ensaios imunoquÍmicos técnicas imunológicas ensaios hormonais biomedicina fiel daisy de souza...

ENSAIOS IMUNOQUÍMICOSTécnicas Imunológicas

Ensaios Hormonais

BIOMEDICINA FIEL

DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO


Reações imunoquímicasReação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo Reação química especial

Reconhecimento do antígeno (depende do tipo de antígeno a ser pesquisado))

Superfície da célula Disperso em solução

Parâmetros que dependem do Anticorpo Utilizado Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de

anticorpo) Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de

anticorpo) Afinidade Avidez Diversidade


Classificação dos Imunoensaios

Classificação Sinalizador Deteção do

sinal Sensibilidade Automatizável?

Precipitação Nenhum visual (olho nu) turbidez, nefelometria

10 microgramas/mL Não REAGENTES NÃO

MARCADOS Aglutinação de Partículas

Látex, gelatina Céluas

visual (olho nu) contagem de partículas

5 microgramas/mL Não

Radio-imunoensaio Radioisótopos Contagem fótons 5 picogramas/mL Não

Enzimáticos Enzimas Espectrofotometria Fluorometeia Contagem fótons

0,1 picogramas/mL SIM

Fluorescentes Fluoróforos Fluorometria Contagem fótons

5 picogramas/mL SIM

Quimioluminescentes Compostos quimioluminescentes

Fluorometria Contagem fótons

5 picogramas/mL SIM

REAGENTES MARCADOS

Combinados (Axsym) Combinados Combinados variável SIM


Reações de Precipitação

QUANTIFICAÇÃO dos complexos formados pela reação Antígeno+anticorpo que se precipitam no meio.

Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos

componentes: FENÔMENO PR0-ZONA

Desnecessária separação do complexo antígeno+anticorpo (fase ligada) das substâncias livres no meioCOMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO pode ser quantificado: visualmente a olho nu visualmente usando um microscópio por medida da turbidez (turbidimetria) quantificado por nefelometria


Reações de Precipitação

Fatores interferentes: Concentrações do antígeno e do anticorpo

presentes no “sistema” (amostra+reagente)

Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH) Precipitação máxima: concentrações

equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)

Sensibilidade: 10 microgramas/mL


Reações de Precipitação Direta Clássica

triagem inicial p/ SÍFILIS OU LUES VDRL – Venereal Desease Research Laboratory RPR – Reagina Plasmática Rápida RPS - Reagina Para Sífilis medido nestas reações:

presença de anticorpos para o material lipoproteico das células danificadas pela doença.

presença de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas

Métodos não treponêmicos e INESPECÍFICOSSensibilidade: 78% na fase primária (74 a 87%) 100% na fase secundária 95% na fase latente (88 a 100%) 71% na fase tardia (37 a 94%)


Reações de Precipitação DERIVADAS

MANUAIS Imunodifusão Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixação Eletroimunodifusáo

UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS DE PESQUISA

AUTOMATIZADAS NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA

UTILIZADAS EM GRANDES LABORATÓRIOS


Nefelometria e Turbidimetria

Possibilidade de Automação total Nefelômetros Equipamentos de bioquímica (turbidimetria)Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína) Fator Reumatóide Microalbumina Proteína C Reativa Apoliproproteína inúmeras outras substâncias (imunoglobulinas, transferrina

etc)


Reações de AglutinaçãoFormação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos;Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículasDetectam tanto a presença de IgM quanto de IgGVisualização: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:


Reações de AglutinaçãoFatores interferentes:

Classe do Anticorpo envolvido;Eletrólitos;Macromoléculas Hidrofílicas;Enzimas; pH (6 a 8);Tempo;Temperatura


Falso Negativas

Quantidade pequena de anticorpos:a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a

sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando;

Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)


TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS

1. Determinantes antigênicos Naturais:Eritrócitos humanos – determinação grupo sangüíneo ABO Bactérias – SLIDEX meningites Protozoários

2. Partículas inertes revestidasLátex (mais comum) – teste de gravidezGelatinaBetonita, polipeptídeos

3. Células antigenicamente não relacionadas Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados

Hemácias e bactérias


Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas

Aglutinação direta : ex teste de gravidez

Aglutinação passiva

Hemaglutinação direta: ABO RH

Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose

Hemaglutinação Passiva

Inibição de Hemaglutinação

Inibição de Hemaglutinação passiva


Imunofluorescência Manual 1

Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno.Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos –

Isotiocianato de Fluoresceína* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)


Imunofluorescência Manual 2 - DIRETA

A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência

Pesquisa de antígeno

• amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)*

microscópio de fluorescência


Imunofluorescência Manual 3 – IFI - INDIRETA

A- pesquisa de antígeno• amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *• microscópio de fluorescência• * lavagens

B- pesquisa de anticorpos• Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *• microscópio de fluorescência• determinação do título e classe do Ac


IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS classificação tipo de reação (cinética)

COMPETITIVOS Há competição entre a substância presente na

amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA).

NÃO COMPETITIVOS: São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase

sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico


Competitivo ou não

Competitivo: Quanto maior a

concentração do analito menor a contagem do sinal

Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou “cut-off”

Não Competitivo Quanto maior a

concentração do analito maior a contagem do sinal

Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou “cut-off”


IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:

COMPETITIVOSanticorpo primário na fase sólida – (pag

963) e antígeno marcado anticorpo secundáriosecundário na fase sólida – (pag

964) e antígeno marcado

NÃO COMPETITIVOSSEQUENCIAL SANDUÍCHE


IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: CLASSIFICAÇÃO TIPOS / SIGLAS

Marcador radioativo: Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiométrico (IRMA)

Marcador enzimático Enzimaimunoensaio (EIA) ELISA - Ensaio imunoenzimático MEIA - Ensaio imunoenzimático de micropartículas

Marcador FLUORESCENTE Imunofluorométrico (IFMA) FPIA – Fluorescence polarization immunoassay ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay

Marcador QUIMIOLUMINESCENTE Quimioluminescência convencional EQL,

Eletroquimioluminescência (ECLIA) Ensaio imunológico quimioluminescente magnético

CMIA


IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:

Fatores Interferentes: Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais.

Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais


IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS Fatores interferentes II

Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade.

Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.


Ensaios com marcadores RADIOATIVOS – RIA, RIE, IRMA

pouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em São Paulo)um dos componentes do sistema é marcado com isótopo radioativo ensaios competitivos : o reagente marcado é = à

substância que se quer dosar (antígeno) (RIA/RIE) ensaios não competitivos: o reagente marcado é

um segundo anticorpo (IRMA)O radioisótopo mais utilizado é o I125 (57,5 dias)


Ensaios com marcadores ENZIMÁTICOS – EIA, ELISA, MEIA, ELFA

EIA – Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimático

ELISA - Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay

MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas

ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay:

Ensaio imuno-enzimático fluorescente


ETAPAS ELISA, EIAsensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Acbloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) *adição da amostra (em diluente) *adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupção da reação: SDS ou ácido forte leitura: leitor de ELISA

* lavagens


EIA – ELISA Vantagens e Desvantagens

Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica;Cuidados com interferentes, reações cruzadasVersatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura;Erros operacionais, variáveis analíticasAdaptação a diferentes graus de automaçãoInstabilidade dos reagentesInfluência em manipulações e do equipamento


Ensaios com marcadores FLUORESCENTES – MEIA, ELFA, FPIA

MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio

imunoenzimático de micropartículas (detecção é fluorescente

– Axsym) (ABBOTT)

ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-

enzimático fluorescente

IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaio

Imunofluorométrico

FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssay


Ensaios com marcadores FLUORESCENTES

Utilizam enzimas com substratos FluorescentesUtilizam aparelhos denominados de Fluorômetros;As técnicas diferem quanto ao suporte sólidoAs técnicas diferem também á forma de ampliar o sinal;Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA

Possui sensibilidade e especificidades elevadas;Bom método para dosagens hormonais


QUIMIOLUMINESCÊNCIA I

Reação entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instável o qual após estabilização gera emissão de fótons de luz medida por FM, que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos(CPS).

São reações de oxidação ►luz no espectro visível;


QUIMIOLUMINESCÊNCIA II

A sensibilidade de um método enzimático aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromogênico por um luminescente;É a emissão de luz produzida em algumas reações químicas envolvendo moléculas que emitem luz, quando passam do estado de excitação para o basal eletrônico;São altamente sensíveis;Método de escolha para quantificação de substâncias, como hormônios e marcadores tumorais.


QUIMIOLUMINESCÊNCIAPra que serve??? Qual vantagem?

1. UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3,

CA-19-9, CEA, AFP) HORMÔNIOS DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTEÍNA

2. VANTAGENS:Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente

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