efeitos biolÓgicos do composto organoselenado …
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EFEITOS BIOLÓGICOS DO COMPOSTO ORGANOSELENADO
EBSELEN EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS
SIMONE TERESINHA MIORELLI
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Diagnóstico Genético e Molecular da Universidade Luterana do Brasil,
para a obtenção do grau de Mestre em Diagnóstico Genético e Molecular
Orientadora: Dra. Jenifer Saffi
Canoas
2006
UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM DIAGNÓSTICO
GENÉTICO E MOLECULAR
2
Este trabalho foi realizado nas instalações do Laboratório de Genética Toxicológica da
Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), bem como no Laboratório de Reparação de
DNA em Eucariontes do Departamento de Biofísica da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul (UFRGS).
3
Aos meus pais Adão e Odete, que
tanto rezaram pela minha proteção, dedico este trabalho.
4
“ A vida não é um corredor reto e tranqüilo que
nós percorremos livres e sem empecilhos,
mas um labirinto de passagens,
pelas quais nós devemos procurar nosso
caminho, perdidos e confusos, de vez em quando
presos em um beco sem saída.
Porém, se tivermos fé,
uma porta sempre será aberta para nós,
não talvez aquela sobre a qual
nós mesmos nunca pensamos,
mas aquela que definitivamente
se revelará boa para nós.”
A.J. Cronin
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha orientadora, professora e amiga Jenifer Saffi, pelo apoio,
dedicação e exemplo de comprometimento e competência em tudo o que faz. Pelo
incentivo nas diversas etapas do trabalho e por todo conhecimento científico que dividiu
comigo para que eu aprendesse um pouquinho.
A todo o pessoal do Laboratório Giovanni, Renato, Dinara, Diego, Nicolas, Rafael,
Cláudio, Izabel, Miriana, Mateus, Albanin, Bacana, que sempre me socorreram nos
momentos de dúvida em relação aos protocolos e testes ou me indicavam onde encontrar o
material quando eu estava perdida.
Aos bolsistas Manoela, Emerson e Larissa, pelo auxílio na realização de parte deste
trabalho, pela amizade, pela dedicação e empenho em também querer aprender.
Um especial agradecimento a minha irmã Sandra, que se não fosse por ela, eu não
teria feito este mestrado, pois foi ela quem me avisou das inscrições nos últimos dias.
Além disso, me deu casa e comida durante os dias de aula e trabalho no laboratório, me
incentivou em todos os momentos e me deu carinho e atenção quando eu estava cansada,
sempre cuidadosa comigo, preocupada com o trânsito, com a minha alimentação, enfim...
A Andréia, que apesar de não sermos da mesma família, também considero uma irmã,
pelo seu apoio, incentivo, preocupação com o meu bem estar, sempre me deixando muito a
vontade. Pelas nossas conversas, às vezes profundas ou só de brincadeira.
Aos meus amigos, que souberam entender minha falta, que me apoiaram, me
incentivaram muito e sempre me deram coragem para enfrentar as dificuldades.
Aos meus colegas, em especial: Maristela, Cristiane e Janice pelos nossos papos e
troca de idéias durante os almoços, para espairecer e aliviar a cabeça.
6
Aos professores, por despertarem mais ainda em mim o interesse pela área da saúde,
genética, conhecimento científico, e pela certeza de que os avanços tecnológicos nesta área
serão sempre benéficos e uma esperança para todos nós.
A toda minha família, pai, mãe, irmãs, sobrinhos, cunhado,... por estarem sempre
perto de mim e por compartilharmos juntos todos os momentos de nossa vida.
E a Deus, que com certeza tem um dedinho dele nisso tudo...
7
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 09
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 10
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................................... 11
RESUMO ..................................................................................................................... 13
ABSTRACT ................................................................................................................ 14
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
1.1 Espécies Reativas de Oxigênio ....................................................................... 15
1.1.1 Ânion Superóxido (O2•-) ......................................................................... 17
1.1.2 Peróxido de Hidrogênio (H2O2) ............................................................. 17
1.1.3 Radical Hidroxil (HO•) ........................................................................... 18
1.1.4 Radical Peroxil (ROO•) .......................................................................... 19
1.1.5 Oxigênio Singlete (1O2) ........................................................................... 19
1.2 Principais Defesas Antioxidantes ................................................................... 19
1.2.1 Superóxido Dismutase (Sod) ................................................................ 20
1.2.2 Catalase (CAT) ....................................................................................... 21
1.2.3 Glutationa Peroxidase (GPx) ................................................................ 22
1.2.4 Glutationa (GSH) .................................................................................... 23
1.3 Compostos de selênio: da Química à função Biológica ............................... 24
1.3.1 Composto Organoselenado Ebselen ...................................................... 27
1.4 Células Eucarióticas como modelos de estudo ............................................. 31
1.4.1 Levedura Saccharomyces cerevisiae ...................................................... 31
1.4.2 Células de mamíferos ............................................................................. 37
1.5 Ensaio Cometa ................................................................................................. 38
2 OBJETIVOS ............................................................................................................ 40
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................. 40
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 40
3 CAPÍTULO I
Evaluation of Genotoxicity, Antigenotoxicity and Antioxidant Effects of
Ebselen in Mammalian and Yeast Cells ……………………………………….
41
4 DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................. 65
8
5 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 70
6 PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 71
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 72
8 APÊNDICE .............................................................................................................. 81
9
LISTA DE FIGURAS
1 INTRODUÇÃO
Figura 1 Formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) através da redução do O2
Figura 2 Representação simplificada dos sistemas oxidante e antioxidante nas células
Figura 3 Estrutura química do ebselen
Figura 4 Fases de crescimento de uma levedura selvagem quando iniciada em meio
completo
Figura 5 Micrografia eletrônica da levedura S. cerevisiae
Figura 6 Ciclo celular de S. cerevisiae
Figura 7 Tipos de danos celulares no Ensaio Cometa
3 CAPÍTULO I
Figure 1 DNA damage measured by comet assay in V79 and Jurkat cells exposed to
ebselen, with subsequent treatment with oxidant agents
Figure 2 Distribution of damage classes in V79 cells treated with different doses of
ebselen in the absence and presence of oxidant agents
Figure 3 Distribution of damage classes in Jurkat cells treated with different doses of
ebselen in the absence and presence of oxidant agents
8 APÊNDICE
Figura 1 Efeitos do ebselen no crescimento de linhagens de S. cerevisiae na ausência
e presença de agentes oxidantes.
10
LISTA DE TABELAS
3 CAPÍTULO I
Table 1 S. cerevisiae strains used in this study
Table 2 Modulatory effect of ebselen in V79 and Jurkat cells, in absence or presence
of oxidant agents
Table 3 Induction of point mutation (his1-7), ochre allele (lys1-1) and frameshift
(hom3-10) mutations in haploid XV185-14c strain of S. cerevisiae after
ebselen treatment during 2h in non-growth conditions and stationary phase
Table 4 Growth inhibition assay (central disc) in wild type and superoxide
dismutase mutants treated with ebselen in the absence and presence of
oxidant agents
8 APÊNDICE
Tabela 1 Efeito no crescimento de linhagens de S. cerevisiae, tratadas com diferentes
concentrações de ebselen na ausência e presença de agentes oxidantes, pelo
teste em gotas
11
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AP Sítio apurínico ou apirimidínico
CAT Catalase
DNA Ácido desoxirribonucléico
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
GLR Glutationa redutase
GPx Glutationa peroxidase
GPx1 Glutationa peroxidase - Enzima citosólica
GPx2 Glutationa peroxidase - Enzima gastrointestinal
GPx3 Glutationa peroxidase - Enzima plasmática
GPx4 Glutationa peroxidase - Enzima citosólica
GSH Glutationa reduzida
GSH1 Gene para enzima gama-glutamil-cisteína sintetase
GSH2 Gene para enzima glutationa sintetase
gsh1� Linhagem mutante do gene GSH1
GSSG Glutationa oxidada
G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
HO• Radical hidroxil
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HOCl Ácido hipocloroso
Jurkat Linhagem humana de células de linfócitos T
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NO• Óxido nítrico
O2•- Ânion superóxido
1O2 Oxigênio singlete
O3 Ozônio
ONOO- Peroxinitrito
rhoº Mutação gerando leveduras sem mitocôndria
RO• Radical alcoxil
ROO• Radical peroxil
ROOH Peróxido orgânico
12
RPE Ressonância Paramagnética de Elétrons
SCE Troca de cromátides irmãs
SCGE “Single Cell Gel Eletrophoresis Assay”
Se0 Selênio elementar
Se+4 Selenito
Se+6 Selenato
Se-2 Seleneto
Sod Superóxido dismutase
SOD1 Gene para enzima superóxido dismutase cobre zinco
SOD2 Gene para enzima superóxido dismutase manganês
sod1� Linhagem mutante do gene SOD1
sod2� Linhagem mutante do gene SOD2
sod1� sod2� Linhagem duplo-mutante dos genes SOD1 e SOD2
Sod-CuZn Superóxido dismutase cobre zinco (citosólica)
Sod-Mn Superóxido dismutase manganês (mitocondrial)
S9 Fração pós-mitocondrial hepática
t-BOOH Hidroperóxido de terc-butila
V79 Fibroblasto de pulmão de hamster Chinês
Yap1 Fator de transcrição
YPD Meio completo para crescimento de levedura
13
RESUMO
Compostos orgânicos contendo selênio são fontes apreciáveis de moléculas
antioxidantes, anticarcinogênicas, antiinflamatórias e neuroprotetoras. Assim sendo, uma
gama muito grande de fármacos sintetizados a partir de compostos orgânicos de selênio,
têm sido testados em diversos modelos in vitro e in vivo. Nas últimas décadas, estudos de
síntese têm sido direcionados para o desenvolvimento de compostos orgânicos de selênio
mais estáveis que possam ser usados como antioxidantes, exercendo ação semelhante a
enzimas. O composto organoselenado ebselen (2-fenil-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one),
sintetizado em 1984, foi intensamente estudado na última década. É um composto não-
tóxico, dotado de potente atividade mimética da glutationa peroxidase (GPx), pois reduz
hidroperóxidos orgânicos protegendo lipoproteínas e membranas, sendo portanto, um
excelente antioxidante em diversos modelos biológicos. O objetivo deste trabalho foi
verificar a interferência do ebselen no estado redox celular através de ensaios in vivo,
utilizando linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae, proficientes e deficientes em
defesas antioxidantes e ampliar o conhecimento das ações biológicas do ebselen sobre a
integridade da informação genômica, utilizando ensaios biológicos com células
eucarióticas. Avaliou-se a genotoxicidade e a antigenotoxicidade induzidas por este
composto, utilizando-se o ensaio cometa alcalino em células V79 e células Jurkat. Nossos
resultados demonstraram que o ebselen protege essas linhagens contra os danos ao DNA
induzidos pelos hidroperóxidos inorgânico (H2O2) e orgânico (t-BOOH). A provável ação
protetora do ebselen deve-se ao fato deste composto organoselenado diminuir a
concentração dos agentes oxidantes, reduzindo assim a formação de radicais livres e,
consequentemente, de danos oxidativos ao DNA. Em S. cerevisiae, ele não induz
citotoxicidade nem mutagenicidade. Além disso, protege contra a inibição de crescimento
induzida por exposição a H2O2, apenas na linhagem mutante sod2�. A mesma linhagem,
assim como a selvagem, tratada com doses elevadas de ebselen, e exposta ao paraquat,
apresenta aumento da inibição de crescimento de forma significativa, sugerindo efeito pró-
oxidante. Este resultado demonstra que o ebselen não apresenta atividade antioxidante
contra radicais superóxido e confirma a especifidade de proteção in vivo do ebselen contra
hidroperóxidos, caracterizando sua atividade mimética de glutationa peroxidase.
14
ABSTRACT
Organic compounds containing selenium are considerable sources for anti-oxidant,
anti-carcinogenic, anti-inflammatory and neuroprotective molecules. Therefore, a great
variety of synthesized drugs from seleno-organic compounds have been widely tested in
vitro and in vivo. During the last few decades, synthesis studies have been carried out
aiming the development of more stable seleno-organic compounds, which could be used as
antioxidants, with action similar to enzymes. Ebselen (2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-
3(2H)-one), synthesized in 1984, has gone through intensive studies over the last decade. It
is a non-toxic compound, presenting potential mimetic activity similar to glutathione
peroxidase enzyme; it can reduce organic hydroperoxides, protecting lipoproteins and
membranes, being therefore, an excellent antioxidant in several biological models. The
purpose of this study was to verify ebselen interference on the cellular redox status by in
vivo tests, using Saccharomyces cerevisiae strains proficient and deficient in antioxidant
defenses, and, to enhance the knowledge on ebselen biological actions on the integrity of
genomic information, using biological assays with eukaryotic cells. Genotoxicity and
antigenotoxicity induced by that compound were also tested, using the alkaline comet
assay on V79 and Jurkat cell lines. Our results demonstrated that ebselen protects these cell
lines against DNA damage-induced by organic (H2O2) and inorganic (t-BOOH)
hidroperoxides. One may suggest that ebselen has this protective effect by reducing the
amounts of the oxidative agents, decreasing the free radical generation and therefore the
DNA oxidative damages. In S. cerevisiae, it does not induce neither cytotoxicity nor
mutagenicity. Moreover, it protects against growth inhibition induced by H2O2 exposure in
sod2 mutant only. The same strain, as well as the wild type, treated with high ebselen
doses and exposed to paraquat, presents significant increase of growth inhibition,
suggesting a pro-oxidant action. This result demonstrates that ebselen does not possess
antioxidant activity against superoxide radical and confirms its specificity of in vivo
protection against hydroperoxides, characterizing its gluthatione peroxidase-like activity.
15
1 INTRODUÇÃO
Todos os organismos vivos aeróbios, como o homem, utilizam o oxigênio como
forma de produzir energia. A redução do oxigênio (O2) à água (H2O) fornece a energia que
permite a impressionante complexidade dos organismos superiores (Figura 1). Entretanto,
a redução do O2 gera subprodutos, conhecidos como radicais livres ou espécies reativas de
oxigênio (ERO), que são moléculas com um elétron desemparelhado no último orbital
(Scandalios, 2002). Esta situação confere ao radical uma alta reatividade química,
especialmente como agente oxidante, pela tendência de adquirir o segundo elétron para
estabilizar o seu orbital de valência (Picada et al., 2003). Uma molécula pode tornar-se um
radical livre, tanto ganhando como perdendo um elétron em uma reação química, bem
como por fissão homogênea de uma ligação covalente. Portanto, um radical pode doar seu
elétron sem par para outra molécula (radical redutor) ou pode receber um elétron de outra
molécula para que forme um par (radical oxidante) (revisado por Halliwell e Gutteridge,
2000). As ERO podem ocasionar danos a proteínas, lipídios e ao DNA. Cerca de 95 a 98%
do O2 consumido durante a respiração celular é para a produção de energia, o restante (2 a
5% do O2 metabolizado) produz ERO (Scandalios, 2002).
e- e- e- e-
O2 O2•- H2O2 HO• + HO- 2H2O
2H+ 2 H+ O2
•- = superóxido H2O2 = peróxido de hidrogênio HO• = radical hidroxil Figura 1. Formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) através da redução do O2 (adaptado de Nordberg e Arnér, 2001).
1.1 Espécies Reativas de Oxigênio
Durante o metabolismo basal das células aeróbicas normais, existe uma produção
constante de ERO acompanhada pela contínua inativação destas formas reativas pelos
sistemas antioxidantes, que conseguem manter as concentrações de ERO em níveis
16
compatíveis com as funções celulares. A produção excessiva de ERO ou a diminuição das
defesas antioxidantes provoca um desequilíbrio no estado redox celular conhecido como
estresse oxidativo que pode causar danos a todos os tipos de biomoléculas (Picada et al.,
2003; Satoh et al., 2004). Vários estudos demonstram que as ERO estão associadas com
mecanismos de instalação de muitas doenças, como Doença de Parkinson e de Alzheimer,
isquemias, esclerose múltipla, distrofia muscular, cataratas e retinopatias, enfisema
pulmonar, cirrose hepática e vários tipos de câncer (Halliwell e Gutteridge, 2000; Picada et
al., 2003). O acúmulo de ERO, principalmente em neurônios, resulta em peroxidação
lipídica, oxidação de proteínas, dano ao DNA, e finalmente morte celular (Satoh et al.,
2004).
Em levedura, como nos eucariotos superiores, ERO são produzidas como
subprodutos normais do metabolismo celular (Costa e Ferreira, 2001). As ERO são
conhecidas mediadoras de cascatas sinalizadoras intracelulares, porém, produzidas em
excesso podem levar a estresse oxidativo, perda da função e até apoptose ou necrose
(Nordberg e Arnér, 2001).
Benefícios fisiológicos celulares vitais de ERO são demonstrados em diferentes áreas,
incluindo sinalização intracelular e regulação redox. O peróxido de hidrogênio (H2O2) e o
ânion superóxido (O2•-) foram identificados como moléculas sinalizadoras, reguladoras de
atividade de fatores de transcrição e determinantes de expressão gênica. Várias citocinas,
fatores de crescimento, hormônios e neurotransmissores usam ERO como mensageiro
secundário na transdução de sinal intracelular (Costa e Ferreira, 2001).
As ERO incluem inúmeras moléculas quimicamente reativas derivadas de O2 e
abrangem espécies radicalares, como: o radical hidroxil (HO•), o ânion superóxido (O2•-), o
óxido nítrico (NO•), o alcoxil (RO•), peroxil (ROO•) e o peroxinitrito (ONOO-); e espécies
não-radicalares, como: o peróxido de hidrogênio (H2O2), o ácido hipocloroso (HOCl), o
oxigênio singlete (1O2) e o ozônio (O3) (Picada et al., 2003). Estas podem rapidamente
reagir com a maioria das biomoléculas, iniciando uma reação em cadeia de formação de
radicais livres. Para interromper esta cadeia, o recém-formado radical deve reagir com
outro radical, eliminando assim o elétron desemparelhado, ou reagir com um seqüestrador
17
de radicais livres ou um antioxidante primário (Nordberg e Arnér, 2001). A reatividade
química dos radicais livres é bastante variável e pode ser verificada pelos tempos de meia-
vida muito pequenos. Quanto menor o tempo de meia-vida maior a reatividade.
1.1.1 Ânion Superóxido (O2•-)
O O2•- é o radical mais comum e abundante na célula, criado a partir do O2 pela
adição de um elétron e, apesar de ser um radical, não é altamente reativo (Boveris, 1983).
A formação de O2•- acontece espontaneamente, especialmente em ambientes aeróbios ricos
em elétrons, como na mitocôndria ou em células fagocitárias (como neutrófilos, monócitos,
macrófagos e eosinófilos, que geram grandes quantidades de superóxido para matar
organismos estranhos) (Anderson, 1996; Nordberg e Arnér, 2001). O O2•- também é
produzido endogenamente por flavoenzimas e xantina oxidase, ativadas na isquemia por
reperfusão e por lipoxigenases e cicloxigenases. Duas moléculas de superóxido dismutam
para H2O2 e O2, e esta reação poderá ser acelerada pela enzima superóxido dismutase (Sod)
(Nordberg e Arnér, 2001).
O O2•- é mais seletivo em suas reações químicas que o HO•, que exerce toxicidade
devido a danos oxidativos generalizados (Halliwell e Gutterigde, 2000). Um mecanismo
proposto de toxicidade do O2•-, é baseado na observação de que o superóxido pode
especificamente oxidar o sítio [4Fe-4S] de certas enzimas, causando a liberação de ferro do
sítio e a inativação da enzima. Esse processo levaria a um dano oxidativo adicional de
outros componentes celulares, uma vez que o ferro livre pode promover, via reação de
Fenton, a formação do HO• (Srinivasan et al., 2000).
1.1.2 Peróxido de Hidrogênio (H2O2)
O H2O2 não é um radical, porém é um intermediário reativo do O2 que se torna
perigoso pela habilidade de penetrar membranas biológicas. Ele participa como subproduto
na formação dos radicais mais reativos como ácido hipocloroso (HOCl) (reação 1), ou
ainda de forma mais importante, na formação de HO• via oxidação com metais de transição
(reação 2) (Nordberg e Arnér, 2001). Por não reagir imediatamente, o H2O2 pode migrar
18
pela célula e atingir alvos distantes do local de sua formação (Boveris, 1998). Além de ser
formado na reação de dismutação do superóxido e por fagócitos, também é um subproduto
da assimilação oxidativa de várias fontes de carbono e nitrogênio por peroxissomos e
glioxissomos. O H2O2 é formado principalmente na matriz mitocondrial durante o processo
de redução do O2 (Fridovich, 1998).
H+ + Cl- + H2O2 HOCl + H2O (Reação 1)
H2O2 + Cu+/Fe2+ HO• + HO- + Cu2+/Fe3+ (Reação 2)
Uma vez produzido pelos mecanismos mencionados, o H2O2 é removido pelo menos
por três sistemas antioxidantes enzimáticos, como catalases, glutationa peroxidase e
peroxiredoxinas (Nordberg e Arnér, 2001).
1.1.3 Radical Hidroxil (HO•)
Devido a sua alta reatividade com biomoléculas, o HO• é provavelmente o radical
capaz de causar mais danos aos sistemas biológicos do que qualquer outra ERO. A
capacidade deste radical em lesar as células é superior às demais ERO, já que o organismo
não dispõe de um sistema enzimático de defesa contra HO• (Halliwell e Gutteridge, 2000).
O HO• reage com as quatro bases do DNA, produzindo principalmente bases modificadas,
além de causar quebras de cadeias do DNA e sítios AP (Cadet et al., 1999). Na presença de
íons metálicos (Fe2+ e Cu+), o H2O2 pode originar o HO• através da reação de Fenton
(reação 2). O O2•- passa a ter função importante, reciclando os íons metálicos da reação de
Fenton (reação 3). A soma das duas reações é denominada Reação de Harber-Weiss
(Nordberg e Arnér, 2001).
Cu2+/Fe3+ + O2•- Cu+/Fe2+ + O2 (Reação 3)
O radical hidroxil tem uma meia-vida curtíssima e sua difusão é limitada pela
velocidade de reação. Por isso, a melhor defesa que a célula tem contra este radical é
preventiva, evitar que seja gerado. Para isso a célula mantém um rígido controle da
homeostase metálica. O transporte de metais é altamente regulado e os íons de metais de
19
transição são mantidos em sua valência mais alta ou estão de alguma forma complexados à
proteínas e enzimas onde são armazenados ou fazem parte funcional das mesmas. A
compartimentalização de compostos metálicos nos vacúolos e a ferritina podem ser
consideradas parte das defesas antioxidantes (Fridovich, 1998; Halliwell e Gutteridge,
2000).
1.1.4 Radical Peroxil (ROO•)
O ROO• é um peróxido orgânico e pode reagir, da mesma forma que o HO•, com
moléculas biológicas como o DNA e proteínas. Ele pode ser formado pelo ataque do HO• a
compostos orgânicos ou por decomposição de peróxidos orgânicos (ROOH). A reatividade
do peroxil está relacionada com a parte orgânica do radical, sendo os radicais aromáticos
menos reativos pela possibilidade de rearranjo dos elétrons (Halliwell e Gutteridge, 2000).
1.1.5 Oxigênio Singlete (1O2)
O 1O2 é outro derivado reativo do O2 capaz de modificar o DNA diretamente
(Cadenas, 1989), cuja meia-vida em tecidos é de menos de 0,5 micro segundos. Pode ser
gerado pelos fagócitos, por indução luminosa, por reações catalizadas por peroxidases e
outras. No DNA o 1O2 abstrai elétrons ou pode causar ciclo-adição aos carbonos de ligação
dupla do anel imidazol. O alvo preferencial parece ser a guanina e o produto final mais
freqüente é a 8-hidroxiguanina. Raramente, pode gerar sítios AP, álcali-lábeis e quebras de
cadeia simples em posições adjacentes a guaninas (Cadet et al., 1999).
1.2 Principais Defesas Antioxidantes
Para proteger o organismo do ataque de ERO, existe uma série de sistemas de
defesas antioxidantes. Segundo Halliwell e Gutteridge (2000), estratégias incluem três
níveis de proteção: (i) prevenção (evitar formação de ERO); (ii) interceptação das espécies
reativas (neutralização das ERO geradas); e (iii) reparação dos danos (ocasionados por
ERO). A interceptação das espécies reativas ocorreria através de substâncias enzimáticas
ou não enzimáticas, como vitaminas, que desintoxicam ERO ou apresentam a capacidade
20
de seqüestrar radicais livres. O reparo aconteceria através de enzimas de reparo, as quais
atuam em danos que a ERO pode provocar ao DNA ou a proteínas, tentando repará-las.
Os antioxidantes não-enzimáticos são moléculas que podem interceptar as ERO,
atuando num processo de desativação do poder lesivo que estas provocam nas
biomoléculas. Há três mecanismos básicos da atividade antioxidante não-enzimática: (i)
seqüestradora; (ii) estabilizadora e (iii) quelante de metais (Halliwell e Gutteridge, 2000).
Os antioxidantes do tipo “seqüestradores” de radicais ou de quebra de cadeia reagem
preferencialmente com ERO antes que elas possam lesar as biomoléculas. A retirada de
elétrons pelos radicais normalmente origina outro radical que, teoricamente, poderá causar
reações em cadeia. Estes antioxidantes são oxidados a produtos que apresentam uma
reatividade insuficiente para propagar a reação em cadeia estabelecida pelos radicais, que
desta forma é interrompida (Boveris, 1998). Os carotenóides e licopenos têm uma
atividade “estabilizadora” principalmente do 1O2, que transfere sua energia de excitação à
molécula antioxidante. O urato, além de ser um poderoso seqüestrador, apresenta atividade
“quelante” de ferro e cobre (Halliwell e Gutteridge, 2000).
1.2.1 Superóxido Dismutase (Sod)
A Sod foi a primeira enzima antioxidante a ser descoberta (revisado por Halliwell e
Gutteridge, 2000) em células eucarióticas aeróbias. São metalo-enzimas abundantes que
agem sobre o radical O2•-, dismutando-o a H2O2 (reação 4), que é menos reativo e pode ser
degradado por outras duas enzimas, como catalase e glutationa peroxidase.
O2•- + O2
•- + 2H+ H2O2 + O2 (Reação 4)
A metabolização do O2•- a H2O2 é realizada por duas isoenzimas, uma citosólica
(Sod-CuZn) e outra mitocondrial (Sod-Mn) (Nordberg e Arnér, 2001). A Sod-CuZn é
abundante no citosol de células eucarióticas, e contém cobre e zinco no seu sítio ativo. Em
células animais, ela também pode aparecer nos lisossomos, nos núcleos, bem como no
espaço entre as membranas mitocondriais externa e interna. A Sod-Mn contém manganês
em seu sítio ativo e pode ser encontrada em bactérias, plantas e animais. Foi originalmente
Sod
21
isolada na mitocôndria de fígado de galinha (Longo et al., 1999). Na mitocôndria, o
superóxido é formado relativamente em altas concentrações, devido à dispersão de elétrons
da cadeia respiratória, sendo a Sod-Mn essencial, desde que foram encontradas doenças
não herdadas, pesquisadas em ratos nocaute, onde há deficiência de Sod-Mn e estes
morreram logo ao nascer ou sofreram de neurodegenerações graves. Já a Sod-CuZn parece
ser menos importante, pois em animais transgênicos faltando esta enzima, estes são
capazes de se adaptar, tanto que demonstram um fenótipo normal. Porém, a doença
neurodegenerativa letal amiotrófica lateral, pode ser causada por uma mutação no gene da
Sod citosólica (Nordberg e Arnér, 2001).
1.2.2 Catalase (CAT)
A CAT é uma ferro-hemoenzima, que tem localização subcelular predominante no
peroxissomo, onde existem muitas moléculas geradoras de H2O2. Sua função é dismutar
especificamente o H2O2 em H2O e O2 (reação 5) (Fridovichh, 1998; Nordberg e Arnér,
2001) e ajuda a regular a geração de H2O2 pela ação de oxidases presentes nestas organelas
(Picada et al., 2003).
2H2O2 H2O + O2 (Reação 5)
São enzimas que possuem uma afinidade relativamente baixa para H2O2, porém tem
uma velocidade de reação muito alta. Por isso são defesas potentes para neutralizar
especialmente concentrações altas de peróxido, possivelmente como as que são formadas
por fagócitos ativos (Fridovich, 1998).
A ação destas enzimas envolve a oxidação divalente do heme a ferro (IV),
acompanhada da redução divalente do H2O2. Elas contêm nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) fortemente ligado, o qual pode prevenir a
acumulação da forma ferro (IV) da enzima, a qual é inativa (Nordberg e Arnér, 2001;
Picada et al., 2003). A CAT de mamíferos também pode agir como peroxidase, em relação
a pequenas moléculas como metanol, etanol, nitrito e formato. Desta forma, elas podem
CAT
22
usar o H2O2 para oxidar estes substratos, os quais são suficientemente pequenos para ter
acesso ao ferro do grupamento heme (Picada et al., 2003).
1.2.3 Glutationa Peroxidase (GPx)
Na mitocôndria de mamíferos, a GPx é a principal defesa contra o H2O2 (reação 6),
já que de maneira geral, estas organelas não possuem CAT, e peróxidos orgânicos (ROOH)
(reação 7). Ela é uma seleno-enzima, cuja ação é baseada na oxidação da glutationa
reduzida (GSH) ao dissulfeto correspondente glutationa oxidada (GSSG). (Picada et al.,
2003). Para sua atividade, a GPx necessita da presença de GSH.
H2O2 + 2GSH GSSG + 2H2O (Reação 6)
ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H2O (Reação 7)
Em mamíferos, há pelo menos quatro diferentes tipos de GPx, todas elas contendo
selenocisteína. GPx1 e GPx4, são ambas enzimas citosólicas abundantes na maioria dos
tecidos. GPx2 (gastrointestinal) e GPx3 (plasma) são principalmente expressas no trato
gastrointestinal e rins, respectivamente. Todas GPx podem catalizar a redução do H2O2
usando GSH como substrato (Nordberg e Arnér, 2001). As GPx não estão presentes,
normalmente, em bactérias ou plantas superiores, embora já tenham sido encontradas em
algumas algas e fungos (Picada et al., 2003). Além da redução de peróxidos, as GPx
também reduzem alquilhidroperóxidos a seus respectivos álcoois. Em associação com
outras enzimas, previnem a interação do O2•-, H2O2 e íons metálicos que levariam a
formação do altamente destrutivo HO• e, ainda, regeneram o ascorbato do desidroascorbato
(Sies, 1993; Picada et al., 2003).
GPx
GPx
23
1.2.4 Glutationa (GSH)
A GSH é um tripeptídeo (�-glutamil-cisteinil-glicina) que desempenha função
fundamental na proteção das células contra danos oxidativos causados por oxidantes,
atuando como seqüestradora de radicais; na homeostase tiólica; na manutenção do balanço
redox da célula e para defesa contra agentes eletrofílicos, como os xenobióticos (Meister,
1995). Faz parte dos sistemas antioxidantes não enzimáticos de mamíferos, que reduz H2O2
e outros hidroperóxidos, e é responsável por seqüestrar ERO e proteger biomembranas do
estresse oxidativo (Chang et al., 2003). Além disso, participa na regulação alostérica de
enzimas envolvidas com o transporte de aminoácidos. É utilizada por uma série de enzimas
como GPx, glutationa S-transferase e glutaredoxina. A GSH é sintetizada em dois passos,
por duas enzimas distintas: (i) pela enzima gama-glutamil-cisteína sintetase (codificada
pelo gene GSH1), que é considerada o ponto regulatório da produção da glutationa, e (ii)
pela enzima glutationa sintetase (codificada pelo gene GSH2) (Meister, 1995). O tiol da
cadeia lateral da cisteína é um dos grupamentos mais reativos encontrado nas células, em
pH fisiológico, e pode atuar como captador de ERO, além de funcionar como terminador
de reações em cadeia. A GSSG é regenerada pela glutationa redutase (GLR), com gasto de
NADPH, que por sua vez é regenerado pela glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD),
mantendo-se assim o nível celular de GSH (Meister, 1995).
A GSH encontra-se em baixos níveis em fluídos extracelulares, sugerindo que sua
maior contribuição seja intracelular (Halliwell e Gutteridge, 2000). Está presente em
animais, plantas e muitas bactérias aeróbicas (por exemplo Escherichia coli), em
concentrações celulares muitas vezes na ordem de milimolar, enquanto que é raramente
encontrada em bactérias anaeróbicas (Picada et al., 2003).
Os mecanismos de sistemas de defesa antioxidantes atuam cooperativamente, como
mostra na figura 2. A ausência de uma das defesas acarreta um desequilíbrio no estado
redox da célula, podendo levá-la a um aumento da sensibilidade a agentes oxidantes intra
ou extracelular (Gralla e Valentine, 1991).
24
Figura 2. Representação simplificada dos sistemas oxidante e antioxidante nas células (modificado de Nordberg e Arnér, 2001).
1.3 Compostos de selênio: da Química à função Biológica
O elemento selênio foi descoberto em 1818 pelo químico sueco Jöns Jacob Berzelius,
e seu nome foi dado em homenagem à Selena, deusa grega da lua. Embora a história da
toxicidade do selênio seja extensa, o papel essencial deste elemento para a saúde animal e
o seu uso na medicina, fizeram com que o estudo dos compostos orgânicos contendo
selênio evoluísse (Mugesh et al., 2001; Nogueira et al., 2004). O selênio é um elemento
pertencente ao grupo 16 da tabela periódica, apresentando-se em três formas alotrópicas
incluindo selênio cinza, vermelho e preto e nos seguintes estados de oxidação: selênio
elementar (Se0), selenito (Se+4), selenato (Se+6) e seleneto (Se-2) (Porciúncula, 2003). É um
componente de selenoproteínas, algumas das quais têm importante função enzimática. O
selênio funciona como um centro redox, na redução de H2O2 e peroxidação de lipídios e
fosfolipídios para produtos inofensivos, por ação seleno-dependente de GPx. Essa função
ajuda a manter a integridade da membrana, reduzindo a propagação de posterior dano
oxidativo para biomoléculas (Rayman, 2000).
O selênio entra na cadeia alimentar pela ingestão de plantas que o absorvem do solo.
Pode ser introduzido em um substrato orgânico por reagentes nucleofílicos e eletrofílicos
(Nogueira et al., 2004). Sua importância na dieta ocorreu pela descoberta da Doença de
Keshan, uma cardiopatia infantil com alta incidência em algumas regiões na China onde o
25
solo é extremamente pobre em selênio (Ge et al., 1983). Esse mineral é de fundamental
importância para a saúde humana, pois possui papel estrutural e enzimático como
antioxidante e catalizador para a produção de hormônios e para o funcionamento do
sistema imune. O consumo diário de selênio deve variar entre 100 a 200 µg/dia, podendo
ser encontrado em diversos alimentos como: castanha-do-pará, brócolis, cebola, tomate e
germe de trigo (Rayman, 2000). Este elemento é normalmente encontrado em quantidades
significativas em tecidos como fígado, baço e nodos linfáticos (Spallholz et al., 1990). A
prevenção contra alguns tipos de câncer como o de próstata e pulmão e contra o
envelhecimento dos tecidos são também outros benefícios atribuídos ao selênio (Navarro-
Alarcón e López-Martinez, 2000; Rayman, 2000).
Compostos orgânicos contendo selênio são, nos interesses farmacológicos dos nossos
dias, fontes apreciáveis de moléculas antioxidantes, anticarcinogênicas, anti-hipertensivas,
antiinflamatórias, neuroprotetoras e miméticas de insulina (Mugesh et al., 2001; May,
2002; Tapiero et al., 2003; Nogueira et al., 2004). Assim sendo, uma gama muito grande
de fármacos sintetizados a partir de compostos orgânicos de selênio, têm sido testados em
diversos modelos in vitro e in vivo. Dessa maneira, em diversas formas químicas –
inorgânica ou orgânica, natural ou sintética – estruturas dotadas de selênio foram avaliadas.
Interesse especial foi destinado para as formas orgânicas dotadas deste elemento ligado
covalentemente, pois não disponibilizam este átomo para as células, não aumentando assim
os níveis intracelulares e, portanto, afastando o risco de intoxicação pelo selênio (selenose)
(Mugesh et al., 2001). A síntese de compostos orgânicos de selênio aumentou
consideravelmente devido à menor toxicidade dos compostos orgânicos em relação aos
inorgânicos. A partir de então, uma série de compostos selenados foi avaliada quanto à
genotoxicidade, na busca de efeitos mutagênicos e/ou antimutagênicos (Moore et al., 1996).
Os primeiros modelos utilizados para avaliação da genotoxicidade do selênio foram
os sistemas bacterianos. O selenito de sódio apresentou fraca atividade mutagênica em
ensaios usando linhagem de Bacillus subtilis, mas o selenato mostrou resultados positivos
(Noda et al., 1979). Utilizando várias linhagens de Salmonella typhimurium no teste de
Ames, verificou-se ausência de atividade mutagênica para selenito de sódio e aumento na
freqüência de mutações do tipo substituição de pares de bases para selenato de sódio. Um
26
ano após este estudo, foi evidenciada fraca atividade mutagênica para selenito e selenato de
sódio no mesmo modelo experimental. O selenito de sódio também foi capaz de aumentar
o poder mutagênico da 1-metil-nitrosouréia (agente alquilante), mostrando a influência de
compostos selenados na modulação da genotoxicidade de outros compostos (Noda et al.,
1979; Balanski et al., 1983).
Os compostos selenito de sódio, selenato de sódio, óxido de selênio,
selenohipoxantina, selenopurina, selenocisteína, selenoetionina e selenometionina foram
analisados quanto à sua habilidade em induzir a expressão de retrovírus endógeno na
linhagem AKR de fibroblastos de embrião de hamster. Todos estes compostos foram
extremamente tóxicos neste sistema, mas somente a selenometionina foi capaz de induzir a
expressão retroviral, reflexo de sua atividade genotóxica (Rascati, 1983). O selenito,
selenato e seleneto de sódio induziram troca de cromátides-irmãs (SCE) em células da
linhagem V79 (fibroblastos de pulmão de hamster Chinês) em presença e ausência da
fração S9. O mais potente indutor destas lesões foi o selenito de sódio, em presença de S9,
e seleneto de sódio, em ausência de S9. Selenato de sódio, mesmo em altas doses, em
presença ou ausência de ativação metabólica, não aumentou as taxas de SCE (Sirianni e
Huang, 1983). Em outro estudo, cinco compostos selenados inorgânicos induziram
aberrações cromossômicas em culturas de linfócitos humanos, sendo os compostos com
selênio em valência +4 os mais danosos (Nakamuro et al., 1976).
Os numerosos relatos da atividade mutagênica e antimutagênica do selênio em
diversos modelos biológicos conduz a três importantes características dos efeitos
biológicos deste metalóide: (i) a ação antimutagênica parece estar correlacionada com
concentrações fisiológicas enquanto a ação mutagênica manifesta-se em níveis
suprafisiológicos; (ii) é importante considerar possíveis reações entre um agente
genotóxico e as moléculas selenadas bem como a importância da forma química que
contém o elemento e (iii) o envolvimento do metabolismo celular e os mecanismos de
defesa antioxidante podem modular todos os efeitos biológicos derivados destas moléculas
(Rosa, 2004).
27
Assim como o paradoxo mutagênese/antimutagênese depende da forma química, do
metabolismo e da concentração do composto organoselenado, cria-se o paradoxo: ação
antioxidante/pró-oxidante para compostos contendo selênio (Rosa, 2004). Basicamente a
ação pró-oxidante depende de duas vias distintas: (i) reação com a glutationa, através de
catálise oxidativa, predispondo o ambiente celular aos efeitos danosos de radicais livres
produzidos durante o metabolismo aeróbio normal e (ii) a geração de ERO durante a
reação com glutationa (Claudiere et al., 1992).
Embora o primeiro composto sintético contendo selênio, o seleneto de dietila, tenha
sido elaborado em 1836 por Luwig, foi somente após 1970, com a descoberta de novas
rotas de síntese, que novos compostos organoselenados sintéticos foram desenvolvidos
(Mugesh et al., 2001; May, 2002; Nogueira et al., 2004). Nas últimas décadas, estudos de
síntese têm sido direcionados para o desenvolvimento de compostos orgânicos de selênio
mais estáveis que possam ser usados como antioxidantes, inibidores enzimáticos, agentes
anti-tumorais e antiinfecciosos, bem como imunomoduladores (Wendel et al., 1984; Sies e
Matsumoto, 1997; Mugesh et al., 2001). No campo do desenvolvimento de drogas com
potencial atividade antioxidante, o objetivo principal é desenvolver moléculas selenadas
que exerçam ação semelhante à enzima GPx, os miméticos de GPx. Até 2001, mais de 130
moléculas selenadas haviam sido analisadas quanto à sua ação mimética de GPx (Mugesh
et al., 2001).
1.3.1 Composto Organoselenado Ebselen
O ebselen (2-fenil-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one) (figura 3), também chamado PZ
51, é um composto orgânico de selênio, que tem merecido destaque na literatura pelas suas
propriedades farmacológicas. O ebselen foi descrito e caracterizado como um mimético da
GPx em 1984 (Muller et al., 1984; Wendel et al., 1984; Schewe, 1995), e desde então se
tem expandido a aplicabilidade de suas atividades famacológicas benéficas. A partir dessa
década cresceu enormemente o número de estudos onde o ebselen exerce proteção em
diferentes tipos celulares para os mais diversos tipos de injúrias. Foi um dos primeiros
compostos sugerido para terapia de inativação de hidroperóxidos na presença de glutationa
(Parnham e Kindt, 1984).
28
Em 1988, Maiorino e colaboradores, executando um estudo cinético da catálise da
reação de GPx através do ebselen, concluíram que o mecanismo se pareceu cineticamente
idêntico ao da reação da enzima, um mecanismo de pingue-pongue (Maiorino et al., 1988).
O ebselen reage com os tióis para formar sulfeto de selenenil. Este reage com um segundo
equivalente de GSH e forma um único produto que é caracterizado como selenol.
Finalmente, o selenol reage com H2O2 ou hidroperóxido orgânico e forma H2O e ácido
selenínico, que espontaneamente produz outra molécula de H2O e então este volta a ser
ebselen. O ebselen e outros compostos organoselenados podem utilizar uma variedade de
tióis além de GSH como um substrato. A reação catalizada por estes compostos é similar à
reação catalizada pela GPx, e é de particular significância para células vivas porque
decompõe H2O2, um intermediário que pode dar origem a ERO, prevenindo assim a
formação de HO• e peroxidação de lipídios (revisado por Nogueira et al., 2004).
É um composto não-tóxico, com baixo peso molecular, dotado de potente atividade
mimética da GPx (Yamaguchi et al., 1998; Herin et al., 2001; Li e Cao, 2002; Imai et al.,
2003) e, portanto, um excelente antioxidante, além de possuir ação antiinflamatória,
reduzindo um grande número de enzimas implicadas no processo inflamatório (Fürstenau,
et al., 2004), antiaterosclerótica e citoprotetora em diversos modelos biológicos (Schewe,
1995). Uma nova propriedade do ebselen, como inibidor de apoptose, foi demonstrada em
estudo realizado por Namura e colaboradores (2001). O ebselen e seus metabólitos
reduzem hidroperóxidos orgânicos, protegendo lipoproteínas e membranas (Schewe, 1995;
Herin et al., 2001). A primeira demonstração da habilidade do ebselen em reduzir
hidroperóxidos foi através de um ensaio enzimático utilizando NADPH e GSSG redutase.
O ebselen foi comparado com um análogo sulfúrico, chamado PZ 25, o qual não exibiu
atividade antioxidante (Parnham e Sies, 2000). Estudos recentes demonstraram que o
Figura 3. Estrutura química do ebselen, que tem fórmula química C13H9NOSe (Batna et al., 1997).
29
ebselen usado no sistema tioredoxina é mais eficaz que a glutationa, sugerindo que este é o
seu principal mecanismo de ação como um antioxidante (Fang et al., 2005).
Evidências de atividade neuroprotetora para este potente antioxidante selenado
também são extensas na literatura, principalmente em pacientes com isquemia cerebral
(Saito et al., 1998; Porciuncula et al., 2001; Borges et al., 2005) e doença de Parkinson e
Alzheimer (Schewe, 1995; Rossato et al., 2002). Em pesquisas com animais in vivo foi
investigada a ação antioxidante e eficácia neuroprotetora do ebselen em vários modelos de
derrame cerebral isquêmico (Imai et al., 2003; Moretto et al., 2005), prevenindo a
peroxidação de lipídios provocada pela excessiva ação do sistema glutamatérgico
(Nogueira et al., 2002; Porciuncula et al., 2003). Além disso, o ebselen também foi
administrado com sucesso em humanos, diminuindo os déficits neurológicos provocados
por aneurisma subaracnóide hemorrágico (Saito et al., 1998; Zhao e Holmgren, 2002).
Tratamentos clínicos indicam que o ebselen tem efeitos benéficos em situações patológicas
quando há envolvimento com glutamato (Porciúncula et al., 2001).
Os efeitos benéficos do ebselen não estão relacionados somente aos estudos em
tecidos e células do sistema nervoso central, pois o ebselen protegeu a mucosa estomacal e
esofágica em modelos animais contra vários tipos de lesões experimentalmente induzidas
(Ocakci et al., 2006), e também teve efeitos preventivos contra a toxicidade da cisplatina,
uma droga antitumoral, cujo uso é limitado devido à sua toxicidade (Hardej e Trombetta,
2002; Guérin e Gauthier, 2003). Também preveniu danos aos tecidos durante reperfusão
isquêmica no coração e fígado (Morin et al., 2003; Davis e Bartfay, 2004). Outros estudos
mostraram que a ação antioxidante do ebselen também tem efeito anticarcinogênico, por
mostrar potente inibição contra eventos inflamatórios associados com promoção de tumor
em modelo animal (Nakamura et al., 2002). O ebselen inibe a formação de colônias em
várias linhagens de células cancerígenas, elevando a possibilidade de seu uso como agente
antitumoral (Guérin e Gauthier, 2003).
Entre as drogas antioxidantes, o ebselen parece ser a mais promissora pela baixa
toxicidade, porque o selênio presente na sua molécula não é liberado durante sua
biotransformação e, deste modo, não é metabolizado pelo organismo como os outros
30
compostos onde o selênio está mais disponível (Schewe, 1995). Além de baixa toxicidade,
apresenta: ausência de efeitos colaterais, estabilidade metabólica devida a uma série de
interconversões cíclicas, metabólitos com ação biológica, múltiplas ações farmacológicas,
redução de peróxidos, inibição de enzimas e modulação de processos de transdução de
sinal e interações célula-célula (revisado por Mugesh et al., 2001). Em vista destas
características, o composto apresenta: (i) capacidade de reduzir a toxicidade de outros
xenobióticos; (ii) propriedades cito e tecido-protetoras, principalmente contra estresse
oxidativo e (iii) potencial antiinflamatório com diversos alvos moleculares, como inibição
de lipoxigenases, NO sintase, NADPH oxidase, proteína quinase C entre outras (Schewe,
1995).
Após a descoberta do ebselen, uma série de outras estruturas organoselenadas
candidatas a mímicos de GPx foi estudada, incluindo benzoselenazolinonas, selenamidas e
derivadas, diselenetos de diarila, vários diselenetos imidazólicos modificados e a enzima
sintética selenosubtilisina (Mugesh et al., 2001). Vários compostos testados, derivados do
ebselen, mostraram atividade mimética à GPx tanto quanto o ebselen (Chang et al., 2003;
Mareque et al., 2004). Diferentes análogos do ebselen foram sintetizados como agentes
antivirais e antimicrobianos, alguns apresentaram forte inibição de atividades
citopatológicas e outros inibiram o crescimento de linhagens patogênicas (Wójtowicz et al.,
2004). Porém, até o momento, nenhuma nova estrutura conseguiu superar as qualidades e
vantagens do ebselen (revisado por Nogueira et al., 2004). Apesar da ação benéfica, já
amplamente descrita, se faz necessária a avaliação da atividade mutagênica e/ou
genotóxica do composto organoselenado ebselen, pois, estudos recentes mostram que o
ebselen induz morte celular por necrose, mostrando um efeito tóxico que poderia não ser
prevenido, pois causa inibição de caspases ou bloqueia a ação de compostos de tiol. Estes
resultados indicam que alguns tipos celulares são sensíveis aos efeitos tóxicos do ebselen e
que a morte celular induzida por este interfere no processo apoptótico. Estas são
informações importantes, uma vez que o ebselen atualmente é usado em alguns
tratamentos clínicos (Guérin e Gauthier, 2003).
31
1.4 Células Eucarióticas como modelos de estudo
1.4.1 Levedura Saccharomyces cerevisiae
As leveduras têm estado a serviço do homem por muitos séculos, fermentando os
sucos de frutas, levedando o pão e fabricando certos produtos nutritivos. São utilizadas
numa variedade de processos fermentativos, e também na síntese de certas vitaminas,
gorduras e proteínas. São amplamente utilizadas como modelo de organismo para estudo
genético. Contribuíram para o progresso científico, constituindo o modelo celular de
escolha na elucidação dos processos bioquímicos e metabólicos fundamentais das células
vivas eucarióticas (Henriques et al., 1987).
A levedura S. cerevisiae é um fungo unicelular, pertence à classe Ascomycete,
subclasse Hemiascomycetidae, ordem Endomycetales, família Saccharomycetaceae e
subfamília Saccharomycoideae (Resnick e Cox, 2000). Está amplamente estudada, sendo o
primeiro eucarioto a ter seu genoma totalmente seqüenciado. Possui 16 cromossomos, com
um genoma de 13,389 Kb com média de um gene para cada 2.000 pares de bases, sendo
que diversos genes estão envolvidos com reparação de danos ao DNA. Seu genoma foi
desvendado através do projeto de seqüenciamento do genoma da levedura, iniciado pela
comunidade européia de leveduras em 1989 e concluído em 1996 (Goffeau et al., 1996).
Cerca de 70% de seu genoma codifica aproximadamente 6.000 proteínas, onde 1.400
destas proteínas apresentam homologia com produtos protéicos conhecidos.
É um modelo importante nas pesquisas sobre mutagênese. Os ensaios com levedura
são de grande utilidade na determinação de agentes mutagênicos ambientais ou
farmacológicos e servem para complementar os ensaios de mutagenicidade realizados em
bactérias (Henriques et al., 1987). Esses ensaios são rápidos, sensíveis, econômicos e
reprodutíveis, apresentando resultados confiáveis.
A levedura S. cerevisiae possui um sistema endógeno de ativação metabólica
constituído por um complexo enzimático (citocromo P-450) de detoxificação, sem a
necessidade da adição de um sistema exógeno de metabolização (Moreno et al., 1991).
Apresenta a capacidade de crescer tanto com metabolismo anaeróbio (por fermentação de
32
glicose, sua fonte preferida, que reprime a via biossintética das enzimas da cadeia
respiratória, mesmo em presença do oxigênio), como aeróbio (com fontes de carbono como
etanol e glicerol) (Boveris, 1983). Recentemente, Maris e colaboradores (2000),
demonstraram que a capacidade antioxidante das leveduras em crescimento fermentativo
está bastante diminuída em relação a leveduras que não fermentam e que esta diferença não
depende da função mitocondrial, ou seja, que o sistema antioxidante da levedura está
sujeito à repressão por glicose, também conhecida por repressão catabólica.
Quando cultivada em grande quantidade, em meio rico (YPD – 2% de glicose) em
condições aeróbicas normais, esta levedura fermenta aproximadamente 70% da glicose
para etanol e CO2, incorpora 20% da mesma biomassa e utiliza 8% na produção de glicerol.
Somente 2% da glicose sofrerá fosforilação oxidativa para CO2 e H2O na mitocôndria (De
Winde et al., 1997). Quando a concentração da glicose cai para menos de 0,5% no meio há
a desrepressão das enzimas que participam da biossíntese de mitocôndrias e de outros
genes necessários para o crescimento respiratório (De Winde et al., 1997; Gancedo, 1998).
Esse crescimento apresenta fases distintas (figura 4). Após breve período de adaptação ao
meio (fase lag), as células iniciam divisão celular a cada hora e meia (fase exponencial),
com energia proveniente da fermentação da glicose. Com a diminuição da disponibilidade
da glicose no meio, há uma parada transiente na divisão celular, enquanto as células são
preparadas para o metabolismo respiratório (transição-diáuxica). Após, ela reassume a
divisão celular em um ritmo mais lento (uma divisão a cada três ou quatro horas)
respirando o etanol que foi produzido durante a fermentação (fase pós-diáuxica). Quando
todas as fontes de carbono forem exauridas, as células entram na fase estacionária, na qual
podem sobreviver por muito tempo na ausência de nutrientes (Fuge e Werner, 1997).
33
Figura 4. Fases de crescimento de uma levedura selvagem quando iniciada em meio completo (adaptado de Roehrs, 2004).
As células de S. cerevisiae proliferam-se por brotamento logo após a duplicação do
seu DNA, com tempo de geração de aproximadamente 90 minutos, quando incubadas a
temperaturas de 28 a 30ºC (figura 5). Pode proliferar tanto no estado haplóide, que possui
apenas um conjunto de cromossomos, como diplóide, que contém dois conjuntos de
cromossomos homólogos e, portanto, duas cópias de cada gene (Maris et al., 2001).
O brotamento proliferativo da levedura apresenta fases distintas, G1 (gap 1), S
(síntese de DNA), G2 (gap 2) e M (mitose e divisão celular), cada uma é claramente
definida quando a célula-mãe inicia um novo ciclo de proliferação, resultando na liberação
de uma nova célula-filha. Esta continuará a se dividir em G1 até chegar ao tamanho crítico
Figura 5. Micrografia eletrônica da levedura S. cerevisiae. Pode-se observar a divisão por brotamento. Uma simples célula adulta tem cerca de 8 µm de diâmetro (Maris et al., 2001).
34
celular requerido para passar para um novo ciclo proliferativo (figura 6). Se há limitação
de nutrientes as células ou entram em fase estacionária, também chamada de G0 ou, se
forem diplóides, iniciam a meiose (De Winde et al., 1997).
Figura 6. Ciclo celular de S. cerevisiae.
Como a levedura S. cerevisiae é um organismo eucarioto simples e está bem
caracterizada geneticamente, a sua utilização como modelo de estudo de proteção
antioxidante em estudos de reparo de DNA e mutagênse, torna-se de grande importância,
uma vez que já existem linhagens portadoras de marcadores genéticos apropriados, além
de diversos mutantes deficientes em sistemas enzimáticos de proteção e que podem ser
testados de maneira rápida e sistemática no laboratório.
A S. cerevisiae apresenta uma variedade de mecanismos de defesa contra danos
oxidativos, tais como presença de antioxidantes, atividades enzimáticas, seqüestradores de
metais e diversos mecanismos de reparação (Maris et al., 2001). Ela possui duas enzimas
superóxido dismutase: a Sod-CuZn, que é codificada pelo gene SOD1, e se localiza no
citoplasma, núcleo e lisossomos e é um homodímero com Cu2+ e um Zn2+, ligados
covalentemente a cada monômero de 16 Kd; e a Sod-Mn, que é codificada no núcleo pelo
���������������� ����
��������������
���������
����������
�����������������������������
Início
35
gene SOD2, e sintetizada como um pré-peptídeo no citoplasma com uma seqüência de
localização mitocondrial de 27 aminoácidos, clivada após entrada nas mitocôndrias (Longo
et al., 1999). As Sod são enzimas que fazem a dismutação do radical superóxido a H2O2. A
linhagem mutante sod1�, que é deficiente na enzima Sod-CuZn, apresenta problemas de
crescimento em condições aeróbias; é muito sensível à hiperóxia e a substâncias
envolvidas em reações tipo ciclo-redox, tais como paraquat ou menadiona; perde a
viabilidade em fase estacionária e é auxotrófica para metionina e lisina em presença de O2
(Srinivasan et al., 2000). Acredita-se que a auxotrofia à lisina e a metionina se deve a
enzimas relacionadas a sua síntese, que seriam extremamente sensíveis a desativação por
O2•- (Fernàndez-Checa et al., 1998). Seu tempo de geração mais demorado se deve a um
atraso na fase G1 do ciclo celular em resposta ao estresse oxidativo basal. Este levaria a
uma parada transiente antes do ponto inicial, que se torna uma parada permanente em
condições de hiperóxia (Lee et al., 2001). Na ausência de O2 e em células deficientes na
síntese de heme, há uma diminuição na expressão de SOD1, sugerindo também regulação
por O2 e heme (Srinivasan et al., 2000). A mutante sod2�, que é deficiente na enzima Sod-
Mn, é hipersensível ao O2 e cresce mal ou não cresce em fontes de carbono não-
fermentáveis. A sensibilidade à hiperóxia é revertida pela mutação rho0 (leveduras sem
mitocôndria), confirmando o papel decisivo da mitocôndria na geração de O2•-
(Fernàndez-Checa et al., 1998). Durante o crescimento em fontes de carbono não-
fermentáveis foi observado um aumento na expressão de SOD2 entre 5 e 10 vezes em
relação ao crescimento em meio rico em glicose (Srinivasan et al., 2000). Este aumento de
expressão ocorre antes, e é independente da respiração mitocondrial.
Mutantes sod1� e sod2� mostram níveis de ferro, detectado por Ressonância
Paramagnética de Elétron (RPE) de até 5 vezes maiores em relação aos níveis basais da
linhagem selvagem isogênica, enquanto a duplo mutante sod1� sod2� apresenta níveis de
ferro superiores a 9 vezes o encontrado para a selvagem, em condições aeróbias de
crescimento. O tratamento da linhagem selvagem como um gerador de superóxido
(paraquat), também aumentou o ferro detectável por RPE, indicando que o excesso de ferro
livre pode ser devido aos efeitos deletérios do radical superóxido (Srinivasan et al., 2000).
36
Em levedura a resistência a peróxido tem sido associada aos níveis intracelulares de
glutationa (Kobayashi et al., 1996). O gene GSH1 é necessário para a síntese de �-
glutamilcisteína-sintetase, a enzima responsável pelo primeiro passo, e é o ponto limitante
da biossíntese de GSH; e o gene GSH2 codifica a glutationa-sintetase, a segunda enzima da
síntese de GSH. Ambos foram clonados e as mutantes correspondentes analisadas (Inoue et
al., 1998). Mutantes gsh1� induzem apoptose e morrem rapidamente quando nenhuma
GSH exógena é fornecida (Madeo et al., 1999). A GSH endógena é importante para a
manutenção da integridade mitocondrial; mesmo em meio suplementado com GSH, as
mutantes gsh1� têm alta tendência de perder a função mitocondrial (Brendel et al., 1998).
Além disso, as leveduras mutantes gsh1� não adquirem resistência intrínseca sob
condições não-fermentáveis e na fase estacionária contra H2O2 (Maris et al., 2000) e não
mostraram respostas adaptativas ao estresse por H2O2 durante fase exponencial em meio
YPD-glicose.
Pela simplicidade do cultivo e caracterização genética; fases de crescimento
características e controláveis; e sua marcante semelhança aos sistemas de estudo em
eucariotos superiores, a levedura S. cerevisiae é um sistema modelo ideal para estudo de
danos oxidativos e funções mitocondriais (Longo et al., 1999).
Linhagens isogênicas deficientes em defesas antioxidantes têm sido utilizadas para o
estudo do mecanismo de ação de agentes físicos e químicos que interferem com o estado
redox celular (Lee et al., 2001). Um método utilizado consiste em comparar a sensibilidade
ao tratamento com um agente físico (por ex. radiação) ou químico (por ex. pró-oxidante),
de diversas mutantes deficientes em enzimas antioxidantes ou em um fator de transcrição
sensível ao estado redox, como o Yap1, ou ainda deficiente na síntese de GSH, a fim de
avaliar a importância de cada defesa antioxidante celular na desintoxicação do agente
testado. Também é possível combinar um oxidante conhecido, como H2O2, t-BOOH ou
paraquat, com uma substância antioxidante ou com outro composto de mecanismo
desconhecido, e avaliar o efeito do tratamento da substância na modulação do estresse
oxidativo. O aumento da viabilidade celular ao tratamento estará sugerindo atividade
protetora (antioxidante) e a diminuição da viabilidade a um efeito deletério (pró-oxidante)
(Picada et al., 2003).
37
Respostas adaptativas ao estresse oxidativo também podem ser encontradas em
leveduras. Células pré-tratadas com concentração sub-letal de um oxidante (H2O2, t-BOOH,
paraquat) apresentam indução de uma resposta protetora que permite que as mesmas
sobrevivam a um tratamento com concentrações mais altas ou letais do oxidante (Grant et
al., 1998). Esta resposta adaptativa não é restrita ao estresse oxidativo, sendo que em
levedura a resposta adaptativa mais conhecida é a do choque térmico. Respostas similares
também ocorrem para o estresse osmótico, para agentes que provocam danos ao DNA e
para outros tipos de estresse. O pré-tratamento com um tipo de agente estressor pode
também induzir resistência cruzada contra outro tipo de agente estressor (Sugiyama et al.,
2000). Esses estudos demonstram a complexidade de sistemas altamente regulados que
evitam os danos celulares. A regulação desses sistemas em leveduras pode ser mais
complexa do que daqueles de organismos aeróbios, pois a levedura é um aeróbio
facultativo (Maris et al., 2000).
1.4.2 Células de mamíferos
Os sistemas mais relevantes para a análise do potencial mutagênico e carcinogênico
de produtos químicos em humanos são ensaios em eucariotos e, em particular, ensaios em
células de mamíferos (Tice et al., 1994; Müller e Sofuni 2000). Fibroblastos de pulmão de
hamster Chinês (células V79) correspondem a uma das linhagens de células de mamíferos
mais utilizadas em testes citogenéticos de curta duração (Frieauff et al., 2001). Esta
linhagem é capaz de iniciar rapidamente um crescimento exponencial a partir de um
pequeno inóculo e apresenta alta eficiência de plaqueamento. Em geral, o tempo de
duplicação destas células é de 12-16 horas, a 37oC, com 5% de CO2. Podem ser estocadas
em nitrogênio líquido, recuperando-se rapidamente após o seu descongelamento,
permitindo, portanto, a manutenção de grandes estoques destas células com características
reprodutíveis e similares, como por exemplo, a baixa freqüência de mutações (Frieauff et
al., 2001). A linhagem humana de células de linfócitos T (Jurkat) é usada freqüentemente
como uma linhagem modelo em estudos citoimunológicos. Os subclones diferentes de
Jurkat podem ser derivados de pacientes diferentes. Ocasionalmente, estes subclones têm
características divergentes e indicam uma instabilidade genética extremamente elevada. A
linhagem mais recomendada para uso em análise de danos ao DNA é a Jurkat de clones
38
E6.1, provenientes de células humanas de linfócitos T de leucemia aguda (Castro et al.,
2004).
1.5. Ensaio Cometa
O Ensaio Cometa ou SCGE “Single Cell Gel Eletrophoresis Assay” é um teste de
genotoxicidade capaz de detectar danos no DNA induzidos por agentes alquilantes,
intercalantes e oxidantes em células de mamíferos. Este teste apresenta como vantagens:
simplicidade, rapidez e sensibilidade para mensurar e analisar lesões e detectar efeitos de
reparo no DNA em células expostas a agentes genotóxicos. (Singh, 2000). Apresenta bons
resultados a partir de um pequeno número de células analisadas. Tem uma ampla
aplicabilidade para testes de genotoxicidade in vitro e in vivo (Vilella et al., 2003). Os
danos mais facilmente detectados no DNA são quebras (simples ou duplas), danos álcali-
lábeis, ligações cruzadas e quebras resultantes de reparo por excisão não concluídos
(Fairbairn et al., 1995).
Existem dois tipos de protocolos para este teste: (a) tratamento neutro, que detecta
quebras duplas no DNA; e (b) tratamento alcalino, que detecta quebras simples e danos
alcali-lábeis (Fairbairn et al., 1995). Esta técnica tem sido modificada também para
detectar adutos no DNA (dímeros de timina, danos oxidativos) usando anticorpos
específicos (Sauvaigo et al., 1998) ou enzimas de reparo de danos ao DNA (Collins et al.,
1998; Speit e Hartmann, 1999).
Nesta técnica de microgel para eletroforese as células são embebidas em gel de
agarose em lâminas para microscopia, lisadas sob condições alcalinas (ou neutras),
fazendo-se passar uma corrente elétrica, que faz migrar para fora do núcleo os segmentos
de DNA livres, resultantes das quebras. Após a eletroforese, as células que apresentam um
núcleo redondo são identificadas como normais, sem dano reconhecível no DNA. As
células lesadas são identificadas visualmente por uma espécie de cauda, como de um
cometa, formada pelos fragmentos de DNA (figura 7). Estes fragmentos podem se
apresentar em diferentes tamanhos e ainda estar associados ao núcleo por uma cadeia
simples (Fairbairn et al., 1995).
39
As principais limitações deste teste são: (i) não é um teste de mutagênese, pois o
dano pode ser reparado; (ii) por ser muito sensível, deve-se ter cautela, além de um bom
controle para análise dos resultados e (iii) o tempo decorrido entre exposição ao mutágeno
e a preparação das lâminas, até a lise, deve ser curto (24hs no máximo) (Vilella et al.,
2003).
Figura 7. Tipos de danos celulares em Ensaio Cometa (0) dano do tipo 0, (1) dano do tipo 1, (2) dano do tipo 2, (3) dano do tipo 3, (4) dano do tipo 4 (adaptado de Garcia et al., 2004 ).
40
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Ampliar o conhecimento das ações biológicas do ebselen sobre o estado redox
celular, bem como na integridade da informação genômica, utilizando ensaios biológicos
com a levedura S. cerevisiae e com células de mamíferos.
2.2 Objetivos Específicos
� Considerando o potencial antioxidante verificado em alguns compostos
organoselenados, este estudo visa estudar a interferência do ebselen no estado
redox celular através de ensaios in vivo, utilizando linhagens da levedura S.
cerevisiae deficientes em defesas antioxidantes;
� Avaliar o possível efeito mutagênico deste derivado organoselenado na levedura S.
cerevisiae;
� Avaliar a atividade genotóxica e antigenotóxica do ebselen em cultura V79,
fibroblastos de pulmão de hamster Chinês e em Jurkat, células humanas de
linfócitos T, através do Ensaio Cometa Alcalino.
41
3 CAPÍTULO I
EVALUATION OF GENOTOXICITY, ANTIGENOTOXICITY AND
ANTIOXIDANT EFFECTS OF EBSELEN IN MAMMALIAN AND YEAST CELLS
Artigo a ser submetido a Life Science
42
EVALUATION OF GENOTOXICITY, ANTIGENOTOXICITY AND
ANTIOXIDANT EFFECTS OF EBSELEN IN MAMMALIAN AND YEAST CELLS
Simone Teresinha Miorelli1, Renato Moreira Rosa2, Dinara Jaqueline Moura2, Larissa
Aline Carneiro Lobo1 and Jenifer Saffi 1,2 *
1 Laboratório de Genética Toxicológica, ULBRA – Universidade Luterana do Brasil –
Canoas/RS/Brasil 2 Laboratório de Reparação de DNA em Eucariotos, Departamento de Biofísica,
IB/UFRGS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Porto Alegre/RS/Brasil
Corresponding author
* Universidade Luterana do Brasil Avenida Farroupilha, 8001 Bairro São José CEP: 92425-900 Canoas/ RS – Brasil Tel: (+55) (51) 3477-4000 E-mail address: [email protected]
43
EVALUATION OF GENOTOXICITY, ANTIGENOTOXICITY AND
ANTIOXIDANT EFFECTS OF EBSELEN IN MAMMALIAN AND YEAST CELLS
ABSTRACT
Organic compounds containing selenium are considerable sources for anti-oxidant,
anti-carcinogenic, anti-inflammatory and neuroprotective molecules. Ebselen is an
organoselenium compound showing mimetic activity similar to glutathione peroxidase
enzyme (GPx). The purpose of this study was to verify ebselen interference on the cellular
redox status by in vivo tests, using Saccharomyces cerevisiae strains, proficient and
deficient in antioxidant defenses. Genotoxicity and antigenotoxicity induced by that
compound were also tested, using the Comet Assay in V79 and Jurkat cell lines. Our
results demonstrated that ebselen protects these cell lines against DNA damage-induced by
organic (H2O2) and inorganic (t-BOOH) hidroperoxides. One may suggest that ebselen has
this protective effect by reducing the amounts of the oxidative agents, decreasing the free
radical generation and therefore the DNA oxidative damages. In S. cerevisiae, it does not
induce neither cytotoxicity nor mutagenicity. Moreover, it protects against growth
inhibition induced by H2O2 exposure in sod2 mutant only. The same strain, as well as the
wild type, treated with high ebselen doses and exposed to paraquat, present significant
increase of growth inhibition, suggesting a pro-oxidant action. This result demonstrates
that ebselen does not possess antioxidant activity against superoxide radical and confirms
the specificity of in vivo protection against hydroperoxides, characterizing its glutathione
peroxidase-like activity.
Keywords: Ebselen, Antioxidant, Saccharomyces cerevisiae, V79, Jurkat, Comet assay
44
1 INTRODUCTION
Selenium has been discovered in 1818 by the Swedish chemist Berzelius. The trace
mineral selenium is an essential nutrient of fundamental importance to human biology
(Rayman, 2000). Its biochemical role in mammalians has been clearly established by the
discovery that it is part of the active site of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase
(GPx). Interest in the use of organoselenium compounds in biochemistry has started with
the findings that these compounds are much less toxic in comparison with inorganic
selenium species (Mugesh et al., 2001). Ebselen (2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-
one), selenium-containing heterocyclic compound, has attracted interest since it was found
out that it exhibits enzyme mimetic activity (Sies, 1993). This non-toxic low molecular
weight compound has been reported to mediate the reduction of hydro peroxides by
glutathione, thereby mimicking the enzymatic activity of GPx (Zhao and Holmgren, 2002;
Chang et al., 2003). It presents very low toxicity because of its unique stability in structure
and because its selenium moiety is not liberated during biotransformation and therefore
does not enter the selenium metabolism of the organism (Zhao and Holmgren, 2002). In
addition to its antioxidant activity, ebselen also shows a number of pharmacologic
activities, such as anti-inflammatory, antiatherosclerotic and cytoprotective properties
(Morin et al., 2003; Wójtowicz et al., 2004). In animal model studies, ebselen was shown
to reduce oxidative stress in ischemia-reperfusion in heart (Morin et al., 2003) and to have
neuroprotective effects in brain (Namura et al., 2001). More importantly, it has been
demonstrated its beneficial effects in clinical trials for the treatment of patients with
delayed neurological deficits after aneurysmal subarachnoid hemorrhage and acute
ischemic stroke (Yamaguchi et al., 1998; Herin et al., 2001; Porciúncula et al., 2001; Li e
Cao, 2002; Imai et al., 2003). A recent study has also shown that this compound has a
protective effect in the pathological situations where glutamate is involved (Porciúncula et
al., 2003).
Yeast seems to be a potentially useful eukaryotic model for studies of the effects of
antioxidants at the cellular level. Such studies can not only verify the results of test-tube
experiments on the protection of macromolecules from the action of oxidants, but also may
allow a preselection of antioxidant combinations with potential therapeutic value
(Krzepilko et al., 2004).
45
In this regard, the goal of the present study was to investigate the ebselen
interference on the cellular redox status through in vivo tests, using S. cerevisiae strains,
proficient and deficient in antioxidant defenses. Moreover, to enhance the knowledge on
biological actions of ebselen on the integrity of genomic information, in mammalian cells
V79 and Jurkat, analyzing genotoxicity and antigenotoxicity by alkaline comet assay.
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Chemicals
The chemicals used in this study: ebselen, tertbutyl-hydroperoxide (t-BOOH), 4-
nitroquinoline-oxide (4-NQO) and paraquat were purchased from Sigma (St. Luis, USA);
hydrogen peroxide (H2O2) was purchased from Synth (Brazil) and dimethyl sulfoxide
(DMSO) was purchased from Nuclear (Brazil).
2.2 Yeast strains and media
S. cerevisiae strains used in this study were kindly provided by Dr. E. Gralla
(University of California, Los Angeles, CA, USA) and R.C. von Borstel (University of
Alberta, Edmonton, Canada). The relevant genotypes are listed in Table 1. Haploid strain
XV185-14c was used in mutagenicity assay. Strains were routinely grown and stored on
solid YPD medium (1% yeast extract, 2% glucose, 2% bacto peptone and 2% agar).
Minimal medium (MM) contained 0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.5%
ammonium sulfate and was supplemented with the appropriate amino acids (synthetic
complete medium, SC), at a concentration of 2 mg/mL.
2.3 Growth of yeast
Stationary-phase (STAT) cultures were obtained by inoculation of liquid YPD with
an isolated colony. After 48h incubation at 30ºC with aeration by shaking, the cultures
contained 1-2x108 cells/mL. Cells were harvested and washed twice with saline solution.
46
Cell concentration and percentage of budding were determined by microscopic counts
using a Neubauer chamber.
2.4 Growth inhibition assay in yeast cells (central disc)
An inoculation loop of cells from a suspension treated with 0, 10, 40, 70, 100 and
130 µM of ebselen (dissolved in DMSO) was streaked from the center to the border of a
Petri dish in one continuous strike to both sides of the plate. A filter-paper disk was placed
in the center of the plate and the oxidizing agent was applied onto the disk. Plates were
incubated for 2 days at 30ºC. The impairment of growth was measured as cm of growth
inhibition from the border of the filter-disk to the beginning of cellular growth. Values can
range from 0 cm (complete growth to the filter-disk) to 3 cm (absence of growth to the rim
of the Petri dish). Oxidizing agents used in the disk assay were: 5µL of H2O2 (10M) and
8µL of paraquat (0,5M) in aqueous solution.
2.5 Detection of ebselen-induced reverse and frameshift mutation in S. cerevisiae
Mutagenesis was measured in S. cerevisiae strain XV185-14c. A suspension of
2x108 cells/mL, in STAT phase, was incubated for 2h at 30ºC with various concentrations
of ebselen. Mutation induction was determined on SC (3-5 days, 30ºC). Whereas his1-7 is
a non-suppressible missense allele and reversions result from mutation at the locus itself
(Snow, 1978), lys1-1 is a suppressible ochre nonsense mutant allele (Hawthorne, 1969)
that can be reverted either by locus-specific or by a forward mutation in a suppressor gene
(Von Borstel et al., 1971). The two mutation types at the lys1-1 locus were differentiated
according to Schuller and Von Borstel (1974). It is believed that hom3-10 contains a
frameshift mutation due to its response to a range of diagnostic mutagens. Assays were
repeated and plating for each dose was in triplicate.
The relative sensitivity of the strains to ebselen was assayed by suspending 2x108
cells/mL of STAT culture in 1mL PBS containing various concentrations of ebselen and
incubation by thermomixer at 30ºC for 2h. Cell number was determined by microscopic
count and colony formation on solid YPD. Plates were incubated at 30ºC for 3-5 days
before counting.
47
2.6 Mammalian cells culture
V79 cells (Chinese hamster lung fibroblasts) were cultured in DMEM, supplemented
with 10% fetal bovine serum, L-glutamine 2mM, 100 units/mL of penicillin, 100 mg/mL
of streptomycin, (pH 7.4) in 25 cm2 culture flasks at 37ºC in 5% CO2 atmosphere. After
cells reached about 70-80% confluence, the complete DMEM was removed and cells were
washed one time with phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS). The fresh serum-free
DMEM was then added in the presence of the ebselen compound (0, 5, 10 and 50µM), for
2h at 37ºC. The mutagens employed were H2O2 and t-BOOH for 30min at 37ºC.
Jurkat cell lines was routinely maintained in suspension in culture flaskets containing
RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, L-glutamine 2mM, penicillin
100U/mL and streptomycin 100ng/L, at 37ºC in 5% CO2 atmosphere. Fresh RPMI was
then added in the presence of the ebselen compound (0, 5, 10 and 50µM), for 2h at 37ºC.
The mutagens employed were H2O2 (50µM) and t-BOOH (25µM) for 30min at 37ºC.
2.7 Comet Assay
The comet assay performed in this work was as previously described by Singh et al.
(1988), with minor modifications. Cells were suspended in 1% low melting point agarose
in PBS, pH 7.4, and pipetted on to super frosted glass microscope slides precoated with a
layer of 1% normal melting point agarose (warmed to 37ºC prior to use). The agarose was
allowed to set at 4ºC for 10min and then the slides were immersed in lyses solution (2.5 M
NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris at pH 10, 1% Triton X-100) at 4ºC for 1h in order to
dissolve cellular proteins and lipids. Slides were then placed in single rows in a 30 cm
wide horizontal electrophoresis tank containing 0.3 M NaOH and 1 mM EDTA, pH >13, at
4ºC for 20min in order to allow for separation of the two DNA strands (alkaline
unwinding). Electrophoresis was performed in the unwinding solution at 25V, 300 mA for
20min. After electrophoresis, the slides were then washed three times, for 5min each, with
0.4 M Tris, pH 7.5 (neutralized), stained for 35min using silver solution, with agitation, in
the dark. The slides were then washed three times with distilled water, added in the stop
solution for 5min, washed again three times with distilled water and air-dry. One hundred
randomly selected cells per sample were scored visually according to tail intensity into five
48
classes (from undamaged, 0, to maximally damaged, 4). The damage index (DI) was
obtained by the sum of the individual cell classes, ranging from 0 (no damage: 100 X 0) to
400 (maximum damage: 100 X 4). The damage frequency (DF-%) was calculated based on
number of cells with tail versus those with no tails.
International guidelines and recommendations for the comet assay consider that
scoring of comets is a well-validated evaluation method. It has a high correlation with
computer-based image analysis (Tice et al., 2000; Hartmann et al., 2003). The DI index is
based on the length of migration and on the amount of DNA in the tail and is considered a
sensitive measure of DNA damage. According to Tice et al. (2000), the DF, or the
proportion of cells that show tails after electrophoresis, is less informative than the DI,
because it does not consider the extent of the DNA damage in the cells. Image length or
migration length gives information only about the size of DNA fragments and is largely
dependent upon electrophoresis conditions (i.e., voltage and duration).
2.8 Statistical analysis
Data are presented as means ± standard deviation (SD) and analyzed using one-way
ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test. Differences between the control group
and different doses of the ebselen were considered significant when P<0.05.
3 RESULTS
3.1 Comet Assay
Figures 1A and 1B show the effects of 2-hours treatment at 37ºC with different
doses of ebselen in the presence and absence of oxidant agents H2O2 and t-BOOH in
mammalian cells - V79 and Jurkat. We observed a protection of ebselen against damages
to DNA on these two cell lines, more significantly against H2O2 than t-BOOH. The
protection was higher in the 10µM dose when in presence of oxidant agents. Both figures
1A and 1B show that – in the absence of an oxidant agent – the highest doses presented a
larger protective effect. However, in the presence of oxidant agents, a higher dose (50 µM)
49
of ebselen reduces the protection against DNA damages, both in the V79 and Jurkat strains,
in comparison to lower doses.
Table 2 shows the damage index and damage frequence of V79 and Jurkat cells after
treatment with ebselen in the absence or presence of H2O2 or t-BOOH. It can be seen that
the highest dose of ebselen (50 µM) can significantly reduce the index and frequence of
DNA damage in both cell lines in the absence of the oxidant agents. Althought there was a
significant reduction of damage index, the damage frequence did not change with the
presence of ebselen before the H2O2 or t-BOOH treatment. This response can be better
visualized in Figures 2 and 3 that demonstrate the distribution of damage classes in both
V79 (Figure 2) and Jurkat (Figure 3) cell lines, either in the absence (A) or presence (B and
C) of the oxidizing agents. It is interesting to note that the treatment with ebselen without
H2O2 or t-BOOH reduces the incidence of classes 2 of DNA damage (Figures 2A and 3A).
3.2 Citotoxic and mutagenic effects in S. cerevisiae
Table 3 shows that Ebselen is not mutagenic, since it did not increase significantly
the amount of revertants at the his1, lys1 and hom3 loci, when compared to the negative
control. It was not cytotoxic either, once survival index did not decrease.
3.3 Growth inhibition assay (central disc)
Table 4 shows the results obtained in the growth inhibition assay (central disc) with
wild type (WT) and mutants deficients in superoxide dismutase, treated with different
doses of ebselen, in the absence or presence of oxidant agents (H2O2 and paraquat). We
observed a higher protection of ebselen (for 10 to 100 µM) in sod2� mutants treated with
H2O2. Interestingly, when the same strain was treated with paraquat, this protection was
not observed and sensitivity increased for higher doses (100 and 130 µM), indicating a pro-
oxidant effect. This result was also seen for WT strain.
50
4 DISCUSSION
Ebselen – an organoselenium compound showing mimetic activity similar to
glutathione peroxidase enzyme – has antioxidants properties that, since their discovery in
1984, has attracted a great deal of attention (Parnham et al., 1991; Sies, 1993). Several
studies have shown that ebselen can reduce lipid peroxidation caused by reactive oxigen
species (ROS) both in vitro and in vivo in several model systems (Lass et al., 1996;
Parnham and Sies 2000, Mugesh et al., 2001). Although some recent cell-free studies
showed that ebselen did not prevent lipid peroxidation, Yang and co-workers (1999),
showed evidence that ebselen presents a strong protective effect against H2O2 induced
oxidative damage, including DNA damage in hepatome HepG2 cells. In our study, we
observed ebselen protection against DNA damage in V79 and Jurkat mammalian cells,
both in the absence and in the presence of oxidant agents (Figure 1).
H2O2 is a major producer of intracellular ROS during physiological and pathological
processes (Sies, 1993). H2O2 is also a well-known genotoxic agent able to induce oxidative
DNA damage, including DNA strand breakage and base modification (Halliwell and
Aruoma, 1991). In high concentrations, it is believed that it can induce cellular death or
apoptosis (Barbouti et al., 2002). The main mechanism of H2O2 toxicity in oxidative stress
is the formation of a highly reactive species as hydroxyl radical (HO�) in the presence of
transition metal ions or via other mechanisms (Halliwell and Gutteridge, 2000).
The t-BOOH is also an important ROS since it generates the peroxil radical (ROO�),
which causes lipid peroxidation and damage to DNA (Halliwell and Gutteridge, 2000). The
reduction of either H2O2 or t-BOOH concentration can therefore decrease the formation of
HO� or ROO� radicals and consequently lowering oxidative damage generation. One may
suggest then the protective effect of ebselen observed in V79 and Jurkat cells for oxidative
damage induced by both H2O2 e t-BOOH is probably due to the reduction of the
intracellular concentration of these oxidative agents via glutathione perosidase-like activity
of the organoselenium compound. These results also suggest that ebselen has a strong
protective ability not only against inorganic but also against organic hydroperoxides. The
exact mechanism, however, is yet to be determined.
51
In agreement with our results, it has also been shown in human hepatoma cell lines
(HepG2) that ebselen is capable of reducing the H2O2 cytotoxicity and DNA damage
(Yang et al. 1999).
The results of mutagenesis analysis using the S. cerevisiae haploid strain XV185-14c
(Table 3) demonstrate that this organoselenium compound is clearly neither cytotoxic nor
mutagenic. In this concern, some previous studies confirm that organoselenium compounds
are less toxic and mutagenic in similar doses than inorganic selenium compounds
(Bronzetti et al., 2001).
On the other hand, the organoselenium diphenyl diselenide (DPDS) is able to induce
frameshift mutation in S. typhimurium and haploid yeast and to increase crossing over and
gene conversion frequencies in diploid strains of S. cerevisiae only during cellular growth,
suggesting that this eletrophilic compound with aromatic planar structure is a weak
intercalating agent (Rosa et al. 2004).
One possible explanation for the different behavior between these two compounds is
the fact that ebselen, even possessing a planar structure, is not able to either interact or
intercalate to DNA, at least in non-growing conditions. Moreover, its selenium moiety is
not liberated during biotransformation (Sies, 1993). More importantly, the high antioxidant
property of this compound can prevent the formation of ROS that could be the cause of the
genotoxic effects.
Reinforcing this hypothesis, Table 4 shows the antioxidant effects of ebselen in vivo,
using different S. cerevisiae strains, proficient and deficient in superoxide dismutase
enzymes. The protective effect is only observed for H2O2 treatment, but not for paraquat,
which is in agreement with previous in vitro reports showing the specificity of ebselen
against hydroperoxides (reviewed by Nogueira et al. 2004). Besides, it indicates that the
compound probably does not induce any other antioxidant defense that could protect the
cells from the damage induced by paraquat. Therefore, this suggests that the most probable
action mechanism is via ROS interaction and less probable via an adaptive response. The
sod2� mutant, which is deficient in mitochondrial superoxide dismutase (Mn-Sod), was
highly protected by ebselen against the toxic effects produced by H2O2. It is important to
remark that the experiments were done in stationary phase where high amounts of ROS are
generated due to the aerobic metabolism (Jamieson, 1998), and therefore the presence of a
functional mitochondrial enzyme is very much required. Based on the fact that ebselen is a
52
glutathione-peroxidase mimic compound (reviewed by Nogueira et al. 2004), and that the
GPx enzyme is more active than catalase in the reduction of H2O2 generated in the
mitochondria (Halliwell and Gutteridge, 2000), the highest protection observed in the
strain lacking the mitochondrial Sod is thus not surprising. However, this effect was not
observed for the double mutant sod1�sod2� probably because additional defensive
mechanisms are switched on in this strain.
The pro-oxidative effect produced by high doses of ebselen was mainly observed in
WT and sod2 mutant treated with paraquat. Since this agent generates the superoxide
radical, that needs the Sod enzymes to be detoxified to H2O2, strains lacking Sod produce
less amounts of H2O2, which is an important substrate for the glutathione peroxidase-like
activity of ebselen. Consequently, ebselen binds to glutathione (GSH) but can not complete
its redox cycle, by lacking hydroperoxides and thus sensitizing the cell to the damaging
effects of ROS. This hypothesis can also be true for the wild type strain, since other
defense mechanisms, such as catalase and GPx, can reduce the H2O2 levels generated by
superoxide dismutase activity present in this cell, leading to a cellular redox imbalance.
More recently, Rosa et al (2004) have shown in yeast cells that DPDS acts as a pro-
oxidant by depleting free (GSH) in vitro as well as in vivo probably via adduct formation,
reducing the main antioxidant non-enzymatic cellular defense and thus sensitizing the cell
to the damaging effects of ROS.
In summary, the present findings suggest that ebselen, an organoselenium compound,
is capable of protecting against H2O2 and t-BOOH induced cytotoxicity and DNA damage
in both V79 and Jurkat cells. It is neither citotoxic nor induces mutagenicity in yeast
Saccharomyces cerevisiae and is able to protect against growth inhibition induced by H2O2
in yeast. Therefore, it may be used as a potent antioxidant to protect against oxidative
damage associated with elevated inorganic and organic peroxides production. Besides all
these interesting properties, more studies concerning clinical trials are still necessary for its
safe therapeutic application.
53
Acknowledgments
This work was supported by grants from the Universidade Luterana do Brasil –
ULBRA and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Brazil.
54
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58
Table 1. S. cerevisiae strains used in this study.
Strains Genotypes Source
EG103 (WT) MAT , leu2, his3�1, trp1-289, ura3-52, GAL, mal E.B. Gralla
EG110 (sod1�) Like EG103 except sod1::URA3 E.B. Gralla
EG118 (sod2�) Like EG103 except sod2::TRP1 E.B. Gralla
EG133
(sod1�sod2�)
Like EG103 except sod1::URA3, sod2::TRP1 E.B. Gralla
XV185-14c MAT�, ade2-2, arg4-17, his1-7, lys1-1, trp5-48,
hom3-10
R.C. Von Borstel
59
Table 2. Modulatory effect of ebselen in V79 and Jurkat cells, in absence or presence of oxidant agent. Treatment Damage index Damage Frequence (%) V79 Jurkat V79 Jurkat Modulatory effect of ebselen in absence of oxidant agents Ebselen 0 µMa 96.6 ± 27.5 74.3 ± 20.1 60.0 ± 0.0 45.0 ± 0.7 Ebselen 5 µM 66.6 ± 46.5 54.0 ± 24.4 52.0 ±1.4 35.0 ± 0.7 Ebselen 10 µM 47.6 ± 25.7 44.3 ± 5.0 47.0 ± 2.1 39.0 ± 2.1 Ebselen 50 µM 40.6 ± 11.6* 34.0 ± 7.9 * 38.0 ± 1.4* 29.0 ± 2.1* Modulatory effect of ebselen in presence of H2O2 Ebselen 0 µMa 171.3 ± 2.8 152.3 ± 6.0 70.0 ± 1.4 84.0 ± 1.4 Ebselen 5 µM 101.3 ± 8.3 ** 88.3 ± 7.5 ** 62.0 ± 1.4 78.0 ± 1.4 Ebselen 10 µM 89.6 ± 7.6 ** 55.0 ± 8.8 ** 60.0 ± 1.4 63.0 ± 0.7 Ebselen 50 µM 112.0 ± 7.2 ** 60.3 ± 12.8 ** 66.0 ± 1.4 72.0 ± 1.4 Modulatory effect of ebselen in presence of t-BOOH Ebselen 0 µMa 376.3 ± 17.8 316.0 ± 33.1 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 Ebselen 5 µM 335.3 ± 12.7 264.0 ± 39.9 97.0 ± 1.5 100.0 ± 0.0 Ebselen 10 µM 192.6 ± 23.6 ** 224.3 ± 48.3 92.0 ± 4.0 100.0 ± 0.0 Ebselen 50 µM 301.6 ± 54.8 304.6 ± 49.0 99.0 ± 0.5 100.0 ± 0.0 a Negative control. Results of three independent experiments. Mean is calculated for 100 cells (50 cells on two slides). Significances indicated refer the significance level compared to the respective control (* P<0.05; ** P<0.01).
60
Table 3. Induction of point mutation (his1-7), ochre allele (lys1-1) and frameshift (hom3-10) mutations in haploid XV185-14c strain of S. cerevisiae, after ebselen treatment during 2h in non-growth conditions and stationary phase. Agent Treatment Survival
(%) His 1/107survivorsa
Lys 1/107survivorsb
Hom 1/107survivorsa
0 µg/mLc 100 6.30 ± 1.0e 3.23 ± 6.2e 1.02 ± 1.7e
4NQOd 0.5 µg/mL 75.29 82.57 ± 5.5 11.99 ± 1.0 20.03 ± 1.0 Ebselen 5 µM 86.54 7.21 ± 2.3 2.38 ± 3.2 1.18 ± 1.0 10 µM 80.91 8.00 ± 3.5 3.36 ± 1.7 1.05 ± 1.0 50 µM 97.10 6.42 ± 2.8 3.33 ± 4.3 1.40 ± 1.7 100 µM 81.43 8.78 ± 1.7 4.39 ± 2.0 1.04 ± 2.0 a Locus-specific revertants; b Locus non-specific revertants (forward mutation); c Negative control; d Positive control ; e Mean and standard deviation from three independent experiments.
61
Table 4. Growth inhibition assay (central disc) in wild type and superoxide dismutase mutants treated with ebselen in the absence and presence of oxidant agents. WT sod1� sod2� sod1� sod2� DMSO + H2Oa 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 Sensitivity to H2O2 Ebselen 0µM 9.5 ± 1.1 8.5 ± 1.5 9.7 ± 0.8 9.5 ± 1.1 Ebselen 10 µM 8.6 ± 1.4 8.0 ± 1.7 7.8 ± 0.9 * 8.7 ± 0.7 Ebselen 40 µM 8.6 ± 0.4 8.6 ± 1.4 7.4 ± 1.2 ** 8.4 ± 1.0 Ebselen 70 µM 7.5 ± 1.1 * 7.2 ± 1.7 7.6 ± 1.0 * 8.1 ± 1.5 Ebselen 100 µM 8.4 ± 1.3 9.7 ± 1.2 7.4 ± 0.8 ** 9.7 ± 1.8 Ebselen 130 µM 8.1 ± 2.1 9.1 ± 2.2 8.9 ± 1.6 9.7 ± 1.0 Sensitivity to Paraquat Ebselen 0µM 1.1 ± 1.3 10.2 ± 2.7 8.5 ± 1.3 11.1 ± 0.6 Ebselen 10 µM 4.6 ± 1.8 * 9.0 ± 2.1 10.4 ± 1.6 10.8 ± 1.5 Ebselen 40 µM 1.9 ± 2.3 6.1 ± 0.5 * 6.0 ± 1.9 7.9 ± 0.7 * Ebselen 70 µM 4.3 ± 1.9 7.7 ± 1.9 9.5 ± 2.6 9.2 ± 2.7 Ebselen 100 µM 8.4 ± 2.2 ** 9.9 ± 1.4 12.8 ± 1.1 ** 14.0 ± 2.8 Ebselen 130 µM 11.1 ± 2.5 ** 10.9 ± 3.2 11.8 ± 1.1 * 13.9 ± 1.7 Values in table represent the growth inhibition (mm) in growth inhibition assay. a Negative control. Significances indicated refer the significance level compared to the respective control (* P<0.05; ** P<0.01).
62
V79
0.0 5.0 10.0 50.00
100
200
300
400V79V79 H2O2V79 t-BOOH
** ** **
**
*
Ebselen µµµµM
Dam
age
inde
x (0
- 40
0)
Jurkat
0.0 5.0 10.0 50.00
100
200
300
400JurkatJurkat H2O2Jurkat t-BOOH
****
***
Ebselen µµµµM
Dam
age
inde
x (0
- 40
0)
Figure 1. DNA damage measured by comet assay in V79 (A) and Jurkat (B) cells exposed to ebselen (0, 5, 10 and 50µM) for 2h at 37ºC with subsequent treatment with oxidant agents (H2O2 and t-BOOH) for 30min at 37ºC. The figure shows mean results from three independent experiments. The number of cells analyzed in each treatment was 100 (50 cells on two slides). Significances indicated refer the significance level compared to the respective control (* P<0.05; ** P<0.01).
A
B
V79
0.0 5.0 10.0 50.00
15
30
45
60
75damage0damage1damage2damage3damage4
Ebselen µµµµM
Dam
age
freq
uenc
e (%
)
V79 - H2O2
0.0 5.0 10.0 50.00
15
30
45
60
75damage0damage1damage2damage3damage4
Ebselen µµµµM
Dam
age
freq
uenc
e (%
)
V79 - t-BOOH
0.0 5.0 10.0 50.00
15
30
45
60
75damage0damage1damage2damage3damage4
Ebselen µµµµM
Dam
age
freq
uenc
e (%
)
A
B
C
Figure 2. Distribution of damage classes (0 – undamaged to 4 – maximum damage) in V79 cells, treated with different doses of Ebselen, in the absence and presence of oxidant agents. (A) ebselen; (B) ebselen + H2O2; and (C) ebselen + t-BOOH.
64
Jurkat
0.0 5.0 10.0 50.00
15
30
45
60
75damage0damage1damage2damage3damage4
Ebselen µµµµM
Dam
age
freq
uenc
e (%
)
Jurkat - H2O2
0.0 5.0 10.0 50.00
15
30
45
60
75damage0damage1damage2damage3damage4
Ebselen µµµµM
Dam
age
freq
uenc
e (%
)
Jurkat - t-BOOH
0.0 5.0 10.0 50.00
15
30
45
60
75damage0damage1damage2damage3damage4
Ebselen µµµµM
Dam
age
freq
uenc
e (%
)
A
B
C
Figure 3. Distribution of damage classes (0 – undamaged to 4 – maximum damage) in Jurkat cells, treated with different doses of Ebselen, in the absence and presence of oxidant agents. (A) ebselen; (B) ebselen + H2O2; and (C) ebselen + t-BOOH.
4 DISCUSSÃO GERAL
O selênio é um elemento traço essencial para o crescimento e desenvolvimento de
organismos. A necessidade nutricional de quantidades de selênio na alimentação é
reconhecida há muitos anos (Rayman, 2000). Porém, sua ação como antioxidante era
desconhecida até ser descoberto que o selênio está presente em enzimas de várias famílias,
incluindo a glutationa peroxidase e tioredoxina redutase (Köhrle et al., 2000). Ele atua
como um centro redox, ajudando no controle do estado redox intracelular (Allan et al.,
1999), pela redução de peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos, que causam danos a
lipídios e fosfolipídios, para produtos inofensivos como água e álcoois. Esta função ajuda a
manter a integridade da membrana e reduz a probabilidade de propagação de danos
oxidativos a biomoléculas (Néve, 1996). Durante algum tempo, foi considerado um veneno
em potencial, sendo um agente carcinogênico. Atualmente, uma série de compostos
contendo selênio é sintetizada com o intuito de encontrar novas moléculas antioxidantes,
antitumorais, inibidores enzimáticos, imunomoduladores entre outros (Flohé et al., 2000).
A glutationa peroxidase, uma selenoenzima, é uma das enzimas do sistema
antioxidante de mamíferos, que reduz H2O2 e outros hidroperóxidos. Já é sabido que o
selênio, um componente essencial dos sítios ativos de glutationa peroxidase, é responsável
por seqüestrar ERO e proteger biomembranas de estresse oxidativo. Embora possuindo
potente atividade antioxidante, é limitado para o uso clínico devido a sua instabilidade,
baixa disponibilidade e fácil metabolismo. Então algumas pequenas moléculas
organoselenadas estão sendo sintetizadas com atividade de GPx (Mugesh et al., 2001).
O crescimento rápido, nos últimos anos, do papel de ERO em patologias, trouxe
idéias novas para a terapia de uma variedade de doenças. Assim, a ação antioxidante que
compostos organoselenados sintéticos possuem, pode ser melhor que a ação de
antioxidantes clássicos. Desse modo, vários estudos estão sendo realizados (in vitro e in
vivo), descrevendo a ação antioxidante do ebselen (mimético de GPx) e outros compostos
organoselenados em diferentes modelos experimentais (Sies e Arteel, 2000; Tiano et al.,
2003; Nogueira et al., 2004).
66
Com o objetivo de ampliar o conhecimento das ações biológicas do ebselen, este
trabalho investigou o mecanismo pelo qual o ebselen interfere no estado redox celular,
utilizando culturas de células de mamífero V79 e Jurkat, avaliando a atividade genotóxica
e antigenotóxica através do Ensaio Cometa. Também se analisou o potencial antioxidante
do composto ebselen, através de ensaios in vivo, utilizando-se linhagens de levedura S.
cerevisiae proficientes e deficientes em defesas antioxidantes, bem como o possível efeito
mutagênico deste derivado.
Nossos resultados com o Ensaio Cometa demonstraram que o ebselen protege as
linhagens de células de mamífero V79 e Jurkat contra os danos ao DNA induzidos pelos
hidroperóxidos inorgânico (H2O2) e orgânico (t-BOOH). A provável ação protetora do
ebselen contra danos ao DNA nestas linhagens, deve-se ao fato deste composto
organoselenado diminuir a concentração desses agentes oxidantes, reduzindo assim a
formação de radicais livres e, consequentemente, de danos oxidativos ao DNA. É
importante salientar que mesmo sem a adição de agentes oxidantes, observa-se uma
diminuição na freqüência de danos, de forma dose-dependente, nestes dois tipos celulares
(Figuras 2A e 3A, capítulo I), o que novamente reforça a idéia de que este composto tenha
a capacidade de diminuir a formação de ERO gerada intracelularmente, de acordo com a
proposta de que ele atua de forma semelhante à enzima glutationa peroxidase, a qual
precisa de GSH para detoxificar hidroperóxidos.
Resultados semelhantes foram obtidos por Blasiak e colaboradores (2003),
mostrando que o ebselen dimimui de forma significativa os níveis de danos ao DNA, em
células de linfócitos humanos expostas a alloxan, um indutor de diabetes em modelos
animais, via geração de radicais livres. Um estudo com células de hepatoma humano
(HepG2), realizado por Yang e colaboradores (1999) também demonstrou que o ebselen
reduz de forma significativa a citotoxicidade e os danos ao DNA induzidos por H2O2
nestas linhagens. Além disso, apresenta a capacidade de reduzir a peroxidação lipídica de
forma dose-dependente. Os mesmos autores, em 2000, demonstraram que o ebselen,
também é capaz de induzir apoptose nesta mesma linhagem celular, sendo o efeito
relacionado com a sua habilidade em depletar tióis.
67
O Ebselen já é provado ser um potente antioxidante nos diversos modelos celulares
testados. Os principais resultados obtidos são: (i) demonstra efeito antioxidante com
significante proteção contra dano isquêmico, em um modelo de oclusão da artéia cerebral
mediana (Imai et al., 2003); (ii) tem efeito neuroprotetor na toxicidade induzida por
glutamato em culturas de neurônios cerebelares (Porciúncula et al., 2001); (iii) atua como
mecanismo de neuroproteção pela redução de H2O2 e hidroperóxidos orgânicos, via
interação com o sistema tioredoxina (Zhao et al., 2002); (iv) em interação com cisplatina,
induz nefroproteção devido à redução na depleção dos níveis de GSH nos rins (Husain et
al., 1998); (v) em modelo de sobrecarga férrica crônica, aumenta o efeito antioxidante no
tecido cardíaco, pela análise dos níveis de GSH, previnindo a formação de ERO pela
detoxificação de H2O2 (Davis e Bartfay, 2004); (vi) e induz apoptose em linhagens de
células de hepatoma humano, pela sua habilidade em depletar tióis e alterar a transição da
permeabilidade mitocondrial (Yang et al., 2000). Além da habilidade para reduzir
hidroperóxidos, ebselen mostrou ser um eficiente antiinflamatório em humanos, pois
converte leucotrienos para sua forma biologicamente inativa (Nogueira et al., 2004),
bloqueando a cascata inflamatória, pelo decréscimo de peroxidação lipídica e aumento das
defesas antioxidantes (Ocakci et al., 2006).
Nosso trabalho também teve como objetivo estudar a interferência do ebselen no
estado redox celular através de ensaios in vivo, utilizando linhagens da levedura S.
cerevisiae deficientes em defesas antioxidantes. A S. cerevisiae consiste em um sistema
modelo ideal para estudo de danos oxidativos em eucariotos, por várias razões, dentre elas:
(i) a simplicidade do cultivo e caracterização genética; (ii) fases de crescimento bem
definidas e controláveis; (iii) mecanismos de defesa antioxidante semelhantes aos humanos;
e (iv) principalmente, a possibilidade de construção de mutantes nulos em determinadas
defesa antioxidantes, como Sod, GPx, CAT e GSH (Longo et al., 1999; Costa e Ferreira,
2001). As deficiências na enzima superóxido dismutase em linhagens mutantes de S.
cerevisiae estão associadas com vários defeitos bioquímicos, indicando que genes de Sod
em eucariotos podem proteger contra danos produzidos por ERO. S. erevisiae contém Sod-
CuZn (produto do gene de SOD1) no citosol e Sod-Mn (produto do gene de SOD2) na
mitocôndria. Estas enzimas catalisam a decomposição de O2•-, produzindo O2 e H2O2.
Junto com antioxidantes de moléculas pequenas como glutationa e ascorbato, outras
68
enzimas antioxidantes como catalases e peroxidases, e proteínas que quelam metais como
metalotioneína, permitem a sobrevivência para aeróbios minimizando dano oxidativo
(Gralla e Kosman, 1992).
No capítulo I, utilizando linhagens proficientes e deficientes em Sod (sod1�, sod2� e
sod1� sod2�), mostrou-se proteção do ebselen contra inibição de crescimento, nas doses
de 10 à 100 µM, apenas na linhagem mutante sod2�, quando exposta a H2O2. Porém, a
mesma linhagem, assim como a selvagem, quando exposta a paraquat, nas doses de 100 e
130 µM de ebselen, apresentou aumento da inibição de crescimento de forma significativa.
Este resultado demonstra, conforme estudos realizados por Parnham e Sies (2000), que o
ebselen não apresenta atividade antioxidante contra radicais superóxido e sim aumenta a
inativação de hidroperóxidos em diferentes tecidos com risco de danos oxidativos. O
acúmulo do radical superóxido nas mutantes sod� pode levar a um aumento de Fe (II)
intracelular, originando o radical hidroxil, por participação na reação de Fenton e, dessa
forma, aumentar o estresse oxidativo intracelular.
Outro dado interessante que foi obtido neste trabalho, e está representado na figura 1
do apêndice, é a diminuição na sobrevivência da linhagem gsh1� de S. cerevisiae, quando
tratada com a dose de 50 µM de ebselen. Este resultado confirma que a GSH é um
substrato importante para a ação do ebselen, o que está de acordo com a proposta de que
ele atue de forma semelhante à enzima GPx, a qual precisa de GSH para detoxificar
hidroperóxidos.
Estudos recentes mostraram que o diseleneto de difenila (DPDS), também um
composto organoselenado, apresenta efeito mutagênico na levedura S. cerevisiae, mas
apenas em condições de crescimento (Rosa et al., 2004). Além disso, esse composto pode
atuar como pró-oxidante (Rosa et al., 2005) na levedura, por depletar níveis de GSH
intracelulares. Os radicais livres gerados em metabolismo aeróbico normal, como o radical
hidroxil, podem atacar o DNA, causando dano oxidativo (Barbouti et al., 2002). É possível
que o efeito mutagênico causado pelo DPDS em S. cerevisiae seja pela intercalação ao
DNA, uma vez que compostos químicos eletrofílicos, com topologia planar são capazes de
intercalar-se entre as bases do DNA (Snyder e Arnone, 2002). Em contraste a este
69
composto, o ebselen não mostrou ser mutagênico, pelo menos nas condições experimentais
testadas neste trabalho. Além disso, não apresentou citotoxicidade em linhagens
proficientes e deficientes em defesas antioxidantes. Essa resposta pode ser devido ao fato
dos centros nucleofílicos de selênio não estarem disponíveis, dificultando a sua
intercalação ao DNA, além do ebselen apresentar atividade antioxidante mais pronunciada.
Entretanto, para confirmar esta hipótese, é necessário que se teste também a
mutagenicidade em condições de crescimento.
Substâncias que atuam na modulação do estado redox celular, dentre elas os
compostos organoselenados, merecem uma atenção especial, uma vez que podem exercer
efeitos anti ou pró-oxidantes. Dessa forma, apesar das diversas propriedades biológicas já
demonstradas para o ebselen, principalmente as relacionadas com a sua alta capacidade
antioxidante, mais estudos clínicos e pré-clínicos ainda são necessários para que se possa
garantir o seu uso terapêutico de forma segura e eficaz.
70
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho permitem-nos concluir que:
• O ebselen protege células de mamíferos, como V79 (fibroblastos de pulmão de
hamster Chinês) e Jurkat (linfócitos T humanos), contra danos ao DNA induzidos
por peróxidos inorgânicos (H2O2) e orgânicos (t-BOOH);
• Além de proteger o DNA de células de mamíferos da ação de substâncias
oxidantes, ele é capaz de diminuir os danos endógenos originados do próprio
metabolismo celular, de forma dose-dependente;
• O ebselen não é citotóxico e nem induz mutação gênica na linhagem XV185-14c de
S. cerevisiae, provavelmete pelo fato de ser mais estável que outros compostos
organoselenados e, portanto, não interagir diretamente com o DNA;
• Em linhagens de S. cerevisiae deficientes em superóxido dismutase mitocondrial
(sod2�), exerce um significativo efeito antioxidante contra danos induzidos por
H2O2;
• Na presença de paraquat, um gerador do radical superóxido, o ebselen não exerce
efeito antioxidante, sendo que, doses mais altas, aumentam a inibição de
crescimento, caracterizando um efeito pró-oxidante nas linhagens sod2� e WT.
71
6 PERSPECTIVAS
Para uma melhor compreensão do mecanismo de ação do ebselen, alguns aspectos
ainda poderiam ser investigados na tentativa de complementar este trabalho, como:
• Avaliar o potencial antimutagênico do ebselen, utilizando linhagens de S.
cerevisiae expostas a diferentes compostos mutagênicos;
• Verificar a possibilidade de efeito mutagênico do ebselen através do teste de Ames,
com linhagens de Salmonella typhimurium que detectam mutações induzidas por
radicais livres;
• Verificar a resposta em mutantes de S. cerevisiae, deficientes em vias de reparo de
DNA, quando tratados com ebselen;
• Quantificar a GPx, a CAT e a GSH nas células tratadas com ebselen e com ebselen
mais agentes oxidantes, dentre eles H2O2 e t-BOOH.
72
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8 APÊNDICE
A tabela 1 demonstra o resultado do teste qualitativo (em gotas), que avalia o
crescimento, em fase estacionária, das linhagens selvagem (WT) e mutantes em superóxido
dismutase (sod1�, sod2� e sod1� sod2�), bem como de linhagens mutantes em glutationa
(gsh1� e gsh2�) tratadas com diferentes concentrações de ebselen (0, 5, 10 e 50 µM), por
2h, sob agitação, à 30ºC. Após o tratamento, as linhagens foram 5 vezes diluídas em um
fator de 10 com tampão fosfato (PBS), até atingir a concentração desejada. Então, 10µL de
cada diluição foi plaqueada na forma de gota em meio sintético completo (SC), na ausência
e presença de agentes oxidantes (H2O2 e t-BOOH), em diferentes doses (0.5 e 1mM de
H2O2 e 0.5 e 0.75mM de t-BOOH). Para as linhagens mutantes em glutationa, o meio foi
suplementado com glutationa (20mg/mL). As placas foram incubadas por 2 dias à 30ºC. Os
resultados não revelaram efeito protetor do ebselen nas linhagens expostas aos agentes
oxidantes, com este tipo de meio utilizado.
A figura 1 é uma representação do teste em gotas descrito acima. É interessante
observar que a dose de 50µM de ebselen diminui a sobrevivência da linhagem gsh1, na
ausência dos agentes oxidantes. Este resultado sugere que a glutationa é um substrato
importante para a ação do ebselen, o que está de acordo com a proposta de que ele atue de
forma semelhante à enzima glutationa peroxidase, a qual precisa de GSH para detoxificar
hidroperóxidos. Este efeito já não foi observado com o mutante gsh2, o qual não teve
diferença de reposta com o aumento da dose do composto. Nestes experimentos
preliminares, não foi observado efeito protetor do ebselen nas linhasgens testadas com
H2O2 e t-BOOH.
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Tabela 1. Efeito no crescimento de linhagens de S. cerevisiae, tratadas com diferentes concentrações de ebselen, na ausência ou presença de agentes oxidantes, pelo teste em gotas.
Tratamento Linhagens WT sod 1� sod 2� sod 1�
sod 2� gsh 1� gsh 2�
Controle negativo
+++ +++ +++ +++ +++ +++
Sensibilidade ao H2O2 0.5 mM Ebselen 0 µM +++ +++ +++ + + +++ Ebselen 5 µM +++ +++ +++ + + +++ Ebselen 10 µM +++ +++ +++ ++ + +++ Ebselen 50 µM +++ +++ +++ + + +++ Sensibilidade ao H2O2 1 mM Ebselen 0 µM ++ + ++ + - +++ Ebselen 5 µM ++ + ++ + - +++ Ebselen 10 µM ++ + ++ - - + Ebselen 50 µM ++ + ++ + + ++ Sensibilidade ao t-BOOH 0.5 mM Ebselen 0 µM +++ +++ +++ +++ + ++ Ebselen 5 µM +++ +++ +++ +++ + + Ebselen 10 µM +++ +++ +++ +++ + ++ Ebselen 50 µM +++ +++ +++ +++ + + Sensibilidade ao t-BOOH 0.75 mM Ebselen 0 µM ++ +++ +++ +++ + ++ Ebselen 5 µM +++ ++ ++ ++ + + Ebselen 10 µM +++ +++ +++ +++ + ++ Ebselen 50 µM +++ ++ ++ +++ + + +++, crescimento sem inibição; ++, crescimento parcial; +, forte inibição de crescimento; -, completa inibição de crescimento. Controle negativo não tratado com agentes oxidantes.
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SOD (WT) sod1� sod2� sod1� sod2�
Controle H2O2 1mM H2O2 1mM H2O2 0.5 mM
gsh1� gsh1� gsh2� gsh2�
Control t-BOOH 0,5mM Control t-BOOH 0,75mM
Figura 1. Efeitos do ebselen no crescimento de linhagens de S. cerevisiae na ausência e presença de agentes oxidantes. As concentrações de ebselen utilizadas foram 0, 5, 10, 50 e 100µM (concentração de 100µM apenas para as linhagens Sod). Os agentes oxidantes utilizados foram H2O2 e t-BOOH. Foram feitas 5 diluições em PBS das culturas de levedura tratadas com ebselen (1x108 até 1X103) e plaqueadas em um volume de 10µL em meio SC completo.
Controle t-BOOH 0.5mM Controle t-BOOH 0.75mM