el genoma mitocondrial de la trucha arco iris
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UNiVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOQICASDEPARTAMENTOflE BIOQ*IIMICA Y EXOLOGIA MOLECULAR 1
genomamitocondrialde la truchaarcoir
Oncorhynchusmykiss
El trabajo de investigacióntitulado” El genomamitocondrialde
la trucha arco iris (Oncorhynchusmykiss)”presentadopor D. Rafael
Zardoya San Sebastiánpara optar al grado de Doctor en Ciencias
Biológicas, ha sido realizadoen su mayoría en el Departamentode
Bioquímicay Biología Molecular IV de la Facultadde Veterinariade la
UniversidadComplutensede Madrid bajo la dirección de los doctoresJosé
Manuel BautistaSantacruzy AmandoGarrido-Pertierra,conla excepción
del análisisdel RNA mitocondrial que se realizó en el Departamentode
Bioquímicay BiologíaMoleculary Celularde laFacultaddeVeterinariade
la UniversidaddeZaragoza,bajo ladireccióndeldoctorJulio Montoya.
Directores de la TesisDoctoral
Dr. D. JoséM. BautistaSantacruz Dr. D. AmandoGarrido-Pertierra
Doctorando
D. RafaelZardoyaSanSebastián
A mi familia, por suconstanteapoyo.A Mónica,por suentusiamoy estímulo.
ABREVIATURAS
Se hanempleadolos códigosaceptadospor la IUPAC paradesignar
los distintosnucleótidosy aminoácidos(una y tresletras).Los elementos
químicosse handesignadocon susrespectivossímbolosy las unidadesde
medida empleadascorrespondenal Sistema Internacional. Otras
abreviaturasconvencionalesutilizadasen estetrabajoson:
a. a.
ADP
ATP
ATPasa6y8
BSA
CBS
Col, llyIfl
Cytb
ddNTP
DUX)
D- Loop
DNA
dNTP
DTT
EDTA
FADH2, FAD
H
HSP
IPTG
L
[SP
kb
kDa
mRNA
mtDNA
Myr
Aminoácido
Adenosina5’-difosfato
Adenosina5’-trifosfato
Subunidades6 y 8 de la ATPasamitocondrial
Seroalbúminabovina
Bloquede SecuenciaConservada
Subunidades1, II y III de la citocromooxidasa
Citocromob
Didesoxinucleótido
Dihidrouridina
Bucle dedesplazamiento
Acido desoxirribonucleico
Desoxinucleotido
Ditiotreitel
Acido etilen-diamino-tetracético
Flavín-adeníndinucleótido(formas oxidada y
reducida)
Flavinmononucleótido
Cadenapesada
Promotorde la cadenapesada
Isopropil-B-D-tiogalactopiranósido
Cadenaligera
Promotorde la
Kilo (paresde)
Kilodaltons
RNA mensajeroDNA mitocondrial
Millones de años
cadenaligera
bases
NADH-1 a6y4L
Nicotinamida-adenín-dinucleétido(formasoxidada
y reducida)
Suhunidadesdela NADH deshidrogenasa
Nucleátido
Origendereplicaciónde la cadenapesada
Origende replicacióndela cadenaligera
Marco de lecturaabierta
UnidadTaxonómicaOperacional
Reacciónde la polimerasaen cadena
Acido ribonucleico
RNA ribosómico
Dodecilsulfatosádico
Secuenciaasociadaala terminacióndela
replicación
N,N,N’,N’- tetrametilen-etilen-diamina
RNA detransferencia
5-Br-4-CI-3-indolil-13-D-galactopiranósido
NADH, NADÉ
ND ó
nt
01W
OTU
PCR
RNA
rRNA
SDS
TAS
TEMED
tRNA
X-Gal
OBJETIVOS
La secuenciaciáncompleta de un genoma suele suponerun
considerableavanceen la informaciónquesetieneacercadedicho genoma
y los productosque deél se derivan, lo cual contribuyeenormementea la
caracterizacióny comprensiónde suestructuray funcionamiento.La idea
desecuenciarun genomaensutotalidades,por lo tanto, muy atrayente
desdeel puntode vista científico y los genomasmitocondriales,debido a su
reducidotamañoy rápidaevolución,son aun nivel modesto,los candidatos
idóneosparaestetipo de proyecto.
Con anterioridada este trabajo, aunque existía abundante
informaciónsobrelos genomasmitocondrialesde mamíferos,y en especial
del hombre, el conocimientode los genomasmitocondrialesde otros
vertebradosera muy limitado. Dentro de los vertebrados,los primeros
proyectos de secuenciacióncompleta de genomasmitocondrialesse
centraronen los mamíferos.La secuenciacióndel DNA mitocondrialde
Xenopuslaevis (Roe y col., 1985),demostróqueel genomamitocondrialde
los anfibiospresentabala mismaorganizaciónencontradaen mamíferos.
Sin embargo,en el año 1990, sesecuencióen su totalidadel mtDNA delpollo (Desjardinsy Morais, 1990), encontrándoseligeras diferenciasenel
ordendel los genesdentrodel genomamitocondrial.Este hecho,nos hizo
pensarquelos dos grandesgruposde vertebradosque aúnquedabanpor
investigar (peces y reptiles) podían presentarpeculiaridadesen la
organizacióndesugenomamitocondrial.
En estecontexto,nos decidimosa secuenciarel genomamitocondrial
de la truchaarco iris (Oncorhynchus mykiss)con el fin de ampliarel
conocimientoque se tiene sobre los genomasmitocondrialesa un nuevo
grupode vertebrados,los peces. Se eligió paraestetrabajola truchaarco
iris por estarconsideradaunmodelodeexperimentaciónen peces,tanto en
el aspectobioquímico como en el genético.Recientemente,y duranteel
transcursode estetrabajo,se han publicadolas secuenciascompletasde
los genomasmitocondrialesde dos ciprínidos, Crossostoma lacustre
(Tzengy col., 1992)y Cyprinuscarpio (Changy Huang,1994).
El presentetrabajo de investigaciónse ha dirigido hacia la
consecuciónde los siguientesobjetivos:
1.- Clonar y secuenciarel DNA mitocondrialde la truchaarco iris
con el fin de establecersu organizacióngenómicay determinarlas
peculiaridadesde los genescodificadospor él.
2.- Analizar y caracterizarel procesode transcripcióndel genoma
mitocondrialde la truchaarcoiris.3.- Establecer,a nivel molecular,las relacionesfilogenéticasde la
trucha arco iris con otros pecesy el resto de vertebrados,mediantela
elecciónde los genesmásapropiadosparaestefin.
INDICE
Página
1. INTRODUCCION.
1. LA MITOCONDRIA. ASPECTOSGENERALES.
1.1. Estructura. 112. Fisiología. 2
1.2.1.Cadenadetransporteelectrónico. 4
1.2.2. Fosforilaciónoxidativa. 7
1.3. Endosimbiosis. 8
2. EL DNA MITOCONDRIAL.
2.1.Organizacióndelgenomanútocondrial. 10
2.2. Replicación. 16
2.3. Transcripción. 18
2.3.1. RNAs mensajeros(mRNAs). 23
2.3.2.UNAs ribosómicos(rRNAs). 24
2.3.3.UNAs detransferencia(tUNAs). 24
2.4. El códigogenéticomitocodrial. 25
3. FILOGENL4 MOLECULAR.
3.1. Clasificación,evolucióny biologíamolecular. 293.2. Arbolesfilogenéticos. 33
3.2.1.Métodosdematricesde distancia. 34
3.2.2.MétododeMáxima Parsunoma. 37
3.2.3.Métododemáximaverosimilitud. 38
3.2.4.Eficienciarelativade los diferentesmétodos
deconstrucciónde árbolesfilogenéticos. 393.2.5.Margendeconfianzaestadísticadeun árbol
filogenético. 40
3.3. Estudiosevolutivos conDNA mitocondrial.Situación
actual. 41
II. MATERIAL Y METODOS.
1. MATERIAL.
1.1. Material biológico.
1.2. Productosquímicosy bioquumcos
1.3. Vectoresy estirpesbacterianas.
1.4. Equipoutilizado.
2. METODOS.
2.1.
2.2.
243.
Aislamientodemitocandrias.
ExtraccióndemtDNA.
CromatografíaenSephadex0-50mediante
centrifugación.
2.4. ExtraccióndemtRNA.
2.5. Cromatografía con oliga(dT) - celulosa.
2.6. DeterminaciónanalíticadeDNA y RNA.
2.7. Clonaje.
2.8. PCU.
2.9. Obtencióndecélulascompetentes.
2.10. Transformación.
2.11. Análisisderecombinantes
2.12.Extracciónde DNA plasmídica.
2.13. Marcajedesondas
2.14.TransferenciaamembranaehibridacióndelRNA.
2.15.Síntesisdeoligonucleátidos.
2.16. Secuenciaciónmanual.
2.17. Secuenciaciónautomática.
2.18. Análisis de secuencias.
III. RESULTADOS.
U EXTRACCION DEL mtDNA DE TRUCHAARCO IRIS.
2. MAPA DE RESTRICCIONDEL mtDNA DETRUCHA ARCO IRIS.
3. GENOTECASEco Rl, Hind III y Pvu II DEL mtDNA DE TRUCHA
ESTRATEGIADECLONAJE.
47
47
48
50
51.
51
52
53
53
54
55
55
56
56
57
57
59
59
60
60
61
62
64
64
66
4. SECUENCIADEL mtDNA DE TRUCHA ARCO IRIS. 68
5. ANALISIS DE LA SECUENCIADE LAREGION DE CONTROL<D-LOOPt78
6. ORIGEN DE REPLICACIONDE LA CADENA L. 827. ESTRUCTURASECUNDARIA DE LOSRNAs DETRANSFERENCIA. 82
8. GENESCODIFICANTESDE PROTEíNAS.8.1. Código genéticoy usode codones. 85
8.2. Análisis deproteínas. 94
9. EXTRACCION DE mtDNA DETRUCHA ARCO IRIS. 102
10. IDENTIFICACION DE LOS DIFERENTESmtRNAs. 102
11. ANALISIS FILOGENETICO. 107
11.1. Análisis enfuncióndel genrRNA 12S. 108
11.2.Análisis en funcióndel gendel citocromob. 109
IV. DISCUSION. 114
V. CONCLUSIONES. 128
VI. APENDICES 130
VII. BIBLIOGRAFIA. 133
INTRODUCCION1
Introducción! 1
1. LA MITOCONDRIA ASPECTOSGENERALES
1.1. Estructura.
La mitocondria es un orgánulocitoplasmáticocaracterísticode
célulaseucariotas.En generaltieneun diámetroaproximadode 0.5 ~.ty una
longitud variableentre 1 y 7 g. Su forma más habitual es filamentosao
granulary en el casoconcretode hepatocitosdepeces,varía enfunción del
estadonutricional de la célula; así, tras la ingestión de alimentos,las
mitocondrias,normalmentefilamentosas,adoptanun aspectovesicularque
al cabo de 48 horas revierte a la forma original. Su distribución en el
citoplasmaesuniformey sunúmerodependedel tipo celulary de la especie.
En levadurassólo se encuentrauna mitocondria por célula (Hoffman y
Avers, 1973) mientrasqueen un hígadode rataexistenentre1000 y 1.600
mitocondriasporcélula(Loud, 1968).
Al microscopioelectrónico,mediantetécnicasde criofractura, se
puede observarque cada mitocondria está formada por una matriz
mitocondrialrodeadapor dos membranas(internay externa)de 60 A de
espesor,separadasentresí porun espaciointermembranal.La membrana
interna se caracterizapor presentarunos plieguesorientadoshacia el
interior (crestasmitocondriales)de las que sobresalenhacia la matriz
mitocondrialunaspartículasesféricasde85 A dediámetrodenominadasF1.
(Fig. 1).
R.boSOrfl~
Figura 1. Esquemade la estructura de una mitocondria. (De Robertis y De
Robertis, 1984).
Introducción! 2
La membrana mitocondrial externa contiene un 40% de lípidos
(principalmentefosfolípidosconcadenasdeácidosgrasosmuy insaturados)
y un 60% deproteínas,entrelas quecabedestacarla acil-CoA sintetasa,la
NADH-citocromo c reductasay la monoaminooxidasa;estaúltima es
exclusivade estamembrana,por lo queseutiliza amenudocomomarcador
de la fracciónmitocondrial. En general,la composicionde la membrana
mitocondrialexternaessimilar a ladel retículoendoplásnúco.
La membranamitocondrialinternaestáconstituidapor un 20% de
lípidos, siendoel 80%restanteproteínas.La composiciónlipídica es muy
particularpuestoque no contienecolesterol,y el 20%de los fosfolípidosson
cardiolípidos.Este tipo de composiciónes tambiéncaracterísticade la
membranaplasmáticade bacteriasy de los tilacoidesde los cloroplastos.
Las proteínasincluidasenla membranainternason,esencialmente,todos
los complejos enzimáticosque constituyentanto la cadenarespiratoria
(NADH-ubiquinonareductasa,succinato-ubiquinonareductasa,ubiquinol-
citocromo C reductasa,y citocromo O oxidasa) como el sistemade
fosforilación oxidativa (ATP sintetasaF1F0), ademásde laglicerolfosfato
deshidrogenasay variostransportadores(fosfato,malatoaspartato,ADP y
ATP).
El espaciointermembranacontienevarias enzimas,de las que la
más importantees la adenilatoquinasaque participa en la síntesisdel
ADP, coenzimaintermediariode la fosforilaciónoxidativa.
Finalmente,la matriz mitocondrial contiene todas las enzimas
solublesdel ciclo delos ácidostricarboxilicos,las enzimasinvolucradasenla13-oxidaciónde los ácidosgrasos,asícomolas enzimasnecesariaspara la
síntesisde proteínasa partir delDNA mitocondrial.Además,tambiénse
localizanen la matriz, el DNA mitocondrial, diferentesRNAs y los
mitorribosomas.
1.2. Fisiología.
Cadauno de los compartimentosde la mitocondriarealizafunciones
concretasy coordinadascon otros compartimentos,tanto mitocondriales
como citoplasmáticos.La mayorpartede las funcionesmitocondrialesson
Introducción! a
altamenteespecíficasde este orgánulo,siendolas más características
aquellaslocalizadasenla matriz mitocondrial (descarboxilaciónoxidativa
del ácido pirúvico, ciclo de Krebs, fi-oxidación de ácidos grasos)y en la
membranamitocondrial interna (transportede electronesal oxígenoy
fosforilaciónoxidativa).
La cadena respiratoria utiliza como sustratos donadoresde
electroneslos coenzimasNADH y FADH2. Estossustratosson generados
por oxidacióndecompuestosreducidos(sustratosrespiratorios)mediantela
acción de deshidrogenasaslocalizadasgeneralmenteen la matriz
mitocondrial(Fig. 2).
Glutamata OH 3-Hidrcxiacil-CoA DH3-hidroxiacil 3-oxoacil
glutamato a-cetoglutarato CoAy) y)
Succinij-coA sintetasa
a-cetog¡uwrato suocinil-CoA
y)* NADH+H’
malato oxalacetato ¡socitrato cx-cctoglutarato piruvato Acetil-CoA 13-hidroxibutirato Acetoacetato
Malata OH Isacitrata OH Piruvata OH Ildfidroxihutirato Dli
> FADH2
a-ghcero¡ dihidroxiacetona
fosfato fosfato
a-GIiceroI fosfato Dli
acil-CoA enoil-CoA
AciI-CaA OH
succinato furnarato
Succinata OH
Figura 2. Principales reaccionesde deshidrogenaciónde los sustratos
respiratorios.
Adicionalmente,los equivalentesde reduccióndelNADH de origen
citosólico son transportadosal interior de la mitocondria para su
incorporacióna la cadenade transporteelectrónicomediantesistemasde
NAD +
FAD
Introducción! 4
lanzadera.Sehanidentificadodostipos de lanzaderaespecíficosde tejido: la
lanzaderact-glicerol-fosfatoque es activa en mitocondriasde cerebroy
músculoesqueléticoy la lanzaderamalato-aspartato(Fig. 3) quees activa
en hígado,riñón y corazón.La primera transfierelos equivalentesde
reduccióndel NADH al FAD, mientrasquela segundalo haceal NAD~.
cITOSOLmembranainterna MATRIZ
malatoNAD~
malato
NADH + it oxalacetato
glutamato
aspartato
aspurtatoaminotrans tarasa
malato NAO~
malatoDII
oxalacetato NADH +
aspartataaminotransftrasa
Figura 3. La lanzadera malato-aspartato. El NADH citosólico cedesus
equivalentesde reducción al oxalacetatopor acción de la malato deshidrogenasa
citoplasmática.Se forma así, malato que atraviesala membranamitocondrial interna
medianteel antiportea-cetoglutarato/ malato. La malato deshidrogenasamitoeondrial
convierteel malatode nuevo en oxalacetatoformándoseen el procesoNAiDH a partir de
NAD~. Reaccionesde transaminaciónconviertenel oxalacetatoen aspartatoque puede
salir al citosol medianteel antiporte glutamato¡ aspartatoy de nuevo en oxalacetato
cerrándoseasí el ciclo.
1.2.1.Cadenade transporte electroníco.
La energíaliberadapor la cadenarespiratoriapuedecalcuilarsecon
la ecuaciónLXG0 = - n -? AE0’ siendon el númerodeelectronestransferidos,
aspartato
It
Y’ la constantede Faraday(23 kcal/V’mol) y zXE0’ , la diferenciaentreel
Introducción! 5
potencialestándardel parredoxdadorde electronesy el aceptor.Por lo
tanto, la variación de energíalibre estándarentre los pares redox
NADH/NAD~ <Eo’=- 0.32V) y FADW/FAD (E0’=- 0.06y) y el parH20/02
(E0= + 0.82V) sera:
NADH/NAD+ AG0t = - 2 23 (0.82 - (- 0.32))= - 52.4kcal/mol.
FADHJFAD A00’ = - 2 23 (0.82 - (+0.03))= - 36.3 kcal/mol.
Si setieneen cuentaquela formacióndecadamoléculade ATPenla
fosforilación oxidativa consume 7.3 kcal/mol, es posible predecir la
fonnaciónde dos moléculasdeATP por cadamoléculadeFADH2 queentra
enla cadenade transporteelectrónico,o biendetres moléculasdeATP por
cadamoléculadeNADH.
Los componentesde la cadenatransportadorade electronesse
organizanencuatrograndescomplejosenzimáticos(Fig. 4):
- 1. NADH-ubiquinonareductasa(850 kDa). DenominadatambiénNADH deshidrogenasa,transfierelos equivalentesde reduccióndesdeel
NADH hastala ubiquinonao coenzimaQ quesereduceaubiquinol. Este
complejo está formado por una fracción proteicahidrofóbica y una
hidrofílica. Los polipétidos hidrofóbicos son codificados por genesmitocondrialesy por genes nucleares,mientras que los polipéptidos
hidrofílicos son codificadosexclusivamentepor genesnucleares. Este
complejo contieneentre5 y 7 centrosferro-sulfuradosy parael transporte
de electronesutiliza como grupo prostéticoal mononucleótidode flavina
(FMN).
- II. Succinato-ubiquinonareductasa(97 kDa). Transfiereelectrones
desdeel succinatohastala ubiquinona.Paraello, cuentacon un grupo
prostéticoFAD, un citocromob y 3 centrosferro-sulfurados.
- III. Ubiquinol-citocromoc reductasa(280 kDa). Este complejosirve
de confluenciaa los dos anteriores.La oxidacióndelubiquinol le permite
reducir el citocromo c. Como centrosredoxcontiene el citocromob, un
Introducción! 6
centro ferro-sulfrradoy el citocromo cl. De los 9 ó 10 polipéptidosque
contieneestecomplejo, sólo el citocromob es codificado por el genoma
mitocondrial.
- IV. Citocromocoxidasa(600kDa). Transfierelos electronesdesdeel
citocromo c reducido(Fe3~) hasta el oxígeno. Para ello cuentacon un
citocromoespecíficodenominadoaa3 quecontiene,ademásde dos grupos
hemo,dos átomosde cobre.
Dentro de cadacomplejo los centros redox presentanvalores de
potencialestándarsimilares,por lo que la transferenciade electroneses
reversible,y por tanto la liberaciónde energíaes mínima.Sin embargo,en
tres puntos de la cadena respiratoria (complejos 1, III y IV), la
transferenciade electronesentreungrupo isopotencialy otro, suponeuna
variación en la energíalibre estándarsuficiente como para bombear
protonesdesdela matriz mitocondrial hastael espaciointermembranal
(Hatefi, 1985).
Succinato Fumarato
‘—1 + 0.03V
[¿s ComplejoII
NADE ComplejoIII ComplejoIV, 02II 12+VQ—*. Cytb,Fe-S,c1—~
NAD 1420
-032V +009V +026V •h-~ +082v
Figura 4. Cadenade transporte electrónico. En la figura se destacanlos
componentesde cadauno de los cuatrocomplejosrespiratorios,los potencialesredox
entre complejos y los sitios de conservaciónde la energía representadospor la
traslocaciónde protones.Mientras la oxidación del NADE es capaz de bombeartres
protonesal espaciointennembranal,la oxidación del FADH2 sólo permitela traslocación
de dos.
Introducción! 7
1.2.2.Fosforilaciónoxidativa.
De acuerdocon la teoría clásica que explica el mecanismode
fosforilación oxidativa, en la membranamitocondrial interna existenbombasde protonesqueutilizan la energíalibre proporcionadapor el flujo
electrónicoatravésde la cadenarespiratoriaparatransportarH~ haciael
espaciointermembranagenerandoun gradienteelectroquímicodeprotones.
La vueltade estosionesH~ ala matriz mitocondrialatravésde un canal
específicoenla ATP sintetasaF1F0 provocala síntesisacopladadeATP a
partir deADP y fosfato (Mitchell, 1979).
La ATP sintetasaF1F0 es una enzimapolipeptídica con dos
funciones:unahidrolítica (ATPasa)y otrasintética(ATP sintetasa).En su
estructurasedistinguendos componentes:
- F1. Es una proteínaperiféricade 5 subunidadescon la siguiente
estequiometría:a3, 13a, y, a, ~. Las tres subunidadescx seintercalanentre
las tres subunidades13 formandoel centroactivo del complejoenzimático.
Sólo las subunidades13 o bien las interfasesct/B están directamente
implicadasen la catálisisde las reaccionesde síntesiso degradaciónde
ATP. La subunidady forma partedel canalde protonesimplicado en el
acoplamientoenergético.Las subunidades5 y ~ participanen la unión
adecuadaanivel estructuralde los componentesF1 y F0.
- F0. Es unaproteínaintegralde la membranamitocondrialinterna
con, al menos,3 subunidades(6, 8 y 9) encargadasde formarel canalde
protones.Lassubunidades6 y 8 soncodificadaspor genesmitocondriales.
La reacciónde síntesiso hidrólisisde ATP en el centrocatalíticodel
componenteF1 es independientede la existenciao no de un gradiente
electroquímicode protones.Se suponeque la energíalibre del gradiente
electroquímicode protoneses utilizada para liberar los nucleótidosque
permanecenfuertementeunidosal centro catalíticotrasla reacción.Los
Introducción! 8
protones,a su pasopor el canal de la ATP sintetasa,provocaríanun
cambioconformacionaly deafinidadenel centrocatalítico.
1.3. Endosimbiosis.
De acuerdoconla teoríaendosimbióticasobreel origeny evoluciónde
las célulaseucariotas( Taylor, 1974; Margulis, 1981), al menostres clases
de orgánuiloscelulares,las mitocondrias,los cilios y los cloroplastos,fueron
originalmentebacterias libres que se asociaronde forma estable y
secuenciala procariotashospedadorespara dar lugar a los organismos
eucariotasprinrigenios.Estasbacteriaslibres, ya habíandesarrollado,con
anterioridada la cooperaciónsimbiótica, capacidadesespeciales
(respiraciónaerobia,fotosíntesiso motilidad) que complementabanlas
adquiridas por las bacterias hospedadorasmenos especializadas
(resistenciaa altas temperaturasy medios ácidos)aumentandoasí la
eficaciade la nuevaasouacion.
En el casoconcretode la simbiosisnúcleo/citoplasma-mitocondria,el
primero aportabaun metabolismofermentativode los azúcaresy unas
proteínas, las histonas, que protegían al DNA de las condiciones
ambientalesde acidez y alta temperatura;la segundaaportabala
capacidaddedegradarcompuestosdetresátomosde carbono,productode
las fermentaciones,en dióxido de carbonoy agua,con el consiguiente
aprovechamientoenergético.El organismoprocariotadevida libre quedió
origena la mitocondriadebióserunaeubacteriagram-negativa,aeróbica,
queconteníalas enzimasdel ciclo de los ácidostricarboxílicos,y el sistemade citocromosnecesariopara la total oxidación de los carbohidratos,
posiblementemuy similar aParacoccus denitrificans (Johny Whatley,
1975). Por el contrario,el hospedadordebió serun organismoúnicamente
capazde fennentarla glucosaa piruvatede forma anaeróbicaatravés de
la rutade Embden-Meyerhof,del tipo de Thermoplasmaacidophilum
(Searcyy col., 1978).
El establecimientodecomunidadesdeprocariotassimbiontesquedió
origen a las primerascélulaseucariotasse debióproducir a finales del
precámbrico(hace 1 billón deaños),duranteo despuésde laacumulación
Introducción!9
oxígenoenla atmósfera,encondicionesdealtatempertura,mediosácidosyescasez de nutrientes. La temprana simbiosis nucleocitoplasma-
mitocondriaexplicaríala existenciade mitocondriasen todo los phyla
eucarióticosprotistas, hongos,plantas y animales,mientras que la
adquisiciónposteriorpor parte de sólo algunossimbiontesde protistas
fotosintéticos,origende los plastos,explicaríasu adscripciónexclusivaa
algasy plantas.Las ventajas resultantesde la asociación oportunistaentre
procailotas se acrecentaronporla progresivaespecializaciónfuncional de
cada componente,que culminó en el establecimientode una simbiosis
obligada. De hecho, excepto en algunaslevaduras,en ningunacélula
eucariotasepuedeinducirla pérdidade mitocondriasy recíprocamente,las
mitocondriasno puedensobrevivirdeforma autónomadebidoaquemuchos
de sus componentesson productode la expresiónde genesnucleares,
incluidaslas enzimasresponsablesde la expresiónyregulaciónde los genes
mitocondriales(Attardi y Schatz,1988).
Aunque los simbiontesobligadostiendenarelegarmuchasde sus
funciones(sobretodo las dispensableso las redundantes)enel hospedador,
la mitocondriaaún conservafuncionesy rasgospropiosque sugierensu
origen procariótico. Así, cabe destacar,que su DNA no está unido a
histonas, su síntesisproteica es sensible a antibióticos bacterianos
(estreptomicina,cloranfenicol)pero no eucarióticos (cicloheximida),la
síntesisde DNA serealizaalo largode todoel ciclo celulary no sólo en la
faseS, la herenciano es mendelianaen eucariotasmeióticos,y finalmente
su membranainternatieneunacomposiciónmuy similar a la membrana
plasmáticabacteriana.
Aunquela teoríaendosimbióticaresultamuy atractivaparaexplicar
el origendelascélulassucariotas,no esla única.De acuerdoconla teoríade
la filiación directa (Cavalier-Smith,1975; Reijnders,1975; Taylor, 1976)
algunasbacteriasfotosintéticasdieron lugar a algasy eventualmentea
plantas;algunasalgasperdieronsusplastosy evolucionaronparadarlugar
a los antepasadosde hongosy animalessiendo,tanto los plastoscomo
otros orgánuloseucanoticos,originadospor diferenciacióny especialización
dentrodelascelulas
Introducción! 10
2. EL DNA MITOCONDRIAL.
2.1 Organizacióndelgenomamitocondriail.
La mitocondriaposeeun genomapropio que se caracterizapor su
replicaciónautónomadentrodel orgánulo.El genomamitocondrialestá
constituidoporun DNA dedoblecadena,circulary covalentementecerrado
con un tamañorelativamenteconstanteen todaslas especiesanimales
estudiadasde alrededorde 16000 pb. El DNA mitocondrial(mtDNA)
codifica para3 subunidadesde la citocromocoxidasa(COl, COII y COIII),
7 subunidadesde la NADH deshidrogenasa(ND1 a ND6 y ND4L) el
citocromob dela citocromoc reductasa(Cyt b) y lassubunidades6 y 8 del
componenteF0 de la ATP sintetasa(ATPasa6 y 8). Además,contienela
informaciónnecesariaparala síntesisde 22 tRNAs y 2 rRNAs(12Sy 16S)
implicadosen la traducciónde los mensajerosexpresadospor el genoma
mitocondrial(Andersony col., 1981; Chomyny col. 1985). El resto de las
proteínas presentesen la mitocondria (DNA y RNA polimerasas,
aminoacil-tUNA sintetasas,las proteínasribosomales,y las enzimasde la
matriz, las membranasmitocondrialesy el espaciointermembranal)son
codificadasporel genomanuclear.
La organizacionde los genomasmitocondrialesde los eucariotas
superioreses extremadamenteeconómica(Attardi, 1985). Los genesquecodificanpara los 22 tUNAs seencuentranintercaladostanto entrelos
RNA ribosomalescomo entre los genesque codifican para proteínas,
fiimcionando probablementecomo señalespara el procesamientode los
tránscritosprimariospor RNasasespecíficas(Ojala y col., 1981 a). Conla
excepciónde la región de control, que contiene el denominadobucle de
desplazamiento(D-loop), existenmuy pocosnucleótidosno codificantesy
aparentementeningúnintrón (Andersony col., 1981; Bibb y col., 1981).
Hastala fecha,dentro de los vertebradossuperioresseconocenlas
secuenciascompletasdelDNA mitocondrialdenuevemamíferos:hombre
(Andersony col., 1981), ratón(Bibb y col., 1981), vaca (Andersony col.,
1982), rata (Gadaletay col., 1989),rorcual comun (Arnasony col., 1991),
foca común(Arnasony Johnsson,1992),focagris (Arnasony y col., 1993),
Introducción! 11
rorcualazul(Arnason,1993)y la zarigúeya(Jankey col., 1994);un anfibio,
Xenopus laevis (Roey col., 1985>; dosteleósteos,Crossostomalacustre
(Tzengy ccl., 1992)y la carpa(Changy Huang, 1994> y un ave, el poíío
(Desjardinsy Morais, 1990). De todasellas,conexcepciónde ladelpollo, se
deduceunaorganizacióngenómicaidéntica( Fig. 5).
El DNA mitocondrialde pollo presentaunaorganizacióngenómica
ligeramentedistintade la descritaparamamíferos,anfibios y peces.La
principal diferenciaresideenquelos genesquecodificanpara el tRNAGlu y
la subunidad6 de la NADH deshidrogenasa(ND6) se encuentran
localizadosinmediatamenteadyacentesa la regiónD-loop y no al ladodel
citocromob comoocurreen el restodevertebrados.Además,los genesque
codifican para los tUNAs de prolina y treonina y el citocromo b se
encuentraninmediatamentedespuésdelgendela subunidad5 de la NADH
deshidrogenasa(ND5), mientrasqueenel restodevertebradosaparecenal
lado delD-loop (Fig. 6>. Estaorganización,aparentemente,esel resultado
de unatransposiciónde un segmentode mtDNA quecontendría,bien los
genesdel tRNAGlu y ND6, o bien los genesquecodificanpara tRNAPro,
tRNA Thr y Cyt b. Aunque no se conocenlos mecanismosmoleculares
implicadosen estareorganización,parececlaro por la cotransposiciónde
tUNAs con los genesque codifican para proteínasy la cercaníadel
segmentotranspuestoa la región del D-loop, que los tUNAs podrían
funcionarcomo señalesde duplicaciónacopladasala replicación,tal como
sehadescritoen el DNA mitocondrialdealgunoslagartos(Moritz y Brown,
1987).
Dentrode los invertebradosseconocenlas secuenciascompletasdel
DNA mitocondrialde la moscadela fruta (Clary y Wolstenholme,1985),
dos especiesde erizode mar (Jacobsy col., 1988;Cantatorey col., 1989),
dos nematodos(Okimoto y col., 1992), la abeja(Crozier y Crozier, 1993) y
Artemia franciscana (Valverde,1993).
El mtDNA de las dos especiesde erizo de mar secuenciadas
(Strongylocentrotuspurpuratusy Paracentrotus liv idus), presenta
unaorganizacióngenómicamás económica,incluso, quela descritaen
vertebrados,de la quesededucela necesidadde procesosderegulaciónpost-
transcripcionalde los genes(Fig. 7). Sólo una minoríade los tRNAs se
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Introducción! 13
encuentraseparandogenescodificantesdeproteína.Los posiblesorígenes
de replicacióny transcripciónseencuentranen unaregión no codificante
formadaporel agrupamientode 15 tRNAs. La posiciónde los genesND4Ly 16S rRNA está alteradacon respectoal mtDNA de vertebrados,
imponiendo la separaciónde los genes para rRNA un sistema de
transcripciónespecífico.
Los dos nematodos(Caenorhabditis elegansy Áscaris suum)
presentanun mtDNA con un tamañode,aproximadamente,14000pb. Se
diferencianúnicamenteen la posiciónrelativa de una región rica en
adeninasy timinas que posiblementecontiene el origende replicación.
Existe unaregión no codificanteentrelos genesND4 y COl, con capacidad
de formar un bucle por lo que, potencialmente,podríarepresentarun
segundoorigen dereplicación.Todos los genesson transcritosen la misma
direcciónadiferenciadelo queocurre envertebradosy equinodermos.Otra
particularidadde estosgenomases el hechode queno se ha encontradoningunaregiónquecodifiqueparala subunidad8 dela ATPasa(Fig. 7), lo
cual sugiereque, bien estegen codifica parauna subunidadque no esindispensableparael funcionamientode la ATPasa,o bienen nematodos
estegenseencuentralocalizadoenel núcleo.
Los mtDNAs de los dos insectos (Drosophila yakuba,Apis
mellifera) y el crustáceo (Artemia franciscana) presentanuna
organizacióngenómicasimilar entreellos diferenciándoseúnicamenteenla
posición de algunos tRNAs (A. franciscana y D. yakuba sólo sediferencianenla posiciónrelativadel tRNAGln y el tRNAIIe, mientrasque
entre los dos insectoshay 11 tRNAs en posición diferente).Ha sido
identificadoun único origen de replicación,localizadodentrodeunaregión
rica en adeninasy tñninas.Aunquecontienenlos 22 tRNAs, los dosrRNAsy los 13 genes codificantes de proteínasdescritosen vertebrados
superiores,sudisposiciónen el genomamitocondrialessignificativamente
distinta(Fig. 8).
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Introducción! 16
2.2. Replicacion.
Las dos cadenasque constituyenla molécula de mtDNA se
denominanpesada(II) y ligera(L) en función desu densidadrespectivaen
un gradientede cloruro de cesio. En vertebradossuperiores,el origendereplicaciónde la cadenapesadadel DNA mitocondrial (OH) se localiza
dentrode la regiónD-Loop, quesedenominaasi,por contenerunacadena
pesadanacientecuyo extremo 5’ estálocalizadoen dicho origen, y suextremo 3’ en las regiones TASs que se encuentranasociadasa la
terminaciónprematuradel ciclo replicativo (Doday col., 1981). Estacorta
cadenaes muy inestablepresentandoun recambiomuchomayorque el
ritmo dereplicacién(Clayton, 1982) . El origendereplicaciónde la cadena
ligera (OL) estápresenteen todoslos vertebradosexceptoen el poíío. Se
localizadentrodeun grupode cinco tRNAs entre los genesND2 y COl y
esta constituidopor unos 30 nucleótidoscon la capacidadde formar un
bucle relativamenteestable.Estacapacidadestáconservadaen el mtDNA
de todoslos vertebrados,aunquevaríela secuencianucleotídicadelorigen
de replicación. En el caso del mtDNA de polío, no existe 0L, pero se
mantienela organizaciónde cinco tRNAs en estaregión,por lo que seha
sugeridoqueéstospuedenteneralgunacaracterísticaestructural(como
seríala capacidaddeformaciónde un bucle)queles permitiríasustituira
0L (Desjardinsy Morais, 1990).
La replicacióndel mtDNA comienzasiempreen 0H• La elongación
completade la nuevacadenapesadaprovocala exposiciónde la región0L
en la cadenapesadaparentaldesplazada,lo que permiteel comienzode lareplicaciónde la cadenaligera. El inicio de la replicaciónen 0H requierela
síntesisdeRNA a partir del Promotorde la CadenaLigera (LSP)paraque
actúecomo cebadordel procesoreplicativo. Latransicióndela síntesisde
RNA a la síntesisde DNA seproduceen unaregióncon varios Bloquesde
SecuenciaConservada(CSBs)entre especies(Fig. 9). EstoselementosCSB hansido ampliamenteestudiadosen el hombrey el ratón(Walbergy
Clayton, 1981)presentandoelementoscaracterísticosqueson reconocidos
por laenzimanuclearRNasaMRP (procesadorade mtRNA) encargadade
Introducción! 17
generarextremos 3’-OH en el mtRNA que puedan ser extendidos
posteriormentepor la polimerasademtDNA (Changy Clayton,1989).
int{1’F1 RNA polimerasa
CSBs
Transcripción
RNA — ~ Replicación
Figura 9. Diagrama generalcon los componentesesencialesdel D-loop
del mtDNA de vertebrados.(Clayton, 1991). La línea discontínuarepresentala
síntesisde RNA a partir del promotor de la cadenaligera (ISP) y la línea continuala
síntesisde DNA a partir de RNA sintetizadoen el mismo promotor.Ambas moléculas
tienen como molde la cadenaligera y por lo tanto poseenla secuenciade la cadena
pesada. La transición RNA/DNA en la replicaciónde la cadenapesadase produce a
nivel de los tresbloques de secuenciaconservada(CSBs).0H es el origende replicación
de la cadenapesada. La RNA polimerasamitocondrial se representaunida a los
promotoresde la cadenapesaday ligera (HSPy LSP). así mismo, se indican los sitios
de unión al factor de transcripciónmtTFl y la regionesasociadascon la terminación
prematurade la replicaciónde la cadenapesada(TASs).
De formasimilar en 0L tambiénseinicia la replicaciónapartir deun
cebadorde RNA. Se ha demostradola existenciade una primasade
mtDNA capaz de reconocerun bucle rico en timidinas y comenzarla
síntesisde RNA (Wong y Clayton, 1985). A continuación,en la baseno
apareadadelbucle, seproducela transiciónenla síntesisde RNA a DNA
enun pentanucleótido(5-GCCGG-3’) situadodentrodelgenquecodificapara
el tRNACs’s (Hixsony col., 1986)(Fig. 10).
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Pro TASs [ISP HSP Phe
RNA4-
Introducción!18
SíntesisRNA
TAAA
A
3 5’
Figura 10. Esquemadel inicio de la replicacién en 0L• (Clayton, 1991)
UnamtDNA primasainicia la síntesisde RNA apartir deunaregión rica en timidinas
localizada en un bucle. La transicióna DNA se produceen la base del bucle en una
región cuyasecuenciaen el mtDNA humanoes 5’ GCCGG 3.
La elongacióny maduraciónde lascadenasUy L esrealizadapor la
polimerasade mtDNA o DNA polimerasay Estaenzimahasidopurificada
en Drosophila melanogaster(Wernettey Kaguni, 1986) y Xenopus
laevis (Insdorfy Bogenhahen,1989 ay bit El holoenzimaconsisteen una
subunidadcatalíticade 125-140kDay, al menos,unasubunidadde 35 kDa
defúnción aúndesconocida.Esteenzimapresentaasociadaunaactividad
exonucleasa 3’-5’ que le confiere capacidadcorrectoray una fidelidad
similar ala de la DNA polimerasaanuclear(Wernettey col., 1988).
2.3. Transcripción.
En vertebradossuperiores,las dos cadenasdel mtDNA se
transcribencompletamentey los precursorespolicistrónicosformadosson
procesadosdandolugaralasdiferentesespeciesdeRNA. La transcripción
de los genesque codificanparalos tRNAs defenilalanina,valina, leucina
SíntesisDNA
Introducción! 19
(UUR y CUN), isoleucina,metionina, triptofano, ácido aspártico,usina,
glicina, arginina,histidina,serna(AGY) y treoninaserealizaa partir de la
cadenapesada,mientrasquela de los quecodifican paralos tRNAs deglutamina, alanina,asparagmna,cisteina,tirosína, serna(UCN), ácido
glutárnicoy prolinaserealizaapartir de la cadenaligera.Los dos genesque
codificanparaRNA ilbosomaly todoslos genescodificantesde proteínasa
excepciónde ND6, setranscribenapartir dela cadenapesada.El comienzo
del gen ATPasa6 solapacon el final delgenATPasa8, y lo mismoocurre
conlos genes ND4L y ND4. En amboscasos,sólo se observaun tránscrito
a partir del mtDNA (Ojala y col., 1980) por lo que se cree que el
procesamientode cadapar de genesse deberealizarpor traducción en
diferentefasedelectura.
Cadauna de las cadenasdel mtDNA cuentaen el D-loop con su
propiopromotorparainiciar la transcripción(Fig. 9), estandoel promotor
de la cadenapesada(HSP) localizadocercanoal extremo5’ del gen 12S y
separado150 nucleótidosdel promototde la cadenaligera (LSP) (Montoya
y col., 1982; Changy Clayton, 1984). Estos promotoresconsistenen
secuencias de, aproximadamente,50 nucleótidoscon, al menos, dos
dominiosfuncionales;uno,en el quela polimerasade mtRNA iniciaría la
transcripción y otro, situadoen posición5’ con respectoal primero (-12 a
-39), que mejoraría la eficiencia de la iniciación al ser un elemento
reconocidopor el factordetranscripcióndenominadomtTFl. Estefactorha
sido purificadoenel hombre( Fishery Clayton, 1988)y el ratón(Fishery
col., 1989) y se ha descritounaproteínahomólogaen levadura(Fishery
col., 1991). En el hombre,el mtTFl estáformadopor 204 aminoácidos,
tiene un carácterglobal básico,y escapazde desenrollary curvar el DNA
(Parisiy Clayton, 1991). Estefactor seuneconmayorafinidad a LSP que
a HSP, estandolas dianasparaestefactor, invertidasunacon respectoa
la otra en estospromotores,lo que sugierequeel mtTF1 puedefuncionar
bidireccionalmente.
Granpartede los 16S rRNAs analizadospresentanun extremo3’
quese localizadentro del tRNALeu adyacente(Dubiny col., 1982) y por lo
tanto no provienendel procesamientodel RNA policistrónicosino de un
procesotranscripcionalseparado.Parececlaroque, la transcripciónde la
Introducción!20
cadenapesadaserealizaendos unidadesde transcripcióndistintasdebido
a la existenciadeun segundopuntodeiniciaciónen estacadena(Montoyay
col., 1983). Estesegundopromotorseñael responsablede la transcripción
de los dos rRNAs y se localizaría 16-19 nucleótidospor delantedel
tRNAPhe. Por otro lado,se haidentificadola secuencia5’-TGGCAGAGCC
CGG-3’ como responsablede la terminaciónde la transcripciónde los
rRNAs (Christiansony Clayton, 1988; Stauby Castora,1993) y se ha
sugeridoqueactuaríacomodianade un factor que, al unirse,impediríael
avancedela polimerasademtRNA (Hessy col., 1991).En cuantoal procesamientodel RNA policistrónicocodificadopor la
cadena pesada,se efectúa mediantecortes endonucleolíticosen losextremos5’ y 3’ de los tRNAs por la actividadRNasaP (Doerseny col.,
1985). En general,se consideraquelas enzimasprocesadorasde tRNAs
reconoceríanmotivos de estructurasecundariay terciaria, en vez de
secuenciasprimariasespecíficas.Ello justificaríael procesamientode los
genesATPasa6 y COIiI, quesonlos dos únicosno separadospor un tRNA,
y que,por lo tanto,debenteneren la regióndeunión,la capacidadde formar
un bucle susceptiblede sercortadopor RNasasespecíficas(Bibb y col.,
1981).Por otro lado, la trancripciónde los genescodificadospor la cadenaligera se realiza tambiéna través de la formación de un mensajero
policistrónicomenosestableque,posteriormente,esprocesado(Gelfandy
Attardi, 1981).
Los productosde transcripcióndel genomamitocondrial fueron
inicialmenteidentificadosy caracterizadosencélulasHeLa(Amalric y col.,
1978; Montoya y col., 1981; Montoyay col., 1983).Las diferentesclasesde
RNAs producidospuedenserseparadasmediantecromatografíaa través
de una columnade oligo(dT)-celulosaen dos fracciones,segúnseano no
poliadenilados.Las especiesque componencadaunade estasfracciones
pueden,a su vez, serseparadaspor electroforesisen gelesde agarosacon
hidróxido de metilmercurio como agentedesnaturalizante(Bailey y
Davidson, 1975; Montoyay col., 1983; Fernández-Silvay col., 1992). De
estaforma sehanidentificadoen célulasHeLahasta18 especiesde RNAs
poliadeniladosy al menoscinco no poliadenilados(Tabla1). Los productosno poliadeniladossonel rRNA 12S, el rRNA 16S, el RNA 4a, el RNA 75 y
Introducción! 21
los tRNAs. Los 18 productos poliadeniladosse numeran en orden
decrecientedepesomolecular.Los RNAs 1,2,3 y 18 estáncodificadospor la
cadenaligeray el restopor la cadenapesada.Su posterior secuenciación(Montoya y col., 1981; Dubin y col., 1982) permitió elaborarun mapa
detalladodela transcripcióndelgenomamitocondrial de célulasHeLa (Mg.
11).
El RNA 4a esel precursorde los dos RNAs ribosómicos(Montoyay
col., 1983).Suextremo5’ estálocalizadounos19 nucleótidospor delantedel
gen para el tRNAPhe y por lo tanto provienede un acontecimientode
transcripcióndiferente al del resto de RNAs. Este RNA se acumula
solamenteen condicionesen las que el procesamientoestá disminuido
(Montoya y col., 1983). Se ha sugeridoque el RNA 78 (al menosen células
HeLa) debeactuarcomo cebadoren la iniciaciónde la replicacióndela
cadenapesadao iniciador en la transcripción dela cadenaligera,dado que
su secuenciaselocalizaentreLSP y 0H (Ojala y col., 1981b). El RNA 18
correspondeaunafraccióndelRNA 78 queestápoliadeniladaeincluyeuna
pequeñaORF quecodificaríaen célulasHeLaparaun polipéptidode 23-24
aminoácidos(Ojala y col., 1981 b). Es, además,el único RNA mitocondrial
quecontieneun extremo 5’ no codificante. La ausenciade esta ORF en
otros genomasmitocondrialesdevertebradosplanteadudasacercade su
significadofuncional.Los RNAs 1, 2 y 3 tienenunavida mediamuycorta y
pareceprobableque actúencomointermediariosen la formaciónde los
tRNAs codificadospor la cadenaligera.La secuenciadel gen NDB está
incluidaen el extremo5’ de estostresRNAs; ello sugierequeestosRNAs, o
algunosderivadossuyos,puedenactuarcomomensajerosde estegen.
Los RNAs 5, 9, 11, 12, 13, 15, 16 y 17 son los mensajerosde los
genesND5, Col, Cyt b, ND2, ND1, COIiI, COl! y ND3 respectivamente.
Los RNAs 7 y 14 contienendosmarcosdelecturacadauno (genesND4L y
ND4 y ATPasa8 y 6, respectivamente)solapadosentresí endistinta fase
de lectura parasu traducción.El RNA 6 es un precursordel RNA 9 que
continúahastael gendel t~~ATrp. El RNA 10 representaunapequeña
fraccióndel RNA 168 que seencuentraoligoadenilada.El RNA 4 es un
precursor de los rRNAs que se encuentratambiénoligoadeniladoy
presentaun extremo5’ localizadocercadel extremo5’ del rRNA 128 y, por
ARN NUMERO PtJNCJON CADENANUcLEOTIDOSI DEL A~
NO UNIDOS A 01.100 (dr
ARN 4 2612 PRECURSORES DE LOS ARN Rl- PESADA¡ BOSOMICOS
¡ SACA¡ ARNr 65 ‘559 COMPONENTES ESTRUCTURALES REARNr ‘29 >54 DE LOS RIBOSOMAS59-75 4PM DE TRANSFERENCIA ‘4ARNt PESADA
SARNI. LIGERA
UNIDOS A 01.100 ~dt POLI(AI.ARN
1 —10400 } LIGERA2 ¡ — ~070 jARNT1DENDS? LIGERA ¡
¡ 3 — 4155 LIGERA4 2582 PESADA5 2410 !ARN,II DE NOS PESADA
930 PRECURSOR DE ARNQ PESADA588 ARNr~~ DEL NO 41.-NC 4 PESADA
9 1617 ARNmDECOI PESADAII 1141 ARNmDECTOCROMOa PESADA12 1042 ARNmDFND2 PESADAII 960 ARNn, DE NO 1 PESADA4 842 ARMa, DE ArPan 8 ATPSS fi PESADA
15 784 ¡ APNm DE CO III 1 PESADAte 709 ARNa, DE COl’ PESADA
346 ARNa,DEND3 PESADA215 LIGERA
Tabla 1. Productos de transcripción del tDNA humano. (Montoyay Attardi,
1986). Los RNAs son divididos según estén o no poliadenilados.Cada mtRNA está
caractenzadocon su tamaño,función y cadenaapartir de la cualse ha originado.
fi —
—Nt
3 18
— INIo,.
BUCLE OThr
Figura 11. Mapa génico y de transcripción del mtDNA humano. <Montoyay
Attardi, 1986). Se representaen el interior el mtDNA con los genes que codifica y en el exterior
sus productosde transcripción. Las flechas indican la direcciónde la transcripcióny de la
replicación. Los RNAs 1,2,3 y 18 se transcriben a partir de la cadena ligera, el resto a partir de
la pesada.‘¡iT. Ig¡~ e ‘L indican los lugares de iniciación de la cadenapesada, los rRNAs y la
cadena ligera respectivamente.O¡~ y O¡i son los origenes de replicación de la cadenapesaday
ligera respectivamente.
Introducción! 23
lo tanto forma parte dela mismaunidadde transcripciónqueel resto de
poli(A)-RNAs de la cadenapesada.Finalmente,al RNA 8 no se le hapodido
asignarfunciónalguna,ya quesólosehadetectadoencélulasHeLa cuando
éstashansidotratadascon antibióticospara inhibir la síntesisde RNAs
nucleares(Montoyay col., 1983).
2.3.1. RNAs mensajeros(mRNAs).
Una característicacomún a todos los mRNAs mitocondrialesde
vertebradoses la ausenciade 7-metilguanosina(Grohinanny col., 1978).
así mismo, la secuenciaciónde los mRNAs ha reveladoque, con la
excepcióndelRNA 18 (Montoyay col., 1981;Ojalay col., 1981 b), todoslos
mRNAsmitocondrialesdecélulasHeLacarecende secuenciasreguladoras
no codificantesen el extremo 5’, y por lo tanto de los característicos
motivosShine-Dalgarnodeuniónal ribosoma(Shiney Dalgarno,1974).Por
otra parte,los mRNAs mitocondrialessontodospoliadenilados(Arnalricy
col., 1978; Montoyay col., 1981)presentandounacoladepoil(A) deunos55
nucleótidosen su extremo3’. Sin embargo,no se hapodido encontrar en
estos mRNAs ningunasecuenciaen el extremo 3’ o cerca de él que
contengaunaseñalpotencialde poliadenilaciónsimilar a las encontradas
enmRNAsnucleares(Proudfooty Brownilee, 1976).
Excepcionalmente,cuandohayvariasbasesespaciandountRNA y
un gencodificantede proteínas,o bien en los casos de solapamientode
genes,los mRNAs transcritosno connenzancon un marco de lectura
abierto y, frecuentemente,se encuentrael triplete ATG como codón deiniciación, probablementeporque,enestoscasos,se necesitaunaseñalde
iniciaciónfuerteparacolocarel mensajeroenfasede lectura.Sin embargo,
cuandolos marcosde lecturaabiertacomienzana la vez queel mensajero,
cualquier codónATN y posiblementeGTG funcionan como señal de
iniciación.
Con respectoa los codonesde terminación,cuandoun mensajero
lleva unaregión 3’ nocodificanteo en el casode solapamientodegenes,los
codonesutilizados son TAG o TAA. Cuando los mRNAs terminan
inmediatamenteantesde un tRNA, se puedenencontrarcodonesde
Introducción!24
terminaciónincompletosde tipo ‘17 o TA. En estoscasosel transcritoes
procesadoinmediatamenteantes del tRNA y a continuaciónes
poliadenilado,creándoseel codónde terminaciónTAA. Por otro lado,seha
descritoqueel extremo3’ de los genesCOl en hombre(Andersony col.,
1981)y Cytb envaca (Andersony col., 1982)terminaenAGA.
2.3.2.RNAs ribosómicos(rRNAs).
Los rRNAs 12S y 165,constituyentestípicosdelas dossubunidades
que forman los ribosomasmitocondriales,presentanuna estructura
secundariacaracterística,aparentementemuy conservadaenvertebrados
(Dunon-Bluteauy Brun, 1986;Gadaletay col., 1989)aunquesuestructura
primaria presentemayoresdivergencias.EstosrRNAsson oligoadenilados
post-transcripcionalmenteen la mitocondria(Dubin y col., 1982). En el
rRNA 125 se localizantres secuenciasdiferentes de 12, 17 y 18 pb
conservadasen casi todoslos vertebradoseinclusoen el genomade E. cdi,
que se correspondencon buclesdel rRNA expuestosy que presentan
secuenciascomplementariasa variosgenesmitocondrialescodificantesde
proteínas(cyt b, ATPasa6 y COIII) por lo quesehasugeridoparaellosun
papel reguladoren la traducción(Gadaletay col., 1989). Por otraparte,en
el rRNA 16S se encuentraunaregión de unas60 pb complementariaal
mRNA del genND6. Además,partedeestaregiónes complementariacon
la secuenciadel promotorde la transcripciónde la cadenapesadaen la
regióndel D-loop (Changy Clayton, 1986),por lo queen el casode queel
mRNA delgenND6 actúecomoRNA antisentidoseha sugeridoparaesta
regiónun papelreguladorde la trancripción,tanto dela cadenapesadaa
nivel del promotorcomodela ligeraa nivel de los tránscritosprimarioso en
ambasanivel de la formaciónderibosomasactivos(Gadaletay col., 1989).
2.3.3.RNAs detransferencia(tRNAs).
Los tRNAs mitocondrialesson más pequeñosque los tRNAs
citoplamáticosy procarióticos.Se caracterizanpor la posesióndel triplete
CCA en su extremo3’. Estetriplete no está presenteoriginalmenteen
Introducción! 25
ningunode los 22 genesde tRNAs por lo que necesariamentedebe ser
incorporadodurante la maduración de los tRNAs. Otro tipo de
modificacionestípicas de tRNAs como son la presenciade residuos
metilados,pseudouridina.,etc., también se producen durante su
maduración.Los tRNAs mitocondrialesson ricos en adeninay uracilo,
presentandocongranfrecuenciaapareamientosdebasesy configuraciones
tridimensionalesheterodoxas.La regióndel anticodónes la únicaqueha
conservadolas característicasgeneralesde tRNAs citoplasmáticosy
bacterianos;en el hombre,el primer nucleótidodelbucle es siempreuna
pirintdinay los nucleótidosqueprecedeny signenal anticodónsonsiempre
U y unapurina, respectivamente,exceptoen el caso del dINA Met quetieneunaC precediendoal anticodón.
En contrastecon el restode sistemas,en los quesiempreexisteun
genpara la especieformil- tRNA Met, en la mitocondriano existemásque
un gentRNA Met. Sin embargo,la capacidadde los tripletesAUG y AUA
paraactuarcomo codonesde iniciación, hacesuponerla existenciadeuna
familia detRNAs iniciadores.
2.3.1.El codigogenéticomitocondrial.
Las característicasque presentael código genéticouniversalson
consecuenciadelas propiedadesbioquímicasintrínsecasdelos nucleótidos.
Las dosprimerasbasesdel codónse emparejancon las dos últimasbases
delanticodóndelas móleculasde tRNA, de acuerdocon el modelo deenlace
de Watson-Crick(Watsony Crick, 1953). En cambio,la primerabasedel
anticodónse emparejacon la tercerabasedel codónde acuerdocon las
reglas del balanceo:el hechode queG se empareje,no sólo con C sino
tambiéncon U, es responsablede la existenciade un código genético
degenerado(Crick, 1966).
La existenciade tansólo 22 tRNAs en la mitocondria (frentea los
55 utilizadosen el citoplasmapor el códigouniversal)justifica la existencia
deun modelodereconocimientode codonesdistintodel propuestopor Crick.
Enel código mitocondrialsepuedendistinguir dosgrandesgruposde tRNAs
Introducción! 26
en relacióncon el númerode codonesque reconocen.El primer grupo
inc]uyeocho tRNAs distintos queidentificancadauno un total de cuatro
codones.En todos los casosestos tRNAs tienenuna U en la primera
posicióndel anticodón(HsuCheny col., 1983; Montoyay Attardi, 1986).
Esta es una de las mayoresdiferenciasrespectodel código universal,ya
que no existe en este último ningún tRNA capaz de reconocercuatro
codones.Esta situaciónse puedeexplicarenla mitocondriamediantedos
posiblesmodelos:1) queel balanceoseamásflexible detal maneraquela U
de laprimeraposicióndel anticodónseacapazde reconocercualquierbase
en la terceraposición del codón(balanceoU:N; Barreil y col., 1980); 2) que
en la interacciónentre codóny anticodónsolamenteesténimplicadas
únicamentelas dos baseslocalizadasenla primeray segundaposicióndel
codón(Lagerkvist, 1978). El segundogrupo incluyeel resto de tRNAs que
reconocensolamentedos codonescadauno.De ellos, 8 (tRNAs deAsn, Mp,
Cys,His, ile, Phe,Ser,y Tyr) cumpliríanla reglauniversaldel balanceoy 6
(tRNAs de Glu, Gin, Leu, Lys, Trp y Met) queposeenunaU modificadaen
la primera posición del anticodóny reconoceríanindistintamentecodones
con una A o una G en la terceraposición.Además,es de destacarla
ausencia,al menosenvertebrados,de tRNAs quereconozcanlos codones
AGA y AGG, que por lo tanto actúanen el códigomitocondrial como
codonesde terminación.
El DNA mitocondrial (excepto en plantas) se caracterizapor
presentarun código genéticopeculiar,distinto del universal(Fig. 12). La
principal diferenciaentreel código genéticomitocondrialy el universalesel
uso del triplete UGA, no como codónde terminación,sinoparacodificar
triptófano(Barrelí y col., 1979). Otrasvariacionesencontradasen el códigogenéticode mitocondiriason: usoen vertebradossuperioresdel codónAUA
no paracodificar isoleucina,sinometionina;uso delcodónAAA (lisina) para
codificar asparaginaen invertebrados;usodel codónAGR (arginina)para
codificar serna en invertebradosy como codón de terminaciónenvertebradossuperiores.
Introducción! 27
UCU SerUdO Ser IRlAOCA Ser
uuaiauunuaaser
UUtJPheUUCPha ~
UAUTYT auUACTYT A
UGUCYEadAUCICCyS
UDA Leu UAA FinUACFÚi
UGA Trp OCAUGGTIp
LenOVO la UAGCUAla
aou ProCCC Pro UdC
CAlI HÉ auaCAC Mis
CalI Ar~CGOP.r~~A4: UdCoua
AUU Ile aauAlIO De
ACU TbrACO TbrAdAACO Tbr
AAU Ant AGO SerACO
&UAMet UAUAMO¡viet
AAALyu~no Lys
ACA fin —ACO Fin —
CXIII Vsiaucvái lIAdGUAVsi~ua Vsi
GCUAla(100 Ala uco(IdA Ala000 Ala
GAU ~ aucCAO ASTI
(1011 Gly000 Gly u~c(lOA GlyGOQ Oly
<IAA GluGAG Clii ~
Figura 12. El codigo genético de mitocondrias de vertebrados
superiores.Se indican los codonesposibles (5’—*3’), su traduccióny el anticodóndel
tRNA correspondiente.Se señalanen negrita,los codonescon traduccióndiferente a la
del codigogenéticouniversal.
Las diferenciasdel código genéticomitocondrial entre especies
puedenresuniirseenformade árbolfilogenético (Fig. 13). El primercambio
fue el que afectó al codón UGA (terminación —* Trp) y ocurrió con
posterioridada la separaciónentreel reino animaly el vegetal. Ya en lalínea animal, el codónAGR (arg) comenzóa codificar para sernaen
platelmintos(Gareyy Wolstenholme,1989) y continnóen equinodermos
(Himenoy col.,1987;Jacobsy col., 1988; Cantatorey col., 1989), moluscos
(Shimayamay col., 1990) e insectos(HsuCheny col., 1984; Clary yWolstenholme,1985; Croziery Crozier, 1993) hastaconvertirseen codón
de terminaciónen vertebrados(Andersony col., 1981; Bibb y col., 1981;
Andersony col., 1982;Gadaletay col., 1989;Arnasony col., 1991;Arnason
y Johnsson,1992;Roey col., 1985y Desjardinsy Morais, 1990).
U c A G
U
o
E
A
a
U
O
:3
A
a
Introducción! 28
(7)4, Vertebrados
InsectosCelentereos
Equinodermos
Paramecu¡m
Mohos
Protosimbiontes TorulopsisSaccliaromyces
CODIGOUNIVERSAL Plantasverdes
Figura 13. Evolución del códigogenéticomitocondrial. (Jukesy Osawa,
1990). Los protosimbiontesy las plantas verdes mantienenel código universal,
mientras que las initocondrias del resto de eucariotassufren progresivamentelos
siguientescambios: (1) UGA, Trp; (2) AGR, ser; (3) AUA, Met; (4) AAA, Asn; (5) UAA,
Tyr; (6) CUN, Thr; (7) AGE, stop; (8) CGN, no codificante;(9) AUA, Met—dle -
El codónAAA cambióde Lys aAsnen la ramadelos platelmintosycomo un acontecimientoaisladoen equinodermos.A partir de nematodos
(Wolstenholmey col., 1987) y, de forma independiente,en levaduras
(Hensgensy col., 1979) el codónAUA cambióde Ile a Met, cambioque
posteriormenterevirtió enequinodermos.El codónCUN se traducecomoThren vezde Leu enlevaduras(Li y Tzagoloff, 1979).El codónUAA parece
serusadoparaTyr en vez de codónde terminaciónen la mitocondriade
platelmintos(Besshoy col., 1992). En la mitocondria de Toralopsis
glabatra (levadura) no se ha encontradoningún codónAGR, ni un
~~~AArg capaz detraducirlo (Clark-Walkery col., 1985).
En cualquiercaso, pareceevidente,quetodos los códigosgenéticos
encontradosen mitocondriaderivandel código genéticouniversal,quede
hechosemantieneparael DNA mitocondrial deplantas.Los mecanismoscausantesde la evolución del código genético
mitocondriala partir del universalestanrelacionadoscon fenómenosde
economíagenómica.La desapariciónde un tRNA conlíevael cambio del
correspondientecodóna otro sinónimosin traducciónasignada.El nuevo
t(3,6)
Introducción! 29
codónadquieresentido,bien por mutaciónen el anticodóndel tENA, bien
por cambioen el antnoácidoqueseuneal mismotRNA, o bienpor cambio
en el emparejamientocodón-anticodón.El primer casoesel queocurreenel
cambio deUGA de codóndeterminacióna codónparael triptófano,en el
cambiode CUG decodónparaleucinaa codónparasernay en el cambiode
APIA decodóndelisina acodóndeasparagina.El segundocasoocurre enel
cambio del codón CUNde leucina a treonina en el mtDNAde levadura. El
tercero se da en el cambio del codón AGE de arginina a serma y
posteriormentea codóndeterminacióny en el anticodónCAU del tRNAMet
que pasa, de reconocersólo el codónAUG, a reconocertambiénel codón
AUA (Osaway col., 1992).
3. FILOGENIA MOLECULAR.
3.1. Clasificación,evolucióny biologíamolecular.
Tradicionalmente se considera la obra SystemaNaturae de Linneo
(1707-1778) como el comienzo de la taxonomía moderna. En función de sus
características morfológicas y funcionales, a cada organismo se le asigna
una especie, y ésta se clasifica dentro de un género, familia, ordeny clase.
Con esta metodología, Cuvier (1769-1832>, De Candolle (1778-1841) y
otros naturalistas fueron extendiendola clasificaciónde Linneo anuevas
especies de plantas y animales hasta que la teoría evolutiva de Darwin
(1809-1882),juntamentecon las posterioresleyes sobre la herencia
genéticade Mendel (1822-1884),cambiaronpor completola forma de
concebirlos sistemasdeclasificaciónde los seresvivos.
De acuerdocon el pensamientoneodarwinista,la biodiversidad
existente,es consecuenciadel procesoevolutivo resultantede la actuación
de la selecciónnaturalsobrela variacióngeneradapor la mutacióngenética
en una población.Por lo tanto, una sistemáticarigurosa debereflejar,
primordialmente,la historia evolutiva de los organismosestudiados,integrandopara ello, los conocimientosadquiridossobresu morfología,
fisiología, genética,interaccionesecológicasy registro fósil. Basándoseen
estapremisa,los sistemasde clasificaciónbásicamentemorfológicos,han
Introducción! 30
ido renovándosemediantela incorporaciónsucesivade los descubrimientos
realizadosen los camposde la paleontología,la sistemáticay la biología
molecularhastallegar a la, actualmenteaceptada,clasificaciónen cinco
reinos: monera, protista, plantae, fungi y animalia (Whittaker, 1969;
Whittaker y Margulis, 1978) (Fig. 14).
PLANTAE ANIMALIA
RJNGI
~EC.AINODEPK4A¶A
SPHEÑOP*V¶A% ~HEP*CHOROATA
IDA
URACULlOA
A~A~10GNANA I
- <INOR*YNCHAACAN¶HOCEPNALA
E NTOPROC lA~TH0S¶OMULIOA
NEI5?tINA
PROTISTA ~t<HELM¡ÑTHES OOMVCCTA
*AES0ZOA CNID0SPORIDIA SAMOP* 4-lANOPHORA APICQMPLEI<.A CHV¶RIOIOMYCQTA
¡ CHLORQPHY¶A O¡ASMODIORSOROM<COTL¡ ZOOMAS¶IGIl HYPHOCHY¶RIOIOMYCOTA
1 BACILLARI0PI- <It X~Lk -4.” ~POPAMINIPERA
- XANT~-0RI-$YTA CRYPIOPHYTA
~XOM~C0TaC4-4RYS0PH~TA SARCODINA
HAPTOP’~YTA EUGLENOPHYTA ACRASIOMYCOTA AC¶INSBAC’EP¡AEUSTIGMAIOPhYTA LAEYPINTI4IJLAIAYCOTA
CYANOBAC’ERhA C1L10P*ORA MY~0BAC~R A
DLNOFLAOELLATA 4>—1 .4 CROCOCOCAP VOS LASTEACHLOROXYBAC¶ERIA ‘SEUOOMONAOS
—Ammsr~’rgncxs- OMNIBACIERIA
ME¶I-IAÑEOCPEATR.CES r AEROENOOSPORA
SP,ROCHAETAE ¡
QUlMloáwnnoscás ~
AP*RACMABAC¶ERIA
Figura 14. Clasificación en cinco reinos de Whittaker. Se representantodoslos
phyla incluidos en cadareino: monera(16), protista(27), fungi (5), plantae(9) y animalia(32).
El esquemaestaríade acuerdocon la teoría endosinibiontepara el origen de los eucariotas.
Modificado de Margulis(1981).
Introducción!31
Esta clasificaciónes unreflejo de las filogeniasentreorganismosy
por lo tanto representaun razonableacercamientoa los principales
aspectosde la historia evolutiva de los seresvivos desdeel origen de los
procariotasmás sencillos hasta el desarrollode la diversidadactual.
Aunque válido, este acercamientono es definitivo ya que está lleno de
conjeturasy muchosdetallessontodavíacontrovertidos.
En estesentido,el gran desarrollode la biología moleculary su
creciente aplicación en los estudios de carácter evolutivo, está
contribuyendo,no sólo aresolverlos numerosospuntososcurosexistentes
aúnen lasfilogeniasya establecidas,sinoademása podercomprenderlos
mecanismosevolutivos.Tan pronto como fuerondeterminadaslas secuenciasde proteínas
como el citocromoc (Margoliash,1963) o la hemoglobina(ZuckerkandlyPauling, 1962) en diversosorganismos,sepudo establecerque,entredos
especies,el númerode sustitucionesaminoacídicasparaunaproteínadada,
aumentabade forma aproximadamentelineal con respectoal tiempo
pasadodesdesu divergencia.La existenciade un reloj molecular tuvo una
consecuenciadirecta en el estudiode la evolución: se podían construir
árbolesfilogenéticossobrela basede un patrón decambioevolutivo mucho
másregularqueel proporcionadopor caracteresmorfológicoso fisiológicos
y, por lo tanto, permitíaescalaren el tiempo la historia evolutiva de los
organismos(Fitch y Margoliash,1967).
Puestoquetodala informacióndeunservivo estáalmacenadaen su
genoma,se puedenestablecerfilogeníasentrediferentesorganismospor
comparaciónde sus secuenciasde DNA. El clonajede geneses unalabor
cara,consumemuchotiempo,notodoslos genesson fácilmenteclonablesy
no siempretienenel mismo interésdesdeel puntode vista evolutivo. En
general,cuantomás imprescindiblees un gen, menor es la apariciónde
variacionesen su secuenciay por lo tanto mejor describefilogeniasentre
taxonesalejados.Por eso, durantemuchosaños,la mayoríade los estudios
sobrefilogeniamolecularse hancentrado,sólo,enunospocosgenes(genes
mitocondriales,genesnuclearescodificantesde rRNA) de únicamenteunas
pocasespecies.
Peseaello, el desarrollode las técnicasde DNA recombinantey la
Introducción!32
posibilidad,relativamentereciente,de secuenciarel DNA de forma sencilla
y rápida (Sanger,1981) han permitido obtener,en pocos años, gran
cantidad de información sobre muchosgenesen una granvariedadde
organismos.Mi, las basesde datosGenBanky EMBL contaban,el 30 de
Febrero de 1992, cada una con 63378 entradas(83.6 millones de
nucleótidos)correspondientesa3000 organismos,y se esperabaduplicarla
cifra de secuenciasen, tansólo, 18 meses(Burksy col., 1992;Higginsy col.,1992). La informaciónacumuladaestal, que el manejoy análisisde las
secuenciasde DNA sólo se puederealizarcon potentescomputadoresa
travésde programasespecialmentedesarrolladosparaestefin (Devereuxy
col., 1984). Se ha de señalarque,aunquela mayoríade las secuenciasde
DNA introducidasen los bancosde datos,no provienende trabajosde
investigaciónrelacionadoscon temas evolutivos, la información que
contienen es, casi siempre, aprovechablepara confirmar o aclarar
cuestionesdeestaíndole.
En definitiva, el avanceconseguidohastamediadosde los años80,
fue espectacularpero, obviamente,limitado por una característica
inherentea las técnicasde DNA recombinante,la necesidadde obtener
grandescantidadesde DNA de buenacalidadde cadaorganismoobjetode
estudiocomopasoprevio parasudonación,asícomo porla necesidadde
construir genotecasy disponerde un métodoadecuadode selección.Lasituacióncambió de formasorprendentetras la apariciónde una nueva
técnica,la reacciónde la polimerasaen cadenao PCR(Saiki y col., 1988).Estatécnicapermiteamplificarcualquierfragmentode DNA, mediantela
unión de oligonucleótidosespecíficosalas secuenciasquelo flanquean.Es
evidentequela especificidaddela amplificaciónviene determinadapor el
diseñode oligonucleótidosadecuadosy queésteno hubierasido posible,de
no serpor la informaciónsobresecuenciasdeDNA acumuladaen los años
previosala apariciónde la técnicadePCR.
Aunquelos productosde PCRnormalmenteno secorrespondencon
la secuenciacompleta de un gen, y por lo tanto no ofrecen tanta
informacióncomola derivadadelclonajede uno o variosgenes,la técnica
ofrece numerosasventajasparael abordajede cuestionesevolutivas:es
muy rápiday sencilla;requierecantidadesmínimasdeDNA (nanogramos)
Introducción! 38
y en algunos casosbasta la rotura celular como único paso previo de
purificación del DNA; permite amplificar DNA a partir de tejidos
procedentesde, prácticamente,cualquierorganismoincluso fosilizados
(Pááboy col., 1989; Canoy col., 1993;Pomary col., 1993) o guardadosen
coleccionesde museos(Kochery col., 1989); por otra parte,no requierela
muertedel organismoobjeto del análisisy, finalmente,permiteanalizar
simultáneamenteun grannúmerode individuosal mismotiempo.
3.2. Arbolesfilogenéticos.
A medida que las técnicasde biología molecular se han ido
introduciendoen el campode la evolución,la cantidad de información
disponiblesehaido incrementandoconsiderablemente.Los datosempíricos
acumuladosy correctamenteinterpretadospermiten,por un lado avanzar
en la comprensióndel mecanismoevolutivo, y por otro, construirárboles
filogenéticosque reflejenla historia evolutivade los organismoscadavez
más precisos. Para lograr ambosobjetivos, se ha hecho necesario
desarrollarmétodosmatemáticosy estadísticoscapacesde cuantificarlos
cambiosevolutivos(sustitucionesdenucleótidos,delecionese inserciones)observadosanivel delDNA (Jutesy Cantor,1969).
Paratratar de elucidarel mecanismomolecularde la evolución,en
los años60 se desarrollaronmétodosbasadosenla teoríamatemáticadela
genéticade poblaciones(Fisher, 1930; Wright, 1931; Haldane, 1932).Dichos métodos estadísticosse aplicaron a los datos moleculares
disponiblesen aquellaépocacon el fin de poderdeterminarla distancia
genética entre poblaciones, mediante la estimación del número de
sustituciones producidas en una determinada secuencia para diversos
organismos (Cavalli-Sforza y Edwards, 1967; Kimura, 1968; Nei, 1969).
Para construir árbolesfilogenéticosmoleculares,se desarrollaron
métodos estadísticosa partir de los ya empleadospor la taxonomía
numéricaen la construcciónde árbolesevolutivosbasadosen caracteresmorfológicos (Sneath y Sokal, 1973) y, aunque éstos podían ser
directamente aplicados a datos moleculares, se desarrollaron nuevos
métodos que tuvieran en cuenta las particularidades de la evolución a nivel
Introducción!34
molecular (por ejemplo la importancia de los factores estocásticos).
En la taxonomíanuméricaexistendos tipos deacercamientoteórico
a la construccióndeun árbolfilogenético.Uno es el fenético,en el queel
árbol se construyeconsiderandoúnicamentelas similitudes fenotípicas
entre las especies,sin tratar de entendersu historia evolutiva. Este
acercamientose utiliza cuandono se conocenbien las reglasquerigen el
cambio evolutivode los caracteresusados,o cuandoel análisistaxonómico
se basaúnicamenteenla semejanzafenotípica.Dado que estosárbolesno
tienenpor quérepresentarrelacionesevolutivas,se les sueledenominar
fenogramasy son consideradossimplesagrupamientosde organismos.En
el segundo acercamiento, el cladístico, el árbol filogenético se construye
considerando posibles formas de evolución siguiendo determinadas reglas y
escogiendoel árbolquemejor refleje los datosexperimentales.Estosárboles
se conocen con el nombre de cladogramas.En la práctica, este
acercamiento está limitado por la necesidad, en un momento dado, de
realizarsupuestosno soportadospor los datos,al escogerun árbolentrelos
variosposibles.Los métodosestadísticosmás utilizados par construir árboles
filogenéticosapartir dedatosmoleculares,son losde matricesde distancia
(fenéticos>, el de máxima parsimonia (cladista> y el de máxima
verosimilitud.
3.2.1. Métodosde matrices de distanaa.
- Distancia media o liPOMA (Sneathy Sokal, 1973).Se basaenel
cálculo de la distanciagenéticaentre pares de unidadestaxonómicas
operacionales(OTUs). Las OTUspuedenser especieso poblaciones,y se
representanenuna matriz.El algoritmodel métodoconsisteen agruparlas
OTUs empezandopor lasdosconmenordistanciaentresí. EstasdosOTUs
se agrupancon un punto intennediode ramificacióny formanuna nueva
OTU. Se calculannuevasdistanciasentrela OTU combinaday el resto de
OTlJs y de nuevo se busca el valor de distanciamenor,añadiendo así
gradualmente,las OTUs más distantementerelacionadas.El método
UPGMA asumeun ritmo constanteenel procesoevolutivo, por ello, sóloen
Introducción!35
el casodequelamedidade distanciasno estésujetaa erroresestocásticos,
da árbolescontopologíay longitud de ramascorrectas.La fidelidad de la
topologíade un árbolfilogenético realizadopor estemétodoa unosdatos
experimentalesdeterminados,viene dadapor comparaciónde los errores
estándardecadauno delos puntosde ramificación.
Farris (1977)sedió cuentadequela topologíaobtenidapor el método
UPGMAen el casoderitmosdiferentesdesustitucióngénicaen cadalinaje
evolutivo, podíasermejoradasi las distanciassecalculabanen funciónde
unadelas OTUs analizadas.EstaOTU dereferenciadebíaserclaramente
distinguibledel resto.Estemétodo no permiteobtenerestimacionessobre
la longitud de las ramaspara unatopologíadada,por lo quetienequeser
usadoen combinacióncon el métododela distanciamediao bien con el
desarrolladopor Fitchy Margoliash.
- Método de Fitch y Margoliash (1967). Cuando el ritmo esperado de
sustitucionesgénicasvaríasustancialmentesegúnlos linajesevolutivos,el
método UPGMA da lugar a topologías incorrectas y erroresenel cálculode
la longitud de las ramas. El método desarrollado por Fitch y Margoliash
permite estimar el número de sustitucionesen cada rama y obtener
topologíasmásfiablescuandolos ritmos desustituciónparacadaramason
diferentes.En este caso, se eligen primero las dos OTUs (A y B) que
muestran menor distancia entre sí y el resto se agrupa en una OTU
compuesta (C). Se calculan, por separado, las distancias entrelas OTUs A
y B y la OTU C (mediade las distanciasentrelas OTUsA o B y todaslas
OTUs deC). Posteriormente,se calculael númerodesustitucionesgénicas
para cadarama.A continuaciónse unenA y B en una OTU combinada
(AB). Se recalculanlas distanciasentrela OTU AB y todaslas demás
OTUs quecomprendíanla OTU C original, y se eligenlas dos OTUs que
muestranmenordistanciaentresí, aunqueseandosen las queno participa
la OTU AB. Estasdos OTUs sedesignande nuevoA y B y el resto C. El
procedimientose repite hastaque todaslas OTUs quedanagrupadasen
una única familia. A diferenciadel métodoUPGMA, estealgoritmo no
permitedeterminarla raiz del árbol. Paraconocerla,se buscauna OTU
claramentediferentecomoreferencia,o bien se asumeun ritmo constante
de cambioevolutivo y la raiz se estableceal calcular las distanciasdel
Introducción!36
último tripleteABC.
El procedimientono termina con la construccióndel primer árbol;
Fitch y Margoliash sugierencomprobarque otras topologíasposiblesy
similaresala obtenidano sonmejores.Paraello, se comparanlos árboles
enfunciónde la desviaciónestándar(SFM). Sin embargo,sehademostrado
mediantesimulacionespor computador,queSFM no esmuy eficaz a la
horade identificarla topologíacorrectaentrelos diferentesárbolesposibles
probablementedebidoa unabajacorrelaciónentreesteparámetroy los
errorestopológicoso de longitud de lasramasacumuladosen los diferentes
árbolesgenerados(Tatenoy col., 1982).A pesarde ello esteparámetrose
utiliza con frecuenciadebido a queno existe ningunaotra manerade poder
cuantificar la cercanía de un árbol estimado al real.
- Distancia Wagner (Farris, 1972). Como en el método de Fitch y
Margoliash,seexaminanlos posiblesárbolesquesepuedenobtenerapartir
de los datos empíricos.Sin embargo,en este caso como el procesode
discriminación ya está incluido en el propio método, sólo se obtiene un árbol
finaL
El algoritmoconsisteenproducir unamatriz dedistanciasgenéticas
de las OTUs a estudio.Las dos OTUs más cercanasse combinan. La
distanciaentreestaOTU combinaday cadaunade las restantesse calcula
tomando la media de las distancias entre cada una de las OTUs de la OTU
combinaday cadauna delas OTUs restantes.De nuevo,aquellaOTU que
permiteobtener la distanciamenor pasa a formar parte de la OTUcombinada.Secalculanla longitudde cadarama.El siguientepasoconsiste
en añadirunanuevaOTU. Paraello, cadauna de la OTUs que quedanpor
agruparseuneal árbol,existiendotresposibilidadesdeuniónparacadauna
deellas(Fig. 15). Se calculanlas longitudesde todaslas ramasposiblesy
aquéllaqueposeala menorseelige comoramadelárbol.
La siguienteOTU puedeserañadiday en estecaso, lasposibilidades
de unión son cinco. El procesocontinúahastaquetodaslas OTUs están
agrupadas.Para establecerla raiz del árbol, bien se usa una OTU
claramentediferentecomoreferencia,o bien se asumeun ritmo constante
de cambioevolutivo y la raiz seponeen el puntomedioentrelasdos OTUs
conectadaspor la ramamayor.
Introducción!37
A A A
C EZ~ C
B B B 133
Figura 15. Procedimientopara construir un árbol filagenética por el
métodode la distancia Wagner.
- Método de unión por vecindad. (Saitouy Nei, 1987). Estemétodo
está basadoen el originalmentedescritopor Cavalli-Sforzay Edwards
(1967) pero el algoritmo desarrolladosimplifica enormementela
computación. Paraunatopologíadadase calculala sumade la longitud de
cada una de sus ramas (L). El procedimientose repite con todas las
topologíasposiblesy aquellaque déel valor mínimode L seelige comoárbol
definitivo. La longitud decadaunadelas ramasse calculasegúnel método
de Fitch y Margoliash.La comparaciónentrelasdiferentestopologíasestá
incorporadaen el algoritmo desarrolladopor Saitou y Nei por lo quese
obtienecomo resultadofinal un únicoárbol contopologíay longitud de las
ramas.
3.2.2.MétododeMáximaParsimonia.(Fitch, 1977).
El algoritmo de estemétodoconsisteen consideraruna topología
particularparaun grupo de OTUs e inferir cualesson las secuenciasmás
antiguasparaestatopología.A continuaciónsecalculael númeromínimode sustitucionesque son necesariasparaexplicarlos cambiosexistentes
entrelas secuenciasmásantiguasy las másmodernas.Una vez obtenido
estenúmero,serepiteel procesoconunanuevatopología.Cuandotodaslas
topologíasrazonableshan sido ensayadas,se elige como árbol final aquella
Introducción! 38
querequiereel mínimonúmerodesustituciones.Estemétodo, no permiteestimarla longitudde lasramas.
En principio lo másconvenienteesobtenerla primeratopologíapor
el métododela distanciaWagnero mediantela modificaciónde Farrisdel
métodode la distanciamedia,y producir lastopologíasalternativaspor elmétododeFitchy Margoliash(Nei, 1987).
En la construcciónde árbolesde máximaparsimonia,no todoslos
sitios de unasecuenciasonútiles parala determinaciónde unatopología.
Sólo son informativosaquellossitios enlos que,a lo largode suevolución,
existen al menos dos clases diferentes de nucleótidos, cada una
representada,al menos,dos veces.Esto suponequecuandoel númerode
sustitucionespor sitio es pequeño,y el númerode OTUs usadotambién,
gran partede las mutacionescontempladasson únicas,y porlo tanto no
informativasparaconstruirun árbol de máximaparsimonia.Estaes su
principal desventajacon respectoa los métodosde matricesdedistancia,
que aprovechan todos los sitios existentes para determinar las distancias
genéticas.
3.2.3.Métododemáximaverosimilitud.
Este métodofue desarrolladooriginalmenteusandocomomodelola
teoríadel movimientoBrowniano,asumiendounadistribución de Gauss
parala variaciónevolutivade los genes(Cavalli-Sforzay Edwards,1967).
Sin embargo,posteriormentese demostróque este tipo de variación es
típicamenteno-gaussianay quepodíaser descritacon relativa facilidad
medianteunadistribucióndePoisson. Mi, sedesarrollaronalgoritmosde
máximaverosimilitudparaestimarúnicamentela longitud de las ramas
(Langley y Fitch, 1974> o para construir árbolesfilogenéticoscompletos
(Felsenstein,1981).
En el métododeLangleyy Fitch, seestimala longitud de lasramas
para una topología dada a partir del número conocido de sustituciones de
cadarama. Se asumeuna velocidadde sustituciónconstantey que el
númerode sustitucionessigueuna distribucióndePoissonparacualquier
intervalo detiempo. El métodopuedeser fácilmenteextendidoparael caso
Introducción!39
de contarcon datossobrevarios genes.La velocidadde sustituciónpuede
ser diferente de un gen a otro, pero la distancia evolutiva entre dos OTUs es
siempre la misma para todos los genes. La longitud de las ramas así
obtenida,es másfiable quela presentadaen árbolesbasadosen un único
gen.Enel métododeFelsenstein,se calculaparadiferentestopologíasla
probabilidad de obtener las secuencias observadas para un grupo de OTUs.
La topología que presenta la máxima probabilidad se elige como árbol final.
Al calcular la probabilidad de que en un sitio, un nucleótido sea sustituido
por otro, surge el principal problema de este método, y es que esta
probabilidad no es uniforme, sino que depende de su posición en una zona
conservada o no conservada de la secuencia de DNA.
3.2.4. Eficiencia relativa de los diferentes métodos de construcción
de árbolesfilogenéticos.
La eficiencia de los diferentes métodos puede ser comparada
determinandosu fiabilidad a la horade recuperarla topologíacorrectay
estimar las longitudes de las ramas de un árbol modelosimuladoalordenador<Tatenoy col., 1982;Nei y col., 1983;Sourdisy Krimbas; 1987>.
En el casode los métodosdematricesde distancia, el de unión por
vecindad es el más versátil y eficiente conindependenciadel númerode
sustituciones de nucleótidos por sitio de la secuencia. Cuando el ritmo de
sustitución génica es constante, y el número de sustituciones por sitio es
bajo, la distancia Wagner de Farris es el mejor método para recuperar la
topología correcta. Sin embargo, cuando el número de sustituciones es
relativamentegrande,el método a escogeres el UPGMA. Cuandolavelocidadde sustituciónvaríaentrelos linajes evolutivos,el métodode la
distanciaWagneresligeramentemejor que el de Fitch y Margoliashy el
IIJPGMA en la recuperacióndel árbol correcto,inclusocuandoel númerode
sustitucioneses gande.El mejormétodoparaestimarlaslongitudesdelas
ramases el UPGMA. Ello es debidoa quela estimaciónde las distancias
genéticas está sujeta a grandes errores estocásticos, y el procedimiento de
hallar distanciasmediasdel UPGMA reduceel efectode esteerror en la
Introducción!40
estimacióndelas longitudesde lasramas.En general,el métododeFarris
tiendeasobreestimarla longitud de lasramas(Tatenoy col., 1982).
Al compararel métododemáximaparsimoniaconlos dematrices
dedistancia,asumiendoun ritmo evolutivoconstantey un númeropequeño
de sustitucionespor sitio, se observéque el método que con mayor
probabilidad recuperabala topología correcta, era el de máxima
parsimonia.Sin embargoesde destacar,queel métodode parsimoniasóloesfiable si seexaminaun númerograndede nucleótidos.Así, cuandoseusa
DNA mitocondrial como fuente de secuenciasy se conoceun organismo
claramente distinguible del resto, se necesitan al menos 2600 nucleótidos
para detenninar el árbol correcto. Cuando se usan genes nucleares, esta
cifra es mucho mayor dado que la velocidad de sustitución de nucleótidos es
menor. Este método deja de ser fiable cuando las secuencias analizadas son
lo suficientemente lejanas como para acumular fenómenos de paralelismo y
reversión, siendo entonces más fiables, la distancia Wagner, la modificación
de Farris del UPGMA(Saitou y Nei, 1986) o el método de unión por
vecindad.
El métodode máxima verosimilitud es en generalmáseficiente
que el métodode máximaparsimoniay, en particular,cuandoel ritmo desustitución es variable. Sin embargoes ligeramentemenoseficienteal
método de unión por vecindad.La eficiencia de este método depende
directamentedelmodelodeprobabilidadescogido(Saitoue Imanishi, 1989).
3.2.5. Margen de confianza estadística de un árbol filogenético.
Los diversos métodos desarrollados para reconstruir filogenias a
partir de datos moleculares, rinden como resultado final la topología y la
longitud de las ramas de uno o unos pocos árboles, pero no proporcionan
información acerca del nivel de confianza estadística de la estimación Por
ello, sehandiseñadométodosparaevaluar la precisióncon la queel árbol
obtenido refleja la filogenia verdadera en comparación con otros árboles
alternativos (Templeton, 1983; Felsenstein, 1985; Steel y col, 1993). Se
trata de un problema complejo ya que, por un lado, el número de árboles
alternativosposibles es muy grandeincluso cuando se comparanun
Introducción]41
número moderado de especies y por otro, el tratamiento estadístico de los
datos no suele satisfacerlos supuestosutilizados por el métodode
construccion.
Los métodos estadísticos más utilizados actualmente para
establecer el margen de confianza de un árbol filogenético,
independientementedel método utilizado para su estimación,son los
denominados“Jacknife’ (Mueller y Ayala, 1982) y bootstrap’
(Felsenstein,1985). Ambos, sebasanenla generaciónal azar, de forma
iterativa de sustitucionesenel grupode datos a analizar,la obtenciónde
árboles a partir de estos estimadosy en la construcciónde un árbol
consenso.La ideaesencialde estosmétodosesque el grupode estimados
generados al azar presenta una distribución estadística que se aproxima a
la distribuciónreal. La estimacióndel númerode vecesque una rama
aparece en el total de árboles generados nos indica el límite de confianza
paraestarama. Si un 95%o másde los árboles,muestranla formaciónde
un grupo en esepunto, se puedeasumir que el resultadoes altamente
significativo. Comoentodométodoestadístico,cuantomayorseael número
de datosgenerados,la consistenciade la estimaciónestadísticay, por lo
tanto,el gradodesignificacióndel árbolobtenido,aumenta.
3.3. EstudiosevolutivosconDNA mitocondrial.Situaciónactual.
El DNA mitocondrialsehaconvertidoenunaherramientamuy útil
en los estudios de genética molecular evolutiva debido a su reducido
tamaño, alto número de copias por célula, herencia materna y
comportamientoevolutivo (envertebrados,la tasadesustitucióngénicaes
5-10 veces mayoren los genesmitocondrialesqueen los genesnucleares)
(Brown y col., 1979; Vawter y Brown, 1986). La existenciade genes
conservados (12S rRNA, 16S rRNA, Cyt b) en los que las sustituciones se
acumulandeforma aproximadamenteconstante,así como deregionesde
evolución rápida (D-loop) permite abordar estudios de tipo comparativo
tanto entre grupos distantes como dentro de taxones concretos.
Mi, la progresiva acumulación de secuencias completas de mtDNA
estápermitiendocorroborarlas relacionesfilogenéticasya establecidas
Introducción/42
entre muchasespeciesAdemás,cualquiergen mitocondrial puedeser
amplificado a partir de casi cualquierespecie,graciasa la técnicade PCR,
lo que permite abordardirectamentelas cuestionesevolutivas más
candentesy aclarar,en parte,las numerosasincógnitasaúnexistentesen
algunosgruposdedificil clasificación.
El DNA mitocondrial ha sidoparticularmenteútil a la hora de
estudiaren detalle las relacionesfilogenéticasdentro del grupo de losprimates (Hixson y Brown, 1986; Hayasaka y col., 1988; Hasegawa y col.,
1990). Las secuencias de mtDNApermitieron establecer que la rama de
los primates, conducente al hombre, se separó de los prosimios (Lemures,
társidos) hace 66 millones de años (Myr). Hace 42 Mr los platirrinos
(monos ardilla) se separaronde los catarrinos;por otra parte, los
cercopitecos(macacos),el gibón, el oragután,el gorila y el chimpancése
fueron separando sucesivamente hace 30, 17, 13, 5 y 4 Mr (Fig 16).
Hombre
ChimpancéGorilaOrangután
Gibón
Macacobárbaro
Macacocomedorde cangrejosMacacoRhesusMacacojaponés
Mono ardilla
Társido
Lemur
Vaca
Ratón
1
Figura 16. Relacionesfilogenéticasde los primates. (Hasegaway col.,
1990). árbol filogenéticoobtenidopor el métodode máximaverosimilituda partir de los
genesN04, tENA-fis, tENA-Ser (AGY) y tRNA-Leu (CUN). Lalongitud de las ramases
proporcionalal númeroestimadode sustitucionespor nucleótido.
Introducción!43
Dentrode los ungulados,la secuenciacióny comparaciónde los genes
mitocondrialesquecodificanparalos RNAs ribosomalesenvariasespecies,
ha permitido profundizar en la filogenia del suborden Pecora (Kraus y
Miyamoto, 1991)y en especialconstruir árbolesevolutivosdelasfamilias
Cervidae (Miyanoto y col., 1990) y Bovidae (Allard y col., 1992). De acuerdo
con los estudios realizados, el suborden Pecora (orden Artiodactyla) aparece
hace 23-28 Myr, a finales del oligoceno, y es a principios del mioceno (hace
16 Mr> cuando, coincidiendo con la aparición de la sabana como nuevo
biotopoen Africa, seproducela rápidadiversificaciónde la familiabovidae.Por otro lado, la obtención de la secuencia completa del mtDNA de la
ballena (Arnason y col., 1991) y su comparación con la secuencia completa
de la vaca (Anderson y col., 1982) y las secuencias parciales (citocromo b)
de diversosungulados(Irwin y col., 1991), ha permitido clasificar a los
cetáceos como un grupo monofilético, estrechamente relacionado con el
ordenArtiodactyla, delque se separóhace 10 Myr (Fig 17 a) Además,
mediantePCRse hanobtenidosecuenciasparcialesde los genes12SrRNA
y 16 5 rRNA de 16 especiesde cetáceos.La comparaciónde estas
secuenciaspor los métodosde máximaparsimonia,máximaverosimilitudy
unión por vecindad ha permitido realizar un árbol filogenético del taxón (Fig.
17 b). Sorprendentemente, la tradicional división de los cetáceos en los
subordenesOdontocetíy Mysticeti, no es corroboradapor los datos
molecularesobtenidos(Milinkovitch y col., 1993).
Una cuestiónevolutivaenormementediscutida,ha sido el origendelos tetrápodos(vertebradosterrestres)a partir de los peces.Los estudiosde
morfología comparadarelacionan a los tetrápodoscon los peces del
superordenSarcopterigii.Sin embargo,no permitenaclararcuál de los dos
ordenesincluidosen este superorden,Crosopterigii (celacanto)o Dipnoi
(pecespulmonados)estámásrelacionadoconel origende los tetrápodos.Se
ha podido amplificar y secuenciarpor PCRpartede los genes128 rRNA y
Cyt b del DNA mitocondrialde un teleósteo(superordenActinopterigii), un
pez pulmonado sudamericanoy el celacanto.El alineamientode las
secuenciasobtenidascon la secuencia completa del DNAmitocondrial de
Xenopus laevis, y su posteriorcomparación mediante los métodos de
máxima parsimonia, unión por vecindad y distancia Wagner, ha permitido
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Introducción!45
establecerun árbol filogenético (Fig. 18 a) en el que el origen de los
tetrápodossesitúa más cerca de los pecespulmonadosquedel celacanto
(Meyer y Wilson, 1990). Estudiosmás recientes(Hedgesy col., 1993)
establecencon mayorprecisiónel origende los tetrápodos,al haberdonado
el genparael 16SrRNA enlasespeciesanteriormentecitadas,y ampliarel
análisisa especiesaustralianasy africanasdepecespulmonados(Fig. 18
b).
RatónRata
PecespulmonadosBallenaFocaVaca
Tetrapodos Hombre(Xenopuslanis ) Pollo
Xenopuslaevis
Celacanto Pezpulmonado(Australia)Pezpulmonado(Sudamérica
Pezpulmonado(Africa)
Actinopterygii Celacanto
Actinopterygii
a
Figura 18.Relaciones filogenéticas entre los peces vivos y las
tetrápodos.a) Se representael árbol filogenéticoobtenidopor el métodode máxima
parsimonia,resultantede compararlas secuenciasde partede los genesmitocondriales
del Citocromo b y 12S rENA de un pez pulmonado (Lepidosiren paradoxa), el
celacanto (Latimeria chalumnae), un tetrápodo (Xenopus taevis) y un teleósteo
(Cichlasoma citrinellum). Modificadode Meyery Wilson <1990). b) Arbol ohtenidopor
el métodode unión por vecindada partir de la comparaciónde las secuenciasde los
genes 12S, 165 y parte del cyt b de diversostetrápodosy pecessarcopterigios.Se
analizanespecialmentelas especiesde pecespulmonadosafricana (Protopterus sp.),
sudamericana(Lepidosiren paradoxa) y australiana (Neoceratodus forsteri).
(Hedgesy col., 1993).
EL mtDNA tambiénse ha utilizado en estudiosde divergencia
genéticay especiaciónde poblaciones.En estoscasosse comparanzonas
del DNA mitocondrialde evoluciónrápidacomo es el casode la región del
b
Introducción!46
D-loop. Este tipo de análisis,primeramente,se aplicó en estudiossobrelas
diferentes razas y poblaciones humanas (DiRienzo y Wilson, 1991) y sólo
recientementeen el estudiodepeces.Es dedestacarel estudio,aplicandoel
método UPGMA, de las relacionesfilogenéticasentrelas especiesde los
génerosOncorhynchusy Salmo (Thomasy Beckenbach,1989). Así
mismo, se ha estudiadola distribucióndel celacantoen el mar Indico
comprobándosequetodos los individuos pertenecena unamismapoblación
(Schlleweny col., 1993). El casocontrarioseha descritoparalos pecesdel
géneroTroplieus(Cichbdae)quevivenenel Lago Tanganica.Aunquetodos
los individuos estudiadospresentanla mismamorfología, el análisispor
PCR de partede la región de control del DNA mitocondrialy del gendel
citocromo b revela una sorprendentedivergenciagenéticaentre las
poblacionesdel lago y un fuerte procesode especiación(Sturmbauery
Meyer, 1992).
Finalmente,mereceser mencionadoque, aunquela mayoríade los
estudiossobrefilogeniamolecularbasadosen el DNA mitocondrialse han
centradoenlos vertebradossuperiores,la tendenciaexistentees retrocederpaulatinamenteen la evolucióne ir aclarando,progresivamente,la filogenia
de los peces(Digby y col., 1992), los vertebradosinferiores(Martin y col.,
1992; Martin, 1993)y los invertebrados(Cunninghamy col., 1992; Crozier
y Crozier, 1993; Valverde, 1993), quedandocomoreto para el futuro, el
abordajede lasrelacionesevolutivasenel, aúnpococonocido,reinoprotista.
MATERIAL YMRTODOS1
Material y Métodos/47
1. MATERIAL.
1.1. Materialbiológico.
Parael desarrollodelpresentetrabajosehanutilizadotruchasarco
iris (Oncorhynchusmykiss)procedentesde las piscifactoriasque Piszolla
S.L tieneen Zorita de los Canes(Guadalajara)y Cimballa(Zaragoza) Los
ejemplaresempleadoseranadultosy su pesooscilabaentre200 y 400 gr.
La extracción de los hígadosse realizó medianteincisión en la línea
medioventral.
1.2. Productosquímicosy bioquímicos.
Los productosutilizados en la elaboraciónde mediosde cultivo:
bactotriptona,extractode levaduray agarfueronsuministradosporla casa
comercial Difco. La ampicilinase obtuvo de Sigmamientrasque el X-Gal y
el IPTGdePromega.
Las endonucleasasde restricción, principalmenteEcoRí, Hindilí,
BamHI, PstJy PvuIl, asícomo la T4 DNA ligasa,el fragmentoKlenow y la
polinucleótidoquinasafueron suministradaspor Promega, la matriz
SephadexG-50 por Sigma. Los reactivospara electroforesisde DNA:agarosay bromuro de etidio se obtuvieron de Sigma. Los reactivos
utilizadosen la reacción de PCR fueron suministradospor Boehringer
Mannheim (dNTPs), Sigma (aceite mineral) y Fynnenzyme(DNA
polimerasa termoestable). La extracción a gran escala de DNAplasmídico
se realizó con las columnasQIAGEN-tiplOO suministradaspor la casa
comercialIZASA. El kit conlaT7 DNA polimerasaparala secuenciaciónes
de Pharmacia-Biotech. Los geles de secuenciación se realizaron con
acrilamida, N,N-metilenbisacrilamida, TEMEDy persulfato amónico de la
compañía Bio-Rad. El [a-35S]dCTP necesario para la secuenciación, se
consiguió a través de Nen Research.
Los reactivosutilizados en la extracción y caracterizacióndel
mtRNA estabanlibres de RNasa.El hidróxido de metilmercurioes de
productosAlfa, JohnsonMatthey GmBH (Karlsruhe, Alemania). Las
Material y Métodos!48
membranasde nitrocelulosautilizadas en la transferenciadel RNA
(Hybond) y el [ct-32P]dCTP empleadoen lashibridacionesprocedende
Amersham,asícomola películaHyperfilm.
Los disolventes órganicos, sales y demás reactivos utilizados para
este trabajo proceden de las casas Merck, Panreac y Sigma. Las distintas
disoluciones y tampones se prepararon con agua destilada o Milli Q(Millipore). Todos los compuestos y sustancias utilizadas presentaban el
mayor grado de pureza disponible comercialmente.
1.3. Vectores y estirpes bacterianas.
En el clonaje del mtDNA, se utilizó como vector el plásmido pUC18
suministrado por Boehringer-Mannheim. Se trata de un plásmido
multicopia(carecedelgenropimplicadoen el control de la replicación)que
confiere resistencia a ampicilina. Se caracteriza por poseer un fragmento
del gen lacZ de E. col¿, denominadolacZ’, que contiene la región del
promotor-operadordel gen,un polilinker con múltiples sitiosde clonaje(Hg.
19 a) y la secuenciacodificante del extremoamino-terminal de la
13-galactosidasa. La inserción de fragmentos de DNAen cualquiera de los
sitios únicosde restriccióndelpoliiinker conlíevala pérdidade ffincionalidad
de lacZ’ y los clonesrecombinantespierdenla capacidaddeformar colonias
de color azul en mediosdecultivo sólidosconX-Gal e IPTG (Yanisch-Perron
y col., 1985).
El clonaje de los productosde PCR se realizó con el plásmido
pGEM-T. Se trata de un vector de característicassimilaresal pUC18, pero
con diferentessitios únicosde restricciónen el polilinker (Fig. 19 b). El
plásmido es suministrado por Promega cortado y con desoxitimidinas en los
dos extremos 3’ del corte, que son las que se unen a las desoxiadenosinas
añadidasinespecíficamenteen los extremos3’ de los productosde PCRpor
algunasDNA polimerasastermoestables,permitiendoel clonaje.
La estirpebacterianautilizadacomohospedadorafue E. coli dM109
cuyo genotipo es: recAí endAl gyrA96 thi hsdRl7 supE44 reí Al A
(lac-proAB) [F’ tra D36 proAB+ lac Iq lacZAM15]. Se trata de una cepa no
recombinante carente del sistema de restricción, que contiene en el
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Material y Métodos!50
cromosomael gen lacZ inactivado por deleción. Este gen tambiénse
encuentraen el episomapero con la deleciónMiS que se complementa
conconel genlacZ’ de pUC18y pGEM-T. Estacepaseobtuvo deBoehringer
Mannheim.
14. Equipoutilizado.
Los aparatos más relevantes utilizados en la realización de este
trabajo de investigación han sido los siguientes:
- Agitadoresorbitales.
- HomogeneizadoreléctricoBraun Potter5.
- BañotermostáticoconagitaciónUnitronic320 OR,
PSelecta.
- Centrífuga Beckman J2-21 y rotor JA-20.
- Espectrofotómetro PYE-Unicam UV/VIS PU 8800.
- Cubetasy fuente de electroforesis de Pharmacia-
Biotech.
- Transiluminador 2011 Macrovue, Pharmacia-Biotech.
- Termociclador automático Minicycler, Md Research.
- MicrocentrífugaSorvail (Dupont).
- ContadorGeigerPUG-1(Technicalassociates).
- CámarainstantáneaPolaroidDS 34.
- SecuenciadorMacrophor2010,Pharmacia-Biotech.
- OrdenadoresVAX-VMS Digital DEC 3000 (Alpha) delCentro de Biología Molecular (CSIC/ Universidad Autónoma
deMadrid) y delCentroNacionalde Biotecnología.
- SecuenciadorautomáticoAIF , Pharmacia-Biotech.
- SintetizadordeoligonucleótidosGeneMsemblerPlus,
Pharmacia-Biotech.
Matenal y Métodos!51
2. METODOS.
2.1. Aislamientode mitocondria4s(Lansmany col., 1981).
Una buena extracción de mtDNA se basa en una eficiente
separación de los núcleos intactos (con el DNA nuclear) del resto de
componentes citoplasmáticos. Por eso, como fuente de mtDNA se eligen
tejidos tales como hígado,riñón y corazónen los que la rotura de la
membrana citoplasmática no afecta a la integridad de la envoltura nuclear.
Así mismo es conveniente utilizar tejidos ftescos o conservados a 40C, ya
que la congelación rompe la membrana nuclear, reduciendo hasta un 50%el
rendimientode la extraccion.
La separaciónde los núcleosy la posteriorpurificación de las
mitocondriasserealizómedianteunacentrifúgacióndiferencial.Paraello, el
hígado de trucha fue cortado en porciones de alrededorde 2 gr y
homogeneizado en 10 ml de tampón MSB(Manitol 0.21 M, Sacarosa 0.07 M
y Tris-HCl 0.05 MpH 7.5) en presencia de CaCI2 3 mM. Posteriormente se
añadióEDTA hastaunaconcentraciónfinal de lOmM. Lapresenciade Ca2+
durantela homogeneizaciónreducela rotura de los núcleos;la adiciónde
EDTA minimiza la agregaciónde las mitocondriasy ademásinhibe la
actividaddelas posiblesnucleasaspresentes.
Los núcleos y restos celulares fueron eliminados del homogeneizado
mediantedos centrifugacionessucesivasa 700 x g durante5 mm. Las
mitocondriasfueronrecuperadasdel sobrenadantecon una centrifugación
de 10 mm a 10000 x g. El sedimentofue lavado 3 veces con 20 ml de
tampón MSB en presenciade EDTA 10 mM y de nuevorecuperado
mediante una centrifugación. Todas las centrifugaciones se realizaron a
4”C.
22. Extracciónde mtDNA (Palvay Palva, 1985).
El sedimentoaltamenteenriquecidoenmitocondriasfue resuspendido
en 200 gí de tampónGTE (Glucosa50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.0 y
EDTA 10 mM) y 7 jal de RNasaA (10 mg/mi). Paralisarlas mitocondriasy
Material y Métodos!52
desnaturalizarel DNA nuclearcontaminantese añadieron400 >.d de una
solución reciénpreparadade NaOH 0.2 M y 1% de SDS, se mezcló
suavementeparaevitar la roturadelmtDNA y seincubó 5 mm enhielo. Sedetuvola lisis con la adición de 300 pl de acetatopotásico3M pH 4.8 y tras
2 muí a-700C secentrifugó10 mm a 10000x g a40C.
Se recuperóel sobrenadantecon el mtDNA y conel fin de eliminar
contaminantes de origen proteico se mezclé con 1 ml de fenol saturado en
agua.Una centrifugaciónde 5 mm a 10000x g permitió separarlas fases.
Se recuperóla faseacuosay serepitió la extracciónfenólica. Con el objeto
deeliminar cualquierrestode fenol en la faseacuosa,seañadió 1 ml deuna
solución cloroformo:isoamílico, 24:1. Se recuperó de nuevo la fase acuosa y
seañadierón0.6 volumenesde isopropanol.Una incubaciónde 5 mm a
-700C y unacentrifugaciónde 10 mm. a 10000 xg permitieron recuperar el
mtDNA en forma de precipitado,queunavez lavadocon 200 ¡.11 deetanol
70%, seresuspendiófinalmenteen 15 pl de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0 y
EDTA 1 mM).
2.3. CromatografiaenSephadexG-50mediantecentrifugación.
(Sambrooky col., 1989).
Los métodos desarrollados para el aislamiento de DNAno permiten
conseguir una purificación perfecta y, en muchas ocasiones,los
contaminantes arrastrados en el proceso de extracción pueden actuar como
inhibidores en reacciones posteriores. Por ello, el mtDNA extraído fue
cromatografiadoenunacolumnade SephadexG-50conel objetodeeliminar
sales,proteínas,fenol, etc.
La resma fue equilibradaen tampón TE y empaquetadaen una
jeringade plásticode 1 ml medianteuna centrifugaciónde 1 muí a 2000 x g.
A continuación,selavó añadiendo1 ml deTE y centrifugando 3 mm a 2000
x g. Finalmente, se aplicó la muestra en la columna y se centrifugó de nuevo
3 mm a 2000 x g con el fin de recuperar el mtDNAlimpio en el eluido.
Material y Métodos!53
2.4. ExtraccióndemtRNA (Attardi y Montoya,1983>.
Paraevitar la degradacióndel mtRNA por RNasas,esnecesarioque
todo el material y tampones utilizados en la extracción estén estériles. El
sedimento con las mitocondrias lavadas fue resuspendidoen4ml detampón
pronasa(Tris-HCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM y NaCí 150mM) e incubado
5 muí en hielo en presenciade pronasaa una concentraciónfinal de 100
gglml. A continuaciónseañadióSDShastaunaconcentraciónfinal del2% y
posteriormenteseincubódurante30 ruin a temperatura ambiente. Tras la
incubaciónse añadieron4 ml de una soluciónde fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico,25:24:1. Se agitó fuertementedurante5 mm y se centrifugó a
5000x g durante5 ntn. Serecuperóla faseacuosay serepitió la extracción
fenólica. Posteriormente,se recuperóde nuevo la fase acuosay se
añadieron2 volúmenesde etanola ~20oC.Se incubé2 horasa ~70oCy se
centrifugó a 10000 x g durante30 mm para recuperarel mtRNA
precipitado,queseresuspendióen 500 II deTE.
2.5. Cromatografía con oligo(dT) - celulosa (Aviv y Leder, 1972).
A diferencia de los rRNAs y tRNAs mitocondriales, los mRNAs
presentan colas polí (A) en sus extremos 3’ y por ello pueden ser purificados
medianteunacromatografíade afinidadcon oligo(dT)-celulosa.Paraello, se
resuspendieron0.1 gr de la matrizen25 mi> deNaOH0.1 N. Sepreparóuna
columnacon 5 ml de la solucióny unavez empaquetadaselavó con 10 ml
detampónsalino( Ths-HCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM y NaCí0.15M).
El mtRNA total se desnaturalizómedianteincubación a 650(3
durante5 mm y posteriorincubaciónen agua/hielo. Se le añadióNaCí
hasta una concentración fina] 0.15 M y se aplicó sobre la columna. A
continuación se pasaron 8 ml del tampón saluío y se recogió el eluido con las
especies de mtRNAno poliadeniladas (A-). Las especies poliadeniladas (A~)
retenidas en la columna fueron eluidas mediante la adición de 8 ml de TE, se
desnaturalizarona 650(3, se lesañadióNaCí hastaunaconcentraciónfinal
de 0.15 M y de nuevo fueron cargadasen la columnapreviamente
Material y Métodos!54
equilibradacon 8 mil de tampónsalino. La adiciónde 8 ml de TE permitió
recuperar los mtRNAsoligo o poliadenilados.
Tanto las especies poliadeniladas como las no poliadeniladas fueron
precipitadas mediante la adición de 2 volunenes de etanol a ~20oCy la
incubacióna ~7OoC durante2horas.En e] caso de la fracción poliadenilada
se añadieronpreviamente20 ~igde tRNA de levadurapara favorecerla
precipitación. Una centrifugación a 10000x g de 30 mmpermitió recuperar
las fracciones A- y A~ que fueron resuspendidas en 250 pl de TE. Las
especies A~ fueron de nuevo precipitadas y resuspendidas en 25 pl de TE.
2,6. DeterminaciónanalíticadeDNA y RNA.
- Cuantitativa: La concentración de ácidos nucleicos se valoró
midiendola absorbanciaa 260 mr de alícuotascon 2 y 4 jal deDNA o RNA
diluidosen600 pl de agua.1 Unidadde Absorbanciade DNA aesalongitud
de ondaequivalea una concentraciónde50 ag/ml. 1 unidaddeabsorbancia
de RNAa 260 nmequivale a 42 gg/ml (Brown, 1991).
- Cualitativa: Para visualizar el DNA serealizarongelesde
agarosaal 0.8 y 1.5 % en tampón TBE (Tris-HCI 89 mM pH 8.2, ácido
bórico 89 mM y EDTA 2.5 mM) con bromurode etidioa unaconcentración
de 0.3 gg/ml. Los marcadoresde pesomolecularutilizadosfrieron ?4.HindIII
y 0X174 Haelil. Las electroforesisse realizaronen TBE a un voltaje
constantede80 voltios. El DNA sevisualizó con luzultravioleta y los geles
fueron fotografiados para su posterior análisis. (Andrews, 1991).
Para visualizarel RNA se realizarongelesde agarosaal 1.4% en
tampón Borato (ácido bórico 50 mM, tetraboratosódico 5 mM, sulfato
sádico10 mM y EDTA 0.1 mM> con hidróxidode metilmercurio(CHgHgOH)
5mM tratado con amberlita (Fernández-Silvay col., 1992). Las
electroforesisse corrieron a un voltaje constantede 120 voltios con
recircularizacióndel tampón.E] gel fue teñidomedianteincubaciónde 20
muíen unasoluciónde acetatoamónico0.2 M con 2 ~.¡g/mlde bromurode
etidio y posteriormentelavado2 ó 3 vecescon aguadestilada. El RNA se
visualizó con luz ultravioleta y los geles fueronfotografiados para su
Material y Métodos!55
posterioranálisis.
2.7. Clonaje(Thomasy Beckenbach,1989).
Para donar el mtDNA de trucha se eligió como vector el plásmido
pUC18. Una solución que contenía 1 ¡tg de mtDNAy 0.2 gg de pUCl8 fue
digerida con 1-3 unidades del enzima de restricción apropiado en un volumen
final de 20 fil. Tras una incubación de 2 horas a 370(3, el enzima de
restricciónfue extraído con fenol. Los restos de fenol, sales y otros
contaminantesfueroneliminadospasandola mezcla a través de una
columnade SephadexU-SO. Se añadieron2 gí deacetatosódico3M pH 6.8y
40 iii de etanoly se incubó a ~70oCdurante5 mm paraprecipitar los
fragmentosde DNA resultantesdela digestión.Tras una centrifugación
delO ruin a 10000x g, el DNA fue lavado con una soluciónde etanolal 70%
y resuspendidoen 8 gí de tampónde ligamiento{Tris-HCl 30 mM pH 7.8,
MgCI2 10 mM, DTT 10 mM y ATP 1 mM). A continuación,seañadieron3
unidadesde T4 DNA ligasa,seincubó3 horasa150(3,de nuevoseañadieron
3 unidadesmásdeT4 DNA ligasay sedejó todala nochea 4o(3~
2.8. PCR(Saiki y col., 1988).
Las regiones del mtDNA de trucha que no pudieron ser donadas
directamente en el plásmido pUC18 fueron amplificadas mediante la
reacción de la polimerasa en cadena (PCR) y a continuación donadas en el
vector pGEM-T. En cada reacción, a 47 jal de tampón de PCR(50 mMKCl,
10 mMTris-HCl pH 8.3, 1.5 mMMgCl2, 0.001% gelatina, 0.05% Nonidet
P40,0.05% Tween20, 300 iM de cadadNTP) seañadieronsucesivamente
0.1 ~tgde mtDNA, 1 unidadde DNA polimerasatermoestabley 150 ngde
cada uno de cebadores diseñados a partir de secuencias conocidas del
mtDNA detrucha.
Con el fin deevitar la evaporaciónse añadióunafina capade aceite
mineral y despuésde un breve calentamientode 2 mm a 94 0(3 para
desnaturalizarcompletamenteel mtDNA, serealizaron35 ciclos cadauno
conlas siguientesetapas: 1 mm a94 0(3 (desnaturalización),1 mm a 50 ~(3
Material y Métodos!56
(anillamiento)y 1 mm a 72 0(3 (elongación).Finalmentese incubó la
reaccióna 72 0(3 durante10 mm con el fin de elongarcualquierproducto
inacabado.Los productosde PCRobtenidosfueron analizadosengelesde
agarosa al 1.5% y aquellos que presentabanel tamaño esperadofueron
ligados al vector pGEM-T con el mismo protocolo utilizado en el clonaje del
mtDNA.
2.9. Obtenciónde célulascompetentes(Hanahan,1983).
Los plásmidosrecombinantesobtenidosenel clonajedel mtDNA y
los fragmentosde PCR, fueronintroducidosen la bacteriaE. coli JM
109.Para ello, fue necesario previamente, someter a esta bacteria a un
tratamientoque le hiciesesermásreceptivaala entradadelvector. Una
colonia deE. coli dM109fue inoculadaen SmI de SOB (Bactotriptona2%,
extracto de levadura 0.5%, NaCí 10 mM, KCI 2.5 mM, MgCl2 10 mMy
MgSO4 10 mM) y cultivadaduranteuna nochea 37O(3~ Un alícuotacon 200
iii de estecultivo fue sembradoen 10 ml demedioSOB frescoeincubadoa
370(3 hastaquela densidadóptica alcanzadaa 550 mr fue de 0.45- 0.55(equivalentea4 - 7 x 10~ células/ml).
Una vez enfriado el cultivo enhielo, las célulasfueronrecogidas
medianteuna centrifugaciónde 10 mm a 4500 x g. El sedimentofue
resuspendidoen 800gí detampónTFB (KCl 100 mM, MnCl - 4H20 45 mM,
CaCl2 - 2H20 10 mM, HACoCl3 3 mM y K-MES 10 mM) e incubadoenhielo durante15 ruin. Trasunacentrifugaciónde 10 mm a 4500 x g, las
célulasfueron resuspendidasen 200 gí deTFB. Se añadieron7 pl de una
solución DnD [90% (y 1 y) de dimetilsulfóxido, ditiotreitol 1M, acetato
potásico 10 mM] y se incubó durante 15 mm en hielo. Se repitió el
tratamiento con DnD tras el cual, se considera que las bacterias han
adquirido el estado de competencia.
2.10. Transformación (Hanahan, 1983).
A cadauna de las reaccionesde ligamientose añadieron50 ití de
bacterias competentes y se incubó la mezcla durante 30 mm en hielo. Se
Material y Métodos!57
sometióa un choquetérmicode 90 sga 420(3. Con el fin de posibilitar la
reparación de las paredes celulares de las bacterias, estas fueron incubadas
en un medio rico 80(3 (SOB suplementado con glucosa 20 mM) a 370(3
durante45 mm. A continuaciónfueronsembradasen placasde LB que
conteníanampicilinaa unaconcentraciónfinal de 50 ~g/ ml. Justoantesde
la siembraacadaplacasele añadieron40 pl deunasolucióndeX-gal al 2%
en dimetilformamiday 25 pl de IPTG. Las placasfueroncultivadastoda la
nochea 370(3
2.11. Análisisde recombinantes(Sambrooky col., 1989).
Las coloniasrecombinantessereconocenpor carecerdecolor azulal
no poder metabolizar las bacterias que las componen el X-gal por contener
un inserto en el vector pUC18. Estas colonias fueron cultivadas a pequeña
escala y su DNAplasmídico extraído. Para poder ratificar la presencia de
inserto en los plásmidos, se realizó una digestión de 2 horas a 370(3 conel
mismo enzima utilizado en el clonaje. Una electroforesis en geles de agarosa
al 0.8% permitió identificar aquellos clones que contenían los insertos
buscados, así como su tamano. Estos clones fueron cultivados a gran escala
y su DNAplasmídico fue extraído para ser secuenciado.
2.12. Extracción de DNAplasmídico.
- A pequeñaescala(ntniprep):La extracciónde DNA plasmídicode
los clonesseleccionadosse realizó de acuerdocon el métodode Birboim y
Doly (1979). Cadacolonia fue inoculadaen 5 ml de Terrific Broth (Tartofy
Hobbs, 1987)y cultivadadurantetodala nochea 37o(3• Las célulasfueron
recogidasmedianteuna centrifugacióna lOOOOx gde 1 mm y resuspendidas
en 200 pl de GTE. A continuaciónseprocedióa lisarlas bacteriasmediantela adiciónde 200pi de una soluciónreciénpreparadadeNaOH 0.2M, SDS
1%. Se mezcló por inversión para evitar la rotura del DNAplasmídico. Tras
una incubación de 5 mm en hielo, la lisis alcalina fue detenida mediante la
adición de 200 pl de acetato potásico 3MpH 4.8. Una incubación de 15 mm
en hielo, consiguió precipitar los restos celulares, y el DNAcromosómico
Material y Métodos! 58
desnaturalizadopor el NaOHy una centrifugaciónde 5 mm a 10000 x g
permitió eliminar este precipitado. El sobrenadante fue sometido a una
extracción fenólica para eliminar proteínas y a continuación, el DNA
plasmidico fue precipitado mediante la adición de 2 volúmenes de etanol frío
(a ~20oC) y la incubaciónenhielo durante10 mm. El DNA fue recuperado
medianteunacentrifugaciónde 10 mm a 10000 x g. Se lavó con 200 ~l de
etanol al 70% y seresuspendióen 50 gí de TE. Alícuotasde 5 ~il fueron
utilizadosparael análisisderestriccióny la secuenciaciónmanual.
- A gran escala(midi y maxiprep): La secuenciaciónautomática
requiere DNA de gran purezaen grandesconcentraciones.La forma
tradicionalde obtenerDNA con estascaracterísticaserasometerel DNA
extraídode cultivos de hasta500 ml a unaultracentrifugaciónduranteal
menos 16 horas en un gradiente de cloruro de cesio. Este procedimiento
altamente tedioso y caro ha sido sustituido recientemente por la aparición
decolumnasconmatricescapacesdepurificar el DNA apartir de, tansólo,
100 ml de cultivo con una calidadsimilar a la obtenidapor el método
antiguo.En nuestrocasoseutilizaron lascolumnasQuiagenquepermiten
obtener50 pi de DNA plasmídicocon concentracionesentre 1 - 4 mg! ml
libre deproteínas,DNA cromosómico,RNA y sales.
2.13. Marcajede sondas.
Con el fin de identificar las distintas especiesde mtRNA que
aparecen en los geles de hidróxido de metilmercurio se realizaron
hibridacionesutilizando sondasdiseñadaspara reconocerexclusivamente
un únicogen. Fragmentosde restriccióncon un tamañovariableentre80 y
1500 nucleótidosfueron desnaturalizadosy marcadosal azarmediante
incubación a 370(3 con hexanucleótidos, dNTPs y [ct-32P]dCTP(3000 Ci!
rumol), en presencia del fragmento Klenow de la DNApolimerasa de E. cali.
Al cabo de 1 hora, se pasaronlos fragmentosmarcadosa travésde una
columna de Sephadex U-SO con el fin de eliminarlos nucleótidosradioactivos
no incorporados. La eficacia del marcaje sr comprobó con un contador
Geiger.
Material y Métodos!59
2.14. Transferenciaa membrana e hibridacióndel RNA (Thomas,
1983).
La transferenciade RNA desdegelesamembranasde nitrocelulosa
(Northern) se realizópor capilaridaden presenciade 2OxSSC (3M NaCí,0.3M Citrato trisódico)durante16 horassegúnel siguienteesquema:
Peso
CristalToallasdepapel
Whatmann3MMMembrana
Gel
No se realizó ninguntratamientoprevio del gel paraeliminar el
hidróxido demetilmercurio.Terminadala transferencia,la membranase
dejó secaral aire y el RNA fue fijado mediantecoccióna 800(3 durante2
horasdentrodeunabolsadeplásticoquecontenía10 ml de unasolucióncon
formamidaal 50%, SxDenharts(looxDenhardts:2% ficolí, 2% polivinil-
pirrolidonay 2% BSA), 5xSSC,0.1% SDSy 200 ~xgImldeDNA de esperma
desalmónsonicadoy desnaturalizado.Se selló la bolsay seincubó a 420(3
duranteal menos1 hora.Para la hibridación,seretiró el líquidode la bolsa. Las sondasse
desnaturalizaron mediante incubación durante 5 mm a 1000(3 y posteriorincubación en agua! hielo y se mezclaron con 2 ml de solución de hibridación
(50% formamida, lxDenharts, 5xSSC, 0.1% SDS y 200pg/ml de DNAde
esperma de salmón). Se añadieron a la bolsa con la membrana y se incubó
durante 16 horas a 42o>C.
Seguidamente, el filtro fue lavado con 2xSSC, 0.1% SDSdurante 15
mm, primero a temperatura ambiente y después a 650(3. Finalmente,la
membranasin secarfue expuestaa una película de RayosX a ~80oC en
presencia de una pantalla intensificadora y se observaron los resultados a
las 2-16horas.
2OxSSC
Material y Métodos! 60
2.15. Síntesis de oligonucleótidos.
La síntesis de los oligonucleótidos utilizados en la secuenciación o el
PCR serealizóde maneraautomáticaen el aparatoGeneAssemblerPlus
de Pharmacia Biotech. El proceso esta basado en la reacción de
condensaciónentre el grupo hidroxilo enposición5’ de un nucleátidoy el
fosfato enposición3’ de otro. Con el fin deevitar quelos gruposhidroxilo del
aguacompitancon los del azúcar,el acoplamientoserealizaen condiciones
de absolutaausenciade aguaen disolventesorgánicos,normalmente
acetonitrilo.
Sin embargo,losnucleótidossonextremadamentehidrofílicos y, por
tanto, insolublesen acetonitrilo.La protecciónde los sitiosreactivosde los
nucleótidoscon gruposhidrofóbicoselimina esteproblema.El hidroxilo en
posición 5’ es protegidocon4,4’-dimetoxitritilo (DMTr). Los gruposamino
primarios de las basesnitrogenadasson protegidostransformándo]osen
gruposamida. El hidroxilo delgrupo fosfatoesprotegidousandoB-cianoetilo.
Un nucleótidocompletamenteprotegidosedenominaarnidita.
La síntesis automática consiste en ciclos de desprotección-
condensaciónde los nucleótidosa partir de la primera amidita que se
encuentraunidaaun soportesólido. Unavezsintetizadoel oligonucleátido,
se producela desprotecciónfinal y la separacióndel soportemedianteuna
incubación en amoniaco.Finalmente,el oligonucleótidoes purificado
mediantecromatografíaenSephadexU-25.
2.16. Secuenciaciónmanual(Tabory Richardson,1987).
El métodomás empleadoparasecuenciarel DNA se basaen la
imposibilidadpor partede las DNA polimerasasde elongarunacadenade
DNA en la quesehayanincorporado2’, 3’ didesoxinucleótidos(Sangery col.,
1977). La regióndeDNA quesesecuenciavienedeterminadapor el cebador
elegido.Todaslas cadenasnacientesde DNA se originan a partir de este
cebador,generándosefragmentosquedifieren en una basey puedenser
separadosen un gel e identificadospor el ddNTP terminal. Aunque
Material y Métodos!61
originalmentese utilizó el fragmentoKlenow de la DNA polimerasade E.
cali, en la actualidadha sido sustituidapor la DNA polimerasadel fago T7
portenerunamayorprocesividady unamenoractividadexonucleasa.Dada
la capacidadde esteenzimaporincorporarddNTPsconla mismafacilidad
que dNTPs, se hacenecesarioen la prácticadividir las reaccionesde
secuenciaciónendos etapas,unade marcajey extensión,sin ddNTPsy otra
de terminaciónenpresenciadelos ddNTPs.
En la secuenciaciónmanualsepuedeutilizar indistintamenteDNA
procedentede“mxm” o “midipreps”. Normalmente,se partede 1.5 -2 gg de
DNA en un volumen de 10 ~l. Se añadeNaOH hastauna concentración
final de400 mM y seincubadurante10 ruin a temperaturaambienteparadesnaturalizarel DNA. Se neutralizala reaccióncon 0.1 volúmenesde
acetatosódico3M (pH 4.8) y se precipitael DNA con 2.5 volúmenesde
etanoldurante15 mm a ~70oC.Tras el lavadocon etanolal 70% sesecael
sedimentoal vacío y se resuspendeen 10 ~il de agua(Hattori y Sakaki,
1985).
A continuación,se añaden8ng del cebadorapropiadoy serealizasu
aniilaniientoal DNA medianteunaincubaciónde 20 mm a370(3y de 10 mm
a temperaturaambiente.La reacciónde marcajeserealizamedianteuna
incubaciónde 5 mm a temperaturaambientede la solución de DNA en
presenciade dNTPs, T7 DNA polimerasay 10 gCi de 355 - dCTP.
Finalmente,el productode estareacciónesañadidoa cuatromezclasque
contienenlos cuatrodNTPsy uno de los ddNTPs.Se incuba5 mm a370(3 y
sedetienela reacciónadicionandoformarnida.
2.17. Secuenciaciónautomática(Ansorgey col., 1987)
Al igual quela secuenciaciónmanual,la secuenciaciónautomática
estábasadaenel métodode Sanger(1977).En estecaso,un oligonudeótido
marcadoen su extremo5’ con fluoresceínaes elongadopor la T7 DNA
polimerasaencuatroreaccionesindependientescadauna enpresenciade
un 2’, 3’ didesoxinucleótidodiferente(ddATP, dd(3TP,ddGTPy ddT’I’P). Las
reaccionesson cargadasen un gel de poliacrilamidaal 6%, urea7M.
Durantela electroforesis,las bandasde DNA migranpor el gel y emiten
Material y Métodos!62
fluorescenciaal ser excitadaspor un rayo laser colocadoen sentido
perpendicularal gel. La fluorescencia emitida es detectadapor
fotodetectoreslocalizadosdetrasdel gel y a continuacióndigitalizaday
procesadaporun ordenador(Fig. 20).
2.18.Análisis de secuencias.
El análisisde la secuenciacorrespondienteal mtDNA detruchafue
realizadoconel paquetede programasGCG dela Universidadde Wisconsin(Deverauxy col., 1984)enlos ordenadoresVax delCNB (CentroNacionalde
Biotecnología)y el CBM (Centrode BiologíaMolecular).
Las secuenciasfueron introducidasy editadascon el programa
SeqEd. La identificación de los genesse realizó con los programa Map y
Tranalate. Los sitios de restricción fueron localizados con el programa
Map. La composición en bases y el uso de codones del mtDNA se
obtuvieron con los programasComposition y Codon Frequency
respectivamente.En la búsqueday obtenciónde secuenciasenlos bancosde datosse
manejaronlos programasStringSearch y Fetch. El alineamientode
secuenciasse realizó con el programaGap que utiliza el algoritmo de
Neediemany Wi.msch (1970). El programaFastA (Pearsony Lipman,1988)seutilizó pararealizarlasbúsquedaspor similitud desecuenciaen los
bancosde datosGenBank,EMBL y SwissProt.
Los árbolesfilogenéticosfuerongeneradoscon el programaPileUp
del paqueteGCG y los programasPhylip (Felsenstein,1989) y Clustal y
(Higgins y Sharp, 1989) quetienenimplementadoslos algoritmosde los
métodosdemáximaparsimonia,uniónporvecindady máximaprobabilidad.
Finalmente,el programaMacMolly (Soft Gene,Berlin) fueutilizado
paraestablecerposiblesmodelosdeplegamientodeproteínas.
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RESULTADOS1e>1
Resultados! 64
1. EXTRACCION DEL mtDNA DE TRUCHA ARCO IRIS.
Con el objeto de donary secuenciarel mtDNA dela truchaarco iris
se extrajeronlos hígadosde varios ejemplaresadultosde esta especie.
Debido a lo laboriosodel proceso,no se pudoextraerinmediatamenteel
mtDNA de todos ellospor lo que algunosfueronguardados16 horas a 40(3
antes de ser utilizados. A partir de estoshígados se obtuvieron las
mitocondriaspor centrifugacióndiferencial(Lansmany col., 1981) y el
mtDNA por el método de lisis alcalina (Palva y Palva, 1985). No se
apreciarondiferenciassignificativasen el rendimientode extracción,tanto
de las mitocondriascomo del mtDNA, segúnel hígadofueserecienteo
conservadoa 40(3
Las truchas de 200-400 gr de peso poseían un hígado de
aproximadamente4 gr, delquenormalmenteseextrajeronentre5 y 10 ~tg
de mtDNA. Al analizarelectroforeticamentesobregelesdeagarosaal 0.8%
unamuestrade estemtDNA, seobservóque apenasestabacontaminado
conDNA nucleary queel tratamientoconRNasahabíasido efectivoya que
no seobservópresenciadeRNA (Fig. 21).
2. MAPA DE RESTRICCION DEL mtDNA DE TRUCHA ARCO IRIS.
El mtDNA de trucha fuedigerido con enzimasde restricción(EcoRI,
HindIII, PstI,BamHI, Apal, NruI y PvuII) quereconocendianasde seis
nucleótidos.De estaforma, se obtienenfragmentosdeun tamañoadecuado
para su posterior donación y se favorece la elaboración del mapa derestricción.Los fragmentosobtenidosfueronanalizadosengelesde agarosa
al 0.8% (Fig. 21a) y sustamañosrelativosseindicanenla Fig 21b. Puesto
quela sumade los fragmentosgeneradospor las distintasenzimaserade
aproximadamente16 kb, y sin embargo,la sumadelos fragmentosEcoRí
era de sólo 12.8kb, se pensóen la existenciade dosfragmentosde 4 kb en
lugar de uno en el corte EcoRI. Este hechose pudo confirmar, como
veremos, posteriormente.
Paracompletarel análisisde restricción,serealizarondoblescortes
con las mismasenzimasy, con los datosobtenidos,se elaboróun mapade
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00
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.——
—
o—
-o
Resultados! 66
restricción aproximado del mtDNAde trucha arco iris (Hg. 22).
PstI
HmdIII
Hindilí
Figura 22. Mapade restriccióndel mtDNA de trucha arco iris. Se señala
únicamentela posición delas enzimasutilizadasen el clonajedel mtDNA.
3. GENOTECASEcoRI, Hindilí Y PvuII DEL mtDNA DE TRUCHA. ESTRATEGIA
DE CLONAJE
Entre los diferentespatronesde restricción obtenidosseeligieron
para realizarla donacióndel mtDNA los producidospor EcoRí,HindIII yPvuII, por ser estasenzimaslas máseficientesen cuantoa la digestióny
por producirfragmentosderestriccióncon un tamañomásadecuadopara
suinserciónenpUCiS (0.5 - 9 kb).
En el método empleado, la eficiencia de clonaje de los fragmentos
pequeñoses mucho mayor que la de los grandesy por ello se necesita
analizarun gran número de recombinantes.En el caso de la genoteca
EcoRI, se analizaron40 posiblesrecombinantes.De ellos, 34 contenían
BamnHí-
EcoRI
Resultados! 67
como insertoel fragmentode 0.8 kb, 4 conteníanun fragmentode 4 lib y 2
carecían de inserto alguno. Con el fin de conocer cuantos tipos de inserto
conteníanlos clones con un fragmentode 4 kb, se realizó un pequeño
análisisderestricción. Los cuatro clonesteníanun mismofragmento,que
conteníaen su secuenciauna diana para Pstl, pero no paraHindIlí o
BamHI.
En el caso de la genoteca Hindilí, se analizaron 30 posibles
recombinantes.Cinco conteníanel insertode 1.1 lib, doceconteníanel de
1.2 kb, unoel de 2.2 kb y otro el de 3.5 kb. Además,cinco clonescontenían
un inserto de 025 kb y cuatro no conteníaninserto alguno. No se
encontraronclones con los fragmentosde 6.5 y 1.7 kb. Dado que el
fragmentode 4 kb de la genotecaEco Rl no conteníadianasparaHindilí,
éste sólo podíaestarlocalizadodentrodel fragmentoHindlII de 6.5 kb, lo
cual implicaba que la combinaciónde las genotecasHindilí y EcoRí
comprendía,aproximadamente,un 75%(12.25kW> delmtDNA de trucha.De la genotecaPvuII, seobtuvierondos clonesconlos fragmentosde
2.3 y 2.5 kb insertados.El fragmentode 2.3 kb selocalizó en el mapade
restriccióndentro del fragmentoEcoRí de 4 lib ya donado,por lo que se
utilizó comosubclonde secuenciacióndedicho fragmento.El fragmentode
2.5 lib comprendíael fragmentoHindIII de 1.1 kb completoy partede los
fragmentosHindIII de 1.2 y 1.7 lib, lo que, posteriormente,permitió
secuenciarparcialmenteel fragmentoHindIII de 1.7 kb.
El resto del mtDNA de truchaarco iris fue donadocondiferentes
estrategias.Primeramente,se realizarondiversasgenotecascon cortesde
restriccióndobles. Aunquela mayoríade los clonesprocedentesde estas
genotecasconteníanfragmentosya donados,aparecierondos nuevos
clonesque conteníanun fragmentoHindIII-EcoRI de0.5 lib y un fragmento
EcoRI-BamHIde 1 kb. A continuación,seclonó el fragmentoHindIII de 1.7
kb medianteelectroeluciónespecíficadel fragmentode un gel deagarosay
posterior ligamiento al vector. Se pudo comprobar que los clonesque
conteníanel fragmentocomoinserto, teníanun númeromuy bajode copias
del plásmido, lo cualexplicabala dificultad paradonarel fragmentode 1.7
lib directamente de la genoteca Hindil!. Finalmente, el clonaje del mtDNA
de trucha arco iris se completó con la amplificación mediantePCR y
Resultados! 68
posterior donación en el plásmido pGEM-T de un fragmento
HindIJI—BamHIde 0.7 kb. El resumengráfico de la donacióndel mtDNA de
truchaarcoiris se muestraen la Figura23.
23 456789 10
¡11 12
u
Figura 23. donación del mtDNA de trucha arco iris. Electroforesisen
gelesde agarosaal 0.8% de los clonesquecontienenel mtDNA de truchaarco iris. La
digestión con la enzima apropiadade] plásmido recombinante,permite extraer el
inserto. Los marcadoresutilizados son: 2. Hindilí y 0X174 haelIl (1). Los fragmentos
donadoscon EcoEltienenun tamañode 0.8 (2> y 4 kb (3). Los fragmentosdonadoscon
HindIII tienen 0.25 (4), 1.1 (5), 1.2 (6), 1.8 7), 2.2 (8) y 3.5 kb (9). El fragmento1-lindilí-EcoRí tiene 0.5 kb (10). El fragmento EcoRl-BamHI tiene 1.3 kb <11> y el
fragmentoHindilí-BamEl tiene 0.7 kb (12). Los vectorespUCiS y pGEM-T tienenun
tamañode 2.8 y 3 kb respectivamente.
4. SECUENCIADEL mtDNA DE TRUCHA ARCO IRIS.
Para secuenciarpor completo el mtDNA de trucha arco iris se
utilizaron, en total, 15 clones (Tabla 11). Los clonesfueron secuenciadosen
ambasdirecciones(Fig. 24). Primeramente,cadaclon sesecuenciécon dos
oligonucleótidosuniversalesque reconocíanespecíficamentelos extremos
Resultados! 69
Clon TamañoVector Fragmentode restnccnon1 (nt)
pTRZ~-0 pU(3 18 EcoRJ-HindJIl 643
pTRZ-11 pUC 18 HindIlí 244
pTRZ-12 pU(3 18 HindIlí 1121
pTRZ-13 pUC 18 HindIlí 1225
pTRZ-14 pUC 18 HindIlí 1792
pTRZ-15 pU(3 18 HindlJI 2209
pTRZ-16 pU(3 18 HindIlí 3463
pTRZ-2 pUC 18 EcoRJ 4035
pTRZ-2a pUC 18 EcoRl-PstJ 2751
pTRZ-2b pUC 18 PstI-EcoRI 1284
pTRZ-2c pUC 18 PvuIJ 2386
pTRZ- 3 pU(3 18 EcoRí 762
pTRZ- 4 pUC 18 PvuII 2596
pTRZ- 5 pU(3 18 BamHI-EcoRI 1229
pTRZ- 6 pGEM-T HindIlI-BamHI 699
Tabla II. Clonesempleadosen la secuenciacióndel mtDNA detruchaarco iris. Como vectordeclonajeseutilizó el pUC 18, exceptoen el casodel clonpTRZ-6
que provienedel clonaje de un productode PCR. De los 15 clonesindicados, sólo
pTRZ-2a, pTRZ-2b y pTRZ-2c son subclones.El resto de los clonescubrenpor completo
el mtDNA de trucha.
Resultados! 70
delpolilinker devectoresderivadosdel fago M13 mplScomosonel pUC18y
el pGEM-T. Estosoligonucleótidospermitieronla secuenciacióncompletade
los clonespequeños(c 800 pb), sin embargo,los clonesde mayor tamaño
(1000 - 3500 pb), necesitarondel diseñoy síntesisde oligonucleótidos
específicosparapoderavanzaren la lecturade su secuencia.En total se
utilizaron31 oligonucleótidosespecíficos.
2c2a 2b3
4 ri
16 11 14 12 13nr 1FII
fmi ND2 COL COTí
ATPasaSATPasa6
leS
615 mn
~1 r1
‘-• 1—b
\-ff4LLND4
COIJI
NDS
5ir
IIt~NDS
II2
ti
Cyt b iii4IND6 rnoop
EcoR! BainHí PstI
Hindilí PvuJI
Figura 24. Estrategia de secuenciacióndel mtDNA de trucha arco iris.
De la partesuperior a la inferior de la figura se indican: los clones empleadospara
obtenerla secuenciadel mtDNA de truchaarcoiris, las dianasde restricción utilizadas
en el clonaje y, la posición de la región de controly los diferentesgenesmitocondriales.
Lasflechasmuestranel sentidode la secuenciación.
Las secuenciasobtenidasa partir de cadaclon fueron combinadas
paraoriginar unasecuenciaconsensocon unalongitud final de 16660 pb,
quecubrela totalidaddelamoléculadelmtDNA detruchaarcoiris (Fig. 25).
En estafigura, la secuenciapresentada,estáorientadaensentido5’ - 3’ y
correspondea la cadenaligera (L) delmtDNA. La posición1 de la secuencia
se correspondecon el primer nucleótidodel D-loop. Los marcosde lectura
abierta(ORFs)estántraducidos,indicándoselos aminoácidos,encódigo de
una letra, encimadel primer nucleótidode cadatriplete codificante. Los
tRNAs se indicanmedianteunacaja. La composiciónenbasesdela cadena
L fue: A: 27.9%; (3: 28.9%;U: 17%y T: 26.2%.
o
t 125
D-loop
D-Loop
1 . . - — - . -
101 . - - - - .
201 . - - . - . -
TCAGTCCGGCTTMTGTAGTAAGAACCGACCMCGATTTATCGGTAGGCATAcTCTTATTGATGGTCAGGGGCAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTG301 - . . . - - - . -
AATTATTCCTGGcATTTCGflCCTAAGTCAAGGGCTATCCTTAAGAAACCAGCCCCTGAAAGCCOAATGTAAAGCATCTGGTTAATGGTGTCAATCTTAT401 - - - - - - . -
501 - - - - - - . - -TcTMCA.AGGTCGA.ACTAGATCTTOAATTCCAGAGA.ACCCATGTATCATGGTGAAATGATAflcTATAAAGAATCACATACTTGGATATCAAGTGCATAA
601 . . . - . . - - -GGTCAATTATTTTCTTCACAGATACCTA.AGATCGCTCCCGGCTTTTGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCTAAGCTGAAAGATCCTTATGTTCCTGTTAA
701 . . - - - - . - -
801 . . - - - - - -
901 - - - . - - . - -
tRNA-phe -> 12S rflAOC CIOACGIAGC¶IAACIAAAOCATAACACISAAtiC¶5TIAAOACG CCCTAGAMGTCCCCIAOC AAAGOCTIOOTCCISACTTTACTA¶CAO
1001 . . - - - - . -
1101 - - - - - . -
CCACOACOCC¶IOCIM&CACACCCCCAAO&AACICAOCAOIOAIAA¶M¶AAGCCA¶AAOCOAAAOCTIGAC¶TAGIIMGGIIAAGAGGGCCtMfl1201 - - - . - - . -
1301 - . - . . . -
1401 . - . . - - - - -
TACCcACTATGCCTAGCCGTAAAcCTTGATAGAAATATACAATTGATATCCGCCAGGGAAcTACAAGcOCCAGCTTAAAAcCCAAAOCACTTGGCGGTOC1501 . . . - - -
CTCAGACCCACCTAGAGG&GCC¶G¶TCTAQMCCGATMCCCCCG¶¶CAACCTCACCACCCC¶¶G¶TT¶ACCCGCCTA¶A¶ACCACCG¶CGTCAGC¶¶AC1601 - - - . - - -
1701 - - . - . . - -
AGCACTACGAACCACGCTG¶GAAATCACcG¶CCGAAGG¶GAAAflThGCAGTUACAQAMACAGAGAGflC¶cflGMACTGGC¶CIGAGGCGCGcAcA1801 - - - - - . - -
1901 -> - - - - - 16$ rRNA -->
TOCGCTTGGAATAA AGAOTGTAOCTAAMTAGGMAOcACCTCCCTTACACCGA AAGACATCCOTGcAAATCOGGTCACcCTG CTGACTAGCTAG
CCAACATATTTGGTCCAACACCACMCATACATACCCCAATAAAACTTAGAATTAAGTCAACAAACCATTITTCCACCTTAGTAGGGGCGACCGAAAAGG
ACCTTAACAGGcGGCTAAGGATCATAGTTCCkAGGTMCCTGTTAcAGTGGGCCTAAGAGcAGCCACcTGCACAGAAAGCLITTAAAGCTcAGACAOATAc
ACCAA.AAACATCGCCTCTTGCAAATCAAAACATAGAOOTCCGCCTGCCCTGTGACTATGGGTflAACGGCCGCGGTATTTTOACCGTGCGMOGTAGCGC
2001 2100
2101 2200
2201 2300
2301 2400
2401 2500
2501 2600
2601 2700
2701 2800
2801 2900
2901 3000
3001 3100
3101 3200
3201 3300
3301 . . . . . . . . - - 3400
Figura 25. Secuenciacompleta del DNA mitocondrial de trucha arco iris <Oneorhynchus mykiss). Secuencia
correspondientea la cadena ligera orientada en sentido 5’-> 3’. La posición 1 de ¡a secuenciasecorresponde con el primernucleótidodel D-loop. Los tRNAs se indican medianteuna caja. Así mismo, losgenescodificantesde proteínas presentanencimadel primer nucledtidode cadacodónel correspondienteaminoácido.Los codonesde tenninaciónson señaladosconun asterisco.El sentidode lecturade cadagen es expresadomedianteuna flecha con su correspondientenombre, al iniciode su marcode lectura-
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
3401 . . . . . - . - . 3500
3501 - . - . . - . . . 3600
3601 . . . - . . - - 3700tRNA-Leu <UUR)
cCccCAccTGATGAAGGCMCTAAAACACAcAAGGGGGCAcACCAACATTGccTAAAAGAACGGCG CT&AGGTGGCAGAGCCCGGTAATTTGCGAGAG3701 - . - . . . . 3800
NADH 1 -->
MI TI 1 THVI NPLAY 1 VPVLGCCTAAGCCCTCTTTCTCAGAGGTTCAAACCCTCTCCflAGC TGATTACCCTAATTACCCACGTTATTAATCCACTAGCATACATTCTACCCGTTCTG
3801 . - - - . - . - . 3900LAVA F LT LLERKVLGYMQLRKGPN 1 VGPYGL LQP
3901 - . . . - . - . - 40001 AD CL KL FI KE TVRPST SSP F L F LAT PMLA L T L
4001 . . . - . - 4100ALTLWAPMP 1 PYPVTDLNLGVL FVLAL SSLAVY
4101 . . . . . . . . 4200SIL GSGWASNS KYAL 1 GE LRAVAO TI SV EV 5 LOL
4201 . - - - . - - . . . 4300Y L L 3V III 500 FI LOT F NVAQE SI WL L VPAWP L
4301 . . - - . - - - - . 4400AAMWY 1 ST LAETNRAP FDL TEGES! LVSGF NVE
4401 . . . . - . . - . . 4500YAGGP FAL FF LAEVAN 1 LLMNTLSAVL F LGASF4 1
4501 - - - - . . . . 4600PAF PE L TALN LI4T KAAL L SVV F L WVRA 5V PR FR
4601 . - - . - - - . - 4700YO O LM HL VLJKS F L PL T LA 1 VLWfI LAL PIAL AOL
4701 . . - - - . - - - . 4800
PP QL * tRNA-Ite-->CCCCCTCAGcTTTAGCCGAATTGTCCCTCAATGcTTAACGACCACCTTGATAGCGTGGCTAATAGGGCTTCAACTCCCCTCAATJESE~G~CCG
4801 . - - . . - . - - - 4900tRNA-CIn
RNA-MeGCTCGAACCcATCCTCAAGAGATCAAAACTCTTGGTGCTTCCACTACACCACTTTCTMGGTCAGCTAATTAAGCTTTCGGGCCCATACCCCGAATA
4901 - - •2--> - . - - . . - 5000
MII P VV L TI L LS SL G LO TV L T FAS SNTGTTGGTTAAMTCCITCCCTTACTTGAACCCCTACGTACTCACCATCTTACTTTCTAGCCTAGGACTAGGCACAGTCCTCACcTTTGCCAGCTCCCA
5001 . - - - - - . - - - 5100WL LAWMG LEí NT LATí PI MAGO H NPRA TEA IT K
5101 - . . . - - - - - - 5200Y F L TQA TAAAM 1 L FAST TNAWL VGE NE 1 H QL 5 HP
9201 . . - . - - - - - 5300LATTTVMLALALKLGLAPVH FWLPEVLQGLELT
5301 - - . . - - - . - 5400T CLI LS TUOKLAP FALM 1 OVAP TI NS SL 1 VT lO
5401 . - . - . . - - . . 5500LI ST LVGGWGGLNOTQLRKI LAY LP! AHí GWMVL
5501 L . - . - . - - - 56001 0 FA PS L Ti LS LS LVI VMT 3 SA PL T L K T II NS L
5601 - . - - - - - . - - 5700
Figura 25. Secuenciaconipleta del DNA ndtocondrial de trucha arco iris (cont.)
T ! II TLATSWTKSPTLAALTALVLL SLOGLPPL 5
5701 - - - . - . . . - . 5800
G PHP KWL Y bEL T KQGLP LSA TLAAMTA L LS LV F5801 . . - . . . . . . . 5900
Vi RL C VAL Ti T ¡ VP MIL T ATA PWR LII F T MIT LPTTTATcTAcCACTCTGCTACCCCTTAACCCTcAcTATTIAICCcA.ACACCCTAAcTOCTAcTOCCCCATOACGCCTCAACTTTACCATAATTACCCTACC
5901 - . . - . . . . - 6000L $ Y T T 1 M A L O L L P L T P A V T A M L A L *
CCTTICAATTAcTACTATTATAGCCCTACGACTACTAcccCTCACAccAGcTCTGAcTCcGATATTAGcTTTGTAAT~6001 . . - . - - . - - . 6100
CCAAGACCCTTCAAAOCTCTAAAcOOCOOTCAAATCcCCCAGCccT AAGACTTOCAOOACTTTATCCCACATCTTCTCAATGCAACCCACAcACTTT6101 . - . . . . . . . - 6200
tRNA-Ata <-- tRNA-ASfl#AATTAACCTAAAGCCT TAOGIOCCAAGCCCTCOATCcTACAAACTCTTAGTTAACAGcTAAOCGCTCTATCCAOCCAGCATCCATCT TTTCCCCC
6201 - . . . . . - . - - 6300---DriL <-- tRIIA-CvsGCCCCCCCGOGOOOGAGCOAOOCGGGOAOCCCCGGCACGCTATTAGCCTACTTCTTCAOATTTGCTCTAACGTGTOOTACACcAcAOOOCIATA
6301 . . . . - - . - -> . . . 6400Co
tRMA-TyrM A 1 T R LI F F 5 T IIACCA ACGAGTcAAAccTCTGTTTATOCACcTAcAATCCAccCcTTA.ACCTCTcACCCACccATC GTOOCAATcACACCATOATTTTTCTCAACcAAC
6401 - . . - - . . . . - 6500H KO! GT LV LV F GAWAGMVGTAL SL LI R AEi SaPOCACAAAGACATTGOCACCCTCTATTTAGTATTTOGTOCCIGAGCCOOCATAGTAGGCACCGCCCTGAOTCTACTGATTCOGGCGCAACTAAOCCAGCCCC
6501 - - - - - - . . 6600
AL LCD DO 1 VMV Y VIAHA FVM 1 F FMVMP 1 MIGO
6601 - . - - . . . . . - 6700
ONLIL Y PilE ¡ GAPDMAFPRMIIIIMSFLIL L PPSF Li6101 . . . . - . - . - - 6800
L LSSSOVEAOAGTGWTVYPPLAOIILAHAOASVDL
6801 . . . . . . . . . . 6900
TI PSi HLAG ISSI LOAI IIF ITT II IIMKPPA Y SO
6901 . - . - . . . . - 7000VOT PL F VWAVLVTAVLL L LSLPVLAAO ¡ TM L LT
7001 . - . - . . . . - - 7100DR MLII TT F FDPAOOCDP 1 LVOHL FWF F SHPEVV 1
7101 . - . - . - - - . - 7200LI L PO FGM 1 SH 1 VAVVSCKKEP FGVlEGMVWAMM
TTCTCATCCTCCCACOCTTTCGTATAATTTCACACATCOTTOCCTACTACTCCGCCAAAAAOCAACCCTTCOOGTATATAGOAATOCTCTGAOCTATAAT7201 . . - - . - - . - . 7300
A IGL LO FI VWA H HM FT VOMOVOT RAV F T SA TM 1AGCCAICGGG¶TGtTAGGATTTATCGTT¶GAGcCCACCAIAIGflCAC¶GTAOGGATAGACGIGGACACTCCTGC¶¶AcTflACATC¶GCCACCATGATT
7301 . - . - . . - . - - 7400
Y A IP T OVKV E SWLA T L HGGS 1 KWETP L L MA LO FI
7401 . - . . . - . 7500
Fi FTVCGLTOI VLAMSSLO 1 VLHDTVVVVAH F HTTTTCCTGTTCAcAOTGOCTOOACTTACAOCTATTOTcCTTGCTMCTccTCATTACAcATTGTTCTACATCAcACTIATTAcCTAOITCCTCATTICCA
7501 . . - - - - . - . - 7600YVLSMCAVFA XMOAFVHWFPL FTGVT LHSTWTK
CTACGTACTATCTAT&GGACCTGTATTTCCCATTATACCCGCTTTcCTACACTGCTTCCCCCTATTTACAGGGT&CACCCTCCAcACCACATCMCCAAA7601 - - - . . . . - . - 7700
Y li FOl MF 1 OVIILT F FPQHF LCLAGMPRRVSDYPD
7101 - - - - - - - - . - 7800ATT LIJNTVSS 1 GSLVSLVAVI MF L FI LW~ AF AA
7801 - - - . . . . . - - 7900KREVAS 1 EL TSTIIvEWLHGCPPPVHT FEEPAFV
7901 - - - . - - - - . - 8000
Figura 25. Secuenciaconipletadel DNA mitocondrial de trucha arco iris <cont.)
OVO AM * <-- tRMA-Ser(UCN~ tRMA-CAAGTACAAOCAAACT OAGAAAOOOAOCAATIOMCCCCCATGTOCTGGTTTCAAGCCAACCGCAT&ACcACTCIGcCAcTTTCITA u~jACAC
8001 - . . . . - - . - 8100Col’
Aso --> MAHPSOLTAGTAAAAcTACTCTATTACACIOcCTOOTcAAOGCAAAATTOTGGGTTAAAcCCCCcGTCTCTT OCAcTIAGcTACAATOGCACATCCCTCACAAcT
8101 . . . . . - . - - 8200GFQDAASPVMEELLM FHDHALM 1 VLL 1 ST LVLV
8201 . . . . - . - . . - 8300Y! VANVSTKLTMMY 1 iDSQE 1 El VWTVLPAV Iii
8301 - . - . . . - . - 8400LI ALPSLR 1 LVLMDE 1 MOPHLT 1 KAMO14QWYWS
8401 - . . . . . . . . . 8500VEV TDVEDLOPDSVMVPTQDLVPGQ FRL LE TDH
8501 - . - . . - . . - 8600RI4VVPVE SP 1 RVLVSAEDVLH SWAVPS L GVK?4DACGAATAGTTOTCCCTOIAOAATCCCCAATCCOAOTTCTCOTCTCAGCTGMGACCTCCTTCACTCCTGAOCCCTTCCTTCTTTACGTGTAAACATAGACO
8601 . . - . . . . - 8700VPCR LMOTAF 1 ASRPGVFVGQCSE 1 COAMHS FM
8701 . . . . - - - . - 88001’ IVVEAVPLEHPEKWSTMMLEDA tRIIA-Lys-->
ACCTATCCTTOTTGAACCOGTACCCCTAGAACAcTTCOAOAAATOATCCAcTATGATACTTOAACATGCC ACTAAGAAOCTAAATCGGCA.ATACCCTT- - - -> . . - . - 8900
MPOLNPAPWPAI LVFSWLAGCCTTTTkAOCIAAAOATTOOTGGCCCCCAAcCACCCCTACT ATOCCCCAACTCAACCCCCCCCCCTOATITOCTAITTTAOTATTCTCGTGACTG
8901 - . - . . . - - . . 9000
V Fi TV! PPKVLGHT PTNEPTSQSTEKAKPEPWHW
9001 . - . . . . . - 9100ATPasa6 - ->
NT LS PFDQFMSPTVLGI PL lAVAL T LPW Y U PPPWH *
9101 . . - . . - . . - 9200T PSA R W LII NR LI TíO ¡3M FI MR F T QQ L Li PL ML ¡30ACCCCCICTOCCCOAT&ATTAAACAACCOCCTAATTACCCTOCAAOOOTGGTTCATCAACC&ATTTACCCAGCAACTTCTTTTACC&CTAAATCTA&CCO
9201 K AL •i T - . . . - . - 930014 MA L ML F LI T L MML O L LP VI FTP IT O
9301 . - - . - . . 9400SiMM Ci AVP LLIL ATV Y! OMR MQP TAA LO HL L PE
9401 . . . - . - - - 9500O T PVP LI PVL III ET ¡SIP IR PAL OVR L TAN L TA
9501 - . - . . - - - - 9600OHOL 1 AIAAFVL LPMMPTVA 1 iT SI VL F LLTLL
CAOCCCACcAACTAAIIGCTACAGCACCCTTTGTTCTTCTACCTATAATACCTACAGIACcAATCCTAACTTCIATTOTCCTCTTTCTACTCACCCTTCT9601 . . - . - - - - - 9700
El AVAM 1 QAYVFVLLLSLVLQEIIV MAI4QAIIAV H
9701 - - - CA Y AAL •L LT - - . 9800MVDPS PWPL 1 SOT AVW F HP H SL Ti
9801 . - . . . . - 9900
líO MILL L L T MV O LILIR DII RE O 1 FO CH H T PP V
9901 . - - - - . . . - - 10000QKOLRVOM 1 LP 1 TSEVF P FLOF FWAPV HASíAPT
10001 - - - . - - . . 10100
PE LGGCWPPAG ITT LDPFfVPL LNTAVLLASGV
10101 - . . - . - - - . 10200
Figura 25. Secuenciaco¡npleta del DNA mitocondrial de trucha arco iris (cont.)
TV TU AH 14S1 ME GE R KO TíO AL Ti T Y L L OF VE T P
10201 . - - . . - . - 10300LO OMS VV EAP FT 1 AD OVVOST P F VAT OF H OL 14V 1
10301 . . . . . . - - - - 104001 GST P LAVCL LROVQY}IFTSEH>4 POFEAAAUVU
10401 . . - - . . - . . . 10500
HP V DV Y U LP LV VSI y w LI OS tRIIA-Gtv-->ACACTTTOTACACOTTOTATGGcTCTTcCIATACCTcTCTATTTAcTCATGAOCCTCAT TCTTTCTAOTATTAATACGTATAAOTOACITCCAAICAc
10501 . - . . . - . - - . 10600
NADH-3 - ->
MMLII TI IT Y TI T L SA Vi A TI SP UCCOCTCTTGOITAAAATCCAAOCAAAOAT TCKAITTAATCACAACAATCATCACTATTAcCATCAcATTATcCGcAOTACTAOcCACTATTTCTTTcT
10601 - . . - - . - . . . 10700UPO 1 SPDAEKLSPYECGFOPLGSARLPF SiR F F
10101 . - . . . . - - . 10800LI A ¡LP Li F OLE IAL U LP LP U GO O L H T FIL Ti Y
10801 . . . . . . - - 10900U STA Vi A Li T LO LIV E U TOGO LE U A E fi~Ar-z.......TCATCCACTGCCOTTCTACccCTTcTTAcTCTTOGCTTA.ATCTATGAATCAACCCAACCACOCTTAGAATCACcCGAGTACOOAGTTAO~~AAAA~fi~O
10901 . . . . . . . . . . 11000
IIADH-4L - ->
MTPVHFS PISA FI LGLMAcCCTTOATTTCOOCTcA.AAAGACCATOOTTTAAOTCCATOACCOCCT TOACACCAOTACACTTCACCTTTACCTCAOCCTTTATTTTAOOCcTTATA
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EATGVSVAPMLL UAFSACEASAGLAL LVATARI
11201 . . . . . . - - . . 11300
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HGTDRLOSLNLLQC*
11301 - - - - - . . - - - 11400
WLWT TS 1 AOSL II ALASLSULKWSSETOWSSSM
11401 - . - . - - - . . 11500
LV LATDPLSTPLLVLTCULLPLM 1 LASQSHLSP
11501 . - . - - . - - - - 11600
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11601 - - . - - . - - - 11700
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TCATATTcCAACCcACCcTACTccCCAcCcTTATTATTATcAcCCa&TGACCAAATCAAACTGAACGcCTCAATGCCGCTACCTACTTCTTATTTTATAc11701 . . - . - - . - . . 11800
LAOS UPU UVALL UMOMO MOT LSM FT U 0V TOP L 14
11801 . . - . - - . - - - 11900L U T WGDK LWUAAC U LA F LVKMP LV GV H LUí PKA 14
cTTaMCGTOAGGAOAT&AACTOTCATOAGCTGCCTOCcTTTTACcCTTCCTTCTAAAAATACCcCTATAcCGTGTTCACCTflOACTCCCAAAAOCCC11901 . - - - - - . - - . 12000
VE API AOSM 1 LAAVL LKLGOY OMMRPIMVM UD PLACOTAGMCCTCCMTCGCCOOATcCATAATCCTAOCOOCTGTTCTCCTCAAGCTGCCACCATACGOCATAATACOTATMTACITATACTAGACCCOTT
12001 . . - . . . . . . 12100
TKE LAVPF 1 VUALUOZ Y MTGS 1 CLRQTDLKSL 1
12101 . . . . . . . . - 12200
AV SS VONMO i VAGO Y L YO TPUO FI GA Y 1 LM 1 AH G
12201 . . . . . - - - . - 12300LASSAL E CLAMTSVERIHSRTMLLARGMQM ¡LP
12301 . . - . . . ~. - - 12400
mi TWL/F VAS LAt4LAI. PPLPHL!4GE TSHF
CTTAATAACCACTTGGTCATTTOTAOCTAOTTTAOCAAATCTOOCcCTCCCCCCICTCCCCAAcCTAATAOCAGAACTAATAATCATCACTTCTATATTT12401 . . - . . - . . - 12500
Figura 25. Secuencia completa del DNA initocondrial de trucha arco iris (cont.)
MW SV WT Lii TOL O TUI TAS VS UY LP L MT O R aPi pAACTGOTCOTATTOAACCCTTATTCTCACOGOACTAOOCACOTIAATTACAGCAAGCTACTCCCTTTATCTOTTCTTAATAACTCAACGGGCACCCCTAC
12501 . . . . . . . . . - 12600
51411 AL LP T 14 T RE HL Liii HL IP ¡ Viii U PC P EL
CTTCCCATATTATTGCTCTTGAACCCACCCACACCCGACAACACCTACTTATTATTCTOcACCTCATCcCAATICTCCTTCTAATCCTAAAOcCTGAGCT12601 . . . . . . . . . - 12700
M U O LI C F tRMA-His --> tRIIA-SerCATCTGAOGCTOATCTTIC TAGATATAOTTTAACCAAOACATTAGATTOTGATTcTAAAAATAGAOOTTAAAATCCTCTTATCCAC CAGAMTCT
12701 . . . . . . 12800CAOV)GTTGATAACAOAGACTOCTAATCT¶CThCCCCCTCAOTTAAATTCTOTOOTICACTCCTTCTA.AAOOATAATAOCTCAICCATIGOTCITAOOAACC
12801 - . . . . . . . . . 12900MADH-5)4>IPIIL 1 I.SSSLI.M 1 FTLL 1 VPL
AAAAcTCITOOTOCAAATCCAAOTAOCAOC TGCACCcOACTACACTCATCTTAAGCTCATCCCTTITAATAATCTTcACACTTCTAATTTATCCTCTT12901 . . - - . . . . . . 13000
ITT 1. TPT POHKNWALTHVKTA 1 KMA PLV St. LPL E
13001 . . . . . . . . . . 13100y Fío CGT E T Y VT MWQWMNT Ti Fol MUS PC FD H V
13101 . . . . . . - . . - 13200
Sil FTP IAL YVTWS ILE FASWYM HADP MMM R PF
13201 . . . . . . . . . . 13300KV Lb U Fil AM ¡ ¡ LVTAMNMPOL FI GWEGVG 1 MSF
13301 . . . . . . . . . . 13400
L LI OLIUN ORADANTAAMOAV 1 VMRVGD Y GUI LSTTCTCCTCATTGCATOATOACAcOGACOAOCTGACOCTAACAcAOCTOCTATAcAAOCTGTAATTTAcAAcCOAOTAGGAGACATCOCACTTATCCTAAO
13401 A b II . . . . . .13500
MAWF TN SIJE FAS 5KG bO b T LP L MCLITATAGcCTGGTTcOCAACAAACCTMAcTCCTGAOAAATTCKACAAATATTTOcCTCTTCAAAAOOACTTGACCTCAcACICCCTCTTATAGGCCTCATT
13501 . . . . . . . . . . 13600
LAATGKSAOFGLHPWbPSAMEOPIPVSAL L H SST
13601 . . . . . . . . . . 13700MVVAG ¡ FUi ¡ RLHPLMEDIIOTAL TVCLCLGAL 1
13701 . . . . . . . . - - 13800
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13801 . . . . . . . . . 13900O LII OP OLAF b Hl C T HA FE K AM U FUCS G 5 Y 114 SL II
13901 . ..... . . . . 14000
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14001 LA •O PP• PC D A•iI E•AL It . . . . . 141005 T 5 HL MA WALT L TUL A T 5
ATTCTTAGCTCGGTTCTTCTCCAAAGACGCTATTATTGMGCCTTAAACACCTCCCACCTCAACGCCTCAGCCCTTACTCTTACCTTACTACCCACCTCA14101 . . . . . . . . . - 14200
PTA1 VS U RV 1 E PVSMONPR F TATAPVNE MM P SV 1TTTACTGCCATTTATAGCCTCCCAGTCATCTTTTTTCTCTcCATAGGACACCCCCGcTITACGGCMCACCCCCTGTTMTGMMkTAACCCATCCGTM
14201 . . . . . . . . . . 14300MP ¡ KRLAWOS II AGLL 1 TSIIFLPTM TPVMTMPT
TTMCcCAATCMGCOACTAGCCTGAOGMGCA¶CAflGCGGGGCflCTAATTACCTCAMC¶¶CC¶ACCCAcCMCACCCCCCTMTAACCATGCccAC14301 . . . . . . . . . . 14400
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14401 . . . . . . . . 14500
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14501 . . . . . . . . . 14600
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14801 . . . . . . . - . . 14900
Figura 25. Secuencia conipleta del DNA mitocondrial de trucha arco iris (cont.)
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14901 . . . . . . . . . . 15000
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15101 . . . . . . . . . . 15200
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15201 . . . . . . . . . . 15300NADH-6 C>’tb - ->
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16001 . . . - . . . - . 16100iAL FAPM LLGDPDM FTPAMPLVTPPH 1 KPEWY F
16101 . . . . . . . . - 16200PAVA 1 LRS 1 PIIKLOGVLALL PSI LVLMVVP ¡ UN
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16401 . - . . . . . . . - 16500
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16501 . - . . . . - . 16600<-- tRNA-Prn
OAGATTTTAACTCCCACCCTTAACTCCCAAAOCT&AOATTCTA.AATTAAACTACCCTCIG16601 . . . . . 16660
Figura 25. Secuenciacompleta del DNA mitocondrial de trucha arco iris (cont.)
Resultados! 78
El mtDNA detruchaarco iris codificapara2 rRNAs, 22 tRNAs y 13
cadenaspolipeptídicas.Los genesfueronlocalizadose identificadospor
comparaciónconlas secuenciasde los mtDNAs de Xenopuslaevis (Roe y
col., 1985), Cyprinus carpio (Changy Huang, 1994) y Crossostoma
lacustre (Tzeng y col., 1992). La organizaciónresultantees la misma
descritaenestasespeciesy enmamíferos(Fig. 25 y Tabla III). Al igual que
enel restodemtDNAs secuenciados,la característicamássobresalienteen
el mtDNA de truchaesla casi total ausenciade secuenciasno funcionales.
Las secuenciasintergénicasse reducenenla mayoríade los casosa, tan
sólo, 1 a 3 nucleótidos,siendounaexcepciónla existenteentreel genque
codificaparael tRNAA.sp y el gen(3011 con 14nucleótidosintergénicosno
codificantes.
5. ANALISIS DE LA SECUENCIADE LA REGIONDE CONTROL(D-LOOP).
La regióndecontrol delmtDNA de truchatieneunalongitudtotal de
1003 ph. Se encuentraflanqueadapor el tRNAPro en suextremo5’ y por el
tRNAPhe en su extremo 3’. AA no ser una región codificante,el D-loop
presentauna granvariabilidadentrelos diversosgenomasmitocondriales.
No obstante,enel D-loop dela truchasepuedereconocerunaregióncentral
y ciertosmotivosconservadosenotrasespecies(Fig. 26).
AA igual queen la regióndecontrol del mtDNA deotros vertebrados,
en la región delD-loop de trucha arco iris sepuedenidentificar tresbloques
de secuenciaconservada(CSBs1, II y III) y ochoregionesasociadasconla
terminaciónprematurade la replicaciónde la cadenapesada(TASs). De
lastresCSBsidentificadaslasmejorconservadas,al compararlasconotros
teleósteos,X. laevis y el hombre,sonla CSB-II y la CSB-III (Fig. 27). La
CSB-I entruchaestáreducida a un pentanucleótido y pudo ser identificada
como tal, enfunciónde su posiciónrelativacon respectoala CSB-II (Fig.
27). En la regióncomprendidaentreCSB-III y el tRNAPhe,dondedeben
estar los promotoresimplicadosen el inicio de la transcripciónde las
cadenaspesada(HSP)y ligera (LSP), apareceunarepeticióndirecta de 19
nucleótidos.Otra característica significativa, es la presenciade 26
nucleótidospirimidínicosseguidos,cercade lasCSBs.
Resultados! 79
Región funcional Inicio Fin Tamaño (pb)
D-Loop 1 1003 1003tRNA-Phe 1004 1071 6812S rRNA 1072 2015 944tRNA-Val 2016 2087 7016S rRNA 2088 3767 1680tRNA-Leu (UUR) 3768 3843 76
NADH 1 3844 4815 972
tRNA-Ile 4819 4890 72
tRNA-Gln 4958 4888 71
tRNA-Met 4958 5026 69NADH 2 5027 6076 1050tRNA-Trp 6079 6147 69tRNA-Ala 6217 6149 69tRNA-Asn 6291 6219 73OrigendereplicaciónL 6292 6328 37tRNA-Cys 6395 6329 67tRNA-Tyr 6466 6396 71(301 6468 8018 1551tRNA-Ser(UCN) 8089 8019 71tRNA-Asp 8094 8166 73COII 8181 8871 691tRNA-Lys 8872 8945 74ATPase8 8947 9114 168ATPase6 9105 9774 670CO III 9776 10559 784tRNA-Gly 10561 10630 70NADH3 10631 10979 349tRNA-Arg 10981 11049 69NADH4L 11050 11346 297NAiDH4 11340 12720 1381tRNA-His 12721 12789 69tRNA-Ser (AGY) 12790 12858 69tRNA-Leu (CUN) 12860 12931 72NADH 5 12932 14770 1839NADH 6 15306 14767 540tRNA-Glu 15375 15307 69Citocromob 15379 16519 1141tRNA-Thr 16520 16591 72tRNA-Pro 16660 16591 70
Tabla III. Localizaciónde las principales regionesfuncionalesdel
genomainitocondrial de trucha arco iris. Se indica la situación y tamañode los
diferentesgenesy regionesmitocondriales.
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‘4O
O
‘4aOQ
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aOO‘4‘4aEAaO‘4OEA‘4‘4HEAaa‘4‘4O‘4O‘4EA‘4O‘4‘4OEAOOOOEAEAEA‘4aEAaaO‘4H‘4OEA‘4EA‘4EAaEA
‘4EA‘4EAEA‘4O‘4a‘4EAa‘4aEAa
EAEA‘4EAaH‘4EAEA‘4EA‘4O‘4EA‘4EA‘4‘4‘4EAaEA‘4HoEA‘4O‘4O‘4EA‘4EAEAOEAOEA‘4EAEAaEAaEAOO‘4EAaEA‘4EAOa‘4O‘4EAOaaO‘4
Resultados! 81
Distanciaa
CSB-fl
OncorhynchusmykissCrossostomalacustreCyprinuscarpioAcipensertransmontanusGadusmorhuaXenopuslaevisHornosapiens
Consenso
OncorhynchusmykissCrossostornalacustreCyprinuscarpioAcipensertransmontanusGadusmorhuaXenopuslaevisHornosapiens
Consenso
OncorhynchusrnykissCrossostornalacustreCyprinuscarpioAcipensertransmontanusGadusrnorhuaXenopuslaevisHorno sapiens
Consenso
CACPITA
-GACATh-GACAÍIA-GAGA~IA
gaCA2~
CSB-ll
YAAALXXCCC---’IáGCCCC
csB-m
ygtCAAACCCC----rAAI½ccR
flgura 27. Bloquesde secuenciaconservada.CSBsidentificadosen las
regiones de control de los mtDNAs de la trucha arco iris (Oncorhynchusmyktss);
Crossostomalacustre (Tzeng y col., 1992); la carpa,Cyprinus carpio (Changy Huang,
1994); el esturión,Acipensertransmontanus(Buroker y col., 1990); el bacalao,Gadus
morhua (Johansen,1990);Xenopuslaevis (Roe y col., 1985)y el hombre,Horno sapiens
(Andersony col., 1981; Changy Clayton,1987). En la figura también semuestranlas
secuenciasconsensoparacadaCSB y, en el casode la CSB-I, la distanciaen relacióncon
la CSB-II.
CSB-I
77951011086910070
Resultados! 82
En estamismaregión,entrelos nucleótidos820 y 985, se locailiza
una pequeñaORF de 165 pb con probabilidadde codificar para un
polipéptido de 55 aminoácidos,con un pesomolecularde 6200 Da y un
punto isoeléctricode 8.7. De acuerdocon la orientaciónde la ORE, este
polipéptido estaría codificado por la cadena L y, dependiendo de la
localización exacta de LSP, podría ser el primero o el último de sus
productos-El modelodelplegamientodeducidoparaestepolipéptido,predice
unaestructuracentralde doblehoja plegadaflanqueadapor dos cadenas
conconformaciónen helicea (Fig. 28).
6. ORIGEN DE REPLICACIONDE LA CADENA L.
El origende replicaciónde la cadenaL tieneunalongitud total de 52nudeótidos,selocaliza a continuacióndel tRNAAsn y solapaparcialmente
con el tRNACYs (Fig. 25). Presenta una estructura secundaria que consiste
en unabaseformadapor los extremosdelos dos tRNAsflanqueantes,que
continúaenun tallo constituidopor el apareamientode22 nucleótidos,de un
total de 23, y termina en un bucle de 17 nucleótidos(Fig. 29). Las dos
secuenciasflanqueantesdel 0L son las mismasdescritasen el resto de
vertebradosy, en el casodel extremo5’, se puedereconocerel motivo 5’-
GG(3CG-3’ en el que se producela transiciónRNA/DNA al inicio de la
replicación(Hixsony col., 1986).El pie tieneun altocontenidoenguaninasy
citosinas,y presentagranhomologíacon los de otros peces,X. laevis y
mamíferos.El bucle sorprendepor su gran tamaño, así como por la
presencia de 10 citosinas seguidas y únicamente dos timinas. En este
sentido sólo conserva cierta homología con el 0L descritoen el mtDNA del
bacalao(Gadusmorhua).
7. ESTRUCTIJEASECUNDARIA DE LOSRNAs DE TRANSFERENCIA
El genoma mitocondrialde la truchaarco iris contiene22 tRNAs
intercalados entre los RNAribosomales y entre los genes que codifican para
proteínas.Por lo tanto, el modelodescritooriginalmenteenel hombre(Ojala
y col., 1981)según el cual los tRNAs tXimcionarían como señalespara el
Resu]tados/ 83
Helice a
Hoja 13
Giro
Pliegue
A AL ti 1 A LL U L G Al K10
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II¡ TALSUPNAKVI-IKSLLMYKKN ¡AOL
40 50
a
Figura 28. Marco de lectura abierta deducido a partir de la secuencia
del D-loop entre los nucleátidos820 y 985. a) Plegamiento deducidoparael posiblepolipéptidocodificadobasandoseen la hidrofobicidadde losdistintos aminoácidosque lo
componen.b) Representacióngráficade suposibleestructurasecundaria.
b
Resultados/ 84
cC CcCeTe
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OCCCeCCocCCATATATCC
5’-AGAT GCGGCC 1-3<
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T
T
1
Hornosap¿ens
OCC o1~~í -3’
Figura 29. Estructuras secundariaspropuestas para los orígenesde
ccCC
O
Oncorhynchusmykiss
11
G C
replicación de la cadenaL del mtDNA de varios vertebrados.
Resultados/ 85
procesamientodetránscritosprimarios pareceser tambiénaplicableenel
caso de la trucha.Las secuenciasobtenidaspresentangranhomologíacon
las descritasenX laevisyotrospeces(Fig. 30),siendoel tallo y el bucledel
anticodónlas regionesmás conservadas,y el brazoTyC el másvariable.
Las estructurassecundariasen forma de hojade trébol, propuestaspara
los 22 tRNAs en función de la secuenciaobtenidapara sus genes,se
representanen la Figura 31. Los tRNAs mitocondrialesde truchason
particularmentericos en adeninay uracilo y presentan,con gran
frecuencia,apareamientosde basesatípicos,especialmenteO+U, queno
correspondenal modelode Watsony Crick. El bucle DHU es el quemuestra
mayorvariabilidadentrelos tRNAs dela truchaarco iris, asípor ejemplo,
mientrasen el tRNALen (UUR) está formado por nueve nucleótidos, en el
tRNAO1uestáreducido,únicamente,ados.
El tRNASer (ACY) presentaunaestructurasecundariarelativamente
distintaal resto de tRNAs mitocondriales.En el brazoDHU, el bucle está
reducido a tres nucleótidosy, en cambio, el tallo esta formado por 10
nucleótidos apareados- Además, el tallo del brazo del anticodón es
anormalmentecorto.
El tRNALeU(UUR) cuentaen su brazo DHU con la secuencia5’-
TGGCAGAGCCCOG-3’.Estasecuencia,queen el hombre sehaidentificado
como responsablede la terminación de la transcripciónde los rRNAs
(Christiansony Clayton, 1988),estáencambio,menosconservadaen otros
peces,X. laevisy poílo -
8- GENESCODIFICANTES DEPROTEíNAS.
8.1. Códigogenéticoy uso decodones.
Todoslos codonesde iniciación identificadosenel mtDNA detrucha
arco iris, son ATO exceptoel del genCOl que es OTO. Por otrolado,cinco
genes(ND2, COl, ATPase8, ND4L y ND5) utilizan TAA como codónde
terminación,y dos (ND1 y ND6) terminancon TAO. El resto de genes
codificantesde proteínaspresentancodonesde terminaciónincompletos,
bién acabanen T (COII, ND4 y (34 b) o bien enTA (ATPasa6, (30111y
3’
BrazoT’pC
Brazovariable
BrazoDRIl
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OTO..9?~~.0.0
Figura 30. Comparación y alineamiento de las secuenciasde los 22 tENAs codificados por el
nxtDNA de trucha arco iris y otros genomasmitocondriales de vertebrados.Se señalanaproximadamente
las posicionesdel tallo y el bucle de los brazosaminoacídico(AA>, DHTJ, anticodón(A. Cg variableyTwC. Los
anticodonesde cadatRNA serepresentanen negrita.
5’
Brazo
Brazoanticoddn
TruchaCaipaa. lacustreX. laevísPolloHombre
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TruchaCamaa’. lacustreX. laevisPolloHombre
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TruchaCarpaO. lacustreX. laev:sPo‘loHombre
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TruchaCarpaO. lacustreX. laevisPolloHombre
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TruchaCarpaO. lacustre2<. laevísPo1 loHombre
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C9?AC
Figura 30. Comparación y alineamiento de las secuenciascorrespondientes a los 22 tRNAs
codificadospor el mtDNA de trucha arco iris (Cont.)
TruchaCarpa0. lacustre2<. laeviSPolloHombre
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TruchaCazpa0. laCustre2<. laevisPolloHorrbre
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TruchaCaz-pa0. lacustre2<. laevísPolloHombre
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TruchaCaipa0. lacustre2<. laevísPolloHoretre
CruchaCarpea’. lacustre2<. laevísPolloHombre
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Figura 30. Comparación y alineamiento delas secuenciascorrespondientesa los22 tENAs
TruchaCaz-paa. lacustre2<. iaevisPolloHombre
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TruchaCaz-pae. lacustre2<. laevisPolloHombre
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CVIO~AC’PT7.-Ce
CCO..C
e.T.C.
PACOCItOCA.0 A...0 A....TA....AOCOMA.. NI
codificadospor el mtDNA de trucha arco iris (Cont.)
Resultados/ 89
AAUAUtiCGUCaUAUA
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U-ACGU-AtiCGU
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A-Ua-c tENA OlaA-UOC
UU A
UUG
Figura 31. Estructura secundaria en hoja de trébol de los 22 tRNAs
Aa
C
CGAa
UUC
codificadospor el mtDNA de trucha.
Resultados! 90
U AA-U
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UAGUUG A
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CUU
Figura 31. Estructura secundariade los 22 tENAs (Cont).
Resultados! 91
A
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Uu
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Figura 31. Estructura secundariade los 22 ÉRNAs (Cont.>
Resultados! 92
Figura 31. Estructura secundariade los 22 tRNAs <Cont)-
Resultados! 93
ND3). En ningún caso se encuentranAOA o AGO como codonesde
terminación,ni tampocose encuentrandentrode las ORFs,por lo quese
puedeconsiderar,queestoscodonesno existenenel mtDNA de truchaarco
ms.
El uso de codonesdel mtDNA de truchaarco iris fue calculadoa
partir de las 13 ORFsencontradas,utilizandocomo referenciael código
genéticomitocondrialde mamíferos.El uso de codoneses muy similar al
descritoen X. laevisy otros pecesy, como sepuedeobservarenla Tabla
III, secaracterizapor una claratendenciaa no incluir residuosde guanina
enlaúltima posicióndelcodón.
Aa Codón Numero /1000 Fracción Aa Codón Nwnero /1000 Fracción
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111.00114.00113 .00
10.00
55. 0055 - 0067.00
12.8624.42
8 - 6618.90
6 - 0421.797.09
12 - 60
8 - 4023.6314.7014.70
6.3024.4219.6939.38
5.25
26.522.105.25
O - 531.31
10.7618.11
6.30
29.14
29.9329.67
2 - 6314 - 4414. 4417.59
0.20 Fin ACO0.38 Fin ACA0.13 Ser AOl’0.29 Ser AOC
0.22 Lys AAO0.78 Lys AAA0.36 Asn PAT0.64 Asn AAC
0.14 M~ ACC0.38 M~ ATA0.24 Ile Art0.24 Ile ATO
0.07 Thr ACO0.27 Thz ACA0.22 Thr ACT0.44 Thxc ACO
0.17 Arg CCC0.83 Axg OCA0.29 Arg COl’0.71 Arg eGO
0.29 <Din CAO0.71 Oln CAA0.37 Mis CAl’0.63 lila CAO
0.04 Leu 0<150.17 Leu CTA0.50 Leu CVI’0.50 tau CI’O
0.000.00
11.0043 - 00
15.0059.0036.0076.00
41.00108.00135.00130.00
20.0096.0079.00
120.00
8 - 0048.009. 00
11.00
11. 0089.0027 - 0084. 00
42.00185.00150.00146.00
0.04 Pro CCC 18.000.23 Pro OCA 57.000.23 Pro CC’? 49.000.28 Pro CCC 87.00
Tabla IV. Código genéticoy uso decodonesdel genomamitocondrial de truchaarcoiris. Semuestranel nUmen,de codonestotalesencontradosenlos 13 genescodificantesdeproteínasdel mtDNA de
trucha arco iris, la frecuenciade usode codones,en tanto por mil, y la proporciónen quecadacodón
0. 00o . 002.89
11.29
3 - 9415 - 499-45
19.95
10.7628.3535.4434.13
5.2525.2020.7431.50
2.1012.602.362. 89
2.8923.37
7.0922.05
11.0348.5739.3838.33
4-7314.9612.8622 - 84
o - 00o - 00o - 05o - 18
0.20o - soo - 32o - 68
0.28o - 720.51o - 49
0. 060.30o - 250.38
o - 11o - 63o - 12o - 14
0.110.89o - 240.76
0.06O .28o . 230.22
o - 09o - 270.230.41
contribuyeacodificarparaun determinadoaminoácido.
Resultados! 94
8.2. Análisisdeproteínas.
El genomamitocondrialde trucha arco iris, al igual queel de otros
vertebrados,codifica para 13 cadenaspolipeptídicascon un tamaño
variableentre55 (ATPasa8) y 612 (ND5) aminoácidos.Todoslos genes,a
excepción del ND6, estáncodificadospor la cadenapesada-Al igual que
ocurreen los genomasmitocondrialesde otrosvertebrados,enel mtDNA de
truchaarcoiris sedan doscasosde solapamientode OREs;el final del gen
quecodificaparala ATPasa8, solapaen 10 nucleótidos con el principio del
gen de la ATPasa 6. Lo mismo ocurre entre los genes ND4L y ND4estando,
en este caso, el solapamiento reducido a 7 nucleótidos. Por otra parte, los
codonesde terminaciónde los genesND5 y ND6 selocalizanen la misma
posición del genomamitocondrial,aunqueen distinta cadena,llegandoa
compartir dos nucleótidos. Los genes ATPasa6 y COIJI son los únicos que,
no estando solapados, carecen de un tRNA entre ellos.
El alineamientoy comparaciónde las secuenciasaminoacídicasde
las proteínascodificadaspor el genomamitocondrialde truchaarcoiris con
sus homólogasde carpa(Changy Huang,1994),C. lacustre (Tzengy col.,
1992), X. laevis (Roe y col., 1985),pollo (Desjardinsy Morais, 1990) y
hombre(Andersony col., 1981) semuestraen laFigura32. En general,las
subunidadesde la citocromooxidasa(Col, COII y COIiI) se encuentran
muchomásconservadasquelassubunidadesdela NADH deshidrogenasay
la ATPasa.Ello es debido,probablemente,a que en el primer caso,las
subunidades codificadas forman parte del centro catalíticodel holoenzima
(Cantatorey Saccone,1987),mientrasque en los otros dos casosse trata
desubunidadesreguladoras,estandolassubunidadescatalíticascodificadas
en el núcleo.La secuenciasaminoacídicasdeducidasde los genesCOl y
ATPasa8 presentan,respectivamente,el mayor y menor grado de
homologíacon carpa(973/ 80.0 %), C. lacustre (97.1/ 76.8%), X. laevis(95.3/80.3%), Pollo (94.0/67.3 %) y hombre(92.8/45.3 %).
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9. EXTRACCION DE mtRNA.
EL mtRNA representasólo un 0.5% de la cantidadtotal del RNA
celular, por lo que su aislamientosueleplantearla necesidadde un
enriquecimientoprevio. Tradicionalmenteesteenriquecimientoseconsiguia
manteniendola contaminaciónnuclearal mínimomedianteel tratamiento
con nucleasade micrococoso inhibidores de la transcripciónnuclear,
seguidodel aislamientode lasinitocondriaspor centrifugacióndiferencial.
En nuestro caso (Métodos, sección24) para reducir al máximo la
contaminaciónnuclear se realizó exclusivamenteuna rotura celular
controlada,seguidade lavados sucesivosde la fracción mitocondrial
obtenidapor centrifugacióndiferencial. Con estatécnica, el rendimiento
obtenido fue de 30 gg de mtRNA por gramo de hígado,únicamente
contaminadoconpequeñascantidadesde rRNA nuclear(Fig. 33, calle 1).
Con el objeto demejorarla purificación, lasfraccionespoliadeniladas
fueronseparadasdel resto delmtRNA mediantedos pasesconsecutivosa
travésdeunacoluninadeoligo(dT) - celulosa.Los componentesdecadauna
de las dos fraccionesresultantesde la cromatografía(A-’- y A-> fUeron
separadosmedianteelectroforesisen gelesdesnaturalizantesdehidróxido
de metilmercurio(CH3HgOH)y posteriormenteteñidos con bromurode
etidio. De estaformasepudieronidentificar, al menos,8 bandasdiscretas,
variablesenintensidady tamaño,enla fracciónpoliadeniladay dos en la no
poliadenilada(Hg. 33, calles2 y 3).
10. IDENTIFICACION DE LOSDIFERENTES mtRNAS.
Aunque el patrón electroforéticoobtenido para las especiesde
mtRNA detruchaarcoiris recuerdaal descritoencélulasHeLa (Montoyay
col., 1983), ciertas diferenciasen la movilidad relativa de las bandas
impedíanla identificación directa de las diferentesbandas.Por ello, el
estudiose completéconla realizacióndehibridacionesentrelasdiferentes
especiesde mtRNA obtenidasy lassondaspreparadasapartir delmtDNAde truchaarco iris previamentedonado.Paraquela identificaciónfriese
inequívoca,lassondasfuerondiseñadasdetal maneraquecadaunadeellas
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Resultados! 104
sólopudierareconocerunaespeciedemtRNA (Tablay).
La hibridación con las sondasanteriormentedescritaspermitió
asignarclaramentecadaunadelasespeciesde mtRNA, observadasenlos
gelesteñidoscon bromurode etidio, a un gen determinado.Siguiendola
nomenclaturaestablecidapor el grupo deAttardi (Montoyay coiL, 1983),en
la fracción no adeniladadel mtRNA de trucha arco iris, se pudieron
identificar los rRNAs 125 y 165,así comola presencia,enmenorcantidad,
de su precursorno procesado,el RNA 4a (Fig. 34, a)- Por otra parte,la
sondaquereconocíael rRNA 125,hibridabaconunaespeciedemtRNA no
adeniladade menortamaño,queno ha sido caracterizadahastaahora.Así
mismo, el RNA 18 descrito en célulasHeLa(Montoyay col., 1983), no ha
podido serdetectadoentrelos RNAs de truchaarco iris directamenteen los
geles teñidosconbromuro de etidio, ni medianteunahibridación con un
fragmentoque comprendela zonadel D-loop dondeteóricamentedebería
estarcodificado.
En la fracciónpoliadenilada,se identificaronde forma precisalos
mtRNAs5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15 y 16 quecorresponden,respectivamente,
a los genesND5, ND4L y ND4, COl, Cyt b, ND2, ND1, ATPasa8 y 6,
COIiI y COII, todosellos codificadospor la cadenapesada(Fig. 34, c). Los
RNAs 7 y 9 migraronala mismaaltura, y lo mismoocurrió con los RNAs
11 y 12. La sondaquepermitió reconocerel rRNA 165 en la fracciónno
adenilada,reconocióel mtRNA 10 a la misma alturaen la fracción A+.
Mereceespecialmenciónla detección,mediantesobre-exposiciones,de una
especiede mtRNA que migrabaentrelos RNAs 7 y 9 y quehibridó, tanto
con la sondaque reconoceel RNA 14 comocon la que reconoceel RNA 15 y
que,por lo tanto,sepodríasospecharque esun precursorno procesadode
ambos (Fig. 35). La hibridación con la sondaque reconoceel RNA 9 no
permitedetectarel RNA 6. Por otraparte,no se pudoprepararapartir del
mtDNA donadouna sondaparadetectarel RNA 17, debidoa que el gen
ND3 no conteníadianaalgunaparalas enzimasde restricciónhabituales.
Se intentaronotras estrategasalternativas,como la hibridacióncon
oligonucleótidosespecíficosdedichogeno el marcajedela cadenapesadadel
fragmentoderestricciónqueconteníael genapartir deun oligonucleótido
específico,pero ningunadeellaspermitió identificardichoRNA.
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Resultados¡ 106
Con el fin de poderdetectar los tránscritosde la cadenaligeray en
especial identificar la existenciade un RNA específicodel gen ND6 se
preparó, utilizando como molde la cadenapesadadel clon pTRZ—2a, una
sonda marcadaal azara partir de un oligonucleátidoqueconteníapartede
la secuenciade la cadenaligera en la regióndel genND6. Estasondahibridé
con un RNA quemigra en los gelesde agarosa a la mismaaltura que los
RNAs 11 y 12.
14—
9
—8
~-i5
Figura 35. Detecciónde un misma RNA con las sondasque reconocen
los genesde las ATPasas8 y 6 y el gen00111.Es muy probable que este RNA
correspondaa un precursoraún no procesadode los RNAs 14 y 15.
4
Resultados! 107
Además, una sobreexposiciónde los filtros hibridados,permitió
detectardos bandasque, por su migración,podríancorrespondera los
RNAs 1 y 2 descritosen célulasHeLa (Montoyay col., 1983). Estasdos
bandastambiénfueron detectadascuandose hibridó con lassondaspara
los genesATPasa8 y 6, COIIJ y GOII, y la de mayor tamañoincluso con
lassondasparalos genesl2Sy 16S. Por el contrario,ningunadelassondas
utilizadaspermitiódetectarel RNA 3.
11. ANALISIS FILOGENETICO.
Cualquieradelos genesqueformanpartedel genomainitocondrialde
la truchaarco iris puedeutilizarseen un análisisifiogenético.Sin embargo,
no todos contienenel mismo númerode sitios informativos ni poseenel
mismoritmo de sustitucionesen sussecuencias.Además,la elecciónde
unosu otrosgenesdependedel tipo de relacionesfilogenéticasquese desee
investigar.Finalmente,esnecesarioteneren cuenta,a la hora de elegir un
genconcreto,el númeroy posiciónevolutivade los organismosen los que
estegenestátambiénsecuenciado.El númerodeorganismosen los quese
ha secuenciadototalmenteel genomamitocondrial es pequeñoy, más
concretamente,sólo se conocela secuenciacompletadel mtDNA de dos
peces(C. carpio y C. lacustre).La escasezde secuenciasimpide,por lo
tanto, realizarun análisisexhaustivode lasrelacionesfilogenéticasentre
los pecese incluso entrelos teleósteos.Tampoco es factible utilizar los
genesmitocondrialesparaestablecerlasrelacionesfilogenéticasentrelos
vertebrados,puestoqueno existeaunningúnmtDNA secuenciadode reptil
y sólo unode anfibios(X laevis)y otrodeaves (Gallusgatius),lo queimpide
la obtenciónde árbolesfilogenéticosconalto margendeconfianza
A partir de los datos de secuenciadisponiblesen la actualidad,las
únicas cuestionesfilogenéticasabordablesa nivel de pecesson: 1) el
establecimientode las relaciones evolutivas entre actinopterigios
(teleósteos)y sarcopterigios(celacantoy pecespulmonados>y surelación
con el origen de los tetrápodos (vertebradosterrestres)y, 2) el
establecimientode lasrelacionesentrecondrictios(pecescartilaginosos)y
osteictios(pecesóseos).
Resultados! 108
Para resolver este tipo de cuestionesfilogenéticas, son
especialmenteindicadoslos genesmitocondrialesque codificanparael
rRNA 125 y para el citocromo b. Ambos presentanun ritmo de
sustitucionesconstante,siendosussitios informativosdistintosal codificar
uno pararRNA y el otro paraunaproteína. Ademástienenunaventaja
adicional,y es queson los genesque másse han utilizado enel estudiode
cuestionesevolutivasdentro de los peces,por lo queel númerode especies
quesepuedenincorporaral análisis,esmuchomayor.
11.1. Análisisenfuncióndel genrRNA 125.
La secuenciacompletadel gen 125 rRNA de truchaarco iris (944
nucleótidos)fue alineaday comparadacon todaslas secuenciasde peces
que, paraestegen,se encuentranactualmentedisponiblesen los bancosde
datosGenBanky EMBL, asícomoconlas secuenciascorrespondientesde
anfibios. A partir de los alineamientos,se calcularonlas matrices de
distanciasutilizando los métodosde Kimura (1968, 1980) y Jukes-Cantor
(1969). En la construcciónde árbolesseutilizó como especieexternael
celacanto(Latimeria chalumnae).Los algoritmosde Fitch y Margoliash
(1967) y de unión por vecindad(Saitou y Nei, 1987) se aplicarona las
matrices de distancia generadas,dandolugar a los correspondientes
árboles.Estos,presentabantodosla mismatopología,diferenciándoseunos
de otros,únicamente,en la longitud de susramas(ñg. 36, ay b). Por otro
lado, seaplicó directamentea los datosdesecuencia,el métododemáxima
verosimilitud(Felsenstein,1981),obteniéndosela mismatopologíaquecon
los métodos de matrices de distancia, pero con ramas de longitud
ligeramentedistinta (Fig. 36, e). Finalmente,el algoritmo de máxima
parsimonia(Fitch, 1977) fue aplicadodirectamentealos alineamientosde
las secuenciasde nucleótidosobteniéndoseun árbol con una topología
ligeramentedistinta, en la quelos pecespulmonadosdejande comportarse
comoun grupomonofilético(Fig. 37, b).
El nivel de confianzaestadísticade los árbolesestimadospor los
diferentesmétodos se evaluó mediantela generaciónal azar de 100
variantesdel grupode secuenciasoriginal [jbootstrap(Felsenstein,1985)].
Resultados! 109
A continuación, a partir de cada variante se construyó el
correspondienteárbol mediantelos métodosde máximaparsimoniay unión
por vecindad.Finalmente,se realizóun árbol consensode los 100 árboles
generadospor el algoritmode máximaparsimonia(Fig. 37,a) y de los 100
generadospor el algoritmode unión por vecindad(Fig. 37,b). En los árboles
consensoobtenidos,cadanodopresentaunvalor quecorrespondeal número
de árbolesenlos queaparecedichonodo, proporcionandode estamanera,unasignificaciónestadísticaalasramasquepartendelmismo.
1L2. Análisisenfuncióndelgendelcitocromob.
La secuenciacompleta delgenquecodificaparael citocromob de la
trucha arco iris (1141 nucleótidos),fue alineadacon las secuenciasanálogasdetrescondrictios(C. plumbeus;S. tiburo y G. cuvier),el esturión
(A. transnwntanus)y tresciprínidos(C. carpio; C. lacustrey L. roseipinnis).
El análisisde los alineamientosgeneradosmediantelos métodosde unión
por vecindad, Fitch-Margoliash, máxima verosimilitud y máxima
parsimoniapermitió construir los correspondientesárbolesfilogenéticos,
utilizando el erizo de mar (Strongylocentrotuspurpuratus)como especie
externa(Figs.38 y 39). El nivel de confianzaestadísticade los árbolesfue
evaluadomedianteel método“bootstrap” (100 réplicas)con los algoritmos
de unión por vecindady máxima parsimonia(Fig. 39). Las topologías
obtenidaspor los métodosde matricesde distanciay la generadapor el
método de máxima verosimilitudson iguales,diferenciándoselos árboles,
únicamente,en la longitud de sus ramas.La topología obtenidapor el
métodode máximaparsimonia,difiere del resto,en la posiciónrelativadel
estunón.
Resultados! 110
Oncorhynchusmykiss
Cros.sostomalacustre
Cyprinuscarpio
Xenopuslaevis
Ranacastebejana
Neoceratodusforsteri
Protopterussp
Latimeriachalumnae
a
Oncorhynchusmykiss
Crossostomalacustre
Cyprinu.scarpio
Xenopuslaevis
Ranacastebetana
Neoceratodusforsteri
Protopterus sp
Latimeriachalumnae
b 0.1
Oncorhynchasmykiss
CyprinzzscarpioCrossostoynalacustre
Xenopus¡aeL•Is
Rana castebetana
Neoceratodusforsteri
Protopterussp
Latimeriachalumnae01
c
Figura 36. Arboles filogenéticosbasandoseen la secuenciadel gen
rRNA 12S. Los árboleshan sido generadosmediantelos algoritmosde a) Unión por
vecindadsobre la basede unamatriz de distanciascalculadapor el método de Jukes-
Cantor.b) Fitch-Margoliashsobrela basede unamatriz de distanciassegúnel método
de Kimura y c) Máximaverosimilitud. En todoslos casos,la longitud de las ramases
proporciona]a] númeroestimadode sustitucionespor nucleótido.
U
Resultados! 111
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u-
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Oncorhynchusmykiss
Crossostornalacustre
Cyprinuscarpio
Xenopus laevis
Ranacastebejana
Neoceratodusforsteri
Protopterussp
Latimeria chalumnae
a
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u-
Oncorhynchusmykiss
Crossostomalacustre
Cyprinuscarpio
Xenopuslaevis
Ranacastebejana
Neoceratodusforsteri
Protopterus sp
Latimeria chalumnae
Figura 37. Arboles consensoresultantesdel análisis estadísticopor
“bootstrap”, basandoseen la secuenciadel gen rRNA 12S. a> utilizando el método
de unión por vecindada partir de unamatriz de distanciasgeneradapor el métododeKimura y b) utilizando el métododemáximaparsimonia.En amboscasos,el númerode
réplicas generadopor “bootstrap” fue 100. Los valoresexistentesen cada bifurcaciónindicanel porcentajede vecesqueapareceel grupode especiespresentesa la derechade
dichabifurcación <nodo> en todoslos árbolesexaminados.
67.2
¡ 1
L~
b
Resultados! 112
Carcharhinusplumbeus
SphyrnatiburoGaleocerdocuvier
Cyprinus carpio
Lythrurus. roseipinnisCrossostomalacustre
Oncorhync/u¿snzykiss
Acipenser transmontanus
Strongylocentrotuspurpuratus
a ¡ 0.1
Carcharhinusplumbeus
Sphyrna tiburo
1GaleocerdocuvierCyprinuscarpio
LythrurusroseipinnisCrossostomalacustre
Oncorhynchus mykiss
Acipensertransmontanus
Strongylocentrotuspurpuratus
b 0.1
Carcharhinusplumbeus
SphyrnatiburoGaleocerdocuvier
Cyprinus carpio
Lythrurus. roseipinnisCrossostomalacustre
OncorhynchusmykissAcipenser transmontanus
Strongylocentrotuspurpurat
e 0.1
Figura 38. Arboles filogenéticos basados en la secuencia del gen
citocromo b. Los distintos árbolesfueron generadospor los algoritmosde a> Unión por
vecindadsobrela basede unamatriz de distanciascalculadapor el método de Jukes-
Cantor.b> Fitch-Margoliashsobrela basede unamatriz de distanciassegúnel método
de Kimura y c) Máximaverosimilitud. En todoslos casos,la longitud de las ramases
proporcionalal númeroestimadode sustitucionespor nucleátido.
Resultados! 113
I *5 0
l00
—82.0 1~~—
m 78.0
92.0
w
Carcharhinusplumbeus
Sphyrnatiburo
Galeocerdacuvier
Cypr-inus Carpio
Lythrurus roseipinnis
Crossostomalacustre
Oncorhynchus myktss
Acipenser transmontanus
Strongylocentrotus purpuratus
a
85.0
100
tu——52.0
Carcharhinusplumbeus
Sphyrna tiburo
Galeocerdocuvier
Cyprinus carpio
Lythrurus roseipinnis
Crossostomalacustre
Oncorhynchus myktss
Acipensertransmontanus
Strongylocentrotus purpuratus
b
Figura 39. Arboles consensoresultantesdel análisis estadísticopor“bootstrap”, basandose en la secuenciadel gen citocrozno b. a) utilizando el
método de unión por vecindada partir de unamatriz de distanciasgeneradapor el
métodode Rimura y b) utilizando el métodode máximaparsimonia.En amboscasos,el
númerode réplicasgeneradopor “bootstrap” fue 100. Los valoresexistentesen cada
bifurcaciónindicanelporcentajede vecesqueapareceel grupode especiespresentesa la
derechade dicha bifurcación(nodo) en todoslos árbolesexaminados.
DISCIJSJON 1
Discusión] 114
El genomamitocondrialde los animales,debidoa sureducidotamaño
y peculiarescaracterísticasestructurales(economíaorganizativa)y
funcionales(estrechainterrelacióncon el genomanuclear),hademostrado
ser particularmenteútil en el estudio de procesosmolecularestan
complejoscomo la replicacióno la transcripción.Así mismo, su relativa
simplicidady alta tasamutacionalcon respectoal genomanuclear(Brown
y col., 1979) le han convertidoen unaherramientamuy útil a lahora de
establecerrelacionesfilogenéticasentre diferentesespecies.En este
sentido,la secuenciacióndel genomamitocondrial de la truchaarco iris
(Oncorhynchusmykiss)realizadaenel presentetrabajo,pretendecontribuir
a la caracterizaciónde estamoléculaypermitir su utilización en estudios
debiologíay filogeniamolecular.
El métodoelegidoparala extraccióndel mtDNA de la truchaarcoiris
(Palvay Palva,1985) sebasaenla lisisalcalinade mitocondriashepáticas
previamentepurificadas.Estemétodo,aunqueproporcionaun mtDNA de
menor calidadqueel que se obtienepor centrifugaciónen gradientesde
cloruro de cesio (Lansmany col., 1981; Tapper y col., 1983), es
relativamenterápido y, como sedemuestraen estetrabajo,en el casode
las mitocondriasdel hígadode truchaarco iris, permiteobtenergrandes
cantidadesde mtDNA con calidadsuficiente para su utilización en
experimentosde clonaje,PORy secuenciación.Los patronesde digestiónresultantesdel cortecon HindIII y Bgl II,
son los mismosque los denominadosHindIlI (i) y Bgl 11(i) por Palvay
Palva(1987).Por lo tanto,sededucequelos ejemplaresde truchaarco iris
utilizados en nuestro trabajo, corresponderíanal stock finlandés
denominadoA por estosautoresy queprocedede EstadosUnidos.Este
hecho demuestra que, piscifactorias tan distantes como lasnorteamericanas,las escandinavasy las españolas,compartenel mismo
stockparasu producción,y que éstepuedeser fácilmentecaracterizadomedianteel corteconHindIl! delmtDNA -
En la construcciónde las genotecasde mtDNA se observóque, al
margende su tamaño,la eficienciadeclonaje dealgunosde los fragmentos
Discusión] 115
de restricción, era muy pequeña-Concretamente,se observó que la
incorporaciónde un fragmento EcoRI de 4 kb (clon pTRZ-2)’ y un
fragmentoHindlII de 1.7 kb (clon pTRZ-14)’ por el plásmidopUCiS
provocabaunadisminuciónmuy evidenteen el númerodecopiasdelvector.
Estasituaciónno sepresentabaen cambio,en los subclonesobtenidospor
digestióncon Pstl del clon pTRZ-2 (pTRZ-2a y pTRZ—2b)’, ni en el clon
pTRZ~41 que contenía un fragmento PvuII de 2.5 kb que solapaba
parcialmentecon el clon pTRZ-14. Significativamente,cuandosesecuencié
el mtDNA secomprobóque, el clon pTRZ-2y el subclonpTRZ-2bcontenían
el origen de replicaciónde la cadenapesada(OH), y el clon pTRZ-14
conteníael origende replicaciónde la cadenaligera (00, y no así,los clones
pTRZ—2a y pTRZ-4. Todoello sugiere,quela presenciaen los insertosde la
secuenciacorrespondientea los orígenesde replicaciónmitocondriales,o
bien las estructurassecundariasasociadasa ellos en los insertos,debe
afectara la propiareplicacióndelplásmidoutilizadocomovectordeclonaje.
Adicionalmente,esteefectoparecedependerde la posicióndelos orígenesde
replicaciónmitocondrialesenel inserto,puestoque, por ejemplo,el subclon
pTRZ—2b aun conteniendoel 0H, no presentabadisminuciónen el número
decopias.
Los clonespTRZ—0, pTRZ-11,pTRZ-12,pTRZ-13, pTRZ-14, pTRZ—
15, pTRZ-16, pTRZ-2, pTRZ—5 y pTRZ-6’ cubrenla totalidaddel mtDNA de
la trucha arco iris. La secuenciaconsensopresentada,resultantede la
combinaciónde las secuenciasobtenidasa partir decadacadaunodeestos
clones,tieneuna longitudfinal de 16660 pb. Es,por lo tanto,casiigual quela deC. lacustre(16558pb), ligeramentemayorquela de carpa(16575 pb)
y mamiferos(16295-16569pb), ligeramentemenorquela delpollo (16775
pb) y considerablementemenorquela deXenopuslaevis (17553 pb). Las
variacionesencontradasenla longitudtotal del genomamitocondrialentre
diferentesespeciesson,principalmente,debidasavariacionesenel tamaño
del D-loop y, secundariamente,al tamañode los genesde los rRNAs 125 y16S. El contenidoG + O del genomamitocondrial de la truchaarco iris
(459%)esequiparableal del restodevertebrados(Tzengy coL, 1992).
1 Ver Tabla II de Resultados,pág. 69.
Discusión! 116
Conanterioridada estetrabajo,sehandescritoalgunassecuencias
parciales del mtDNA de trucha arco iris, que en total suponen,
aproximadamente,un 24 % del genomamitocondrialtotal. En concreto, se
conocela secuencia de un fragmentoXbaI de 1.3 kb (Davidsony col.,
1988), la secuencia del fragmento HindIII de 2.2 kb (Thomas y
Beckenbach,1989),quesolapacasicon la totalidaddel fragmentoXbal y,
más recientemente,se ha secuenciadoel D-loop (Digby y col., 1992).
Nuestrasecuenciaesidénticaa laobtenidapor Dighyy col., y discrepaen 3
nucleótidosde la obtenidapor Thomasy Beckenbach,probablemente
debidoavariacionesinterpohíacionales.Por otra parte,tanto la secuencia
de Thomasy Beckenbachen la zona quesolapa,como la nuestraen su
totalidad,sonclaramentedistintasdela obtenidapor Davidsony col.
La organizacióngenómica(tanto el ordende los genes,como la
cadenaquelos codifica) del mtDNA de trucha arco iris es idéntica a la
descritaen ciprínidos (C. lacustrey carpa) y en todos los vertebrados,
exceptoel pollo (Desjardinsy Morais, 1990) y el pato (Ramírezy col.,
1993)2. Conrespectoalassecuenciasintergénicasexistentesenel mtDNA
de truchaarco iris, cabedestacarque la mayor de ellas (14 nt), situada
entreel genquecodificaparael tRNAAsp y el gen0011,presentala misma
longitud enC. lacustrey carpa,estáreducidaatres y dos nucleótidosen X
laevisy pollo respectivamente,aun nucleótidoen la rata y no existe en el
hombre. Por lo tanto, parececlaro que, en consonanciacon la línea
evolutivade economíaquerige la organizacióndelmtDNA, estasecuencia
intergénicasehaperdidoenel transcursodela evolución.
La región que comprendeel D-loop ya había sido donaday
secuenciadaanteriormente(Digby y col., 1992). La secuenciaobtenida en
este trabajo,esidénticaa la ya descrita.Sin embargo,ennuestroanÁlisis,
encontramosocho regionesasociadasa la terminaciónde la replicación
(TASs) basándonosen la homologíade su secuenciacon la de las TASs
descritaspara hombre y ratón (Doda y coL, 1981), frente a las tres
identificadas(TAS- 1, TAS-5 y TAS-8)por Digby y col 3. Respectoa los
2 Ver Figs 5 y 6 dela Introducción,pág. 12 y Fig. 24 de Resultados,pág. 70 -
Ver Fig. 26 de Resultados,pág. 80.
Discusi6~ 117
bloquesde secuenciaconservada,dos de ellos, CSB-ll y CSB-III, son
claramenteidentificables y muy parecidosa los descritosen esturión
(Burokery col., 1990),bacalao(Johanseny col., 1990),C. lacustre(Tzengy
col., 1992), carpa(Changy Huang, 1994),X. laevis (Roe y col., 1985) y
hombre (Chang y Clayton, 1987). Por otra parte, el elementoCSB-I
definido como tal, en hombre y ratón (Walbergy Clayton, 1981), está
reducidoen los pecesy X. laevis, a un pentanucleótido.Si a este hecho
añadimos,que en la vaca(King y Low, 1987), la oveja (Zardoyay col.,
1994)y los cetáceos(Dillon y Whright, 1993) no se encuentrael elemento
CSB-llI, pareceprobableque,únicamente,el bloqueCSB-1I puedatener
un papel decisivo en la transiciónde RNA a DNA en el inicio de la
replicacióndelmtDNA (Zardoyay col., 1994).
Una característicanotablede la secuenciadel D-loop esla presencia
de 26 pirimidinasseguidasen posición5’ con respectoalos CSBs.Se han
encontradodos bloquessimilaresde 17 y 27 pirimidinas en el bacalao
(Johanseny col., 1990). Así mismo, se ha descrito una proteína
mitocondrialdenominadamtSSBquereconoce,preferencialmente,motivos
deestetipo enDNAs decadenasencilla(Mignottey col., 1985)y queparece
estarimplicadaenla regulacióndel inicio de la replicación.
Por otraparte,enel extremo3’del D-loop, cercadelgentRNAPhe,se
haidentificado unarepeticióndirectade 19 nucleótidos.La presenciade
repeticionesen el D-loop del mtDNA de vertebradoses un fenómeno
bastantecomún. Se handescritorepeticionesen el extremo5’ del D-loop de
X. laevis (Roe y coL, 1985), esturión (Buroker y col., 1990), bacalao
(Johanseny col., 1990), pollo (Desjardinsy Morais, 1990) y oveja(Zardoya
y col., 1994). Estasrepeticionesestanlocalizadasalrededorde lasTASs,y
su origenpareceestarrelacionadoconfenómenosde reincorporacióndela
cadenanacientede replicación(Buroker y col., 1990). La presenciade
repeticionesen el extremo3’ es menoscomúny sólo se ha descritoen el
conejo(Mígnottey coL, 1990),enel monoverde(Karawyay Martin, 1987)y
en la oveja (Zardoyay col., 1994). Lasrepeticionesquese encuentranen el
D-loop de truchaarco iris, selocalizanentrelasCSBs y el gentRNAPhe,en
la mismaposición dondeaparecenlos promotoresimplicadosen el inicio dela transcripcióndelas cadenaspesada(HSP) y ligera(LSP) enel hombrey
Discusión] 118
el ratón(Montoyay col., 1982; Changy Clayton, 1984),por lo quepodrían
estar relacionadoscon ellos. De hecho, en el hombre y el ratón, los
promotorespresentanun dominio quees reconocidopor el factor mtTFl
(Fishery col., 1989), y las dianasparaestefactor estáninvertidasunacon
respectoa la otra en estospromotores,lo que sugierequelos promotores
HSP y LSP procedende la duplicaciónde un únicopromotorbidireccional
original. En X laevis (Bogenhageny Yoza, 1986)y enel bacalao(Johansen
y col., 1990),los promotoresselocalizanen estazonay presentantambién
duplicacionesaunquedemenorextensión.El análisis de la secuenciadel D-loop se ha completadocon la
búsquedadeposiblesOREs.Se haencontradounapequeñaORE entrelos
nucleótidos820 y 985 que podría codificar para un polipéptidode 55
aminoácidos.De acuerdocon la orientaciónde la ORF, estepolipéptido
estadacodificadopor la cadenaL y suestructurasecundariaconsistidaen
unahoja 13 plegadacentralrodeadade doshélicesa. La posiciónde esta
ORF entreel gen tRNAPhey los CSBs,su tamañoy orientación,recuerdan
a la ORF descritaenel RNA 7S decélulasHeLa (Ojalay col., 1981b). Sinembargo,la secuenciade aminoácidosdeestaORE, no secorrespondecon
la encontradaen el D-loop decélulasHeLa. En cambio,unabúsquedaen el
banco de datosSw-issProt,revelaun cierto parecidode estepolipéptido
(limitado a unos pocasaminoácidos)con un factor de transcripciónde
levadurascodificadopor el núcleoe implicadoen el inicio correctode la
transcripciónmitocondrial(Hafftery Fox, 1992). Dadasulocalizaciónenla
región dondedebenestar los promotores,la ideade que esta ORF esté
implicadaen la regulacióndela transcripciónresultamuy atractiva.No
obstante,no se haencontradoenningúnotropez (bacalao,esturión,carpa
y C. lacustre), lo quehace poco probableque tenga algunsignificado
funcional en la truchaarcoiris.
El origen dereplicacióndela cadenaligera (Ox.) de truchaarco iris se
localizacomoen el restodevertebrados,enlos quehasido secuenciado(con
la excepcióndelpollo y el pato, quecarecende él), entreel gendel tRNAAsn
y el gendel tRNA Cys amboscodificadospor la cadenaL. 0L conservala
Discusión] 119
estructurasecundadatallo-bucledescritaen otros vertebrados4.El tallo,
rico en guaninasy citosinas,presentagran homologíacon los tallos
encontradosenotrospeces(exceptoC. lacustre ), X. lae vis y mamíferos.Por
el contrario, el bucle que proponemos para el 0L de la trucha arco iris
sorprendepor su gran tamaño(17 nucleótidos)con respectoa otros bucles
y por la presenciade 11 pirimidinasseguidas(10 citosinasy 1 timina)4.
Ningúnbucle descritohastael momentopresentatal cantidaddecitosinas.
En los peces,el bucledel 0L delbacalaopresentacuatrocitosinasseguidas,
el de C. lacustreúnicamentedos y el de la carpa,ninguna. En X. laevis
tampoco hay y en mamíferos,la foca y el hombreexistentres. Sin
embargo,en X. laevis y mamíferosse encuentrancinco y seis timinas
seguidas,respectivamente.De acuerdocon el modelo propuestopara la
especiehumana(Hixsony col., 1986),el inicio de la replicaciónseproduce
por la síntesisde un cebadorde RNA por unapnmasaenla regiónrica en
timinas, y la transicióna DNA se produceen la secuencia5’-cGGcc-3’,situadaenla basedel Eh,dentro del tRNACYs. La secuenciade transición
RNA-DNA descrita en el hombre, aparece en todos los orígenes
identificadosenvertebrados,incluidala truchaarco iris. Sin embargo,la
sustituciónde timidinaspor citosinasen la truchaarco iris permitesugerir
que la síntesis del RNAcebador por la primasa, probablemente, requiere
unaregión rica en pirimidinas,y no está restringida,exclusivamente,a la
presenciade timinas como sehabíasugeridopreviamente(Hixson y col.,
1986). Por lo tanto, el modelo de inicio de la replicaciónen 0L propuesto
para el hombrepareceser aplicablea la trucha arco iris con ciertas
variaciones,sin embargo,estemodelono puedeserdefinitivo parapeces,
puesto que en la carpa y en C. lacustre,no existenregionesricas en
citosinas,ni entinúnas.
El genomamitocondrial de la truchaarco iris, contiene 22 tRNAs
intercalados entre los genes codificantes de proteínas y rRNAs, ajustándose
asíal modelodepuntuaciónpropuestoparael hombre(Ojalay col., 1981 a)
y quetambiénse cumplepara el resto devertebrados.Así mismo, como
ocurre en los demásvertebrados,el triplete CCA del extremo 3’ de los
4 Ver Fig 29 de Resultados,pág. 84.
Discusión] 120
tRNAs, no apareceenla secuenciadesusgenes,por lo quedebeserañadidoen la maduraciónpost-transcripcionalde los tRNAs, junto con otras
modificacionestípicas de tRNAs (residuosmetilados,pseudouridina).A
pesarde la existenciade numerososapareamientosO + U, los 22 tRNAs
mitocondrialesde la truchaarco iris presentanla capacidaddeplegarseen
unaestructurasecundariaenformadehojade trébol5.
La secuenciacorrespondientea los brazosaminoacídicoy anticodón,
sonlas másconservadascuandosecomparanlos tRNAs mitocondrialesde
la truchaarco iris con los de carpa,C. lacustre,X laevis, pollo y hombre,
mientrasquelas secuenciasde los buclesDHU y TpC son las másvariables.
De estacomparaciónsededucequeel tRNAMet (probablementedebidoasu
función comoiniciador en la traducción)es el más conservadoentrelos
vertebradosy, en cambio,el tRNASer(AGY) es el másvariable.EstetRNA
se caracteriza,en todoslos animalesconocidos,por carecerde brazo DHU
(De Bruijn y col., 1980). Sin embargo,la estructurasecundariaque
proponemosparaestetRNA enla truchaarco iris, mantienela formade
hoja de trébol; así, el brazo DHtT está formado por un tallo con diez
nucleótidosapareados(dosmásque en el restode tRNAs) y un bucle con
tres nucleótidos. Por el contrario, el tallo del brazo anticodón en el
tRNASer(AGY) estáreducidoa sólo seisnucleótidos,cuandoen el restode
tRNAs, presentadiez -
La estructura del brazo DHU del tRNALeu(UUR> está muy
conservadaentruchaarcoiris, carpa,C. lacustre,X. laevis, pollo y hombre.
De forma manifiesta,la conservacióndetectadaen estebrazo, tanvariable
en otros tRNAs, secentraen la secuencia5’-TGOCAGAGCCCGG-3’queen
el hombrese ha identificado como responsablede la terminaciónde la
transcripción de los rRNAs (Christianson y Clayton, 1988). Esta
secuencia,es idénticaen la truchaarco iris y en el hombre,presentando
sustitucionesen otros peces,enX.laevisy en el poílo. En el hombreseha
descrito que la presenciade mutacionesen esta región, producela
enfermedad denominada MELAS, que es una subclase de encefalomiopatía
de origenmitocondrial (Hessy coL, 1991).
5 Ver Fig. 31 de Resultados,págs.89-92.
Discusión!121
En el análisisdeluso de codonesenel mtDNA de truchaarco iris, en
los 13 genescodificantesde proteínas,se contabilizanun total de 108
codonesATA codificantesde metioninafrentea, tan sólo, 41 codonesATG;
todoslos codonesde iniciaciónidentificadosenel mtDNA de truchaarcoiris
sonATG, exceptoel del genCOl queesGTG, situaciónqueserepiteenotros
peces(Tzengy coL, 1992) y en el pollo (Desjardinsy Morais, 1990). En INI
laevis todos los codonesde iniciaciónson ATG (Roe y col., 1985), mientras
que en mamíferos,ND2, ND3 y ND5 suelencomenzarcon ATA, y en
roedoresNDl comienzacon GTG (Bibb y col., 1981; Gadaletay col., 1989).
Sibien el uso decodonesdeiniciación, esidénticoen todos los teleósteos,no
ocurreasíconel uso de codonesde terminación.En la truchaarco iris, los
genesND2, 001,ATPasa8, ND4L y ND5 terminanen TAA; los genesND1
y ND6 acabancon el codónTAG. El resto degenesterminanen 1’ (COII,ND4 y Cyt b) o en TA (ATPasa6, COIJI y ND3) y, tal como se ha
demostradoen el hombre(Ojaila y col., 1981 a; Andersony col., 1981), los
codonesde terminación,probablemente,se debencompletarconla adición
post-transcripcionalde colaspoli-(A) a los mRNAs correspondientes.Sin
embargo,en C. lacustre, ND2, ND3 y ND4 terminanenTAG; COIJy Cyt b
acabanenT; 00111terminaenTA y el restoenTAA y en la carpa,ATPasa
8 terminaen TAG; ND2, 0011, ND4 y Cyt b acabanenT; 00111 y ND3
terminanenTA y el restoenTAA.
Al no existirun tRNA quereconozcalos codonesAGG y AGA, cuando
éstosaparecen,actúancomo codonesde terminaciónenel códigogenético
nútocondrialdevertebrados(Andersony col., 1981). En la truchaarco iris,
se confirma la inexistenciade estoscodones,tantodentrode los genescomo
al final de ellos. Sorprendentemente,en la secuenciade carpa(Changy
Huang,1994),existeun codónAGO dentrodelgenND4 enla posición 11351
y que, según estos autores, codifica paraarginina.De forma similar, en la
secuenciadeC. lacustre(Tzengy col., 1992)existe uncodónAGA dentro del
gen00111enla posición9753 que,segúnlos autores,codificatambiénpara
arginina.En truchaarcoiris, enla posicionescorrespondientesdel genND4
y delgenCOIII, se encuentranel codónCGC, quecodificaparaargininay el
codónGCC, quecodificaparaalanina,respectivamente.
Discusión! 122
El codón~A, que en el código genéticouniversales un codónde
terminación, en el código genéticomitocondrialcodificapara triptófano
(Barrelí y coL, 1979), y en el casode la truchaarcoiris esel codónquese
usa mayoritariamenteparacodificar esteaminoácido(en los 13 genes
codificantesde proteinasse utilizan 101 codonesTGA frente a sólo 20
codonesTGG paracodificar triptófano).
Como ocurre en el resto de mtDNAs de vertebrados,el uso de
codonesdel genomainitocondrial detruchaarcoiris se caracterizapor una
clara tendenciaa utilizar citosinasy adeninasen la última posición de
codóny apenasincluir residuosdeguanina.Del alineamientoy comparaciónde las secuenciasaminoacídicasde
las proteínascodificadaspor el genomamitocondrialde truchaarco iris con
sushomólogasde otros vertebradosse deducequelas subunidadesdelacitocromo oxidasa están altamente conservadas,mientras que las
subunidadesde la ATPasa y la NADH desbidrogenasa.son de las más
variables.Mientras las primerascorrespondena subunidadescatalíticas
del holoenzima,las segundascorrespondena subunidadesreguladoras
(Cantatorey Saccone,1987). Lógicamente,los polipétidoscodificadospor
el mtDNA de trucha arco iris presentanmayor homologíacon los
codificadospor el restode peces(76.8-977%),acontinuaciónconlos deX
laevis (803-95.3%)y en menor medidacon los de poíío (673-94.0%)y
hombre (45.3-92.8%).Una característicacomún a todos los polipéptidos
codificadospor el mtDNA, esla variabilidaden el extremocarboxilo.Los dos
casos más patentes son el extremo carboxilo de la subunidad8 de la
ATPasa, que en el hombre cuenta con once aminoácidos más que en el resto
de vertebradosanalizados,y el extremocarboxilo de la subunidad6 de la
NADH deshidrogenasa,que enel hombretiene ocho aminoácidosmenos6.
En amboscasos,estásituacióncoincide con el hechode quelos genesque
codificanpara estospolipéptidossolapancon los genesadyacentes.Sinembargo,tambiénsolapael genND4L con el genND4, y no por ello se
observala presenciadeun extremocarboxilovariable.
6 Ver Fig. 32 de Resultados,pág. 95-101.
Discusión] 123
Comosedesmuestraen el presentetrabajo,el tratamientoutilizado
para aislar el RNA mitocondrial, consistenteen una rotura celular
controlada, seguidade repetidos lavadosde la fracción ¡nitocondrial
obtenidapor centrifugacióndiferencial,essuficienteparaobteneruna gran
cantidad de dicho RNA de los hepatocitosde truchaarco iris. El mtRNA
purificado,apenasmuestracontaminacióncon RNA nucleary, debidoal
particular metabolismohepático de la trucha arco iris, está libre de
glucógeno, fuente principal de contaminación en los extractos
mitocondrialesde hepatocitosdemamíferos(Cantatorey col., 1987).
Los mtRNAs tienenuna gran tendenciaa agregarse,debido a la
presenciade secuenciascomplementariasresultantesde la transcripción
simétricade las dos cadenasdel mtDNA. Por ello, la electroforesis,en
presencia de formaldehido utilizadanormalmenteenla desnaturalizaciónde
RNAs nucleares,no es suficiente para fraccionarlos productosde la
transcripción mitocondrial, y es necesario recurrir a agentes
desnaturalizantesmásfuertescomoel hidróxidode metilmercurio(Amaldc
y col., 1978). Al igual que ocurreen el hombre(Gelfandy Attardi, 1981;
Montoya y Attardi, 1986), los rRNAs 12S y 16S de la truchaarcoiris, son
mayoritariosentrelos tránscritosmitocondriales(se encuentranen una
proporciónentre30 y 60 vecessuperiora los mRNAs) y son, por lo tanto,
fácilmenteidentificablesen gelesteñidoscon bromurode etidio trasuna
electroforesisen condicionesdesnaturalizantes.Por otra parte, los
componentesde la fracción poliadeniladadel mtRNA de trucha arco iris
(obtenidapor cromatografiacon oligo (dT)-celulosa),fueron separados
mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes dando lugar, tras
la tinción de los gelesconbromurodeetidio, aun patrónde 8 bandassimilar
al descrito en células HeLa (Montoya y col., 1983). No obstante,los
patronesde ambasfraccionespresentabanciertasparticularidades,que
hanquedadodemanifiestoal realizarla identificaciónde cadaunade las
bandas con sondas específicas de cada gen, construidas a partir del mtDNA
donado. En primer lugar, cabe destacar que, en general, los mRNAs de
trucha arco iris migran por encima de los correspondientesmRNAs de
célulasHeLa, comoseobservaal tomarcomoreferencialos rRNAs. Puesto
que el tamaño de los rRNAs en trucha arco iris y en el hombrees
Discusión] 124
prácticamenteigual, la diferenciaen la migraciónde los mRNAs, puede
explicarseenfuncióndeun mayortamañode las colaspoli-A en los mRNAs
delpez,conrespectoa los delhombre.Las sondasespecíficasparalos genes12S y 16S, apenaspermiten
detectarel RNA 4a. De ello se deduceque el procesamientodel RNA 4a
para dar lugar a los rRNAs 12S y 16S es muy eficiente en la mitocondria
de truchaarco iris- Los RNAs 7 (genesND4L y ND4) y 9 (genCOl) migran
a la mismaaltura, muy similarmentea lo que ocurreen célulasHeLa
(Amalric y col., 1978;Montoyay col., 1983). De ello sepuedededucirque,al
igual que ocurre en células HeLa, los genesND4L y ND4 se transcriben
juntosdandolugar al RNA 7. Además,la sondaquedebereconocerel RNA
9 y 6, no permitedetectarel RNA 6, por lo que sepuedesugerir queeste
RNA es procesadorápidamenteenla mitocondriade truchaarco iris para
darlugar al RNA 9. A diferenciade lo queocurre encélulasHeLa, el RNA
11 (cyt b) y el RNA 12 (ND2) migran a la misma altura.El RNA 10
detectadoconla sondaparael gen165, migra a la mismaalturaqueeste
RNA y, tal y comosucedeenel hombre(Montoyay Attardi, 1986),esmuy
posiblequepuedacorresponderaunafracciónoligoadeniladadel rRNA 165.
Un hechohastacierto punto sorprendentefue la detecciónde una
especiede RNA poliadeniladoqueesreconocidotantopor la sondadirigida
contrael RNA 14 (ATPasas8 y 6) comoporla sondadirigida contrael RNA
15 (00111)- Este RNA debeser un precursorde los RNAs 14 y 15, y al
migrar entrelos RNAS 7 y 9 permitesugerirque puedeser el mismo RNA
que, encélulasHeLa, fue denominadoRNA 8, y sólo seencontrabacuando
lascélulashabíansido tratadasconactinomicinaO (Montoyay col., 1983).
Puestoqueno existeningún tRNA separandolos genesATPasa6 y 00111,
pareceprobable queel procesamientode tránscritosprimarios paradar
lugara los RNAS 14 y 15 seaun procesomás complejode lo normal, lo que
implicadala acumulaciónmomentáneade un precursor,queen el casode
la truchaarco iris, es posibledetectarsin el uso de actinomicinaD. En
célulasHela,normalmente,esteprecursorseprocesadaconmásrapidez,y
sólo se acumularíaenlos tratamientosconactinomicinaD dandolugaral
RNA 8.Con respecto a los tránscritos de la cadena ligera, con la sonda
Discusión]125
diseñadaparadetectarel productodelgenND6, seidentificó unabandaque
migra a la mismaalturaquelos RNAs 11 y 12. En célulasHela, nuncase
hadetectadoun tránscritoespecíficoparael genND6 (Attardi, 1985). Este
gen, en truchaarco iris, tieneun tamañode 540 Pb, por lo que el RNA
detectado(alrededorde 1100 nucleótidos)debeincluir una región más
amplia. Unasobreexposiciónde las membranashibridadascon estasonda
permitedetectardos bandasque,por su migración,podríancorrespondera
los RNAS 1 y 2, descritosen célulasHeLa (Montoyay col., 1983). La mayor
de las bandas,sedetectótambiénconlas sondasparalos genesATPasa8
y 6, 00111,0011, 125 y 165, por lo queparececorrespondera un tránscrito
primario que abarcaríatoda la moléculadel mtDNA, tal y como se ha
sugeridoparael RNA 1 decélulasHeLa(Attardi, 1985). La menor de las
bandasse detectótambiénconlas sondaspara los genesATPasa8 y 6,
00111y 0011, por lo quecorrespondería,perfectamente,al RNA 2 descrito
en célulasHeLa, que comienzaen el genND6 y terminaen el gen0011
(Attardi, 1985). Ningunade las sondasempleadaspermitió detectarun
equivalentedelRNA 3 de célulasHeLa, y ello puedeserdebido a queeste
RNA en la truchaarco iris, se procesadarápidamenteparadar lugar al
RNA detectadocon la sondapara ND6, que a su vez, nunca ha sido
detectadoencélulasHeLa.
El análisisde los tránscritosde la mitocondriade truchaarco iris
revelaque, conciertaslógicasdiferenciasdebidasadistintaseficienciasen
el procesadode los transcritos primarios, el modelo de transcripción
sugeridopara las mitocondriashumanas(Montoya y Attardi, 1986) es
completamenteválido en la truchaarco iris y, posiblemente,en casi todoslos vertebrados.Ello suponeque,no sólo estaríaenormementeconservada
la organizacióngenómicadel mtDNA en los diferentesgrupos de
vertebrados,sino quetambiénlo estánlos mecanismosimplicadosen su
expresion.El análisis ifiogenético realizadoapartir de los genesquecodifican
para el 12S rRNA y el citocromob de la trucha arco iris, confirma la
utilidad de estosgenesmitocondrialesen el establecimientode relaciones
evolutivas entre diferentes especies.De acuerdo con las relaciones
establecidasen función de carácteresmorfológicos, los primerospeces
Discusión] 126
apareceríanen el cámbrico(Lovtrup, 1977) y son los agnatos(pecessin
mandíbula).A partir de ellos, en el silúrico (Storer y col., 1982),
evolucionaron,por un lado, los antepasadosde los condrictiosactuales
(pecescartilaginosos)y, por otro, los antepasadosde los osteicitiosactuales
(peces óseos)- En el devónico,dentro de los osteictios, se produjo la
separaciónde actinopterigios(condrósteos,holósteosy teleósteos)y
sarcopterigios(crosopterigiosy dipnoos)y, posteriormente,la apariciónde
los primerosanfibiosa partir de los sarcopterigios(Valentine,1978)~.
En funciónde las especiesde vertebradosinferioresenlas quese ha
secuenciadocompletamenteel gen 125 y el citocromo b, se realizóun
análisisfilogenético encaminadoa confirmar el origen de los tetrápodos
(vertebradosterrestres)apartir de los sarcopterigios,y lasrelacionesentre
condrictios, sarcopterigiosy actinopterigios.Los árbolesfilogenéticos
construidosenfunción delgen 12S,establecenclaramentequelos dipnoos
(pecespulmonados>son el grupo de pecesactualesmás cercanoa los
anfibios- El métododemáximaverosimilitudy los queutilizan matricesde
distancia,danlugar a árbolesenlos quelos teleósteosestánclaramente
separadosdeanfibiosy dipnoos.Estosúltimos y los anfibiosse comportan
como ungrupo monofiléticoy, dentrode los teleósteos,ocurrelo mismo conlos ciprínidos (C. lacustrey C. carpio). El árbolresultantede la aplicacióndel
métododemáximaparsimoniaalas secuenciasdel gen 12S, apuntaa una
tempranaseparacióndelpez pulmonadoafricano (Protopterussp) del resto
de los peces,quedandoel pez pulmonadoaustraliano(NI forsterl) como el
pez actual más cercanoa los anfibios. Estudiosprevios basadosen la
secuenciasaniinoacídicasde lascadenasay 13 de lahemoglobina,sugedan
quedentro de los sarcopterigios,el celacanto0- chalumnae),debíaser el
pariente más cercano de los anfibios, en detrimento de los peces
pulmonados(Gorr y col., 1991). Los dos árbolesobtenidosa partir delgen
125 favorecen, sin embargo, una mayor relación entre los anfibios y los
pecespulmonadosqueentrelos anfibiosy los crosopterigios.Estosárboles
concuerdanconlos obtenidosen estudiossimilares(Meyery Wilson, 1990).
La topologíade los árbolesobtenidosporHedgesy col. (1993), en la quelos
7 Ver Apéndice11.
Discusión! 127
dipnoos se comportancomo un grupo monofilético apoyalos resultados
obtenidoscon los métodos de máxima verosimilitud y de matrices de
distancia,frentea la obtenidapor el métododemáximaparsimonia.De los árbolesfilogenéticosconstruidosen función del gen del
citocromob, sededuceunaseparacióntempranadecondrictiosy osteictios.
El único puntooscuroes la posiciónevolutivadel esturión.De acuerdocon
el árbol obtenidopor máximaparsimonia,el esturiónseríaclaramenteun
osteictio pero no un teleósteo.Los árbolesobtenidospor métodos de
matricesde distanciay demáximaprobabilidadsugierenunaseparaciónde
la ramaconducenteal esturiónanteriora la separaciónde condrictiosy
osteictios. Curiosamenteel esturión, morfológicamente,recuerdaa los
condrictios,presentaun esqueletosecundariamentecartilaginoso,escamas
placoideasy cola heterocercay, sin embargo,estáclaramenteclasificado
como un osteictio(Storery col., 1982),por lo que, enprincipio, parecemás
correctala topologíaobtenidamedianteel análisisdemáximaparsimonia.
Conla salvedaddelesturión,el restode osteictiosanalizadossonteleósteos,
y forman un grupo monofilético claramentediferenciadoen todas las
topologíasobtenidas,estandolos ciprínidos (L. roseipinnis,0. carpio y C.
lacustre) perfectamenteseparadosde la truchaarco iris. Dentro de los
condrictios,en todaslas topologíasobtenidas,el tiburón gris (Carcharinus
plumbeus)estámásrelacionadocon el pez martillo (Sphyrnatiburo) que
con el tiburón tigre (Galeocerdocuvier). Este resultadoes notable, si
tenemosen cuentaqueel tiburóngris y el tiburóntigre estánclasificados
dentro de unamismafamilia (Carcharhinidae),mientrasel pez martillo
perteneceaotra familia (Sphyrnidae).Finalmente,es importanteresaltar quelos análisisfilogenéticos
realizadosvienendeterminadospor la escasezde secuenciasque existende
los genes 12S y citocromo b entre los vertebradosinferiores. Las
discrepanciasexistentesentrelos árbolesobtenidospor métodosfenéticos
y métodoscladísticosson, en granparte debidas,a estaescasezdedatos
moleculares.Por idénticasrazones,los valoresdeconfianzaestadísticaque
se obtienenparaalgunosnodosno son significativos(< 50%) -
CONCLUSIONES¡
Conclusiones!128
Del análisisde la secuencianucleotídicay de los productosde la
transcripcióndel genomarnitocondrialde truchaarco iris (Oncorhynchus
mykiss)podemosconcluir que:
1. El genoma mitocondrial de trucha arco iris (Oncorhynchusmykiss)
estáconstituidopor 16660 Pb y codifica para 13 proteínas,2 rRNM y 22
tRNAs presentandola característicaorganización de la mayoría de
vertebrados,en la quelos genesde tRNAs se intercalanentre los genes
codificantesdeproteínasy derRNAs.
2. En el mtDNA de trucha arco iris, la región de control presentalos
mismoselementosimplicadosen la replicaciónde la cadenapesada(CSBs,
TASs) descritosen otros vertebrados.Porel contrario,aunqueel origende
replicacióndela cadenaligera estáformado por unaestructurasecundaria
tallo-bucleidénticaala encontradaenotros mtDNAs, se caracterizapor la
posesiónenel bucle,deunasecuenciarica encitosinas.De esteresultadose
deducequela RNA primasaencargadade sintetizarel cebadorparael inicio
de la replicación, debe reconocerun molde de polipirimidinas y no de
politiminas, comosehabíapropuestoanteriormente.
3. El tRNA Ser(AGY) dela truchaarcoiris, adiferenciadelrestodeespecies,
presentauna estructurasecundariaen hoja de trébol, estandoel brazo
DHU formado por un tallo con diez nucleótidosapareadosy un bucle con
tresnucleótidos.Por el contrario, el tallo delbrazoanticodónestareducidoa
seisnucleótidos.
4. Todoslos genescodificantesdeproteínasdel mtDNA detruchaarco iris
comienzanconel codónATG conla excepcióndelgenCOl quecomienzacon
el codón GTG. Por el contrario, los codones de terminación son
característicosdeestaespecie,ya queel patrónencontradoesdiferenteal
descritoenotros vertebrados,inclusoenpeces.Enun total de seisgeneslos
codonesdeterminaciónsonincompletos.Porotra parte,los codonesAGG y
AGA rio existendentrode los genesni al final deellos.
Conclusiones/129
5. Del alineamientoy comparaciónde las secuenciasaminoacídicasde las
proteínascodificadaspor el genomaniitocondrialde truchaarcoiris consus
homólogasde otros vertebrados,se deducequeaquellassubunidadesque
presentanactividad catalítica (citocromo oxidasa)están notáblemente
conservadasmientras que aquellascon función reguladora(ATPasay
NADH deshidrogenasa)sonmásvariables.
6. La identificaciónde los tránscritosde la mitocondriade truchaarcoiris
revela que el modelo de transcripciónsugeridopara las mitocondrias
humanases completamenteválido en la trucha arco iris, con ciertas
diferenciasdebidasadistintaseficienciasen el procesadode los transcritos
primarios.Así, sehapodidoidentificar un supuestoprecursorde los mRNAs
14 y 15. Por otra parte, seha detectadopor primeravez en preparaciones
in vivo de mitocondriaun transcritodel genND6.
7. El análisisfilogenéticorealizadoapartir de los genesquecodificanparael
12S rRNA y el citocromob de la truchaarco iris confirmala utilidad deestos genes mitocondrialesen el establecimientoderelacionesevolutivas
entre diferentesespecies,situandoa la trucha arco iris dentro de los
teleósteoscomo un grupo monofilético claramentediferenciadode los
ciprínidos-
AFENDJCR$
APENDICE 1
LA TRUCHA ARCO mis
La truchaarco iris (Oncorhynchusmykiss)es un teleósteode lafamilia Salmonidaeoriundodela costa pacíficadeAméricadel Norte.Su
distribución geográficaactual abarca tambiénEuropa, dondeha sidointroducidapor el hombre. Al igual quela truchacomún, esmuy sensiblea
la polución, pero soporta temperaturasmás altas y aguasmenos
oxigenadas.Se alimentade insectosacuáticos,zooplancton,moluscosy
pequeñospeces.A nivel morfológico,se caracterizapor la posesióndeunabandacentralrosadaquecomienzaen la cabezay terminaen la basedela
cola. La cabeza, el dorso, los flancos y la aleta dorsal están
abundantementemoteadasdenegro.El dimorfismosexualsemanifiestaen
la coloraciónmáspronunciadade los machosquepresentantambiénuna
mandíbulainferior ganchuda.Alcanzala madurezsexualhacia los 2 ó 3
años.En Europael desovetienelugar denoviembrea mayo. Cadahembra
ponede 1500 a2000huevos/kg.
La truchaarcoiris presentagrandesaptitudesparala críaintensivaen estanqueso viveros artificialesya que se adaptacon facilidad a la
cautividad, es resistente a las enfermedadesy tolera los piensos
comerciales. Sin embargo, rara vez forma poblaciones capacesde
autorreproducirsey es precisoprocederconstantementea operacionesde
fecundaciónartificial.
y
D¡strhbución onínínal en ojo~ aC[Ua] (enizul> Cje Ja trC±c¡ijarce
r.<.~,,.,~4¾.:>t;
APENDICE II
PLACODERMOS PECES CON MANDIBULAS ARCAICOS)
AGNATOS <PECES SIN MANDíBULAS
)
Evolución de los pece..Empezó en el Cámbrico con la aparición de las especiesno
mandibuladas(los agnatos). En el Silúrico, surgieronlas mandíbulasa partir de un par deorificios branquialesy las aletasse hicieron pares(Placodermos);seprodujo la separaciónde losantepasados de los condi-ictioe y los osteictios. En el Devónico, una linea importantede peces,los
provistos de aletascon radios, constituyeronel ancestrode la mayona de especiesactuales
(actinopterigias). La otra línea importante, constituida por peces de aletas lobuladas
(sarcopterigios) no tuvierontanto grito, aunque con el tiempo dieronlugara los primerosanfibios.
Modificado de Valentine, 1978.
APENDICE III
N.~mhus9mú¡t Nomenclaturabinomial
Truchaarcoiris
Carpa
Pollo
Zarigúeyaamericana
Vaca
Rorcualcomún
Ballenaazul
Focacomún
Focagris
Rata
Ratón
Hombre
Erizo demar
Erizo demar
Moscadela fruta
Abeja
Lombriz intestinal
Oncorhynchusmykiss
Cyprinuscarpio
Crossostomalacustre
Xenopuslaevís
Gallusgallus
Didelphisvirginiana
Rostaurus
Ralaenopteraphysalus
Ralaenopteramusculus
Phocavitulina
Halichoerusgrypus
Rattusnoruegicus
Musdlomesticus
Hornosapiens
Paracentrotusliv idus
Strongylocentrotuspurpuratus
Drosophulayakuba
Anemiafranciscana
Apis mellifera
Caenorhabditiselegans
ÁscarisSuum
Númerosde accesodel GenBank.Seindicanúnicamentelasespeciescuyo
genomamitocondrialhasido secuenciadoensutotalidad.
L29771
X6 1010
M91245
M10217
X52392
Z29573
V00654
X61145
X72204
X63726
X72004
X14848
JO1420
JO 1415
J04815
X12631
XO3240
X69067
L06178
X54252
X52453
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AGRADECIMIENTOS
En las páginas precedentes se resumen el esfuerzo y la ilusión de los últimos
cuatro años. Siya puseentusiasmode mi parte, la dedicaciónfueposibleengran
parte gracias a la concesiónde una beca de investigaciónpor parte de la
UniversidadComplutense.A continuación,quierodestacaraquellaspersonascuyo
trabajoha sido imprescindiblepara queestatesishayafinalizado con éxito.
Misdirectoresdetesis,AmandoGarridoPertierra yJoséManuelBautistame
dieron la oportunidad de iniciarme en la investigacióncientífica.Durante el
desarrollo de esta tesis he podido comprobarcomo su esfuerzodía a día
transformabaunasinstalacionesprácticamentevacías> en el actual laboratoriode
bioquímicay biología molecularquepermiteya, desarrollar unainvestigacióncada
vez más avanzaday competente.Ademásde los medios,debo estarlesagradecido
especialmentepor la libertady confianzaqueme handadoentodomomento.
La ayuda de los doctoresJulio Montoyay AciscloPérezMurtos ha sido
también muy importante en este trabajo. Su preocupación continua y gran
experienciajunto con su amabilidadhicieron que mi estanciaen Zaragozafuera
muyfructíferay entrañable.El poderobservarlas bandasde RNAmitocondrial de
la trucha arco iris en un gel teñido con bromuro de etidio es uno de los resultados de
estatesisquemásmesatisfacepersonalmente.
1 alsowish to acknowledgeDr. Phil Masonfor myproductiveappointmentat
the HammersmithHospital. He assumedthe hard taskof introducing me in the
difficult world of cloning and hybridisation techniques.Apart from molecular
biology, healsodemonstratedto beanexpertchap in ales,football ami blues.
María IsabelGarcía Saez,como responsablede la unidadde secuenciación
automática de la UniversidadComplutense,ha participado en el otro gran
resultadode estatesis, la secuenciacióncompletadelDNA mitocondríalde la trucha
arco iris. Su labor ha sidoeficazy competente,suamabilidaduna suene.
Por último, agradezcoa todaslasdemáspersonasquede un modou otro me
hanayudadoen la realizaciónde estetrabajo.