9/18/2012

1

Os princípios e o uso de LC-MS em laboratórios de análises

orgânicas

Setembro 2012

Rosy Simas

QO427

Espectrometria de Massas

9/18/2012

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QUÍMICA ORGÂNICA

Defeito de Massa

12C 12.0000

13C 13.0034

14C 14.0032

Nenhum átomo (c/ exceção do 12C) tem massa inteira

Diferença é chamada de defeito de massa

● Nomina - Massa arredondada em 1 u:

H = 1, C = 12, Cl = 35

●Média – Massa média dos isótopos:

H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532

●Mono isotópica - Massa do isótopo mais abundante:

H = 1.0078, C = 12.000, Cl = 34.9688

Resolução Unitária x Alta Resolução

249 249.0700 249.0580 249.1479

C20H9+

C19H7N+

C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+

(a)(a) (b)(b)

m/zm/z m/zm/z

249 249.0700 249.0580 249.1479

C20H9+

C19H7N+

C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+

(a)(a) (b)(b)

m/zm/z m/zm/z

0000 249 249.0700 249.0580 249.1479

C20H9+

C19H7N+

C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+

(a)(a) (b)(b)

m/zm/z m/zm/z

249 249.0700 249.0580 249.1479

C20H9+

C19H7N+

C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+

(a)(a) (b)(b)

m/zm/z m/zm/z

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A importância da Altíssima Resolução

m/z

Medido Calculado 445.00485 445.00481

445.01297 445.01291

445.01741 445.01738

445.07954 445.07939 445.08487 445.08469

445.08764 445.08750

445.09214 445.09197

445.09580 445.09560 445.10024 445.10007

445.10472 445.10454

445.10809 445.10791

445.14587 445.14611

445.16525 445.16545

445.16979 445.16992

445.17799 445.17803

445.18258 445.18250

m/z

445.20 445.16 445.12 445.08 445.04 445.00

1

2

3

* *

4

*

5

6

7

8 9

11

*

12 13

*

14 15 16

*

1. C27H11NS3

2. C28H12S3 3. C28H13S3

4. C31H13N2S

5. C33H15S

6. C32H14NS

7. C32H15NS

8. C32H15S

9. C33H16S

10. C33H17S

11. C30H21S2 12. C33H19N5S4

13. C33H20N2

14. C33H21N2

15. C34H22N

16. C34H23N

8

Vantagens da Altíssima Resolução

N

N S

C23H47

S

459.3865

459.3899

459.2960

H12/C 93.9 mDa 5,000

SH4/C3 3.4 mDa 135,000

C2H3/13CN 17.0 mDa 27,000

O/CH4 36.4 mDa 13,000

m2- m1 C30H53NS

C33H49N

C20H41

C31H41NS

C16H33

459.3695 13CC31H46N2

13CC17H37

N

N

459.3501 C32H45NO

C13H27

N O

Sistema de Vácuo

Introdução

de amostra

Fonte de íons

Analisador

Detector Processador

de dados

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Modos de inserção de amostra

Fontes de ionização

a- EI (Electron Ionization”)

b- CI (“Chemical Ionization”)

c- APCI (“Atmospheric Pressure Chemical Ionization”)

d- APPI (“Atmospheric Pressure Photo-Ionization”)

e- ESI (“Electrospray Ionization”)

f- MALDI (“Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization”)

g- DESI (“Desorption Electrospray”)

h – DART (Direct Analysis in real Time”)

i- EASI (Easy Ambiente Sonic-Spray Ionization)

API: ESI x APCI x APPI

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Ionização à Pressão Atmosférica (API):

API

Analisadores de

Massas

MS e MS/MS

Introdução

de amostra

Vácuo

Detector

LC Interface

MS

The happy “marriage”of the bird (MS) and the fish (LC analyte)

ESI (“Electrospray Ionization”):

ESI – Electrospray Ionization

John Fenn 1989 (Nobel 2002)

Compostos Polares e Pesados

Can Elephants fly ?

■ Processo de transferência de íons em solução para a fase gasosa, introduzida

por Yamashita e Fenn em 1984.

Formação do spray em ESI positivo:

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ESI: Vantagens

•Utilizado para qualquer íon formado

em solução (±);

•Confirmação de massa molecular;

•Determinação de altas massas

moleculares;

•Compostos voláteis ou não voláteis;

•Analítos iônicos e polares ;

•Baixa temperatura/baixa

fragmentação;

•Boa sensibilidade;

•Fluxos variam de nL/min a 1 mL/min.

Desvatagens

•Melhor performance em fluxos baixo;

•Deve formar íons em solução;

•Supressão iônica em condições de

alta salinidade;

•Pode-se formar adutos iônicos;

•Usuários devem c onhecer química

de soluções (equilíbrio ácido-base,

reações redox…);

•Compostos desconhecidos devem ser

analisados nos modos positivo e

negativo.

APCI (“Atmospheric Pressure Chemical

Ionization”): T ~ 400-600 oC

Íons positivos Íons negativos

Corrente na Corona 0.5-3 µA 1-5 µA

Voltagem na Corona 1-4 kV 1-4 kV

Probe de APCI:

Probe Movement

Corona Needle

Vaporizer

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APCI:

Vantagens

• Informação de massa molecular;

• Fonte robusta;

• Ionização muito eficiente;

• Compatível com altos fluxos de LC

2.0 mL/min;

Desvantagens

• Pode ocorrer degradação térmica;

• Ruído químico em massas baixas;

• Técnica não apropriada para

compostos de massa molecular com

relação m/z maior que 2000;

APPI (“Atmospheric Pressure Photo-

Ionization”)

APPI:

Vantagens

Compostos não polares;

Mínima fragmentação;

Não apresenta sinal para o

solvente ;

Mínimo efeito de competição por

carga.

Desvantagens

Difícil otimização;

Dependente da estabilidade

dopante;

Necessário sistema de exaustão.

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Analisadores

Magnéticos-Eletrostáticos (BE)

Quadrupolos (Qq)

Íon-Traps 3D e Íon-Traps Lineares (QIT)

Tempos de Vôo (TOF)

Orbitraps

Ressonância Ciclotrônica de Íons (ICR)

Analisadores :

Quadrupolo

TOF Ion trap

A importância do modo de ionização

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Noções em

Quantificação por

LC-MS/MS

Cromatografia

em papel

TLC

HPLC

LC-MS

- Extração

- Velocidade de análise

- Limites detecção/quantificação

- Escopo de matriz

Quantificação HPLC: Realidade Atual

Preparo da Amostra

Concentração do analito de interesse e tipo de matriz:

Concentração do Analito: Porcentagem ? ppm? ppb? traços ?

Ultratraços ?...

• Matriz: Orgânica (animal ou vegetal) ?

• Matriz : Inorgânica ?

• Matriz : Mista ?

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HPLC CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Injetor

Bomba

Solvente

Coluna

Registrador

Detector

HPLC SELETIVIDADE

Capacidade de distinguir e não quantificar a substância dentro da análise.

= 16-4 = 12 = 1,5

12-4 8

= 20-4 = 16 = 2,0

12-4 8

4 12 20 16 Tempo

HPLC

EFICIÊNCIA

Baixa eficiência

Alta eficiência

Tempo tR(A) tR(B) 0

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HPLC SIMETRIA

Comportamento da população de moléculas

a b

10 %

S10 = b

a

HPLC RESOLUÇÃO

R = t = t = 2 t

< W > WA + WB WA + WB

2

tR(A)

tR(B)

t

A B

Tempo

WA WB

Pratos teóricos:

Número indicativo da

performance da coluna. É a

medida da largura do pico em

relação ao seu tempo de

retenção. É o parâmetro que

mais precisamente define a

qualidade de um sistema

cromatográfico

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HPLC EFEITO DA TEMPERATURA SOBRE A SEPARAÇÂO

40 ºC

65 ºC

0 5 10 (min)

Reservatório de fase móvel e

preparo

Filtrar

sempre

Fase móvel: solvente

• Alto grau de pureza

• Dissolver a amostra sem decompor seus

componentes;

• Ter polaridade e viscosidade adequada

• Ser compatível com o detector

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Fase móvel- água

Bombas de alta pressão Eluição

Fluxo constante = max. 400 bar ou 5800 psi

Isocrático = mesma composição de

FM

Gradiente = composição varia com

eluição;

Injetor Manual e

Automático

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Colunas Cromatográficas

• Pré- colunas - proteção

• Preparativas- > 10 mm

• Convencional – 2-5 mm

• Microbore – 1-2 mm

• Capilar – 0.075-1 mm

Condicionamento e limpeza de

coluna cromatográficas

• Coluna nova = mínimo 12 horas

• Coluna de uso ocasional = 2 horas

• Limpeza = 2 horas

Seqüência lógica de solventes

Fase estacionária

quimicamente ligada

• Fase normal (silica, amino, diol, ciano e nitro)

FEP=FMA

• Fase reversa ( Nalquil C18-C4, fenil)

FEA=FMP

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Fase Móvel: • Normal= hexano, diclorometano (isopropanol,

acetato de etila)

• Reversa= metanol,acetonitrila, THF (água e tampão)

Silanol e pH de 2 a 8

Detectores

• Absorção: UV-VIS e DAD

• Índice de refração

• Fluorescência

• Eletroquímico

• MS????

DICAS: o que não fazer em HPLC • Lavar sistema tampão com orgânico puro

• Injetar amostra que precipita na FM

• Usar ácidos inorgânicos no sistema

• Deixar a bomba trabalhar seca

• Vedar conexões com fita teflon

• Deixar o equipamento parado com

tampão

• Perder a paciência

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Full Scan ou TIC

Single ion Monitoring (SIM)

Fonte Detector

Q1

Fonte Detector

Q1

Fonte Detector

Q1

Fonte

Q1

TIC SIM

Modos de varredura – Q:

Multiple reaction monitoring

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

O que interessa neste modo de varredura

é o cromatograma.

MRM

SIM:

3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

29Jan_33 2: SIR of 8 Channels ES+ 411

5.91e4

29Jan_36 2: SIR of 8 Channels ES+ 411

5.65e4

29Jan_35 2: SIR of 8 Channels ES+ 411

1.07e5

29Jan_32 2: SIR of 8 Channels ES+ 411

8.72e4

29Jan_34 2: SIR of 8 Channels ES+ 411

3.14e4

Nicosulfuron, SIM

Tomate

Abacate

Limão

Uva passa

Farinha

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4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

29Jan_27 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182

7.95e3

29Jan_30 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182

1.05e4

29Jan_29 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182

5.27e3

29Jan_26 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182

8.36e3

29Jan_28 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182

8.64e3

MRM:

Nicosulfuron, MRM

Tomate

Abacate

Limão

Uva passa

Farinha

Comparando…

Modo de Ionização;

Coluna:

•Diâmetro e Fluxo

•Bombeamento

Fase Móvel: Pode afetar tanto a cromatografia

como o processo de ionização.

Fatores importantes

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APCI : 0.2 - 2 mL/min -

Não é necessário utilizar split.

ESI : 1 - 300 µL/min

Indicado até 1 mL/min.

Geralmente utiliza-se split para

fluxos mais elevados de tal forma

que apenas 250 L/min seja

enviado ao espectrômetro de

massas.

Fluxo de LC para MS

O diâmetro interno da coluna analítica depende do

fluxo de LC

Fluxo Coluna I.D.

0.5 - 2 mL/min 3.9 - 4.6 mm I.D.

0.1 - 0.3 mL/min 2 - 2.1 mm I.D.

40 - 50 µL/min 1 mm I.D.

< 10 µL/min Colunas capilares

Fluxo em LC:

Solventes e aditivos :

Solventes

Água

Acetonitrila

Metanol

Isopropanol

Aditivos

Ácido Acético

Ácido Fórmico

Hidróxido de Amônia

Acetato de Amônia*

Formato de amônia*

(* = Podem ser utilizados como tampão. As

concentrações não devem exceder

10 mM.)

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n-Hexano

n-Heptano

Éter etílico

Clorofórmio

Cloreto de metileno

Tetrahidrofurano

Diclorometano

Dioxano

Acetato de etila

Acetonitrila

n-Propanol

Etanol

Metanol

Adsorção Ordem crescente

de força de eluição

Solventes:

•Substâncias agregadas à fase móvel, em pequena quantidade, para

desativação dos sítios de alta reatividade da sílica;

•Tempos de retenção mais estáveis, melhor capacidade de carga na

coluna, maior eficiência e menos cauda;

•A adição de Trietilamina (ou aminas de uma forma geral) na fase

móvel, diminui o encaudamento de analitos básicos, da mesma forma, a

adição de ácido acético (ou ácidos orgânicos de uma forma geral)

beneficia a análise de substâncias ácidas.

Modificadores:

6.00 7.00 8.00 9.00Time0

100

%

Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3) F1365

2.30e6

7.56

6.00 7.00 8.00 9.00Time6

100

%

Raylo_1_007 Sm (Mn, 2x3) F1365

2.19e67.52

Efeito do ácido fórmico :

Sem aditivos

Somente água

e acetonitrila

0.03%

Ácido

fórmico

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•Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)

•Detergentes (supressão iônica)

•Ácidos inorgânicos (Sulfúrico, fosfórico, etc.)

Solventes e tampões não utilizados

Fragmentação na fonte

+ + + +

Voltagem do cone elevada

Íons produzidos por ESI ou APcI

Fragmentos

gerados por colisão

e íons não

fragmentados

N2

N2 N2

Íons que são acelerados pela voltagem do cone colidem com moléculas de nitrogênio

+ +

+

+

Fragmentação induzida pela voltagem do cone

Etalon 550 pg/ul, ES , FS positif , CV variables

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

Etalon 10 220 (12.126) 3: Scan ES+ 2.81e4214.36

96.03

89.34

174.16103.44 131.73

110.23125.55

145.55 163.16205.39

196.16186.21

241.40

279.43263.34 304.36 327.08 337.74 348.20

Etalon 10 221 (12.162) 2: Scan ES+ 4.19e4241.39

214.33

205.30155.4798.15 138.52113.54 174.02 196.20 223.16 282.41264.53249.44 291.95 303.39 330.71312.82 343.97

Etalon 10 221 (12.144) 1: Scan ES+ 3.82e4241.39

130.8197.28 108.28 151.06 223.14171.00 195.59183.04 205.32 234.36 282.41264.47253.29 292.58 310.62 325.69 345.85

Efeito da voltagem no espectro de MS:

20 V

40 V

60 V

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Experimentos de infusão para definir o método de ionização e otimizar

as condições de MS para a sensibilidade e seletividade necessária;

Otimização de valores da energia do cone para cada íon precursor;

Experimentos de MS/MS para determinação dos fragmentos a serem

monitorados em MRM e otimização da energia de colisão para cada transição;

Desenvolvimento do método de LC;

Otimização das etapas de extração e preparação da amostra. Estudos

de recuperação e efeito de matriz;

Criação do método para processamento de dados e quantificação.

Etapas do desenvolvimento:

partículas de 1.7µm

Separações mais rápidas

2-5x

Maior resolução

Separação de metabólitos

Redução nos efeitos de matriz

Maior sensibilidade

LOQ 3x mais baixo

UPLC versus HPLC MS

Validação de métodos analíticos

9/18/2012

22

Validação: A Resolução para...

Complexidade da Amostra

Teor do Analito

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23

BROMATOLOGIA (VIA ÚMIDA: TITULAÇÃO, GRAVIMETRIA, KJELDHAL)

KARL FISCHER, ANCON, PHMETRO, POLARIMETRO

ESPECTRO UV/VIS, LECO, NIR

AAS,

ICP-OES, HPLC, GC, HGAAS, GFAAS

ICP-MS,RMN, MS

ppmporcentagem (%) ppb/ppt nano (ng) / pico(pg) / fento(fg)

ANÁLISE INSTRUMENTAL

Tipo de Análise

Lógica em validação

Equipamentos e materiais: calibrados

Analistas: qualificados e treinados Utilizar substâncias químicas de referência oficiais espécie com estabilidade e

natureza confiáveis, para análises

quantitativas e qualitativas, permite comparação entre as espécies analisadas,

além de ser parâmetro de exatidão;

Antes de Validar...

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24

• Aplicabilidade

• Faixa de trabalho

• Linearidade

• Faixa linear de trabalho

• Sensibilidade

• Limite de detecção

• Limite de determinação/quantificação

• Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade)

• Exatidão/Taxa de recuperação

• Seletividade

• Robustez

FIGURAS DE MÉRITO

Frases de Albert Einstein

1879-1955 - Cientista

rsimas@iqm.unicamp.br

Obrigada a todos !!!!!