A descoberta do Material genético, sua estrutura

e replicação

Material genético

Duas cepas de Streptococcus pneumoniae

Tratamento 1 - controle

Tratamento 2 - controle

Griffith e o princípio da transformação

Griffith e o princípio da transformação Tratamento 3

Tratamento 4

Avery, MacLeod e McCarty: o princípio da transformação era o DNA

Hershey e Chase: DNA vs proteína

Hershey e Chase: DNA vs proteína

Hershey e Chase: DNA vs proteína

Agitação e centrifugação

Outras evidências

Guthrie e Sinsheimer purificaram DNA de um pequeno fago e infectou bactéria

DNA em células eucariontes no núcleo, cloroplasto e mitocôndria

DNA em células eucariontes no núcleo, cloroplasto e mitocôndria

O espectro de absorção da luz UV de DNA é comparável ao espectro de ação da luz UV como agente mutagênico

Direta: tecnologia do DNA recombinante

Blocos de construção do DNA

Nucleotídeo

Tipos de base nitrogenada

Purinas

Pirimidinas

adenina guanina

timina citosina

Tipos de açúcar

desoxirribose

Nucleotídeos vs nucleosídeos

Nucleosídeos difosfato e trifosfato

DNAComo a sua estrutura foi determinada?

Estrutura do DNA

• Chargaff:

Estrutura do DNA

• Willian Astburg: periocidade de 3.4 Angstrom

• Franklin e Maurice Wilkins

Watson e Crick e a estrutura do DNA

Watson e Crick e a estrutura do DNA

DNA é uma dupla hélice voltada para direita

É formado de 2 cadeias polinucleotídica antiparalelas

As bases se distanciam em 3.4 Angstrom3.4A

Cada volta completa é de 34Angstrom

Uma volta é composta por 10 pares de bases

34A

A dupla hélice tem 20Angstrom em diâmetro

As bases são perpendiculares ao eixo fosfato-açúcar

Watson e Crick e a estrutura do DNA

Watson e Crick e a estrutura do DNA

Outras formas do DNA

B- DNA Z- DNA

Replicação do DNA

Modelo de replicação semi-conservativa

Nova Velha NovaVelha

Outros Modelos de replicação do DNA

Qual modelo entre os três propostos corresponde ao modelo atual de

replicação do DNA ?

Experimento realizado por Meselson e Stahl

Replicação do DNA em procariontes (Arthur Kornberg)

Cadeiacrescente

dNTP precursor

Ligaçãofosfodiester

Replicação do DNA e DNA polimerase I

Mutante deficiente na atividade de DNA polimerase I

Capaz de replicar DNA e deficiente no reparo

Quais seriam as conclusões retiradas dessas observações?

DNA polimerases I, II e III

Todas requerem pequeno segmento complementar a fita de DNA parental para iniciar a síntese (iniciador) e pertencem a grandes complexos

DNA polimerase I – responsável pela remoção do iniciador síntese de DNA e possui atividade exonuclease 3´ 5´ e 5´ 3´

DNA polimerase II – reparo de DNA

DNA polimerase III – síntese de DNA e atividade exonuclease3´ 5´

DNA polimerase III e suas subunidades

α polimerização de nucleotídeos

ε atividade exonuclease 3´ 5´

γ complexo carregamento da enzima no molde de DNA(5 subunidades) – carregador do grampo e une as subunidades da holoenzima e se liga aos SSBβ previne retirada da enzima do molde de DNA – grampo tem formato de anel e liga-se a subunidade α da pol III

α θ ε “core” ou núcleo da enzima

θ ainda é discutido

Pol III família C - bacteria

Direção de síntese do DNA

DNA molde

“Primer” ou iniciador RNA Novo DNA

Sumário da replicação do DNA

Síntese contínua e descontínua do DNA

Início da replicação do DNA(procariontes)

Hidrolise de ATP

Hidrolise de ATP

Helicases

Sumário da replicação do DNA

Helicase – DnaB – 5’- 3’lagging + polIII+ primase!DnaB – pode formar novosprimers na leading

Primase – DnaG –permaneceligada ao DNA através de SSB e se dissocia destedepois de ligação da polIII

Na presença de ATP o carregador do grampo se liga ao grampo e o abre

DnaA se liga ao Ori C ricoem AT – 13bp 5X

Sumário da replicação do DNA

Complexo se liga ao DNA.Hidrólise do ATP faz o carregador do grampo se soltar

Subunidade α da polIII se liga ao grampo e começa a síntese

Leading – replicação semicontínua – forquilha “salta”DNAss danificado

Lagging – replicação discontínuacomplexo dissocia ao trombarcom 5’do Okazaki

Sumário da replicação do DNA

Fragmentos de Okazaki de 1 –2 Kb

Término da replicação do DNA

Replicação do DNA bidirecional – Cairns, 1963

Após 2 meses

Replicação do DNA bidirecional

Replicação de DNA em eucariotos

Múltiplas origens de replicação

Taxa de síntese de DNA

Horn e Craig, 2002

Intermediária

Menos condensada

Mais condensada

DNA em eucariotos - Cromatina

Replicação de DNA em eucariotos

Replicação de DNA em eucariontes

Levedura- sequências de replicação autônoma (ARS) –AT

ORC – complexo de reconhecimento da origem de replicação do DNA

Polimerases αδε (replicação do DNA nuclear), βζ (reparo do DNA) e γ (síntese de DNA mitocondrial)

Polimerase α primase, elonga primer e baixa processividade, reponsável pelo primer da leading and lagging strand

Polimerases δ alta processividade e atividade exonuclease 3´ 5´ responsável pela síntese da leading strand

Replicação de DNA em eucariontes

Lagging strand é sintetizada ou por δ ou por ε polimerases

RF-C e PCNA análogos ao carregador do grampo (clamp loader) e ao grampo (clamp)

RFC e carregador do grampo

Replicação de DNA em eucariotos e ciclo celular

ORC – complexo Orc1-6

Orc 1 (AAA ATPase) + cdc 6 (AAA ATPase) – hidrolisa ATP e aumenta a especificidade de ORC-cdc6 -DNA

Cdc6 necessária para ligação de cdt1-MCM no ORC-cdc6-DNA

MCM – helicase – desenrola o DNA na direção 3’-5’, portanto MCM diferente de DnaB está na leading strand

Replicação de DNA em eucariotos e ciclo celular

Cdc6 e cdt1 se dissociam e a hidrólise de ATP completa o carregamento do MCMc

Cdc6 fosforilada em levedura é degradada e em mamíferos é exportada para fora do núcleo. Para que?

Geminin inibe cdt1. Para que?

Replicação de DNA em eucariotos e ciclo celular

DDK fosforila MCM e libera domínio A de mcm5; CDK fosforila Sld2 e Sld3

Dpb1 se liga a origem com cdc45 que se liga ao MCM e a ativa junto com as GINs. Cdc 45 tb se liga as SSB (RPA)

Replicação de DNA em eucariotos