UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO

PROGRAMA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOFOTÔNICA APLICADA ÀS CIÊNCIAS

DA SAUDE

ADRIANA DE BRITO

EFEITO DA TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE O

REMODELAMENTO DO TECIDO CONJUNTIVO E A REGENERAÇÃO DO

MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATOS IDOSOS.

São Paulo, SP

2016

2

ADRIANA DE BRITO

EFEITO DA TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE O

REMODELAMENTO DO TECIDO CONJUNTIVO E A REGENERAÇÃO DO

MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATOS IDOSOS.

Tese apresentada à Universidade Nove de Julho,

para obtenção do título de Doutor em Biofotônica

aplicada às Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari

Co-orientadora: Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes

São Paulo, SP

2016

3

FICHA CATALOGRÁFICA

Brito, Adriana de.

Efeito da terapia laser de baixa potência sobre o remodelamento do

tecido conjuntivo e a regeneração do músculo esquelético de ratos

idoso./ Adriana de Brito. 2016.

60 f.

Tese (Doutorado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São

Paulo, 2016.

Orientador (a): Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari.

1. Envelhecimento. 2. Regeneração. 3. Laser de baixa potência. 4.

LBP. 5. Colágeno. 6. Músculo esquelético.

I. Ferrari, Raquel Agnelli Mesquita. II. Titulo

CDU 615.831

4

5

DEDICATÓRIA

Aos meus pais,

Que me deram a vida e ensinaram a vivê-la com dignidade,

Que iluminaram os caminhos obscuros com afeto e dedicação

para que eu trilhasse sem medo e cheios de esperanças,

Que se doaram inteiros e renunciaram aos seus sonhos,

para que, muitas vezes, pudesse realizar o meu,

não bastaria um muitíssimo obrigado.

Não temos palavras para agradecer tudo isso.

Uma emoção que jamais seria traduzida por palavras.

Amo vocês!

6

Agradecimentos

Primeiramente quero agradecer a Deus por estar presente em todos os momentos da

minha vida, desde minha geração no ventre até os dias atuais.

Agradeço a profa Raquel Mesquita-Ferrari e profa Kristianne Porta pela excelente

orientação e pelas oportunidades que me foram oferecidas pelo grupo de trabalho.

Ao meu pai, que mantenho uma imensa saudade dos seus abraços de carinho, pois me

confortavam sempre quando mais precisava. Obrigada por suas palavras sábias, seu

olhar fascinante e por todos os ensinamentos que me deu.

À minha família, meus irmão Leandro, Artur e Saulo, e em especial minha mãe e Evaldo,

pelo amor, amizade, carinho, confiança, pelos incentivos, pelas oportunidades, pela

formação do meu caráter. Sem a ajuda de vocês não chegaria onde cheguei.

Em especial ao meu amor Sergio Louzada, que me conquistou em todos os sentidos e

que a cada dia é uma pessoa mais e mais maravilhosa e surpreendedora. Um único

parágrafo é pouco para dizer tudo o sinto. Mas as mexidinhas da Luana, o chamego da

Nina, suas conversas com nossa pequena e as carícias na barriga, podem ser resumidos

em uma única palavra: eu te amo!! Somos uma linda família! Obrigada por me fazer muito

feliz!

Aos sogros, querido Dalmir e Vera, que me deram de presente uma das pessoas mais

importante da minha vida. Obrigada por serem tão especiais!

À Universidade Nove de Julho, aos chefes, colaboradores e amigos que aqui conquistei.

Obrigada pela oportunidade, pelos apoios, compreensão e contribuições para minha

formação pessoal e profissional.

7

SUMÁRIO

Lista de Figuras 07

Lista de Tabelas e Quadros 08

Lista de Abreviaturas e Símbolos 09

Resumo 11

Abstract 12

1. Contextualização 13

1.1 Lesão e regeneração do músculo esquelético 14

1.2 Regeneração do músculo esquelético em idosos 16

1.3 Remodelamento de Matriz Extracelular e Envelhecimento 19

1.4 IL-6 e IL-1B: importância no processo de processo muscular 19

1.5 Laser de Baixa Potência e reparo muscular 19

2. Justificativa 22

3. Objetivos e objetivos específicos 23

4. Metodologia 24

4.1 Procedimento de criolesão do músculo esquelético TA 27

4.2 Procedimento de irradiação laser de baixa potência 27

4.3 Eutanásia dos animais 29

4.4 Análise morfológica qualitativa e quantitativa do músculo TA 30

4.5 Análise da distribuiçãoo e organizaçãoo do colágeno 31

4.6 Imunohistoquímica para IL-6 e IL-1beta 31

5. Análise Estatística 32

6. Resultados 32

7. Discussão 47

8. Conclusão 49

9. Referências Bibliográficas 50

10. Anexos 57

8

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Quatro fases do processo de reparo inter-relacionadas e dependentes do tempo. 15

Figura 2. Ciclo de regeneração da fibra muscular 16

Figura 3. Crescimento de fibras musculares

Figura 4. Deposição de colágeno matriz extracelular (ECM)

18

20

Figura 5. Fluxograma dos grupos de animais estudados 26

Figura 6. Demonstração do procedimento de criolesão 28

Figura 7. Equipamento Laser

Figura 8. Procedimento de irradiação com LBP

29

29

Figura 9. Metodologia do estudo 30

Figura 10. Fluxograma do processo de seleção dos artigos

Figura 11. Fotomicrografia histológica de músculos tibial anterior, coradas com HE

32

36

Figura 12. Dados estatística da análise quantitativa da morfologia do músculo TA 37

Figura 13. Fotomicrografia de corte histológico do músculo corado com Picrosirius Red 39

Figura 14. Quantificação de fibras colágenas no músculo tibial anterior 40

Figura 15. Fotomicrografia de imunohistoquímica para expressão de IL-1beta 44

Figura 16. Fotomicrografia de imunohistoquímica para expressão de IL-6 45

Figura 17. Análise estatística da imunoexpressão de IL-6 e IL-1beta 46

9

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Critérios estabelecidos para seleção dos artigos para revisão sistemática 25

Tabela 2. Parâmetros do Laser de Baixa Potência AsGaAl (Arseneto de Gálio e Alumínio) 28

Tabela 3. Resultados do Artigo de Revisão Sistemática 33

10

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ATP Adenosina trifosfato

AsGa Arseneto de Gálio

AsGaAl Arseneto de Gálio Alumínio

BCIP 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil fosfato

BSA Albumina de soro Bovino

CaCl2 Cloreto de calico

CDNA DNA complementar

cm2

centímetro ao quadrado

CO2 Dióxido de carbono

DAB Diaminobenzidina

DEPC Dimetil pirocarbonato

DNA Ácido desoxirribonucleico

dNTP Deoxinucleotídeos trifosfatos

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FGF Fator de crescimento fibroblático

GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

HeNe Hélio Neônio

HCL Ácido clorídrico

HGF Fator de crescimento hepatocitário

IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina 1

InGaAlP Índio Gálio Alumínio Fósforo

IL Interleucina

J Joules J/cm2 – Joules por centímetro ao quadrado

LBP Laser de baixa potência

kDa KiloDalton

MEC Matriz extracelular

11

mg miligrama

mL mililitro

mg/g miligrama por grama

mg/mL miligrama por mililitro

mL/kg mililitro por quilo

mM milimolar

mm milímetro

MRFs Fatores regulatórios miogênicos

MyoD Fator de determinação miogênico 1

mW miliwatts

NaN3 Azida de sódio

NaCl Cloreto de sódio

nM nanomolar

nm nanômetros

PCR Reação em cadeia polymerase

RNA Ácido ribonucleico

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

Rpm Rotações por minuto

SDS Dodecil sulfato de sódio

TGF-β Fator de crescimento transformador β

TNF-α Fator de necrose tumoral α

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial

W/cm2 Watts por centímetro ao quadrado

ZnCl2 Cloreto de zinco

μL microlitros

μg micrograma

μm micrometro

λ Comprimento de onda

12

RESUMO

O envelhecimento altera a ativação e proliferação de células satélites e células

inflamatórias no músculo esquelético e promove o aumento de fibroblastos, diminuição da

vascularização e espessamento da lâmina basal. O objetivo do presente estudo foi avaliar

os efeitos do LBP no músculo tibial anterior (TA) de ratos idosos após criolesão sobre os

aspectos morfológicos, sobre a expressão de Il-6 e IL-1 beta, a distribuição e organização

do colágeno. Foi realizada fotomicrografia histológica do músculo TA corados com HE,

Picrosirius Red e Imunohistoquímica para IL-6 e IL-1 beta. Os resultados foram quantitativa

e qualitativamente no software Image J. O estudo foi aprovado pelo CEUA-UNINOVE e

foram utilizadas n=30 patas de ratos machos Wistar distribuídas em 03 grupos

experimentais: - Grupo 1 Controle (n=4): animais não lesionados ou tratados com LBP;

Grupo 2 Criolesão sem tratamento LBP (n= 13) e Grupo 3 Criolesão tratado com LBP

infravermelho (n=13). O LBP foi aplicado no TA após 2h da indução da lesão e consistiu de

aplicações diárias até o dia do sacrifício (grupos 1, 3 ou 7 dias) de acordo com o grupo

estudado. Foram utilizando os parâmetros (λ= 780nm; 1000mW/cm2 densidade de potência;

40mW de potência; 3,2J de energia total; tempo de 10s). Na análise histomorfológica, o

grupo 7 dias tratado teve diminuição significantes de infiltrado de células inflamatórias e

aumento de fibras imaturas e novos vasos sanguíneos, comparado ao grupo 7 dias não-

tratado (p<0,05). Na análise da distribuição e organização do colágeno, houve diferença do

grupo controle em relação ao grupo 7 dias tratado e não-tratado (p<0,05). A expressão de

IL-6 por imunohistoquímica, foi maior em todos os grupos estudos (p<0,05) comparado ao

controle, porém não houve diferença entre os grupos lesionados tratados ou não. Quanto a

expressão de IL-1 beta, houve aumento da expressão em 3 dias tratados comparados ao

grupo 1 e 7 dias tratados. Em conclusão, o LPB demonstrou efeito modulatório no processo

de reparo muscular em animais idosos.

Descritores: envelhecimento, regeneração, Laser de Baixa Potência, LBP, colágeno,

músculo esquelético.

13

ABSTRACT

The aging changes the activation and proliferation of satellite cells and inflammatory cells

in skeletal muscle and fibroblasts promotes increased, decreased vascularization and

thickening of the basal lamina. The aim of this study was to evaluate the effects of LBP on

the tibialis anterior (TA) muscle of aged rats after cryoinjury on morphological, on the

expression of IL-6 and IL-1 beta, distribution and collagen organization. It was performed

histological photomicrographs of the TA muscle stained with hematoxylin-eosin,

Picrosirius Red, and immunohistochemistry for IL-6 and IL-1beta. The results were

quantitatively and qualitatively in Image J software. The study was approved by CEUA-

UNINOVE and were used n= 30 legs of male rats Wistar divided into 03 experimental

groups: - Group 1 Control (n= 4): animals uninjured or LBP-treated; Group 2 cryoinjury

LBP untreated (n= 13) and Group 3 treated with LBP infrared cryoinjury (n= 13). The LBP

was applied to muscle after 2h of induction of injury and consisted of daily application until

the day of sacrifice (Groups 1, 3 or 7 days) according to the study group. We were using

the parameters (λ = 780nm, 1000mW / cm2 power density, power 40mW; 3,2J total

energy, time of 10s). In histomorphological analysis, seven days the treated group had a

significant decrease in infiltration of inflammatory cells and increased immature fibers and

new blood vessels compared to Group 7 days did not-treated (p <0.05). In the analysis of

distribution and collagen organization, there was a control group difference from the group

treated 7 days and non-treated (p <0.05). The expression of IL-6 by

immunohistochemistry, was higher in all study groups (p <0.05) compared to control, but

there was no difference between the groups treated injured or not. The IL-1beta

expression, there was increased expression in 3 days treated compared to group 1 and 7

days treated. In conclusion, the LPB shown modulatory effect on muscle repair process in

aged animals.

Descriptors: aging, regeneration, low-level laser therapy, LLLT, collagen, skeletal

muscle.

14

1. CONTEXTUALIZAÇÃO

O músculo esquelético compreende cerca de 40% a 45% do peso corpóreo,

sendo um tecido dinâmico com alta capacidade em termos de remodelamento, reparação

e regeneração (Ceafalan et al., 2014). Nos seres humanos, 40% da massa muscular é

perdida entre os 20 e 80 anos de idade (Evans 1997; Lexell, Taylor, Sjostrom et al.,1988;

Reid, Fielding 2012).

Durante o processo de envelhecimento as fibras musculares danificadas são menos

substituídas por fibras novas e a resposta inflamatória muscular torna-se mais

prolongada. Essa sequência de eventos resulta em perda da massa muscular, redução

do número de fibras musculares, da força e da qualidade da execução do movimento,

com concomitante, fibrose e deposição da matriz extracelular (MEC) (Allen Herbst et al,

2013; Mann et ai, 2011; Jang et al 2011; Brooks, Myburgh 2014; Peake et al., 2010).

Esses fatores favorecem a ocorrência de lesões em idosos, e reduzem a capacidade

regenerativa do músculo esquelético (Sobrian et al., 2014).

Apesar das diferentes hipóteses propostas, a causa para explicar essa imparidade

relacionada à idade, a regeneração do músculo esquelético e os mecanismos envolvidos,

ainda permanecem desconhecidos (van der Poel et al., 2011).

No envelhecimento ocorre um estado pró-inflamatório que estaria relacionado com

o desenvolvimento da sarcopenia, uma vez que os níveis elevados de citocinas induziram

a síntese reduzida da proteína muscular. Em idosos ocorre níveis plasmáticos elevados

de IL-6, TNF e IL-1 (Evans et al., 2010), sendo estes associados com perda de músculo e

menor força em indivíduos idosos. Em particular, a IL-6 desempenha um papel na

aceleração da sarcopenia e fragilidade (Visser et al 2002;. Schaap et al., 2009).

1.1 Lesão e regeneração do músculo esquelético

A capacidade de reparo do tecido muscular esquelético após uma lesão requer uma

série de eventos, que envolve atividades coordenadas por células inflamatórias. Após a

ocorrência de lesão, inicia-se o reparo do músculo esquelético que compreende um

processo complexo e altamente organizado envolvendo quatro fases inter-relacionadas

denominadas degeneração, inflamação, regeneração e formação de fibrose-

remodelamento (ver figura 1) (Jang et al., 2011).

15

Figura 1. Quatro fases do processo de reparo interrelacionadas e dependentes do

tempo. Fonte: adaptação de Carosio et al., 2011.

A regeneração muscular é um fenômeno complexo, envolvendo a substituição de

fibras danificadas por novas fibras musculares. Este processo no músculo esquelético

envolve a participação de células precursoras quiescentes localizadas entre a lâmina

basal e sarcolema da fibra muscular madura denominadas células satélites (inserir

referências aqui)

Logo após uma lesão essas CS são ativadas, proliferam-se passando a ser

denominadas mioblastos, fundem-se as fibras musculares já existentes ou fundem-se

com as células satélites vizinhas para gerar novas fibras musculares. Durante estas

etapas, estas células expressam diferentes fatores regulatórios miogênicos (MRFs)

(Foschini et al., 2004; Fernandes et al., 2011).

16

Figura 2. Ciclo de regeneração da fibra muscular. Fonte: (adaptada de Hawke and

Garry, 2001 disponível em http://www.efdeportes.com/efd160/variaveis-que-influenciam-o-dano-muscular.htm)

Os MRFs expressam nas fases iniciais do processo de reparo são especialmente

MyoD e Myf5 enquanto que nas fases mais tardias são expressos os MRFs relacionados

a diferenciação da fibra sendo especialmente miogenina e MRF4 fatores regulatórios

miogênicos específicos.

Foram identificados dois grupos de MRFs: os MRFs primários que são MyoD e

Myf-5, atuam na determinação da miogenese favorecendo a ativação das células

satélites e proliferação dos mioblastos. E os MRFs secundários que são a miogenina e

MRF4, relacionados a diferenciação celular de mioblastos em miotubos e, posterior fusão

em fibra muscular pré existente ou para a formação de nova fibra (Vatansever et al.,

2012; Meregalli et al., 2014).

A fase inicial de ativação e proliferação das células é caracterizada pela expressão

de MyoD, a qual exibe aumento 3 horas após a lesão, atingindo seu pico em 12 horas e,

depois desse período, volta a se normalizar. Com o avançar da regeneração, é expressa

a Miogenina, um marcador peculiar da fase de diferenciação das células satélites durante

o processo de regeneração para reparo ou formação de novos mioblastos (Pertille et al.,

2012).

17

1.2 Regeneração do músculo esquelético em idosos

Com o envelhecimento, a homeostase do tecido muscular é progressivamente

interrompida e a capacidade das células-satélites (CS) para reparar o músculo lesionado

diminui acentuadamente. Estudos recentes mostram que as SC são submetidas a

alterações celulares intrínsecas que afetam profundamente a função regenerativa (Blau

et al., 2015).

Em animais já foi demonstrado que o reparo da fibra muscular é diferente em

animais jovens e em idosos. Em resposta a lesão, as CS presentes na lâmina basal de

um músculo jovem são ativadas por estímulos provenientes de fibroblastos, células

intersticiais, macrófagos residentes, fibro/progenitores para formar novas fibras

musculares que são quase indistinguíveis das fibras pré-existentes. No músculos de

idosos, o processo de reparo resultará em fibras recém-formadas de tamanho reduzido,

além de um espessamento da lâmina basal por deposição de componentes da matriz

extracelular (MEC), que pode ser atribuído ao aumento da atividade de fibroblastos

residentes e à diminuição de células satélite potencialmente miogênicas (ver figura 1)

(Mann et al, 2011; Uezumi et al, 2010; Arsic et al., 2004).

A regeneração muscular é mais lenta em animais idosos, que coincide com a

diminuição da fagocitose por células inflamatórias. Os animais depletados de neutrófilos e

monócitos também mostraram acúmulo de tecido muscular lesionado, o que sugere a

capacidade diminuída para remover os restos de tecido por fagócitos, retardando

processo regenerativo (Tidball 2005).

Assim, em idosos o processo de reparo irá resultar em fibras musculares recém-

formados de tamanho reduzido e espessamento da lâmina basal por deposição

melhorada de componentes da matriz extracelular (MEC), que poderia, potencialmente,

ser atribuída ao aumento da presença e da atividade de fibroblastos residentes e à

diminuição de células satélite potencial miogênica. A conversão de células miogênica em

células fibrogênicas também poderia contribuir para o acúmulo de matriz extra-celular.

Estas novas condições do microambiente dentro do nicho de células-satélite irá impedir

funções de células satélite eficientes e reparação muscular (Mann et al, 2011; Arsic et al.,

2004).

18

Figura 3. Crescimento de Fibras Musculares: acúmulo da matriz extracelular (MEC) após lesão

após é diferente nos músculos jovens e idosos. Fonte: Mann et al. Skeletal Muscle 2011)

A fase degenerativa é caracterizada por influxo de cálcio extracelular e proteólise,

que resulta em necrose. A fase inflamatória é caracterizadas por infiltrado de leucócitos

ativados que amplificam a resposta inflamatória e atuam na regeneração muscular

(Ferrari, 2005; Hughes et al., 2002). Essas fases iniciam-se minutos após a lesão e

duram até 2 semanas (Ceafalan et al., 2014; Jang et al., 2011; Chargè et al., 2004; Ekaza

et al., 2006).

Na fase final da regeneração ocorre a maturação das fibras musculares e a

reorganização do tecido cicatricial de forma a permitir a recuperação da capacidade

funcional muscular (Fernandes et al., 2011; Ceafalan et al., 2014; Chargè et al., 2004;

Ekaza et al., 2006). A maioria das lesões do músculo esquelético não formam tecido

cicatricial fibroso incapacitante, contudo a proliferação de fibroblastos pode ser excessiva

e resultar na formação de tecido cicatricial denso no interior da lesão muscular

(Fernandes et al., 2011).

Contudo, as alterações morfofisiológicas que ocorrem nos tecidos em decorrência

do envelhecimento acarretam declínio da ativação e proliferação das células satélites,

lenta ativação de células inflamatórias, aumento da produção de fibroblastos, diminuição

da vascularização, espessamento da lâmina basal e redução no nível de IGF-I (fator de

crescimento semelhante a insulina do tipo I), que está relacionada com o

desenvolvimento muscular. Em conjunto, essas alterações desencadeiam um ambiente

celular desfavorável à regeneração muscular do idoso (Pertille et al., 2012).

Além disso, também existe a associação do envelhecimento com a alteração do

número absoluto de células satélites (CS) e a diminuição da capacidade miogênica, que

estão parcialmente atribuídos a senescência e apoptose de CS envelhecidas, pois podem

reduzir a ativação, proliferação e a função das CS pela depleção de certas populações de

CS (Sobrian et al., 2014; Garcia Prat et al., 2013; Rhoads et al 2013).

Célulasatélite

Lâminabasal

Fibramuscular

Macrófagoresidente Aumentonúmero

defibroblasto

Atrofiamuscular

DeposiçãoMEC

JOVEMIDOSO

19

As CSs são particularmente sensíveis à miostatina e fatores de crescimento. A

miostatina (fator de crescimento da diferenciação 8, do inglês denominado GDF8),

membro da superfamília de fatores de crescimento (TGF), é um regulador robusto de

desenvolvimento muscular e crescimento pós-natal, cuja atividade é regulada por uma

série de eventos pós-transcripcionais complexos (Mesquita-Ferrari et al., 2011; White et

al 2014).

Segundo White et al 2014, não é certo se a abundância ou a atividade de

miostatina são afetados pelo envelhecimento ou se miostatina desempenha um papel na

causa da sarcopenia. No entanto, a inibição da miostatina em animais adultos e mais

velhos aumenta significativamente a massa muscular e confere benefícios sobre as

medidas de desempenho e metabolismo.

1.3 Remodelamento de Matriz Extracelular e Envelhecimento

Outro ponto a ser considerado no panorama da regeneração é o remodelamento do

tecido conjuntivo que depende da ação coordenada da degradação e síntese de

proteínas intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) (Bischoff et al.,

1994).

Em se tratando do envelhecimento a fibrose no tecido muscular também é uma

alteração presente decorrente do aumento de tecido conjuntivo (Mann, 2011) devido a

substituição do tecido muscular por tecido conjuntivo, e à redução na degradação e

síntese das fibras colágenas gerando aumento na quantidade de ligações cruzadas

dentro e entre as fibrilas (Imamura et al., 1999). Além disso, no envelhecimento ocorre

um aumento da quantidade do colágeno, que se torna mais firme e estável gerando uma

formação excessiva de tecido fibroso, resultando em comprometimento funcional do

músculo esquelético (Barberi et al., 2013).

20

1.4 Citocinas IL-6 e IL-1B: importância no processo de processo muscular

As citocinas compreendem uma grande família de proteínas que desempenham

papel mensageiros intracelulares. Algumas citocinas ganham destaque com relação ao

seu papel durante o processo de regeneração muscular, como a IL-6 e IL-1B. A IL-6 é

uma citocina pró-inflamatória envolvida na ativação da proliferação de células satélites, a

qual tem grande importância no crescimento e reparo muscular.

A regeneracao do muscular pode depender da ativacao e supressao da sinalizacao

de citocinas inflamatorias, como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta

(IL-1b) e interleucina-6 (IL-6), apresentam efeitos diversos no musculo esqueletico

(Langen, Schols et al., 2002).

1.5 Laser de Baixa Potência e reparo muscular

No âmbito experimental das intervenções terapêuticas, o laser de baixa potência

(LBP) tem demonstrado resultados promissores durante o processo de reparo muscular

após diferentes tipos de lesão (Bibikova, Oron 1993; Bibikova, Oron 1995; Oliveira et al.

1999; Weiss, Oron 1992; Mesquita-Ferrari, 2011, de Almeida et al. 2011) porém a maioria

dos estudos experimentais se restringem a animais jovens.

Já foi demonstrado que o LBP quando aplicado no tecido muscular lesionado

é capaz de reduzir a dor, o edema, o influxo de leucócitos, a mionecrose e ainda alterar a

expressão de citocinas, enzimas inflamatórias e o remodelamento do colágeno,

acelerando o processo de reparo (Dourado et al. 2003, Barbosa et al. 2008, Barbosa et

al. 2009, Mesquita-Ferrari et al. 2011, de Souza et al. 2011, Baptista et al. 2011,

Fernandes et al. 2013, Alves et al 2014).

Contudo, em animais idosos há poucos estudos que associam o LBPa regeneração

do músculo esquelético, e esses estudos, divergem quanto aos parâmetros dosimétricos

utilizados (Vatansever, et al., 2012; Pertille et al., 2012).

Pertille et al., 2012 avaliaram o efeito da laserterapia em modelo de contusão

muscular em ratos de 18 meses de idade (GaAlAs comprimento de onda de 830 nm,

emissão contínua, potência de saída de 30 mW, área do feixe de 0,07 cm2 e densidade

de energia de 4 J/cm2). A terapia foi aplicada por meio da técnica pontual, distribuída em

2 pontos, sendo um ponto realizado imediatamente em cima da lesão e o outro no terço

distal do músculo, com distância de 1 cm. A aplicação de cada ponto teve duração de 16

segundos. O tratamento teve início 24 horas após a contusão, diariamente, com

intervalos de 24 horas, frequência de cinco vezes por semana e intervalo de dois dias,

totalizando sete ou 21 sessões, de acordo com o grupo. Após 21 dias de tratamento,

21

houve redução significativa na área de inflamação/regeneração no grupo tratado com

laser comparado ao grupo apenas lesionado. Na área de secção transversal das fibras

em processo de regeneração, não houve diferença estatística entre ambos os grupos.

O estudo realizado por Vatansever, et al., 2012 avaliou os efeitos da LBP (λ=830

nm, por 29 segundos e energia de 0, 87J) após criolesão no músculo tibial anterior (TA)

de ratos machos Wistar de 3 meses e 10 meses (grupo jovem e adultos,

respectivamente). A análise morfológica não evidenciou diferença na regeneração

muscular entre ratos adultos irradiados e não irradiados. Contudo, a expressão de MRFs

foi regulada positivamente com aumento da expressão de RNAm de MyoD em ratos

adultos. A LBP induziu o aumento da maturação de células satélites em mioblastos e

miotubos, reduzindo a atrofia muscular em ratos irradiados adultos. Esses resultados são

muito importantes para o desenvolvimento de novas estratégias e modalidades

terapêuticas.

De Melo Rambo et al., 2014 analisaram o efeito do LBP (comprimento de onda de

660 nm; potência de 30 mW, energia total de 2 J) na cicatrização de feridas cutâneas em

ratos jovens e idosos. A análise histológica mostrou que o reparo é retardado em animais

idosos em relação aos jovens, principalmente no que se refere a fase inflamatória

(polimorfo nuclear, macrófagos e linfócitos) e a fase da proliferação da re-epitelização,

angiogênese e fibrogênese. Apesar desse achado, ambos os grupos tratados com LBP

tiveram aumento no processo de reparo quando comparado com os seus grupos de

controle. Observaram que a LBP foi eficaz na diminuição da expressão dos mediadores

pró-inflamatórias (IL-1-beta e TNF-alfa) durante todo o período experimental, embora

houve um aumento da expressão da proteína da citocina anti-inflamatória IL-10. No

entanto, os níveis de IL-10 estava aumentado nos animais jovens, comparado aos

animais idosos.

22

2. JUSTIFICATIVA

Diante do aumento da expectativa de vida, é imprescindível o estabelecimento de

novos recursos terapêuticos na prática clínica para melhorar o processo de reparo

muscular, a qualidade motora e o tempo de resolução de uma lesão (Sobrian et al.,

2014). O laser de baixa potência (LBP) tem sido vastamente aplicado como um novo

recurso terapêutico em estudos envolvendo seres humanos e/ou modelos experimentais

(Fukuda et al, 2013; Silveira et al, 2009).

O uso do LBP está bem fundamentado na literatura por ter efeito sobre o

tratamento de desordens inflamatórias, regeneração, reparo do músculo esquelético e

também sobre outros tipos de lesões e tecidos. Promove efeitos modulatórios positivos

sobre as células precursoras musculares e no remodelamento de colágeno, conforme

estudado previamente em nosso laboratório de pesquisa (Alves et al., 2014a; Alves et al.,

2014b; Franca et al., 2013).

Contudo, a maioria dos estudos experimentais se restringe a animais jovens e/ou

adultos (Bibikova, Oron 1993; Bibikova, Oron 1995; Oliveira et al. 1999; Weiss, Oron

1992; Lopes-Martins et al.2006; de Almeida et al., 2011), sendo poucos realizados com

animais idosos (Pertille et al., 2012; Vatansever, et al., 2012).

Por esse motivo, este estudo visou avaliar os efeitos do LBP no processo de reparo

do músculo esquelético em animais idosos de forma a verificar a modulação causada por

este recurso durante o envelhecimento e ao mesmo tempo permitir a comparação com os

efeitos induzidos em animais adultos, previamente relatados.

23

3. OBJETIVO

O presente estudo teve o objetivo avaliar os efeitos do LBP sobre os aspectos

morfológicos do músculo esquelético tibial anterior de ratos senis e sobre o

remodelamento do tecido conjuntivo.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Analisar os efeitos do LBP sobre:

Os aspectos morfológicos (infiltrado inflamatório, mionecrose, edema, vasos

maduros e a presença de fibras musculares imaturas) do tecido muscular de

animais idosos após lesão aguda induzida por criolesão.

O remodelamento da MEC durante o reparo muscular de animais idosos por meio

da deposição e a distribuição do colágeno após lesão aguda induzida por

criolesão;

A imunoexpressão de IL-6 e IL-1β durante as diferentes fases do processo de

reparo do músculo esquelético de animais idosos após lesão aguda.

24

4. METODOLOGIA

O estudo foi realizado no laboratório de pesquisa do Programa de Mestrado e

Doutorado em Biofotônica aplicada em Saúde utilizando metodologia de acordo com as

normas internacionais de ética na experimentação animal (National Research Council,

1996) e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisas Animais da Universidade Nove de

Julho – UNINOVE (protocolo no. An0002/2014) (vide carta de aprovação anexo 1).

Para a delineamento do estudo com idosos foi realizada uma revisão sistemática

da literatura, incluída no artigo 1. A metodologia empregada no artigo encontra-se a

seguir:

A pesquisa bibliográfica foi realizada utilizando o banco de dados on-line

MEDLINE (Medical análise da literatura e Retrieval System Online) e SCOPUS para

artigo original sobre o efeito de modulação da terapia laser de baixa intensidade (LBI) na

regeneração do músculo esquelético em modelo experimental animal mais velho,

combinações do seguintes palavras-chave e Medical Subject Headings (Mesh): animal,

rato, ratos, envelhecido, envelhecimento, animais idosos, velho, mais velho, idoso, fadiga,

laser, laser terapia, terapia laser de baixa intensidade, a fototerapia, fotobiomodulação,

músculo esquelético, reparação, regeneração. Dez anos era a data limite aplicada à

pesquisa. Estudos adicionais foram identificados a partir da lista de referências de artigos

originais ou artigos de revisão.

25

Tabela 1. Critérios estabelecidos para seleção dos artigos para revisão sistemática.

Inclusão de estudos que seguiram os seguintes critérios:

Estudos experimentais envolvendo animais idosos, modelo de lesão do músculo

esquelético, fadiga e terapia laser de baixa potência.

Inclusão de estudos que descrevem os seguintes parâmetros dosimétricos:

Energia total (J) e densidade de energia (J/cm2)

Densidade de energia (J) e densidade de potência (W/cm2)

Feixe tamanho do ponto (cm2)

Potência (kW ou W).

Frequência (Hertz).

Tempo de tratamento (s) e dose por sessão de tratamento (J).

Tempo de irradiação foram obtidos utilizando fórmulas tradicionais.

Comprimento de onda (nm).

Pulso em nano-segundos ou ciclo de trabalho de dispositivo (%).

Exclusão de estudos que relataram os seguintes critérios:

Artigos escritos em Russo.

Não inclusão de um grupo lesão sem tratamento, fadiga ou lesão muscular não

esquelético.

Os estudos in vitro ou realizados em seres humanos.

Estudos que não descreveram adequadamente o modo de aplicação, a energia,

potência e outros parâmetros.

Relatos de casos ou artigos de revisão.

Legenda: J: joule; kW: quilowatts; W: watts; s: segundos; %: porcentagem; J/cm2: joule por centímetro

quadrado; W/cm2: watts por centímetro quadrado; nm: nanô

4.1 ANIMAIS

Foram utilizados para o estudo ratos Wistar (Rattus norvegicus: var. albinus,

Rodentia, Mammalia) machos, da linhagem Wistar, com vinte meses de idade e massa

corporal 400±15 gramas, mantidos no biotério da UNINOVE, em caixas plásticas

apropriadas, temperatura ambiente (22°C), umidade relativa (40%), luminosidade

controlada com ciclo de 12h (claro/escuro) e com comida e água ad libitum.

A metodologia do estudo foi aprovada pelo Comitê de Ética em Animais da

Universidade Nove de Julho (CEUA-UNINOVE), sob protocolo no. An0002/2014.

Foi realizado modelo de criolesão aguda no músculo esquelético tibial anterior de

animais idosos. Foram utilizadas no total (n= 30) patas, distribuídos aleatoriamente em 03

grupos experimentais:

Grupo 1 Controle: os músculos tibial anterior (TA) não foram submetidos a

nenhum procedimento, havendo remoção do músculo de (n= 4) patas;

26

Grupo 2 Criolesão sem tratamento: o músculo TA direito (TAD) dos animais

foram criolesionados e não receberam tratamento com LBP, sendo (n= 13) patas;

Grupo 3 Criolesão tratado com LBP infravermelho: o músculo TA esquerdo

(TAE) dos animais foram criolesionados e tratados com LBP 780 nm, sendo

(n=13) patas.

Figura 4. Fluxograma dos grupos de animais estudados.

Os animais de todos os grupos estudados foram eutanasiados após 1, 3 ou 7 dias

após a criolesão (sem tratamento ou tratado com LBP), grupos 2 e 3, respectivamente.

Os animais do grupo irradiado com LBP receberam um aplicação diária diretamente

sobre a área correspondente ao local da lesão, conforme figura 8.

27

4.1 Procedimento de Criolesão do Músculo Esquelético Tibial Anterior

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados de acordo com o descrito por

Miyabara et al. (2005) e Mesquita-Ferrari et al. (2011). Os animais foram pesados e em

seguida anestesiados com injeção intraperitonial de uma mistura proporcional à massa

corporal com administração intraperitoneal na dose de 80mg/kg de ketamina (Dopalen,

Vetbrands, Jacareí, SP) e na dose de 10mg/kg de xilazina (Anasedan, Vetbrands,

Jacareí, SP). Para aplicação da anestesia foram utilizadas seringas da marca BD 100

Unidades com Agulha BD Ultra-Fine®, modelo insulina com a agulha Ultra-Fine®

(regular), comprimento: 12,7 mm, calibre: 0,33 mm e bisel trifacetado. Posteriormente à

indução anestésica, os animais foram posicionados em uma superfície plana e realizada

tricotomia da região correspondente ao músculo TA.

Após incisão, o músculo TA foi exposto e submetido ao procedimento de

criolesão, o qual consistiu na aplicação de um bastão metálico de extremidade plana (3

mm de diâmetro), previamente resfriado em nitrogênio líquido, diretamente na superfície

do músculo TA exposto e mantido nessa posição por 10 segundos. Após o

descongelamento da área, o procedimento foi repetido na mesma área por mais 10

segundos. Após esse procedimento foi realizada a sutura utilizando-se fio de poliamida

(5,0) e os animais foram mantidos em caixas plásticas com temperatura ambiente de

(37°C) até ficarem conscientes para prevenir a hipotermia. Todos os animais receberam

uma dose de cloridrato de tramadol (50 mg /kg de massa do animal) de 12 em 12 horas.

O modelo de lesão muscular por meio de criolesão foi o escolhido para este

estudo por ser um modelo que se consegue executar uma lesão bem delimitada na

superfície ventral do músculo, de forma padronizada, e com pouca variabilidade na

severidade da lesão (Oliveira et al., 2007; Baptista et al., 2011; Alves et al., 2012).

4.2 Procedimento de Irradiação Laser de Baixa Potência

A irradiação foi feita com o equipamento Twin Laser® (MM Optics, São Carlos –

SP, Brasil) utilizando os parâmetros descritos na tabela 1.

Para a irradiação, os animais idosos foram contidos em suporte plástico (ver figura

6F e 6G). Em seguida, as patas foram separadas e utilizada a técnica pontual e contato

diretamente sobre a pele que recobre o músculo TA, na região da incisão e ao redor da

área da lesão, abrangendo aproximadamente 8 pontos (Baptista et al. 2011, figura 1). O

tratamento foi iniciado 2h após o procedimento de criolesão sendo realizado diariamente

até o período de eutanásia de cada grupo experimental. Os parâmetros utilizados estão

descritos na tabela 1 e estão de acordos com os parâmetros padronizados e utilizados

em estudos prévios em nosso grupo de pesquisa, conforme Alves et al., 2012.

28

No início e final do procedimento experimental, a potência de emissão de luz do

laser foi aferida utilizando o “Laser Check power meter” (MM Optics, Sao Carlos – SP,

Brasil).

Tabela 2: Parâmetros do Laser de Baixa Potência AsGaAl (Arseneto de Gálio e Alumínio)

Parâmetros

Comprimento de onda (nm) 780

Frequência do laser Contínuo

Potência de saída (mW) 40

Área do feixe (cm2) 0,04

Densidade de potência (W/cm2) 1

Densidade de energia (J/cm2) 10

Energia por ponto (J) 0,4

Energia total (J) 3,2

Pontos irradiados 8

Tempo de irradiação por ponto (s) 10

Tempo total por tratamento (s) 80

Figura 6. Imagem demonstrativa das etapas do modelo de lesão empregado nos animais idosos (A: incisão e exposição do ventre do músculo esquelético; B: aplicação de bastão resfriado em nitrogênio líquido; C: criolesão; D: pontos de aplicação do laser de baixa potência (LBP); E: equipamento laser usado na terapia; F: modelo de contenção usada nos animais idosos; G: irradiação a laser.

29

4.3 Eutanásia dos animais e remoção dos músculos

Após o período experimental de cada grupo, os animais foram sacrificados

utilizando os overdose de anestésicos (240mg/kg de ketamina e 30mg/kg de xilazina).

Em seguida, os animais foram pesados e os músculos TA foram retirados (figura abaixo)

e pesados para serem utilizadas nas análises descritas a seguir.

Figura 8. Procedimento de irradiação com LBP.

Os círculos representam os locais da área lesionada que receberam o tratamento laser.

30

Figura 9. Fluxograma da metodologia do estudo.

4.4 Análise morfológica Qualitativa e Quantitativa do Músculo Tibial Anterior

Amostras dos músculos foram coletadas, hemisseccionados na região central da

área lesionada e fixadas em formol tamponado 10%. Em seguida os músculos foram.

incluídos em parafina e espécimes foram cortados transversalmente com 10 µm de

espessura por meio de um micrótomo (Leica RM2125, Nussloch, Alemanha). Foi

utilizada a coloração com hematoxilina-eosina (HE) para exame histológico de rotina

realizada sob microscopia de luz convencional (Zeiss Axioplan 2, Alemanha). A análise

qualitativa dos cortes histológicos corados com HE incluiu uma descrição das fases da

reparação de tecidos, envolvendo a presença e tipo de infiltrado inflamatório, edema,

mionecrose, fibras musculares imaturas e vasos sanguíneos.

Para a análise quantitativa foram contabilizadas as células do infiltrado

inflamatório, edema, mionecrose, fibras musculares imaturas e vasos sanguíneos por

área, conforme descrito por Hadi et al., 2011 e realizado previamente em nosso grupo de

pesquisa por Alves et al., 2014. Neste estudo, foram examinados e contabilizados três

Animais Idosos (Wistar)

Pesados

Anestesiados - injecção intraperitoneal

80mg/kg ketamina/10mg/kd xilazina

Tricotomia

Região do Músculo Tibial Anterior (TA)

Exposição cirúrgica do músculo TA

Criolesão

Bastão metálico – superfície plana 3mm – resfriado em nitrogênio líq.

- 10s e repetido por 10s após descongelamento;

Pós-Cirurgico

Sutura da lesão; Animais mantidos em cx plástica à 37ºC

Dor: tramadol (50mg/kg) de 12h/12h/2 dias

Análise Morfológica H&E

Efeito do LBP sobre: células

inflamatórias; mionecrose; vasos

sanguíneos e fibras imaturas.

Análise da Distribuição do

Colágeno

Efeito do LBP sobre: células

inflamatórias; mionecrose; vasos

sanguíneos e fibras imaturas.

Imunoexpressão de IL-6 e IL-1β

No processo de reparo do músculo

esquelético de animais idosos após

lesão aguda.

31

cortes histológicos do músculo tibial anterior de cada animal estudado. Em cada corte,

cinco áreas de aumento de 400X, correspondentes a 50% da área total, foram

fotografadas com auxílio de microscópio de luz convencional (Zeiss Axioplan 2,

Alemanha). As imagens analisadas foram contabilizadas as células inflamatórias totais,

mionecrose, vasos sanguíneos e fibras musculares imaturas (novas), utilizando o plug-in

“Count Cells” do software Image J (National Institute of Health - NIH, EUA). Os dados

foram submetidos à análise estatística, conforme descrito no item 5.

4.5 Análise da distribuição e organização do colágeno

Cortes adicionais foram corados com Picrosirius Red (Sigma, St. Louis, MO,

EUA), seguindo o método descrito por Junqueira et al (1982) e foram examinados com

auxílio de microscópio de luz polarizada Pol-Interferencial Photomicroscope (Modelo

61282, Carl Zeiss, Alemanha). As imagens foram analisadas pelo programa Image J

(NIH, EUA), no qual a área relativa ocupada pelo colágeno foi calculada em relação à

área total do corte, conforme descrito por Hadi et al (2011) e Alves et al (2014).

4.6 Imunohistoquímica para IL-6 e IL-1 Beta

As amostras de tecido do músculo esquelético tibial anterior, após serem

emblocadas em parafina, foram cortadas em secções de 5um. Os cortes de tecido foram

dispensados em laminas silanizadas (Sigma Chemical Co.; St. Louis, Missouri, EUA) e

posteriormente agrupados em suporte adequado. Em seguida foi realizada a

desparanifinizacao, por meio da imersao das laminas em xilol (60 – 65o C), e colocados

em estufa histologica durante 5 minutos e posteriormente passadas em 3 banhos de xilol

frio.

Para hidratacao dos cortes, as laminas foram colocadas em dois banhos de alcool

absoluto, um banho de alcool 95°ou 80° e um banho de alcool 70°. Em seguida, foram

lavadas em agua corrente, agua deionizada e deixadas em tampao fosfato salino pH 7,4

(PBS) ou tampao tris-base salino pH 7,4 (TBS).

O proximo passo foi a recuperacao dos sitios antigenicos realizada em alta

temperatura com solucao tampao de acido citrico 10 mM pH 6 (panela a vapor) por 15

minutos. Apos esta etapa ocorreu o esfriamento do tampao por mais 15 minutos. Em

seguida, foi feito o bloqueio da peroxidase endogena presente nas hemacias com 3

banhos 5 min. de agua oxigenada 10v (3%), apos esta etapa as laminas foram lavadas

muito bem em agua corrente, agua destilada e deixadas em tampao salino (PBS/TBS).

Posteriormente, o anticorpo primario foi incubado por 16 horas a 4oC. Todos os

anticorpos primarios foram diluidos em diluente especifico (Spring Bioscience Corp –

32

Pleasanton - EUA) que contem em sua formula albumina serica bovina (BSA) e tampao

fosfato, pH 7,4. No dia seguinte os cortes foram lavados por 2 vezes durante 5 minutos

em TBS e posteriormente incubados com o anticorpo secundario nao diluido (Histofine –

Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japao) por 30 minutos em estufa 37oC. Apos esta

incubacao os cortes foram lavados em TBS e incubados com o cromogeno DAB-

Diaminobenzidina (Dako - Dinamarca) por 5 a 10 min. Posteriormente ocorreu a lavagem

em agua corrente por 10 min. e a contra-coloracao com Hematoxilina (Merck, Darmstadt,

Alemanha) por 1min. Apos a marcacao de imunohistoquimica, 5 campos consecutivos da

area da ferida foram fotografados em um aumento de 400X (Leica Microsystems,

Wetzlar, Germany) e as imagens digitalizadas das celulas marcadas foram contadas com

auxilio do software ImageJ 1.45 (software livre, NIH, Bethesda, Maryland, USA) usando-

se o pluggin “cell counter”.

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados através do software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad

Software, San Diego, CA, EUA). A distribuição da normalidade dos dados foram avaliada

pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Os dados com distribuição paramétrica foram

submetidos ao teste One-way ANOVA, seguido pelo teste de Tukey para comparação entre

os grupos. Os níveis de confiança foram ajustados para 95% (p<0,05).

33

6. RESULTADOS

ARTIGO 1

PHOTOTHERAPY EFFECT ON FATIGUE AND SKELETAL MUSCLE REPAIR DURING

AGING: A SYSTEMATIC REVIEW.

Brito A, Fernandes KP, Bussadori SK, Mesquita Ferrari RA.

Após a realização do processo de seleção da literatura, conforme descrito em

métodos, uma tabela foi criada baseada nos critérios de inclusão e exclusão.

A pesquisa identificou 151 estudos potencialmente relevantes. Com base numa

análise dos resumos, 144 artigos foram excluídos, considerando os critérios de exclusão

de acordo com descrito na figura 1. Cinquenta e quatro artigos foram selecionados para a

análise de texto completo, mas sete foram excluídos nesta revisão da qual foi excluído

porque não utilizado lesão esquelética ou fadiga, vinte e três não submetidos à irradiação

laser, dezessete utilizados animais jovens ou idade menção do animal. Assim, sete

estudos dos quais utilizado irradiação do laser na irradiação contínua sobre o tratamento

da fadiga e / ou lesões musculares de ratos modelos experimentais velhos no. Alguns

estudos utilizaram diferentes parâmetros de irradiação para tratar lesões musculares e

diferente de modelos experimentais foram incluídos para induzida experimentalmente

lesão muscular, fadiga e o criolesão (tabela 2).

Figura 10: Fluxograma do processo de seleção dos artigos de revisão de literatura sistemática,

conforme descrito no artigo submetido a publicação.

Palavras-chavespesquisadas:animal,rato,animalidoso,animalvelho,animalsenil,músculoesquelé co,fadiga,reparo,regenera on,laser,laserterapia,laserdebaixapotência,fototerapiaefotobiomodulação.

PESQUISAEMBASEDEDADOSELETRÔNICO

SPIELivrariaDigitalSCOPUSBancodeDados

Pubmed/MEDLINE(n=151)

SPIELivrariaDigital(n=6)

SCOPUSBancodeDados(n=69)

Pubmed–MEDLINE(n=76)

- Semmodelodelesãonomúsculoesquelé cooufadiga(n=7)

- Nãosubme doairradiaçãolaser(n=23)

- Estudoscomhumanos(n=34)

- Ar gosescritosemidiomaRusso(n=11)

- Usodeanimaisjovensouanimaissemidademencionada(n=17)

- Ar gosderevisãooupublicaçõesencontradasemmaisdeum

bancodedados(n=51)

-Ar gospublicadoshámaisde10anos(n=1)

Estudosexcluídos(n=144)

Lesãomúsculoesquelé coidoso(n=2)

Fadigaemmúsculoesquelé co(n=5)

Estudoscomdesenhoeprocedimentosdetratamentoadequados(n=7)

Tabela 3. Resultados do artigo de revisão sistemática.

ESTUDOS SELECIONADOS QUE UTILIZARAM LASER

Autores Músculo e

animal

Modelo lesão/fadig

a

Comprimento

de onda, nm

Potência, mW Pulso,

ns Frequência, Hz

Feixe por

ponto, cm

2

Tempo de irradiação

por ponto,

sec

Densidade de Energia,

J/cm2

Energia Total por

tratamento, J

Único ou múltiplos pontos

Início e frequência

do tratamento

Período

avaliado Resultados

Vatansever et al.,

2012

Tibial anterior

(TA)

Rato Wistar

Criolesão 830 30 0.0028 29 30 0.87 Único ponto

24 hrs pós-lesão, 5

vezes por

semana

7 dias

↓ área transversal ↑ células mononucleares ↑ matriz extracelular ↑ lisossomos ↑ fibras musculares jovens

↑ expressão do RNAm do gene MyoD. ↑ expressão do gene VEGF em idosos.

Pertille et

al., 2012

Tibial anterior

(TA)

Rato

Wistar

Trauma 830 30 0.07 16 4 0.48 Múltiplos

pontos

24 hrs pós-lesão, 5

vezes por semana

7, 21 dias

¯ inflamaçãoo

↓ área de lesão

↓ efeito anti-inflamatório na regeneração muscular de ratos idosos

↓ TGF-1

↓ expressão do mRNA gene do MyoD.

De

Almeida et al., 2011

Tibial anterior

(TA)

Rato Wistar

Estimulação elétrica

904 infravermelho

15 mW 180 ns 700 Hz

0.2

7

20 67 200

0.525 J/cm-2

1.5 J/cm-2

5.025 J/cm-2

15.000 J/cm

-2

0.105

0.300 1.005 3.000

Único ponto

Imediatamente após fadiga

1 dia

↓ 1,0 e 3.0J aumento do trabalho total.

↓ atividade de CK após 190% de contração no controle.

↓ atividade de CK no grupo laser, exceto para o 3.0J.

↓ expressão do gene COX-1 após seis contração tetânica em 1.0J

↓ expressão do gene COX-2 pós seis

contração tetânica em 1.0J

Ferraresi et al., 2015

Sóleo, Gastrocnêmio, ratos

Balc/c

Exercício

850 infravermelho 630 vermelho

contínuo

50 25

45 90 7.2 4.5

2.25 Único ponto

Imediatamente após fadiga

1 dia

ATP muscular e resistência a fadiga pela mistura de vermelho e terapia de

luz infravermelha aplicada sobre músculos esqueléticos.

Lopes-Martins et

al., 2006

Tibial anterior

(TA)

Rato Wistar

Estimulação elétrica

655 2.5 0.08 32 80

160

1.0 2.5

5.0

0.08 0.200

0.400

Único ponto

Imediatamente após

fadiga

1 dia

­ pico de contração de força 0.5, 1.0 e

2.5 J/cm2 após seis contrações em 1.0

e 3.0J ¯ níveis de CK em 0.5,J/cm

2 após

seis contrações.

Leal

Junior et al.,

Tibial anterior

(TA) Rato

Wistar

Estimulação elétrica

904 infravermelho

15mW 700Hz

0.2

7 20 67 200

0.525 J/cm-2

1.5 J/cm-2

5.025 J/cm-2

15.000 J/cm

-2

0.1 0.3 1.0 3.0

Único ponto

Imediatame

nte após fadiga

1 dia

¯ 0.1J laser grupo tiveram 50% dimunição na força máxima na

segunda, terceira e sexta contração. ­ performance do trabalho a partir da

segunda contração após 1.0 e 3.0J ¯ atividade CK antes da contração e

aplicação das doses do laser 0.1, 0.3 e 1.0J.

35

6.2 RESULTADOS

ARTIGO 2

EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE O REPARO MUSCULAR APÓS

LESÃO AGUDA EM ANIMAIS IDOSOS.

Brito A, Alves AN, Ribeiro BG, Barbosa DVE, Magalhães E, Fernandes KPS, Bussadori

SK, Mesquita-Ferrari RA.

Em preparação para submissão para a revista Lasers in Surgery and Medicine.

Resultados do artigo:

6.2.1 Análise Morfológica Qualitativa do Músculo Esquelético Tibial Anterior (TA)

Os cortes histológicos do músculo esquelético TA do grupo controle apresentaram

aspecto morfológico normal, sem lesões ou processo inflamatório e as fibras com núcleos

periféricos (figura 4A). Os grupos lesionados sem tratamento laser após 1 e 3

demonstraram moderado infiltrado celular entre as fibras musculares, com presença de

neutrófilos e mononucleares e, apresentaram também áreas de mionecrose (fibras

necróticas) e pouco edema entre as fibras (figuras 4B e D). Os grupos lesionados e

tratados laser tiveram redução tanto no infiltrado inflamatório quanto na mionecrose,

comparado ao grupo não tratado no mesmo período (figura 4C e E).

Após 7 dias, o grupo lesionado sem tratamento apresentou intenso infiltrado

inflamatório e mionecrose (figura 4F). Nesse mesmo período, o grupo lesionado e tratado

laser apresentou as fibras musculares com aspecto histológico mais preservado, com

mionecrose e infiltrado inflamatório reduzidos (figura 4G).

6.2.1 Análise Morfológica Quantitativa do Músculo Esquelético Tibial Anterior (TA)

O grupo controle (não lesionado e sem tratamento) exibiu aspectos

histomorfológicos normais de tecido muscular esquelético sem quantidade significativa de

infiltrado celular ou mionecrose, que foi significativamente diferente a todos os outros

grupos estudados (p<0,05).

A analise quantitativa (figura 5) identificou que a laserterapia teve efeito sobre as

fibras musculares, pois foi capaz de reduzir no numero de mionecroses apos 1 dia de

tratamento (p<0,001), comparado ao grupo sem tratamento de mesmo período.

No grupo após 3 dias, apesar do número reduzido de mionecrose e células

inflamatórias no grupo tratado com laser, não houve diferença significativa. Também não

houve diferença quanto o aumento do número de vasos sanguíneos no grupo tratado.

36

Após 7 dias, os grupo submetido a laserterapia apresentou redução significativa

na quantidade de infiltrado inflamatorio e mionecrose, comparado ao grupo não-tratado

(p<0.001). Houve aumento significante no número de vasos sanguíneos e fibras

imaturas.

37

3Dias

C

E E

*

38

G

ˆ

ˆ ˆ

7Dias

F

Lesão Lesão + LLLT

* F G

ˆ ˆ

ˆ ˆ

Figura 11. Secções Fotomicrografia histológica de músculos tibial anterior, coradas com HE (aumento original x 100). A seta () indica infiltrado de células inflamatórias;

asterisco (*) indica edema; o simbolo (ˆ) indica vasos sanguíneos maduros; o triângulo () indica mionecrose e o quadrado indica fibras musculares imaturas. A figura (A)

Músculo controle: morfologia muscular normal; (B) Lesão 1 dia: infiltrado inflamatório, edema e mionecrose; (C) Lesão+LBP apó s 1 dia: presença de edema e infiltrado inflamatório leve; (D) Lesão após 3 dias: edema, mionecrose e infiltrado inflamatório adjacente; (E) Lesão+LBP após 3 dias: edema, mionecros e e infiltração de leucócitos (seta); (F) Lesão após 7 dias: mostra intenso infiltrado inflamatório, mionecrose, presença de vasos sanguíneos; (G) Lesão+LBP, mostra mionecrose,

presença de fibras musculares imaturas e vasos sanguíneos, diminuição da quantidade de infiltrado inflamatório .

39

Figura 12. Dados estatística da análise quantitativa da morfologia do músculo TA em corte histológicos corados com H&E e analisados no software Image J. Foram avaliados os efeitos do laser de baixa potência (LBP) sobre a mionecrose (A), número de vasos sanguíneos (B), número total de células inflamatórias (C) e número de fibras imaturas (D). Os valores estão expressos em (ANOVA/Tukey), *p< 0,05.

Controle Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP

0

200

400

600

800

1000

Mio

ne

cro

se

/mm

2

*

*

*

1 dia 3 dias 7 dias

Controle Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP

0

2000

4000

6000

8000

10000

Célu

las I

nfl

am

ató

ria

s/m

m2

*

*

*

1 dia 3 dias 7 dias

Controle Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP0

50

100

150

200

250

Va

so

s S

an

gu

íne

os

/mm

2

*

1 dia 3 dias 7 dias

Controle Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP0

20

40

60

80

100

Fib

ras

Im

atu

ras

/mm

2

*

*

1 dia 3 dias 7 dias

A B

C D

40

6.2 Análise Qualitativa e Quantitativa de Fibras Colágenas

O grupo controle apresentou o tecido normal com colágeno organizado e

distribuído adequadamente no endomísio, perimísio e epimísio (figura 6A). Após 1 e 3

dias, os grupos lesão sem tratamento e grupo lesão com terapia laser foram semelhantes

na distribuição de colágeno, apresentando fibras dispersas na região do infiltrado

inflamatório e fibras necróticas nos espaços celulares. O grupo 7 dias lesionado tratado

apresentaram melhor organização das fibras de colágeno, comparado ao grupo 7 dias

lesionado não-tratado, que apresentou colágeno desorganizado. A quantificação do

colágeno realizada a partir das imagens obtidas sob luz polarizada, demonstrou que não

houve diferença na quantidade de colágeno nos grupos avaliados após 1, 3 e 7 dias.

Contudo, o grupo 7 dias tratado com laser apresentou melhor organização de colágeno

comparado aos demais grupos tratados e não-tratados estudados. Também foi possível

observer no grupo após 7 dias, comparado ao grupo controle, uma concentração

aumentada de colágeno no grupo criolesionado sem tratamento e no grupo criolesionado

submetido a laserterapia (p<0,05).

41

Picrosirius Picrosirius-luzpolarizada

Controle

A

LESÃO

1dia

3dia

7dia

B

C

D

LESÃO+LBP

E

F

G

6.2 Análise da distribuição e organização do colágeno

Figura 13. Fotomicrografia de corte histológico do músculo corado com Picrosirius Red com ou sem luz polarizada (aumento original X 400). As figuras ilustram imagens usadas para quantificar a porcentagem de fibras colágenas por área, feitas em microscópio de luz polarizada. (A) Músculo Controle, mostrando morfologia normal; (B) grupo Lesão após 1 dia; (C) grupo Lesão + LBP após 1 dia; (D) grupo Lesão após 3 dia; (E) grupo Lesão + LBP após 3 dia; (F) grupo Lesão após 7 dia; (G) grupo Lesão + LBP após 7 dia.

42

Figura 14. Quantificação de fibras colágenas no músculo tibial anterior em relação a área total do músculo;

valores expressos em media e desvio padrão (ANOVA/Tukey); * p <0.05 em comparação do grupo controle com os grupos 7 dias lesionado e grupo 7 dias lesionado e tratado.

43

6.3 Análise da Expressão IL-6 e IL-1 Beta por Imunohistoquímica em células do

músculo tibial anterior.

A expressão de IL-6 do grupo controle comparado com os grupos 1, 3 e 7 tratados

e não-tratados com LBP apresentou diferença significante (p< 0,05), sendo que todos os

grupos tiveram expressão de IL-6 aumentada em relação ao controle. Porém, não houve

diferença significante da expressão de IL-6 entre os grupos lesionados sem tratamento e

os tratados com LBP.

A expressão de IL-1 beta no grupo controle foi menor quando comparada aos

grupos 1, 3 e 7 tratados e não-tratados com LBP diferente (p< 0,05). Com relação aos

grupos tratados e não com o LBP é possível verificar que não houve diferença

significante entre eles nos três períodos avaliados.

44

Figura 15. Imagem ilustrativa de Imunohistoquímica de secções fotomicrografia histológica do músculos tibial anterior expressando IL-1 Beta. Foram avaliados os grupos lesão e lesão tratado após 1, 3 e 7 dias.

1dia-Lesão

3dia-Lesão

1dia–Lesão+LBP

3dia–Lesão+LBP

7dia-Lesão

7dia–Lesão

+LBP

Controle

45

Figura 16. Imagem ilustrativa de Imunohistoquímica de secções fotomicrografia histológica do músculos tibial anterior expressando IL-6. Foram avaliados os grupos lesão e lesão tratado após 1, 3 e 7 dias.

1dia-Lesão

3dia-Lesão

1dia–Lesão+LBP

3dia–Lesão+LBP

7dia-Lesão

7dia–Lesão+LBP

Controle

46

Controle Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP

0

20

40

60

IL-6

*

1 dia 3 dias 7 dias

Controle Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP Lesão Lesão+LBP0

20

40

60

80

IL-1

Be

ta

*

*

1 dia 3 dias 7 dias

*

Figura 17. Dados estatística da análise quantitativa da imunoexpressão de IL-6 e IL-1beta em corte histológicos corados com H&E DAB e analisados no software Image J. Os valores estão expressos em

(ANOVA/Tukey), *p< 0,05.

47

7. DISCUSSÃO

Esse estudo propôs avaliar a modulação do laser baixa potência (LBP) na

inflamação aguda em modelo de lesão muscular em ratos idoso. O modelo de criolesão,

usado neste trabalho, já foi realizado por muitos grupos de pesquisa, avaliando

parâmetros distintos. Muitos desses estudos foram publicados na literatura,

demonstrando que o LBP tem efeito no processo de reparo do musculo esquelético,

apesar dos diferentes parâmetros dosimétricos empregados (Rodrigues et al, 2014;

Pinheiro et al, 2011; Pires et al, 2011).

A maioria desses estudos restringem-se a estudar modelos de animais jovens e

adultos, ou não citam a idade do animal usado na pesquisa. Há poucos trabalhos

publicados que utilizam animais idosos (Vatansever et al., 2012; Pertille et al., 2012).

Acreditamos que um dos motivos para a falta de estudos com animais idosos esteja na

dificuldade de adquiri-los ou mantê-los nos biotérios por um tempo prolongado até o

envelhecimento. Outra razão, pode ser o fato de muitos desses animais não resistirem as

consequências do envelhecimento, ocasionando a perda prematura do animal. Contudo,

há a necessidade de aprofundar o conhecimento nessa faixa etária, pois a dinâmica do

envelhecimento modifica o processo de reparo tecidual.

Para estudar os efeitos do LBP em idosos e compará-los com os efeitos já

descritos em animais jovens e adultos, mantivemos nesse trabalho os mesmos

protocolos e parâmetros dosimétricos utilizados em estudos prévios do nosso grupo de

pesquisa (Alves et al., 2013) e que evidenciaram efeito modulatório positivo em diversos

aspectos do processo de reparo incluindo a redução de citocinas inflamatórias (Mesquita-

Ferrari et al, 2011, Fernandes et al 2013 checar datas), melhor organização de colágeno

(Batista et al 2011, Silva et al 2012), aumento de fibras musculares jovens (Ribeiro et al.,

2015), redução da mionecrose e infiltrado inflamatório (Agnelo, et al., 2013) entre outros

achados.

Os estudos na literatura demonstrarm que a regeneração muscular é mais lenta

em animais idosos (Tidball 2005; Mann et al, 2011; Arsic et al, 2004). Essa diferença em

relação aos animais jovens e adultos pode também estar relacionada com a redução do

suprimento vascular no músculo esquelético, estímulos quimiotáticos menos potentes e

inflamação persistente (Poel et al., 2011; Tidball 2005; Grounds, Sorokin, 2005;

Kääriäinen et al., 2000; Wynn 2008; Carlson, Faulkner 1996).

Nossos resultados corroboram com estes dados encontrados na literatura.

Observamos, diminuição do infiltrado de células inflamatórias nos animais idosos

lesionados e tratados LBP durante 7 dias após lesão enquanto que este mesmo achado

foi encontrado em animais jovens adultos submetidos ao mesmo modelo de lesão já a

partir do 3o dia de tratamento. Quanto a mionecrose, houve tendência a redução após 7

48

dias de tratamento nos animais idosos contudo esta não foi estatisticamente significante

diferentemente do que ocorreu em animais adultos uma vez que o LBP induziu uma

redução significante após 1 dias (Alves et al., 2013; Alves et al., 2014).

O efeito do LBP sobre o aumento de vasos sanguíneos e fibras musculares

imaturas em animais idosos aparentemente foi mais tardio (7 dias) quando comparado ao

realizado em animais jovens adultos (3 dias) (Alves et al., 2013).

Com relação ao remodelamento da MEC, especialmente do colágeno, durante o

reparo do músculo de ratos idosos, os resultados presentes demonstram que o LBP não

causou uma diferença significante na área do colágeno assim como observado em

animais jovens (Alves et al., 2013), porém promoveu uma melhor organização dos feixes

de colágenos após 7 dias, fato este observado mais precocemente (3 dias) em animais

jovens (Alves et al 2013).

Com relação as citocinas avaliadas foi possível verificar que não houve diferença

na imunomarcação de ambas quando comprados os grupos que receberam tratamento

com LBP ou não.

Em conclusão os resultados evidenciaram que o LBP promoveu um efeito positivo

no reparo do músculo esquelético de ratos idosos contudo, como já verificado na

literatura, esta modulação foi temporalmente diferente em relação aos animais adultos.

49

8. CONCLUSÃO

O LPB modulou de forma positiva o processo de reparo muscular em animais idosos,

reduzindo o número de células inflamatórias e a mionecrose. Estimulou a formação de

novas fibras imaturas e vasos sanguíneos.

Os animais idosos responderam mais lentamente ao LBP sobre o reparo tecidual,

comparado com dados de animais jovens adultos publicados na literatura.

O LBP promoveu melhora na organização e remodelamento das fibra colágenas

somente após 7 dias de tratamento, comparado ao grupo controle.

50

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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57

10. ANEXOS

10.1 Aprovação no Comitê de Ética (CEUA-UNINOVE), sob protocolo n. An0002/2014.

10.2 Participação da 30a Reunião Anual da FeSBE, realizada nos dias 09 a 12 de

setembro de 2015, na Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em

São Paulo – SP.

10.3 Artigo de Revisão Sistemática a ser submetido a publicação.

58

ANEXO 1. APROVAÇÃO DO CEUA-UNINOVE

59

60

ANEXO 2. PARTICIPAÇÃO EM EVENTO

61

ANEXO 3. REVISÃO SISTEMÁTICA

Adriana de Brito

Departamento de Pós Graduação, Biophotonics Applied to Health Sciences, Universidade

Nove de Julho – UNINOVE, Rua Vergueiro, 249, Liberdade, CEP 01504001 São Paulo,

SP, Brazil.

e-mail: dridbritto@gmail.com

Kristianne Porta

Departamento de Pós Graduação, Biophotonics Applied to Health Sciences, Universidade

Nove de Julho – UNINOVE, Rua Vergueiro, 249, Liberdade, CEP 01504001 São Paulo,

SP, Brazil.

e-mail: kristianneporta@uninove.br

Sandra Bussadori

Departamento de Pós Graduação, Rehabilitation Sciences and Biophotonics Applied to

Health Sciences, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, Rua Vergueiro, 249,

Liberdade, CEP 01504001 São Paulo, SP, Brazil.

e-mail: sandrakalil@uninove.br

Raquel Agnelli Mesquita

Departamento de Pós Graduação, Rehabilitation Sciences and Biophotonics Applied to

Health Sciences, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, Rua Vergueiro, 249,

Liberdade, CEP 01504001 São Paulo, SP, Brazil.

e-mail: raquel.mesquita@gmail.com

62

PHOTOTHERAPY EFFECT ON FATIGUE AND SKELETAL MUSCLE REPAIR

DURING AGING: A SYSTEMATIC REVIEW

INTRODUCTION

Fatigue is characterizes for intense contractile activity causes a dramatic decline in the

force and velocity generating capacity of skeletal muscle within a few minutes (Debold,

2015). Muscle damage can occur in some activities where skeletal muscle fatigue

develops. This damage is characterized by structural abnormalities that affect functional

status of muscle tissue and varies widely in both pathologic and physiologic conditions.

These facts represent an index of cellular necrosis and tissue damage following acute and

chronic muscle injuries (Cheung, Hume, Maxwell, 2003; Szumilak, Sulowicz, Walatek;

1998).

Muscle wasting occurs systemically in older people. Old age is associated by the

progressive non-pathological loss of muscle mass, a decrease in force, power, fibers and

function with concomitant fibrosis and matrix extracellular (ECM) deposition (Herbst et

al., 2013; Mann et al., 2011; van der Poel et al., 2011; Prasad, Sung, Aggarwal 2011). In

humans, 40% of muscle mass is lost between the ages of 20 and 80 (Evans 1997; Lexell,

Taylor, Sjostrom, 1988) with persons aged 60 years or older representing the fastest

growing segment of the worldwide population, there will continue to be a corresponding

increase in the prevalence of mobility limitations (Reid, Fielding, 2012).

In addition, increase the risk falls, fracture and other injuries in the elderly. It indicates

regenerative changes influenced by modification in the neuromuscular system, blood

hypoperfusion and sarcopenia, which lead to inability to maintain strength and motor

control (Vatansever et al., 2012; Alway, Lowe, Chen, 2001). It is well recognized that this

is due to atrophy of individual myofibres, although the reasons for this are still the subject

of intense research (Smythe et al., 2008).

In normal muscle repair after acute injury, such as in experimental animals and in humans

after sports injuries, damaged or dead fibers are first removed by inflammatory cells, and

they are then repaired or replaced by tissue-resident muscle stem cells known as satellite

cells (Mann et al., 2011; Mauro 1961).

The inflammatory response is regulated by cytokines and growth factors are released from

both the injured blood vessels and from inflammatory cells (Chazaud et al., 2009; Tidball,

Villalta, 2010; Tidball 2005).

Activated inflammatory cells produce a wide range of cytokines and chemokines, such as

63

interleukin-1 (IL-1), IL-6, IL-8, IL-17, IL-18, and others (Fukuda et al., 2013). Cytokine is

a generic term used to designate a large group of molecules (proteins, interleucinas,

chemokines, interferons, transforming growth factor, and tumor necrosis factor) produced

by T cells, inflammatory cells (leucocytes) and some endothelial cells. The cytokines are

involved with signal emissions that promote communication between cells during the onset

of immune responses and repair (Fukuda et el., 2013; Kelso 1998).

The proinflammatory state of aging has been implicated in the development of sarcopenia

due to the effect of increased cytokines on reduced muscle protein synthesis. Older person

is characterized for high plasma levels of IL-6, TNFa, and IL-1 (Evans et al., 2010). TNF-a

and IL-6 have been associated with muscle loss and lower strength in a large sample of

older persons. In particular, IL-6 appears to play a role in accelerating sarcopenia and

frailty (Visser et al. 2002; Schaap et al. 2009).

TNF-α is a potent pro-inflammatory cytokine that influences various cell types and the

chronic inflammatory process by recruiting polymorphonuclear cells and other immune

cells, thereby contributing to the amplification and progression of the inflammatory

process (Mesquita-Ferrari 2011; Herbein et al., 2000). However, the higher number of

neutrophils and macrophages in the injured area results in a greater concentration of

reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) (Toumi, Best 2003).

ROS/RNS are chemically reactive molecules making them capable of transiently or

permanently damaging cell membranes and proteins. ROS were originally generated in the

mitochondria as a by-product of oxidative phosphorylation and the free radicals are

continually produced in muscle cells. At rest, low levels are generated and to play an

important role in maintaining normal muscle function when levels of ROS are low, as

might occur at rest or even in the early stages of fatigue, they appear to enhance not inhibit

force production and may even help to delay the onset of fatigue. However, as contraction

intensifies and/or becomes prolonged, ROS/RNS become elevated and are inhibit proper

function of muscle proteins. In addition, at higher concentrations, certain ROS inhibit

contractile function in isolated muscle fibers. When excessively elevated, the reactive

nature of ROS/RNS mean that they can induce structural modifications to contractile

proteins. Skeletal muscle fatigue from intense contractile activity could result from the

failure anywhere along the muscle activation pathway (Debold, 2015).

During the inflammatory phase, factors such as phagocytic stimuli increase the

regeneration of reactive oxygen species (ROS), leading to oxidative stress (Luo et al.,

2013; Cuzzocrea et al., 2004). A condition of oxidative unbalance can cause additional

injury, amplifying the inflammatory response and expanding the injured area (Mantineo et

64

al., 2014; Luo et al., 2013).

Acute injury to healthy muscle produces rapid and controlled inflammation that removes

dead and damaged myofibers, and promotes replacement of the injured muscle. However,

in conditions of chronic injury, as occurs in the muscular dystrophies, chronic

inflammatory events result in the excessive accumulation of ECM components, which

inhibit myogenic repair and lead to muscle being replaced by fibrotic and/or scar tissue

(Mann et al., 2011; Porter et al., 2002).

Muscle regeneration is a complex phenomenon, involving replacement of damaged fibers

by new muscle fibers. During this process, there is a tendency to form scar tissue or

fibrosis by deposition of collagen that could be detrimental to muscle function (Assis et al.,

2013). The survival of an organism can often depend on the ability to rapidly repair

damage to muscle from mechanical trauma, exposure to toxins or infections. This rapid

resolution of tissue injury requires a sequential and well-orchestrated series of events

(Grounds et al., 2005; Kaariainen et al., 2000; Wynn 2008; Mann et al, 2011).

The capacity of adult muscle to regenerate or repair in response to injury stimuli represents

an important homeostatic process (Carosio et al., 2011). With aging, muscle tissue

homeostasis is progressively disrupted and the ability of the satellites-cell (SC) to repair

injured muscle markedly declines. Recent studies show that the SC are progressively

undergo cell-intrinsic alterations that profoundly affect stem cell regenerative function

with aging (Blau et al., 2015).

Muscle regeneration involves several highly organized molecular and cellular processes

that ideally lead to structural and functional recovery of the injured muscle (Assis, et al.,

2013; Filippin et al., 2011). However, aging process has been attributed to the reduced

capacity of skeletal muscle to synthesize new proteins thus injured skeletal muscle

generally regenerates less efficiently (Smythe et al., 2008; Evans et al., 2010; Albright and

Albright 2000).

Myofiber growth after damage differs in young and aged muscles. In young muscles in

response to injury, the satellite cells under the basal lamina can be activated by

environmental cues released by the neighboring cells (a local milieu composed of

fibroblasts, interstitial cells, resident macrophages, fibro/adipogenic progenitors (FAPs)

and microvasculature associated cells) to eventually form new fibers almost

indistinguishable to the pre-existing ones (Mann et al., 2011; Uezumi et al., 2010; Arsic et

al., 2004). Muscle regeneration is slower in older animals, which coincides with slowed

phagocytosis by inflammatory cells. The animals depleted of neutrophils and monocytes

also showed more tissue debris in injured muscles, which suggested the possibility that the

65

impaired capacity to remove tissue debris by phagocytes could slow the regenerative

process (Tidball 2005).

The neutrophils has a phagocytic function to clear the injury of necrotic cells, and enhance

the inflammatory response via the release of pro-inflammatory cytokines such as

interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNFa) (Van der Poel et al., 2011).

In aged muscles, the repair process will result in reduced size of newly formed myofibers

and thickening of the basal lamina by enhanced deposition of extracellular matrix (ECM)

components, which could potentially be ascribed to the increased presence and activity of

resident fibroblasts (and/or FAPs), and to decreased satellite-cell myogenic potential.

Conversion of myogenic into fibrogenic cells could also contribute to ECM accumulation.

These new microenvironment conditions within the satellite-cell niche will impede

efficient satellite-cell functions and muscle repair (Mann et al., 2011; Uezumi et al., 2010;

Arsic et al., 2004).

A secondary phase of the inflammatory response is indicated by an influx of macrophages,

which appears to coincide with a decline in neutrophil numbers. Both inflammatory cells

are associated with an increase in a number of pro-inflammatory cytokines such as IL-1b,

tumor necrosis factor (TNF), and transforming growth factor beta-1 (TGF-b1) (van der

Poel et al., 2011; Carosio 2011).

Several animal and human trials have been performed that show the modulatory effect of

laser radiation on inflammatory markers (PGE2, TNF-α, IL-1β, plasminogen activator) and

on the inflammatory process itself (reducing edema, hemorrhagic formation, necrosis,

neutrophils influx) (Pallota et al., 2012; de Almeida et el., 2011).

Last years, phototherapy has also shown very interesting effects in modulation of both

cyclooxygenase isoforms (COX-1 and COX-2). The COX-1 and COX-2 represent a key

role in inflammation process, and that an ideal anti-inflammatory therapy in most cases

would be expected to reduce COX-2 activity (Wallace 2006; Capone et al., 2010; de

Almeida et al., 2011). However, to the best of our knowledge, it has a lack of studies

investigating effects of common recovery modalities employed to enhance restitution after

exercise on cyclooxygenase isoforms (de Almeida et al., 2011).

Recent evidence strongly supports the notion that molecular inflammatory processes play a

pivotal role in the aging process and in age-related diseases. During aging, the generation

of cyclooxygenase (COX)-derived reactive species (RS) increases and the expression of

particular genes is upregulated, including interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor

alpha (TNF-α), COX-2, and inducible nitric oxide synthase. COX activity and the

production of thromboxane A2 and prostaglandin also increase during aging. Other pro-

66

inflammatory proteins, such as adhesion molecules (e.g., vascular cell adhesion molecule

1, intercellular adhesion molecule 1, and P- and E-selectin), are all upregulated during

aging (de Melo Rambo et al., 2014; Chung et al., 2009).

The treatment of muscle injuries is a common practice at rehabilitation centers (Alves et al,

2014). Several promising therapeutic agents are in development, and major advances in

our understanding of the cellular mechanisms that regulate the protein balance in muscle

include the identification of several cytokines, particularly myostatin, and a common

transcriptional programme that promotes muscle wasting (Cohen, Nathan, Goldberg

2015).

Currently, investigations have been carried out to demonstrate the positive effects of low-

level laser therapy LLLT either alone or in combination with other therapies for the

treatment of skeletal muscle and tendon injuries, rheumatic diseases,

osteoarthromyopathies, neuromuscular disorders, sports injuries, among others. The LLLT

has demonstrated anti-inflammatory, analgesic, and reparative properties. These properties

may be related to the action of the laser in the activation of cell metabolism, increase cell

proliferation and collagen synthesis, the activation of lymphocytes and angiogenesis.

Several animal and human trials have shown positive effects of LLLT on inflammatory

disorders both in acute and in chronic phases (Huang et al., 2009).

The LLLT is used in the treatment of inflammatory disorders to promote tissue

regeneration or repair (Fukuda et al., 2013; Silveira et al., 2009), however, there are very

few studies associating the laser with the regeneration of skeletal muscle in old age and

many discrepancies of the optimal parameters of stimulation.

One of these novel application areas is LLLT for muscle fatigue and muscle injury. Since

it is becoming agreed that mitochondria are the principal photoacceptors present inside

cells, and it is known that muscle cells are exceptionally rich in mitochondria, this suggests

that LLLT should be highly beneficial in muscle injuries. The ability of LLLT to stimulate

stem cells and progenitor cells means that muscle satellite cells may respond well to LLLT

and help muscle repair. Furthermore the ability of LLLT to reduce inflammation and

lessen oxidative stress is also beneficial in cases of muscle fatigue and injury (Ferraresi et

al., 2012).

Some authors have used low-level laser therapy (LLLT) to accelerate these metabolic and

structural changes in muscle with the goal of preventing or reducing muscle fatigue Studies

on this issue have used experimental models to identify possible effects of LLLT on

muscle tissue subjected to mechanical and metabolic stress from exercise (Ferraresi et al.,

2012).

Formatado: Fonte: 12 pt

Formatado: Fonte: 12 pt

Formatado: Fonte: 12 pt

Formatado: Fonte: 12 pt

67

A recent study has revealed that antioxidant levels are a major determinant of the

regenerative capacity of muscle stem cells. It has been reported that LLLT promotes

cellular redox activity. However, other studies reported that LLLT can restrain oxidative

stress by increasing anti- oxidant levels or activity (Luo et al., 2013).

Pertille et al., 2012 demonstrated that LLLT (wavelength 830 nm; power output 30 mW;

energy 4 J) on the muscle regeneration of old experimental rat models after contusion

induced in the tibialis anterior muscle was effective for muscle regeneration in old rats,

however only through its anti-inflammatory effect.

De Melo Rambo et al., 2014 analyses the effect of LLLT (wavelength 660 nm; power

output 30 mW; total energy 2 J) in cutaneous wound healing and showed that LLLT was

effective in the treatment of skin wounds in aged animals at different stages of the tissue

repair process.

Vatansever et al., 2012 evaluate the effects of LLLT (wavelength 830 nm; total energy

0.87 J) on the tibialis anterior (TA) muscle of aged rats, which was increased the

maturation of satellite cells into myoblasts and myotubes, enhancing the regenerative

process of aged rats irradiated with laser.

Despite the benefits reported in experiments conducted in vitro, studies conducted on

different animal models, and a number of clinical trials, divergent findings have been

described. This is mainly because of the variability in the irradiation parameters and

treatment protocols used. In addition, studies that investigated laser as a treatment for

muscle regeneration in aged rats are difficult to access and the effects of this therapy on the

repair process, when associated with aging are still little known.

The aim of this study was to review the literature regarding of the treatment and

applicability of LLLT in the treatment and regeneration of skeletal muscle lesions of older

animals.

68

METHODS

The literature search was conducted using the MEDLINE online database (Medical

Literature Analysis and Retrieval System Online) and SCOPUS for original article

regarding the modulation effect of low-level laser therapy (LLLT) on skeletal muscle

regeneration in experimental model older animal, combinations of the following keywords

and Medical Subject Headings (MeSH): animal, rat, mice, aged, aging, aged animals, old,

older, elderly, fadigue, laser, laser therapy, low-level laser therapy, phototherapy,

photobiomodulation, skeletal muscle, repair, regeneration. Ten years was the date limit

applied to the search. Additional studies were identified from the reference list of original

articles or review articles.

This article included studies that reported the following established criteria:

Old animals studies involving experimental models of muscle injury, laser

therapy and fatigue.

Studies describing the dosimetric parameters as shown in table 1:

Total energy (joules) and energy density (joules per square centimeter).

Energy density in joules and power density in watts per square centimeter

Beam spot size in square centimeters.

Power in milliwatts or watts.

Frequency of treatments in hertz.

Treatment time in seconds and dose per treatment session in joules.

Irradiation time were obtained using traditional formulas.

Wavelength (lambda) in nanometers.

Pulse in nano-seconds or duty cycle of device in percentage.

This article excluded studies that reported the following established criteria:

Articles not written in English language.

Noninclusion of an injury group without treatment, fatigue, or not skeletal

muscle injury.

In vitro studies or involving human subjects.

Studies that do not adequately describe the mode of application (contact),

energy lost, power and other parameters not described, not allowing the

reproducibility.

Case reports or review studies.

69

RESULTS

The search identified 151 potentially relevant studies. On the basis of an analysis of the

abstracts, 144 articles were excluded considering the exclusion criteria according described

in figure 1. Fifty-four articles were then selected for the full-text analysis, but seven were

excluded in this review of which was excluded because not used skeletal injury or fatigue,

twenty-three not submitted to laser irradiation, seventeen used young animals or mention

age of the animal. Thus, seven studies of which used laser irradiation in the continuous

irradiation on the treatment of fatigue and/or muscle injuries of old experimental rat

models in the. Some studies used different irradiation parameters to treat muscle injuries

and different of experimental models were included to experimentally induce muscle

injury, fatigue and the cryoinjury (table 2).

DISCUSSION

Many studies can be found in the literature about the effects of laser irradiation on cells

associated with this inflammatory response. The low-level laser therapy (LLLT) can

improve muscle regeneration through many biochemical process modulations, including

the production of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines such as

cyclooxygenase enzyme, increased collagen synthesis, maintenance of the functional

integrity of muscle fibers, enhanced mitochondrial respiration, and adenosine triphosphate

(ATP) formation (Rodrigues et al., 2014; Pinheiro et al., 2011; Pires et al., 2011).

Improved knowledge of the specific physiologic mechanisms that mediate impairments in

physical functioning will be crucial for developing effective therapeutic interventions for

preserving mobility and independence among older people (Reid, Fielding 2012).

LLLT promotes oxidative balance by increasing the levels of superoxide dismutase (SOD)

enzyme. Higher expression of SOD causes less expression of cyclooxygenases and a lower

release of prostaglandins. The interactions between SOD, RNS and ROS, subsequent to

LLLT, seem to balance the oxidants beneficial and harmful effects by reducing the

oxidants concentration without compromising cell proliferation (Mantineo et al., 2014;

Lim et al., 2007; Assis et al., 2012).

The cause to explain of the age-related impairment in skeletal muscle regeneration and the

exact mechanisms remain elusive, despite of different hypotheses proposed. Modified

muscle use or injury can produce a stereotypic inflammatory response in which neutrophils

70

rapidly invade, followed by macrophages. This inflammatory response coincides with

muscle repair, regeneration, and growth, which involve activation and proliferation of

satellite cells, followed by their terminal differentiation (Tidball 2005). Therefore,

perturbation of any of these stages can result in unsuccessful muscle regeneration, typically

characterized by persistent degeneration of myofibers, inflammation and fibrosis (Grounds,

Sorokin, White 2005; Kaariainen et al., 2000, Wynn 2008).

The repair process of damaged tissue involves the coordinated activities of several cell

types in response to local and systemic signals. Following acute tissue injury, infiltrating

inflammatory cells and resident stem cells orchestrate their activities to restore tissue

homeostasis. However, during chronic tissue damage, such as in muscular dystrophies, the

inflammatory cell infiltration and fibroblast activation persists, while the reparative

capacity of stem cells (satellite cells) is attenuated (Grounds et al., 2005; Kaariainen et al.,

2000; Wynn 2008; Mann et al, 2011).

The reduced regenerative capacity is related to aging in association with changes in the

function of satellite cells. However, activation of satellite cells requires a controlled

increase in the MRFs expression and the muscle specific genes. In the muscles of older rats

the MRFs expression are high enough; however, they are ineffective in action. According

to Alway et al., 2001, gene expression of MRFs can increase in aged muscles; however, it

cannot increase as much and with the same rates after injury, which is an impairing factor

in the regenerative process.

Work by Carlson and Faulkner and their colleagues over several decades showed that the

recovery from skeletal muscle injury was prolonged in aged rats. An altered inflammatory

response may affect the cellular processes required for optimal muscle remodeling. This

form of injury which involves a loss of vascular supply to the muscle resulted in delayed

regeneration in old compared with younger mice, a finding attributed to a less than

vigorous inflammatory response by old host mice and a less potent chemotactic stimulus

produced by the damaged muscles of old mice (Poel et al., 2011).

71

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