estudo da regeneração óssea guiada em mandíbula de ratos ... · aos meus novos irmãos, talita;...

CELEY APARECIDA EUGENIO SILVEIRA

Estudo da regeneração óssea guiada em

mandíbula de ratos idosos.

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Ciências Médicas Área de concentração: Processos Inflamatórios e Alérgicos Orientadora: Profª Drª Suzana Beatriz Veríssimo de Mello

(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011. A versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP)

São Paulo 2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Silveira, Celey Aparecida Eugênio Estudo da regeneração óssea guiada em mandíbula de ratos idosos / Celey Aparecida Eugênio Silveira. -- São Paulo, 2012.

Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Ciências Médicas. Área de concentração: Processos Inflamatórios e Alérgicos

Orientadora: Suzana Beatriz Veríssimo de Mello. Descritores: 1.Envelhecimento 2.Regeneração óssea guiada 3.Enxerto ósseo

4.Membrana 5.Titânio 6.Implante experimental 7.Microtomografia por raio-X 8.Densidade óssea 9.Ratos

USP/FM/DBD-274/12

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Deus por permitir em minha vida esta e

outras oportunidades de crescimento pessoal e profissional.

Com todo amor, eu dedico este trabalho em homenagem aos meus

queridos pais, Celso e Leila, por representarem o início de uma existência

e uma educação primorosa dando sempre o que tinham de melhor a

oferecer.

A minha família, de sangue e a que escolhi fazer parte. Dedico tanto

a família Eugênio Silveira quanto a família Ferrari Casadio por tudo que

representam de melhor na minha vida.

Em especial aos meus irmãos, José Norberto e Celso, por

representarem o que eu tive de mais bonito na minha infância

e por todo amor.

Aos meus novos irmãos, Talita; Érica; Caio e Ana Julia, por

completarem minha vida.

Ao amores da tia, Nicholas e Giovanna, que representam a

ingenuidade e o amor sincero que a infância nos dá e a vida nos tira.

E principalmente, ao meu grande amor, meu marido Marco César

Ferrari Casadio, que sempre me apoiou e nunca deixou eu desistir de um

sonho.

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Agradeço especialmente,

à Profa Draa Suzana Beatriz Veríssimo de Mello

pela oportunidade de realizar um sonho,

pelo carinho de “pegar na minha mão” em momentos

que precisei de apoio e motivação,

pelo em empenho dedicado a execução deste estudo

e por toda contribuição no meu aprendizado

acadêmico e pessoal.

Guardarei com carinho a pessoa

que conheci por trás desta grande mulher.

Muito obrigada!

AGRADECIMENTOS

A Profa Dr

a Eloísa Silva Dutra de Oliveira Bonfá, pela aprovação do

projeto e disponibilidade de todo o Departamento de Reumatologia.

A Profa Dra Rosa Maria Rodrigues Pereira, pelas portas abertas e pela

valiosa contribuição e carinho a mim dedicado.

A Profa Dr

a Vanda Jorgetti, pelas portas abertas e pela valiosa

contribuição e carinho a mim dedicado.

A Profa Dr

a Walcy Rosolia Teodoro, pelas portas abertas e pela valiosa

contribuição e carinho a mim dedicado.

Aos membros da banca de qualificação, Profo Dr

o Wilson Jacob Júnior,

Profa Dr

a Cecília Helena de Azevedo Gouveia, Prof

o. Dr

o. João Cesar

Batista Neto, pelas valiosas considerações.

Aos que colocaram „„ a mão na massa‟‟, Maria Aurora Gomes da Silva,

Maria de Fátima de Almeida, Valeria de Falco, Liliam Takayama,

Antonio dos Santos Silva, Waldecy, Walter, Meire, Boleta, Paulo

Lasso, pela participação ativa na execução deste estudo e ainda pelo

carinho diário a mim dedicado em palavras de apoio e estímulo.

Aos Profo. Dr

o. Benedito de Moraes Purquerio e Prof

o. Dr

o. Carlos

Alberto Fortulan pelas portas abertas e participação na elaboração dos

enxertos sintéticos que seriam utilizados no projeto inicial deste estudo.

A Doutora Cláudia Camilo pela ajuda com a obtenção da microtomografia

e principalmente pelo carinho e amizade.

Ao Domingos, pelo ombro companheiro durante a pós-graduação.

Aos Professores da graduação da Universidade Federal de Alfenas, em

especial aos Prof. Dr. Paulo Antonio Arantes e Prof. Waldo Horta.

Aos Prof. Dr. Antônio Fernando Martorelli de Lima (in memoriam),

Prof. Dr. Julio Cesar Joly, Prof. Dr. Robert Carvalho da Silva,

Prof. Dr. Eduardo Hebling, pela importância na minha formação

profissional e pelo carinho a mim dedicado durante a Especialização em

Periodontia na Associação Paulista de Cirurgiões Dentista Regional de

Piracicaba.

Aos Prof. Dr. Luiz Antonio Pugliesi Alves de Lima, pelas portas abertas

durante meu estágio na Disciplina de Periodontia na Faculdade de

Odontologia da Universidade de São Paulo.

Ao Prof. Dr. Marcelo Cavalcanti, pelo carinho a mim dedicado.

Ao Mestre André Hespanhol pelo aprendizado de um modelo de estudo,

pela paciência e pelo meu crescimento pessoal.

A Janaina Santos Badin Carvas pelo carinho e amizade.

A Priscilla Chibebe, pelo carinho e amizade.

Aos eternos amigos, Cléverson, Carlos Roberto, Ana Paula, Ivan, Kelen,

Argeo, Mariana, Ana Maria, Liza, Ana Luiza, Elen Nogata, Gustavo

Camilo, Cintia, Marilena e Tatiana pela alegria em minha vida.

A minha amiga Ângela Verillo Jorgino por todo apoio e carinho oferecidos

diariamente.

A minha linda família de Alfenas, Valdo, Denise, Liz e Isa, pela proteção e

carinho a mim dedicados desde a faculdade até hoje.

A CAPES, pela auxilio de bolsa.

Ao SISTEMA INP LTDA, pelo fornecimento dos mini-implantes e kit

cirúrgico.

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas

Resumo

Abstract

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

1.1 Técnica de regeneração óssea guiada ............................................................. 2

1.2 Envelhecimento e o tecido ósseo ..................................................................... 8

2. OBJETIVO ............................................................................................................ 18

3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 20

3.1. Animais .......................................................................................................... 21

3.2. Grupos Experimentias .................................................................................... 21

3.3. Procedimentos Cirúrgicos .............................................................................. 23

3.4. Análise Hematológica .................................................................................... 25

3.5. Avaliação Ponderal ........................................................................................ 26

3.6. Densitometria Óssea ...................................................................................... 26

3.7. Microtomografia Computadorizada ................................................................ 28

3.8. Processamento Histológico ............................................................................ 30

3.9. Análise Histomorfométrica ............................................................................. 30

3.10. Marcação por tetraciclina ............................................................................. 31

3.11. Análise Estatística ........................................................................................ 33

4. RESULTADOS ..................................................................................................... 34

4.1. Animais .......................................................................................................... 35

4.2. Avaliação Ponderal ........................................................................................ 35

4.3. Contagem total e diferencial de leucócitos ..................................................... 36

4.4. Avaliação da Densidade Mineral Óssea ........................................................ 37

4.5. Microtomografia Computadorizada ................................................................ 41

4.6. Histomorfometria...............................................................................................42

4.7. Taxa de Aposição Mineral...................................................................................44

5. DISCUSSÕES ...................................................................................................... 46

6. CONCLUSÕES ................................................................................................. 51

7. REFERÊNCIAS.......................................................................................................53

LISTA DE ABREVIATURAS

%BA – percentual de área ossea

%BIC – percentual de contato osso-implante

%BV – percentual de volume ósseo

A – animais adultos

ANOVA - análise de variância

AT – área total

BA – área óssea

BIC – contato osso-implante

BMP-6 proteína morfogética óssea -6

BMU - unidade básica multicelular

BV – volume ósseo

Cappesq - Comitê de Ética da Faculdade de Medicina

CMO – conteúdo mineral ósseo

COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

D1 – densitometria óssea inicial

D2 – densitometria óssea final

DDM – distância entre as duas marcações de tetraciclina

DMO – densidade mineral óssea

DXA - dupla emissão de fonte de raios-X

FGF - fator de crescimento de fibroblastos

IL-1 – interleucina-1

IL-6 – interlaucina-6

INP – Instituto Nacional de Prótese

MAR – taxa de mineralização óssea

PRS – sobrenadante liberados por plaquetas

PT - perímetro total do implante

PTFE-e - membranas de politetrafluoretileno expandido

ROG – regeneração óssea guiada

ROI – região de interesse

ROT – regeneração tecidual guiada

V – animais velhos

VEGF - fator de crescimento endotelial vascular

VT – volume total

ΔCMO – variação de conteúdo mineral ósseo

ΔDMO – variação da densidade mineral óssea

ΔPeso – variação de peso

μCT - microtomografia computadorizada

μCT 3D – microtomografia computadorizada em 3D

RESUMO

Silveira, CA. Estudo da regeneração óssea guiada em mandíbula de ratos

idosos. São Paulo, 2012. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo.

Atualmente há um número crescente de idosos necessitando reabilitação

com enxerto ósseo, no entanto pouco se sabe sobre o efeito do

envelhecimento fisiológico sobre este processo. Este estudo teve como

objetivo comparar a regeneração óssea guiada na mandíbula de ratos

adultos e velhos. Ratos Wistar machos, com 9 meses (adultos) e 20 meses

(velhos) de idade, foram avaliados 0, 7, 28 e 120 dias após a cirurgia. O

protocolo cirúrgico incluiu a remoção de osso autógeno da calvária e sua

fixação com implante de titânio na mandíbula. A formação óssea foi

avaliada através da densidade mineral óssea (DMO), microtomografia

computadorizada (μCT), análise histomorfométrica e taxa de aposição

mineral. Cento e vinte dias após a cirurgia, os animais velhos

apresentaram uma redução da variação da DMO na tíbia quando

comparada com adultos (-0,022±0,007 vs. 0,011±0,004 g/cm2,

respectivamente, p=0,004) e no fêmur (-0,036±0,01 vs. 0,024±0,007 g/cm2,

respectivamente, p=0,000). A análise de μCT revelou uma redução no

percentual de volume ósseo nos ratos velhos quando comparados aos

adultos (52,34±1,98 vs. 61,46±2,0 %, respectivamente, p=0,032). A análise

histomorfométrica confirmou estes dados, tanto no percentual de área

óssea (44,0±1,9 vs. 51,0±1,4 e %, velho vs. adulto, p=0,014) quanto no

contacto osso-implante (63,5±3,4 vs. 73,0±1,7%, velho vs. adulto,

p=0,028). A taxa de aposição mineral óssea também foi significativamente

menor nos ratos velhos em comparação com os adultos, tanto na região da

mandíbula (1,23±0,05 vs 2,62±0,33 μm/dia, respectivamente, p=0,001)

quanto na região do implante (0,16±0,03 vs. 1,17±0,06 μm/dia,

respectivamente, p=0,001). Em conclusão, nossos resultados sugerem que

o processo de envelhecimento, por si só, afeta a capacidade de

regeneração ossea de animais velhos que não são caracterizados como

osteoporóticos e sugerem que isso deva ser levado em conta durante o

tratamento de pacientes idosos.

DESCRITORES: 1.Envelhecimento 2.Regeneração óssea guiada

3.Enxerto ósseo 4.Membrana 5.Titânio 6.Implante experimental

7.Microtomografia por raio-X 8.Densidade óssea 9.Ratos

ABSTRACT

Silveira, CA. Advanced age impairs guided bone regeneration: a study in rat jaw

model. São Paulo, 2012. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo.

Currently there are an increasing number of elderly requiring rehabilitation with

bone graft, however little is known about the effect of physiological aging on this

process. This study aimed to compare guided bone regeneration in adult and old

normal rats. Male Wistar rats with 9 months (adult) and with 20 months (old) were

evaluated at 0, 7, 28 and 120 days after surgery. The surgical protocol included

the removal of autogenous parietal bone and insertion in the jaw with titanium

implant. Bone formation was evaluated through bone mineral density (BMD), X-ray

computerized microtomography (3DµCT), histomorphometric analysis and

mineralization apposition rate. At baseline, adults and old animals presented

similar values of BMD. 120 days after surgery, old animals presented a reduction

of tibia BMD when compared with adults (-0.022±0.007 vs. 0.011±0.004 g/cm2,

respectively, p=0.004) and of femur (-0.036±0.01 vs. 0.024±0.007 g/cm2,

respectively, p=0.000). The 3DµCT analysis revealed a reduction of new-formed

bone volume in the old group when compared with adult (52.34±1.98 vs. 61.46±2.0

%, respectively, p=0.032). Histomorphometric analysis corroborates these data,

since 120 days after surgery the % of bone area and bone-implant contact were

impaired in old rats. Mineralization apposition rate was also impaired in mandible

and at implant region of old rat. Together our results suggest that the ageing

process per se affect bone regenerative capacity and calls for attention of

surgeons to this retard during the treatment of elderly patients.

Keywords: Aging; Guided bone regeneration; Bone graft; Membrane; Experiment

titanium implant; X-ray microtomography; Bone density; Rats.

I n t r o d u ç ã o | 1

INTRODUÇÃO


1. Introdução

1.1. Técnica de Regeneração Óssea Guiada.

Atualmente, os implantes são considerados como a primeira linha de

tratamento para restaurar dentes ausentes. Em determinadas situações

clínicas, o volume ósseo insuficiente pode ter influência sobre a estrutura

protética, estética e sobre o prognóstico de fixação do implante a longo prazo.

Nesses casos, a terapêutica de implante dentário passa a não ser uma opção

de tratamento sem uma prévia terapêutica regenerativa. Uma grande variedade

de técnicas e materiais têm sido empregadas para restabelecer o volume de

tecido ósseo necessário ao suporte de implantes dentários. Essas técnicas

regenerativas visam a reconstrução do tecido danificado ou destruído para que

este seja idêntico em composição, morfologia e função ao tecido original.

O princípio da técnica de regeneração óssea guiada (ROG) foi baseado

na regeneração óssea tecidual (ROT). O conceito da ROT se baseia no

princípio de que a cura da área lesionada depende do tipo de população celular

presente na lesão (Melcher 1969,1976). Na área da periodontia, a técnica foi

inicialmente demonstrada em um estudo experimental que objetivou a

regeneração do periodonto de inserção (Nyman et al., 1982). Outros estudos

em animais (Gottlow et al., 1984; Karring et al., 1985) e em humanos (Gottlow

et al.,1986) comprovaram que ocorre a regeneração do periodonto de inserção,

através da técnica de ROT.

Em 1988, a ROG foi introduzida como uma modalidade terapêutica por

Dahlin e colaboradores com o objetivo de alcançar a regeneração óssea.


Posteriormente, mostrou-se que a ROG promove o aumento horizontal do

rebordo alveolar (Esposito et al., 2009) utilizando enxerto ósseo autógeno em

bloco recoberto por membrana (Chen et al., 2009). Sendo assim, ficou definida

a ROG como uma técnica que visa a regeneração de defeitos ósseos através

da aplicação de membranas oclusivas. A membrana é um barreira física que,

mecanicamente, exclui populações de células não-osteogênicas (células

indesejáveis) provenientes do tecidos moles circunjacentes (células epiteliais e

conjuntivas). Portanto, somente as populações de células osteogênicas

originárias do osso hospedeiro que promovem o povoamento da ferida óssea

(Retzepi e Donos 2010, Donos et al. 2002a, 2002b, 2002c, 2002d). Em

conjunto, estes estudos sugerem que a regeneração óssea é significativamente

melhorada quando a invasão do tecido mole em defeitos ósseos é

mecanicamente impedida pela membrana.

No contexto da terapia com ROG, vários tipos de membranas (não

reabsorvíveis e reabsorvíveis) têm sido usadas em estudos experimentais e

clínicos. No entanto, antes da escolha do tipo de membrana, alguns pré-

requisitos são essenciais: (1) biocompatibilidade, (2) capacidade de impedir a

entrada de células adjacentes, (3) interação com o tecido a ser regenerado, (4)

capacidade de manutenção do espaço na área a ser reconstruída (Karring et

al.,1993). A propriedade de oclusão da membrana está diretamente

relacionada ao seu adequado posicionamento, sendo assim, a membrana

deve: se sobrepor 3 a 4 milímetros além das bordas do defeito, ser protegida

pela síntese do retalho e manter uma boa estabilidade (Hämmerle e Jung,

2008).


Inicialmente a técnica de ROG foi clinicamente aprovada, utilizando

membranas não-reabsorvíveis como a de politetrafluoretileno expandido

(PTFE-e). Entretanto essa membrana apresenta desvantagens e complicações

no seu uso tais como: hidrofobia, difícil fixação, risco elevado de exposição,

contaminação e a necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica para sua

remoção (Chiapasco et al., 1999). No campo da odontologia, as membranas de

colágeno absorvíveis passaram a ser as mais utilizadas na ROG. Entre as

vantagens da sua utilização ressaltam-se a facilidade de fixação, baixo risco de

exposição e contaminação além de, em função de sua reabsorção, não exigir

um segundo procedimento para sua remoção (Fridmann et al., 2002; Moses et

al. 2005). Adicionalmente, é importante ressaltar outra grande vantagem das

membranas de colágeno, a inerente capacidade de adaptação devido sua forte

aderência ao coágulo sanguíneo (Buser et. al., 2011). Apesar das vantagens, a

membrana de colágeno tem um tempo de degradação que pode variar de

quatro a dezesseis semanas além de não ter uma boa capacidade de

manutenção do espaço em função de suas propriedades mecânicas (Bornstein

et al., 2009).

O sucesso d a regeneração óssea ut ilizand o a t écn ica d e ROG

necessit a d a ob servação a 4 p r incíp ios d uran t e sua execução: o

f echam ent o p r im ár io d a f er id a, a angiogênese, a cr iação e

m anut enção d e esp aço ab aixo d a m em b rana e a est ab ilid ad e t an t o

d o coágulo sanguíneo in icial q uand o d a f ixação d o im p lan t e (Wang

and Boyapati, 2006). Sendo assim, é muito importante a presença do enxerto

ósseo sob a membrana pois este permite uma sustentação mecanica da

mesma impedindo o seu colapso (Levin et al, 2011).


A exemplo do uso da ROG, em 2006, von Arx and Buser apresentaram,

em um estudo clínico, o aumento de rebordo com o uso de enxerto autógeno

em bloco e enxerto ósseo mineral bovino inorgânico recobertos por membrana

de colágeno. Os resultados monstraram uma elevada taxa de sucesso no

aumento horizontal do rebordo alveolar com alta previsibilidade. Estes autores

ressaltaram que o método cirúrgico foi simplificado, ainda mais, com o uso de

membrana reabsorvível.

Portanto, o enxerto ósseo autógeno é comumente utilizado na ROG para

promover um aumento ósseo, fornecer suporte mecânico à membrana de

colágeno e estabilizar o coágulo sanguíneo (Jensen et al., 2006). O enxerto

autógeno, por ter propriedade osteocondutora e indutora, atualmente

representa o "padrão ouro" para o tratamento de defeitos ósseos (Listrom e

Symington, 1988; Jensen e Pedersen, 1991; Marino e Ziran, 2010). Dessa

forma o enxerto autógeno fornece fatores de crescimento e tecido

vascularizado, mantendo as células nativas com potencial osteogênico (Delloye

et al., 2007).

A obtenção do enxerto autógeno podem ser intra ou extra-oral (Hunt e

Jovanovic, 1999). Na odontologia, preferencialmente, opta-se por enxertos

ósseo intra-orais, das regiões do mento e retromolar. A área anatômica de

remoção do enxerto ósseo têm importância devido a vascularização do tecido,

uma vez que esta característica pode alterar a reabsorção do enxerto. Os

enxertos em bloco, de origem intramembranosa apresentam menores taxas de

reabsorção que enxertos de origem endocondral (Zins e Whitaker, 1983). Em

vista disto, é importante ressaltar que a mandíbula e calota craniana são ossos

de origem membranosa e o osso ilíaco e a tíbia são de origem endocondral


(Pinholt et al., 1994). Portanto, o enxerto com osso da calvária é o que melhor

mimetiza o procedimento técnico empregado em humanos (Smolka et al.,

2006). Apesar da diferença na taxa de reabsorção entre os enxertos

intramembranos e o endocondrais, ambos apresentam menores taxas quando

recobertos por membrana (Alberius et al., 1996).

Visando melhorar o suprimento sanguíneo e o preparo do leito

hospedeiro, a técnica de ROG preve a realização de perfurações ou

decorticalização. Esse procedimento antes da inserção do enxerto promove

uma angiogênese precoce que acelera o processo de remodelação óssea

(Faria et al., 2008). Por outro lado, as perfurações ou decorticalização podem

desencadear uma reabsorção acentuada do leito ósseo em função de seu

enfraquecimento ou aporte vascular exacerbado (de Carvalho e Vasconcellos,

2000). Portanto, é importante preparar o leito hospedeiro, sem perfurar

demasiadamente.

O sucesso da técnica regenerativa pode ser comprometido, tanto pela

ausência de contato íntimo entre o enxerto e o leito receptor quanto pela falta

de estabilidade do enxerto ósseo junto ao leito. Essa estabilidade pode ser

alcançada com o uso de parafusos de fixação ou com a inserção simultânea de

implante dentário. Na ROG a colocação do implante é recomendada apenas se

o mesmo puder ser inserido em uma ótima posição e com satisfatória

estabilidade primária no leito ósseo (Chen et al., 2009).

Em resumo, inúmeros fatores podem interferir no sucesso do tratamento

com enxertos ósseos. Esses fatores podem interferir na vascularização, na

formação de novo osso e consequentemente na união adequada do enxerto

com o leito hospedeiro. Dentre eles salientam-se: biocompatibilidade do


enxerto, presença de células osteogênicas, origem embrionária,

microarquitetura, suprimento sanguíneo, estabilidade mecânica e íntimo

contato com o leito hospedeiro (Stevenson et. al., 1996; de Carvalho e

Vasconcellos, 2000).

Evidências histológicas mostram que na ROG a neoformação óssea sob

a membrana segue o mesmo processo e as mesmas fases de uma formação

óssea nativa em um álveolo após a extração do dente. Estas incluem a

formação do coágulo sanguíneo protegido pela membrana, formação de tecido

granulação, formação de osso primário, imaturo ou reticular, formação de osso

secudário, maduro ou lamelar e remodelação óssea. Assim, o processo de

neoformação óssea segue etapas que são iniciadas imediatamente após

injúria. A ruptura dos vasos sanguíneos e a hemorragia local promovem a

formação do coágulo sanguíneo e consequente hipóxia e acidose no local da

injúria. Dentro deste ambiente, as plaquetas são ativadas e liberam grânulos

ricos em fibrina e moléculas sinalizadoras para a matriz extracelular. O coágulo

estabelecido no local da injúria, funciona como um depósito para moléculas de

sinalização que são quimiotáxicas para células inflamatórias. Os neutrófilos,

monócitos e linfócitos aparecem consecutivamente e sua atividade lhes permite

migrar para dentro da matriz extracelular. A formação de novos vasos

sanguíneos, em conjunto com o povoamento por células mesenquimais

indiferenciadas formam o tecido de granulação. A regeneração envolve a

remoção de detritos pelas células do sistema imune inato, principalmente pela

linhagem monócito/macrófago e a estimulação simultânea de residentes

células mesenquimais. As células progenitores mesenquimais derivadas a

partir dos envelopes periosteal e endosteal, bem como a partir da medula


óssea, podem diferenciar-se em osteoblastos. A formação de tecido ósseo

pelos osteoblastos, inicialmente é uma estrutura desorganizada e

posteriormente o tecido ósseo é remodelado em osso lamelar. A duração de

todo este processo é de 4 a 6 meses (Schenk et al., 1994; Gruber et al., 2006).

Portanto, a remodelação do osso autógeno ocorre pela substituição de osso

necrótico por osso viável, processo esse denominado de creeping substitution

(Burchardt e Enneking, 1978).

A neoangiogênese, processo em que novos vasos sanguíneos são

formados a partir de vasos sanguíneos existentes, é uma etapa crucial para

formação e remodelação óssea. Uma vascularização apropriada é pré-requisito

para regeneração do tecido ósseo, tendo uma real reciprocidade entre

vascularização e o número de osteoblastos (Carano & Filvaroff, 2003;

Kleinheinz et al., 2005).

Diante dos mecanismos envolvidos na regeneração do tecido ósseo,

após o uso de técnicas regenerativas, surge a necessidade de verificar se o

processo de envelhecimento promove abalo no sucesso da ROG

comprometendo o almejado resultado final.

2.2. Envelhecimento e o Tecido Ósseo.

Atualmente, observamos um aumento na demanda de técnicas de

regeneração óssea devido a um gradual aumento da população idosa. O idoso

necessita de procedimentos regenerativos para melhorar sua qualidade de

vida. Em busca desta melhoria, as áreas da saúde vêm investindo cada vez


mais em pesquisas que forneçam evidências científicas para uma maior

segurança clínica tanto na indicação quanto no prognóstico destas técnicas.

Entretanto, em função da perda de dentes por trauma ou infecção,

fraturas ósseas, tumores e o processo de envelhecimento, a grande maioria

dos idosos não apresenta um volume ósseo necessário para se inserir um

implante. Corroborando essa afirmação, um estudo retrospectivo, avaliou os

pacientes encaminhados para tratamento com implantes dentários durante um

período de 3 anos. Os resultados indicam que: (1) os pacientes desdentados

que necessitavam de implante tinham mais que 50 anos de idade; (2) mais que

50% necessitavam substituir um único dente; (3) a necessidade de técnica para

promover aumento do osso ocorreu em 50% dos casos (Bornstein et al., 2008).

Ou seja, a necessidade do restabelecimento do volume ósseo perdido coloca a

técnica de regeneração óssea guiada como a melhor opção para um ganho

adicional do volume ósseo e reduzir a taxa de reabsorção do enxerto.

Outro desafio para os clínicos é enfrentar um metabolismo ósseo

alterado em função da idade avançada. O cirurgião se depara constantemente

com a dúvida de considerar um paciente idoso saudável e apto para os

procedimentos cirúrgicos. Em geral, considera-se o paciente apto aos

procedimentos cirúrgicos quando este não apresenta co-morbidades ou

quando já tem doenças de base sob controle. Nessas condições, considera-se

nula ou mínima a interferência sobre o metabolismo ósseo. Entretanto, o

próprio envelhecer prejudica o tecido ósseo tanto no metabolismo de

manutenção, quanto na regeneração de defeitos.

O organismo, durante seu desenvolvimento, passa por um processo

dinâmico de transformações. O envelhecimento ou senescência é


caracterizado como um processo progessivo e generalizado, no qual os

organismos apresentam um comprometimento de suas funções. No entanto, ao

contrário da morfogênese, o envelhecimento não é um processo pré-

programado. Dentre as inúmeras teorias para o processo de envelhecimento,

uma delas coloca o envelhecer como processo evolutivamente inesperado,

uma vez que não teria lógica o empreendimento de tamanho esforço de anos

na morfogênese para depois permitir sua destruição. Assim, seria plausível

acreditar que o envelhecimento ocorra como resultado da própria incapacidade

do corpo de se sustentar (Manolagas and Parfitt, 2010; Kirkwood, 2005; Tung

and Iqbal, 2007).

O organismo como um todo investe anos no processo de morfogênese

óssea até atingir seu patamar máximo, com a obtenção do pico de massa

óssea. Após essa fase, o tecido ósseo é fortemente afetado pelo processo de

envelhecimento, acometido por um desequilíbrio no balanço entre a taxa de

reabsorção e a formação óssea (Riggs et al, 2002).

O osso é um tecido bastante dinâmico que é remodelado durante toda a

vida para manutenção de sua integridade mecânica. Essa integridade depende

da remoção de um osso “velho” caracterizado por fadiga devido à presença de

microlesões, e sua substituição por um “novo” osso. Os objetivos da

remodelação óssea são adaptar o esqueleto a carga mecânica e manter a

homeostase do cálcio e fósforo. A comunicação altamente coordenada entre as

células formadoras (osteoblastos) e as que promovem a degradação do tecido

ósseo (osteoclastos) é necessária para manter a homeostase óssea

(Pietschmann et al., 2009).


O ciclo de remodelação óssea começa com a degradação do osso pelos

osteoclastos, que requer cerca de 2-4 semanas. Após essa degradação, a

formação óssea é realizada pelos osteoblastos que sintetizam matriz óssea

orgânica extracelular (osteóide) e orquestram a sua mineralização, cerca de 4-

6 meses. Este conjunto de células nas superfícies ósseas constitui a unidade

básica multicelular (BMU). Após a formação óssea, a BMU entra na fase de

repouso. A atividade das BMUs é determinada através da regulação

combinada de fatores locais como citocinas inflamatórias e hormônios (Rauch

et al., 2007).

No que diz respeito a formação óssea, estudos experimentais e clínicos

têm sido realizados para avaliar o efeito da idade sobre a geração,

diferenciação, e função dos osteoblastos. Os osteoblastos e adipócitos se

diferenciam a partir de células mesenquimais, presentes na medula óssea. No

idoso e em paciente com osteoporose, uma maior diferenciação das células

mesenquimais para a linha adipocítica poderia explicar a redução na

quantidade de osteoblastos. Portanto, um menor número de osteoblastos

prejudicará o processo de formação óssea (osteogênese) favorecendo a

formação de gordura (adipogênese) (Rosen et al., 2009).

O fator de crescimento de fibroblastos (FGF) é liberado pelas plaquetas,

macrófagos e pelos próprios fibroblastos. Fibroblastos estes que também se

diferenciam a partir de células mesenquimais, presentes na medula óssea

Atualmente, alguns estudos in vitro mostram que o processo de adipogenese

pode ser antagonizado pelo FGF e consequentemente, favorecer a via de

diferenciação das células mesenquimais precursoras (Schilling et al., 2008;

Xiao et al., 2010).


A capacidade das células mesenquimais de formar osso in vivo é

mantida com a idade. Assim, sugere-se que a diminuição na produção óssea

observada nos idosos está associada a um defeito no microambiente do osso

(Stenderup et al., 2004).

Em 2006, Cei et al. demonstram em um estudo experimental, que

independente da idade do animal, as células mesenquimais da medula óssea

respondem de forma semelhante aos fatores de crescimento ósseo, PRS e

BMP-6, in vitro. Esses resultados sugerem que as células osteoprogenitoras

provenientes de ratos adultos (9 meses) mantém o seu potencial juvenil, ou

seja, apresentam a mesma capacidade de responder a fatores de crescimento

e se diferenciar. Isso tanto quando esses fatores são liberados naturalmente ou

quando são aplicados terapeuticamente em locais de regeneração óssea.

Durante o envelhecimento, uma das alteração do microambiente ósseo é

o declínio generalizado na capacidade de retenção de proteínas na matriz

óssea. Exemplos são a osteocalcina e as proteínas ósseas morfogenéticas

(BMPs) que são secretadas por osteoblastos e desempenham um papel

importante nas interações entre células e matriz óssea (Kloss & Gassner,

2006).

No que diz respeito a reabsorção óssea no idoso, o desequilíbrio na

remodelação óssea parece ser causado não por um aumento no número de

osteoclastos e sim, por uma redução na atividade osteoblástica que diminui a

neoformação óssea e mineralização da matriz osteóide (Qiu et al., 2002).

Entretanto, alguns autores demostraram que no idoso a reabsorção

óssea (osteoclastogênese) está aumentada no osso trabecular, devido a

alteração da relação entre os osteoblastos e osteoclastos. Um aumento


significativo das células mesenquimais/osteoblástica promovem

consequentemente um maior número de células precursoras de osteoclastos

(Cao et al., 2005).

Um quadro de doença bastante comum no idoso é o declínio na

produção de hormônio sexual e consequentemente o aumento na taxa de

reabsorção óssea. Esse quadro decorrente do declínio na produção de

estrógeno é verificado tanto em homens quanto em mulheres. Este hormônio

funciona como protetor do tecido ósseo inibindo os efeitos do paratormônio na

ativação dos osteoclastos (Chan & Duque, 2002, Machado do Reis et al.,

2008).

As mudanças na atividade das células osteoblásticas, afetam

principalmente o osso trabecular diminuindo a densidade óssea. Entretanto,

embora numa velocidade mais lenta, também ocorrem reabsorções ósseas na

camada endocortical. Isso se deve ao osso trabecular apresentar maior

superfície óssea e conseqüentemente estar mais exposto ao maior número de

BMUs ativados. Considerando-se que no idoso a taxa de formação está

diminuída, a erosão do tecido ósseo se torna mais evidente também no osso

trabecular (Riggs et al., 2004).

Em resumo, as alterações na morfologia do osso em idosos incluem: a

expansão dos canais medulares devido a infiltração de gordura na medula

óssea e a compensação biomecânica através do aumento do diâmetro externo

das corticais sendo necessária devido a expansão dos canais medulares.

Essas mudanças na geometria óssea no idoso são reflexo de uma perda óssea

reduzida, porém contínua, tanto em osso trabecular quanto em osso cortical. A

taxa de formação óssea periosteal é contínua em indivíduos mais velhos


enquanto uma reabsorção óssea ocorre no compartimento endosteal

promovendo aumento da porosidade (Aronson et al., 2001).

Alterações no sistema imune/inflamatório, que ocorrem durante o

processo de envelhecimento, podem influenciar a formação óssea. Essas

alterações da capacidade de resposta inflamatória afetam o reparo dos tecidos

por modificar a adesão celular, migração e respostas funcionais. Dentre estas,

o neutrófilo que desempenha um papel central, no início da resposta

inflamatória, também sofre alterações durante o envelhecimento. Estudos in

vitro demonstraram que, apesar do maior número de neutrófilos, ocorre uma

redução na sua capacidade de fagocitose e quimiotaxia (Mello et. al., 1992),

além de uma diminuição na sua diapedese devido à menor permeabilidade

vascular (Butcher et al., 2001). O aumento do recrutamento leucocitário em

animais idosos foi obtido com de IL-1 e TNF (Campbell et al., 2007).

Outra célula importante para a resposta inflamatória, o macrófago

possui adesão e migração aumentadas com a idade (Iiyama et al., 1992),

possivelmente devido a um declínio na expressão do fator inibidor da migração

de macrófagos, considerado um fator central na regulação da inflamação e

reparo tecidual (Hardman et al., 2005). Contrariamente um estudo com ratos

jovens que receberam injeção subcutânea com soro anti-macrófago

apresentaram um retardo no fechamento de feridas, comprometimento esse

similar ao dos animais velhos (Cohen et al., 1987).

Tanto a medula óssea (responsável pelas células progenitoras), quanto

o timo (responsável pela maturação destas células), sofrem alterações

degenerativas com o envelhecimento. Consequentemente, populações de

células T são geradas com uma capacidade comprometida de responder a


desafios antigênicos (Pawelec et al., 2001). Mesmo durante um

envelhecimento natural e na ausência de doença, alterações importantes

ocorrem no idoso, ressalta-se a produção aumentada de importantes citocinas

inflamatórias como IL-1 e IL-6 (Fulop et al., 2006).

A regeneração óssea segue uma sequência de eventos semelhantes

aos envolvidos na remodelação óssea. Portanto, as evidências do desequilíbrio

na remodelação óssea no idoso permitem supor que a regeneração do tecido

ósseo deva também sofrer um abalo negativo na formação frente a injúrias.

Possivelmente as alterações decorrentes do avanço da idade na regeneração

do tecido ósseo sejam devido a: atraso no início da reação periosteal, atraso na

invasão angiogênica, atraso na diferenciação celular e consequentemente uma

redução na formação óssea com período prolongado de cura.

Em áreas de regeneração óssea, a redução tanto no número de células

osteogênicas quanto na formação de vasos sanguíneos são descritas no idoso

(Rivard et al., 1999). Enxertos ósseos provenientes da calota craniana ou

mandíbula, de animais com nove meses de idade, quando comparados a

animais jovens, apresentaram redução do número, mas não da função de

células osteogênicas (Cei et al., 2006).

Corroborando esses achados, em estudos de fratura, animais velhos

apresentaram uma diminuição no número de células osteoprogenitoras, uma

perturbação na taxa de diferenciação osteogênica, e uma menor taxa de

formação dos vasos sanguíneos, consequentemente retardo do reparo (Lu et

al., 2005; 2008).

Uma possível explicação para a menor angiogênese, com o avanço da

idade, poderia ser a alteração da expressão do fator de crescimento endotelial


vascular (VEGF), um componente crítico tanto para a angiogênese fisiológica

quanto patológica (Ferrara & Gerber, 2001).

Em estudos clínicos, a sobrevivência a longo prazo de implantes em

ossos regenerados com enxerto de osso temporal foi inversamente

correlacionada com a idade do paciente. Esse insucesso foi atribuído à falta de

aporte sanguíneo no idoso (Smolka et al., 2006). Uma formação óssea menor

no idoso foi tambem descrita para aloenxerto em bloco inserido em maxila

atrófica, (Nissan et al., 2012).

Animais provenientes de linhagem com envelhecimento acelerado,

apresentaram redução da osseointegração do implante inserido em tíbia,

redução essa mais evidente na região trabecular que na cortical (Beppu et al.,

2011). Corroborando esses achados, animais idosos com implantes inseridos

dentro do canal medular apresentaram um menor percentual de contacto

osso/implante bem como uma menor quantidade de osso neoformado ao redor

do implante (Takeshita et. al.,1997).

O emprego de roedores no estudo do envelhecimento e de alterações do

sistema esquelético é comum. Os mais frequentemente utilizados incluem a

remoção das gonadas sexuais. Esses animais apresentam um aumento da

taxa de remodelação óssea e um desequilíbrio a favor da reabsorção óssea.

Em animais ovariectomizados, a redução do estrógeno circulante promoveu

influência negativa na osseointegração de implante de titânio, que foi revertida

pela infusão do hormônio (Giro et al., 2011). Em estudo utizando ratas com 12

meses de idade ovariectomizadas observou-se, 28 dias após o ato cirúrgico, a

redução da regeneração de enxertos ósseos autógenos inseridos em

mandíbulas (Luize et al., 2008). Entretanto, nesse único estudo avaliando o


efeito do envelhecimento patológico sobre regeneração óssea, não foi utilizada

a membrana de colágeno que é classicamente utilizada na técnica em

humanos. Adicionalmente, esses animais com osteopenia induzida por uma

queda abrupta de estrógeno, não tiveram avaliação da qualidade do osso pré-

existente, uma vez que esse estudo não traz os dados de densidade mineral

óssea. Comparando-se a osseointegração de implante de titânio em tíbia de

ratas com 22 meses e animais com 3 meses ovariectomizadas, observou-se

que, a idade avançada afetou principalmente o osso pré-existente, enquanto a

ovariectomia afetou tanto o osso neo-formado quanto o pré-existente (Duarte et

al., 2005). Este estudo reforça a existência de diferenças significativas no

metabolismo ósseo durante o envelhecimento natural e quando há ruptura

abrupta do eixo hormonal.

Considerando a carência de estudos avaliando o efeito do

envelhecimento per se na regeneração óssea guiada, técnica mais comumente

utilizada na reabilitação oral de pacientes idosos, elaboramos o presente

protocolo buscando utilizar as principais ferramentas disponíveis para avaliação

de regeneração óssea.

O b j e t i v o s | 18

OBJETIVOS

O b j e t i v o s | 19

3. Objetivos

O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial regenerativo do osso

de ratos adultos e velhos, sem ablação do eixo gonadal, em diferentes fases do

processo de regeneração óssea guiada.

M a t e r i a l e M é t o d o s | 20

MATERIAL E MÉTODOS


3. Material e métodos

3.1. Animais

Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade

de Medicina (CAPPesq no 0429/09) e estão de acordo com o Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal (COBEA).

Foram utilizados ratos machos da raça Wistar fornecidos pelo Centro de

Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os ratos

foram obtidos da área de acasalamento porque estes animais já apresentavam

certa idade, ou seja, continham sete meses de idade. Após obtenção, os

animais foram mantidos até que completassem nove e vinte meses de idade,

quando foram submetidos aos procedimentos cirúrgicos.

Os animais foram mantidos em experimentação no Biotério do

Departamento de Clínica Médica/Reumatologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo, sendo mantidos dois animais por gaiola, com água

e ração ad libitum.

3.2. Grupos Experimentais

Inicialmente, nosso projeto previa a avaliação de grupos que seriam

sacrificados em 0, 7, 14, 28 e 120 dias após a realização do protocolo cirúrgico,

assim 70 animais foram obtidos. Entretanto, os ratos apresentaram alta taxa de

falecimento antes que completassem 20 meses de idade devido a várias

causas diagnosticadas e não diagnosticadas, tais como: tumor; dente de lobo e


baixo peso (Peso < 300g). Portanto, nosso projeto foi no seu transcorrer

reformulado e o grupo experimental de 14 dias pós-operatório removido da

pesquisa. Essa restrição do número de animais utilizados se deve ao prazo de

conclusão exigido no mestrado, que não possibilitou tempo hábil para manter

novos animais pelo período de 13 meses e repor os ratos perdidos. E ainda, o

experimento com animais velhos também apresenta grande dificuldade de

execução devido ao espaço físico disponível no biotério e o custo de

manutenção.

56 animais foram divididos em dois grupos com 28 adultos (A) de nove

meses e com 28 velhos (V) de 20 meses de idade. Esses grupos foram

divididos em quatro subgrupos com 7 animais em cada conforme o período de

eutanásia em 0, 7, 28 e 120 dias após a cirurgia. Evidentemente, ao final do

período experimental, aos 120 dias após a cirurgia, os animais do grupo adulto

apresentavam 13 meses e do grupo velho 24 meses de idade.

56 ratos

28 adultos

28 velhos

0 dia

7 dias

28 dias

120 dias

0 dia

7 dias

28 dias

120 dias

9 meses

9m +7d

9m + 28d

13 meses

20 meses

20m +7d

20m + 28d

24 meses

Grupos

Pós-operatório Idade

Figura 1. Esquema ilustrando o quadro de animais utilizados, totalizando 56 animais. Dois grupos de 28 animais

cada foram estabelecidos, grupo de animais adultos com 9 meses e grupo de animais velhos com 20 meses de

idade. Cada grupo foi divido em 4 subgrupos conforme o período de eutanásia ( 0, 7, 28 e 120 dias após a cirurgia).

Ao finalizar o período de experimentação, os animais adultos apresentam 13 meses e os velhos 24 meses de

idade.


3.3. Procedimentos cirúrgicos

O planejamento experimental seguiu o seguinte cronograma:

1) Inicialmente, uma primeira pesagem foi realizada para permitir a

dosagem de anestésico e a realização do primeiro exame de

densitometria óssea (D1);

2) A execução do protocolo cirúrgico;

3) Após a cirurgia, os animais receberam tetraciclina em dois

momentos para marcar as frentes de mineralização óssea e

dipirona sódica para controlar possíveis sintomas de dor.

4) Uma segunda pesagem dos animais foi realizada para permitir a

dosagem de anestésico e a realização do segundo exame de

densitometria óssea (D2);

5) No dia da eutanásia foi realizada a coleta de sangue e sedação

profunda para posicionar os animais na câmara de dióxido de

carbono.

Os animais foram anestesiados com ketamina (40mg/Kg) e xilasina

(5mg/Kg) na proporção 3:1 por injeção intraperitoneal (0,2 ml por 100g de

peso). A seguir foi realizada a tricotomia da área doadora do enxerto autógeno,

região parietal e frontal na calota craniana (figura 2), e da área receptora do

enxerto, região temporal e parotídea-massetérica na mandíbula do lado

esquerdo (figura 3).

Após a exposição da área receptora por incisão em planos e

deslocamento do retalho permitindo a visualização do ramo e chanfradura


mandibular, o enxerto autólogo foi coletado com o uso de uma broca Trefina de

3,5 mm de diâmetro. Com o auxílio de duas brocas, uma Lança de 1,2mm e a

outra Helicoidal de 1,3mm, a perfuração guia foi realizada tanto no enxerto

quanto no leito. As perfurações foram realizadas sob abundante irrigação com

solução fisiológica estéril (Cloreto de sódio 0,9%). O fragmento ósseo foi

mantido em solução salina até o momento de sua inserção na área receptora.

Antes da inserção do conjunto implante e enxerto autógeno na área

receptora foram realizadas quatro pequenas perfurações na cortical óssea para

promover melhor nutrição sanguínea ao enxerto autógeno.

Foram utilizados implantes de titânio com superfície maquinada e

dimensões 1,4 mm de diâmetro por 2,5 mm de comprimento (Sistema INP,

Brasil).

Após o posicionamento e fixação do enxerto através da inserção do

implante de titânio. Ambos foram recobertos por membrana de colágeno Bio-

gide (Geistlich, Brasil) como está exemplificado na figura 3 e 4.

Figura 3. Esquema ilustrando a inserção do parafuso de

titânio (preto), enxerto autógeno (vermelho) e

membrana de colágeno (azul). Ao redor da perfuração

central realizada para inserir o implante, verificamos

quatro perfurações adjacentes para promover irrigação

vascular ao enxerto.

Figura 2. Esquema ilustrando a perfuração de

3,5 mm na área doadora.


Figura 4. Representação esquemática do procedimento cirúrgico, mostrando o posicionamento da membrana de

colágeno (e), do enxerto ósseo (d), do implante para estabilização do enxerto e membrana (c) e a área receptora

denominada leito (a).

Posteriormente foram realizadas suturas por planos utilizando fio de

sutura reabsorvível Vicryl 5,0 e não-reabsorvível Nylon 5,0 (Ethicon, Johnson &

Johnson).

No pós-operatório os animais receberam durante três dias consecutivos,

uma gota de dipirona/150 ml de água do bebedouro (Dipirona 500mg/ml,

Medley, Brasil). A eutanásia foi realizada em câmara de dióxido de carbono nos

dias 0, 7, 28 e 120 após a cirurgia. Imediatamente após a coleta, as amostras

ósseas (mandíbula esquerda) foram fixadas em etanol a 70%.

3.4. Análise Hematológica

A análise hematológica foi realizada para caracterizar o estado de saúde

do animal e possibilitar a análise de mobilização de leucócitos. Assim, após o

estímulo local, ato cirúrgico, foi avaliado a resposta inflamatória através deste

parâmetro.

a) Leito.

b) Pequenas perfurações

c) Parafuso de fixação.

d) Enxerto ósseo.

e) Membrana de colágeno.


Amostras de sangue foram coletadas, no momento da eutanásia, por

perfusão cardíaca. As amostras foram diluídas a 1:20 (vol.: vol.) com líquido de

Turk e homogeneizadas para contagem total de leucócitos em câmara de

Neubauer. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em esfregaços de

sangue fixados e corados pancromicamente pelo corante de May-Grünwald e

Giemsa.

3.5. Avaliação ponderal

Os animais foram pesados em dois momentos: antes do procedimento

cirúrgico e antes da eutanásia, para estabelecer a dosagem de anestésico e a

para a realização dos exames de densitometria óssea inicial (D1) e final (D2).

3.6. Densitometria Óssea

O exame de densitometria óssea foi realizado para possibilitar a

caracterização dos grupos experimentais. Essa análise permite verificar a

qualidade do tecido ósseo de ambos os grupos, adultos e velhos. Assim,

verificamos que o grupo adulto, nosso controle, encontra-se no pico de massa

óssea e comparamos dois grupos de animais com massa óssea semelhantes.

Nossa pesquisa, ao contrário da maioria dos estudos não compara animais

velhos a animais que ainda estão em fase de crescimento. Portanto, no

momento do protocolo cirúrgico a massa óssea de ambos os grupos seria

semelhante.

A avaliação da densidade mineral óssea (DMO) foi realizada através de

exame de densitometria de dupla emissão de fonte de raios-X (DXA), utilizando


o densitômetro Hologic Discovery QDR series A, com software especialmente

desenvolvido para análise de dados em animais pequenos (Version 610-0691

for QDR XP).

Os valores obtidos para DMO foram expressos em grama por centímetro

quadrado (g/cm²). As áreas de interesse avaliadas foram corpo total, coluna,

fêmur e tíbia ambos do lado direito.

Os resultados da coluna foram obtidos pela média das DMOs obtidas

para L1, L2, L3 e L4. Os valores referentes ao fêmur e tíbia foram aferidos

considerando sempre a mesma área em todos os animais.

A precisão da DXA para a determinação da DMO foi avaliada através da

obtenção do coeficiente de variação (Grier et al., 1996). Assim, foi realizado em

dois animais cinco tomadas consecutivas da mesma região anatômica. O

coeficiente de variação do densitômetro foi de 0,2% para corpo total, 0,4% para

coluna, 0,8% para fêmur e 0,5% para tíbia.

A primeira análise foi antes do procedimento cirúrgico (D1) e a segunda

tomada após eutanásia do animal (D2). A Variação da DMO foi observada

através do cálculo da diferença entre D2 e D1, conforme a fórmula abaixo:

∆DMO (2-1) = D2 – D1

Os valores obtidos de densidade óssea mineral foram expressos como

variação das DMO g/cm². Adicionalmente, os dados de variação do conteúdo

mineral ósseo (ΔCMO) que expressam a variação do peso total que o animal

tem de osso (g) estão apresentados.


3.7. Microtomografia Computadorizada

A avaliação da microtomografia computadorizada (μCT) foi realizada no

laboratório de técnicas nucleares na Embrapa Instrumentação Agropecuária

em São Carlos/SP. Este exame foi realizado para quantificar o volume de osso

formado ao final dos diferentes períodos experimentais.

O volume de osso da mandíbula foi adquirido utilizando a técnica

modificada de Ikeda et.al. 2011 e baseada no protocolo de avaliação histológica

utilizado por Trisi et al. 2003. Três espécimes de cada subgrupo foram envoltos

em filme plástico para evitar o ressecamento das peças. A microtomografia

computadorizada foi realizada em um microtomógrafo de bancada, SkyScan

1172 (SkyScan, Bélgica). Todos os exames foram obtidos com uma resolução

isotrópica de 8 μm de tamanho do pixel, os níveis de energia dos raios-X foram

fixados em 100 kVp, a corrente foi de 100 μA, utilizando um filtro de alumínio

com 0,5 mm de espessura para otimizar o contraste, um tempo de integração

de 885 ms, 180° de rotação, quatro tomadas radiográficas a cada 0,4° de

rotação e a ferramenta de correções de artefatos em forma de anel (ring

artifact) foi fixada em 12 para garantir maior qualidade com o mínimo efeito de

artefatos produzidos pelo implante metálico.

As imagens de μCT 3D, para todos os espécimes, foram reconstruídas

com software especialmente desenvolvido (NRecon SkyScan, Bélgica). O

programa de análise (CTAn, SkyScan, Bélgica) foi usado para avaliar as

imagens reconstruídas. Nas imagens reconstruídas, para padronizar a

avaliação foram sempre selecionadas as 350 fatias (slices) mais centralizadas

em relação ao enxerto-implante.


Com base em comparações com as imagens originais em escala de

cinza, os valores limiares (threshold values) foram selecionados de modo a

reproduzir uma melhor representação do implante e do osso. Portanto, a

análise 3D, também seguiu um padrão nestes valores limiares quando a

imagem foi binarizada. Para todas as amostras foram utilizados os valores

limiares de 120 e 255 na gama de absorção de raios-X, para avaliar o volume

do implante na imagem original. E ainda, para avaliar o volume de osso (BV,

μm3) valores limiares de 35 e 120 foram selecionados.

O implante metálico produz na captura da imagem, artefatos em forma

de anel, assim, uma margem de segurança de 25 pixels ao redor foi excluída

da análise (Figura 5).

Após as padronizações, o percentual de BV foi determinado na região de

interesse (ROI), utilizando uma ferramenta de processamento personalizado do

programa CTAn. Os resultados foram expressos como os valores de % BV,

%BV = (BV/VT) X 100.

Figura 5. Na figura à esquerda, a imagem original e na direita, em verde temos a região ao redor do implante que

foi excluída da análise. A região adjacente (laranja) foi à região de interesse analisada (ROI). O programa CTAn

oferece ferramentas que possibilitam selecionar a região adjacente em laranja, e para tal o recurso de dilatação do

programa entende que a partir da região do implante (cinza) duas novas regiões são selecionadas em verde (região

excluída da análise) e em laranja (tecido ósseo analisado).

25 pixels

ROI

Implante


3.8. Processamento histológico

O processamento histológico foi realizado no laboratório de nefrologia da

Faculdade de Medicina da USP. O protocolo histológico empregado foi o de

secções não descalcificadas.

Após obtenção dos espécimes, estes foram fixadas em etanol a 70%,

desidratados e embebidos em resina de metilmetacrilato. Os blocos foram

cortados com um micrótomo Isomet (Buehler, EUA), na direcção do longo eixo

do implante resultando em secções espessas de aproximadamente 500 μm.

Subsequentemente, as secções foram polidas até uma espessura final em

torno de 30 μm e coladas com cianoacrilato em lâminas de acetato. As lâminas

histológicas foram coradas com azul de toluidina.

3.9. Análise Histomorfométrica

A avaliação da histomorfometria óssea foi realizada no laboratório de

matriz extracelular da Faculdade de Medicina da USP. Este exame foi realizado

para quantificar a área de osso formado e o perímetro de contato osso-implante

ao final dos diferentes períodos experimentais.

Todas as mensurações foram realizadas manualmente, por um único

observador que não tinha conhecimento de qual grupo experimental as

amostras pertenciam.

A área de osso (BA, μm2) e o contato osso-implante (BIC, μm) foram

avaliados em imagens digitalizadas através de Image-Pro ® Plus versão 6.0

para Windows (Media Cybernetics, EUA). A análise histomorfométrica foi


realizada em lâminas fotografadas ao microscópio óptico com aumento de uma

lente objetiva de 4X para BA e objetiva de 10X para BIC.

O percentual BA foi obtido medindo a área de tecido ósseo corados com

azul de toluidina, esta mensuração foi realizada dentro de uma área de análise

padronizada (AP) e expressa como % de BA, %BA = (BA/AP) X 100.

Para obtermos o percentual de BIC aferimos o perímetro das espiras do

implante em que observamos o contato entre o osso e a superfície do implante

(BIC), esta mensuração foi obtida a cerca do perímetro das três primeiras

espiras do implante (P3E) e expresso como % de BIC, %BIC = (BIC/P3E)X100.

3.10. Marcação por Tetraciclina

Os animais receberam ainda, conforme o período de eutanásia de 7, 28

e 120 dias, quatro doses de tetraciclina - solução injetável 20mg por Kg de

peso via i.p. (Terramicina, Pfizer, BR). Essa substância promove a

Figura 6. Na figura, em azul temos o tecido

ósseo corado por azul de toluidina. O circulo

em vermelho mostra o delineamento da área

de análise. Dentro desta área delineada, o

tecido ósseo foi quantificado (amarelo) tanto

na região do enxerto quanto na região de leito.

Figura 7. Em vermelho, as três primeiras espiras

que foram adotadas na análise. Assim, o

perímetro analisado foi nas três espiras do lado

direito e esquerdo, e a média destas foi

considerada.


pigmentação das frentes de mineralização óssea permitindo avaliar a

velocidade de mineralização.

Para determinar a taxa de formação óssea, tetraciclina foi injetada por

via intraperitoneal nos dias 1º, 2º, 8º e 9º dias após a cirurgia. Somente os

animais sacrificados no 28o dia foram utilizados na análise deste parâmetro,

sendo assim os demais grupos receberam as mesmas doses para

padronização.

A dupla marcação do tecido ósseo por tetraciclina foi utilizada para

análise histomorfométrica dinâmica. A mensuração da distância (perímetro)

entre duas marcações (DDM) de tetraciclina dividida pelo intervalo de tempo (7

dias) fornece a taxa de aposição mineral (MAR = DDM/7dias) que foi expressa

em μm/dia (Parfitt et al, 1987). A definição do intervalo de tempo de 7 dias se

justifica como o primeiro intervalo (1º e 2º dias) considerado como um único dia

(tempo de ação da droga) seguido de uma pausa de 5 dias e somado mais um

dia com a segunda dose (8º e 9º dias).

L1

L2

L1

L2

Figura 8. Na figura, ilustração da dupla marcação das frentes de mineralização óssea. Através do

emprego do protocolo de tetraciclina temos duas linhas amarelas tanto na região das espiras do

implante quanto na região do leito (mandíbula). A primeira marcação (L1) foi administrada no 1º e 2º

dias após a cirurgia. E a segunda marcação (L2) foi administrada no 8º e 9º dias após a cirurgia.


3.11. Análise Estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Os

dados foram analisados por teste “t” de Student ou análise de variância

(ANOVA) complementada pelo teste de comparação múltipla de Newman-

Keuls e Turkey quando de distribuição normal; dados não paramétricos foram

analisados pelo teste de Mann-Whitney. O nível de significância considerado foi

o de 0,05.

R e s u l t a d o s | 34

RESULTADOS


4. Resultados

4.1 Animais

Do número inicial de animais que foram requisitados para o estudo (70

animais), a grande maioria dos ratos do grupo velho (14 animais) morreu antes

do procedimento cirúrgico. Dos 56 animais operados, um animal adulto e três

idosos morreram no pós-operatório imediato.

4.2 Avaliação Ponderal

No início do experimento o peso dos animais do grupo adulto não diferiu

do grupo de animais velhos (602±19g e 593±22g, respectivamente, p = 0,75).

A figura 9 ilustra a variação ponderal dos animais durante o período

experimental. No pós-operatório imediato, sete dias após a cirurgia, tanto os

ratos adultos quanto os velhos perderam peso, entretanto essa perda não foi

significativa.

Nas avaliações subseqüentes (28 e 120 dias), os animais adultos

tiveram um ganho de peso enquanto os animais velhos permaneceram

perdendo peso.

Ao final do período experimental (120 dias) o grupo adulto apresentou

um ganho significativo de peso enquanto o grupo velho perdeu peso (41,13 ±

7,38 e -104,11 ± 32,75g; p= 0,001).


Figura 9. Variação ponderal (peso final - inicial), de 6-7 animais adultos com 9 a 13 meses de vida () e

de 5-7 animais velhos com 20 a 24 meses de vida (). Os animais foram pesados antes da cirurgia e no

dia da eutanásia com 7, 28 e 120 dias pós-operatório. Os resultados estão expressos como média ±

e.p.m., * p< 0,05 adulto vs. velho.

4.3 Contagem total e diferencial de leucócitos

A tabela 1 mostra os resultados da avaliação hematológica dos animais

no dia da eutanásia, ou seja, 0, 7, 28 e 120 dias após a cirurgia. No início do

período experimental, não houve diferença no número total de leucócitos

circulantes entre animais adultos e velhos (6217 ± 512 e 8471 ± 1272

células/mm3, respectivamente, p = 0,126).

No pós-operatório imediato (7 dias), a mobilização de leucócitos nos

ratos adultos foi significativamente maior (12621 ± 353 células/mm3) que a

observada nos animais velhos (9350 ± 1023 células/mm3, p = 0,006).


4.4 Avaliação da Densidade Mineral óssea

Na figura 10 estão apresentadas as variações da densidade mineral óssea

(ΔDMO) nos animais adultos e velhos. Os valores da ΔDMO inicial não

diferiram entre os animais adultos (9 meses) e velhos (20 meses), a DMO basal

foi semelhante em corpo total (0,180 ± 0,001 e 0,184 ± 0,002 g/cm2,

respectivamente, p = 0,09), coluna (0,254 ± 0,003 e 0,251 ± 0,007 g/cm2,

respectivamente, p = 0,7), fêmur (0,339 ± 0,006 e 0,345 ± 0,007 g/cm2,

respectivamente, p = 0,5) e tíbia (0,272 ± 0,004 e 0,283 ± 0,005 g/cm2,

respectivamente, p = 0,1).

Durante os 120 dias do período experimental, os animais adultos

apresentaram, de forma geral, um ganho na DMO. A exceção foi a queda, não


significativa, da ΔDMO de tíbia no período pós-cirúrgico imediato (7 dias)

(painel a) e de coluna aos 28 dias (painel b).

Contrariamente, o grupo de ratos velhos, durante todo período

experimental, exibiu uma redução na ΔDMO em todos os sítios avaliados. NO

período pós-cirúrgico de 7 dias essa redução foi significativamente diferente,

quando comparado com animais adultos, nos sítios corpo total e coluna

(painéis a e b). Aos 120 dias a diferença entre adultos e velhos se restringiu ao

fêmur (painel c) (0,024 ± 0,007 e -0,036 ± 0,01 g/cm2, respectivamente,

p=0,0001) e tíbia (painel d) (0,096± 0,014 e -0,048 ± 0,017 g/cm2,

respectivamente, p=0,004).


Figura 10. Variação da densidade mineral óssea (ΔDMO = DMO final – DMO inicial) em corpol total (a),

coluna (b), fêmur (c) e tíbia (d). A ΔDMO de adultos () e velhos () foram adquiridas nos tempos 0, 7,

28 e 120 após a cirurgia. Os resultados estão expressos como média de 5-7 animais ± e.p.m. p<0,05 por

ANOVA seguido de Newman Keuls comparando-se adultos vs. velhos.


Na Tabela 2 estão apresentados os dados de variação de densidade

mineral óssea (ΔDMO), da variação do conteúdo mineral ósseo (ΔCMO) e

variação de peso nos animais adultos e velhos durante o período experimental.

Esses dados tornam mais evidentes que a perda de peso observada no animal

adulto 7 dias após a cirurgia não ocorreu em conseqüência à perda de osso

(CMO). Entretanto no rato velho, essa perda de peso é também decorrente da

perda óssea, e foi significativa em coluna e corpo total.

Em conjunto os dados da tabela 2 mostram que, durante o período

experimental o animal adulto mantém além do peso, o conteúdo ósseo e que, o

animal velho perde peso consequente à perda de osso.


4.5 Microtomografia Computadorizada

A figura 11 mostra o percentual de volume ósseo (% BV) ao redor do

implante de titânio em ratos adultos e velhos.

Os valores do % BV no tempo 0 após o ato cirúrgico foram semelhante para

ratos adultos e velhos (32,69 ± 1,70 e 32,10 ± 0,86 %, respectivamente, p =

0,772) (figura 11c).

A análise microtomográfica realizada 7 e 28 dias após a cirurgia, mostrou

um comparável valor de % BV (figura 11c) entre os animais adultos e velhos.

No entanto, 120 dias após a cirurgia a %BV (figura 11c) foi

significativamente maior frente aos valores basais, tanto no grupo adulto (61,46

± 2,0 e 32,69 ± 1,70 %, final vs. inicial, p = 0,0001) quanto nos velhos (52,34 ±

1,98 e 32,10 ± 0,86 %, final vs inicial, p = 0,0001).

Nesse mesmo período experimental (120 dias) os resultados do %BV

(figura 11c) foram significativamente maiores no grupo adulto que no velho

(61,46 ± 2,0 e 52,34 ± 1,98 %, respectivamente, p = 0,032), evidenciando o

maior ganho ósseo do rato adulto.

Nesse sentido, vale ressaltar que verificamos também uma maior

quantidade de osso ao redor do implante no rato adulto (figura 11a). Os

animais velhos apresentaram, além de um menor volume ósseo, uma menor

área de integração do enxerto ao leito receptor, apontado pela seta na figura

11b.


Figura 11. Microtomografia computadorizada realizada na mandíbula de ratos adultos (9 a 13 meses) e

velhos (20 a 24 meses). A quantificação do volume ósseo formado foi realizada 0, 7, 28 e 120 dias após a

cirurgia. Painel a ilustra a formação óssea no animal adulto 120 dias após a cirurgia, detalhe da imagem

com e sem o implante de titânio na região do enxerto. O Painel b ilustra a formação óssea no período de

120 dias após a cirurgia em animais velhos. A seta indica incompleta interação do enxerto ao leito. O

painel c resume os dados de % de volume ósseo dos ratos adultos e velhos no períodos de 0, 7, 28 e 120

dias após a cirurgia. Os resultados estão expressos como média de 3 animais ± e.p.m. * p<0,05 entre

adultos e velhos e #p<0,05 inicial vs.final.

4.6 Histomorfometria

A Figura 12 ilustra a análise histomorfométrica do enxerto ósseo fixado por

implante de titânio na mandíbula de animais adultos (a) e velhos (b). Na figura

12c estão apresentados os dados de área óssea (%BA) e do contato osso-

implante (%BIC).

Reforçando os achados microtomográficos, os valores %BA no grupo adulto

e velho foram semelhantes no tempo 0 do estudo (31,6 ± 1,8 e 30,3 ± 1,9%,



Quando comparamos os valores obtidos no tempo 0 (valores basais) aos

obtidos 120 dias após a cirurgia, verificamos um aumento de %BA nos animais

adultos (31,6 ± 1,8 e 51,0 ± 1,4 %, respectivamente, p = 0,0001 ) e velhos (30,3

± 1,9 e 44,0 ± 1,9 %, respectivamente, p = 0,0001).

No entanto, a comparação dos resultados obtidos em animais adultos e

velhos revelaram menor ganho no % BA do velho 120 dias após a cirurgia

(51,0 ± 1,4 e 44,0 ± 1,9, respectivamente, p = 0,014).

Na figura 12b as setas brancas apontam a fusão óssea incompleta do

enxerto ao leito receptor verificada em animais velhos. Essa imagem pode ser

comparada com a formação óssea evidente nos animais adultos 120 dias após

a cirurgia (figura 12a apontada pela seta vermelha).

Os valores para quantificar a osseointegração de implantes de titânio, foram

obtidos através do percentual de contato osso-implante (%BIC). O contato

ósseo direto (tecido corado por azul de toluidina) sobre a superfície do implante

(em preto), sem qualquer interposição de outro tecido detectável em análise de

microscopia óptica com objetiva de 10X de aumento (100X de aumento).

Os valores de BIC no grupo adulto e velho foram semelhantes no tempo 0

do estudo (5,8 ± 0,8 versos 6,2 ± 0,4%, respectivamente, p = 0,664).

Tanto os animais adultos quanto os velhos apresentaram um aumento

progressivo da %BIC durante o período experimental (7, 28 e 120 dias).

Comparando-se os valores de BIC nos períodos iniciais e finais, verificou-se

um aumento significativo da %BIC em ratos adultos (5,8 ± 0,8 e 73,0 ± 1,7,

respectivamente, p = 0,0001) e velhos (6,2 ± 0,4 e 63,5 ± 3,4%,



No entanto, 120 dias após a cirurgia, os resultados do BIC nos animais

adultos são significativamente maiores do que os verificados nos velhos (73,0 ±

1,7 e 63,5 ± 3,4%, respectivamente, p = 0,028).

Figura 12. Histomorfometria do enxerto osseo (azul) em mandibula de ratos fixados com implante de

titânio (preto). O painel a ilustra o resultado obtido 120 dias após a cirurgia em ratos adultos e o b o

verificado em animais velhos. No painel b, as setas brancas indicam a menor interação do enxerto ósseo

com o leito receptor no animal velho e a vermelha o tecido ósseo neoformado no adulto. No painel c os

resultados da área óssea (%BA) e do contato de osso-implante (%BIC) 0, 7, 28 e 120 dias após a cirurgia.

Os resultados estão expressos como média ± e.p.m, *p<0,05 adultos vs. velhos. (aumento de 100X)

4.7 Taxa de Aposição Mineral

A medida da distância média entre as duas marcações por tetraciclina,

mostrou que, 28 dias após a cirurgia a taxa de aposição mineral estava

reduzida no animal velho (Tabela 3).


O animal adulto quando comparado com velho, apresentou um maior MAR

que é caracterizado por uma maior distância entre as duas marcações, tanto na

região de leito receptor (2,62 ± 0,33 e 1,23 ± 0,05 μm/dia, respectivamente, p =

0,001) quanto na região das espiras do implante (1,17 ± 0,06 e 0,16 ± 0,03

μm/dia, p = 0,001).

D i s c u s s ã o | 46

Discussão

D i s c u s s ã o | 47 ..............................................................................................................

5. Discussão

O presente estudo em ratos com envelhecimento fisiológico fornece

evidências de que o processo de envelhecimento interfere na regeneração

óssea guiada por um efeito prejudicial na formação do osso. Dois aspectos

foram fundamentais para selecionar um modelo experimental que permitisse

estudar o efeito do envelhecimento sobre os parâmetros ósseos. O primeiro, foi

utilizar animais com o eixo gonodal intacto para invalidar os possíveis efeitos

promovidos por uma abrupta privação de hormônio sexual. Animais com

depleção do estrogênio, por ovarectomia e orquiectomia, apresentam uma alta

taxa de remodelação óssea com um desequilíbrio a favor da reabsorção óssea

(Wronski et. al., 1985; Meyer et. al., 2001; Duarte et. al., 2005; Almeida et. al.,

2007; Ferreri et. al., 2011; Miyagawa et. al., 2011). O segundo, foi definir uma

correta faixa etária dos animais durante o estudo. Esse, ao nosso ver, foi um

diferencial importante do nosso protocolo. Inúmeros trabalhos compararam o

animal velho com animais de 3 meses de idade (fase de crescimento).

Entretanto ratos Wistar machos atingem o patamar de DMO entre 6 e 12

meses e somente entre 15 e 24 meses de idade, é que os animais apresentam

uma diminuição sítio dependente e progressiva na DMO (Ilda e Fukuda, 2002).

Corroborando esses achados, a análise microtomográfica de osso de hamster

com 22 meses revelou uma redução de osso trabecular na coluna menor que a

verificada no fêmur e tíbia, e que a área do osso cortical permanece inalterada

entre 3 e 24 meses enquanto a espessura do osso diminui entre 12 e 24

meses. Com relação à DMO os dados de hamster são semelhantes aos

D i s c u s s ã o | 48 ..............................................................................................................

verificados em ratos, a queda da DMO ocorre significativamente entre 18 e 24

meses (Chen et al., 2008).

Sendo assim, nossa opção foi por iniciar o estudo com animais velhos

com 20 meses que terminaram o período de avaliação aos 24 meses, e

compará-los a controles adultos com 9 a 13 meses que estavam no platô de

massa óssea. Adicionalmente, os animais dos dois grupos ingressaram no

protocolo cirúrgico com igual DMO, e ao longo do período experimental o idoso

tende a ter uma perda de massa óssea enquanto o adulto apresenta DMO

inalterada.

É importante ressaltar que, em nosso estudo, a perda de osso verificada

no animal velho representou uma perda decorrente do envelhecimento natural

e caracterizada como uma osteopenia. Nossos resultados mostram uma maior

perda do velho em osso trabecular (coluna) no período pós operatório e uma

perda significativa de osso cortical ao final do período experimental. Nossos

dados estão de acordo com a afirmação de que o envelhecimento afeta tanto

osso trabecular quanto cortical, embora o osso trabecular seja afetado mais

precocemente (Riggs et al., 2004).

Nossos resultados apontam para alterações bem precoces na reparação

óssea do idoso. Uma vez que, a mobilização leucocitária necessária para as

fases inicias de um processo de reparação tecidual (Mello et al, 2004,

Campbell et al., 2007), esta prejudicada nos animais velhos.

É importante ressaltar que o nosso protocolo experimental se inicia

com grupos de animais com igual peso corporal e DMO. Em geral os estudos

de regeneração óssea utilizam animais ovariectomizados ou ooforectomizados

que, ja apresentam no momento do protocolo cirúrgico DMOs diferentes entre

D i s c u s s ã o | 49 ..............................................................................................................

animais experimentais e controles (Wronski et. al., 1985) ou seja um severo

grau de osteopenia no grupo experimental. A capacidade regenerativa do osso

de animais jovens ovariectomizadas e velhos com 22 meses de idade é

bastante distinta, e nesse sentido o animal com ablação do eixo gonadal tem

essa função mais prejudicada . Esse resultado é evidenciado por alterações na

fosfatase alcalina observada nos animais com ablação do eixo gonadal, e que

promove uma alta remodelação óssea (Duarte et al., 2005). Adicionalmente a

regeneração do enxerto ósseo em animais adultos ovariectomizadas, é

também reduzida principalmente pelo aumento da reabsorção ossea (Luize et.

al., 2008). Entretanto, o desequilibrio na remodelação óssea do idoso parece

ser causado não por um aumento no número de osteoclastos e sim, por uma

redução na atividade osteoblástica (Qiu et al., 2002). Em protocolo de fratura,

animais velhos apresentaram uma diminuição no número de células

osteoprogenitoras, uma perturbação na taxa de diferenciação osteogênica, e

uma menor taxa de neoangiogênese, consequentemente um retardo no reparo

(Lu et al., 2005; 2008). Nossos resultados, com machos envelhecidos, indicam

para uma redução na formação óssea evidênciada pela taxa de aposição

mineral óssea claramente menor. Corroborando nossos achados animais

ovariectomizadas ou envelhecidas tambem apresentaram taxas menores de

MAR (Sampath et.al., 2008; Robert et.al.,1996). O protocolo cirúrgico

empregado, com regeneração óssea guiada utilizando o enxerto autógeno

fixado na mandíbula por implante de titânio permitiu uma dupla análise, ou seja

duas frentes de formação óssea puderam ser avaliadas: a osseointegração do

implante e o ganho de volume ósseo na região de mandíbula. Em ambas as

regiões se verificou redução na formação óssea no animal velho. É importante

D i s c u s s ã o | 50 ..............................................................................................................

ressaltar que embora descrita na literatura (Ko et al., 2010) a avaliação

mocrotomográfica da osseointegração em nosso estudo se mostrou altamente

sem resolução em função dos artefatos de imagem gerados pela presença do

implante. Sendo assim nossa avaliação de BIC ficou restrita ao estudo

histomorfométrico onde os animais velhos apresentaram uma menor

osseointegração. Entretanto, a técnica de microtomografia computadorizada

utilizada se mostrou uma importante ferramenta de análise de neoformação

óssea (Preininger et. al., 2012), além de ter se mostrado bastante comparável

à histomorfometria. Essa mesma fidelidade entre as técnicas já havia sido

descrita para animais jovens em estudo de regeneração óssea guiada com

enxerto sintético (Kochi et al., 2010). Ao final do período experimental, embora

tenha ocorrido formação de osso na região do defeito (ganho ósseo em

comparação ao grupo 0), nos animais velhos verifica-se uma incompleta união

do enxerto à região receptora. Esse achado foi semelhante tanto na análise

microtomográfica quanto histomorfométrica.

Em conjunto nossos achados em regeneração óssea guiada,

demonstram que o envelhecimento per se altera a formação de osso em

diferentes fases do processo de regeneração. Esse estudo evidencia que a

qualidade do osso do idoso necessita de especial atenção no sentido de

garantir maior previsibilidade de sucesso das técnicas regenerativas.

C o n c l u s õ e s | 51

CONCLUSÕES

C o n c l u s õ e s | 52 ..............................................................................................................

6. Conclusões

O presente estudo sugere que o animal velho apresenta alterações que

compromete as diferentes fases da formação óssea. Adicionalmente, os

resultados obtidos através de diferentes técnicas de mensuração de

regeneração óssea evidenciam que, a integração do enxerto à mandíbula de

ratos velhos e caracterizados com osteopenia, foi reduzida quando comparada

a animais jovens.

R e f e r ê n c i a s | 53

REFERÊNCIAS

R e f e r ê n c i a s | 54 ..............................................................................................................

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