 a M8 (a vermelho) representam os passos

mutacionais. As “networks” foram calculadas no programa NETWORK 4.5.0.1, utilizando a

opção “median-joining”.

A Portugal_MI- B Portugal_MI+ C Moçambique_MI- D Moçambique_MI+

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 49 -

4.5. Análise do Equilíbrio de Hardy-Weinberg Procedeu-se à análise do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) nas duas populações

em estudo, Portugal e Moçambique.

As tabelas seguintes mostram os resultados obtidos para cada SNP estudado. Na

população Portuguesa todos os marcadores estão em HWE (tabela 9), enquanto a

população Moçambicana apresenta um desvio ao HWE para o marcador rs3812862

(SNP2) (tabela 10), observando-se uma heterozigotia inferior à esperada.

Tabela 9: Estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg na população Portuguesa.

a Heterozigotia observada b Heterozigotia esperada * Teste Exacto utilizando a “Cadeia Markov”

Tabela 10: Estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg na população Moçambicana.

a Heterozigotia observada bHeterozigotia esperada* Teste Exacto utilizando a “Cadeia Markov”

Marcador Het.Obsa Het.Espb P* rs9554217 0,504 0,500 1,000 rs3812862 0,142 0,140 1,000 rs1805106 0,033 0,041 1,000 rs3742110 0,420 0,439 0,831 rs2504211 0,308 0,313 1,000 rs2481952 0,563 0,500 0,189 rs3003954 0,403 0,385 0,622

rs9285356 0,233 0,214 0,361

Marcador Het.Obsa Het.Espb P* rs9554217 0,337 0,319 0,76 rs3812862 0,347 0,492 0,004 rs1805106 0,010 0,020 1,00 rs3742110 0,287 0,288 1,00 rs2504211 0,446 0,504 0,31 rs2481952 0,406 0,369 0,42 rs3003954 0,436 0,496 0,30

rs9285356 0,465 0,507 0,55

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 50 -

4.6. Análise de Linkage Disequilibrium

Para estudar a ocorrência de associação não aleatória entre os alelos dos diferentes

SNPs procedeu-se à análise de Linkage disequilibrium (LD) nas 2 populações. As

tabelas seguintes apresentam os valores absolutos de D’ (|D’|), valor que mede a

extensão do desequilíbrio, obtidos entre os marcadores genotipados e para os quais

houve relevância estatística (P ≤ 0,05), em Portugal e Moçambique, respectivamente.

Tabela 11: Linkage disequilibrium entre os marcadores genotipados na população

Portuguesa

1 *** 2 - *** 3 - - *** 4 0,667 - - *** 5 0,6 1 - 1 *** 6 0,333 1 - 0,5 1 *** 7 0,333 1 - 0,667 1 0,333 ***

8 - 0,538 - - 0,446 0,4 0,6 ***

Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8

(-) representa ausência de associação estatística.

A amarelo estão indicados os valores de |D’| para os marcadores com LD estatisticamente significativo

(P≤0,05).

A análise da tabela permite verificar que, de uma forma geral, todos os marcadores se

encontram associados, com formação de um bloco de ligação entre os marcadores 4, 5,

6 e 7. O marcador 3 apresenta um nível de heterozigotia extremamente baixo

(heterozigotia=0,033), não sendo informativo na análise de ligação factorial.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 51 -

Relativamente ao marcador 8 verifica-se que há ligação com os marcadores 5, 6 e 7, que

estão mais próximos, e com o marcador 2, que está mais distante. No entanto, os valores

de D’ não indicam um LD forte ou total. A ligação é perdida com os marcadores 1 e 4,

facto que pode ser explicado pela presença de possíveis regiões de recombinação entre o

SNP2-SNP3, SNP4-SNP5 e SNP1-SNP5.

Tabela 12: Linkage disequilibrium entre os marcadores genotipados na população

Moçambicana

1 *** 2 - *** 3 - nv *** 4 0,05 nv - *** 5 0,05 nv - 1 *** 6 - nv - - 1 *** 7 0,24 nv - 1 0,525 1 ***

8 0,05 nv - 1 1 1 0,525 ***

Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8

nv, não valorizado

(-) representa ausência de associação estatística

A amarelo estão indicados os valores de |D’| para os marcadores com LD com valor P significativo

(P≤0,05).

Na população Moçambicana (tabela 12) verifica-se que, de uma forma geral, todos os

marcadores se encontram associados, sendo esta associação mais nítida entre o bloco

constituído pelos marcadores 4, 5, 6 e 7. O marcador 3, tal como em Portugal, é pouco

polimórfico (Heterozigotia<1%), não podendo ser considerado na análise de ligação

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 52 -

factorial. Relativamente ao marcador 2, os valores de LD não podem ser valorizados

pois, como já foi referido, este SNP não está em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

4.7. Análise da variância molecular (AMOVA)

A análise de variância molecular (AMOVA) foi realizada utilizando o programa de

análise populacional ARLEQUIN 3.01 (63). Os indivíduos foram divididos pelos 4

subgrupos anteriormente descritos, Portugal e Moçambique e dentro destes em MI+ e

MI-. A análise foi executada, numa primeira fase, para o conjunto dos 8 SNPs

genotipados e, posteriormente, de forma isolada para cada marcador. Foram calculados

Índices de Fixação de Wright (valores de FST) como indicadores de diferenciação

genética entre as duas populações.

4.7.1. AMOVA total

Os resultados obtidos (tabela 13) mostram que, para o conjunto dos 8 SNPs estudados

no locus do gene CDX2, a maior fonte de variação é encontrada entre os indivíduos

dentro dos subgrupos e entre populações, Portugal e Moçambique, não se encontrando

diferenças quando se comparam os subgrupos MI- e MI+ dentro de cada população.

Esta análise produziu um valor de FST de 0,18738 (P<0,001). Este valor de P indica uma

diferenciação genética significativa entre as duas populações, Portugal e Moçambique.

No entanto existe uma elevada variação dentro de cada um dos subgrupos (81,26% de

distribuição da variação) mas não entre os subgrupos dentro de cada população (0% de

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 53 -

distribuição da variação). A tabela 14 apresenta os valores de FST associados à

distribuição da variação para os 4 subgrupos em estudo. Para o conjunto dos 8 SNPs

foram obtidos valores de FST significativos ao comparar os subgrupos Portugueses com

os Moçambicanos.

Tabela 13: Índices de Fixação de Wright para as duas populações, Portugal e

Moçambique, e para os subgrupos (MI- e MI+), para os 8 marcadores

*valores percentuais

Tabela 14: Matriz de diferenciação genética entre as subpopulações Portuguesas e

Moçambicanas para os 8 SNP’s

FST* 1 2 3 4

1.Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000(0,56757) -

3.Moçambique_MI- 0,19277(0,00000) 0,16554(0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,22650(0,00000) 0,18291(0,00000) 0,00662(0,30631) -

*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)

AMOVA TOTAL Distribuição da variação*

Entre populações 18,77

Entre subgrupos dentro de cada população

-0,03 (0,00)

Entre indivíduos dentro dos subgrupos

81,26

Total 100

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 54 -

Nesta fase, colocamos a hipótese de haver ancestralidade genética europeia nos

indivíduos Moçambicanos com MI, e que este factor os tornasse mais susceptíveis ao

desenvolvimento de MI no contexto de infecção pela H. pylori. No entanto esta hipótese

não foi confirmada. Os valores de FST, indicativos de distância genética entre

populações, indicam que o subgrupo português MI+ está geneticamente mais distante

do subgrupo Moçambicano MI+ (FST=0,18291) do que do subgrupo Moçambicano MI-

(FST=0,16554), rejeitando qualquer hipótese de ancestralidade. O mesmo se verifica

relativamente ao subgrupo Português MI-.

4.7.2. AMOVA para cada marcador

No sentido de verificar a ocorrência de diferenciação genética de forma isolada,

procedeu-se à análise AMOVA para cada marcador. A tabela 15 apresenta os Índices de

Fixação de Wright obtidos.

Os resultados obtidos mostram a mesma tendência observada quando foi feita a análise

global dos 8 SNPs, isto é, maior variação genética entre as populações, Portugal e

Moçambique, e entre os indivíduos dentro dos subgrupos, do que entre os subgrupos

MI- e MI+ dentro de cada população.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 55 -

Tabela 15: Índices de Fixação de Wright para as duas populações, Portugal e

Moçambique, e para os subgrupos populacionais (MI- e MI+), para cada marcador

1 2 3 4 5 6 7 8

Marcador rs9554217 rs3812862 rs1805106 rs3742110 rs2504211 rs2481952 rs3003954 rs9285356

Entre populações

14,91 26,7 0,87 4,99 24,32 9,33 19,28 29,71

Entre subgrupos dentro de cada população

-0,79 (0,00)

1,89 -1,04 (0,00)

-0,69 (0,00)

-0,97 (0,00)

0,76 -0,22 (0,00)

0,17

Entre indivíduos dentro dos subgrupos

85,88 71,41 100,17 95,7 76,65 89,91 80,94 70,11

Total 100 100 100 100 100 100 100 100

Os valores representam percentagens de distribuição da variação.

Os valores de distribuição da variação intrapopulacional superiores a 0% estão destacados a azul.

No entanto, 3 SNPs mostraram valores de distribuição percentual indicativos de alguma

variação intrapopulacional: o rs3812862 (1,89%), o rs2481952 (0,76%) e o rs9285356

(0,17%). As tabelas seguintes apresentam os valores de FST obtidos para estes

marcadores, respectivamente, e o anexo I as tabelas com os valores obtidos para os

restantes marcadores.

Tabela 16: Matriz de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais

Portugueses e Moçambicanos para o marcador 2

SNP2 (rs3812862)* 1 2 3 4

1.Portugal_MI- -

2. Portugal_MI+ 0,00000(0,48649) -

3.Moçambique_MI- 0,25717 (0,0000) 0,18699(0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,66403 (0,0000) 0,54230(0,00000) 0.06537(0,18919) -

*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)

Os valores de FST intrapopulacionais superiores a 0,01 estão destacados a azul

Resultados

_____________________________________________________________________________________

- 56 -

Tabela 17: Matriz de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais

Portugueses e Moçambicanos para o marcador 6

SNP6 (rs2481952)* 1 2 3 4

1.Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000(0,95495) -

3.Moçambique_MI- 0,20581 (0,0000) 0,16001(0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,00000(0,79279) 0,00000(0,45045) 0,03830(0,13514) -

*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)

Os valores de FST intrapopulacionais superiores a 0,01 estão destacados a azul

Tabela 18: Matriz de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais

Portugueses e Moçambicanos para o marcador 8

SNP8 (rs9285356)* 1 2 3 4

1. Portugal_MI- -

2. Portugal_MI+ 0,02563(0,00901) -

3.Moçambique_MI- 0,32867 (0,00) 0,19515(0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,45930 (0,00) 0,23068(0,01802) 0.00000(0,99099) -

*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)

Os valores de FST intrapopulacionais superiores a 0,01 estão destacados a azul

Para os valores de FST indicativos de diferenciação genética intrapopulacional relativos

aos SNPs 2, 6 e 8, só foi encontrada relevância estatística para o SNP8. Este valor de

FST deve-se a uma diferença significativa entre os subgrupos MI- e MI+ em Portugal, já

observada no cálculo das frequências alélicas. Relativamente aos SNPs 2 e 6 as

diferenças são observadas entre os subgrupos MI- e MI+ dentro da população

Moçambicana, no entanto provavelmente devido ao baixo efectivo amostral o valor de

FST não tem relevância estatística. Para todos os SNPs foram obtidos valores de FST

significativos quando se comparam subgrupos Portugueses com subgrupos

Moçambicanos, excepto para o SNP 3.

Discussão _____________________________________________________________________________________

- 57 -

CAPÍTULO V - DISCUSSÃO

Este trabalho consistiu no estudo de 8 SNPs no gene CDX2 e regiões flanqueantes,

previamente descritos nas bases de dados (Ensembl) e escolhidos de forma a estudar

uma região genómica envolvendo o gene CDX2 de, aproximadamente, 30 Kb. O

objectivo foi o de averiguar se alterações genéticas no locus do gene CDX2 se

associavam ao desenvolvimento da MI gástrica, no contexto da infecção pela H. pylori,

em duas populações distintas, uma Portuguesa (constituída por 120 indivíduos) e outra

Moçambicana (constituída por 101 indivíduos). Numa primeira análise foram

comparados os dois subgrupos, com metaplasia e sem metaplasia, dentro de cada

população, Portugal e Moçambique. Posteriormente, comparou-se a distribuição dos

marcadores nas duas populações, no sentido de perceber se existiam alterações que

explicassem a diferença que se observa entre elas relativamente às taxas de

desenvolvimento de MI (e carcinoma gástrico de tipo intestinal), diferença esta que

constitui a base do “Enigma africano”. Neste último ponto estudou-se ainda a

possibilidade de existir ancestralidade europeia no subgrupo Moçambicano com MI.

A nossa abordagem foi baseada numa estratégia “populacional”, também chamada

“blind study of SNP associations”, e envolveu o estudo da região genómica que contém

o gene CDX2. Esta estratégia foi seguida pelo facto de não existirem trabalhos

publicados que mostrem que SNPs específicos do gene CDX2 (localizados na região

codificante ou na região reguladora) estejam relacionados com o desenvolvimento do

fenótipo em análise. Sendo assim, o nosso interesse não foi a pesquisa de polimorfismos

específicos no gene CDX2, mas a identificação de regiões que se pudessem relacionar

com esse fenótipo.

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 58 -

A grande maioria dos estudos que envolvem a pesquisa de polimorfismos e mutações no

CDX2 foram efectuados usando casos de carcinomas do cólon e recto (CCR). O

primeiro estudo, realizado por Yagi et al. (1999) (69), identificou, numa população

Japonesa, 5 SNPs em ADN de células normais e encontrou 3 casos de perda de

heterozigotia (LOH) para duas das variantes encontradas: 2 casos no codão 61 (exão 1)

para a variante CCG→CCC (do tipo “silent mutation”) e 1 caso no codão 293 (exão 3)

para a variante TCT→CCT, Ser→Pro. Contudo, todos os SNPs foram também

identificados em indivíduos saudáveis (69). Posteriormente, um estudo numa população

Britânica, identificou 6 SNPs, 2 dos quais previamente descritos por Yagi et al mas, tal

como no primeiro estudo, não foram encontradas diferenças na distribuição das

variantes alélicas entre os controlos saudáveis e os casos de CCR (70). Em 2005 um

estudo que permitiu a identificação de 9 polimorfismos numa população Israelita, dois

dos quais previamente descritos e 7 identificados “de novo”, concluiu que nenhum deles

se associa ao desenvolvimento de CCR, aparecendo com frequência semelhante em

indivíduos saudáveis (71).

No que respeita à identificação de variantes raras (mutações) no gene CDX2 os

resultados são muito semelhantes: foi encontrada uma mutação somática num caso de

carcinoma do cólon hereditário não-polipóide (HNPCC) (69), duas mutações em CCR,

em que apenas uma (A1408G) foi exclusivamente encontrada num caso tumoral e

ausente em 47 controlos saudáveis (70).

Em resumo, todos os estudos apontam no sentido de que as variações genéticas

identificadas no gene CDX2 têm uma importância mínima na carcinogénese do cólon e

recto pois, na sua grande maioria, foram também identificadas em indivíduos normais.

Em 2008, um estudo com casos de carcinomas gástricos provenientes de uma população

Coreana, levou à identificação de 2 SNPs (codões 293 e 260) dos 5 previamente

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 59 -

descritos por Yagi et al (1999), LOH para 2 marcadores de microssatélites em 25% dos

casos de carcinoma e duas mutações somáticas de tipo “missense”. Em 3 dos casos com

LOH e nos casos com mutação somática foi encontrada perda de expressão de CDX2

por imunohistoquímica. No entanto, os autores concluíram que, tal como para a

carcinogénese do cólon e recto, a inactivação do gene CDX2 por mutações é pouco

frequente (72).

Um aspecto relevante também discutido nestes trabalhos, todos com abordagens

metodológicas muito semelhantes, é que a identificação de diferentes SNPs em

diferentes populações pode dever-se à variação da etnicidade e que o perfil genético

diverso encontrado entre populações de regiões geográficas distintas pode ser

importante para avaliar a importância real do CDX2 (71, 72). Esta possibilidade tem

especial importância no âmbito do nosso trabalho.

Existem diferenças na distribuição das variantes alélicas dos 8 SNPs entre os

subgrupos MI- e MI+, em cada uma das populações estudadas?

O cálculo das frequências alélicas mostrou haver, na população Portuguesa, uma

associação significativa (P≤0,05) do SNP8 e, na população Moçambicana, uma

associação que pode ser interpretada como tendencialmente significativa (P=0,06) do

SNP2, com o desenvolvimento de MI. Não foi encontrado significado estatístico para

mais nenhum marcador estudado, em ambas as populações.

A associação significativa entre o alelo C do SNP8 e o desenvolvimento de MI na

população Portuguesa, apesar do número de cromossomas analisados no subgrupo

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 60 -

Português MI- ser maior (N=152) do que o do subgrupo MI+ (N=88), sugere que o alelo

C (ancestral) está mais representado no subgrupo menor MI+ (17,05%) do que no

subgrupo maior MI- (8,55%). Esta observação sugere uma possível relevância deste

alelo, ou outro na região que o circunda com o qual esteja em linkage disequilibrium,

para a susceptibilidade ao desenvolvimento de MI. Este marcador está associado aos

marcadores 5, 6 e 7 (que lhe estão mais próximos) e ao marcador 2 (que se encontra

mais distante), mas com valores de associação iguais ou inferiores a 0,6. Este facto pode

justificar não se ter verificado nenhuma variação na distribuição das frequências alélicas

nos marcadores com os quais está em LD. Por outro lado, este SNP está localizado a

cerca de 7 Kb a 3’ do gene, fora da região promotora e de regiões prováveis de

regulação, o que nos leva a considerar a hipótese de que esta associação seja

circunstancial. Contudo, mais estudos seriam necessários para sustentar estas

suposições.

Na população Moçambicana, embora não tenha sido encontrada nenhuma associação

significativa na distribuição dos SNPs com o aparecimento de MI, verificou-se que,

para o SNP2, há uma inversão na distribuição das frequências das variantes alélicas

entre os dois subgrupos. O alelo C (derivado) está representado em 39,13% das

amostras MI- e em 61,11% das amostras MI+ e é o único marcador que não está em

HWE nas duas populações. Este SNP está localizado na região promotora do gene

CDX2, a 1,8 Kb do primeiro exão (Figura 4) e numa região cromossómica cuja taxa de

recombinação mostra valores médios esperados (1CM/MB). Tendo em conta estes

aspectos, consideramos que este marcador ou mais concretamente, o alelo C, ou outro

na região que o circunda e que esteja em forte LD com ele, poderá estar envolvido no

aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de MI. Para se poder confirmar esta

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 61 -

hipótese teremos de aumentar o efectivo amostral do subgrupo Moçambicano MI+,

factor limitante para o poder da análise estatística. No momento da realização deste

estudo não foi possível obter mais amostras devidamente caracterizadas quanto à

presença/ausência de infecção e MI (também devido ao baixo número de indivíduos que

desenvolvem MI em Moçambique). Uma outra abordagem será a realização de estudos

funcionais. A clonagem das duas variantes alélicas do promotor com o gene da

Luciferase seria importante para verificar se há diferenças de expressão. Em todo o

caso, e com os dados de que dispomos, a relevância deste resultado ainda não está

demonstrada, podendo ser resultado do baixo efectivo amostral. Por outro lado, pode

não ser este SNP a ter efeito directo sobre o CDX2 mas estar em LD com outro

marcador na mesma região, sendo esse o portador do efeito “directo” no gene, na

população moçambicana. Se assim for, o SNP2 funcionaria como um indicador dessa

associação.

Um último aspecto prende-se com o facto dos SNPs potencialmente relevantes que

foram identificados não serem os mesmos nas 2 populações. Se as duas populações

fossem geneticamente semelhantes para o conjunto dos 8 marcadores estudados, não

seria possível interpretar estes resultados como possíveis indicadores de alguma

associação, pois estaríamos à espera que os marcadores indicativos de alguma relação

com o fenótipo em estudo fossem os mesmos nas 2 populações. O Teste Exacto de

Diferenciação Populacional baseado nas frequências haplotípicas indicou-nos no

entanto que a probabilidade de as conseguirmos diferenciar é significativa (P<10-7),

tornando possível interpretar as variações encontradas como potencialmente indicadoras

de alguma associação. Este facto vem ao encontro de resultados publicados por outros

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 62 -

grupos que encontram associação de um ou mais SNPs com alguma patologia

dependendo da origem da população em estudo (71, 72).

São cada vez mais os estudos de associação de SNPs, localizados quer em regiões

reguladoras quer em regiões codificantes, com diversas patologias. Muitos dos SNPs

localizados nas regiões promotoras afectam a ligação a factores de transcrição. Alguns

revelam-se importantes dependendo da origem geográfica da população estudada. Por

exemplo, os SNPs -1031 e -863 no promotor do TNF-α demonstraram ser importantes

na susceptibilidade do hospedeiro para a inflamação gástrica e risco de desenvolvimento

de úlcera péptica, após infecção pela H. pylori (73). Numa população Chinesa, o SNP

C46359T no promotor do gene que codifica a metiltransferase de ADN 3B (DNMT3B)

não pode ser utilizado como marcador de estratificação de grupos com maior

susceptibilidade de desenvolvimento de metástases linfáticas de adenocarcinoma

gástrico do cárdia, ao contrário do que foi publicado em populações Caucasianas (74).

O SNP -181A/G no promotor do gene da metaloproteinase-7 (MMP-7) pode ser

utilizado como indicador de risco aumentado de carcinoma esofágico de células

escamosas, adenocarcinoma gástrico do cárdia e carcinoma pulmonar de não pequenas

células (75). Da mesma forma, numa população Chinesa, o alelo -251T do promotor do

gene da IL-8, encontra-se associado ao aumento do risco de carcinoma gástrico de tipo

difuso, ao contrário da variante -251A (76). Os indivíduos portadores do genótipo G/G

do SNP 309 do promotor do gene MDM2, regulador negativo da proteína p53, têm

susceptibilidade aumentada para o desenvolvimento de carcinoma gástrico e pior

prognóstico, quando comparados com os indivíduos portadores do alelo T (G/T+T/T)

(77). O SNP -260 C<T do promotor do gene CD14, principalmente os indivíduos

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 63 -

portadores do alelo T, têm maior risco de desenvolvimento de carcinoma gástrico

relacionado com infecção pela H. pylori (“H. pylori – related gastric carcinoma”) (78).

Com este pano de fundo, a diferença encontrada na distribuição das variantes alélicas do

SNP2 na população Moçambicana, ganha relevância.

Como já foi referido anteriormente, o SNP2 (rs3812862) não está em HWE na

população Moçambicana. As frequências genotípicas para este marcador comparadas

com as frequências depositadas no “International Hapmap Project”

(http://www.hapmap.org) para uma população Nigeriana (YRI, “Youruba in Ibadan”)

(tabela 19) são diferentes. Na população Moçambicana observa-se um aumento

estatisticamente significativo (P≤0,05) de indivíduos homozigóticos CC e uma

diminuição estatisticamente significativa (P≤0,05) na taxa de indivíduos heterozigóticos

CT, em relação à referida população Nigeriana. Por comparação, verificamos que os

valores obtidos na população Portuguesa em estudo são semelhantes aos depositados na

mesma base de dados para uma população Europeia. Este facto já nos indica uma

diferença na distribuição deste marcador na população Moçambicana.

Tabela 19: Frequências alélicas e genotípicas para o marcador rs3812862 obtidas

neste estudo e descritas para populações europeias e africanas

Alelos Genótipos rs3812862 C T CC CT TT

Total Total Portugal 0,071 0,929 1 0 0,141 0,859 1

HapMap-CEU* 0,067 0,933 1 0 0,133 0,867 1

Moçambique 0,411 0,589 1 0,238 0,347 0,416 1 HapMap-YRI* 0,35 0,65 1 0,1 0,5 0,4 1

* Baseado no “Genome Browser Ensembl.org” (http://ensembl.org), Homo sapiens Março 2008 ( CSHL-HAPMAP: HapMap-CEU-

Europa; CSHL-HAPMAP: HapYRI, África).

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 64 -

O que temos discutido até aqui relaciona-se com a associação deste SNP como

indicador de associação com o desenvolvimento de MI e com o desvio ao HWE

encontrado. Como tal, fomos verificar o HWE em cada subgrupo Moçambicano, MI- e

MI+, isoladamente, e verificamos que é o subgrupo MI- que não obedece à Lei de

Hardy-Weinberg.

Tabela 20: Frequências alélicas e genotípicas nos dois subgrupos Moçambicanos

Alelos Genótipos

rs3812862 C T CC CT TT Total Total Moçambique_MI- 0,391 0,609 1 0,228 0,326 0,446 1 Moçambique_MI+ 0,611 0,389 1 0,333 0,556 0,111 1

Estudando as frequências genotípicas (tabela 20) dos dois subgrupos Moçambicanos

verificamos haver, no subgrupo MI- face ao subgrupo MI+, diminuição dos indivíduos

homozigóticos CC, aumento significativo de homozigóticos TT (P≤0,05) e diminuição

de indivíduos heterozigóticos. Estes resultados levam-nos a considerar a hipótese de que

o alelo T, e mais concretamente o genótipo TT, poderão ter um efeito “protector” para o

desenvolvimento de MI e ser específico da população Moçambicana, já que em Portugal

e na população europeia estudada no “International Hapmap Project” este é o alelo mais

prevalente em ambos os subgrupos. Este resultado vem ao encontro de um estudo

publicado em 2006 que mostra que há regiões genómicas que se associam com

determinada patologia dependendo da origem da população (79).

Outros aspectos são importantes na interpretação de desvios ao HWE. Uma das razões

geralmente apontadas para que um marcador não obedeça à Lei de Hardy-Weinberg

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 65 -

reside na ocorrência de erros técnicos que se traduzam nos resultados de genotipagem.

(80, 81). Não é o caso do nosso estudo em que não houve qualquer dúvida relativa à

genotipagem para este marcador. Este aspecto é reforçado pelo facto de na amostra

Portuguesa não haver qualquer evidência de “desvio ao equilíbrio” para o mesmo

marcador. Uma outra forma de sustentar a veracidade dos resultados da genotipagem e

evitar associações erradamente positivas seria a inclusão no estudo de uma verdadeira

população controlo em HWE (grupo de indivíduos “normais”, isto é, nunca infectados

e, portanto, sem metaplasia intestinal). Contudo, foi-nos vedada esta hipótese de

trabalho devido às limitações amostrais nesta população africana. Um outro aspecto

apontado como causa de desvios ao HWE é a ocorrência de endogamia, fenómeno

comum em populações africanas, que se traduz na diminuição na taxa de heterozigotia

(82). Contudo, se fosse esta a justificação para o desvio encontrado, seria de esperar que

outros marcadores estudados não obedecessem a esta lei. Sendo assim, dado haver

estudos que indicam que uma violação ao HWE pode ser devida a uma associação real

(83, 84), indicando uma possível selecção de um alelo em relação a outro, este resultado

sugere a importância deste marcador na população Moçambicana, sendo que o reforço

amostral, factor limitante neste tipo de estudos, bem como estudos mais detalhados,

seriam da máxima importância para melhor perceber o verdadeiro significado destas

observações.

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 66 -

Existe algum haplótipo que se associe ao desenvolvimento de metaplasia intestinal

dentro de cada população?

A caracterização haplotípica das duas populações produziu 26 haplótipos. Na população

Portuguesa, apesar da diferença encontrada na distribuição das variantes alélicas do

SNP8, não se verificou nenhuma diferença significativa na distribuição haplotípica entre

os dois subgrupos, indicando que os dois subgrupos Portugueses, MI- e MI+, são

geneticamente muito semelhantes para o conjunto dos 8 marcadores genotipados. Este

facto vem reforçar a associação, interpretada como circunstancial, do alelo C do SNP8

com a MI, já discutida anteriormente.

Relativamente à população Moçambicana foi observada, para o haplótipo H23, uma

variação na distribuição entre os dois subgrupos MI- e MI+ que foi significativa

(P≤0,05). Este haplótipo é um dos mais representados no subgrupo Moçambicano MI-

(16,3%) e não tem qualquer representação no subgrupo MI+ (Figura 7C e 7D). De

realçar que o haplótipo H23 apenas difere da combinação H24 na posição

correspondente ao SNP2, sugerindo a possível associação do alelo T na protecção ao

desenvolvimento de MI. O facto do alelo T estar presente na população com MI

(haplótipos H2, H7 e H8) não invalida a hipótese anterior uma vez que o mesmo se

encontra associado a diferentes “backgrounds” genéticos. Mais ainda, como mostra a

tabela 20, existe uma diferença estatisticamente significativa na proporção de indivíduos

homozigóticos TT entre o subgrupo MI- (44,6%) e o subgrupo MI+ (11,1%).

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 67 -

Os resultados obtidos anteriormente foram confirmados duma outra forma aplicando o

teste AMOVA através do qual são calculados os valores de FST (índice de Fixação)

como indicadores de diferenciação genética entre populações. No entanto, para o

conjunto dos 8 marcadores estudados, não foi encontrada nenhuma variação entre os

subgrupos dentro de cada população. A totalidade da distribuição da variação (tabela

13) foi encontrada ao comparar as duas populações entre si, Portugal e Moçambique,

com 18,77% de distribuição da variação e sobretudo ao comparar os indivíduos dentro

dos subgrupos com 81,26% de distribuição da variação. Entre Portugal e Moçambique o

valor obtido de distribuição da variação está dentro do intervalo de valores esperados

quando se comparam populações de diferentes continentes (15 a 20% de variação). O

“Teste Exacto de Diferenciação Populacional” baseado nas frequências haplotípicas

também apontou neste sentido. Por este facto, com base nestes marcadores, não é

possível identificar diferenças que expliquem a variação encontrada entre as duas

populações relativamente ao desenvolvimento de MI.

Haverá indícios de ancestralidade genética europeia nos indivíduos Moçambicanos

com MI?

Um outro aspecto desta análise relaciona-se com a possibilidade de podermos estudar se

havia ancestralidade genética europeia nos indivíduos pertencentes ao subgrupo

Moçambicano MI+, numa tentativa de “desvendar” um pouco o mistério subjacente ao

“Enigma Africano”. Verificamos que não existe ancestralidade genética europeia no

pequeno subgrupo Moçambicano MI+ e que não é este o factor envolvido na maior

predisposição destes indivíduos para o desenvolvimento de MI. De facto, a distância

genética encontrada entre o subgrupo Português MI+ e o subgrupo Moçambicano MI+ é

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 68 -

superior (FST=0,18291) à encontrada entre o subgrupo Português MI+ e o subgrupo

Moçambicano MI- (FST=0,16554), o que rejeita qualquer hipótese de ancestralidade.

Embora não se tenha observado nenhuma associação do conjunto dos 8 marcadores

genotipados e o desenvolvimento de MI entre as duas populações estudadas,

verificamos a ocorrência de diferenciação genética para cada marcador, para confirmar

os resultados obtidos no cálculo das frequências alélicas.

Os resultados mostraram a mesma tendência observada aquando da análise global, isto

é, maior distribuição da variação entre as duas populações, Portugal e Moçambique, e

entre indivíduos dentro dos subgrupos (tabela 15), do que entre os subgrupos MI- e MI+

dentro de cada população. No entanto verificamos que 3 marcadores mostraram alguma

percentagem de distribuição da variação intrapopulacional, um entre os subgrupos MI- e

MI+ em Portugal (SNP8) (tabela 16) e dois entre os subgrupos MI- e MI+ em

Moçambique (SNP2 e SNP6) (Tabelas 17 e 18). Estes resultados, excepto para o SNP6

(rs2481952), estão de acordo com o que foi observado inicialmente no cálculo das

frequências alélicas e discutido para o SNP8 e SNP2, respectivamente na população

Portuguesa e Moçambicana. Relativamente ao SNP6, que não tinha demonstrado

indícios de variação alélica, mesmo que tendencial, entre os dois subgrupos

Moçambicanos, verificamos que o alelo A no subgrupo MI+ está representado em

38,89% das amostras face aos 22,83% nas amostras do subgrupo MI-. No entanto, para

este tipo de variação, o baixo efectivo amostral do subgrupo Moçambicano MI+, não

permitiu que o teste estatístico utilizado detectasse esta diferença na variação da

distribuição alélica. No entanto, dado que a análise estatística AMOVA é mais sensível

a efectivos amostrais baixos, nenhum dos valores P associado aos valores de FST

Discussão

_____________________________________________________________________________________

- 69 -

indicativos de algum grau de diferenciação ou distância genética entre os subgrupos

Moçambicanos é significativo.

Conclusão _____________________________________________________________________________________

- 70 -

CAPÍTULO VI - CONCLUSÃO

O estudo de 8 SNPs na região genómica que contém o gene CDX2, realizado com o

objectivo de identificar alterações na distribuição das variantes alélicas que se associem

com o desenvolvimento de metaplasia intestinal gástrica no contexto da infecção pela

H. pylori, permitiu identificar na população Portuguesa um SNP (rs9285356) que se

associa significativamente com o desenvolvimento de MI. Na população Moçambicana

identificamos um SNP no promotor do CDX2 (rs3812862, C>T) potencialmente

associado com MI, e verificamos haver, para este SNP, um aumento significativo

(P≤0,05) de indivíduos homozigóticos para o alelo T no subgrupo MI- em comparação

com o subgrupo MI+. Também observamos uma associação significativa (P≤0,05) do

haplótipo H23 com o subgrupo MI-. Tudo isto nos leva a afirmar que, na população

Moçambicana, o alelo T deste SNP e mais concretamente o genótipo TT podem ter um

efeito protector em relação ao desenvolvimento de MI.

Verificamos também que não há indícios de ancestralidade genética europeia no

subgrupo Moçambicano MI+ e que não é este o factor envolvido na maior predisposição

destes ao desenvolvimento de MI, em relação à maioria da população.

A realização de estudos funcionais e o aumento do efectivo amostral do subgrupo

Moçambicano com metaplasia intestinal são tarefas que se mostram fundamentais para

confirmar estes resultados e, concretamente, para suportar a hipótese de que

polimorfismos no gene CDX2 seriam “facilitadores” ou “inibidores” do

desenvolvimento de MI.

Anexo

_____________________________________________________________________________________

- 71 -

ANEXO - Matrizes de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais

Portugueses e Moçambicanos para os marcadores 1, 3, 4, 5 e 7, respectivamente

SNP1- rs9554217a 1 2 3 4

1. Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,99099) -

3.Moçambique_MI- 0,13852 (0,0000) 0,14055 (0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,19203 (0,00901) 0,19382 (0,00901) 0.00000 (0,34234) -

SNP3-rs1805106a 1 2 3 4

1. Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,66667) -

3.Moçambique_MI- 0,00000 (0,62162) 0,00526 (0,25225) -

4.Moçambique_MI+ 0,00000 (0,99099) 0,00000 (0,99099) 0.00000 (0,99099) -

SNP4-rs3742110a 1 2 3 4

1. Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,52252) -

3.Moçambique_MI- 0,05116 (0,0000) 0,02394 (0,02703) -

4.Moçambique_MI+ 0,07390(0,09910) 0,04363 (0,15315) 0.00000 (0,53153) -

SNP5-rs2504211a 1 2 3 4

1. Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000(0,99099) -

3.Moçambique_MI- 0,23588 (0,0000) 0,21299 (0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,21587 (0,01802) 0,19046 (0,00000) 0.00000 (0,82883) -

SNP7-rs3003954a 1 2 3 4

1. Portugal_MI- -

2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,95495) -

3.Moçambique_MI- 0,20581 (0,0000) 0,18297 (0,00000) -

4.Moçambique_MI+ 0,06485 (0,09910) 0,04568(0,21622) 0.01079 (0,30631) -

a valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)

Referências bibliográficas

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- 72 -

CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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