efeito do veneno bruto e da l-aminoácido oxidase de bothrops

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops

pirajai em clulas BCR-ABL positivas

*Verso corrigida da Dissertao apresentada ao Programa de

Ps-Graduao em Biocincias Aplicadas Farmcia. A verso original

encontra-se disponvel na Faculdade de Cincias Farmacuticas de

Ribeiro Preto/USP*.

Sandra Mara Burin

Ribeiro Preto

2011

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops

pirajai em clulas BCR-ABL positivas

Ribeiro Preto

2011

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biocincias Aplicadas Farmcia para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias rea de Concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia.

Orientado(a): Sandra Mara Burin

Orientador(a): Profa. Dra. Fabola Atti de Castro

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Burin, Sandra Mara

Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai em clulas Bcr-Abl positivas. Ribeiro Preto, 2011.

71 p. : Il. ; 30cm Dissertao de Mestrado, apresentada Faculdade de Cincias

Farmacuticas de Ribeiro Preto/USP. rea de concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia.

Orientadora: Castro, Fabola Atti. 1. Leucemia Mielide Crnica. 2. BCR-ABL 3. Apoptose 4. L-aminocido

oxidase 5. Bothrops pirajai.

FOLHA DE APROVAO

Sandra Mara Burin Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai em clulas Bcr-Abl positivas

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________________________________________

Instituio: _________________________Assinatura: _________________

Prof. Dr. _____________________________________________________


Prof. Dr. _____________________________________________________


Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biocincias Aplicadas em Farmcia para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias rea de Concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia.

Orientador(a): Profa. Dra. Fabola Atti de Castro

Dedico este trabalho...

... aos meus pais com muito carinho

AGRADECIMENTOS

Deus por ter me dado esta oportunidade e ter me guiado em todos os

momentos para que eu chegasse at aqui.

Profa Dra Fabola Atti de Castro, minha orientadora, pela amizade e

ensinamentos, essenciais para meu crescimento cientfico e pessoal, pela

ateno, dedicao e por estar sempre presente durante o decorrer deste

trabalho.

Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto da Universidade de

So Paulo, pela oportunidade da realizao do mestrado.

Ao CNPq e Fapesp pelo apoio financeiro, concedido para a realizao desta

pesquisa.

Profa Dra Suely Vilela e Dr. Andreimar Soares pela colaborao com este

projeto, cedendo-nos os venenos .

Dra. Simone Kashima Haddad, por disponibilizar o Laboratrio de Biologia

Molecular do Hemocentro de Ribeiro Preto para a realizao dos experimentos.

Fabiana, responsvel pela Citometria de Fluxo, por sua grande colaborao,

essencial durante todo o curso.

Luciana, tcnica do laboratrio de Hematologia da FCFRP, pela amizade e

ajuda com os experimentos, principalmente com os Westerns.

s amigas Raquel, Natlia, Lvia, Aline e Renata do laboratrio de Hematologia

da FCFRP, pela amizade, apoio e colaborao.

Lorena e Maria Augusta, minhas grandes amigas e companheiras desde a

Faculdade por tantos momentos de convvio e experincias trocadas.

s novas amigas Aline e Luiza pela amizade, fora e incentivo.

A todos os amigos e familiares que estiveram comigo durante esta jornada.

O importante no parar de questionar

(Albert Einstein)

i

RESUMO

BURIN, S.M. Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops

pirajai em clulas BCR-ABL positivas. 2011. 71f. Dissertao (Mestrado).

Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So

Paulo, Ribeiro Preto, 2011.

A leucemia mielide crnica (LMC) uma doena mieloproliferativa caracterizada citogeneticamente pela presena do cromossomo Philadelfia (Ph) e molecularmente pelo neogene bcr-abl1 que codifica a oncoprotena BCR-ABL com alta atividade de tirosina-quinase. A clula leucmica BCR-ABL+ apresenta baixa adeso ao estroma medular, resistncia apoptose e potencial mitognico exacerbado. A LMC possui curso evolutivo trifsico (fase crnica, acelerada e blstica) e seu tratamento pode ser realizado por meio de diferentes modalidades teraputicas, destacando-se o mesilato de imatinibe (MI) que inibe a TK BCR-ABL induzindo altas taxas de remisso citogentica dos pacientes na fase crnica da doena. Apesar do MI ser eficiente, os pacientes na fase acelerada e blstica da doena so comumente refratrios a essa terapia e na fase crnica h casos de resistncia ao MI descritos. Nesse contexto, potenciais novos frmacos so investigados para melhorar a eficincia da terapia da LMC. Nesse estudo, investigamos o efeito do veneno bruto (VB) e da enzima L-amino-cido-oxidase (LAAO) da Bothrops pirajai em desencadear apoptose em clulas BCR-ABL+. A apoptose das clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL foi quantificada pela deteco da percentagem de clulas com ncleos hipodiplides pela da citometria de fluxo e confirmada pela observao da ativao das caspases 3, 8 e 9 por western-blot. Os resultados obtidos indicam que a LAAO capaz de induzir apoptose em clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL por ativao das vias extrnseca e intrnseca. Alm disso, foi verificado que a LAAO diminui a fosforilao de BCR-ABL em clulas HL-60.BCR-ABL e quando associada ao MI potencializou a inibio da atividade quinase de BCR-ABL. Os dados da presente investigao indicaram ainda que a LAAO capaz de modular a expresso de bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w e c-flip, genes reguladores da apoptose celular. Apesar do pouco conhecimento acerca do mecanismo de ao dessa toxina, os dados obtidos sugerem que a LAAO possui o potencial de estimular a apoptose nas linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL e aumentar o efeito do inibidor da atividade quinase, MI, dados relevantes para estudos futuros associados a descrio de novos frmacos contra leucemia mielide crnica. . Palavras chaves: Leucemia Mielide Crnica, BCR-ABL, Apoptose, L-aminocido oxidase e Bothrops pirajai.

ii

ABSTRACT

Burin, S.M. Effect of Bothrops pirajai crude venom and L-amino acid

oxidase in BCR-ABL positive cells. 2011. 71f. Master. Faculdade de Cincias

Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto,

2011.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder cytogenetically

characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and molecularly

by bcr-abl1 neogene that encodes the BCR-ABL oncoprotein with high tyrosine

kinase (TK) activity. The leukemic cell BCR-ABL+ presents poor adhesion to bone

marrow stroma, resistance to apoptosis and exacerbated mitogenic potential. The

CML has a three-phase course (chronic, accelerated and blastic phase) and its

treatment can be performed by different therapeutic modalities, especially the

imatinib mesylate (IM) that inhibits the TK BCR-ABL inducing high rates of

cytogenetic remission in chronic phase. Although MI is effective, patients in

accelerated and blastic phases of the disease are often refractory to this therapy

and there are also cases of resistance to MI described in chronic phase. In this

context, potential new drugs are investigated to improve the efficiency of the

therapy of CML. In this study, we investigated the effect of crude venom (CV) and

of the enzyme L-amino acid oxidase (LAAO) from Bothrops pirajai in triggering

apoptosis in BCR-ABL+. The apoptosis of HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL was

quantified by detecting the percentage of cells with hypodiploid nuclei by flow

cytometry and confirmed by observation of the activation of caspases 3, 8 and 9

by Western blot. The results indicate that LAAO is able to induce apoptosis in HL-

60 cells and HL-60. BCR-ABL by activation of the extrinsic and intrinsic

pathways. Furthermore, it was found that LAAO decreases phosphorylation of

BCR-ABL in HL-60 cells. BCR-ABL when associated with MI potencialized the

inhibition of kinase activity of BCR-ABL. The data from this study also indicated

that the LAAO is able to modulate the expression of bad, bak, bax, bid, bimel, fas,

FasL, A1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w and c-flip, regulatory genes of apoptosis. Even

though there is little knowledge about the mechanism of action of this toxin, the

data obtained suggests that LAAO has the potential to stimulate apoptosis in HL-

60 lines and HL-60. BCR-ABL and increase the effect of the inhibitor of protein

kinase activity, MI, relevant data for future studies associated with the description

of new drugs against chronic myeloid leukemia.

Keywords: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL, apoptosis, L-amino acid oxidase

and Bothrops pirajai.

iii

RESUMEN

BURIN, S.M. Efecto del veneno bruto y de la L-aminocido oxidasa de

Bothrops pirajai en clulas BCR-ABL positivas. 2011. 71f. Tesis (Maestra).

Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So

Paulo, Ribeiro Preto, 2011.

La leucemia mieloide crnica (LMC) es una enfermedad mieloproliferativa

caracterizada citogenticamente por la presencia del cromosoma Philadelfia (Ph)

y molecularmente por el neogen bcr-abl1 que codifica la oncoprotena BCR-ABL con alta

actividad de tirosina-cinasa. La clula leucmica BCR-ABL+ presenta baja adhesin al

estroma medular, resistencia a la apoptosis y el potencial mitognico alterado. La LMC

posee un curso evolutivo trifsico (fase crnica, acelerada y blstica) y su tratamiento

puede ser realizado por medio de diferentes modalidades teraputica, destacndose el

mesilato de imatinibe (MI) que inhibe la TK BCR-ABL induciendo altas tasas de remisin

citogentica de los pacientes en la fase crnica de la enfermedad. A pesar del MI ser

eficiente, los pacientes en la fase acelerada y blstica de la enfermedad son

comnmente reflejados a esa terapia y en la fase crnica hay casos de resistencia al MI

descriptos. En este contexto, potenciales nuevos frmacos son investigados para

mejorar la eficiencia de la terapia de la LMC. En este estudio, investigamos el efecto del

veneno bruto (VB) y de la enzima L-amino-cido-oxidasa (LAAO) de Bothrops pirajai en

desencadena apoptosis en clulas BCR-ABL+. La apoptosis de las clulas HL-60 y HL-

60.BCR-ABL fue cuantificada por la deteccin de clulas nucleadas hipodiploides por

citometra de flujo y confirmada por la activacin de las caspasas 3, 8 y 9 por western-

blot. Los resultados obtenidos indicaron que la LAAO es capaz de inducir la apoptosis

en clulas HL-60 y HL-60.BCR-ABL por activacin de las vas intrnsecas y extrnsecas.

Adems de esto, fue verificada que la LAAO disminuye la fosforilacin de BCR-ABL en

clulas HL-60.BCR-ABL y cuando est asociada al MI fue potencializada la inhibicin de

la actividad cinasa de BCR-ABL. Los datos de la presente investigacin indicaron que la

LAAO es capaz de modular la expresin de: bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2,

bcl-xl, bcl-w y c-flip, los cuales son genes reguladores de la apoptosis celular. Apesar

del poco conocimiento acerca del mecanismo de la accin de esta toxina, los datos

obtenidos sugieren que la LAAO posee el potencial de estimular la apoptosis en los

linajes celulares HL-60 y HL-60.BCR-ABL, as como tambin aumenta el efecto del

inhibidor de la actividad cinasa, MI, datos relevantes para estudios futuros asociados a

la descripcin de nuevos frmacos contra la leucemia mieloide crnica.

Palabras claves: Leucemia Mieloide Crnica, BCR-ABL, Apoptosis, L-aminocido oxidasa y Bothrops pirajai.

iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Caritipo de paciente com LMC indicando a presena do Cromossomo Philadphia..................................................................................

4

Figura 2 - Esquema representando a via extrnseca da apoptose.................. 8

Figura 3 Esquema representando a via intrnseca da apoptose................... 9

Figura 4 Anlise da percentagem dos ncleos hipodiplides de clulas HL-60.BCR-ABL pelo mtodo HFS por citometria fluxo..........................................

20

Figura 5 - RNAs extrados de amostras de HL-60 e HL-60 BCR-ABL cultivadas na presena e ausncia da LAAO e submetidos eletroforese em gel red 1,5%.......................................................................................................

23

Figura 6 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)...........................................

29

Figura 7 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)...................................................

30

Figura 8 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.Bcr-Abl aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)............................

31

Figura 9 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)...................................................

32

0Figura 10 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase........................................

33

Figura 11 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.Bcr-Abl aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase...............................

34

Figura 12 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60.................... 35



Figura 15 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60.Bcr-Abl....... 36



Figura 18 - Anlise da porcentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO, MI e LAAO associada ao MI por 18h..........

38

Figura 19 Expresso da protena fosfotirosina, c-abl e de BCR-ABL em clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento, tratadas com MI, LAAO e LAAO associada ao MI por 18 horas............................................................................

41

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Seqncia dos oligonucleotdeos utilizados na amplificao dos

cDNAs das molculas envolvidas na apoptose celular, tamanho do

fragmento amplificado e temperatura de anelamento (TA)..............................

25

Tabela 2 - Concentrao dos oligonucleotdeos e Programa das reaes de

amplificao dos genes avaliados...................................................................

26

Tabela 3 - Expresso gnica em clulas HL-60 tratadas com LAAO nas

concentraes de 0,5 e 1,0g/mL....................................................................

43

Tabela 4 - Expresso gnica em clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com

LAAO nas concentraes de 1,0 e 1,5g/mL..................................................

45

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abl Ableson leukemia

ACT-D Actinomicina -D

APAF-1 Apoptosis Protease- Activator Facto1

ATP Trifosfato de adenosina

bad bcl-2 antagonist of the cell death

bak bcl-2 homologous antagonist / killer

bax bcl-2 associated x protein

bcl-xl bcl-2 related gene

bcl-w antiapoptotic bcl-2 family member

bcl-2 b-cell lymphoma

bcr Breakpoint cluster region

bcr-abl1 gene resultante da translocao t(9;22)q(34;11)

BCR-ABL protena resultante da expresso do gene bcr-abl1

bid bh3-interacting domain against

bim bcl-2 interacting mediator

BpirLAAO L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai

BSA Albumina de soro bovino

cDNA DNA complementar

CT - controle

DD death domain

vii

DISC Death Inducing Signaling Complex

DNA cido desoxirribonuclico

DMSO Dimetilssulfxido

DR Death receptor

FADD Fas- Associated Death Domain

Fas/CD95 receptor de morte

FasL Fas ligand

Flip Flice-inhibitory protein

H2O2 - Perxido de Hidrognio

HEPES - Hidroxietilpiperazina

HFS Hypotonic Fluorescent Solution

HL-60 linhagem celular de leucemia pr-mieloctica

HL-60.BCR-ABL linhagem HL-60 transfectada com o gene bcr-abl1

IAP Proteina Inibidora da Apoptose

IL - Interleucina

INF- Interferon

kDa quilodaltons

LAAO L-aminocido oxidase

LMC Leucemia Mielde Crnica

MI Mesilato de Imatinibe

Ph Cromossomo Philadelphia

viii

PI Iodeto de propdeo

PY - fosfotirosina

PVDF DifluoridoPolividileno

RNA cido Ribonuclico

STAT - Signal transducer and activator of transcription

STI571 Signal Transduction Inhibitor 571

TA Temperatura Ambiente / Temperatura de Anelamento do primer

TBS Salina tamponada com Tris

TK Tirosina quinase

TMO Transplante de Medula ssea

TNF Fator de necrose tumoral

Tris HCl Tris hidroclordrico

t(9;22)q(34;11) translocao entre os braos longos do crmossomos 9 e 22.

SUMRIO

1. INTRODUO................................................................................................. 2

1.1. Leucemia Mielide Crnica............................................................................ 2

1.1.1. Caractersticas Gerais................................................................................................ 2

1.1.2. Leucemia Mielide Crnica e o BCR-ABL............................................................... 3

1.1.3. Leucemia Mielide Crnica e Apoptose................................................................... 5

1.1.4. Tratamento da LMC..................................................................................... 9

1.2. Venenos, L-aminocido-oxidase, e Apoptose................................................ 11

2. OBJETIVOS..................................................................................................... 15

2.1. Geral............................................................................................................... 15

2.2. Especficos..................................................................................................... 15

3. MATERIAL E MTODOS................................................................................. 17

3.1. Linhagens celulares, veneno bruto e L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai.....................................................................................................................

17

3.2. Cultivo celular................................................................................................. 17

3.3. Ensaios de Induo de Apoptose.................................................................. 18

3.4. Deteco das caspases 3, 8 e 9 por western-blot......................................... 20

3.5. Deteco do efeito da associao do Mesilato de Imatinibe com a LAAO.....................................................................................................................

21

3.6. Extrao de RNA, sntese de cDNA e PCR em tempo real........................... 23

3.7. Anlise Estatstica.......................................................................................... 27

4. RESULTADOS.................................................................................................. 29

4.1. Induo de Apoptose da linhagem HL-60 pelo Veneno Bruto de Bothrops pirajai.....................................................................................................................

29

4.2. Induo de Apoptose na linhagem HL-60.BCR-ABL pelo Veneno Bruto de Bothrops pirajai................................................................................................................

30

4.3. Induo de Apoptose na linhagem HL-60 pela L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai......................................................................................................

32

4.4. Induo de Apoptose na linhagem HL-60.BCR-ABL pela L-aminocido

oxidase de Bothrops pirajai...........................................................................................................

33

4.5. Ativao das Caspases 3, 8 e 9 por western blot.................................................... 34

4.5.1. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-60........................ 35

4.5.2. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-

60.BCR-ABL..........................................................................................................

36

4.6. Deteco da percentagem de ncleos hipodiplides e da atividade de

fosfotirosina na linhagem HL-60.BCR-ABL tratada com Mesilato de Imatinibe e

L-aminocido oxidase.........................................................................................................

37

4.7. Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real................................... 41

5. DISCUSSO..................................................................................................... 47

5.1. Deteco do efeito da associao do Mesilato de Imatinibe com a L-

aminocido oxidase...............................................................................................

51

5.2. Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real................................... 54

6 . CONCLUSES................................................................................................ 57

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................... 59

INTRODUO

_______________________________________________________________Introduo 2

1. INTRODUO

1.1. Leucemia Mielide Crnica

1.1.1. Caractersticas Gerais

A Leucemia Mielide Crnica (LMC) uma doena mieloproliferativa,

resultante da expanso clonal de uma clula tronco hematopotica pluripotente

alterada (SAWYERS, 1999; FRAZER et al., 2006; MELO et al., 2007).

Caracteriza-se laboratorialmente por apresentar aumento da produo de

granulcitos maduros, culminando com a leucocitose exacerbada (CHEN, et al.,

2010). Constitui 14% de todas as leucemias e sua incidncia anual de 1 a 2 casos

por 100.000 pessoas, acometendo principalmente os homens em relao as

mulheres (na proporo de 2:1) e mais freqentemente indivduos na faixa etria

entre 45 e 55 anos (FADERL et al., 1999).

O nico fator de risco comprovado para a LMC a exposio radiao

ionizante (DOLL; SMITH, 1968; HEHLMANN et al., 2007).

Baseado em achados clnico-laboratoriais, a LMC apresenta trs estgios de

evoluo distintos: fase crnica, acelerada e blstica. A maioria dos pacientes com

LMC diagnosticada na fase crnica, na qual se observa a elevao do nmero de

granulcitos jovens que preservam suas funes (MELO et al., SHERBENOU;

DRUKER, 2007). Na fase crnica grande parte dos pacientes assintomtica (20-

40% dos casos) ou apresenta sinais e sintomas inespecficos, tais como fadiga,

anorexia, cansao e sudorese.

Os fentipos das fases acelerada e blstica so mais diversos quando

comparados a fase crnica (CHEN et al., 2010; WONG; WITTE, 2004).

A fase acelerada pode surgir em meses ou anos depois do diagnstico da

doena, dependendo principalmente da resposta do paciente ao tratamento

institudo na fase crnica. Esta fase caracteriza-se pelo aumento do nmero de

blastos e basfilos circulantes e alterao significante na contagem de trombcitos.

Na medula ssea h blastos, porm a contagem fica abaixo de 20% (COTTA e

BUESO-RAMOS, 2007).

_______________________________________________________________Introduo 3

A fase blstica caracteriza-se pelo aumento de blastos (>20%) na medula

ssea e sangue perifrico, leucocitose e basofilia no sangue perifrico, anemia e

trombocitopenia (FADERL et al., 1999). Nessa fase, ocorre falha na maturao dos

precursores mielides malignos, que frequentemente possuem anormalidades

citogenticas adicionais o que resulta na agudizao da LMC, a doena progride

para leucemia linfide ou mielide aguda (HEANEY et al., 2007; CHAUFFAILLE,

2009).

O fentipo agressivo da crise blstica sugere que diferentes anormalidades

oncognicas como trissomia do cromossomo 8, perda da funo de genes

supressores de tumor como p16 e p53 poderiam levar transio da fase crnica

para a blstica (CHEN et al., 2010; MICHOR, 2007; MITELMAN, 1993, JENNINGS &

MILLS, 1998).

1.1.2. Leucemia Mielide Crnica e o BCR-ABL

Em 1960, o sinal patognomnico da LMC foi descrito por Nowel e Hungerford,

o cromossomo Philadelphia (Ph). Esta descoberta foi a primeira demonstrao de

um rearranjo cromossomal ligado a patognese de um cncer especfico. Esse

marcador citogentico da LMC, foi identificado como resultante de uma translocao

recproca entre os braos longos dos cromossomos t(9;22)q(34;11). Dessa

translocao surge o cromossomo 22 encurtado, denominado cromossomo

Philadelphia (NOWEL; HUNGERFORD, 1960; WESTBROOK, 1992) (Figura 1), e o

neogene bcr-abl1 que codifica a oncoprotena BCR-ABL com elevada e constitutiva

atividade tirosina-quinase (DI BACCO et al., 2000; NEVIANI et al, 2007).

Assim, o neogene bcr-abl1 o responsvel pelo fentipo maligno das clulas

leucmicas, pois determina a transformao da clula progenitora hematopotica

nomal em maligna por meio de trs mecanismos principais: induz na clula a

resistncia apoptose, adeso alterada ao estroma medular e alto potencial

mitognico. Portanto, pacientes com LMC, apresentam clulas precursoras

hematopoticas e do sangue perifrico malignas mais resistentes apoptose do que

as clulas normais, devido expresso da tirosina-quinase Bcr-Abl Estas alteraes

nos mecanismos reguladores da proliferao e morte da clula progenitora culminam

_______________________________________________________________Introduo 4

no acmulo de clulas leucmicas BCR-ABL positivas encontradas na LMC.

(NEVIANI, 2007).

Daley e colaboradores, em 1990, por meio de experimentos com modelos

murinos que mimetizavam a doena, detectaram que a protena quimrica BCR-ABL

estava associada ao desenvolvimento da LMC. Nesses modelos, o camundongo,

aps ter sido transplantado com medula ssea, cujas clulas apresentavam um vetor

retroviral com Bcr-Abl, desenvolveu sndrome mieloproliferativa com as

caractersticas da LMC.

A instabilidade gentica, conseqncia da translocao que originou o

cromossomo Ph, provavelmente a responsvel pelas aberraes cromossmicas

ou mutaes adicionais nas clulas leucmicas (CILLONI; SAGLIO, 2009)

Ao ocorrer a translocao entre os cromossomos 9 e 22, diferentes tamanhos

de protenas como p190, p210 e p230 kDa, podem ser originados, dependendo do

stio de quebra do gene Bcr. A protena de tamanho p210 a mais freqente e est

associada com a patognese da LMC e induo de apoptose por drogas

citostticas e radiao ionizante (NISHII et al, 1996), enquanto a p190 est ligada ao

pior prognstico da doena. A p230 est associada com a leucemia neutroflica

crnica, forma mais indolente da doena (BRECCIA et al., 2011; DI BACCO et al.,

2000; NEVIANI et al., 2007).

Figura 1 Caritipo de paciente com LMC indicando a presena do Cromossomo Philadelphia. As setas representam os cromossomos originados pela translocao t(9;22)q(34;11). Figura adaptada de: www.fleury.com.br (acessado em fevereiro, 2011).

http://www.fleury.com.br/

_______________________________________________________________Introduo 5

1.1.3. Leucemia Mielide Crnica e Apoptose

A apoptose, processo fisiolgico de morte celular programada, desempenha

importante papel na homeostase dos diferentes tecidos e controla, inclusive, o

sistema hematopotico (MAURILLO et al., 2001).

A resistncia anormal apoptose pode conduzir ao aparecimento de

neoplasias e doenas auto-imunes (RAMENGHI et al., 2000) devido a persistncia

de clulas mutantes ou transformadas, enquanto que sua exacerbao acarreta o

surgimento de doenas agudas neurodegenerativas e neuromusculares

(RATHMELL; THOMPSON, 2002).

O fenmeno da apoptose celular quando iniciado promove a ativao de

eventos moleculares, que culminam na ativao de certas proteases, denominadas

caspases, as quais so responsveis pelo desmantelamento e morte celular

(AMARANTE-MENDES; GREEN, 1999). A regulao deste processo realizada por

fatores inibidores e ativadores da cascata apopttica, entre os quais podemos

destacar os receptores de morte (death receptors) pertencentes famlia do

receptor de TNF- (SUDA et al., 1993), as protenas pertencentes s famlias Bcl-2,

IAPs, FLIPs, Caspases, ou ainda fatores de supresso de tumores com p53, entre

outros. (HALE et al., 1996; BORNER, 2003). O equilbrio das interaes entre as

protenas pro- e anti-apoptticas definem a ocorrncia da morte celular.

A apoptose pode ser desencadeada por duas vias, a via extrnseca (figura 2)

e a via intrnseca (figura 3). A chamada via extrnseca iniciada pela ligao dos

receptores de morte (DR, Death Receptors - Fas/CD95, TNFRI, DR3, DR4, DR5 e

DR6), aos seus respectivos ligantes. Os DR so molculas existentes na superfcie

celular que apresentam um domnio extracelular rico em cistena e um domnio

intracelular denominado DD (death domain). A interao receptor-ligante leva a

uma interao homoflica de receptor-adaptador citoplasmtico de domnio de morte.

O adaptador de protena Fas associado ao DD (FADD) permite o recrutamento da

pro-caspase 8, formando o complexo DISC (Death-inducing signaling complex). A

pr-caspase 8 autoclivada e transformada em caspase 8 ativa, sendo ento

liberada para o citoplasma, onde poder agir diretamente na ativao da caspase 3

(fase executora do processo de apoptose), ou ento agir na clivagem da molcula

Bid, a qual se dirige mitocndria, induzindo a liberao de citocromo c e SMAC. A

_______________________________________________________________Introduo 6

clivagem de Bid representa um ponto de interconeco entre as vias extrnseca e

intrnseca da apoptose (AMARANTE-MENDES; GREEN 1999; ZIVNY et al., 2010).

Por outro lado, a via intrnseca comea pela ao de diferentes sinais de estresse

intracelular, tais como irradiao, agentes quimioterpicos, vrus, bactrias e

ausncia de fatores de crescimento celular, os quais convergem para a mitocndria,

induzindo a translocao de citocromo c e SMAC (second mitochondria-derived

activator of caspases) destas organelas para o citosol, resultando, na presena de

APAF-1, na ativao de molculas de caspase-9. A via executora do processo de

apoptose comum a ambas vias iniciadoras caracteriza-se pela ativao das

caspases executoras, a saber, caspases-3, -6 e -7, e pelo desmantelamento celular

caracterstico da apoptose (DU et al., 2000 ; SHARMA et al., 2000; SUSIN et al.,

1999).

A regulao da via mitocondrial realizada pelos membros da famlia Bcl-2,

protenas citoplasmticas capazes de integrar sinais de sobrevida ou morte celular

gerados nos meios intra e extracelulares (BORNER, 2003). Essa famlia subdivide-

se em duas classes: protenas anti-apoptticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 e A1),

cuja funo proteger a clula da morte, e pro-apoptticas (Bax, Bak, Bad, Bid, Bmf

etc), que sensibilizam ou conduzem a clula apoptose (BORNER, 2003). As

protenas inibidoras interferem na formao do complexo APAF-1/caspase 9 por

meio do bloqueio da liberao do citocromo C ou SMAC/DIABLO da mitocndria

(BORNER, 2003). As protenas pr-apoptticas (Bax, Bak e Bad) ativam-se quando

interagem com a molcula tBid, liberada pela clivagem da protena Bid pela caspase-

8. A via mitocondrial tambm susceptvel a regulao negativa pelas protenas da

famlia dos IAPs (c-IAP-1 e -2, X-IAP e Survivina), as quais podem inibir as

caspases-3 e -9, mas so bloqueadas pelo SMAC (HUANG 2002; SHI 2002).

Como citado anteriormente, a ausncia ou diminuio da expresso das

protenas pr-apoptticas esto associadas ao aparecimento de infeces

recorrentes, doenas hematolgicas (linfomas e leucemias), autoimunes e

resistncia a drogas (SHARMA et al., 2000). Em contraste, a exacerbao dessa

expresso obtida por meio da utilizao de radioterapia, antineoplsicos,

imunoterpicos no tratamento de tumores slidos ou leucemias conduz a cura de

doenas (GUILHOT; LACCOTTE 1998; SHARMA et al., 2000). Ainda neste contexto,

anormalidades concernentes expresso das protenas anti-apoptticas tambm

culminariam em doenas.

_______________________________________________________________Introduo 7

A elucidao dessas anomalias em diferentes doenas poderia colaborar com

a escolha e/ou modulao do tratamento dessas doenas. Por exemplo, o proto-

oncogene bcl-2, presente na membrana mitocondrial interna de vrias linhagens

celulares, inibe a ativao do fenmeno da apoptose, com o aumento de sua

expresso em linfcitos, clulas precursoras hematopoticas e tumorais,

promovendo a resistncia celular apoptose (HOCKENBERY, et al., 1991).

Outro dado a ser ressaltado, o fato de que a citotoxicidade mediada pelas

clulas T e NK contra clulas tumorais pode ser exercida pela via de ativao do

sistema Fas-FasL, todavia clulas tumorais podem evadir da resposta imune pela via

Fas-FasL. Assim, clulas leucmicas ou tumorais que secretam ou expressam o

antgeno FasL podem promover a apoptose de clulas efetoras, impedindo que

estas atuem na erradicao do clone tumoral (LICKLITER, et al., 1999). O antgeno

FasL presente nas clulas tumorais, quando ligado ao antgeno Fas das clulas

efetoras, conduziria apoptose da clula efetora, diminuindo o pool circulante de

clulas da resposta imune. Por isso, a necessidade da observao do nvel de

expresso dos antgenos Fas nas clulas da resposta imune e FasL nas clulas

precursoras malignas.

sabido que, na LMC, as clulas precursoras hematopoticas malignas so

mais resistentes apoptose do que as clulas normais, devido expresso da

tirosina-quinase bcr-abl1 que prolonga a sobrevida da clula. A protena BCR-ABL

parece exercer sua capacidade antiapopttica, por meio do aumento da expresso

das protenas BCL-2 e BCL-XL nas clulas malignas (SANCHEZ-GARCIA ;MARTIN-

ZANCA, 1997).

Handa e colaboradores (1997) relataram que, na LMC, a expresso da

protena Bcl-2 aumenta com a progresso da doena, o que suporta a hiptese de

que seja a expresso desta protena, em altos nveis, que prolongaria a sobrevida da

clula leucmica e a torna resistente a apoptose enquanto que Wei et al (2007)

demonstraram que o perfil das protenas reguladoras da apoptose tem relao com

a resposta aos inibidores de TK. O antgeno Fas parece estar expresso em nveis

normais nas clulas malignas dos pacientes portadores de LMC na fase crnica,

mas devido a alta expresso do BCL-2, as clulas malignas apresentam resistncia

apoptose (RAVANDI, et al., 2001). A correlao entre a patognese/prognstico da

LMC com as demais protenas reguladoras do processo de apoptose tem sido pouco

_______________________________________________________________Introduo 8

investigada, no entanto como a clula precursora maligna presente na doena

resistente apoptose, esta abordagem precisa ser melhor explorada.

Algumas modalidades de tratamento da LMC, como os inibidores da tirosina-

quinase, parecem objetivar a inibio da proliferao celular, da atividade quinase e

potencializao da apoptose. Mesmo com a eficincia dessa terapia h ainda

pacientes que apresentam progresso da doena ou mesmo refratariedade s

terapias.

Assim sendo, a descrio de substncias capazes de tornar essas clulas

mais sensveis apoptose poderiam colaborar no aumento da eficcia dos inibidores

de tirosina quinase no tratamento dessa doena.

Figura 2 Esquema representando a via extrnseca da apoptose. Figura adaptada de PEREIRA e AMARANTE-MENDES, 2011.

Apoptose

Tipo I Tipo II

_______________________________________________________________Introduo 9

Figura 3 Esquema representando a via intrnseca da apoptose. Figura adaptada de PEREIRA e AMARANTE-MENDES, 2011.

1.1.4. Tratamento da LMC

O tratamento clnico da LMC pode ser realizado por meio da quimioterapia

(hidroxicarbamida), inibidores da enzima tirosina-quinase (STI571 ou mesilato de

imatinibe ou Glivec; dasatinibe e nilotinibe) e transplante de medula ssea (TMO).

Dentre esses, o mesilato de imatinibe (MI) escolhido como primeira linha do

tratamento de LMC para a maioria dos pacientes diagnosticados na fase crnica

(BRECCIA et al., 2011).

O MI demonstrou ser 10 vezes mais potente do que IFN- no controle da

doena (GOLDMAN, 2004). Seu mecanismo de ao consiste em ocupar, e

conseqentemente bloquear, o stio cataltico da molcula BCR-ABL na regio de

ligao ao ATP. Dessa forma, a atividade enzimtica da protena BCR-ABL

suprimida e a clula leucmica morre. Um dos grandes trunfos do mesilato de

imatinibe sua alta especificidade; ele liga-se quase que exclusivamente a BCR-

ABL, alm de algumas outras tirosina-quinases, como c-kit e receptor de PDGF

(BRECCIA et al., 2011; BUCHDUNGER et al., 2000), com o que praticamente no

provoca efeitos colaterais (JOHN et al., 2004). Alm de impedir o avano da

Apoptose

Clivagem de substratos

Apoptose

Apoptossomo

Rompimento

citoesqueleto

Retirada do fator

de crescimento

Protenas

BH3-only

Membrana plasmtica

Danos DNA

Ativao p53

Expresso de NOXA e PUMA

_______________________________________________________________Introduo 10

leucemia, por bloquear a progresso para a fase acelerada ou blstica, o mesilato

de imatinibe normaliza a contagem de leuccitos no sangue perifrico em 98% dos

casos, o que configura remisso hematolgica (KANTARJIAN et al., 2002 e 2003).

Os pacientes nas fases acelerada e blstica apresentam boa resposta inicial

ao mesilato de imatinibe, aps 4 semanas, 69% dos pacientes que comearam a ser

tratados na fase acelerada e 15% daqueles j na fase blstica respondem ao

tratamento, o que at ento no havia sido reportado para nenhum outro frmaco

(TALPAZ, 2002; SESSIONS, 2007). Apesar dos avanos obtidos com a utilizao do

MI no tratamento dos pacientes com LMC, vrios mecanismos de resistncia das

clulas leucmicas a esse tratamento j foram descritos e clulas BCR-ABL

positivas persistem na medula ssea e sangue perifrico mesmo aps a terapia. As

principais causas dessa resistncia so: presena de mutaes no stio cataltico de

Bcr-Abl, duplicao do cromossomo Philadelfia, superexpresso do gene bcr-abl e

reduo na captura do composto devido a superexpresso de glicoprotena P (Pgp)

ou, alternativamente, por metabolizao excessiva (RADICH, 2010; MAHON et al.,

2000; GORE et al., 2001; SHAH et al., 2002; AZAM et al., 2003).

Outras opes para o tratamento dos pacientes resistentes ao MI seriam o

dasatinibe e o nilotinibe. Medicamentos mais potentes que o MI, mas que tambm

so ineficientes nos pacientes em fases acelerada, blstica ou portadores da

mutao T315I (SHERBENOU; DRUKER, 2007). Um nmero de novos inibidores de

TK, como o Bosutinibe e Sarafenib, esto em desenvolvimento (JABBOUR et al.,

2009).

A persistncia de clulas BCR-ABL positivas nos pacientes em tratamento

com o mesilato de imatinibe indica que a inibio da atividade de tirosina-quinase de

Abl talvez no seja suficiente para erradicar todas as clulas leucmicas. Assim

sendo, a identificao de novos frmacos que induzam a morte da clula leucmica

BCR-ABL positiva ou potencializem a ao do mesilato de imatinibe seria de

fundamental importncia para o tratamento de pacientes com LMC resistentes ao

inibidor de tirosina-quinase.

_______________________________________________________________Introduo 11

1.2. Venenos, L-aminocido-oxidase, e Apoptose

As toxinas animais tm sido importantes instrumentos para ampliar os

conhecimentos sobre a fisiologia humana e farmacologia. Informaes sobre a

natureza e mecanismos de ao das toxinas permitiram a evoluo do tratamento de

suas intoxicaes baseada em informaes mais cientficas e, portanto, mais

eficientes (BERTAZZI et al., 2005).

Os venenos da maioria das serpentes so constitudos por toxinas, em

concentraes variadas, as quais incluem: neurotoxinas, citotoxinas, cardiotoxinas,

protenas que agem na hemostasia (proteases) e peptdeos (desintegrinas,

peptdeos potenciadores da bradicinina/inibidores da enzima conversora de

angiotensina), oxidases (L-aminocido oxidase), hialuronidases, metaloproteases e

lectinas (DUERRE et al.,1975; MATSUI et al., 2000, RAMOS e SELISTRE-DE-

ARAJO, 2006; SARRAY et al., 2004).

O gnero Bothrops encontrado em todo o Brasil o responsvel pela maioria

dos acidentes ofdicos brasileiros (EVANGELISTA, et al., 2010). A ao de seu

veneno proteoltica, coagulante e hemorrgica (RAMOS; SELISTRE-DE-ARAJO,

2006; QUEIROZ et al., 2008).

Da Silva e colaboradores, em 1996, mostraram que o veneno de Bothrops

jararaca apresentou efeito antitumoral nas clulas de Tumor Asctico de Ehrlich e

que este efeito antitumoral deve ser devido ao efeito anti-proliferativo celular

associado indiretamente com a resposta inflamatria mediada por IL-2, IL-8 e TNF-.

Outros pesquisadores demonstraram, por exemplo, a atividade

anticarcinognica do veneno da cobra Indiana monocellate, estudada recentemente

em modelos de leucemia, carcinoma e sarcoma (GOMES et al., 2010; DEBNATH et

al., 2007; KARTHLEYAN et al., 2008).

Os componentes biologicamente ativos que se encontram em maior quantidade

nos venenos das serpentes do gnero Bothrops so: fosfolipase A2,

metaloproteases, serinoproteases, LAAOs, fatores de crescimento dos nervos (NGF)

e lectina tipo C, protenas ricas em cistena (CORREA-NETTO et al., 2010). Dentre

este conjunto complexo de componentes txicos e no txicos destaca-se a LAAO,

_______________________________________________________________Introduo 12

que representa de 1 a 9% do total das protenas do veneno (IZIDORO et al., 2006).

As L-Aminocido Oxidases (LAAOs, EC 1.4.3.2) so flavoenzimas que

catalizam a deaminao oxidativa de L-aminocidos em -cetocido com a

produo de amnia e perxido de hidrognio. As LAAOs so usualmente

glicoprotenas homodimricas ligantes de FAD, com uma massa molecular entre 110

e 150 kDa, quando medidas por filtrao em gel em condies no-desnaturantes.

Esta verstil classe de enzimas est amplamente distribuda em vrias

espcies de seres vivos, como nas peonhas de serpentes, insetos, fungos,

bactrias e at mesmo plantas (TAN ;FUNG, 2008; DU & CLEMETSON, 2002).

As LAAOs so substncias de grande interesse na rea cientfica, por

apresentarem alto potencial citotxico sobre diversos patgenos, linhagens celulares

tumorais, fungos e vrus (LEE et al., 2011; SUN et al., 2010; WEI et al., 2009;

ZULIANI et al., 2009; DU e CLEMETSON, 2002). O efeito farmacolgico desta

enzima ainda incerto (TORRES et al., 2010; TORII et al.,1997), contudo trabalhos

recentes descrevem amplos efeitos biolgicos e farmacolgicos como, induo de

apoptose (YAN, 2006; 2005), citotoxicidade, induo e/ou inibio de agregao

plaquetria, hemorragia, hemlise, edema, atividade bactericida, leishmanicida e

anti-HIV (SUN et al., 2011; STILES et al., 1991; SUHR e KIM, 1996; SOUZA et al.,

1999; SAKURAI et al., 2001 e 2003; DU e CLEMETSON, 2002; SAMEL et al., 2006;

STABELI et al., 2007). Muitos dos efeitos biolgicos de LAAOs so creditados aos

efeitos secundrios do perxido de hidrognio (H2O2), produzido durante a reao

enzimtica e que induz a apoptose celular (RODRIGUES et al., 2009; DU;

CLEMETSON, 2002; LEWIS; GARCIA, 2003; ANDE et al., 2006).

Apesar dos numerosos estudos publicados sobre as LAAOs e suas atividades

biolgicas, pouco se sabe sobre a ao do veneno e da LAAO de B. pirajai,

conhecida popularmente como jararacussu da Bahia (COSTA et al., 1999).

Investigaes demonstraram o efeito citotxico da LAAO de Bothrops pirajai

(BpirLAAO) em linhagens celulares de tumor S180, cncer de mama, leucemia

aguda de clulas T e tumor Asctico de Erlich (IZIDORO et al., 2006). O efeito

observado nesse ltimo caso foi dose dependente sobre as clulas tumorais e

parece estar relacionado tambm a produo de perxido de hidrognio (IZIDORO

et al.,2006).

_______________________________________________________________Introduo 13

Nesse contexto, a L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai torna-se

interessante para a investigao sobre clulas leucmicas BCR-ABL positivas para

possvel descrio de tratamento mais eficiente para pacientes com LMC.

OBJETIVOS

________________________________________________________________Objetivos 15

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar o potencial do veneno bruto e da enzima LAAO de Bothrops pirajai em

induzir apoptose nas clulas BCR-ABL positivas.

2.2. Especficos

A) determinar as doses do veneno bruto e da LAAO de Bothrops pirajai capazes de

induzir apoptose em clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL;

B) verificar se a morte celular nessas linhagens desencadeada pela via intrnseca

ou extrnseca da apoptose;

C) checar se a LAAO sensibiliza a morte de clulas HL-60.BCR-ABL pelo inibidor de

tirosina-quinase mesilato de imatinibe

D) avaliar se a LAAO, em baixas concentraes, modula a expresso de genes pr e

anti-apoptticos que controlam a apoptose celular em clulas HL-60 e HL-60.BCR-

ABL.

MATERIAL E MTODOS

_________________________________________________________Material e Mtodos 17

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Linhagens celulares, veneno bruto e L-aminocido oxidase de Bothrops

pirajai

Foram empregadas nesse estudo as linhagens celulares HL-60 (clula derivada

de leucemia pr-mieloctica) e HL-60.BCR-ABL. Esta ltima, cedida gentilmente pelo

Prof. Dr. Gustavo Amarante Mendes do Departamento de Imunologia do Instituto de

Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo.

A HL-60.BCR-ABL originada da infeco de clulas HL-60 selvagens com

retrovrus recombinante, obtidas por meio da transfeco por eletroporao da

combinao de clulas empacotadoras das linhagens PA317 e 2 com o plasmdeo

pSRMSVp185bcr-abl tkneo, contendo o gene bcr-abl. Quando comparada a clula

HL-60 vetor e selvagem, essa clula transfectada com o gene bcr-abl

extremamente resistente apoptose induzida por agentes apoptognicos clssicos

como actinomocina-D, teniposdeo, etoposdeo, vincristina, citarabina,

estaurosporina e ciclofosfamida (BRUMATTI et al., 2003; AMARANTE-MENDES, et

al., 1997 e 1998 ).

O veneno bruto e o componente biologicamente ativo L-aminocido oxidase

(LAAO) da Bothrops pirajai foram fornecidos pela Profa. Dra. Suely Vilela da FCFRP-

USP e pelo Dr. Andreimar Martins Soares. A enzima LAAO purificada e utilizada

nesse estudo apresentou grau de pureza superior a 95%.

3.2. Cultivo celular

As linhagens celulares encontravam-se congeladas em nitrognio lquido e

continham aproximadamente 1x107 clulas/mL de soluo de congelamento (soro

bovino fetal, 10% DMSO). O descongelamento deu-se submergindo o flaconete com

as clulas em recipiente de gua a 37C at que as mesmas se desgrudassem da

parede do tubo. Assim sendo, as clulas foram depositadas em 10 mL de meio

RPMI completo (suplementado com 10% soro bovino fetal, 2mM glutamina,

100UI/mL penicilina, 100 g/mL estreptomicina e 25mM HEPES) e centrifugadas a


240 x g a 4C por dez minutos. Aps esse procedimento as clulas foram

ressuspensas em 1mL de meio RPMI, contadas em azul de tripan na cmara de

Newbauer e plaqueadas para cultivo.

Aps estabelecimento do crescimento celular de modo exponencial, as

linhagens celulares foram empregadas nos experimentos com o veneno bruto e

LAAO. Os ensaios foram realizados somente quando a viabilidade celular, verificada

pelo mtodo do azul de tripan, estava superior a 95%.

3.3. Ensaios de Induo de Apoptose

Esses experimentos foram realizados para avaliar se o veneno bruto e a

LAAO eram capazes de induzir a apoptose nas linhagens celulares HL-60 e HL-

60.BCR-ABL. As clulas foram plaqueadas na concentrao de 2x104 por poo em

placas de 96 poos na presena e na ausncia do VB e da LAAO de Bothrops pirajai

para padronizao da tcnica e das doses a serem utilizadas nos experimentos

subseqentes.

Foram utilizadas durante a padronizao dos ensaios as concentraes de

0,05 g/mL, 0,1 g/mL, 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 5,0 g/mL, 7,5 g/mL, 10 g/mL, 25

g/mL, 50 g/mL e 100 g/mL do veneno bruto e 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 1,5 g/mL,

2,0 g/mL, 2,5 g/mL e 5 g/mL de LAAO, alm da realizao dos controles

negativo (somente clulas) e positivo (clulas na presena do indutor de apoptose

clssico).

As clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL foram plaqueadas na concentrao de

2x104 /poo e incubadas na presena ou ausncia dos tratamentos citados

anteriormente por 12 e 18 horas.

O controle positivo de induo de apoptose foi realizado com clulas

plaqueadas com o agente apoptognico Actinomicina (ACT-D) (Sigma, St Louis,

Missouri, EUA) na concentrao de 1M. Todos os testes foram realizados em

triplicatas.

Aps a incubao das clulas com o VB e LAAO por 12 e 18 horas as clulas

foram recuperadas dos poos, centrifugadas e submetidas avaliao da apoptose

celular pelo mtodo de Hypotonic-Fluorescent-Solution (HFS, soluo hipotnica


fluorescente). Os resultados obtidos foram expressos pela mdia da percentagem de

ncleos hipodiplides das amostras obtidas em trs experimentos independentes.

Aps padronizao dos testes foram iniciados os ensaios para

determinao do efeito da LAAO sobre as linhagens celulares.

Foram plaqueadas as clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL na concentrao de

1x105 por poo e incubadas durante 18 horas com os diferentes tratamentos. Aps

esse perodo, as clulas foram recuperadas dos poos, centrifugadas por 240 x g a

4C durante dez minutos e submetidas avaliao da apoptose pelo mtodo HFS.

As clulas recuperadas dos poos da cultura aps exposio ao veneno

bruto, LAAO e agente apoptognico foram incubadas com soluo HFS (iodeto de

propdeo 50 g/mL em citrato de sdio 0,1% e Triton X-100 0,1%) por 15 minutos e

analisadas por citometria de fluxo (FACSCanto, BD) pelo software DiVa.

A percentagem de morte celular destes ensaios foi quantificada avaliando-se

o contedo de DNA genmico (percentagem de ncleos hipodiplides), visto que as

clulas foram marcadas com iodeto de propdio (PI) e os espectros de emisso de

luz pelos fluorocromos foram analisados no citmetro de fluxo (FACSCanto, BD, San

Jose, Califrnia, EUA), detector FL2, com gate retirando apenas debris . Foram

adquiridos e analisados cinco mil eventos da gate por meio de grficos em formato

de histograma. A avaliao do contedo de DNA foi feita por meio da incorporao

de PI em ncleos isolados. Dessa forma, os ncleos de clulas saudveis exibem

incorporao compatvel com contedo diplide ou tetraplide, presente em clulas

em fase G0-G1 ou G2-M, enquanto que ncleos apoptticos aparecem na regio

hipodiplide do histograma, devido fragmentao ou maior condensao da

cromatina (NICOLETTI et al, 2006; ,BRUMATTI et al., 2003).

A figura 4 mostra os grficos de citometria de fluxo obtidos durante a anlise

da percentagem de clulas em ncleos hipodiplides pelo mtodo de HFS. Na figura

4A o histograma refere-se ao controle negativo do experimento, ou seja, o HFS de

clulas HL-60.BCR-ABL no tratadas, enquanto que a figura 4B ilustra a anlise de

clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO. Observa-se na figura 3B que a LAAO

induziu a apoptose nas clulas HL-60.BCR-ABL, pois h marcao dos ncleos

hipodiplides com iodeto de propdio.


qq

Figura 4 Anlise da percentagem dos ncleos hipodiplides de clulas HL-60.BCR-ABL pelo mtodo HFS por citometria fluxo. 4A) Controle negativo do ensaio. 4B) Clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO na concentrao de 2,5g/mL. O histograma indica a intensidade de fluorescncia (percentagem) dos ncleos hipodiplides (clulas em apoptose) marcados com iodeto de propdio (P2) e ncleos diplides (P1, clulas viveis).

3.4. Deteco das caspases 3, 8 e 9 por western-blot

A deteco da ativao das caspases 3, 8 e 9 por western-blot foi realizada

com o intuito de confirmar a induo de apoptose das clulas HL-60 e HL-60.BCR-

ABL pela LAAO e determinar se a ativao da morte foi desencadeada pela via

extrnseca ou intrnseca da apoptose.

Assim sendo, 1x106 cellas HL-60 e HL-60.BCR-ABL foram cultivadas com as

diferentes concentraes de LAAO (0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 1,5 g/mL, 2,0 g/mL e

2,5 g/mL), sem estmulo (controle negativo) e estimuladas com ACT-D 1M

(controle positivo) por 18h. Aps esse perodo as clulas foram coletadas e

ressuspensas em tampo de amostra para western-blot (5% de mercaptoetanol, 4%

de SDS, 20% de glicerol e 100mM Tris-CL-pH 6).

O lisado protico das linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL foram separadas

por SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF para deteco das

caspases. As membranas de western-blot foram bloqueadas em tampo de lavagem

com 5% de leite desnatado por 12 horas temperatura ambiente (TA) e

subseqentemente incubadas com os anticorpos primrios especficos desejados.

A) B)

P2

P1 P1

P2


Os anticorpos primrios utilizados foram: anticorpo monoclonal de camundongo anti-

caspase 8 humano na diluio de 1:1000 (cdigo 551243; BD Pharmingen, San

Diego, Califrnia, EUA), anticorpo policlonal de coelho anti-caspase 3 humano na

diluio 1:1000 (cdigo 235412, Calbiochem, Darmstadt, Germany), anticorpo

monoclonal de camundongo anti-caspase 9 humano na diluio 1:250 (cdigo

63103; SIGMA, San Louis, Missouri, EUA) e anticorpo policlonal de coelho anti

tubulina 1:5000, (cdigo T3320; SIGMA, San Louis, Missouri, EUA), empregada para

marcar a protena endgena das amostras investigadas.

Esses anticorpos foram diludos, nas concentraes indicadas em soluo

de bloqueio contendo 0,01% azida por perodo que variou de 16h 72h, em

temperatura ambiente. Aps trs lavagens das membranas com tampo TBS-T

(20 mM de Tris-CL-pH 6, 137 mM NaCl e 0,1% de Tween), essas foram incubadas

com os anticorpos secundrios anti-camundongo e anti-coelho conjugados

peroxidase na diluio de 1:2000 (Amersham Biosciences, GE Healthcare Life

Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA) por uma hora a temperatura ambiente (TA). A

deteco da marcao foi realizada pelo mtodo de quimioluminescncia

(Amersham ECL Plus, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA).

3.5. Deteco do efeito da associao do Mesilato de Imatinibe com a LAAO

O efeito da LAAO e da LAAO associada ao Mesilato de Imatinibe (MI)

(Novartis Pharma AG, Suia) sobre a atividade quinase de BCR-ABL e quanto ao

potencial indutor de apoptose foi avaliado em clulas HL-60.BCR-ABL.

Clulas HL-60.BCR-ABL na concentrao de 1x106 foram plaqueadas em

placas de 24 poos da seguinte forma: controle negativo; clulas com MI na

concentrao de 10 M por 18h; clulas, MI na concentrao de 10uM e LAAO nas

concentraes de 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 1,5 g/mL, 2,0 g/mL e 2,5 g/mL por 18

horas. Paralelamente, 1x106 dessas clulas foram cultivadas junto ao MI na

concentrao de 10 M por 2h horas para observar diferena do perfil de inibio

da atividade quinase entre 2 e 18h de incubao com o frmaco.

Aps os perodos correspondentes de incubao, as clulas foram coletadas

dos poos, colocadas em tampo HFS e de amostra de western-blot.


A quantificao da apoptose das clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com a

associao LAAO e MI, nas diferentes concentraes por 18h, foi determinada pelo

mtodo de HFS, cuja tcnica est descrita no item III.3 dessa dissertao.

Para avaliar a potencial inibio da atividade quinase de BCR-ABL pela LAAO

foi realizado o western-blot nos lisados proticos celulares para deteco de

fosfotirosina.

Assim, amostras da enzima LAAO previamente incubadas (nas

concentraes: 0,5 g/mL; 1,0 g/mL; 1,5 g/mL; 2,0 g/mL e 2,5 g/mL) por 18h

foram utilizadas.

O lisado protico das amostras foi submetido ao SDS-PAGE para separao

das protenas, que foram posteriormente transferidas para membrana de PVDF

(BRUMATTI et al., 2003). As membranas de western blot foram bloqueadas em

tampo de lavagem com 5% de BSA por 3 horas TA e subseqentemente

incubadas com o anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina (PY) (UpstateBiotech Inc.,

Lake Placid, NY, USA, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Gustavo Amarante-

Mendes, do Instituto de Cincias Biomdicas / USP) diludo 1:2000 em tampo de

bloqueio (por 12 horas, em temperatura ambiente. Aps trs lavagens de 10

minutos com TBS-T, os blots foram incubados com anticorpo secundrio anti-

camundongo conjugados peroxidase na diluio de 1:2000 (Amersham

Biosciences, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA) por uma

hora a TA. A deteco da marcao foi realizada pelo mtodo de

quimioluminescncia (Amersham ECL Plus, GE Healthcare Life Science,

Pittsburgh, Pensilvnia, EUA).

Aps os experimentos descritos acima neste item, as amostras utilizadas nos

ensaios de associao LAAO + MI; LAAO sem MI e amostras de HL-60 j

armazenadas em tampo de amostra foram novamente transferidas para

membrana de PVDF. Como descrito anteriormente, as membranas de western blot

foram bloqueadas em tampo de lavagem com 5% de BSA por 3 horas TA e

subseqentemente incubadas com o anticorpo monoclonal ant-c-abl (cdigo

MAB1130; Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) diludo 1:250 em tampo de

bloqueio por 5 horas, em temperatura ambiente. Aps trs lavagens de 10

minutos com TBS-T, os blots foram incubados com anticorpo secundrio anti-

camundongo conjugados peroxidase na diluio de 1:3000 (Amersham

Biosciences, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA) por uma


hora a TA. A deteco da marcao foi realizada pelo mtodo de

quimioluminescncia (Amersham ECL Plus, GE Healthcare Life Science,

Pittsburgh, Pensilvnia, EUA.

3.6. Extrao de RNA, sntese de cDNA e PCR em tempo real

Para a extrao do RNA total, 3x106 clulas das linhagens previamente

plaqueadas em placas de 24 poos e incubadas por 18 horas na ausncia e na

presena da LAAO (concentraes selecionadas: 0,5 g/mL e 1,0 g/mL para HL-60

e 1,0 g/mL e 1,5 g/mL para HL-60.BCR-ABL), foram coletadas dos poos aps

este perodo e lisadas com 500L de Trizol (Invitrogen, Life Technologies,

Carlsbad, Califrnia, EUA), conforme protocolo do fabricante. O RNA foi recuperado

da fase aquosa pela adio de clorofrmio e centrifugao. Em seguida, a fase

aquosa contendo o RNA foi submetida precipitao com isopropanol e

centrifugao. O precipitado foi lavado com etanol 70% e ressuspenso em 13 L de

gua livre de RNAses e DNAses. A concentrao de RNA total foi quantificada em

espectrofotmetro a 260 nm e 280 nm.

O RNA extrado das clulas foi submetido eletroforese em gel de agarose

1,5%, que foi realizada corrente eltrica de 80 Volts durante 50 minutos e as

bandas 28S, 18S e 5S. Devido utilizao do corante gel-red (Biotium, Hayward,

Califrnia, USA), as bandas do RNA foram visualizadas em transiluminador UV.

(Figura 5)


Figura 5. RNAs extrados de amostras de HL-60 e HL-60 BCR-ABL cultivadas na presena e ausncia da LAAO e submetidos eletroforese em gel red 1,5%. Observa-se a visualizao das bandas 28S, 18S e 5S do RNA.

Para obteno do cDNA, foi utilizado o kit High Capacity cDNA Archive Kit

(Applied Biosystems, Foster City, Califrnia, EUA), sendo utilizado 1g de RNA por

reao e o seguinte ciclo: 25C por 10 minutos e a 37C por duas horas no

equipamento Mastercycler (Eppendorf AG, Hamburg, Germany ).

Os cDNA das linhagens foram utilizados nos ensaios de PCR em tempo real

para quantificao da expresso dos genes pr e anti-apoptticos. Para a

amplificao e quantificao dos cDNA por real time PCR utilizou-se o Kit SybrGreen

Quantitect (Applied Biosystems, Foster City, Califrnia, EUA) e o aparelho ABIPrism

7700 (Applied Biosystems, Foster City, Califrnia, EUA).

Para tanto, oligonucleotdeos (primers) especficos foram desenhados para

a amplificao dos genes pr-apoptticos (fas, fasl, bax, bad, bak, bimEL, bid) e anti-

apoptticos (a1, bcl-w, bcl-xL, bcl-2, c-flip) (Invitrogen, Carlsbad, Califrnia, EUA)

(tabela 1). Os programas utilizados no processo de amplificao das amostras foram

padronizados anteriormente pela equipe do laboratrio. Foram empregados como

controle da qualidade da amplificao e sntese de cDNA o gene actina, como

housekeeping gene (gene endgeno). Os resultados foram expressos pelos 2-ddCt,

que calculado considerando-se a razo entre o gene testado e o gene endgeno (

-actina) em relao linhagem HL-60 (calibrador) ou HL-60.BCR-ABL (calibrador).

28S

18S

5S


Tabela 1 - Seqncia dos oligonucleotdeos utilizados na amplificao dos cDNAs das molculas envolvidas na apoptose celular, tamanho do fragmento amplificado e temperatura de anelamento (TA).

Oligonucleotdeo

Sequncias (53) Produto

(Pb)

TA

(C)

bax F: CCC TTT TGC TTC AGG GTT TC

R: TCT TCT TCC AGA TGG TGA GTG

501 56

bad F: CCG AGT GAG CAG GAA GAC TC

R: GGT AGG AGC TGT GGC GAC T

209 60

bak F: TCT GGC CCT ACA CGT CTA CC

R: ACA AAC TGG CCC AAC AGA AC

201 60

bid F: GCT TCC AGT GTA GAC GGA GC

R: GTG CAG ATT CAT GTG TGG ATG

203 62

bimEL F: GCC CCT ACC TCC CTA CAG AC

R: AAG ATG AAA AGC GGG GAT CT

152 59

bcl-2 F: ACG AGT GGG ATG CGG GAG ATG

TG

R: GCG GTA GCG GCG GGA GAA GTC

245 67

bcl-w F: AGT TCG AGA CCC GCT TCC

R: CCC GTC CCC GTA TAG AGC

308 60

bcl-xL F: CTG AAT CGG AGA TGG AGA CC

R: TGG GAT GTC AGG TCA CTG AA

211 60

a1 F: GGC TGG CTC AGG ACT ATC

R: CCA GTT AAT GAT GCC GTC

227 50

fas F: CAA GGG ATT GGA ATT GAG GA

R: TGG AAG AAA AAT GGG CTT TG

203 55

fasL F: AGG AAA GTG GCC CAT TTA AC

R: CAA GAT TGA CCC CGG AAG TA

176 55

c-flip F: GCC GAG GCA AGA TAA GCA

R: GCC CAG GGA AGT GAA GGT

464 54

-actina F: GCC CTG AGG CAC TCT TCC A

R: CCA GGG CAG TGA TCT CCT TCT

192 58


Tabela 2 - Concentrao dos oligonucleotdeos e Programa das reaes de amplificao dos genes avaliados.

Gene Ciclo Concentrao do

primer

bax 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

56C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

bad 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

60C - 1 min. 6,0 pM

bak 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

60C - 1 min. 8,0 pM

bid 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

63C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

bimEL 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

59C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

bcl-2 50C - 2 min; 95C - 10 min/55x: 95C - 15 seg;

67C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

bcl-w 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

60C - 1 min. 8,0 pM

bcl-xL 50C - 2 min; 95C - 10 min/55x: 95C - 15 seg;

60C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

a1 50C - 2 min; 95 - 10 min/50x: 95 - 15 seg;

50C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

fas 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

55C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

fasL 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

55C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

c-flip 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;

54C 34 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM

-actina 50C - 2 min; 95C - 10 min/40x: 95C - 15 seg;

58C - 1 min. 2,5 pM


3.7. Anlise Estatstica

A comparao dos valores da percentagem de ncleos hipodiplides entre as

clulas tratadas e no tratadas com VB, LAAO e LAAO associada ao MI em

diferentes concentraes e no perodo de 18 horas foi realizada por meio da

aplicao do teste t.

As anlises estatsticas dos resultados dos ensaios das clulas HL-60.BCR-

ABL tratadas com a LAAO e com a LAAO associada ao MI e das clulas HL-60 e

HL-60.BCR-ABL com VB em diferentes concentraes e nos perodos de incubao

de 12 e 18 horas foram realizadas por meio da anlise de varincia (ANOVA). Foram

consideradas estatisticamente significantes as anlises cujo valor de p foi menor do

que 0,05.

RESULTADOS

_______________________________________________________________Resultados 29

4. RESULTADOS

4.1. Induo de Apoptose da linhagem HL-60 pelo Veneno Bruto de Bothrops

pirajai

As clulas foram tratadas em diferentes concentraes do veneno bruto

(0,05 g/mL, 0,1 g/mL, 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 5,0 g/mL, 7,5 g/mL, 10 g/mL,

25 g/mL, 50 g/mL e 100 g/mL) e Actinomicina-D (ACT-D) na concentrao de

1M (controle positivo de morte) por 12 e 18 horas. Os resultados obtidos indicam

que o veneno bruto capaz de induzir apoptose em clulas HL-60 partir da

concentrao de 0,1 g/mL, contudo somente nas concentraes de 7,5, 10, 25, 50

e 100 g/mL que se verifica um perfil dose-dependente de veneno quanto induo

de apoptose nas clulas tratadas e incubadas por 12 e 18 horas (Figura 6).

Analisando-se os tempos de incubao, observa-se que a morte celular foi maior

quando as clulas foram cultivadas nas concentraes de 10 ug/mL a 100 ug/mL do

veneno por 18h (Figura 6).

Assim sendo, 18h de incubao foi o perodo escolhido para o tratamento das

clulas com o veneno bruto para realizao dos ensaios subseqentes.

Figura 6 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p

_______________________________________________________________Resultados 30

Neste ensaio, com 18 horas de incubao, observou-se induo significativa

da apoptose com o VB a partir da concentrao de 0,1 g/mL. Como esperado para

esta clula, a ACT-D induziu significativamente a apoptose, uma vez que a HL-60

sensvel morte celular estimulada por essa substncia, inibidora da RNA

polimerase (Figura 7).

Figura 7 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para 18 horas de incubao. * diferena significante, com valor de p

_______________________________________________________________Resultados 31

Figura 8 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p

_______________________________________________________________Resultados 32

Figura 9 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p

_______________________________________________________________Resultados 33

Figura 10 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase. C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem a mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p

_______________________________________________________________Resultados 34

Figura 11 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase. C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p

_______________________________________________________________Resultados 35

4.5.1. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-60

O tratamento das clulas HL-60 com a LAAO por 18 horas estimulou a

ativao das caspases 3 (Figura 12), 8 (Figura 13) e 9 (Figura 14), sendo possvel

detectar esta ativao pelo desaparecimento sequencial das bandas especficas das

caspases inativas. A ativao ocorreu de modo dose dependente da concentrao

de LAAO, ou seja quanto maior a concentrao de LAAO maior ativaao.

Conforme descrito, no item 3.4 em Material e Mtodos, a expresso protica

do protena endgena tubulina foi utilizada para a normalizao dos valores da

densidade das bandas das protena-alvo.

CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D

Figura 12 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60. A diminuio da pr-caspase 3 (PM=32kDa), no lisado celular, indica ativao da apoptose das clulas HL-60 pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 3 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.

CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D

Figura 13 Ativao da caspase 8 pela LAAO em clulas HL-60. A diminuio da pr-caspase 8 (PM=55kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose de clulas HL-60 pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 8 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.

32kDa Pr-Caspase 3

Tubulina 48kDa

Pr-Caspase 8

Tubulina 48kDa

55kDa

LAAO (ug/ml)

LAAO (ug/ml)

_______________________________________________________________Resultados 36

CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D

Figura 14 Ativao da caspase 9 pela LAAO em clulas HL-60. A diminuio da pr-caspase 9 (PM=37kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose da clulas HL-60 pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 9 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.

4.5.2. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-

60.BCR-ABL

Nesta linhagem, o tratamento com a LAAO por 18 horas tambm culminou

com o desencadeamento da apoptose celular verificada pela ativao das caspases

3 (Figura 15), 8 (Figura 16) e 9 (Figura 17). Foi possvel avaliar esta ativao pelo

desaparecimento de bandas especficas das proformas destas protenas por meio de

western blot. Conforme descrito no item 3.4 em Material e Mtodos, a expresso

protica da tubulina (PM=48kDa) foi utilizada para a normalizao dos valores da

densidade das bandas das protena-alvo.

CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D

Figura 15 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60.BCR-ABL. A diminuio da pr-caspase 3 (PM=32kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose da clula HL-60.BCR-ABL pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 3 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.

Pr- Caspase 9 37kDa

Tubulina 48kDa

Pr-Caspase 3

Tubulina

32kDa

48kDa

LAAO (ug/ml)

LAAO (ug/ml)

_______________________________________________________________Resultados 37

CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D

Figura 16 Ativao da caspase 8 pela LAAO em clulas HL-60.BCR-ABL. A diminuio da pr-caspase 8 (PM=55kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose me clulas HL-60.BCR-ABL pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 8 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.

CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D

Figura 17 Ativao da caspase 9 pela LAAO em clulas HL-60.BCR-ABL. A diminuio da pr-caspase 9 (PM=37kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose em clulas HL-60.BCR-ABL pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 9 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio. 4.6. Deteco da percentagem de ncleos hipodiplides e da atividade de

fosfotirosina na linhagem HL-60.BCR-ABL tratada com Mesilato de Imatinibe e

L-aminocido oxidase

Nesta etapa, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito da LAAO quando

associada ao inibidor de tirosina quinase (MI) em clulas HL-60.BCR-ABL e o

consequente efeito desta associao sobre a atividade tirosina quinase de BCR-

ABL. A induo de apoptose em clulas HL-60.BCR-ABL foi avaliada por citometria

de fluxo. Foi detectada nesse ensaio a percentagem de ncleos hipodiplides das

clulas HL-60.BCR-ABL tratadas por 18 horas com 10M de mesilato de imatinibe

associado a LAAO nas concentraces de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/mL.

Os resultados obtidos mostraram aumento significativo da percentagem de

apoptose celular das clulas HL-60.BCR-ABL, em relao aos dados obtidos quando

as clulas foram tratadas apenas com o MI (Figura 18A) ou somente com a LAAO

Caspase 9 37kDa

Pr-Caspase 8

Tubulina 48kDa

55kDa

Tubulina 48kDa

LAAO (ug/ml)

LAAO (ug/ml)

_______________________________________________________________Resultados 38

(Figura 18B). Importante ressaltar que o MI sozinho e com 18h de incubao, no

induziu a apoptose em clulas BCR-ABL+

Figura 18 Anlise da porcentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO, MI e LAAO associada ao MI por 18h. (A) Comparao entre a porcentagem de ncleos hipodiplides das clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com MI e com LAAO associada ao MI por 18 horas. * valor de p

_______________________________________________________________Resultados 39

A partir dos resultados obtidos pela citometria de fluxo e na tentativa de

melhor elucidar o mecanismo pelo qual a LAAO associada ao MI exerce esse efeito

sobre clulas HL-60.BCR-ABL, foi observada a ao dessa associao sobre a

atividade tirosina quinase de BCR-ABL. Assim sendo, foi detectada a expresso da

fosfotirosina (PY) nos lisados proteicos das clulas HL-60.BCR-ABL tratadas por 18

horas com a LAAO nas concentraes (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/mL) e MI 10 M

por western-blot. Paralelamente ao ensaio de 18 horas de incubao, verificamos o

perfil de atividade do MI sobre a a tividade tirosina quinase das clulas HL-60.BCR-

ABL, tratando-as por apenas 2 horas com o MI. O resultado indicou que no h

diferena do efeito do MI sobre a atividade quinase de BCR-ABL entre 2 e 18 horas,

sendo assim, ambos perodos so suficientes para inibir a atividade quinase de

BCR-ABL.

Os dados obtidos por western blot da associao da LAAO com o MI

evidenciaram que a LAAO potencializou a inibio da atividade quinase de BCR-ABL

pelo MI na linhagem HL-60.BCR-ABL. O efeito da potencializao da inibio da

atividade fosforilativa foi observado de forma dose-dependente de LAAO e ocorreu

de forma mais proeminente a partir da concentrao de LAAO de 1,5 g/mL,

confirmando os resultados obtidos pela citometria de fluxo (Figura 19A).

Uma vez observado este efeito interessante da associao da LAAO com o

MI, foi checado a ao da LAAO na atividade quinase de BCR-ABL, sem o MI. Para

isto, um novo western blot para fosfotirosina foi realizado com os lisados proticos

das clulas HL-60.BCR-ABL cultivadas com a LAAO nas mesmas concentraes

(0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/mL) por 18 horas. Neste ensaio, observou-se que a partir

da concentrao de 1,5 g/mL uma diminuio da intensidade das bandas

referentes atividade fosforilativa de BCR-ABL, sugerindo-nos realmente o efeito

inibitrio sobre a atividade quinase de BCR-ABL (Figura 19B)

Sabendo-se que o MI possui um efeito inibidor apenas sobre a atividade TK de

BCR-ABL, ou seja no afeta a expresso da protena BCR-ABL, realizamos a

marcao com o anticorpo c-abl para constatarmos que a expresso de BCR-ABL

(185kDa) no havia sido afetada (figura 19C). Verificamos, como esperado, que a

expresso de BCR-ABL no foi afetada pelo tratamento com o MI, no entanto, para

nossa surpresa, quando associamos a LAAO, esta expresso apresentou-se

_______________________________________________________________Resultados 40

diminuda a partir da concentrao de 1,5g/mL, a partir da qual observou-se a

diminuio da intensidade das bandas correspondentes expresso protica de

BCR-ABL.

48kDa

Anti-c-abl

A) CT 2h 18h 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

c-abl (120kDa)

BCR- ABL(185kDa)

Protenas Fosforiladas

Anti- fosfotirosina

MI 10M MI 10M + LAAOg/mL

48kDaTubulina

Anti-c- abl

B) CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

c-abl (120kDa)

BCR-ABL (185kDa)

LAAOg/ml

Protenas

FosforiladasAnti- fosfotirosina

LAAO (g/mL)

Tubulina

_______________________________________________________________Resultados 41

48kDa

C) CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Tubulina

Anti-c- ablc-abl (120kDa)

BCR-ABL (185kDa)

LAAOg/ml

Figura 19 Expresso da protena fosfotirosina, c-abl e de BCR-ABL em clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento, tratadas com MI, LAAO e LAAO associada ao MI por 18 horas. A) Clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento (CT); tratadas com MI por 2 e 18 horas e tratadas com MI associado LAAO por 18 horas. As clulas foram marcadas com o anticorpo anti-c-abl e anti-fosfotirosina. B) Clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento (CT) e tratadas com LAAO por 18 horas. As clulas foram marcadas com o anticorpo anti-c-abl e anti-fosfotirosina. C) Clulas HL-60 sem tratamento (CT) e tratadas com LAAO por 18 horas. As clulas foram maracadas com o anticorpo anti-c-abl.

Conforme descrito no tem 3.4 em Material e Mtodos, a expresso protica

do gene endgeno utilizada para a normalizao dos valores da densidade das

bandas das protena-alvo. Nesses experimentos a tubulina (48kDa), foi empregada

como protena endgena .

4.7. Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real

Com o objetivo de checar se a LAAO capaz de modular a expresso de

molculas que controlam a apoptose celular foi realizada a quantificao da

expresso dos genes pr e anti-apoptticos da famlia BCL-2 e via extrnseca em

clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO em dose que no induziram a

apoptose celular.

Assim sendo, a anlise da expresso gnica foi realizada nas amostras de

cDNA de clulas HL-60 tratadas com LAAO nas concentraes de 0,5 g/mL e

1,0 g/mL (Tabela 3) e de clulas HL-60.BCR-ABL cultivadas com LAAO nas

concentraes de 1,0 g/mL e 1,5 g/mL (Tabela 4).

Para o melhor entendimento dos resultados, os mesmos esto descritos

separadamente para a HL-60 e HL-60.BCR-ABL e conforme as concentraes de

LAAO utilizadas para cada linhagem.

Os resultados obtidos na HL-60 tratada com LAAO na concentrao de

0,5g/mL de LAAO foram:

- diminuio da expresso de bad, fasl, bcl-2 e bcl-w;

LAAO (g/mL)

_______________________________________________________________Resultados 42

- aumento da expresso de bid e fas.

Os genes a1, bak , bax, bim, bcl-xLe c-flip no foram modulados pela LAAO

nesta concentrao.

Os dados obtidos na HL-60 tratada com LAAO na concentrao de 1,0g/mL

foram:

-diminuio da expresso de bax, bak, bid, bimel e bcl-2;

- aumento da expresso de bad, fas, fasl, a1, bcl-w e c-flip.

O gene bcl-xl no foram modulados nesta concentrao.

_______________________________________________________________Resultados 43

Tabela 3- Expresso gnica em clulas HL-60 tratadas com LAAO nas concentraes de 0,5 e 1,0g/mL.

Genes Pr-apoptticos Genes Anti-apoptticos

CT/conc

LAAO(g/mL)

-2ddct Resultado CT/conc

LAAO(g/mL)

2-ddct Resulta

do

bad CT

0,5

1,0

1,00

0,41

1,90

------

a1 CT

0,5

1,0

1,00

1,12

4,43

-----

AM

bak CT

0,5

1,0

1,00

0,98

0,53

AM

bcl-2 CT

0,5

1,0

1,00

0,30

0,23

------

bax CT

0,5

1,0

1,00

1,01

0,29

------

AM

bcl-xl CT

0,5

1,0

1,00

1,10

1,17

------

AM AM

bid CT

0,5

1,0

1,00

2,50

0,08

------ bcl-w CT

0,5

1,0

1,00

0,25

1,76

------

bimel CT

0,5

1,0

1,00

0,96

0,77

-----

AM

c-flip CT

0,5

1,0

1,00

1,10

1,46

-----

AM

fas CT

0,5

1,0

1,00

1,50

7,82

------

fasl CT

0,5

1,0

1,00

0,11

4,67

------

CT= controle; AM= ausncia modulao. As flechas indicam aumento ou diminuio da expresso.

Os dados obtidos na HL-60.BCR-ABL tratada com LAAO na concentrao de

1,0 g/mL foram:

-diminuio da expresso de bad, bax, bimel e bcl-xl;

-aumento da expresso de bid, fasl, a1, bcl-2 e bcl-w.

_______________________________________________________________Resultados 44

Os genes bak, fas e c-flip no foram modulados pela LAAO nesta

concentrao. Os resultados obtidos na HL-60.BCR-ABL tratada com LAAO na

concentrao de 1,5 g/mL foram:

- diminuio da expresso de bad, bak, bax, fas,

- aumento da expresso de bid, fasl, a1, bcl-2 bcl-xL e bcl-w;

Os gene bim e c-flip no foram modulados pela LAAO nesta concentrao.

_______________________________________________________________Resultados 45

Tabela 4- Expresso gnica da clula HL-60.BCR-ABL tratada com LAAO nas concentraes 1,0 e 1,5g/mL.

Genes Pr-apoptticos Genes Anti-apoptticos

CT/conc

LAAO(g/mL)

-2ddct Resultado CT/conc

LAAO(g/

efeito do veneno bruto e da l-aminoácido oxidase de bothrops

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