ensayo de crecimiento bacteriano en un efluente industrial
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Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
1
ENSAYO DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN UN EFLUENTE
INDUSTRIAL RECALCITRANTE
Fariacuteas Alejandro R1 Utgeacutes Enrique E1 Tenev Mariacutea D1 Hervot Elsa I1 Utgeacutes
Enid M1 Baccaro Juliaacuten1 Mlot Zaira2
1 Grupo de Investigacioacuten Sobre Temas Ambientales y Quiacutemicos
Universidad Tecnoloacutegica Nacional
Facultad Regional Resistencia
French 414 Resistencia Chaco CP 3500
e-mail gistaqgmailcom
2 Indunor Sociedad Anoacutenima
La EscondidaChaco CP 3514
e-mail zmlotindunorcom
Resumen La fabricacioacuten de furfural a partir del procesamiento de aserriacuten de quebracho
colorado luego de extraerle el tanino genera en la primera etapa de destilacioacuten un efluente
liacutequido denominado aguas madres con bajos valores de pH que contiene principalmente
aacutecido aceacutetico y algo de furfural Actualmente dicho efluente es tratado mediante un sistema
de pantanos secos que utiliza plantas del lugar para la biorremocioacuten El objetivo de este
trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano en medios de cultivo soacutelidos preparados con
distintas concentraciones del efluente industrial para determinar la maacutes adecuada En ellos
se inocularon bacterias autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de
tratamiento (caacutemara de mezcla lodos de las piletas de sedimentacioacuten y raiacuteces del sistema de
pantanos secos) En estos medios preparados en placas de Petri y enriquecidos con fuentes
de foacutesforo y nitroacutegeno como nutrientes se sembraron bacterias por el meacutetodo de estriacuteas Se
incubaron por duplicado en estufa durante 14 diacuteas a 30ordmC y la confirmacioacuten de crecimiento
se realizoacute a traveacutes de la observacioacuten El grupo de bacterias aisladas seraacute utilizado para una
segunda etapa de adaptacioacuten y ensayos de tratamiento del efluente en un reactor de lecho
fluidizado
Palabras claveAguas madres Furfural Efluente recalcitrante Bacterias Crecimiento
1 INTRODUCCIOacuteN
Uno de los problemas ambientales maacutes complejos que se presenta en la actualidad tanto a
nivel local como nacional e internacional es la cantidad de desechos industriales que sin un
adecuado tratamiento se vierten al ambiente como en el caso del vuelco de efluentes liacutequidos
a cursos naturales de agua
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
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En el interior de la provincia del Chaco en la localidad de La Escondida estaacute instalada una
planta fabril taninera de la firma Indunor S A que produce furfural a partir de aserriacuten de
quebracho colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino (aserriacuten detanizado)El GISTAQ
(Grupo de Investigacioacuten Sobre Temas Ambientales y Quiacutemicos) firmoacute un convenio
especiacutefico dentro del convenio marco preexistente para estudiar el proceso de tratamiento de
efluentes y proponer alternativas
El furfural es un aldehiacutedo heterociacuteclico derivado del furano que estaacute en la lista de sustancias
peligrosas reglamentada por la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) En
algunas fichas de seguridad de este compuesto se mencionan las DL50 (dosis letales) para dos
especies de peces (Pimephales promelas y Poecilia reticulata) y una de crustaacuteceo (Daphnia
magna) todos de agua dulce aunque en ellas se aclara que no se espera una bioconcentracioacuten
en organismos acuaacuteticos El efecto toacutexico ocasionado por el furfural parece deberse a que
pueden formar compuestos con determinadas moleacuteculas bioloacutegicas como liacutepidos proteiacutenas y
aacutecidos nucleicos (Singh y Khan 1995) o bien producir dantildeos sobre la membrana plasmaacutetica
(Zaldivar y col 1999) Ademaacutes el furfural produce la inhibicioacuten de enzimas glicoliacuteticas y
fermentativos Estudios efectuados por varios autores demuestran que para concentraciones
diferentes de furfural pero inferiores a 25-30mM no se observa inhibicioacuten en el crecimiento
de distintos microorganismos [1] [2] [3] [4]
Como cualquier efluente industrial previo a su vuelco a un cuerpo receptor deberaacute ser
sometido a tratamiento Para constatar que los paraacutemetros cumplen con los valores de vuelco
que establece la Ley Ndeg3230 ldquoCoacutedigo de Aguas de la Provincia del Chacordquo se deberaacuten
realizar distintos anaacutelisis al mismo para efectuar su descarga
2 MARCO CONCEPTUAL
La extraccioacuten de furfural del aserriacuten de quebracho colorado se realiza previo agregado de un
catalizador con vapor a presioacuten y temperatura El vapor de agua que lo contiene junto con
otras sustancias se condensa y posteriormente se destila Este efluente egresa a temperatura
cercana a 100ordmC tiene un pH muy bajo (entre 26 y 3) e inicialmente carece de
microorganismos Contiene altos niveles de materia orgaacutenica aportada por algunos aacutecidos
carboxiacutelicos de los cuales el aacutecido aceacutetico es el constituyente principal (con una proporcioacuten
entre el 1 y el 5 pv) y tambieacuten contiene furfural en concentraciones de hasta 600 ppm
Estos porcentajes dependen del buen funcionamiento de la primera columna de destilacioacuten
En las columnas de buena calidad el furfural residual tiene concentraciones menores de 50
ppm [5]En la planta hay otras dos columnas la segunda que separa metanol y la tercera que
deshidrata el furfural La cantidad de aacutecido aceacutetico generado es demasiado baja como para
justificar una planta de recuperacioacuten por lo que debe tratarse adecuadamente el efluente
El proceso de remocioacuten de contaminantes en el efluente es complejo debido a la caracteriacutestica
recalcitrante de algunos de ellos La presencia de furfural complica la remocioacuten bioloacutegica ya
que dicho compuesto ataca las membranas celulares e interfiere con el metabolismo
intracelular [6] Por otra parte el efecto toacutexico que ocasionan los derivados furaacutenicos parece
deberse a que por ser quiacutemicamente reactivos pueden formar compuestos con moleacuteculas
bioloacutegicas como liacutepidos proteiacutenas y aacutecidos nucleicos [7]Soacutelo se conocen unos pocos caminos
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metaboacutelicos microbianos del furfural Saccharomyces spp reduce el furfural a alcohol
furfuriacutelico Aunque ha sido maacutes estudiada la degradacioacuten en condiciones anaeroacutebicas [1]
existen bacterias aerobias como las Pseudomonas [8]que pueden transformar y degradar el
furfural
El volumen de aguas madres generado es de aproximadamente 360 m3diacutea Dicho efluente es
neutralizado con cenizas de la caldera y parcialmente diluido con agua antes de su ingreso a
la planta de tratamiento Durante muchos antildeos la disposicioacuten consistioacute en una serie de
grandes lagunas llamadas ldquoevaporativasrdquo que se fueron colmatando con el tiempo alcanzando
el liacutemite de su capacidad de depuracioacuten En el antildeo 2011 se construyoacute una nueva planta de
tratamiento que se utiliza desde 2012 denominada ldquoTratamiento por Pantanos Secos
Artificialesrdquo tecnologiacutea patentada [9] que inicialmente operaba con gramiacuteneas de origen
canadiense que fueron desplazadas posteriormente por las totoras autoacutectonas
Se trata de un meacutetodo natural que utiliza la capacidad depuradora de las plantas citadas para
tratar el efluente generado El mismo se acumula en dos grandes piletas sedimentadoras con
fondo de suelo arcilloso Alliacute sedimentan los soacutelidos y el liacutequido se enriquece adicionaacutendole
desechos cloacales de la faacutebrica y del pueblo aledantildeo Esta mezcla constituye el efluente
crudo Desde los sedimentadores eacuteste ingresa por gravedad a un sistema de pantanos secos
conformado por dos grandes excavaciones en terreno arcilloso la primera a mayor nivel que
la segunda El recinto maacutes alto constituye el ldquolecho de lijadordquo y el segundo al que el efluente
accede por gravedad es el ldquolecho de pulidordquo ambos operan en serie Debido al gran caudal de
liacutequido a tratar se instalaron cuatro lechos de lijado y cuatro de pulido que trabajan
simultaacuteneamente Cada lecho contiene un entramado de cantildeos de PVC con perforaciones
colocados en el piso y cubiertos primero con ripio y luego con arena hasta una altura
aproximada de 1m sobre ella se instaloacute otra red de cantildeos perforados que se tapoacute con maacutes
arena y en eacutesta se plantaron las especies vegetales luego reemplazadas de manera natural por
totoras (figura Ndeg1)El efluente crudo ingresa por la red superior de cantildeos de los ldquolechos de
lijadordquo atraviesa la capa de arena y es colectado por la red inferior pasando a una caacutemara de
registro que permite fijar el nivel de inundacioacuten del lecho de pulido de forma que la capa
superior de arena se mantenga seca Por ello el nombre de pantanos secos Las totoras cuyas
raiacuteces son irrigadas por el efluente van absorbiendo los contaminantes y produciendo su
fitoextraccioacuten El liacutequido egresa de los lechos de pulido como efluente depurado y se bombea
a una pileta como depoacutesito final (figuras Ndeg2 y 3)
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Figura Nordm1 Totoras invadiendo gramiacuteneas canadienses
Figura Ndeg2 Esquema de Tratamiento por Pantanos Secos Artificiales
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Primer
Sedimentador
Segundo
Sedimentador
Pileta de Pulido
1
Pileta de Lijado
1
Pileta de Lijado
2
Pileta de Pulido
2
Pileta de Lijado
3
Pileta de Pulido
3
Pileta de Lijado
4
Pileta de Pulido
4
Agua Madre
C I C I C M
Pileta de Peces
Cloacales Cloacales
C I = Caacutemara de Inspeccioacuten
C M = Caacutemara de Mezcla
Figura Nordm3 Plano de la instalacioacuten de Pantanos Secos
El sistema descripto presenta dos inconvenientes importantes el primero es que el efluente
antes de ingresar debe carecer de soacutelidos para evitar que se tapen las perforaciones y el
segundo tener un pH que oscile en el rango de 5 a 8 a fin de no alterar la biota microbioloacutegica
que realiza la remocioacuten
El primer inconveniente se subsana depositaacutendolas aguas madres en las piletas de
decantacioacuten como se explica en un paacuterrafo precedente En cuanto al segundo se encontroacute que
el pH de las aguas madres se podiacutea elevar adicionando cenizas fuertemente alcalinas
producidas en la caldera de la planta industrial al quemar los restos del aserriacuten de quebracho
colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino y furfural (aserriacuten desfurfuralizado) Las cenizas
no eran totalmente solubles y generaban sedimentos Como alternativa se trabajoacute en el
laboratorio para alcanzar el valor de pH apropiado adicionando carbonato de sodio y
verificaacutendolo con un peachiacutemetro
Desde el GISTAQ se propuso a la empresa poner en marcha un sistema de lechos fluidizados
anaerobio y aerobio que trabajariacutea con el efluente industrial previamente neutralizado y en
los cuales la remocioacuten la realizariacutean las bacterias autoacutectonas provenientes de tres sectores de
la planta de tratamiento caacutemara de mezcla lodos de sedimentadores y raiacuteces de totoras
Los reactores de lecho fluidizado (RLF) constituyen un sistema para el tratamiento de
efluentes ricos en materia orgaacutenica que podriacutea aplicarse al tratamiento del efluente producido
durante la obtencioacuten de furfural En eacutestos se busca lograr el mejor contacto entre el soporte
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inerte (arena carboacuten activado alginato) que inmoviliza la peliacutecula bioloacutegica constituida por
bacterias y el efluente conteniendo el contaminante a eliminar para garantizar la mayor
remocioacuten En experiencias previas se establecioacute que el soporte deberaacute tener el menor tamantildeo
de partiacutecula y la mayor superficie de contacto posible [10]
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano inoculando bacterias
autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de tratamiento actual en medios de
cultivo (liacutequido y soacutelido) preparados con el efluente industrial (aguas madres) distintas
concentraciones para determinar la maacutes adecuada Esto se realizoacute en varias etapas
Caracterizacioacuten de las aguas madres
Preparacioacuten de los medios de cultivo
Preparacioacuten de los inoacuteculos y sus correspondientes recuentos bacterianos
Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente (erlenmeyers y placas de
Petri)
31 Caracterizacioacuten de las aguas madres
El valor del pH del agua madre obtenido in situ por esta faacutebrica es variable pero del orden de
25 El anaacutelisis por yodometriacutea del contenido de furfural y aacutecido aceacutetico realizado tambieacuten por
la empresa arrojoacute los siguientes valores 400 mgL de furfural y 189 equivalentes de aacutecido
aceacutetico por litro Sin embargo estas concentraciones tambieacuten sufren variaciones llegando a
detectarse concentraciones de hasta 790 mgL
Se tomoacute una muestra de 20 litros de aguas madres proveniente de la primera columna de
destilacioacuten utilizando un bidoacuten de 24 litros La misma fue remitida inmediatamente al
laboratorio de investigacioacuten del GISTAQ y conservada adecuadamente seguacuten los protocolos
de anaacutelisis correspondientes hasta el momento de efectuar los mismos Se realizaron anaacutelisis
de la misma a fin de realizar su caracterizacioacuten (tabla Nordm4) Los restantes ensayos se
efectuaron seguacuten meacutetodos normalizados (Standard Methods 21 Edition 2005) o adaptacioacuten de
los mismos
32 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Para la preparacioacuten de los medios de cultivo se utilizoacute agua madre neutralizada agua de
peptona nutrientes y agar-agar
Las aguas madres se neutralizaron previamente con carbonato de sodio soacutelido hasta alcanzar
un pH 6 utilizando un peachiacutemetro Hanna Para 500 ml de agua madre se agregaron
aproximadamente 95g del mismo
Como nutrientes se utilizaron soluciones de cloruro de amonio 127 pv (marca JT Baker
Inc al 997 de pureza) y de fosfato diaacutecido de sodio 328 pv (marca Mallinckrodt
Chemical Works al 99 de pureza) Se agregaron las cantidades necesarias para que cada
medio tenga una concentracioacuten final de 033 gL de N y 0066gL de P Este valor surge de la
relacioacuten 51 que debe existir entre N y P respectivamente [11]
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Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
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Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
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342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
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Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
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Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
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Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
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por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
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[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
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[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
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[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
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Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
2
En el interior de la provincia del Chaco en la localidad de La Escondida estaacute instalada una
planta fabril taninera de la firma Indunor S A que produce furfural a partir de aserriacuten de
quebracho colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino (aserriacuten detanizado)El GISTAQ
(Grupo de Investigacioacuten Sobre Temas Ambientales y Quiacutemicos) firmoacute un convenio
especiacutefico dentro del convenio marco preexistente para estudiar el proceso de tratamiento de
efluentes y proponer alternativas
El furfural es un aldehiacutedo heterociacuteclico derivado del furano que estaacute en la lista de sustancias
peligrosas reglamentada por la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) En
algunas fichas de seguridad de este compuesto se mencionan las DL50 (dosis letales) para dos
especies de peces (Pimephales promelas y Poecilia reticulata) y una de crustaacuteceo (Daphnia
magna) todos de agua dulce aunque en ellas se aclara que no se espera una bioconcentracioacuten
en organismos acuaacuteticos El efecto toacutexico ocasionado por el furfural parece deberse a que
pueden formar compuestos con determinadas moleacuteculas bioloacutegicas como liacutepidos proteiacutenas y
aacutecidos nucleicos (Singh y Khan 1995) o bien producir dantildeos sobre la membrana plasmaacutetica
(Zaldivar y col 1999) Ademaacutes el furfural produce la inhibicioacuten de enzimas glicoliacuteticas y
fermentativos Estudios efectuados por varios autores demuestran que para concentraciones
diferentes de furfural pero inferiores a 25-30mM no se observa inhibicioacuten en el crecimiento
de distintos microorganismos [1] [2] [3] [4]
Como cualquier efluente industrial previo a su vuelco a un cuerpo receptor deberaacute ser
sometido a tratamiento Para constatar que los paraacutemetros cumplen con los valores de vuelco
que establece la Ley Ndeg3230 ldquoCoacutedigo de Aguas de la Provincia del Chacordquo se deberaacuten
realizar distintos anaacutelisis al mismo para efectuar su descarga
2 MARCO CONCEPTUAL
La extraccioacuten de furfural del aserriacuten de quebracho colorado se realiza previo agregado de un
catalizador con vapor a presioacuten y temperatura El vapor de agua que lo contiene junto con
otras sustancias se condensa y posteriormente se destila Este efluente egresa a temperatura
cercana a 100ordmC tiene un pH muy bajo (entre 26 y 3) e inicialmente carece de
microorganismos Contiene altos niveles de materia orgaacutenica aportada por algunos aacutecidos
carboxiacutelicos de los cuales el aacutecido aceacutetico es el constituyente principal (con una proporcioacuten
entre el 1 y el 5 pv) y tambieacuten contiene furfural en concentraciones de hasta 600 ppm
Estos porcentajes dependen del buen funcionamiento de la primera columna de destilacioacuten
En las columnas de buena calidad el furfural residual tiene concentraciones menores de 50
ppm [5]En la planta hay otras dos columnas la segunda que separa metanol y la tercera que
deshidrata el furfural La cantidad de aacutecido aceacutetico generado es demasiado baja como para
justificar una planta de recuperacioacuten por lo que debe tratarse adecuadamente el efluente
El proceso de remocioacuten de contaminantes en el efluente es complejo debido a la caracteriacutestica
recalcitrante de algunos de ellos La presencia de furfural complica la remocioacuten bioloacutegica ya
que dicho compuesto ataca las membranas celulares e interfiere con el metabolismo
intracelular [6] Por otra parte el efecto toacutexico que ocasionan los derivados furaacutenicos parece
deberse a que por ser quiacutemicamente reactivos pueden formar compuestos con moleacuteculas
bioloacutegicas como liacutepidos proteiacutenas y aacutecidos nucleicos [7]Soacutelo se conocen unos pocos caminos
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
3
metaboacutelicos microbianos del furfural Saccharomyces spp reduce el furfural a alcohol
furfuriacutelico Aunque ha sido maacutes estudiada la degradacioacuten en condiciones anaeroacutebicas [1]
existen bacterias aerobias como las Pseudomonas [8]que pueden transformar y degradar el
furfural
El volumen de aguas madres generado es de aproximadamente 360 m3diacutea Dicho efluente es
neutralizado con cenizas de la caldera y parcialmente diluido con agua antes de su ingreso a
la planta de tratamiento Durante muchos antildeos la disposicioacuten consistioacute en una serie de
grandes lagunas llamadas ldquoevaporativasrdquo que se fueron colmatando con el tiempo alcanzando
el liacutemite de su capacidad de depuracioacuten En el antildeo 2011 se construyoacute una nueva planta de
tratamiento que se utiliza desde 2012 denominada ldquoTratamiento por Pantanos Secos
Artificialesrdquo tecnologiacutea patentada [9] que inicialmente operaba con gramiacuteneas de origen
canadiense que fueron desplazadas posteriormente por las totoras autoacutectonas
Se trata de un meacutetodo natural que utiliza la capacidad depuradora de las plantas citadas para
tratar el efluente generado El mismo se acumula en dos grandes piletas sedimentadoras con
fondo de suelo arcilloso Alliacute sedimentan los soacutelidos y el liacutequido se enriquece adicionaacutendole
desechos cloacales de la faacutebrica y del pueblo aledantildeo Esta mezcla constituye el efluente
crudo Desde los sedimentadores eacuteste ingresa por gravedad a un sistema de pantanos secos
conformado por dos grandes excavaciones en terreno arcilloso la primera a mayor nivel que
la segunda El recinto maacutes alto constituye el ldquolecho de lijadordquo y el segundo al que el efluente
accede por gravedad es el ldquolecho de pulidordquo ambos operan en serie Debido al gran caudal de
liacutequido a tratar se instalaron cuatro lechos de lijado y cuatro de pulido que trabajan
simultaacuteneamente Cada lecho contiene un entramado de cantildeos de PVC con perforaciones
colocados en el piso y cubiertos primero con ripio y luego con arena hasta una altura
aproximada de 1m sobre ella se instaloacute otra red de cantildeos perforados que se tapoacute con maacutes
arena y en eacutesta se plantaron las especies vegetales luego reemplazadas de manera natural por
totoras (figura Ndeg1)El efluente crudo ingresa por la red superior de cantildeos de los ldquolechos de
lijadordquo atraviesa la capa de arena y es colectado por la red inferior pasando a una caacutemara de
registro que permite fijar el nivel de inundacioacuten del lecho de pulido de forma que la capa
superior de arena se mantenga seca Por ello el nombre de pantanos secos Las totoras cuyas
raiacuteces son irrigadas por el efluente van absorbiendo los contaminantes y produciendo su
fitoextraccioacuten El liacutequido egresa de los lechos de pulido como efluente depurado y se bombea
a una pileta como depoacutesito final (figuras Ndeg2 y 3)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
4
Figura Nordm1 Totoras invadiendo gramiacuteneas canadienses
Figura Ndeg2 Esquema de Tratamiento por Pantanos Secos Artificiales
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
5
Primer
Sedimentador
Segundo
Sedimentador
Pileta de Pulido
1
Pileta de Lijado
1
Pileta de Lijado
2
Pileta de Pulido
2
Pileta de Lijado
3
Pileta de Pulido
3
Pileta de Lijado
4
Pileta de Pulido
4
Agua Madre
C I C I C M
Pileta de Peces
Cloacales Cloacales
C I = Caacutemara de Inspeccioacuten
C M = Caacutemara de Mezcla
Figura Nordm3 Plano de la instalacioacuten de Pantanos Secos
El sistema descripto presenta dos inconvenientes importantes el primero es que el efluente
antes de ingresar debe carecer de soacutelidos para evitar que se tapen las perforaciones y el
segundo tener un pH que oscile en el rango de 5 a 8 a fin de no alterar la biota microbioloacutegica
que realiza la remocioacuten
El primer inconveniente se subsana depositaacutendolas aguas madres en las piletas de
decantacioacuten como se explica en un paacuterrafo precedente En cuanto al segundo se encontroacute que
el pH de las aguas madres se podiacutea elevar adicionando cenizas fuertemente alcalinas
producidas en la caldera de la planta industrial al quemar los restos del aserriacuten de quebracho
colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino y furfural (aserriacuten desfurfuralizado) Las cenizas
no eran totalmente solubles y generaban sedimentos Como alternativa se trabajoacute en el
laboratorio para alcanzar el valor de pH apropiado adicionando carbonato de sodio y
verificaacutendolo con un peachiacutemetro
Desde el GISTAQ se propuso a la empresa poner en marcha un sistema de lechos fluidizados
anaerobio y aerobio que trabajariacutea con el efluente industrial previamente neutralizado y en
los cuales la remocioacuten la realizariacutean las bacterias autoacutectonas provenientes de tres sectores de
la planta de tratamiento caacutemara de mezcla lodos de sedimentadores y raiacuteces de totoras
Los reactores de lecho fluidizado (RLF) constituyen un sistema para el tratamiento de
efluentes ricos en materia orgaacutenica que podriacutea aplicarse al tratamiento del efluente producido
durante la obtencioacuten de furfural En eacutestos se busca lograr el mejor contacto entre el soporte
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
6
inerte (arena carboacuten activado alginato) que inmoviliza la peliacutecula bioloacutegica constituida por
bacterias y el efluente conteniendo el contaminante a eliminar para garantizar la mayor
remocioacuten En experiencias previas se establecioacute que el soporte deberaacute tener el menor tamantildeo
de partiacutecula y la mayor superficie de contacto posible [10]
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano inoculando bacterias
autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de tratamiento actual en medios de
cultivo (liacutequido y soacutelido) preparados con el efluente industrial (aguas madres) distintas
concentraciones para determinar la maacutes adecuada Esto se realizoacute en varias etapas
Caracterizacioacuten de las aguas madres
Preparacioacuten de los medios de cultivo
Preparacioacuten de los inoacuteculos y sus correspondientes recuentos bacterianos
Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente (erlenmeyers y placas de
Petri)
31 Caracterizacioacuten de las aguas madres
El valor del pH del agua madre obtenido in situ por esta faacutebrica es variable pero del orden de
25 El anaacutelisis por yodometriacutea del contenido de furfural y aacutecido aceacutetico realizado tambieacuten por
la empresa arrojoacute los siguientes valores 400 mgL de furfural y 189 equivalentes de aacutecido
aceacutetico por litro Sin embargo estas concentraciones tambieacuten sufren variaciones llegando a
detectarse concentraciones de hasta 790 mgL
Se tomoacute una muestra de 20 litros de aguas madres proveniente de la primera columna de
destilacioacuten utilizando un bidoacuten de 24 litros La misma fue remitida inmediatamente al
laboratorio de investigacioacuten del GISTAQ y conservada adecuadamente seguacuten los protocolos
de anaacutelisis correspondientes hasta el momento de efectuar los mismos Se realizaron anaacutelisis
de la misma a fin de realizar su caracterizacioacuten (tabla Nordm4) Los restantes ensayos se
efectuaron seguacuten meacutetodos normalizados (Standard Methods 21 Edition 2005) o adaptacioacuten de
los mismos
32 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Para la preparacioacuten de los medios de cultivo se utilizoacute agua madre neutralizada agua de
peptona nutrientes y agar-agar
Las aguas madres se neutralizaron previamente con carbonato de sodio soacutelido hasta alcanzar
un pH 6 utilizando un peachiacutemetro Hanna Para 500 ml de agua madre se agregaron
aproximadamente 95g del mismo
Como nutrientes se utilizaron soluciones de cloruro de amonio 127 pv (marca JT Baker
Inc al 997 de pureza) y de fosfato diaacutecido de sodio 328 pv (marca Mallinckrodt
Chemical Works al 99 de pureza) Se agregaron las cantidades necesarias para que cada
medio tenga una concentracioacuten final de 033 gL de N y 0066gL de P Este valor surge de la
relacioacuten 51 que debe existir entre N y P respectivamente [11]
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
7
Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
9
342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
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actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
3
metaboacutelicos microbianos del furfural Saccharomyces spp reduce el furfural a alcohol
furfuriacutelico Aunque ha sido maacutes estudiada la degradacioacuten en condiciones anaeroacutebicas [1]
existen bacterias aerobias como las Pseudomonas [8]que pueden transformar y degradar el
furfural
El volumen de aguas madres generado es de aproximadamente 360 m3diacutea Dicho efluente es
neutralizado con cenizas de la caldera y parcialmente diluido con agua antes de su ingreso a
la planta de tratamiento Durante muchos antildeos la disposicioacuten consistioacute en una serie de
grandes lagunas llamadas ldquoevaporativasrdquo que se fueron colmatando con el tiempo alcanzando
el liacutemite de su capacidad de depuracioacuten En el antildeo 2011 se construyoacute una nueva planta de
tratamiento que se utiliza desde 2012 denominada ldquoTratamiento por Pantanos Secos
Artificialesrdquo tecnologiacutea patentada [9] que inicialmente operaba con gramiacuteneas de origen
canadiense que fueron desplazadas posteriormente por las totoras autoacutectonas
Se trata de un meacutetodo natural que utiliza la capacidad depuradora de las plantas citadas para
tratar el efluente generado El mismo se acumula en dos grandes piletas sedimentadoras con
fondo de suelo arcilloso Alliacute sedimentan los soacutelidos y el liacutequido se enriquece adicionaacutendole
desechos cloacales de la faacutebrica y del pueblo aledantildeo Esta mezcla constituye el efluente
crudo Desde los sedimentadores eacuteste ingresa por gravedad a un sistema de pantanos secos
conformado por dos grandes excavaciones en terreno arcilloso la primera a mayor nivel que
la segunda El recinto maacutes alto constituye el ldquolecho de lijadordquo y el segundo al que el efluente
accede por gravedad es el ldquolecho de pulidordquo ambos operan en serie Debido al gran caudal de
liacutequido a tratar se instalaron cuatro lechos de lijado y cuatro de pulido que trabajan
simultaacuteneamente Cada lecho contiene un entramado de cantildeos de PVC con perforaciones
colocados en el piso y cubiertos primero con ripio y luego con arena hasta una altura
aproximada de 1m sobre ella se instaloacute otra red de cantildeos perforados que se tapoacute con maacutes
arena y en eacutesta se plantaron las especies vegetales luego reemplazadas de manera natural por
totoras (figura Ndeg1)El efluente crudo ingresa por la red superior de cantildeos de los ldquolechos de
lijadordquo atraviesa la capa de arena y es colectado por la red inferior pasando a una caacutemara de
registro que permite fijar el nivel de inundacioacuten del lecho de pulido de forma que la capa
superior de arena se mantenga seca Por ello el nombre de pantanos secos Las totoras cuyas
raiacuteces son irrigadas por el efluente van absorbiendo los contaminantes y produciendo su
fitoextraccioacuten El liacutequido egresa de los lechos de pulido como efluente depurado y se bombea
a una pileta como depoacutesito final (figuras Ndeg2 y 3)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
4
Figura Nordm1 Totoras invadiendo gramiacuteneas canadienses
Figura Ndeg2 Esquema de Tratamiento por Pantanos Secos Artificiales
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
5
Primer
Sedimentador
Segundo
Sedimentador
Pileta de Pulido
1
Pileta de Lijado
1
Pileta de Lijado
2
Pileta de Pulido
2
Pileta de Lijado
3
Pileta de Pulido
3
Pileta de Lijado
4
Pileta de Pulido
4
Agua Madre
C I C I C M
Pileta de Peces
Cloacales Cloacales
C I = Caacutemara de Inspeccioacuten
C M = Caacutemara de Mezcla
Figura Nordm3 Plano de la instalacioacuten de Pantanos Secos
El sistema descripto presenta dos inconvenientes importantes el primero es que el efluente
antes de ingresar debe carecer de soacutelidos para evitar que se tapen las perforaciones y el
segundo tener un pH que oscile en el rango de 5 a 8 a fin de no alterar la biota microbioloacutegica
que realiza la remocioacuten
El primer inconveniente se subsana depositaacutendolas aguas madres en las piletas de
decantacioacuten como se explica en un paacuterrafo precedente En cuanto al segundo se encontroacute que
el pH de las aguas madres se podiacutea elevar adicionando cenizas fuertemente alcalinas
producidas en la caldera de la planta industrial al quemar los restos del aserriacuten de quebracho
colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino y furfural (aserriacuten desfurfuralizado) Las cenizas
no eran totalmente solubles y generaban sedimentos Como alternativa se trabajoacute en el
laboratorio para alcanzar el valor de pH apropiado adicionando carbonato de sodio y
verificaacutendolo con un peachiacutemetro
Desde el GISTAQ se propuso a la empresa poner en marcha un sistema de lechos fluidizados
anaerobio y aerobio que trabajariacutea con el efluente industrial previamente neutralizado y en
los cuales la remocioacuten la realizariacutean las bacterias autoacutectonas provenientes de tres sectores de
la planta de tratamiento caacutemara de mezcla lodos de sedimentadores y raiacuteces de totoras
Los reactores de lecho fluidizado (RLF) constituyen un sistema para el tratamiento de
efluentes ricos en materia orgaacutenica que podriacutea aplicarse al tratamiento del efluente producido
durante la obtencioacuten de furfural En eacutestos se busca lograr el mejor contacto entre el soporte
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
6
inerte (arena carboacuten activado alginato) que inmoviliza la peliacutecula bioloacutegica constituida por
bacterias y el efluente conteniendo el contaminante a eliminar para garantizar la mayor
remocioacuten En experiencias previas se establecioacute que el soporte deberaacute tener el menor tamantildeo
de partiacutecula y la mayor superficie de contacto posible [10]
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano inoculando bacterias
autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de tratamiento actual en medios de
cultivo (liacutequido y soacutelido) preparados con el efluente industrial (aguas madres) distintas
concentraciones para determinar la maacutes adecuada Esto se realizoacute en varias etapas
Caracterizacioacuten de las aguas madres
Preparacioacuten de los medios de cultivo
Preparacioacuten de los inoacuteculos y sus correspondientes recuentos bacterianos
Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente (erlenmeyers y placas de
Petri)
31 Caracterizacioacuten de las aguas madres
El valor del pH del agua madre obtenido in situ por esta faacutebrica es variable pero del orden de
25 El anaacutelisis por yodometriacutea del contenido de furfural y aacutecido aceacutetico realizado tambieacuten por
la empresa arrojoacute los siguientes valores 400 mgL de furfural y 189 equivalentes de aacutecido
aceacutetico por litro Sin embargo estas concentraciones tambieacuten sufren variaciones llegando a
detectarse concentraciones de hasta 790 mgL
Se tomoacute una muestra de 20 litros de aguas madres proveniente de la primera columna de
destilacioacuten utilizando un bidoacuten de 24 litros La misma fue remitida inmediatamente al
laboratorio de investigacioacuten del GISTAQ y conservada adecuadamente seguacuten los protocolos
de anaacutelisis correspondientes hasta el momento de efectuar los mismos Se realizaron anaacutelisis
de la misma a fin de realizar su caracterizacioacuten (tabla Nordm4) Los restantes ensayos se
efectuaron seguacuten meacutetodos normalizados (Standard Methods 21 Edition 2005) o adaptacioacuten de
los mismos
32 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Para la preparacioacuten de los medios de cultivo se utilizoacute agua madre neutralizada agua de
peptona nutrientes y agar-agar
Las aguas madres se neutralizaron previamente con carbonato de sodio soacutelido hasta alcanzar
un pH 6 utilizando un peachiacutemetro Hanna Para 500 ml de agua madre se agregaron
aproximadamente 95g del mismo
Como nutrientes se utilizaron soluciones de cloruro de amonio 127 pv (marca JT Baker
Inc al 997 de pureza) y de fosfato diaacutecido de sodio 328 pv (marca Mallinckrodt
Chemical Works al 99 de pureza) Se agregaron las cantidades necesarias para que cada
medio tenga una concentracioacuten final de 033 gL de N y 0066gL de P Este valor surge de la
relacioacuten 51 que debe existir entre N y P respectivamente [11]
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
7
Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
9
342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
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methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
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[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
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Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
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Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
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cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
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Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
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[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
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Figura Nordm1 Totoras invadiendo gramiacuteneas canadienses
Figura Ndeg2 Esquema de Tratamiento por Pantanos Secos Artificiales
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5
Primer
Sedimentador
Segundo
Sedimentador
Pileta de Pulido
1
Pileta de Lijado
1
Pileta de Lijado
2
Pileta de Pulido
2
Pileta de Lijado
3
Pileta de Pulido
3
Pileta de Lijado
4
Pileta de Pulido
4
Agua Madre
C I C I C M
Pileta de Peces
Cloacales Cloacales
C I = Caacutemara de Inspeccioacuten
C M = Caacutemara de Mezcla
Figura Nordm3 Plano de la instalacioacuten de Pantanos Secos
El sistema descripto presenta dos inconvenientes importantes el primero es que el efluente
antes de ingresar debe carecer de soacutelidos para evitar que se tapen las perforaciones y el
segundo tener un pH que oscile en el rango de 5 a 8 a fin de no alterar la biota microbioloacutegica
que realiza la remocioacuten
El primer inconveniente se subsana depositaacutendolas aguas madres en las piletas de
decantacioacuten como se explica en un paacuterrafo precedente En cuanto al segundo se encontroacute que
el pH de las aguas madres se podiacutea elevar adicionando cenizas fuertemente alcalinas
producidas en la caldera de la planta industrial al quemar los restos del aserriacuten de quebracho
colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino y furfural (aserriacuten desfurfuralizado) Las cenizas
no eran totalmente solubles y generaban sedimentos Como alternativa se trabajoacute en el
laboratorio para alcanzar el valor de pH apropiado adicionando carbonato de sodio y
verificaacutendolo con un peachiacutemetro
Desde el GISTAQ se propuso a la empresa poner en marcha un sistema de lechos fluidizados
anaerobio y aerobio que trabajariacutea con el efluente industrial previamente neutralizado y en
los cuales la remocioacuten la realizariacutean las bacterias autoacutectonas provenientes de tres sectores de
la planta de tratamiento caacutemara de mezcla lodos de sedimentadores y raiacuteces de totoras
Los reactores de lecho fluidizado (RLF) constituyen un sistema para el tratamiento de
efluentes ricos en materia orgaacutenica que podriacutea aplicarse al tratamiento del efluente producido
durante la obtencioacuten de furfural En eacutestos se busca lograr el mejor contacto entre el soporte
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6
inerte (arena carboacuten activado alginato) que inmoviliza la peliacutecula bioloacutegica constituida por
bacterias y el efluente conteniendo el contaminante a eliminar para garantizar la mayor
remocioacuten En experiencias previas se establecioacute que el soporte deberaacute tener el menor tamantildeo
de partiacutecula y la mayor superficie de contacto posible [10]
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano inoculando bacterias
autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de tratamiento actual en medios de
cultivo (liacutequido y soacutelido) preparados con el efluente industrial (aguas madres) distintas
concentraciones para determinar la maacutes adecuada Esto se realizoacute en varias etapas
Caracterizacioacuten de las aguas madres
Preparacioacuten de los medios de cultivo
Preparacioacuten de los inoacuteculos y sus correspondientes recuentos bacterianos
Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente (erlenmeyers y placas de
Petri)
31 Caracterizacioacuten de las aguas madres
El valor del pH del agua madre obtenido in situ por esta faacutebrica es variable pero del orden de
25 El anaacutelisis por yodometriacutea del contenido de furfural y aacutecido aceacutetico realizado tambieacuten por
la empresa arrojoacute los siguientes valores 400 mgL de furfural y 189 equivalentes de aacutecido
aceacutetico por litro Sin embargo estas concentraciones tambieacuten sufren variaciones llegando a
detectarse concentraciones de hasta 790 mgL
Se tomoacute una muestra de 20 litros de aguas madres proveniente de la primera columna de
destilacioacuten utilizando un bidoacuten de 24 litros La misma fue remitida inmediatamente al
laboratorio de investigacioacuten del GISTAQ y conservada adecuadamente seguacuten los protocolos
de anaacutelisis correspondientes hasta el momento de efectuar los mismos Se realizaron anaacutelisis
de la misma a fin de realizar su caracterizacioacuten (tabla Nordm4) Los restantes ensayos se
efectuaron seguacuten meacutetodos normalizados (Standard Methods 21 Edition 2005) o adaptacioacuten de
los mismos
32 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Para la preparacioacuten de los medios de cultivo se utilizoacute agua madre neutralizada agua de
peptona nutrientes y agar-agar
Las aguas madres se neutralizaron previamente con carbonato de sodio soacutelido hasta alcanzar
un pH 6 utilizando un peachiacutemetro Hanna Para 500 ml de agua madre se agregaron
aproximadamente 95g del mismo
Como nutrientes se utilizaron soluciones de cloruro de amonio 127 pv (marca JT Baker
Inc al 997 de pureza) y de fosfato diaacutecido de sodio 328 pv (marca Mallinckrodt
Chemical Works al 99 de pureza) Se agregaron las cantidades necesarias para que cada
medio tenga una concentracioacuten final de 033 gL de N y 0066gL de P Este valor surge de la
relacioacuten 51 que debe existir entre N y P respectivamente [11]
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
7
Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
9
342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
5
Primer
Sedimentador
Segundo
Sedimentador
Pileta de Pulido
1
Pileta de Lijado
1
Pileta de Lijado
2
Pileta de Pulido
2
Pileta de Lijado
3
Pileta de Pulido
3
Pileta de Lijado
4
Pileta de Pulido
4
Agua Madre
C I C I C M
Pileta de Peces
Cloacales Cloacales
C I = Caacutemara de Inspeccioacuten
C M = Caacutemara de Mezcla
Figura Nordm3 Plano de la instalacioacuten de Pantanos Secos
El sistema descripto presenta dos inconvenientes importantes el primero es que el efluente
antes de ingresar debe carecer de soacutelidos para evitar que se tapen las perforaciones y el
segundo tener un pH que oscile en el rango de 5 a 8 a fin de no alterar la biota microbioloacutegica
que realiza la remocioacuten
El primer inconveniente se subsana depositaacutendolas aguas madres en las piletas de
decantacioacuten como se explica en un paacuterrafo precedente En cuanto al segundo se encontroacute que
el pH de las aguas madres se podiacutea elevar adicionando cenizas fuertemente alcalinas
producidas en la caldera de la planta industrial al quemar los restos del aserriacuten de quebracho
colorado despueacutes de la extraccioacuten del tanino y furfural (aserriacuten desfurfuralizado) Las cenizas
no eran totalmente solubles y generaban sedimentos Como alternativa se trabajoacute en el
laboratorio para alcanzar el valor de pH apropiado adicionando carbonato de sodio y
verificaacutendolo con un peachiacutemetro
Desde el GISTAQ se propuso a la empresa poner en marcha un sistema de lechos fluidizados
anaerobio y aerobio que trabajariacutea con el efluente industrial previamente neutralizado y en
los cuales la remocioacuten la realizariacutean las bacterias autoacutectonas provenientes de tres sectores de
la planta de tratamiento caacutemara de mezcla lodos de sedimentadores y raiacuteces de totoras
Los reactores de lecho fluidizado (RLF) constituyen un sistema para el tratamiento de
efluentes ricos en materia orgaacutenica que podriacutea aplicarse al tratamiento del efluente producido
durante la obtencioacuten de furfural En eacutestos se busca lograr el mejor contacto entre el soporte
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
6
inerte (arena carboacuten activado alginato) que inmoviliza la peliacutecula bioloacutegica constituida por
bacterias y el efluente conteniendo el contaminante a eliminar para garantizar la mayor
remocioacuten En experiencias previas se establecioacute que el soporte deberaacute tener el menor tamantildeo
de partiacutecula y la mayor superficie de contacto posible [10]
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano inoculando bacterias
autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de tratamiento actual en medios de
cultivo (liacutequido y soacutelido) preparados con el efluente industrial (aguas madres) distintas
concentraciones para determinar la maacutes adecuada Esto se realizoacute en varias etapas
Caracterizacioacuten de las aguas madres
Preparacioacuten de los medios de cultivo
Preparacioacuten de los inoacuteculos y sus correspondientes recuentos bacterianos
Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente (erlenmeyers y placas de
Petri)
31 Caracterizacioacuten de las aguas madres
El valor del pH del agua madre obtenido in situ por esta faacutebrica es variable pero del orden de
25 El anaacutelisis por yodometriacutea del contenido de furfural y aacutecido aceacutetico realizado tambieacuten por
la empresa arrojoacute los siguientes valores 400 mgL de furfural y 189 equivalentes de aacutecido
aceacutetico por litro Sin embargo estas concentraciones tambieacuten sufren variaciones llegando a
detectarse concentraciones de hasta 790 mgL
Se tomoacute una muestra de 20 litros de aguas madres proveniente de la primera columna de
destilacioacuten utilizando un bidoacuten de 24 litros La misma fue remitida inmediatamente al
laboratorio de investigacioacuten del GISTAQ y conservada adecuadamente seguacuten los protocolos
de anaacutelisis correspondientes hasta el momento de efectuar los mismos Se realizaron anaacutelisis
de la misma a fin de realizar su caracterizacioacuten (tabla Nordm4) Los restantes ensayos se
efectuaron seguacuten meacutetodos normalizados (Standard Methods 21 Edition 2005) o adaptacioacuten de
los mismos
32 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Para la preparacioacuten de los medios de cultivo se utilizoacute agua madre neutralizada agua de
peptona nutrientes y agar-agar
Las aguas madres se neutralizaron previamente con carbonato de sodio soacutelido hasta alcanzar
un pH 6 utilizando un peachiacutemetro Hanna Para 500 ml de agua madre se agregaron
aproximadamente 95g del mismo
Como nutrientes se utilizaron soluciones de cloruro de amonio 127 pv (marca JT Baker
Inc al 997 de pureza) y de fosfato diaacutecido de sodio 328 pv (marca Mallinckrodt
Chemical Works al 99 de pureza) Se agregaron las cantidades necesarias para que cada
medio tenga una concentracioacuten final de 033 gL de N y 0066gL de P Este valor surge de la
relacioacuten 51 que debe existir entre N y P respectivamente [11]
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
7
Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
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342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
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[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
6
inerte (arena carboacuten activado alginato) que inmoviliza la peliacutecula bioloacutegica constituida por
bacterias y el efluente conteniendo el contaminante a eliminar para garantizar la mayor
remocioacuten En experiencias previas se establecioacute que el soporte deberaacute tener el menor tamantildeo
de partiacutecula y la mayor superficie de contacto posible [10]
3 MATERIALES Y MEacuteTODOS
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento bacteriano inoculando bacterias
autoacutectonas provenientes de distintos sectores de la planta de tratamiento actual en medios de
cultivo (liacutequido y soacutelido) preparados con el efluente industrial (aguas madres) distintas
concentraciones para determinar la maacutes adecuada Esto se realizoacute en varias etapas
Caracterizacioacuten de las aguas madres
Preparacioacuten de los medios de cultivo
Preparacioacuten de los inoacuteculos y sus correspondientes recuentos bacterianos
Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente (erlenmeyers y placas de
Petri)
31 Caracterizacioacuten de las aguas madres
El valor del pH del agua madre obtenido in situ por esta faacutebrica es variable pero del orden de
25 El anaacutelisis por yodometriacutea del contenido de furfural y aacutecido aceacutetico realizado tambieacuten por
la empresa arrojoacute los siguientes valores 400 mgL de furfural y 189 equivalentes de aacutecido
aceacutetico por litro Sin embargo estas concentraciones tambieacuten sufren variaciones llegando a
detectarse concentraciones de hasta 790 mgL
Se tomoacute una muestra de 20 litros de aguas madres proveniente de la primera columna de
destilacioacuten utilizando un bidoacuten de 24 litros La misma fue remitida inmediatamente al
laboratorio de investigacioacuten del GISTAQ y conservada adecuadamente seguacuten los protocolos
de anaacutelisis correspondientes hasta el momento de efectuar los mismos Se realizaron anaacutelisis
de la misma a fin de realizar su caracterizacioacuten (tabla Nordm4) Los restantes ensayos se
efectuaron seguacuten meacutetodos normalizados (Standard Methods 21 Edition 2005) o adaptacioacuten de
los mismos
32 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Para la preparacioacuten de los medios de cultivo se utilizoacute agua madre neutralizada agua de
peptona nutrientes y agar-agar
Las aguas madres se neutralizaron previamente con carbonato de sodio soacutelido hasta alcanzar
un pH 6 utilizando un peachiacutemetro Hanna Para 500 ml de agua madre se agregaron
aproximadamente 95g del mismo
Como nutrientes se utilizaron soluciones de cloruro de amonio 127 pv (marca JT Baker
Inc al 997 de pureza) y de fosfato diaacutecido de sodio 328 pv (marca Mallinckrodt
Chemical Works al 99 de pureza) Se agregaron las cantidades necesarias para que cada
medio tenga una concentracioacuten final de 033 gL de N y 0066gL de P Este valor surge de la
relacioacuten 51 que debe existir entre N y P respectivamente [11]
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
7
Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
9
342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
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[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
7
Se realizaron dos ensayos para evaluar el crecimiento bacteriano a distintas concentraciones
de aguas madres en erlenmeyer y placas de Petri Ambos medios conteniacutean agua de peptona
nutrientes y distintos porcentajes de agua madre En los medios liacutequidos dicho porcentaje
cubrioacute el rango de 25 hasta 80 En los soacutelidos de 20 a 98
El agua de peptona se utilizoacute en distintos pv a fin de mantener una concentracioacuten constante
de fuentes de nitroacutegeno y carbono Para el testigo 0 de agua madre se utilizoacute agar nutritivo
[12] Los medios de cultivos soacutelidos se prepararon como se indica a modo de ejemplo en la
tabla Nordm1
Componentes 20 40 60 80 98
Volumen de medio 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Agua madre
neutralizada 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 98 ml
Agua de peptona 78 ml 58 ml 38 ml 18 ml 0 ml
Solucioacuten de
cloruro de amonio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solucioacuten de fosfato
diaacutecido de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Agar-agar 15 g 15 g 15 g 15 g 15 g
Tabla Nordm1 Preparacioacuten de los medios de cultivo
Luego se calentaron los medios a bantildeo mariacutea hasta disolver el agar y se esterilizaron en
autoclave a 15bar y 112ordmC por un lapso de 15 minutos
33 Preparacioacuten de los inoacuteculos
Se trabajoacute con inoacuteculos bacterianos obtenidos de tres fuentes (Figura Ndeg3)
1 Lodos de los sedimentadores obtenidos del segundo sedimentador cercano al sector de
salida a la caacutemara de inspeccioacuten correspondiente
2 Efluente obtenido de la caacutemara de mezcla receptora de los efluentes provenientes de los
sedimentadores 1 y 2
3 Raiacuteces de las totoras obtenidas a partir de plantas del Lecho de Lijado Ndeg2
Se realizaron recuentos de mesoacutefilas totales de las tres fuentes para determinar las cargas
bacteriales iniciales A fin de estandarizar la carga bacteriana del inoacuteculo y a partir de los
resultados obtenidos se prepararon soluciones al 4 pv de lodos y al 10 pv de raiacuteces El
efluente se utilizoacute sin diluirAl momento del ensayo se realizaron nuevos recuentos para
conocer la carga bacteriana exacta inoculada
331 Recuento bacteriano de los inoacuteculos
Se realizaron diluciones de los inoacuteculos con agua de peptona al 1 en condiciones de
esterilidad Dichas diluciones fueron 110 1102 1103 y 1104 Se sembroacute luego en placas de
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
9
342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
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14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
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[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
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[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
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[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
8
Petri con agar nutritivo 1ml de cada dilucioacuten para cada uno de los tres inoacuteculos Se incubaron
a 30ordmC por 48horas y se determinoacute el nuacutemero de UFCml por medio de recuento de colonias
34 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
341 Siembra en Erlenmeyers
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) utilizando un inoacuteculo por vez para medios de
cultivo liacutequidos Se usaron medios con concentraciones crecientes de agua madre como se
detalla en las tablas Se utilizaron erlenmeyers de 250 ml Se esterilizaron por 2 horas a 140degC
y en cada uno de ellos se adicionaron en esterilidad 100 ml de medio y 1 ml del inoacuteculo
correspondiente por ensayo (1 ml de efluente 1 ml de lodos al 4 pv y 1 ml de raiacuteces al 10
pv) Se homogeneizaron al menos una vez por diacutea para oxigenarlos y se incubaron durante
72horas a 30ordmC en estufa El esquema para cada inoacuteculo es el siguiente
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B A b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma composicioacuten de
nutrientes Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
Tabla Nordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A B a b a b
RaiacutecesLodosEfluente
Observaciones
0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
Los erlenmeyers se mantuvieron esteacuteriles y oxigenados usando tapones de algodoacuten
TablaNordm2 Esquema de siembra de inoacuteculos en Erlenmeyers (continuacioacuten)
Para confirmar el crecimiento bacteriano en los erlenmeyers se utilizaron los mismos medios
de cultivo con el agregado de agar Se tomoacute 1 ml de cada erlenmeyer y se lo sembroacute por
inmersioacuten en placas de Petri para el recuento de UFCml a las 48horas
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342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
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Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
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Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
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por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
9
342 Siembra en placas de Petri
El ensayo se realizoacute por duplicado (a y b) en medios de cultivo soacutelidos en placas de Petri
esterilizadas para concentraciones crecientes de agua madre desde 0 a 98 Se dividioacute cada
placa en tres sectores para realizar la siembra por estriado de los tres inoacuteculos al mismo
tiempo Se incubaron durante dos semanas en estufa a 30ordmC monitoreando el crecimiento
diariamente El esquema de siembra se muestra en la siguiente tabla
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
Raiacuteceslodosefluente
a B a b a b a b a b a b
Observaciones 0 (testigo) medio de cultivo sin agua madre pero con la misma
composicioacuten de nutrientes
TablaNordm3 Esquema de siembra de inoacuteculos en placas de Petri
35 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
Se realizoacute el aislamiento de las distintas colonias bacterianas presentes en los inoacuteculos para lo
cual se observaron las caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las mismas repicando en un pico de
flauta a las consideradas diferentes logrando asiacute su aislamiento Posteriormente a cada una
de ellas se le realizoacute una tincioacuten de Gram determinando las caracteriacutesticas microscoacutepicas
4 RESULTADOS
41 Caracterizacioacuten de las aguas madres
Los resultados obtenidos en el proceso de caracterizacioacuten del agua madre se presentan en la
tabla a continuacioacuten
Determinaciones Resultados Meacutetodos
pH 261 SM4500-H+
Pot Redox (mV) 2009 SM4500-H+B
Conductividad (micros) 1010 SM2510 B
NO3- (ppm) 228 SM4500-NO3
-B
NO2- (ppm) 023 SM4500-NO2
-B
DQO (ppm) 24451 SM5220 D
DBO5 (ppm) 14789 SM5210 B
COT (ppm) 4575 SM5310 D
Soacutelidos totales (gL) 226 SM2540 B
Soacutelidos volaacutetiles (gL) 94 SM2540 E
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
10
Soacutelidos fijos (gL) 132 SM2540 E
Coliformes totales (CT) lt 3 SM9221 B
Coliformes fecales (CF) Ausencia SM9221 C
Turbidez (FAU) 13 Hach8237
Color (Pt-Co) 722 Hach8025
Tabla Nordm4 Ensayos y Meacutetodos Normalizados Standard Methods Meacutetodo HACH adaptado de Standard Methods
42 Preparacioacuten de los inoacuteculos
En la Tabla Nordm 5 se presenta la carga bacteriana determinada para cada uno de los inoacuteculos Se
indica la carga final inoculada en los erlenmeyers calculada a partir del promedio histoacuterico
en cada uno de los ensayos de crecimiento
Inoacuteculo Resultado [UFCml]
Efluente s diluir 31104
Lodos 4 pv 28104
Raiacuteces 10 pv 13106
Tabla Nordm5 Resultados de carga bacteriana
43 Pruebas de crecimiento en distintas concentraciones de efluente
431 Resultados en Erlenmeyers
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
25 5 10 20
a B a b A b a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento Se observa creci-
miento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
INOacuteCULO
PORCENTAJE DE AGUA MADRE
40 60 80
A b a B a b
RaiacutecesLodos
Efluente
Resultado Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se observa
crecimiento
Tabla Nordm6 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente (continuacioacuten)
El crecimiento microbiano se detecta por medio de la visualizacioacuten del enturbiamiento del
medio (Figura Ndeg6) y se confirma mediante siembra en placa
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
11
Figura Nordm6 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
432 Confirmacioacuten del crecimiento bacteriano en erlenmeyers mediante recuento de
colonias
En alguna de las diluciones ensayadas se realizoacute un recuento de colonias siguiendo el
procedimiento detallado en 331 En la tabla Ndeg7 se muestran los resultados obtenidos
INOacuteCULO 20
Inicial
20
48hs
40
inicial
40
48hs
Efluente 75103 UFCml gt5109 UFCml 75103 UFCml 14109 UFCml
Lodos 4 282102UFCml gt5109UFCml 282102UFCml 4107UFCml
Raiacuteces 10 497102UFCml 286109 UFCml 497102UFCml 286109 UFCml
Tabla Nordm7 Resultados de la confirmacioacuten de crecimiento bacteriano
433 Resultados en placas de Petri
INOacuteCULO PORCENTAJE DE AGUA MADRE
0 20 40 60 80 98
RaiacutecesLodosEfluente
a B a b a b a b a b a b
Resultado
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
Se observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
No se
observa
crecimiento
Tabla Nordm8 Resultados de crecimiento a distintas concentraciones de efluente
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
14
[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
12
Figura Nordm7 Crecimiento a las 24 horas de realizada la siembra
Figura Nordm8 Crecimiento a las 72 horas de realizada la siembra
44 Aislamiento bacteriano y tincioacuten de Gram
De la siembra de los inoacuteculos se identificaron visualmente 4 colonias diferentes Una vez
aisladas las mismas en picos de flauta con agar nutritivo se les realizoacute una tincioacuten de Gram
En la misma se observaron cocos y cocobacilos Gram negativos asiacute como tambieacuten bacilos
Gram negativos Posteriormente se realizaraacute la identificacioacuten de cada una a nivel de geacutenero y
especie
5 DISCUSIOacuteN Y CONCLUSIONES
Analizando el efluente (agua madre) a tratar se puede comprobar que el mismo egresa del
proceso sin contaminacioacuten bacteriana Ello estaacute posiblemente relacionado con la alta
temperatura de salida (alrededor de 96degC) Contiene elevada contaminacioacuten orgaacutenica reflejada
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en un Efluente Industrial Recalcitrante
13
por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
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[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
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por su alta DQO y DBO Esta se debe principalmente al aacutecido aceacutetico y al furfural En cambio
el contenido de nitroacutegeno es reducido Se trata de un efluente con escasa turbidez (confirmada
por los bajos valores de soacutelidos) y algo coloreado Esto indica que es complejo y de
caracteriacutesticas particulares
Aunque auacuten no se han identificado las bacterias aisladas a priori seriacutean las mismas que se
presentan en los distintos inoacuteculos
En los ensayos realizados en erlenmeyers el crecimiento se observoacute por enturbiamiento
mucosidad y aparicioacuten de coloracioacuten blanquecina a las 72 horas En las placas de Petri tal
desarrollo se verificoacute a traveacutes de la presencia de colonias en las estriacuteas
Se esperaba un retardo en el crecimiento teniendo en cuenta el tiempo de adaptacioacuten que
necesitan en general las poblaciones bacterianas para iniciar la etapa exponencial Sin
embargo se obtuvo un raacutepido desarrollo en todos los ensayos positivos lo que indicariacutea una
posible adaptacioacuten de estos microorganismos al medio con aguas madres
Aunque no se realizaron recuentos en cada uno de los ensayos positivos de las observaciones
tanto de la turbidez de los erlenmeyers como de las estriacuteas realizadas en el medio agarizado
se desprende que existe un orden descendente en el crecimiento de las bacterias de los
inoacuteculos lodos raiacuteces y efluente Esto indicariacutea que las que estaacuten presentes en los lodos
tendriacutean una mejor adaptacioacuten al medio con contenido de aacutecido aceacutetico y furfural
El contenido de furfural en la muestra de AM con la que se trabajoacute es de 416 mM inferior a
las concentraciones informadas por otros autores en las que se presentoacute inhibicioacuten Por ello
seriacutea esperable percibir crecimiento bacteriano en todos los medios de cultivo La inhibicioacuten
del crecimiento se observa recieacuten en proporciones de agua madre superiores (AM) al 60 Lo
cual es consistente con la falta de enturbiamiento o aparicioacuten de colonias en todos los ensayos
con AM al 80 y 98 Teniendo en cuenta que la cantidad de peptona de carne en cada placa
era aproximadamente constante lo que variaba era la concentracioacuten de AM Por lo que se
infiere que la inhibicioacuten del crecimiento bacteriano podriacutea estar asociada a una interaccioacuten
entre el furfural y el aacutecido aceacutetico a estas concentraciones
Se concluye que es posible el desarrollo de bacterias provenientes de los tres sectores de la
planta de tratamiento en los medios de cultivo conformados por distintas concentraciones de
agua madre (hasta 60) Se espera en ensayos y trabajos posteriores la identificacioacuten de las
cepas y realizar su aclimatacioacuten a fin de incorporarlas a un sistema de lechos fluidizados para
efectuar la biorremocioacuten del efluente en estudio
REFERENCIAS
[1]Boopathy R ldquoAnaerobic biotransformation of furfural to furfuryl alcohol by a
methanogenic archaebacteriumrdquo International Biodeterioration amp Biodegradation Vol8 pp
1070-1072(2009)
[2] Brune G Schoberth S Sahm H ldquoGrowth of a Strictly Anaerobic Bacterium on Furfural
(2-Furaldehyde)rdquo Applied and Environmental Microbiology Vol 46 pp 1187-1192 (1983)
Ensayo de Crecimiento Bacteriano en Efluente Industrial Fariacuteas et al
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[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
Biotechnology for Biofuels Vol 7 pp 51 (2014)
[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
Mutat Res Vol 337 pp 9-17 (1995)
[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
cultures by HPLCrdquo Journal of Liquid Chromatography Vol 4 pp 85ndash291 (1981)
[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
SA(2010)
[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)
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[3] Loacutepez M J Nichols N N Dien B S Moreno J Bothast R J ldquoIsolation of
microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysatesrdquo Applied
Microbiology and Biotechnology Vol 64 pp 125-131 (2004)
[4] Wierckx N Koopman F Bandounas L De Winde J H Ruijssenaars H J ldquoIsolation
and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors
from lignocellulosic hydrolysaterdquo Microbial Biotechnology Vol 3 pp 336-343 (2010)
[5] Wirtz RA Dague RR ldquoAnaerobic treatment of a furfural-production wastewaterrdquo Waste
Manangment Vol 13 pp 309-315 (1993)
[6] Hong R Jian Z Qiuqiang G Zhanglin L Jie B ldquoAnalysis of biodegradation
performance of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Amorphotheca Resinae ZN1rdquo
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[7] Singh N Khan A ldquoAcetaldehide genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytesrdquo
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[8] Hong S W Han H E Chae KS ldquoDetection of furfural and 2-furoic acid in bacterial
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[9] Puyal P ldquoDisentildeo preliminar para el tratamiento de efluente de alta carga generado por
actividad del procesamiento de tanino vegetal a partir del quebrachordquo New England Systems
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[10] Panigatti M Grifa C Boglione R Gentinetta F Cassina D Siri J Torres J
Rosso P Abraham M Ferreyra D ldquoDisentildeo de un biorreactor de lecho fluidizado para
tratamiento de cromo hexavalenterdquo World Congress amp Exhibition ENGINEERING (2010)
[11] Carrillo Leonor Microbiologiacutea Agriacutecola Universidad Nacional de Salta Vol 5 (2002)
[12] Moreno B Diez V Garciacutea M Menes L Gutieacuterrez M Polledo F
Microorganismos de los Alimentos Teacutecnicas de Anaacutelisis Microbioloacutegicos Editorial Acribia
Vol 1 (2000)