avaliação de células fibroblásticas submetidas à terapia laser de
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Londrina 2016
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
JULIANA SERPELONI DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DE CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS
SUBMETIDAS À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA
JULIANA SERPELONI DE ALMEIDA
Cidade Ano
Londrina
2016
AVALIAÇÃO DE CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS SUBMETIDAS À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação
Universidade Norte do Paraná
Biblioteca Central
Setor de Tratamento da Informação
Almeida, Juliana Serpeloni de
A448a Avaliação de células fibroblásticas submetidas à terapia
laser de baixa potência / Juliana Serpeloni de Almeida.
Londrina: [s.n], 2015.
60f.
Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências da
Reabilitação). Universidade Norte do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
1 - Reabilitação - dissertação de mestrado - UNOPAR
2- Terapia laser de baixa potência 3- Fibroblastos 4- Cultura
celular 5- Expressão genética 6- proliferação celular I-
Oliveira , Rodrigo Franco de ; orient. II –Universidade Norte
do Paraná.
CDU 62:61
JULIANA SERPELONI DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DE CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS SUBMETIDAS
À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciências da Reabilitação
(Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade
Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
____________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
(Orientador) Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
____________________________________ Profª. Dra. Deise A. A. Pires Oliveira
(Membro interno) Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
____________________________________ Profª. Dra. Luciana Prado Maia
(Membro externo) Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE
Londrina, 30 de Março 2016.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha família por ser minha fonte de incentivo e amor.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a Deus, pelo dom da vida e por ter conduzido
os meus caminhos e minhas escolhas para conseguir chegar até aqui. E a Nossa
Senhora, por ser uma Mãe tão acolhedora e bondosa.
À minha família: meu pai Benedito, minha mãe Fatima, minha irmã
Fernanda, meu cunhado Guilherme e minhas sobrinhas Catarina e Manuela por
serem o meu porto seguro, a minha fonte de amor, meu incentivo constante e
incondicional! Obrigada por serem sempre presentes, mesmo que de longe, por
entenderem a minha ausência, meu cansaço e meu mau humor. Eu amo muito
vocês!
Ao meu namorado Ricardo, que nunca me deixou desanimar, que
me fez estudar quando a vontade faltou, que me ajudou diminuindo a minha
sobrecarga de atividades e principalmente porque soube entender a minha ausência
durante todo esse último ano! Eu também te amo muito!
Ao meu orientador, Prof. Rodrigo, pela oportunidade e por ter
trilhado esse caminho comigo com muita paciência, confiança e leveza. Obrigada
por dividir seu conhecimento comigo!
À Prof.ª Deise e à Prof.ª Regina, pela simpatia e disponibilidade em
me ensinar e por me ajudarem a concluir uma parte importante da pesquisa!
À Prof.ª Cristina e toda sua equipe por terem me recebido tão bem
em “sua casa” e por terem contribuído de forma tão importante e especial neste
trabalho!
Aos meus amigos e familiares por torcerem sempre por mim e por
estarem sempre presentes! Em especial minha amiga e sócia Ligia, que mesmo
vivendo a sua própria atribulação no mestrado, sempre me ajudou e me apoiou!
A toda equipe do LACCEL, principalmente Nayara, Stheace, Priscila,
Leandro e Larissa, por me ajudarem durante esse período, por entenderem as
dificuldades enfrentadas, as angústias e por toda a ajuda recebida durante a
caminhada!
A todos os meus queridos pacientes que foram muito compreensivos
com as remarcações, as ausências e a minha agitação! Vocês todos foram ótimos!!!
“Verdades não podem ser deduzidas por meio de incertezas; você deve testá-las."
(Antoine de Saint-Exupéry)
ALMEIDA, Juliana Serpeloni de. Avaliação de células fibroblásticas submetidas à Terapia Laser de Baixa Potência, 61p. Dissertação do Programa de Mestrado em Ciências da Reabilitação (programa associado entre a Universidade Estadual de Londrina [UEL] e a Universidade Norte do Paraná [UNOPAR]) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2016.
RESUMO Introdução: A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) é utilizada para acelerar a cicatrização, diminuir a dor, promover a síntese de proteínas, organização de fibras colágenas, neovascularização, aumentar os níveis intracelulares de ATP (Adenosina trifosfato) e de cálcio, e atua também como recurso anti-inflamatório nos processos de regeneração tecidual. Objetivos: analisar a viabilidade celular, a estrutura celular e a expressão gênica dos genes interleucina-6 (IL-6) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) após TLBP (λ = 660 nm) em células fibroblásticas L929. Metodologia: Células fibroblásticas L929 cultivadas em garrafas de 25 cm2 (TPP, Switzerland, Europe) com DMEM/HAM F12 suplementado com 5% SFB (Soro Fetal Bovino) e 1% de antibiótico e antimicótico mantidos em uma estufa de CO2 em atmosfera 5% a 37 º C, foram plaqueadas em placas TPP e em seguida irradiadas com laser de baixa potência (λ = 660 nm) nos tempos 24, 48 e 72 horas, de acordo com os grupos: G1 – controle (não irradiado); G2 – 4 J/cm2; G3 – 6 J/cm2. Após cada período de 24 horas de incubação pós-irradiação, as culturas foram avaliadas pelo método MTT de citotoxicidade [3-(4,5-dimetthylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide] para avaliação da viabilidade celular. As alterações morfológicas referentes ao citoesqueleto e retículo endoplasmático (RE) foram analisadas através da microscopia de fluorescência (MF) com os marcadores rodamina-faloidina e DIOC6, respectivamente. Para análise da expressão dos genes IL-6 e VEGF foi utilizado o método RT-qPCR. Resultados: Em relação à viabilidade celular, encontrou-se significância estatística na realização na Anova de dois fatores (F = 40.53; p = 0.017), porém na análise do pós-teste em relação ao tempo e dose não foi encontrada diferença significante; no entanto o G3 apresentou maior curva de crescimento no tempo 48 horas em relação aos demais grupos. Na avaliação da MF a dose 6 J/cm2, nos tempos 24 e 48 horas, apresentou efeitos biomodulatórios positivos em relação ao citoesqueleto com maior distribuição e organização dos filamentos de actina e também com aumento e melhor distribuição das vesículas de RE no citoplasma em relação ao grupo controle. Quanto à expressão dos genes VEGF e IL-6 foi possível encontrar diferença significativa no G3, em 48 horas nos genes transcritos, sendo de estimulação de 1,82 para o VEGF e de inibição de 36,75 para a IL-6. Conclusão: a TLBP promove efeitos biomodulatórios positivos em cultura celular de fibroblastos favorecendo a proliferação celular, aumento da atividade de RE e alterações morfológicas de citoesqueleto; acelera o processo cicatricial através da inibição do processo inflamatório e estimulação de fatores de crescimento, neovascularização e produção de colágeno. Palavras-chave: Terapia laser de baixa potência; fibroblastos; cultura celular; expressão gênica; proliferação celular.
ALMEIDA, Juliana Serpeloni de. Assessment of L929 fibroblast cells submitted to Low Level Laser Therapy. Dissertation Master in Rehabilitation Sciences Program (program associated between the State University of Londrina [NFB] and the University of North Paraná [UNOPAR]) - University of Northern Paraná, Londrina, 2016.
ABSTRACT Introduction: The Low Level Laser Therapy (LLLT) is used to accelerate healing, reduce pain, promote protein synthesis and arrangement of collagen fibers, neovascularization, increases intracellular levels of ATP (adenosine triphosphate) and calcium, and also acts as an anti-inflammatory use in tissue regeneration processes. Objectives: To analyze cell viability, cell structure and gene expression of the Interleukin-6 gene (IL-6) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) after LLLT (λ = 660 nm) in fibroblast cells L929. Methodology: L929 cells were cultured in bottles of 25 cm2 (TPP, Switzerland, Europe) with DMEM/HAM F12, supplemented with 5% FBS (fetal bovine serum) and 1% antibiotic and antimycotic kept in a CO2 incubator in an atmosphere 5 % at 37 ° C were plated in TPP plates and irradiated followed by low-power laser (λ = 660 nm) at the time 24, 48 and 72 hours, according to the groups: G1 - control (non-irradiated) ; G2 - 4 J/cm2; G3 - 6 J/cm2. After each 24 hours period post-irradiation incubation, the cultures were assessed by MTT cytotoxicity [3- (4,5-dimetthylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] to assess cell viability. The morphological changes related to the cytoskeleton and the endoplasmic reticulum (ER) were analyzed by fluorescence microscopy (FM) with rhodamine-phalloidin and DIOC6 markers respectively. For analysis of expression of IL-6 and VEGF genes was used RT-qPCR method. Results: In relation to cell viability, showed statistical significance in achieving the two-way Anova (F = 40.53, p = 0.017), but in the post hoc analysis with respect to time and dose was no significant difference (p> 0.05), however Group 3 presented a higher growth curve at 48 hours in relation to other groups. In assessing the FM the dose 6 J/cm2 at the time 24 and 48 hours, showed positive biomodulation effects on the cytoskeleton with greater distribution and organization of actin filaments and also to increase and better distribution of endoplasmic reticulum in the cytoplasm in the control group. Regarding the expression of VEGF and IL-6 genes were found significant difference in G3 at 48 hours in transcribed genes, and stimulation of 1.82 to VEGF and inhibiting 36,75 for IL-6. Conclusion: LLLT promotes biomodulatory positive effects on fibroblast cell culture promoting cell proliferation, increased ER activity and morphological changes of the cytoskeleton; accelerating wound healing through inhibition of inflammation and stimulating growth factors, neovascularisation and collagen production. Key words: Laser Therapy, Low-Level; Fibroblasts; Cell culture techniques; Gene expression; Cell proliferation.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10
2 OBJETIVO .............................................................................................................. 12
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................................. 12
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................................... 12
3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 13
3.1 LASER ............................................................................................................................................ 13
3.1.1 Laser de Baixa Potência ........................................................................................................ 18
3.2 CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS .................................................................................................................. 20
3.2.1 Composição das Fibras Colágenas ........................................................................................ 21
3.3 CICATRIZAÇÃO ................................................................................................................................. 22
3.4 LASER DE BAIXA POTÊNCIA E EFEITOS NA CICATRIZAÇÃO ....................................................................... 24
3.5 LASER X CULTURA CELULAR ............................................................................................................... 25
4 ARTIGO ..................................................................................................................28
5 CONCLUSÃO GERAL............................................................................................ 47
6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 48
ANEXOS ...................................................................................................................52
ANEXO A - NORMAS DE FORMATAÇÃO DO PERIÓDICO LASERS IN MEDICAL SCIENCE ........................................ 53
Diretrizes para Autores ................................................................................................................. 53
Apresentação Preparação Checklist .............................................................................................. 56
Aviso de direitos autorais .............................................................................................................. 57
Declaração de privacidade ............................................................................................................ 58
ANEXO B - PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP ...................................................................................... 59
10
1 INTRODUÇÃO
Lesões musculares, ligamentares, ósseas e ulcerações de pele
ocorrem rotineiramente e o desafio do profissional é tratar essas lesões de forma
eficaz, estimulando o reparo tecidual para que o novo tecido formado seja ainda
mais forte e resistente. Diante desse fato o processo de reparação tecidual está
fortemente presente no universo da fisioterapia.
Neste contexto, a Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) tem sido
usada por mais de 20 anos na prática clínica como moduladora de vários processos
biológicos (Kandra, et al., 2005), sendo considerada como um recurso físico não
invasivo, indicado para reduzir a dor, acelerar o processo cicatricial e atuar de forma
importante nos processos inflamatórios (KREISLER, et al., 2002).
A TLBP acelera reações bioquímicas, promove ativação de
fibroblastos, síntese e organização das fibras colágenas, neovascularização,
aumento da atividade de fagócitos e leucócitos, aumenta os níveis de ATP
(Adenosina trifosfato) e os níveis intracelulares de cálcio e síntese de proteína.
Assim, diversos tipos de lasers de baixa potência (LBP) e com comprimento de onda
variando de 524 a 904 nm têm se mostrado eficazes no tratamento de feridas, no
aumento da produção de colágeno, na melhora da diferenciação epitelial e no
aumento da vascularização da derme em vários modelos animais (OLIVEIRA, et al.,
2008; LIRANI-GALVÃO, JORGETTI E SILVA, 2006; MOORE, et al., 2005;
BRONDON, STADLER E LANZAFAME, 2005).
Lirani-Galvão, et al., (2006) relatam que os mecanismos físicos
também afetam a atividade elétrica do tecido, estimulando a angiogênese, a
permeabilidade vascular às células de granulação na fase aguda de uma lesão.
Assim, este processo inibe a atividade inflamatória, resultando na produção de
mediadores químicos que ativam a proliferação de fibroblastos. Subsequentemente
essa ativação leva ao acúmulo precoce de células endoteliais no tecido, bem como a
promoção de síntese de colágeno através da estimulação do influxo de cálcio e uma
mudança na permeabilidade das membranas, o que favorece a síntese e maturação
do colágeno, bem como a formação de tecido cicatricial (RENNÓ, et al., 2011;
HAWKINS E ABRAHAMSE, 2006; WARDEN, et al., 2006; CARVALHO, et al., 2006).
Da mesma forma Kandra, et al., (2004) referenciam que estudos in
11
vitro de cultura celular de fibroblastos humanos da mucosa oral associados a TLBP
demonstraram aumento do número de células, aumento da síntese de DNA e
aumento da produção de colágeno.
Portanto, os resultados obtidos nessa pesquisa nortearão para o
incremento do processo de estimulação e proliferação de células fibroblásticas a
partir da TLBP, correlacionando com o processo de reparo.
12
2 OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL
Analisar os efeitos da Terapia Laser de Baixa Potência em cultura
celular de fibroblasto L929.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a viabilidade celular por meio do ensaio de citotoxicidade e
sobrevivência celular MTT.
Avaliar as estruturas celulares como Retículo Endoplasmático e
Citoesqueleto, de células fibroblásticas a partir de microscopia de fluorescência.
Avaliar a expressão gênica dos genes IL-6 (interleucina – 6) e VEGF
(fator de crescimento endotelial vascular).
Identificar parâmetros de dosimetria de acordo com a irradiação do
laser de baixa potência.
13
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 LASER
O termo Laser é o acrônimo de “Light Amplification by the Stimulated
Emission of Radiation” (Luz Amplificada por Emissão de Radiação) (KOUTNÁ,
JANISCH, VESELSKÁ, 2003).
Os princípios envolvidos na geração desse tipo de luz iniciaram-se
com Albert Einstein em 1917, mas foi em 1960 que Theodore Maiman construiu o
primeiro aparelho de Laser (Laser de Rubi) nos Estados Unidos (Watson, 2009).
Desde então, vários equipamentos foram desenvolvidos a partir desse primeiro
protótipo, e sua evolução permitiu o emprego desse recurso não somente na
medicina, mas também na fisioterapia, odontologia e em vários outros dispositivos
como, por exemplo, leitores de códigos de barras.
O aparelho de laser é formado por uma cavidade ressonante, ou
cavidade óptica. Essa cavidade consiste em um tubo reto contendo um meio ativo,
um par de espelhos (um totalmente e outro parcialmente refletor) dispostos
paralelamente. Genovese, (2000) afirma que o meio condutor é constituído por
materiais que podem produzir a radiação laser. Podem ser sólidos (ex: laser de rubi),
gasosos (ex: HeNe), líquidos (ex: Dy laser), semissólidos (ex: Nd-YAG),
semicondutores (ex: AsGaAl) e excímeros (ex: KrF e XeCl) (WATSON, 2009;
GENOVESE, 2000).
Através de energia elétrica o meio condutor é excitado e seus
átomos começam a emitir fótons que se deslocam em várias direções dentro da
cavidade ressonante. Os que se deslocam em paralelo ao eixo da cavidade
ressonante podem encontrar outro átomo excitado e estimular a emissão de fótons
adicionais. Dessa forma, ocorre um processo de amplificação luminosa gerando um
grande feixe de luz que será transmitido para o exterior através do espelho
parcialmente refletor (WATSON, 2009).
14
Figura 1 - Ilustração de funcionamento do laser.
Fonte: DAVIDOVICH, L. Os quanta de luz e a ótica quântica. Rev. Bras. Ensino Fís. 2015; 37(4):
4205-1 – 4205-12.
Como citado anteriormente, vários elementos podem ser utilizados
como meio condutor. Assim, vários tipos de feixes de luz são formados. A luz é uma
radiação eletromagnética que pode ser classificada por meio de uma escala: o
espectro eletromagnético (Figura 2). Essa escala divide os tipos de feixes de luz de
acordo com o seu comprimento de onda (distância percorrida por uma porção de
energia em uma oscilação completa da onda) medido em nanômetros (nm).
Dependendo do comprimento de onda a luz pode ser ainda classificada como
ultravioleta, luz visível ou infravermelha (AGNE, 2011).
15
Figura 2 - Esquematização do espectro eletromagnético para comprimento de onda (λ).
Fonte: http//images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.teleco.com.br/imagens/tutoriais Pires-Oliveira, 2008. Tese de Doutoramento.
A radiação laser difere da luz comum por suas características
exclusivas: monocromaticidade, coerência e colimação (HAWKINS, ABRAHAMSE,
2007).
Monocromaticidade diz respeito ao fato de que a luz laser é
composta de fótons, todos da mesma cor e com mesmo comprimento de onda (luz
pura) (GENOVESE, 2000).
16
Figura 3 - Característica da luz laser em relação à luz branca – monocromaticidade.
Fonte: Blog Laser, disponível em http://projetolaser.blogspot.com.br/2010/05/como-luz-laser-e-
criada.html em 15/01/2016.
A coerência refere-se ao deslocamento ordenado das ondas que
oscilam uniformemente (mesma fase e mesma direção) (AGNE, 2011).
Figura 4 - Característica da luz laser em relação à luz branca – coerência.
Fonte: Site Laserterapia – Conceitos e Aplicações disponível em
http://www.nupen.com.br/Revista_port/fund_fisicos1.php em 15/01/2016.
17
Por fim, a colimação significa que a luz laser é unidirecional e
paralela, de forma que a energia pode ser propagada durante distâncias muito
longas (GENOVESE, 2000).
Figura 5 - Característica da luz laser em relação à luz branca – colimação.
Fonte: Site Laserterapia – Conceitos e Aplicações disponível em
http://www.nupen.com.br/Revista_port/fund_fisicos1.php em 15/01/2016.
A penetração da luz laser nos tecidos não depende somente das
propriedades anteriormente apresentadas, pois no momento em que o feixe de luz
toca o tecido ocorre reflexão, refração e absorção, e a intensidade desses efeitos vai
depender da natureza e densidade do tecido (AGNE, 2011).
Reflexão é quando uma porção do feixe de luz é refletida ao entrar
em contato com o tecido. A intensidade da reflexão varia de acordo com o ângulo de
incidência do feixe: quanto menor o ângulo formado entre o feixe e a superfície
irradiada, maior será a reflexão, e esta será mínima quando o ângulo chegar a 90°.
E refração ou transmissão é quando a trajetória do feixe sofre
alteração dependendo da composição do tecido (BRONDON, STADLER,
LANZAFAME, 2005).
Absorção é a parcela do feixe que atravessa e interage com o tecido
por meio de processos bioquímicos, bioelétricos ou por dissipação de energia por
18
meio do calor (GENOVESE, 2000).
Figura 6 - Interação da luz laser com o tecido – reflexão, refração e absorção.
Fonte: Site Laserterapia – Conceitos e Aplicações disponível em
http://www.nupen.com.br/Revista_port/fund_fisicos1.php em 15/01/2016.
De acordo com a potência de emissão, a radiação laser pode ser
classificada em: laser de alta, média ou baixa potência (AGNE, 2011; GENOVESE,
2000).
3.1.1 Laser de Baixa Potência
Os lasers de baixa potência (LBP) são aparelhos que emitem
radiação de baixa potência (tipicamente menor que 500 mW), em dosagens
consideradas baixas para produzir aquecimento nos tecidos irradiados (WATSON,
2009; GENOVESE, 2000).
Em relação à interação entre o laser e os tecidos, a profundidade da
penetração da luz será proporcional ao comprimento de onda do aparelho: quanto
maior o comprimento de onda, maior a profundidade de penetração (GENOVESE,
2000).
‘ A imagem a seguir exemplifica a profundidade de penetração de
19
cada comprimento de onda em um desenho esquemático da pele.
Figura 7 - Interação comprimento de onda x tecido
Fonte: Site BrightenYourMood, disponível em: http://www.brightenyourmood.com/how-does-led-light-
therapy-work/ em 11/10/15.
Dentre os principais efeitos observados na TLBP destacam-se:
analgesia local, redução do edema, ação anti-inflamatória, aumento da circulação
sanguínea local e melhora na cicatrização de feridas de lenta evolução. Os
principais lasers dessa categoria são: HeNe (Hélio-Neônio) e Diodo laser (Arseneto
de gálio – AsGa, Arseneto de gálio e alumínio – AsGaAl e AlGaInP - Arseneto Gálio
Índio Fósforo) (HAWKINS, ABRAHAMSE, 2007; GENOVESE, 2000).
A TLBP tem sido amplamente utilizada para estimular a capacidade
de regeneração tecidual. Esse efeito tem sido atribuído ao aumento da proliferação e
do metabolismo celular, e também na expressão de vários genes, como o fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF), que está fortemente relacionado ao
processo de reparação tecidual (BASSO, et al., 2012).
20
3.2 CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS
As células fibroblásticas originam-se de uma célula mesenquimal
indiferenciada, e pode ser considerado como a principal célula presente no tecido
conjuntivo. Ela é responsável pela formação das fibras colágenas, reticulares e
elásticas, além das proteoglicanas e glicoproteínas multiadesivas que fazem parte
da matriz extracelular. As células fibroblásticas são atribuídas também a formação
de fatores de crescimento, que controlam a proliferação e a diferenciação celular
(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2013; ROSS, PAWLINA, 2012; MORISCOT,
CARNEIRO, ABRAHAMSOHN, 2004).
Podem ser encontrados em sua forma ativa (fibroblasto) ou em
repouso (fibrócito) e são diferenciados pelo seu núcleo e citoplasma. Os fibroblastos
possuem vários prolongamentos citoplasmáticos irregulares, núcleo com cromatina
pouco densa, nucléolo pouco evidente e citoplasma rico em retículo endoplasmático
rugoso (RER) e aparelho de Golgi proeminente. Os fibrócitos, por sua vez, são
menores, delgados, de aspecto fusiforme, com núcleo menor e mais escuro e
citoplasma com pouca quantidade de RER (JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2013;
MORISCOT, CARNEIRO, ABRAHAMSOHN, 2004).
Figura 8 - Fibroblastos ativos e quiescentes.
Fonte: JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2013.
21
Dentre as estruturas presentes nas células, destacam-se
citoesqueleto e RE que são estruturas importantes na morfologia celular, uma vez
que suas funções estão diretamente relacionadas à proliferação celular. O
citoesqueleto desempenha papel importante na morfologia celular por influenciar a
adesão e o crescimento da mesma, sendo constituído principalmente pela proteína
actina, disposta em filamentos e microtúbulos. Essa rede de actina é determinante
para a vida celular, pois fornece uma estrutura rígida de proteção ao núcleo e
confere elasticidade da membrana celular. Alterações no citoesqueleto permitem
que a mesma possa migrar, dividir-se e manter a sua forma, enquanto que o RE é o
responsável pela síntese de proteínas (YOUREK, HUSSAIN, MAO, 2007).
Em adultos, os fibroblastos não se dividem com frequência, exceto
quando há uma sobrecarga funcional ou por lesões (MORISCOT, CARNEIRO,
ABRAHAMSOHN, 2004).
3.2.1 Composição das Fibras Colágenas
As fibras de colágeno são os componentes estruturais mais
abundantes do tecido conjuntivo. Apresentam como características a flexibilidade e
uma grande força tênsil. Cada fibra de colágeno é formada por subunidades
filamentosas finas, as fibrilas de colágeno, e estas por sua vez são compostas por
um arranjo de moléculas de colágeno (ROSS, PAWLINA, 2012).
Existem aproximadamente 29 tipos de colágeno, sendo
diferenciados pela complexidade e pela considerável diversidade em sua estrutura e
função. O colágeno do tipo I é o mais abundante (até 90%) e consequentemente o
mais estudado. Pode ser encontrado nos ossos, tendões, pele, ligamentos, córnea,
pulmão e tecido vascular e desempenha papel importante na cicatrização tecidual,
através da formação do tecido cicatricial, e contribui para o aprisionamento,
armazenamento e entrega de fatores de crescimento e citocinas
(BALASUBRAMANIAN, et al., 2013).
A síntese do colágeno é feita pelos fibroblastos. No núcleo da célula,
os genes codificadores das cadeias α1 e α2 são ativados e produzem o RNA
mensageiro (RNAm). A tradução do RNAm ocorre no citoplasma e as cadeias
polipeptídicas formadas são internalizadas no RE, onde sofrerão hidroxilação dos
aminoácidos e glicosilação. Dentro do RE as cadeias α se organizam em grupos de
22
3 formando as moléculas de procolágeno (precursora da molécula de colágeno
madura) que serão então secretadas para o meio extracelular. Uma enzima também
produzida pelo fibroblasto, a procolágeno peptidase, digere as moléculas de
procolágeno, que se associarão espontaneamente formando as fibrilas de colágeno
(MORISCOT, CARNEIRO, ABRAHAMSOHN, 2004).
3.3 CICATRIZAÇÃO
O tratamento de feridas é possivelmente uma das áreas mais
antigas da medicina, podendo ser definida como a perda da continuidade do tecido
corporal, com etiologia variada, passível de atingir a epiderme e também estruturas
mais profundas, como músculo, osso e tendão. Dessa forma, após uma lesão
tecidual, o organismo inicia automaticamente um processo de proteção (inflamação)
e posteriormente de reparo desse tecido (CALISTO, et al., 2015; ROSS, PAWLINA,
2012).
A inflamação é uma reação complexa e fundamentalmente protetora
a uma injúria que pode ser causada por bactérias, traumatismo, substâncias
químicas ou qualquer outro fenômeno, e que visa livrar o organismo tanto da causa
inicial quanto das consequências dessa injúria (KUMAR, et al., 2010).
Depois de ocorrida a lesão, é necessário que haja o reparo; esse
processo pode ser dividido em 3 fases: (1) inflamação, (2) proliferação / formação de
tecido de granulação e (3) remodelagem (KITCHEN, BAZIN, 1988).
Segundo Kumar, et al., (2010), a inflamação aguda apresenta três
principais componentes: na primeira fase ocorre alteração no calibre vascular que
leva a um aumento no fluxo sanguíneo; mudanças estruturais na microvasculatura
que permitem que as proteínas do plasma e os leucócitos saiam da circulação e
também emigração de leucócitos da microcirculação para eliminar o agente
agressor.
Essa emigração de leucócitos, principalmente neutrófilos e
macrófagos, ocorrem por ação de mediadores químicos, como, por exemplo, a
histamina, que, liberada a partir da degranulação dos mastócitos, causa dilatação
das arteríolas e aumenta a permeabilidade das vênulas (GENOVESE, 2000).
A segunda fase, ou fase proliferativa, é caracterizada pela formação
23
de tecido de granulação. Nesta fase a lesão é preenchida por células (em sua
maioria macrófagos e fibroblastos), numerosos vasos sanguíneos e uma matriz de
tecido conjuntivo. Sob essas condições, o principal processo de cura ocorre por
deposição de colágeno e outros elementos da matriz extracelular, promovendo a
formação de um tecido conectivo vascularizado (KUMAR, et al., 2010).
Por fim, a remodelagem: nesta fase o tecido de granulação é
gradualmente substituído por uma cicatriz, que é um tecido relativamente acelular e
avascular. O equilíbrio entre síntese e degradação da matriz extracelular resulta no
remodelamento da trama de tecido conjuntivo – uma importante característica para o
reparo tecidual (KITCHEN, BAZIN, 1988).
A figura a seguir ilustra as 3 fases da cicatrização tecidual de acordo
com os dias de lesão e a presença e quantidade de células em cada fase.
Figura 9 – Fases da cicatrização tecidual ao longo dos dias após o trauma.
Fonte: Site Phytoplenus, disponível em http://phytoplenus.com/produtos em 15/01/2016.
Para Mendonça, et al., (2006), o processo de cicatrização ocorre
para restaurar a integridade anatômica e funcional do tecido, sendo dessa forma um
processo complexo e que envolve diferentes tecidos. As células epiteliais
desempenham um papel importante nos eventos de reparação, pois elas são
responsáveis pela recuperação de áreas lesionadas e estimulação dos tecidos
subjacentes, como os tecidos conjuntivo e endotelial, através da expressão de
fatores de crescimento (BASSO, et al., 2012).
24
3.4 LASER DE BAIXA POTÊNCIA E EFEITOS NA CICATRIZAÇÃO
A TLBP tem sido amplamente utilizada na medicina, principalmente
em tecidos patológicos que apresentam algum grau de alteração, como nos
processos inflamatórios ou de reparo (KHANDRA, et al., 2005; PEREIRA, et al.,
2002).
Karu, (1988) propôs a teoria de que a luz laser é absorvida na
mitocôndria, por seus componentes, que resulta na ativação da cadeia respiratória e
consequentemente promove alterações no estado redox da mitocôndria e
citoplasma. Essas mudanças afetam a permeabilidade da membrana, aumentando
assim os níveis intracelulares de cálcio. Esse, por sua vez, está envolvido na
produção de nucleotídeos cíclicos que controlam a síntese de DNA e RNA e por fim
a proliferação celular. Esse mesmo efeito altera a atividade elétrica do tecido,
promovendo a degranulação das células na fase aguda pós-lesão e inibindo a fase
inflamatória pela produção de mediadores químicos que ativam a proliferação de
fibroblastos (PIRES-OLIVEIRA, et al., 2009).
Os fibroblastos secretam múltiplos fatores de crescimento durante a
reepitelização da lesão e participam ativamente na formação de tecido de
granulação e na formação da matriz extracelular. Assim, fica claro o importante
papel desempenhado pelo fibroblasto durante o processo de reparo tecidual. A
proliferação e o aumento do metabolismo celular determinam o sucesso da
reparação, uma vez que o colágeno produzido pelo mesmo é responsável pela força
e integridade do novo tecido formado (BASSO, et al., 2012; OLIVEIRA, et al., 2008).
Entre os relatos sobre os efeitos biomodulatórios da TLBP, destaca-
se a formação de novos capilares sanguíneos através da liberação de fatores de
crescimento. A liberação de citocinas e de fatores de crescimento a partir de células
lesionadas é uma importante etapa da cicatrização de feridas, pois estimula a
formação de células epiteliais, novos fibroblastos, aumento da produção de colágeno
e neovascularização (KHOO, et al., 2014).
Estudos têm demonstrado que a estimulação in vitro de fibroblastos
através da TLBP apresenta resultados significativos como, por exemplo, o de Basso,
et al., (2012), que demonstrou diferença estatisticamente significante em relação ao
aumento do metabolismo e ao número de células viáveis após a irradiação do LBP
em relação ao controle, assim como Azevedo, et al., (2006) que também identificou
25
aumento na proliferação celular de fibroblastos irradiados com laser λ = 660 nm em
relação ao controle não irradiado.
3.5 LASER X CULTURA CELULAR
Os efeitos da estimulação com TLBP a nível celular e molecular têm
sido demonstrados em muitos estudos, mas em função do grande número de
parâmetros envolvidos como o comprimento de onda, potência do equipamento,
tempo de aplicação, densidade de energia e condição fisiológica da célula, é muito
difícil comparar os resultados obtidos nas diferentes pesquisas, razão pela qual os
mecanismos de interação da TLBP nas células ainda não foram completamente
elucidados (BASSO, et al., 2012; KHANDRA, et al., 2005; KOUTNÁ, JANISCH,
VESELSKÁ, 2003; ALMEIDA-LOPES, et al., 2001).
Podemos citar como principais efeitos da TLBP, a nível celular, a
proliferação celular, síntese de colágeno e liberação de fatores de crescimento
celular. Alguns mecanismos foram propostos para elucidar a ocorrência desses
eventos, como a absorção da luz por enzimas mitocondriais, causando excitação da
cadeia respiratória, produzindo a fotoativação dos canais de cálcio, que resulta no
aumento da concentração de cálcio intracelular e a proliferação celular. Essa reação
estimula a duplicação de DNA, o aumento de síntese proteica e a modulação da
produção de fatores de crescimento de fibroblastos, que por sua vez irão estimular a
proliferação celular (BELLETTI, et al., 2014; DANTAS, et al., 2010; MOORE, et al.,
2005).
Karu, (1987) descreve ainda que a irradiação laser exerce efeitos em
células estressadas ou com alterações em seu metabolismo. Dessa forma a
irradiação poderia normalizar o metabolismo dessas células retornando a condições
ideais, sendo que os efeitos em curto prazo são devidos à estimulação mitocondrial
e que os efeitos em longo prazo são devidos à estimulação ou inibição da
transcrição e replicação do DNA.
Damante, et al., (2008) afirmam que a proliferação celular não é o
único evento biológico presente no processo de reparo tecidual, sendo altamente
coordenado por eventos sobrepostos, controlados por uma variedade de células,
fatores de crescimento e enzimas metabólicas no mesmo sítio de reparação
(HOURELD, et al., 2010; DAMANTE, et al., 2008).
26
Estudos sobre o efeito do laser em cultura celular confirmam as
alterações intracelulares específicas, tal como o metabolismo do cálcio, essas
alterações provocam um estímulo à divisão celular, razão pela qual Azevedo, et al.,
(2006) e Frigo, et al., (2010) encontraram aumento significativo em relação a
proliferação celular quando fibroblastos humanos foram submetidos a TLBP com
laser de comprimento de onda de 660 nm.
Sabe-se que lasers com diferentes comprimentos de onda produzem
efeitos diferentes nos fibroblastos (Almeida-Lopes, et al., 2001). Marques, Pacheco-
Soares e Soares da Silva, (2014) avaliaram os efeitos da TLBP com diferentes
comprimentos de onda (λ = 685 e 830 nm) em células fibroblásticas L929 cultivadas
em diferentes concentrações de SFB (Soro Fetal Bovino) (5 e 10%) com densidade
de energia variando de 0,1 a 30 J/cm2. Em relação ao crescimento celular
encontraram diminuição significativa (p < 0,05) quando irradiado com λ = 685 nm e
dose de 0,1 J/cm2, enquanto que as células irradiadas com maior dose (5 – 30
J/cm2) tiveram a viabilidade aumentada significativamente (p < 0,05) com
concentração de 5% de SFB (λ = 685 nm com dose de 20 J/cm2 e λ = 830 nm e
dose de 10 J/cm2). Na concentração 10% de SFB não houve diferença entre os
diferentes comprimentos de onda.
Ferrielo, Faria e Cavalcanti, (2010) também utilizaram a linhagem
celular L929, λ = 680 nm e dose de 4 J/cm2 e encontraram crescimento celular
aumentado, porém a curva de crescimento não foi estatisticamente significante (p =
0,107) em relação ao controle, ao passo que Damante, et al., (2009) avaliaram
fibroblastos de gengiva humanas, λ = 660 nm e doses de 3 e 5 J/cm2 e verificaram
aumento significativo (p < 0,01) na concentração de bFGF (Fator de crescimento de
fibroblastos), principalmente nas primeiras 48h em relação ao controle.
A proliferação das células fibroblásticas induzidas pela TLBP são
acompanhados também por um aumento no número de algumas proteínas, sendo
as principais a interleucina 6 (IL-6) e o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF). O VEGF é um potente estimulador da angiogênese, que atua estimulando a
proliferação e a migração de células endoteliais, a cicatrização de feridas, a
formação de novos vasos sanguíneos e promove a manutenção da homeostase
vascular em adultos, sendo predominantemente produzido por células endoteliais
em resposta a hipóxia e após a estimulação de fatores de crescimento
(MARTIGNAGO, et al., 2015; KHOO, et al., 2014; ESMAEELINEJAD, BAYAT, 2013;
27
CÉBER-SUAREZ, et al., 2006; BASSO, et al., 2002).
A IL-6 por sua vez é uma citocina pró-inflamatória com atuação tanto
na resposta imune quanto na adaptativa. É produzida por monócitos, macrófagos,
células endoteliais e fibroblastos (Ceccon, et al., 2006; Souza, et al., 2008).
Desempenha papel essencial na fase inflamatória, controlando a inflamação e
preparando o tecido para favorecer a atividade fagocítica, estimular a migração e
quimiotaxia de queratinócitos e fibroblastos para o sítio de reparação, regular a
liberação adicional de outras citocinas e fatores de crescimento (Esmaeelinejad,
Bayat, 2013). Esses mesmos autores encontraram diferença estatisticamente
significante em relação à estimulação de liberação de IL-6 por fibroblastos humanos
através da TLBP, usando λ = 632,8 nm e densidade de energia de 0,5; 1 e 2J/cm2.
28
4 ARTIGO
ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR E A EXPRESSÃO DOS GENES IL-6 E
VEGF APÓS TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA EM CULTURA CELULAR
FIBROBLÁSTICA.
ANALYSIS OF CELL VIABILITY AND GENE EXPRESSION OF IL-6 and VEGF
AFTER LOW LEVEL LASER THERAPY IN FIBROBLAST CELL CULTURE
(Será submetido ao periódico Lasers in Medical Science)
Juliana Serpeloni de Almeida1, Deise A. A. Pires-Oliveira2, Cristina Pacheco Soares3,
Regina Célia Poli Frederico4,Nayara Tahiana Catenace Pereira1, Stheace Kelly
Fernandes Szezerbaty1,Rodrigo Franco de Oliveira2.
1 – Fisioterapeuta, especialista e mestranda em Ciências da Reabilitação pela Universidade
Estadual de Londrina (UEL) / Universidade Norte do Paraná (UNOPAR) – Londrina – PR.
2 – Fisioterapeuta, Prof.(a). Dr.(a). Titular do Programa de Mestrado e Doutorado em
Ciências da Reabilitação – UEL/UNOPAR – Londrina – PR.
3 – Bióloga, Prof.ª. Dra. Integral da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) no
Departamento de Biologia Celular e Tecidual – São José dos Campos – SP.
4–Bióloga, Prof.ª. Dra. Titular do Programa de Mestrado e Doutorado em Ciências da
Reabilitação – UEL/UNOPAR – Londrina – PR.
Endereço para correspondência:
Rodrigo Franco de Oliveira
UNOPAR – Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde - Laboratório de Cultura Celular
Rua Marselha, 591. Jd. Piza. CEP: 86.041-140 Londrina – PR.
e-mail: [email protected]
Fonte de Financiamento: Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior
Particular (Funadesp) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
Instituição: UNOPAR – Universidade Norte do Paraná. Centro de Pesquisa em Ciências da
Saúde – Lab. de Cultura Celular. R. Marselha, 591. Jd. Piza. CEP: 86041-140. Londrina, PR.
29
RESUMO
A fotobiomodulação produzida pela Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) é amplamente utilizada para acelerar processos de cicatrização dos tecidos, promover neovascularização, diminuir a dor, aumentar a síntese de DNA e RNA e também atuar nos processos anti-inflamatórios. O objetivo do trabalho foi analisar os efeitos da TLBP em cultura celular de fibroblastos L929 em relação à proliferação, estrutura celular e expressão gênica dos genes Interleucina – 6 (IL-6) e Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Para tanto, células fibroblásticas foram irradiadas com laser de baixa potência (λ = 660 nm) nos tempos 24, 48 e 72 horas, de acordo com os grupos: G1 – controle (não irradiado); G2 – 4 J/cm2; G3 – 6 J/cm2. Após cada período de 24 horas de incubação pós-irradiação as culturas foram avaliadas quanto à viabilidade celular pelo método MTT de citotoxicidade. O grupo que apresentou melhor resultado quanto à viabilidade celular, foi selecionado para avaliação morfológica de citoesqueleto e retículo endoplasmático (RE) analisadas a partir da microscopia de fluorescência (MF) e avaliação da expressão dos genes IL-6 e VEGF a partir do método RT-qPCR. Para análise dos resultados foi utilizado Anova de dois fatores e pós-teste, que não demonstrou diferença significativa em relação ao tempo e a dose (p > 0,05). No entanto, o G3 apresentou maior curva de crescimento no tempo 48 horas em relação aos demais grupos. Na avaliação da MF o G3, nos tempos 24 e 48 horas, apresentou efeitos biomodulatórios positivos em relação ao citoesqueleto com maior distribuição e organização dos filamentos de actina e aumento intenso da atividade reticular. Em relação à expressão gênica dos genes VEGF e IL-6 foi possível encontrar diferença significativa no grupo 3, em 48 horas, de estimulação de 1,82 para o VEGF e de inibição de 36,75 para a IL-6. Conclui-se assim que a TLBP promove efeitos biomodulatórios positivos na estrutura em cultura celular de fibroblastos favorecendo a proliferação celular; a liberação de fatores de crescimento; a neovascularização e inibição do processo inflamatório. Palavras chaves: Terapia laser de baixa potência; fibroblastos; cultura celular; expressão gênica; proliferação celular.
30
ABSTRACT
The photobiomodulation produced by Low Level Laser Therapy (LLLT) is widely used to accelerate tissue healing processes, promote neovascularization, decrease pain, increase the synthesis of DNA and RNA, and also act as an anti-inflammatory processes. The objective of this study was to analyze the effects of LLLT in fibroblast cell culture L929 regarding proliferation, cell structure and gene expression of genes Interleukin - 6 (IL-6) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). For this, fibroblast cells were irradiated with low level laser (λ = 660 nm) at the times 24, 48 and 72 hours, according to the groups: G1 - Control (non-irradiated); G2 - 4 J/cm2; G3 - 6 J/cm2. After each period of 24 hours incubation post irradiation the cultures were assessed for cell viability by the MTT cytotoxicity. The group received best result and the cell viability had the morphological changes of the cytoskeleton and the endoplasmic reticulum (ER) analyzed by fluorescence microscopy (FM), and assessment of the expression of IL-6 and VEGF genes to the same group using the method RT-qPCR.For data analysis was used ANOVA of two factors and post-test showed no significant difference with respect to time and dose (p> 0.05). However the group 3 had the highest growth curve at the time 48 hours in relation to other groups. In evaluating the FM group 3, the times 24 and 48 hours, show positive biomodulatory effects on the cytoskeleton more distribution and organization of actin filaments and intense increase in the reticular activity. Regarding the gene expression of VEGF and IL-6 genes were found significant differences in the group 3, 48 hours of stimulation to 1.82 and VEGF inhibition 36,75 for IL-6. In conclusion, the LLLT promotes positive biomodulatory effects on the structure of fibroblasts in cell culture promoting cell proliferation; the release of growth factors; neovascularization and inhibition of the inflammatory process. Key words: Laser Therapy, Low-Level; Fibroblasts; Cell culture techniques; Gene expression; Cell proliferation.
31
INTRODUÇÃO
A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) tem sido utilizada na
prática clínica como modulador de vários processos biológicos [1]; acelera reações
bioquímicas, promove ativação de fibroblastos, a síntese e organização das fibras
colágenas, neovascularização, o aumento da atividade de fagócitos e leucócitos e
aumenta os níveis de ATP (Adenosina trifosfato), os níveis intracelulares de cálcio e
síntese de proteína [2,3,4]. O laser é considerado um recurso físico não invasivo e
atérmico, indicado para reduzir a dor, acelerar o processo cicatricial e atua de forma
importante nos processos inflamatórios [5].
Os efeitos da estimulação com TLBP a nível celular e molecular têm
sido demonstrados em muitos estudos [1,6,7], porém seus mecanismos de interação
ainda não foram completamente elucidados em função do grande número de
parâmetros envolvidos (comprimento de onda, potência do equipamento, tempo de
aplicação, densidade de energia e estado fisiológico da célula) [1]. Alguns
mecanismos para explicar esses efeitos foram propostos, como a absorção da luz
por enzimas mitocondriais e fotoativação dos canais de cálcio resultando no
aumento da concentração de cálcio intracelular e a proliferação celular [8].
Damante, et al., (2008) [9] afirmam que a proliferação celular não é
o único evento biológico presente no processo de reparo tecidual, pois os fatores de
crescimento também desempenham um papel muito importante. E que a TLBP,
além de induzir a proliferação das células fibroblásticas, promove também um
aumento no número de algumas proteínas, como por exemplo, a interleucina – 6 (IL-
6) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [6,10]. Houreld, Ayuk e
Abrahamse, (2014) [11] estudaram a interação de 84 genes com a TLBP, entre eles
a IL-6, e encontraram inibição significativa desse gene em relação ao controle. Já
Esmaeelinejad e Bayat, (2013) [12] apontaram estimulação significativa da IL-6 em
fibroblastos humanos com intensidade de 2 J/cm2 e laser de 632,2 nm. Chiarotto, et
al, (2014) [13] por sua vez, encontraram estimulação (p < 0,05) na formação de
novos vasos sanguíneos, aumento no número de fibroblastos e expressão do gene
VEGF em feridas cutâneas de ratos utilizando laser λ = 670 nm e dose de 4.93
J/cm2.
Os fibroblastos desempenham papel importante no processo
cicatricial, no aumento da proliferação e do seu metabolismo, promovendo maior
32
produção de colágeno, e este, por sua vez, é responsável pela força e integridade
do novo tecido formado [4]. Essas células também secretam múltiplos fatores de
crescimento durante a reepitelização da lesão e participam ativamente na formação
de tecido de granulação e na formação de matriz extracelular [14].
Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a viabilidade
celular, a estrutura celular e a expressão gênica dos genes IL-6 e VEGF após
irradiação Laser de Baixa Potência em cultura celular de fibroblasto L929.
MATERIAL E MÉTODOS
Cultura Celular
Células L929 de fibroblastos (Mouse conjunctive tissue - ATCC CCL-
1 NCTC) (Instituto Adolfo Lutz - SP, Brasil) foram cultivadas em garrafas de 25 cm2
(TPP, Switzerland, Europe) com 3 ml de meio DMEM/HAM F12 (Dulbelcos Minimum
Essencial Medium) (GibcoTM - Invitrogen Corporation, Grand Island, USA)
suplementado com 5% SFB (Soro Fetal Bovino) (Cultilab, Brazil) e 1% de antibiótico
e antimicótico, mantidos em uma estufa de CO2 em atmosfera 5% a 37 ºC. Células
do tecido conjuntivo de camundongo foram utilizadas neste experimento, conforme a
norma ISO 10993-5, que recomenda a utilização desta linha de células in vitro para
testes de citotoxicidade [15]. O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética da
Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), sob o protocolo nº 462.478/2013.
Irradiação
Foi utilizado o laser diodo contínuo AlGaInP (Arseneto Gálio Índio
Fósforo) λ = 660 nm, com potência de saída de 35 mW - Endophoton – KLD –
Biosistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda, modelo LLTO 0107, devidamente
calibrado pelo fabricante.
Após a cultura apresentar confluência, foi realizada a tripsinização
nas placas TPP de 96 poços, em uma densidade de 5 x 104 células/ml. Em seguida,
as células permaneceram por 24 horas em repouso (overnight) para a
sedimentação. Posteriormente, iniciou-se a intervenção nos intervalos de 24, 48 e 72
horas, respeitando a seguinte separação de grupos: G1: controle (não recebeu
33
irradiação), G2: 4 J/cm2 e G3: 6 J/cm2, sendo 0,07 e 0,10 segundos o tempo de cada
irradiação respectivamente. Para o momento da irradiação, o meio de cultura foi
substituído por mesma quantidade (1ml) de PBS (phosphate buffered saline /
tampão fosfato-salino) a fim de diminuir a interferência na absorção da energia. A
aplicação ocorreu em ambiente fechado, temperatura ambiente e com mínima
luminosidade. A energia laser entregue à cultura de células via fibra óptica com área
de seção transversal igual a 0,01 cm2, na forma contínua, método de aplicação
pontual, com feixe laser atingindo perpendicularmente a placa com a tampa fechada.
Todo o experimento foi realizado em triplicata. Após cada período, as culturas
tiveram a viabilidade celular avaliada pelo teste de citotoxicidade MTT de acordo
com a figura 1.
Figura 1: Esquema dos tempos de irradiação e avaliação de acordo com o protocolo.
Teste de Citotoxicidade Celular
Os experimentos de citotoxicidade foram avaliados pelo método de
MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio]. As culturas de células
L929 receberam irradiação Laser nos intervalos de 24, 48 e 72 horas, sendo que
após 24 horas de cada irradiação foi realizado teste de MTT de acordo com ensaio a
seguir: foi retirado o meio de cultura de cada poço e adicionado 50 l de MTT e
incubado por 01 hora a 37C em atmosfera de 5% de CO2. Em seguida, retirou-se o
MTT e foi adicionado 50 l de DMSO (Dimetil sulfóxido) em cada poço, a partir daí
as placas foram mantidas em agitação por 15 minutos para solubilização dos cristais
de formazana e sua concentração quantificada espectroscopicamente por meio de
34
um leitor de microplacas (Leitor ELISA – SpectraCount – Packards Instrument,
Offeburg – Alemanha), em comprimento de onda de 570 nm.
Microscopia de Fluorescência
Para acompanhar os efeitos da TLBP, por meio de fluorescência, as
células L929 foram subcultivadas sobre lamínulas de vidro à densidade de 5 x 105
células/ml, em placas TPP de 12 poços; o grupo selecionado para analises de MF foi
o grupo que apresentou melhor crescimento celular e no melhor tempo, 24 horas
após a irradiação as lamínulas foram analisadas ao microscópio de fluorescência,
equipado com sistema fotográfico Leica MPS-30. Todos os corantes fluorescentes
usados nos estudos fluorimétricos foram adquiridos da Invitrogen®. As células foram
marcadas com corantes fluorescentes por incubação em meio de cultura contendo o
corante a 37C nas seguintes condições: rodamina-faloidina para citoesqueleto,
DAPI – Fluoreshild (Sigma-Aldrich®, Steinheim, Germanye) para núcleo e DIOC6
(3,3’- dihexyloxa carbocyanine iodide) (Molecular Probes Eugene, Oregon,USA) para
o retículo endoplasmático. Para completa aderência dos marcadores foi utilizado o
fixador Paraformoldeído PA 4% em PBS. Todas as lamínulas foram marcadas com
DAPI e DIOC6, porém uma parte recebeu a marcação rodamina-faloidina. Apenas
para o marcador rodamina-faloidina foi utilizado paraformaldeído (PA) 4% em PBS e
Triton X-100 a 0,1% como fixador do corante.
Extração de RNA e conversão para cDNA
Para a extração do RNA total foi utilizado o PureLink® RNA Mini
Kit (Invitrogen, Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Após
sua extração, o RNA foi quantificado em espectrofotômetro NanoDrop Lite (Thermo
Scientific). O cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg do RNA total extraído. O volume
final da reação foi de 20 μL, composto por 10% de tampão de reação (200 mM Tris-
HCl (pH 8.4), 500 mM KCl – Invitrogen), 1,5 mM de MgCl2 (Invitrogen), 0,5 mM de
dNTPs (Invitrogen), 80 pmol de Oligo dT12-18 (Invitrogen), 100 pmol de Random
Primers (Invitrogen), 10 unidades da enzima SuperScript III (Invitrogen) e 2 unidades
da enzima RNase Out (Invitrogen).
Para minimizar variações de desempenho da transcriptase reversa e
35
a possibilidade do efeito Monte Carlo, três reações distintas de síntese de cDNA
foram realizadas para cada experimento, cujos produtos foram incorporados para
obtenção de uma única mistura referente a cada amostra em sua respectiva
condição de cultivo. Os cDNAs sintetizados também foram quantificados para
identificação de possíveis variações da eficiência de reação da transcriptase reversa
entre as diferentes condições de tratamento, e também verificados quanto à sua
qualidade por espectrofotometria. A concentração final de todas as amostras foi
ajustada para 50 ng/μL.
PCR em Tempo Real
As reações em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foram
realizadas em um termociclador StepOne Plus System (Applied Biosystems) nas
seguintes condições: 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 60
segundos a 60ºC seguido pela curva de melting nas seguintes condições: 95ºC por
15 segundos, 60ºC por 60 segundos e para finalizar 95ºC por 15 segundos. A
reação final de 20 μL continha 10 μL do TaqMan Universal Master Mix II (Applied
Biosystems), 1 μL do TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems), 8 μL
de H2O ultra pura e 1 μL do cDNA.
Para determinação da expressão relativa dos genes de interesse no
grupo que apresentou melhor crescimento celular e no melhor tempo, foi utilizado o
programa REST – versão 2009 (Relative expression software tool) (QIAGEN),
desenvolvido por Pfafflet, et al., (2002) [16] baseado em seu próprio modelo
matemático de quantificação relativa de dados obtidos por PCR em tempo real, com
correção de eficiência. Os valores obtidos na situação controle (ausência de
tratamento) foram utilizados como referência para comparação e os cálculos foram
normalizados a partir do gene de referência β-Actina. Foram considerados apenas
valores de Cq (quantification cycle) com uma variação de ± 0,5 entre as triplicatas de
reação.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foi utilizado o GraphPad Prism® 6.0 (Graph Pad Software, San
Diego, CA, EUA). Para todos os testes realizados foi adotado um intervalo de
36
confiança de 95% e nível de significância de 5%. Inicialmente, foi realizado teste de
Shapiro-Wilk para verificar se os dados apresentavam distribuição gaussiana, em
seguida foi realizado Anova de dois fatores com pós-teste de Tukey para verificar os
efeitos entre as diferentes intensidades e em relação ao tempo. Para análise da
expressão gênica, os dados foram expressos segundo o método Pfaffl [17] e
calculados com auxílio do Software Rest 2009 [15], considerando valores de desvio
padrão para o teste estatístico "Pair wise fixed reallocation". Foram considerados
diferencialmente expressos quando comparados à situação controle os genes cuja
alteração foi significativamente diferente considerando o valor de p ≤ 0,001 ou
alterações maiores que 1,5 vezes considerando valor de p < 0,05. Na análise
estatística da expressão gênica utilizou-se o programa SPSS versão 20.0.
RESULTADOS
Os valores de crescimento celular baseados em cada intensidade
estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 – Crescimento Celular
Intensidade 24 h 48 h 72 h
Controle 0.95 (±0.02) 0.91 (±0.05) 0.99 (±0.00)
4 J/cm2 1.10 (±0.15) 0.91 (±0.19) 0.78 (±0.05)
6 J/cm2 0.87 (±0.05) 1.21 (±0.32) 1.14 (±0.17)
Valores apresentados em média e desvio-padrão (±).
Foi observada na realização da Anova de dois fatores significância
estatística (F = 40.53; P = 0.017), mas na análise do pós-teste tanto da diferença
entre os valores das intensidades e do tempo não foram observadas diferenças
estatisticamente significante, estando os dados apresentados na figura 2.
37
Figura 02 - Crescimento celular em relação ao tempo e intensidade.
Para melhor compreensão do efeito da TLBP sobre estruturas
celulares, analisadas a partir da Microscopia de Fluorescência (MF), realizaram-se
as marcações do Citoesqueleto (rodamina-faloidina) e do Retículo Endoplasmático
(RE) (DIOC6), permitindo analisar as alterações nas estruturas celulares, uma vez
que essas estruturas apresentam papel fundamental no processo de proliferação
celular.
Para a avaliação das células fibroblásticas L929 por MF foi utilizado
a marcação com DIOC6 – sobreposição de marcações (overlay), RE e citoesqueleto
onde observou-se que nas células controle o RE se espalhou pelo citoplasma (Fig.
3 A).
38
Figura 3 – Microscopia de Fluorescência. A – Grupo Controle – não irradiado, B – 6 J/cm2 24h, C – 6 J/cm2 48h, D – 6 J/cm2 72h. Seta – distribuição de RE; Estrela – Citoesqueleto.
Nos grupos irradiados com laser 6 J/cm2, nos tempos de 24 e 48
horas (Fig. 3 B, C - seta), observou-se um aumento significativo na distribuição do
RE no citoplasma, com maior número de vesículas e intensa marcação, quando
comparado com o grupo controle no qual foi observado um número reduzido de
vesículas. Quanto ao grupo irradiado com laser 6 J/cm2, no tempo 72 horas (Fig. 3
D), observou-se uma diminuição na atividade reticular, quando comparado aos
grupos 24 e 48 horas. Diante destes resultados, infere-se que a intensidade da
fluorescência para todas as células irradiadas foi maior em relação às células não
irradiadas, indicando um aumento na síntese proteica. Em relação ao citoesqueleto,
nos grupos irradiados com laser 6 J/cm2, nos tempos 24 e 48 horas (Fig. 3 B, C -
estrela), observou-se uma maior distribuição e organização dos filamentos actina em
toda célula, caracterizando um evidente efeito biomodulatório do laser, induzindo
assim a remodelagem celular quando comparado ao grupo controle não irradiado
(Fig. 3 A).
A
C D
B A
C D
B
39
Em relação à expressão gênica dos genes VEGF e IL-6 foi possível
encontrar diferença estatisticamente significante no grupo irradiado em relação ao
grupo controle. Nos transcritos do gene VEGF apresentou-se um aumento de 1,82
enquanto que nos transcritos do gene IL-6 foi observado diminuição de 36,75 como
demonstrado na figura 3, ambos para as células irradiadas com dose de 6 J/cm2 no
tempo 48h em comparação com o G1 – controle.
Figura 4: Gráfico da expressão dos genes VEGF e IL-6.
DISCUSSÃO
A TLBP em cultura celular é amplamente utilizada como recurso
biomodulatório, uma vez que dentre os seus principais efeitos destacam-se a
cicatrização de feridas e o favorecimento das reações celulares [18].
Almeida-Lopes, et al., (2001) [19] relatam que a principal vantagem
dos estudos in vitro é o fato desse tipo de estudo poder isolar uma parte específica
do processo. Assim sendo, a linhagem celular L929 favorece os estudos in vitro por
ser uma célula de fácil cultivo e por ter seus padrões fisiológicos bem conhecidos
[11].
Como mencionado anteriormente, a eficácia da TLBP depende da
combinação de vários parâmetros ideais, como o comprimento de onda, potência do
equipamento, tempo e densidade de energia; dessa forma os estudos variam na
busca dessa combinação ideal como, por exemplo, o estudo de Almeida-Lopes, et
al., (2001) [19] que verificou a proliferação celular usando diferentes comprimentos
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
VEGF IL-6
VEGF
IL-6
*
*
40
de onda (λ 670 - 786 nm) e intensidade constante de 2 J/cm2, ou o estudo de
Kreisler, et al., (2002) [5], que encontrou aumento da atividade celular ao usar
mesmo comprimento de onda e potência (λ 809 nm / 10mW) porém com densidade
variando de 1,96 a 7,84 J/cm2. Azevedo, et al., (2006) [20], por sua vez, indicam que
densidades de energia entre 2 e 4 J/cm2 apresentam maior efetividade em relação
ao crescimento celular.
Frigo, et al., (2010) [21] afirmam que a literatura ainda não é
unânime em relação aos parâmetros da TLBP para a estimulação da proliferação
celular, porém estudos anteriores referem que o comprimento de onda na faixa do
vermelho (630 – 730 nm) com variação entre 2 a 6 J/cm2 apresentam melhores
resultados na estimulação da proliferação celular e consequentemente favorecem a
cicatrização tecidual [9,18,21].
No presente estudo, de acordo com os resultados encontrados, não
foi identificado diferença estatisticamente significante entre as doses de 4 e 6 J/cm2,
porém, clinicamente pode-se inferir que a dose 6 J/cm2 se destaca na estimulação
da proliferação celular, principalmente no tempo 48h. Semelhante a esse resultado,
Ferriello, Faria e Cavalcanti (2010) [18], que ao utilizarem comprimento de onda de
680 nm, dose de 4 J/cm2 e linhagem celular L929 também obtiveram curva de
crescimento sem diferença estatística (p = 0,107), porém apresentando crescimento
em valores absolutos no grupo tratado em relação ao controle.
O estudo desenvolvido por Kim, et al., (2015) [22] analisou a
proliferação celular com células das linhagens L929 e HGF-1 submetidos a TLBP,
com laser de comprimento de onda de 660 nm, potência de 2,5; 5,5 e 8,5 mW/cm2, e
tempo de exposição de 5, 10 e 15 min. Após 24h de irradiação foi identificado que
para os dois tipos de células irradiadas houve aumento significativo na proliferação
celular (p < 0,01), sendo que para as células HGF-1 a melhor dose correspondeu a
2,55 J/cm2 e para as células L929 a melhor dose correspondeu a 6,6 J/cm2
confirmando os achados do presente estudo.
Damante, et al., (2010) [9] se contrapõem aos resultados aqui
expostos ao utilizarem lasers de comprimento de onda 660 e 780 nm em cultura
celular de fibroblastos de gengiva humana com doses de 3 e 5 J/cm2 para avaliar os
efeitos da TLBP na produção de fator de crescimento de queratinócitos (KGF) e fator
de crescimento de fibroblastos (bFGF); e encontrar diferença estatisticamente
significante (p < 0,01) apenas no grupo tratado com laser λ = 780 nm, tanto para a
41
produção de KGF quanto de bFGF.
Estudos in vivo também comprovaram a eficácia da TLBP utilizando
lasers na faixa do vermelho (660 e 632 nm) e doses variando de 4 a 10 J/cm2 em
lesões cutâneas produzidas em ratos [23,24]. Porém com relevância clínica e
terapêutica, encontra-se o estudo de Fabre, et al., (2015) [25] através da aplicação
da TLBP (λ = 660 nm e 5 J/cm2) em sítio pós cirúrgico de retirada do 3° molar. Após
7 dias não foi encontrado diferença estatisticamente significante em relação à dor,
edema e trismo do grupo tratado em relação ao controle, porém, melhores
condições foram encontradas no grupo tratado após 24h.
A combinação dos parâmetros físicos que regulam o laser pode não
ser o único fator envolvido nos efeitos produzidos pela TLBP; o estado fisiológico na
célula no momento da irradiação também interfere nos resultados ao estimular
reações que são citotóxicas, estimulando a síntese de proteinas em concentrações
mais baixas [21,26].
Os resultados obtidos neste trabalho através da MF corroboram com
os achados de Pires-Oliveira, et al., (2010) [27] e Carnevalli, et al., (2003) [28]. Pires-
Oliveira, et al., (2010) [27] usaram mesma linhagem celular (L929), comprimento de
onda de 904 nm e intensidades de 50 mJ e 6 J/cm2 e observaram biomodulação
positiva com maior distribuição de RE pelo citoplasma, aumento da fluorescência
nas células irradiadas e melhor distribuição e organização dos filamentos de actina
por todo o citoplasma quando comparado com o grupo controle. Carnevalli, et al.,
(2003) [28] por sua vez utilizaram fibroblastos da linhagem celular CHO-K1, laser
com comprimento de onda de 830 nm e 2 J/cm2 de intensidade e também
observaram efeito biomodulatórios significativo em relação ao citoesqueleto com
perfeita distribuição pelo citoplasma e despolarização dos filamentos intermediários
caracterizando o início da divisão celular.
Com relação à inflamação, a mesma caracteriza-se como um
mecanismo patológico básico presente em uma grande variedade de doenças [29], e
durante esse processo destaca-se a formação do tecido de granulação e matriz
extracelular, a angiogênese e a inflamação, sendo que os fatores de crescimento e
as citocinas não somente controlam esse processo como também influenciam a
expressão dos genes envolvidos na migração, diferenciação e proliferação celular
[11].
Porém, estudos de Esmaeelinejad e Bayat, (2013) [12] referem que
42
ainda existe conflito na literatura ao interpretar os resultados da expressão do gene
IL-6, pois essa citocina é usada também como medida de proliferação celular e
dessa forma não poderia ser avaliada sozinha. Dessa forma, um aumento da
expressão da IL-6 pode significar tanto um aumento na proliferação celular quanto
um aumento no processo inflamatório.
No presente estudo foi encontrado inibição significativa (p < 0,01) na
expressão do gene IL-6 no grupo irradiado com 6 J/cm2 em relação ao controle, indo
ao encontro com os resultados de Houreld e Abrahamse, (2014) [11] que utilizando
laser de mesmo comprimento de onda (λ = 660 nm) e dose de 5 J/cm2, encontraram
inibição significativa na expressão do gene IL-6 em fibroblastos de pele humana
(WS1) em relação ao controle. Enquanto que Esmaeelinejad e Bayat, (2013) [12]
identificaram estimulação na expressão da IL-6 após TLBP (λ = 632,8 nm / 0,5; 1 e 2
J/cm2) em fibroblastos de pele humana cultivados em meio com alta glicose (15
mM/L).
Estudos in vivo também demonstram inibição significativa (p < 0,01)
na expressão da IL-6 quando submetidas à TLBP com comprimento de onda de 660
e 684 nm e doses de 3 e 7,5 Jcm/2 respectivamente [30,29].
Sendo assim, o reparo tecidual inclui uma resposta angiogênica
fundamental para proporcionar nutrientes para o tecido lesado e a formação do
tecido de granulação, destacando-se o VEGF como um importante mediador
envolvido nesse processo [31]. Segundo Cury, et al., (2013) [31] o processo de
angiogénese inicia-se com a ativação de células endoteliais, acompanhado por
proteólise da membrana basal, possibilitando a formação de rebento abluminal,
proliferação celular e a formação e crescimento dos novos vasos; diante este
processo, o passo crucial de degradação da matriz extracelular (ECM) é feito por
metaloproteinases de matriz (MMPs). Sendo essas enzimas produzidas por vários
tipos celulares, elencando os fibroblastos, células epiteliais, lisas musculares,
endoteliais e células inflamatórias. Diante do fato, podemos destacar que a atividade
das MMP é necessária para degradação da membrana basal vascular e a
remodelação de ECM, estimulando assim a migração de células endoteliais durante
a angiogénese, seguindo o proposito. Estes mesmos autores confirmam o
processo, a partir um experimento in vivo comparando o tratamento de dois
comprimentos de onda (λ = 660 e 780 nm) em lesões induzidas em ratos, utilizando
doses de 30 e 40 J/cm2 para cada comprimento de onda, e encontraram aumento
43
significativo no número de novos vasos sanguíneos formados e também aumento na
expressão do VEGF quando comparado o grupo não irradiado com os demais
grupos irradiados.
Resultados semelhantes foram encontrados por Chiarotto, et al.,
(2014) [13], quando, ao compararem dois comprimento de onda (λ = 660 e 830 nm)
e doses de 4,93 e 4,48 J/cm2, constataram que ambos os comprimentos de onda
aumentam significativamente a expressão do gene VEGF e a proliferação de novos
vasos sanguíneos e fibroblastos em relação ao controle não irradiado e sem
diferença significante entre os grupos tratados. Portanto, os dados obtidos nessa
pesquisa são também positivos ao apresentar aumento significativo (p< 0,01) na
expressão do gene VEGF no grupo tratado com 6 J/cm2 após 48h de irradiação em
relação ao controle não irradiado.
Para tanto, pode-se determinar que a TLBP é uma técnica relevante
e não invasiva, com grande efeito positivo nos processos inflamatórios, cicatriciais e
analgésicos [32], tornando-se dessa forma alvo de muitos estudiosos para a
definição dos parâmetros ideais de estimulação, uma vez que a magnitude dos
efeitos fotobiomodulatórios do laser dependem do estado fisiológico da célula no
momento da irradiação, confirmando assim os mecanismos moleculares ativados
[24].
CONCLUSÃO
Conclui-se que a Terapia Laser de Baixa Potência apresenta efeitos
significativos na radiação de fibroblastos em cultivo, onde se verifica um aumento da
atividade fibroblástica nas primeiras 24 e 48 horas, aumento da atividade reticular e
melhor organização e distribuição do citoesqueleto no citoplasma. Dessa forma,
pode-se inferir que a dose de 6 J/cm2 no tempo 48h se mostrou mais eficaz quando
analisado o comportamento dos genes IL-6 e VEGF, onde observa-se a expressão
aumentada secreção de VEGF e diminuição da secreção do IL-6, vindo ao encontro
com as primeiras fases do reparo tecidual, confirmando assim o efeito
fotobiomodulador e indicando sua relevância clínica para o tratamento de lesões
teciduais.
44
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação Nacional de
Desenvolvimento do Ensino Superior Particular (FANADESP) e Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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47
5 CONCLUSÃO GERAL
A Terapia Laser de Baixa Potência tem sido amplamente utilizada
ao longo dos anos na prática clínica para acelerar a proliferação celular, diminuir a
dor e atuar nos processos inflamatórios. Os resultados demonstrados neste trabalho
confirmam a condição de interdependência dos diversos parâmetros que regulam o
laser bem como os efeitos biomodulatórios previamente relatados na literatura
através do aumento da atividade fibroblástica, principalmente no tempo 48h e
densidade de energia de 6 J/cm2; aumento da atividade reticular e melhor
organização e distribuição do citoesqueleto no citoplasma. Pode-se inferir também
que a mesma dose e tempo (6 J/cm2 / 48h) se mostraram mais eficazes quando
analisada a expressão dos genes IL-6 e VEGF, vindo ao encontro com as primeiras
fases do reparo tecidual, confirmando assim o efeito fotobiomodulador. Ainda que
estatisticamente a proliferação celular não tenha apresentado resultados
significativos, os achados confirmam a eficiência da Terapia Laser de Baixa Potência
para a prática clínica por ter alcançado, em números absolutos, o maior crescimento
celular levando assim a formação de um tecido mais forte e resistente.
48
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52
ANEXOS
53
ANEXO A - NORMAS DE FORMATAÇÃO DO PERIÓDICO LASERS IN MEDICAL SCIENCE
Diretrizes para Autores
JLMS publica artigos originais, Artigos de Revisão, Relatos de Casos e breves
relatórios, séries de casos ensaio fotográfico, Cartas ao Editor e comentários nos
campos de laser ou luzes em qualquer campo da medicina, além de artigos técnicos
sobre: O desenvolvimento de novas dispositivos de laser e luz não-laser, sistemas
de fornecimento de luz, sensores para monitorar os efeitos de laser, interações
básicas lasers de tecidos e modelagem de interações de tecidos laser.
■ Tipo de artigos
Artigos Originais: Deve conter página título, resumo, palavras-chave, introdução,
materiais e métodos, resultados, discussão, reconhecimento, referências, tabelas e
figuras. O comprimento do texto deve ser limitado a 4500 palavras, excluindo as
referências.
Artigos de Revisão: Deve ser solicitado pelo editor, mas J Med Sci Lasers também
aceitará comentários apresentados. Os autores de artigos de revisão são
convidados a contactar o Gabinete Editorial antes de preparar um artigo de
revisão. Ambos solicitados e artigos de revisão não solicitadas são submetidos a
revisão editorial, como os papéis originais. Este tipo de artigos devem ser limitados a
5000 palavras.
Relatos de Casos e Relatórios Breves: Não deve exceder 2000 palavras. Ambos
devem incluir resumo, palavras-chave, caso apresentação, discussão,
reconhecimento, referências e 1 a 4 números. Documentações necessárias do caso
(s) como relatórios de testes de patologia e laboratório deve ser incluído no pacote
de submissão. Breves relatos não deve ter mais do que uma figura e / ou tabela.
Caso Series: Ele está incluído todos os relatórios sobre o tratamento especial e
novo procedimento em alguns casos limitados, com bons resultados, mas não
confirmada ainda internacionalmente como uma opção global. Deve ser limitados a
2500 palavras.
Ensaio fotográfico: É um artigo do tipo questionário que deverá ser apresentado por
uma imagem de alta qualidade, uma breve história sobre a imagem e uma pergunta
sobre a melhor modalidade de intervenção. Deve ser limitados a 2500 palavras.
Cartas ao Editor: J Med Sci Lasers aceita cartas ao editor. Letters, a menos de 500
palavras, deve discutir os artigos publicados na revista durante os seis meses
anteriores. Cartas serão sujeitos a processamento peer-review e serão editadas
para melhor compreensão.
Comentário: J Med Sci Lasers aceita o comentário (s) dos peritos na forma de
comentário Carta não mais do que 1000 palavras.
■ Apresentação
A submissão de manuscritos para a J Med Sci Laser só é possível através do
Jornal Submissão de trabalhos on-line página. O manuscrito deve ser
acompanhado por uma carta de apresentação para o Editor-in-Chief, incluindo título
54
e autor (s) nome e compromisso de que não foi publicado ou apresentado em outros
lugares. No caso de o manuscrito foi anteriormente submetido a algumas outras
revistas e foi rejeitado, os autores devem fornecer informações completas para uma
análise apropriada. O manuscrito deve ser digitado como um documento do
Microsoft Word em espaço duplo na página A-4 tamanho configurado com margens
claras de ambos os lados. Mesas, bem como ilustrações devem ser digitados e
empatou no final do manuscrito, após as referências. Não submeta tabelas como
fotografias. Todos os documentos de texto devem ser enviados em formato
Microsoft Word como um anexo. As figuras devem ser enviadas em formato JPEG
ou GIF de que irá produzir imagens de alta qualidade na edição online da revista.
A Página do Título: O título completo do manuscrito, o nome de todos os autores
com suas mais altas qualificações, o departamento ou instituição à qual estão
ligados, endereço para correspondência com números de telefone, e-mail e número
de fax.
O Abstract: Todos os artigos originais devem acompanhar um resumo estruturado
de até 350 palavras. Deve ser estruturado como o fundo, Métodos, Resultados e
Conclusão seguidos de 3 a 5 palavras-chave. Palavras-chave ajudará os
indexadores na indexação cruzada do artigo que são publicados com abstrato. Use
termos do Medical Subject Headings lista (MeSH) do Index Medicus. Autores
precisa ter cuidado para que o resumo reflete o conteúdo do artigo com precisão.
Introdução: Este deve resumir o propósito e as razões para o estudo. Ele nem
deve rever o assunto extensivamente nem deve ter dados ou conclusões do estudo.
Métodos: Deve incluir método exato ou observação ou experiência. Se um
aparelho é Instruções para Authors Instructions para Authors VII Jornal de Lasers
em Ciências Médicas Volume 2 Número 4 Autumn 2011used, nome e endereço do
seu fabricante deve ser dada entre parênteses. Por favor, note que para qualquer
artigo que trata com detalhes a laser, tais como tipo de laser, energia, duração do
pulso e do tamanho do ponto deve ser mencionado com precisão. Se o método for
estabelecida, dar referência, mas se o método é novo, dá informação suficiente para
que um outro autor ser capaz de executá-lo. Se um fármaco é utilizado, o seu nome
genérico, a dose e a via de administração deve ser determinado. Para os pacientes,
idade, deve ser dada sexo, com idade média ± desvio padrão. Método estatístico
deve ser mencionado e especificar qualquer software de computador usado.
Resultados: Ele deve ser apresentado sob a forma de texto, tabelas e
ilustrações. Os conteúdos das tabelas não devem ser todos repetidos no texto. Em
vez disso, pode ser dada uma referência para o número da tabela. Artigos longos
podem necessitar de subtítulos em algumas seções (especialmente Resultados e
peças Discussão) para esclarecer seu conteúdo.
Discussão: Este deve enfatizar os resultados atuais e as variações ou
semelhanças com outro trabalho feito no campo por outros trabalhadores. Os
aspectos novos e importantes do estudo e as conclusões que deles derivam. Deve
ser indicado se a hipótese de que trata o artigo é verdadeiro, falso ou nenhuma
conclusão pode ser derivada.
Aviso: Todos os contribuintes que não cumpram os critérios de autoria devem
ser abordados na seção reconhecimento. Ele deve incluir as pessoas que
55
prestaram ajuda técnica, escrita assistência e chefe de departamento que só tem
prestado um apoio geral. Apoio financeiro e material também deve ser reconhecido.
Tabelas: em números limitados deve ser apresentado juntamente com as
lendas colocados acima. Não submeta tabelas como fotografia. Coloque questões
explicativas em notas de rodapé, não no título.
Figuras: Deve ser em número limitado, com obras de arte de alta qualidade e
montado em páginas separadas. As legendas devem ser colocadas abaixo. Os
mesmos dados não devem ser apresentados em tabelas, figuras e texto,
simultaneamente.
Referências: Todos os artigos deverão ser acompanhados de referências
relevantes. O autor deve assegurar referência a estudos publicados localmente,
fazendo boa pesquisa de literatura. Pode não ser possível para o editor e revisores
para verificar a exatidão de todas as citações de referência. Para minimizar tais erros
autor deve conferir as referências com os documentos originais. A referência deve
fornecer as seguintes informações como indicado nos modelos apresentados da
seguinte forma:
1. • Artigo: Tallab TM, Bahamdam KA, Mirdad S, et al. A leishmaniose
cutânea: Calendário para o tratamento intralesional com estibogluconato de
sódio. Int J Dermatol 1996; 35: 594-7.
2. • Capítulo: Bigby M. A hierarquia de provas. In: Williams HC, Bigby M,
Diepgen T, et al. (Eds). Baseada em evidências dermatologia. Oxford: BMJ
Publishing Group; 2003. 44-8.
3. • Livro: Norman IJ, Redfern SJ (Eds). Cuidados de saúde mental para
pessoas idosas. New York: Churchill Livingstone, 1996.
Abreviaturas e símbolos: Usar somente abreviaturas padronizadas. Evite usá-los no
título e resumo. O prazo total para a qual uma abreviatura deve preceder seu
primeiro uso no texto a menos que seja uma unidade padrão de medição.
■ O autor correspondente
O autor correspondente deve ser a pessoa que está disposta e capaz de lidar com
toda a correspondência com o editor da revista, inclusive respondendo aos
comentários dos revisores e revisão da versão final.
■ Diretrizes Éticas
Considerações éticas devem ser abordadas na seção Materiais e Métodos.
1. • Por favor, indique que o consentimento informado foi obtido de todos os
participantes adultos humanos e dos pais ou responsáveis legais de
menores. Inclua o nome do conselho de revisão institucional adequado que
aprovou o projeto.
2. • Indicar no texto que a manutenção e tratamento dos animais experimentais
em conformidade com Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso
humano dos animais de laboratório, ou aqueles de seu instituto ou agência.
56
■ Conflitos de Interesses
Os autores devem reconhecer e declarar as eventuais fontes de financiamento e
conflito de interesses potencial, tais como receber fundos ou taxas por, ou
segurando ações e ações em, uma organização que pode lucrar ou perder através
da publicação de seu papel. Declarando um interesse competindo não vai levar a
rejeição automática do papel, mas nós gostaríamos de ser informados sobre ele.
■ Página Encargos
Não há taxa adicional para a publicação neste Jornal.
■ Processo de Avaliação
Todos os manuscritos são considerados confidenciais. Eles são peer-reviewed por
pelo menos 2 revisores anônimos selecionados pelo Conselho Editorial. O autor
correspondente será notificado o mais rapidamente possível da decisão editor para
aceitar, rejeitar ou exigir modificações. Se o manuscrito é completamente aceitável
de acordo com os critérios estabelecidos nestas instruções, que está prevista para o
próximo número disponível.
Apresentação Preparação Checklist
Como parte do processo de submissão, os autores são obrigados a verificar a
conformidade da submissão com todos os itens a seguir, e as submissões podem
ser devolvidos aos autores que não aderem a estas orientações.
1. A apresentação não foi publicado anteriormente, nem é antes por outra
revista (ou uma explicação foi fornecida Comentários ao Editor).
2. Os arquivos para submissão estão em formato documento do WordPerfect
Microsoft Word, RTF, ou.
3. Os autores devem garantir que, antes de submeter o manuscrito para
publicação, eles têm tido o cuidado de o seguinte: Página de título deve
conter título, nome do autor / co-autores, as suas qualificações, designação e
instituições que são filiados com e endereço para correspondência para o
futuro correspondência, endereço de e-mail e telefone e número de fax.
4. Resumo em formato estruturado de até 350 palavras.
5. Referências mencionado como indicado na Instrução para a seção Autores.
6. Quando disponíveis, foram fornecidos URLs para as referências.
7. O texto está em espaço simples; usa uma fonte de 12 pontos; emprega itálico
ao invés de sublinhar (exceto em endereços URL); e com figuras e tabelas
são colocados dentro do texto nos pontos apropriados, em vez de no final.
8. O texto segue os padrões de estilo e requisitos bibliográficos descritos
em Diretrizes para Autores, que está na seção Sobre a Revista.
9. Certifique-se de posições de tabelas, seus números e legendas das
ilustrações. Não repita as informações em tabelas se estiver coberto no texto.
10. Fotografias / ilustrações junto com suas legendas.
57
11. Divulgação sobre fonte de financiamento e conflito de interesses se algum
além de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética respectivo / Instituição
Review Board.
12. Carta de apresentação.
Aviso de direitos autorais
Autores que publicam nesta revista concordam com os seguintes termos:
uma. Direitos autorais
Após a publicação, cada autor concorda que a "aplicação de laser na Medical
Sciences Research Center" é proprietário dos direitos autorais do material publicado
no "Journal of Lasers em Ciências Médicas". Os usuários são livres para copiar,
distribuir e exibir o trabalho; para fazer qualquer uso não comercial razoável da obra,
sujeito a devida atribuição de autoria e propriedade dos direitos. Os autores podem
usar seu material em apresentações e publicações posteriores que escrevem ou
editar-se, desde que "Journal of Lasers em Ciências Médicas" é notificado por
escrito e é reconhecida como a publicação original.
b. Declaração de Autoria
Esta declaração reconhece que cada autor abaixo-assinado, deu um contributo
substancial para o manuscrito e está disposta a assumir responsabilidade pública
pelo seu conteúdo. Autor (es) atestam que todas as pessoas designadas como
autores qualificadas para a autoria e todos aqueles que se qualificam são listados. O
autor correspondente assume a responsabilidade pela integridade do trabalho como
um todo, desde o início do artigo publicado. "Jornal de Lasers em Ciências Médicas"
segue a mais recente definição fornecida pelos Requisitos Uniformes para
Manuscritos Submetidos a Revistas Biomédicas listados abaixo: "O crédito de
autoria deve ser baseado em:
1. Contribuições substanciais para a concepção e desenho, ou a aquisição de
dados, ou análise e interpretação dos dados;
2. Elaboração do artigo ou revisão crítica do conteúdo intelectual;
3. A aprovação final da versão a ser publicada. Os autores devem atender às
condições 1, 2 e 3. "
Todos os outros que contribuíram para o trabalho, mas não são autores (se houver)
são citadas nos Agradecimentos do manuscrito.
c. Conflito de interesses e apoios financeiros
Autor (es) garante que quaisquer interesses financeiros, directos ou indirectos, que
existem ou podem ser percebidos a existir para contribuintes individuais em relação
a este manuscrito foram divulgados na carta de apresentação. Além disso, fontes de
58
apoio financeiro do projeto são nomeados na carta de apresentação, bem como dos
Agradecimentos.
d. Requisitos éticos
Autor (es) aqui atestar que todos os estudos em humanos e / ou animais realizados
como parte da investigação de que este manuscrito é derivado, estão em
conformidade com os regulamentos de sua instituição (s) e orientações gerais que
regem esse trabalho. Autor (es) garante que este manuscrito contém nenhuma
violação de qualquer direito autoral existente ou outro direito de terceiros ou
qualquer material de uma obsceno, indecente, difamatório, ou não carácter ilegal e
que o melhor de seu conhecimento do manuscrito não viola os direitos de
outros. Publicações anteriores. Autor (es) certifica que nem este manuscrito nem
outro com conteúdo substancialmente similar sob sua autoria foi publicado ou está
sendo considerado para publicação em outro lugar em qualquer idioma (nem local,
nem revistas internacionais), exceto conforme descrito na carta de apresentação. O
autor abaixo-assinado (s) leu o texto acima e as Instruções aos Autores de "Journal
of Lasers em Ciências Médicas" e aqui cumprir as instruções.
Se este manuscrito não é publicado no imprimir ou versões eletrônicas de "Journal
of Lasers em Ciências Médicas" no prazo de 12 meses após a aceitação (ou
conforme acordado), este acordo será automaticamente rescindido.
Declaração de privacidade
Nós tratamos as informações dos nossos leitores como privadas e confidenciais, e
não vamos divulgar os seus dados a terceiros.Os nomes e endereços informados
nesta revista serão usados exclusivamente para os serviços prestados por esta
publicação, não sendo disponibilizados para qualquer outra finalidade ou a qualquer
outra parte.
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ANEXO B - PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP
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