TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS - II

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

substrato (que será degradado pela enzima)

QualitativosQuantitativos

Ac marcados com Enzimas + + = CORAg

Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

FIGURE 6-10Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to RIA except using an Enzyme (alkaline �, horseradish peroxidase, & β-galactosidase): safer & less costly.

to detect Ab (HIV, HCV)

to detect Ag

to detect Ag

6. ELISA 6. ELISA

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Imunofluorescência

luzλ Ac + fluorocromo Ac +

Fluorocromoλ

rght

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Reagentes secundários:

Anticorpo secundário marcado com fluorocromoproteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs

Treponema Treponema pallidumpallidum

Pneumocystis cariniiPneumocystis carinii

Tripanosoma cruziTripanosoma cruzi

Giardia lambliaGiardia lamblia

CITOMETRIA DE FLUXO

Citometria de FluxoSeparação de células marcadas por fluorescênciaAnticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou

Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferenteTeste qualitativo e quantitativo

CD 4

CD 18

CD 125

CD 147

CD4

CD8

CD20

Aplicações:

Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas

isolar populações celulares

distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag

o tamanho celular.

Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes

HIV , Leucemias

RADIOIMUNOENSAIO

Radioimunoensaio RIA

• Hormônio• proteínas séricas• drogas• vitaminas• Ac

0,0001 microgramas/ mLMoléculas marcadas com ISÓTOPO

Marcações:– I125: emite raios gama– H3: raios beta

Aplicações:Testes que necessitem de alta sensibilidade

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sanguePesquisaPesquisa de drogas na urina ou soro de atletas

FIGURE 6-9 A solid-phase radioimmunoassay (RIA) to detect hepatitis B virus in blood samples & A standard curve to determine the conc. of HBsAg in unknown serum.

5. 5. RadioimmunoRadioimmuno Assay Assay

- One of the most sensitive technique for measuring hormones, drugs, & vitamins at conc. Of<0.001 �/� first discovered by Dr. Berson & Yalow in 1960(1977 Novel prize to Yalow)

- The principle involves competitive binding of radiolabeled Ag and unlabeled Agto the limited supply of a high affinity Ab.

IMUNOHISTOQUÍMICA

WESTERN BLOTTING

7. Western blotting

: separates the components according to their molecular weight.

: the proteins in the gel are transferred to the sheet of nitrocellulose or nylon by the passageof an electric current.

: probed with Ab & then radiolabeled or enzyme-linked2nd Ab.

: a position is visualized by means of an ELISA reaction.

Western Blotting

• Eletroforese de proteínas• Diferença de tamanho (PM)• Mobilidade da proteína• Detecção Ag ou Ac

Western Blotting

Gelmembrana de transferênciapapel filtropreenchimentotela de suportetela de suporte

Gel/ membrana/ filtro

Tampão

( +)( - )

Separação e detecção de proteínas

• Identificação de Ac específico

Ac radiomarcado ou Ac sec. ligado a enzima