efeito da radiaÇÃo ionizante em chÁs da planta

AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

São Paulo 2013

EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CHÁS DA PLANTA Camellia sinensis IRRADIADOS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE ÁGUA

Gustavo Bernardes Fanaro

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações

Orientadora: Profa. Dra. Anna Lucia Casañas Haasis Villavicencio

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES Autarquia associada à Universidade de São Paulo

São Paulo 2013

EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CHÁS DA PLANTA Camellia sinensis IRRADIADOS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE ÁGUA


Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações

Orientadora: Profa. Dra. Anna Lucia Casañas Haasis Villavicencio

Versão Corrigida Versão Original disponível no IPEN

AGRADECIMENTOS

À Dra. Anna Lucia C. H. Villavicencio pela confiança e orientação, me

preparando desde a iniciação científica para a conclusão deste projeto;

À minha flor, Érica, por estar ao meu lado sempre me incentivando e

me tornando uma pessoa cada vez melhor.

Ao IPEN, especialmente ao Centro de Tecnologia das Radiações,

representado pelo Dr. Wilson Aparecido Parejo Calvo, gerente do CTR e pela Dra.

Margarida Hamada, chefe de divisão de pesquisa e desenvolvimento do CTR,

pelo constante apoio e pré-disposição em ajudar e buscar soluções;

À Dra. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto pela valiosa colaboração,

assim como por disponibilizar seu laboratório e equipamentos, senão seria

impossível realizar esta pesquisa;

À Dra. Deborah Helena Markowicz Bastos pela colaboração e

ensinamentos que veem desde o mestrado e também por disponibilizar seu

laboratório e equipamentos.

Ao Dr. Benedito Corrêa do Instituto de Ciências Biomédicas II da

Universidade de São Paulo pela doação das cepas de fungos.

À Dra. Maria Elisabeth Machado Pinto e Silva da Faculdade de Saúde

Pública da Universidade de São Paulo por disponibilizar seu laboratório para a

realização das análises sensoriais.

Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira, pelo

constante auxílio no processamento por irradiação das amostras;

Ao Marcos e à Claudia pela ajuda nos assuntos administrativos;

Aos colegas do laboratório, pela valorosa ajuda na realização deste

trabalho e pelos vários momentos de descontração: Michel, Renato, Amanda,

Flávio, Patrícia, Márcia e Vanessa;

Aos demais profissionais e bolsistas do Centro de Tecnologia das

Radiações, pelo convívio harmonioso e enriquecedor;

Ao CNPq, pelo auxílio financeiro;

Por todos aqueles que contribuíram tanto nesse trabalho, quanto na

minha formação.

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EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CHÁS DA PLANTA Camellia sinensis

IRRADIADOS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE ÁGUA


RESUMO

O chá é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Os chás provenientes da

planta Camellia sinensis possuem altos teores de antioxidantes, o que significa

que podem ter diversos efeitos benéficos na preservação da saúde. Durante

séculos, a humanidade procura formas de conservar melhor e por mais tempo os

alimentos que consomem. O processo de irradiação de alimentos é uma técnica

amplamente utilizada em todo o mundo e é indicada por diversos órgãos de

saúde e sanitários de diversos países. A radiação interage com o material

causando dois tipos de efeitos, o efeito direto e o efeito indireto. No efeito direto a

radiação interage com a molécula de DNA, causando a quebra dessa molécula,

inativando a célula. No efeito indireto, que representa 70% da interação, a

radiação quebra a molécula de água presente no meio, em um processo chamado

de radiólise, criando uma série de radicais livres que vão interagir com os

componentes celulares, levando a morte da célula. Portanto, o objetivo deste

trabalho foi estudar os efeitos da radiação gama em dois tipos de chás da planta

Camellia sinensis irradiados com diferentes valores de atividade de água. As

amostras de chá verde e chá preto tiveram suas Aw ajustadas a três valores (Aw

alta, Aw média e Aw baixa). As amostras foram irradiadas em fonte de 60Co nas

doses de 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0 kGy. As análises utilizadas foram:

microbiologia por semeadura de superfície, quantificação de fenólicos totais,

análise da atividade antioxidante por ORAC e identificação e quantificação dos

principais antioxidantes presente nessas bebidas. Foi possível constatar que

quanto maior a quantidade de água livre presente no meio, menor foi a dose para

realizar o controle microbiológico. O chá verde mostrou ser um pouco mais

suscetível a irradiação com alta Aw do que o chá preto, pois houve variação da

quantidade de fenólicos e flavonóides, diminuindo a quantidade desses

compostos em algumas doses, mas também houve aumento da quantidade em

outras doses. Entretanto em ambos os chás, essas mudanças podem ser

consideradas insignificantes, uma vez que não houve diferença da atividade

antioxidante em doses de até 10 kGy. A dose de 5,0 kGy foi a dose mínima que

garantiu o controle microbiológico e não causou alterações nos parâmetros

analisados.

IONIZING RADIATION EFFECT ON TEAS OF Camellia sinensis PLANT

IRRADIATED WITH DIFFERENT WATER ACTIVITIES


ABSTRACT

Tea is the most consumed beverage in the world. Teas from Camellia sinensis

plant have high levels of antioxidants, which mean that they may have several

beneficial effects on health preservation. For centuries, mankind looks for ways to

conserve better and for a longer time the food that they eat. The food irradiation

process is a largely technique used worldwide, and is recommended by many

health agencies and authorities of several countries. The radiation interacts with

the material causing two kinds of effects, the direct and the indirect effect. In the

direct effect the radiation interacts with the DNA molecule, breaking it, and then

inactivates the cell. In the indirect effect, which represents 70% of the interaction,

the radiation breaks the water molecule in a process denominated radiolysis,

creating a number of free radicals that will interact with the cellular components,

leading to the cell death. Therefore, the aim of this work is to study the effects of

gamma radiation on two kinds of tea from Camellia sinensis plant irradiated with

different water activities. The green tea and black tea samples had their Aw

adjusted to three values (high Aw, medium Aw, and low Aw). The samples were

irradiated in 60Co source at doses of 0, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5.0, 7.5, and 10.0 kGy.

The analyses used were: microbiology by plate count, total phenolic compounds

quantification, antioxidant activity by ORAC assay, and identification and

quantification of main antioxidants in these beverages. It was noted that the

greater the quantity of free water present in the medium, the lower was the dose to

achieve microbiological control. The green tea showed to be a little more

susceptible to irradiation by high Aw once there was more variation in the amount

of flavonoids and phenolics than the black tea, decreasing the amount of these

compounds in some doses, but increasing the amount in other ones. However in

both teas, these changes can be considered insignificant, since there was no

difference in antioxidant activity at doses up to 10 kGy. The dose of 5.0 kGy was

the minimum dose that secured the microbiological control and had no changes on

the parameters analyzed.

SUMÁRIO

Página

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15

2 OBJETIVO ........................................ ................................................................. 18

3 REVISÃO DA LITERATURA ........................... .................................................. 19

3.1 Atividade de água ........................................................................................... 19

3.2 Camellia sinensis ............................................................................................ 20

3.2.1 Chá verde ..................................................................................................... 25

3.2.2 Chá preto ..................................................................................................... 25

3.3 Antioxidantes ................................................................................................... 26

3.3.1 Absorção dos antioxidantes ......................................................................... 30

3.4 Cuidados na produção .................................................................................... 32

3.5 Irradiação ........................................................................................................ 34

3.6 Radiólise da água ........................................................................................... 39

3.7 Radicais livres ................................................................................................. 43

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................. .................................................... 46

4.1 Amostras ......................................................................................................... 46

4.2 Atividade de água (Aw) ................................................................................... 46

4.3 Irradiação ........................................................................................................ 47

4.4 Microbiologia ................................................................................................... 47

4.4.1 Contaminação artificial ................................................................................. 48

4.5 Extração de compostos solúveis ..................................................................... 48

4.6 Determinação de compostos fenólicos totais .................................................. 48

4.7 Atividade antioxidante ..................................................................................... 49

4.8 Separação, identificação e quantificação de biocompostos ............................ 50

4.9 Análise sensorial ............................................................................................. 51

4.10 Análise estatística ......................................................................................... 52

5 RESULTADOS ...................................... ............................................................ 53

5.1 Aw ................................................................................................................... 53

5.2 Microbiologia ................................................................................................... 53

5.3 Fenólicos totais ............................................................................................... 58

5.4 Atividade antioxidante ..................................................................................... 64

5.5 Identificação e quantificação dos biocompostos ............................................. 67

5.6 Análise sensorial ............................................................................................. 72

6 CONCLUSÃO ....................................... ............................................................. 75

7 TRABALHOS FUTUROS ............................... ................................................... 76

ANEXOS ............................................................................................................... 77

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................ ............................................. 90

LISTA DE FIGURAS

Página

FIGURA 1 - Esquema de obtenção do chá verde e chá preto .............................. 24

FIGURA 2 - Estruturas dos diferentes tipos de catequinas e teaflavinas

encontrados na planta C. sinensis ........................................................................ 28

FIGURA 3 - Estrutura básica de três tipos de flavonóides encontrados na planta

C. sinensis............................................................................................................. 28

FIGURA 4 - Símbolo internacional para alimentos irradiados ............................... 38

FIGURA 5 – Curva de calibração utilizada para quantificação de fenólicos totais

nos chás verde e preto irradiados com diferentes doses e atividade de água,

utilizando ácido gálico como padrão ..................................................................... 58

FIGURA 6 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw baixa ..................... 78

FIGURA 7 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw média .................... 79

FIGURA 8 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw alta ........................ 80

FIGURA 9 - Cromatogramas do chá verde irradiado com diferentes doses de

radiação e Aw ....................................................................................................... 81

FIGURA 10 - Cromatogramas do chá preto irradiado com Aw baixa .................... 82

FIGURA 11 - Cromatogramas do chá preto irradiado com Aw média ................... 83

FIGURA 12 - Cromatogramas do chá preto irradiado com Aw alta ....................... 84

FIGURA 13 - Cromatogramas do chá verde irradiado com diferentes doses de

radiação e Aw ....................................................................................................... 85

FIGURA 14 - Cromatograma e espectros de abosrção U.V. dos padrões: (1)

Epigalocatequina; (2) Epicatequina; (3) Epicatequina galato ................................ 86


Catequina; (2) Epicagalotequina galato; (3) Catequina galato .............................. 87

FIGURA 16 - Cromatograma e espectros de abosrção U.V. do mix de padrões de

Teaflavina.............................................................................................................. 88


Cafeína; (2) Miricetina; (3) Kaempferol ................................................................. 89

LISTA DE TABELAS

Página

TABELA 1- Diferentes valores de atividade de água dos diferentes tipos de chá

utilizados ............................................................................................................... 53

TABELA 2 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da planta de chá verde irradiada

com diferentes doses de radiação e Aw ............................................................... 54

TABELA 3 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da planta de chá preto irradiada

com diferentes doses de radiação e Aw ............................................................... 54

TABELA 4 – Valores da contaminação artificial por fungos, em UFC/g, da planta

de chá verde irradiada com diferentes doses de radiação e Aw ........................... 56

TABELA 5 – Valores da contaminação artificial por fungos, em UFC/g, da planta

de chá preto irradiada com diferentes doses de radiação e Aw ............................ 56

TABELA 6 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG/100 mL de chá verde, de

C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água ......................... 59

TABELA 7 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG/100 mL de chá preto, de

C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água ......................... 61

TABELA 8 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá verde, de C. sinensis

irradiada com diferentes doses e atividades de água ........................................... 65

TABELA 9 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá preto, de C. sinensis

irradiada com diferentes doses e atividades de água ........................................... 66

TABELA 10 - Quantidade de flavonóides e cafeína, em mg/100 mL de chá verde,

identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água

.............................................................................................................................. 68

TABELA 11- Quantidade de teaflavinas totais e cafeína, em mg/100 mL de chá

preto, identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de

água ...................................................................................................................... 70

TABELA 12 – Valores das características globais (odor, aparência e sabor) de chá

verde e preto irradiados com diferentes doses de radiação .................................. 73

LISTA DE ABREVIATURAS

C Catequina

EC Epicatequina

ECG Epicatequina galato

EGC Epigalocatequina

EGCG Epigalocatequina galato

Aw Atividade de água

↓Aw Atividade de água baixa

→Aw Atividade de água média

↑Aw Atividade de água alta

15

1 INTRODUÇÃO

O chá é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Anteriormente,

seu consumo concentrava-se em países da Ásia e Europa, panorama que vem

mudando ao longo dos últimos anos. O crescente interesse pela bebida deve-se a

vários estudos que a mostram como fonte de antioxidantes e a relação inversa

entre seu consumo e o risco de doenças degenerativas como câncer e doenças

do coração (Matsubara & Rodriguez-Amaya, 2006a,b; Saito et al., 2006; Santana-

Rios et al., 2001b).

Segundo uma lenda chinesa, o chá foi descoberto acidentalmente por

um imperador há 4.000 anos, enquanto há relatos que os chineses consomem

essa bebida desde 3.000 A.C. (Ferrara et al., 2001).

Chá é definido como produto constituído de uma ou mais partes de

espécie(s) vegetal(is) inteira(s), fragmentada(s) ou moída(s), podendo ser ou não

fermentado, tostada(s), constantes de Regulamento Técnico de Espécies

Vegetais para o Preparo de Chás (Brasil, 2005).

Nos últimos anos, houve um grande aumento no consumo de chás de

todos os tipos, principalmente os provenientes da planta Camellia sinensis (L) O.

Kuntze, uma planta da família Theaceae, que dependendo do beneficiamento

dado pela indústria, pode dar origem a diversos tipos de chás. Os mais comuns

são o chá branco, verde, oolong e preto (Prado et al., 2005).

O aumento no consumo é devido ao fato de chás de C. sinensis

possuírem altos teores de antioxidantes, o que significa que podem ter efeitos

benéficos tanto na conservação de alimentos, quanto na preservação da saúde

humana quando presentes regularmente na dieta (Becker et al., 2004), podendo

ser considerado um alimento funcional.

16

Entre os antioxidantes presentes na C. sinensis os mais ativos e

frequentemente encontrados são os compostos fenólicos, como as catequinas

(C), epigalocatequina (EGC), epigalocatequina galato (EGCG), epicatequina (EC),

epicatequina galato (ECG); teaflavinas e flavonóides como a miricetina,

quercetina e o kaempferol (Bianchi & Antunes, 1999).

Os antioxidantes promovem esses benefícios, pois atuam por meio de

um ou mais dos seguintes mecanismos: indução de várias enzimas que são

ativadas na via metabólica de drogas, como no metabolismo de inativação de

substâncias carcinogênicas e mutagênicas; sequestro de espécies reativas de

oxigênio e nitrogênio; no sistema de checagem das células quando estas estão

em divisão e no processo de apoptose (Dreosti et al., 1997; Mukhtar & Ahmed,

1999; Tijburg et al., 1997; Yang et al., 2000).

Durante séculos, a humanidade procura formas de conservar melhor e

por mais tempo os alimentos que consomem. A preservação e o armazenamento

desses alimentos a baixa temperatura estão entre as técnicas de preservação

mais antigas que se conhece. Já uma das técnicas que se destaca, é o

tratamento dos alimentos por radiação gama (Chmielewski & Haji-Saeid, 2004;

Farkas, 2006; Masefield, 2004).

Os alimentos são irradiados com as mais diversas finalidades tais

como: desinfecção de agentes causadores de doenças, prolongar o tempo de

vida útil do produto, inibir o brotamento, inativação de organismos que degradam

o alimento, retardo da maturação, entre outros (Diehl, 2002; Villavicencio et al.,

2007). A característica da radiação de alta energia é causar ionização no meio em

que é absorvida, ou seja, é capaz de remover elétrons de seus orbitais, seja em

átomos ou moléculas (ICGFI, 1995).

O processo de irradiação pode inibir a divisão de células vivas, como

microrganismos, promovendo uma alteração em sua estrutura molecular (Brasil,

2001a). As células vegetativas são, geralmente, mais sensíveis à radiação

ionizante do que bolores e leveduras que, por sua vez, são mais resistentes do

que os esporos bacterianos (Diehl, 1995; Monk et al., 1995).

17

A radiação ionizante quando é absorvida por um material biológico,

pode ter ação direta ou indireta sobre o material que recebeu este

processamento. O mecanismo primário no qual a radiação destrói os

microrganismos é dado pela quebra das fitas duplas de DNA causando inativação

dessa célula. Esse processo é dominante quando esporos secos de

microrganismos são irradiados. Já o efeito indireto é responsável por 70% de todo

efeito da radiação e é ocasionado pela interação da radiação com a molécula de

água, o que acaba por gerar os chamados radicais livres. Estes irão interagir com

outros constituintes do material biológico tratado com radiação, de maneira similar

aos que reagem nos alimentos. Esse efeito é importante em células vegetais, que

possuem uma abundante quantidade de água (Hayes et al., 1995; Monk et al.,

1995; Morehouse, 1998).

Esses radicais livres são produzidos, mesmo quando são utilizadas

baixas doses. A interação da água com o oxigênio pode aumentar intensamente a

produção desses radicais, principalmente o peróxido de hidrogênio (H2O2) que é

conhecido por ser um agente oxidante (Diehl, 2002).

Por muito tempo os alimentos irradiados foram estudados, até que se

chegou à conclusão que os alimentos submetidos ao processamento por

radiação, cuja dose utilizada não interferir nas propriedades sensoriais e na

composição do alimento, do ponto de vista toxicológico, são seguros para o

consumo humano (Delincée & Pool-Zobel, 1998; WHO, 1994).

18

2 OBJETIVO

Estudar o efeito da radiação gama em dois tipos de chás da planta

Camellia sinensis irradiados com diferentes valores de atividade de água.

19

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Atividade de água

Sabe-se há muito tempo, com origens que remontam à pré-história,

que existe uma relação, apesar de imperfeita, entre o conteúdo de água de um

alimento e sua perecibilidade. Processos de concentração e desidratação são

realizados como objetivo principal de diminuir o conteúdo de água de um

alimento, aumentando, ao mesmo tempo, sua concentração de soluto e, portanto,

aumentando sua vida de prateleira (Reid & Fennema, 2010).

Em um alimento, pode ser considerado que a água exista sob duas

formas: água combinada e água livre. Água combinada é a molécula de água que

faz parte de ligações químicas e, portanto, não é congelável, não pode ser

utilizada como solvente e possui alta energia de ligação. Água livre é considerada

a água disponível onde ocorrem reações químicas, enzimáticas e crescimento

microbiológico (Coultate, 1996).

A disponibilidade de água em um alimento (água livre) é denominada

como atividade de água (Aw). É definida como a relação entre a pressão do vapor

de água do alimento sobre a pressão do vapor de água pura a mesma

temperatura (Karmas, 1980; Leung, 1981). Esse conceito foi introduzido por Scott

em 1957 (Abdullah et al., 2000).

A força que promove as reações químicas com a água em um alimento

é proporcional ao potencial químico da água existente nele. Pela formulação ou

processamento, a atividade de água em um alimento pode ser variada e

controlada (Bone, 1969). O principal fator na estabilidade de um alimento não é,

portanto, o teor de umidade desse, mas sim a disponibilidade da água para o

crescimento de microrganismos e reações químicas (Coultate, 1996). A escolha

do parâmetro Aw em comparação ao conteúdo de umidade como parâmetro de

20

referência no processamento de alimentos e armazenamento destes é baseado

em um número de efeitos amplamente reconhecidos (Maltini et al., 2003):

• A Aw é determinante para o crescimento dos microrganismos.

• A Aw é bem relacionada com a maioria das reações de

degradação de natureza química, enzimática e física.

• Em alimentos compostos com vários ingredientes, a migração

de umidade obedece a Aw e não a quantidade de umidade.

O valor de Aw influencia diretamente na resistência de microrganismos

a tratamentos de conservação e aqueles que encontrados em alimentos com

baixa Aw são mais resistentes. Além disso, muitos dos microrganismos viáveis

nessas condições são produtores de toxinas e esporos (Laroche et al., 2005).

Os fungos que apresentam ocorrência em alimentos com baixa

atividade de água pertencem ao grupo dos fungos xerofílicos, ou seja, consegue

se desenvolver em Aw inferior a 0,85. A maioria dos fungos xerotolerantes

pertence aos gêneros Aspergillus e Penicillium (Hocking & Pitt, 1987). Essas

espécies de fungo conseguem se desenvolver a uma Aw por volta de 0,7 (Gock et

al., 2003).

O controle de crescimento desse tipo de fungo normalmente é feito

baixando a Aw para valores menores de 0,65 onde a incidência de contaminação

é menor (Abellana et al., 1999), porém os fungos xerotolerantes extremos

conseguem se desenvolver com Aw por volta de 0,61 em determinadas

temperaturas (Gock et al., 2003).

3.2 Camellia sinensis

Desde a antiguidade, as plantas têm sido utilizadas como

medicamentos, na prevenção, no tratamento e na cura de doenças em homens e

21

animais. Os povos primitivos iniciaram a identificação de vegetais que melhor se

adequavam ao uso medicinal, época de colheita, técnicas de extração e modos

de conservação (Bugno et al., 2005).

A revolução industrial e as descobertas de substâncias ativas em

plantas medicinais provocaram a substituição dos medicamentos vegetais por

produtos contendo princípios ativos deles extraídos, ou seus derivados sintéticos,

por meio de modificações estruturais e síntese de novas moléculas. Os produtos

naturais passaram a apresentar um significado místico e esta abordagem era

oposta ao novo modo de vida das sociedades industrializadas que consideravam

a utilização de produtos naturais como uma opção de pessoas incultas e de baixa

renda, não creditando a estes produtos qualquer valor farmacológico (Rates,

2001).

Porém, com o passar do tempo, as plantas continuaram sendo

importantes no desenvolvimento de novas drogas e na década passada, cerca de

30% dos fármacos prescritos foram derivados de plantas e dos 252 fármacos

considerados básicos ou essenciais pela Organização Mundial da Saúde (OMS)

nesse período, 11% foram exclusivamente de origem vegetal (Calixto, 2005). No

Brasil, desde a década de 80, as plantas medicinais e os fitoterápicos são

fornecidos no Sistema Único de Saúde (SUS) (Brasil, 2010).

No início desse século devido à ampla divulgação da relação entre

alimentação e saúde, a preocupação da sociedade ocidental com os alimentos

tem aumentado de forma exponencial (Anjo, 2004). Por esse motivo, tem-se

verificado uma tendência mundial do aumento na demanda por plantas e

preparações de origem vegetal como recurso terapêutico, influenciado por fatores

econômicos, sociais e culturais (Abu-Irmaileh & Afifi, 2003; Bent & Ko, 2004).

Pollonio (2000) define alimentos funcionais como qualquer substância

ou componente de um alimento que proporciona benefícios para a saúde,

inclusive na prevenção de doenças. Esses produtos podem variar de nutrientes

isolados, produtos de biotecnologia, suplementos dietéticos, alimentos

geneticamente construídos até os alimentos processados e derivados de plantas.

22

Para Borges (2001), eles devem exercer um efeito metabólico ou

fisiológico que contribua para a saúde física e para a redução do risco de

desenvolvimento de doenças crônicas. Nesse sentido, devem fazer parte da

alimentação usual e proporcionar efeitos positivos, obtidos com quantidades não

tóxicas e que não se destinem a tratar ou curar doenças, estando seu papel

ligado à redução do risco de contraí-las.

A American Dietetic Association (ADA) (2009) classifica todos os

alimentos como funcionais, pois todos contem nutrientes ou outras substâncias

que fornecem energia, sustentam o crescimento ou mantém e repararam

processos vitais. No entanto, alimentos funcionais possuem potencial efeito

benéfico na saúde quando consumidos como parte de uma dieta variada

fornecendo benefícios adicionais para saúde, reduzindo risco de doença e/ou

promovendo uma saúde ótima.

No Brasil, é definido como alimentos com alegações funcionais e deve

possuir “além de funções nutricionais básicas, quando se tratar de nutriente,

produzir efeitos metabólicos e ou fisiológicos e ou efeitos benéficos à saúde,

devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica”, devendo

desempenhar funções metabólicas ou fisiológicas no crescimento

desenvolvimento, manutenção e em outras funções normais do organismo

humano. A legislação não permite quaisquer alegações que façam referência à

cura ou a prevenção de doenças e para seu uso, deve possuir referências

científicas comprovando seus efeitos e os produtos com essa alegação devem ser

registrados (Brasil, 1999a,b).

Os fitoquímicos são substâncias produzidas naturalmente pelas

plantas, para protegê-las contra vírus, bactérias e fungos. Elas parecem ajudar na

preservação de alguns tipos de doenças e incluem centenas de substâncias como

carotenóides, flavonóides, isoflavonas, compostos fenólicos, licopeno, saponinas,

terpenos, sulfetos alílicos, indol entre outras (Simões et al., 2003).

O chá é uma das bebidas mais populares. As infusões derivadas da

planta Camellia sinensis L. Kuntze são a segunda mais consumida em todo o

mundo, perdendo apenas para a água (Owuor et al., 2008). A C. sinensis pode

23

ser um arbusto ou árvore de até 16 metros de altura (Ferrara et al., 2001)

podendo ser cultivado em diversas regiões que possuem alta umidade,

temperaturas amenas e solos ácidos desde o nível do mar até altas montanhas

(Balentine et al., 1997).

Segundo uma lenda chinesa, o chá foi descoberto acidentalmente por

um imperador há 4.000 anos, enquanto de acordo com outros relatos, os chineses

tem bebido chá desde 3.000 A.C. e mais de 4 milhões de acres são utilizados

para seu cultivo. Essa bebida é consumida em todos os países do mundo e, em

alguns deles, têm “status” cerimonial (Ferrara et al., 2001; Sharangi, 2009).

Pesquisas arqueológicas reportadas por Jelinek em 1978 sugeriram que a infusão

de folhas de diferentes plantas selvagens e de árvores de chá é praticada ha mais

de 500.000 anos (Dufresne & Farnworth, 2001).

As folhas de chá são usadas tanto socialmente, quanto para o uso

medicinal. A medicina tradicional chinesa recomenda, desde 3.000 A.C. o

consumo do chá verde para o alívio de dores de cabeça, dores corporais,

digestão, melhoria do sistema imune, desintoxicação, como energético e para

prolongar a vida (Ferrara et al., 2001).

Segundo Weisburguer (1997), a história do chá como bebida data do

ano de 2.700 A.C. na China. No Japão o consumo de chá foi introduzido por volta

do século VI. Por um longo período, o chá apenas era consumido pelas camadas

mais altas da sociedade, tornando-se popular somente 700 anos depois. O

consumo então se difundiu por toda a Ásia e das colônias para as metrópoles (por

exemplo, da Indonésia para a Holanda e da Índia para o Reino Unido), onde em

meados do século XVII os ingleses divulgaram e popularizaram o chá por todo o

mundo.

A denominação “chá” no mundo refere-se a infusões obtidas apenas da

planta C. sinensis, sendo que para outros tipos de planta usa-se a denominação

“infusão”. Entretanto, o Regulamento Técnico de Espécies Vegetais para o

Preparo de Chás define “chá” como produto constituído de uma ou mais partes de

espécie(s) vegetal(is) inteira(s), fragmentada(s) ou moída(s), podendo ser ou não

fermentado, tostada(s) e considera 54 espécies vegetais como matéria prima para

24

essa bebida, entre as quais estão a banana (Musa romática), acerola (Malpighia

glabra), abacaxi (Bromelia ananas), baunilha (Vanilla romática), marmelo (Pyrus

cydonia ou Cydonia vulgaris), mirtilo (Vaccinium myrtillus); raízes como beterraba

(Beta vulgaris), cenoura (Daucus carota) e sementes como guaraná (Paullinia

cupana), entre outros (Brasil, 2005; Brasil, 2006).

Dependendo do processo utilizado, a C. sinensis pode dar origem a

mais de 300 tipos de chás, apesar de ser geralmente consumido na forma de chá

verde e chá preto (Rusak et al., 2008) (FIG. 1).

FIGURA 1 - Esquema de obtenção do chá verde e chá p reto

FolhasFolhas

VaporVapor

SecagemSecagem

Trituração Trituração

OxidaçãoOxidação

SecagemSecagem

Chá VerdeChá Verde Chá PretoChá Preto

FolhasFolhas

VaporVapor

SecagemSecagem

Trituração Trituração

OxidaçãoOxidação

SecagemSecagem

Chá VerdeChá Verde Chá PretoChá Preto

25

3.2.1 Chá verde

O chá verde é mais consumido no Japão, China e Coréia e para sua

obtenção as folhas extraídas são fumegadas (vapor), enroladas e, então secas

naturalmente (Santana-Rios et al., 2001a). Sua cor é verde devido à inativação da

enzima polifenoloxidase por meio do tratamento das folhas frescas pelo calor

(Koo & Noh, 2007).

Introduzido no Japão pela China, o chá verde rapidamente se tornou

uma das bebidas mais populares. Hoje, o seu “flavor” é utilizado na fabricação,

desde sorvetes até vários tipos de bebidas industrializadas (Yamaguchi &

Shibamoto, 1981).

3.2.2 Chá preto

O chá preto representa 90% do consumo total mundial, sendo a Índia a

maior produtora e exportadora desse tipo de chá (Bhattacharyya et al., 2007). Seu

processamento segue algumas etapas utilizadas para chá verde, mas com a

diferença de que as folhas são esmagadas ou quebradas, sofrendo o processo de

oxidação, antes de serem secas (Santana-Rios et al., 2001a).

Nesse processamento, as catequinas presentes nas folhas sofrem

oxidação, o que é muito importante para o desenvolvimento de cor e sabor da

bebida. A oxidação é enzimática por ação das polifenoloxidases presentes nos

vacúolos das células. Para a enzima ser liberada destes vacúolos, as folhas

precisam ser trituradas e deixadas expostas ao oxigênio do ar. Anteriormente,

acreditava-se que o processo era fermentativo e, por este motivo, é ainda

conhecido como “fermentação” para a produção do chá preto (Matsubara &

Rodriguez-Amaya, 2006a,b).

O tempo de fermentação é fundamental para a qualidade final do chá.

É nesse processo que as folhas mudam da cor verde para a cor marrom e o

aroma de gramínea é transformado em floral (Bhattacharyya et al., 2007).

26

Os benefícios associados ao consumo de chá têm sido atribuídos a

altas concentrações de antioxidantes, como as catequinas e sua capacidade de

sequestrar radicais livres (Ho et al., 2010).

3.3 Antioxidantes

Nos seres humanos existe um balanço homeostático em que

mecanismos bioquímicos especiais, tanto endógenos, quanto exógenos, são

suficientes para neutralizar as Espécies Reativas do Oxigênio (ERO). Entretanto,

em alguns casos, estes mecanismos podem se tornar ineficientes ou a produção

destas espécies instáveis podem se tornar ineficientes por algum motivo (Sen et

al., 1994; Packer, 1997).

Os mecanismos bioquímicos de inativação das ERO podem ser

endógenos, como o sistema enzimático formado pela superóxido-dismutase,

glutationa-peroxidase e catalase, ou exógenos, que são compostos provenientes

exclusivamente da dieta ou de suplementação, denominados antioxidantes

(Amarowiez et al., 2004).

Antioxidante é “qualquer substância que, presente em baixas

concentrações quando comparada a do substrato oxidável, atrasa ou inibe a

oxidação deste substrato de maneira eficaz”, que possuem o potencial de

neutralizar os radicais livres, retardando ou inibindo a sua ação de oxidação. Os

antioxidantes estão em constante atividade nos organismos vivos, necessitando

estar em quantidades suficientes para neutralizar os efeitos tóxicos dos radicais

livres que são constantemente produzidos. Quando esta equivalência não existe,

ocorre o estresse oxidativo (Becker et al., 2004).

Os alimentos de origem vegetal são fontes de diversos compostos que

apresentam atividade antioxidante. Diversos trabalhos têm demonstrado a

importância do consumo de alimentos que contenham substâncias com atividade

antioxidante para a preservação de doenças cardiovasculares, câncer e

desordens cerebrais degenerativas relacionadas ao envelhecimento (Chu et al.,

2000; Liyana-Pathirana & Shahidi, 2006; Luximon-Ramma et al., 2003).

27

Um dos principais grupos de antioxidantes encontrados nas plantas,

em especial nos chás, são os compostos fenólicos, com destaque para a classe

dos flavonóides. A classe dos polifenóis compreende cerca de 5.000 espécies,

que são classificados em flavonóides (por exemplo, catequinas no chá;

isoflavonas em feijão, apigenina, quercetina e luteína em hortaliças e antocianinas

em frutas) e não flavonóides (ácidos clorogênicos em café) (Ota et al., 2010).

Os flavonóides além da atividade antioxidante demonstram outras

atividades biológicas importantes, tais como atividades anti-inflamatória,

antialérgica, antimicrobiana, anticarcinogênica e efeitos imuno-estimulantes

(Nijveldt et al., 2001). A atividade antioxidante dos compostos fenólicos é devida

principalmente às suas propriedades redox, que permitem que eles ajam como

agentes redutores ou doadores de hidrogênio. Além disso, estudos demonstram

que os compostos fenólicos apresentam a capacidade de quelar metais (Atoui et

al., 2005).

Estudos epidemiológicos associam o consumo de C. sinensis com

baixo risco de diversos tipos de câncer (Sato & Myata, 2000; Toit et al., 2001) e

seus polifenóis têm demonstrado ser um efetivo agente quimiopreventivo

(Cabrera et al., 2003; Gosslau & Chen, 2004). Outras propriedades estão

relacionadas ao aumento da atividade insulínica (Anderson & Polansky, 2002),

capacidades antimicrobiana, imuno-estimulatória e anti-inflamatórias (Saito et al.,

2006), proteção contra doenças cardiovasculares (Sano et al., 2004) e cerebrais

(Suzuki et al., 2004), inibição do crescimento de cáries (Sakanaka et al., 1989),

inibição de alergias (Yeo et al., 1995), redução da pressão arterial sistêmica e

prevenção de gota (An et al., 1996).

Entre os antioxidantes mais ativos e frequentemente encontrados na C.

sinensis são os flavanóis: catequinas (C), epigalocatequina (EGC),

epigalocatequina galato (EGCG), epicatequina (EC), epicatequina galato (ECG),

teaflavinas (FIG. 2); e os flavonóis: miricetina, quercetina e kaempferol (FIG. 3)

(Matsubara & Rodriguez-Amaya, 2006a,b).

29

A inibição da oxidação lipídica de seus polifenóis são maiores do que

encontrados em antioxidantes sintéticos, como o BHT (butylated hydroxytoluene),

BHA (butylated hydroxyanisole), TBHQ (tertiary butyl hydroquinone) e

antioxidantes naturais como a vitamina E (Wanasundara & Shahidi, 1998).

Também ha registro de que a epigalocatequina galato (EGCG), um tipo de

catequina encontrado nesse tipo de chá, pode ter efeitos anti-HIV quando

associado na periferia de receptores CD4 (Kawai et al., 2003), e seus

antioxidantes estimulam a termogêneses, promovendo assim a perda de peso

(Dulloo et al., 1999).

Outro benefício do uso dos antioxidantes da C. sinensis, e que

recentemente começou a atenção dos pesquisadores, é seu uso na área

esportiva. Ichinose et al. (2011) verificaram que indivíduos suplementados por 10

semanas, com 572,8 mg de catequinas provenientes do chá verde, associado

com um programa de treinamento de 60 minutos por dia, 3 vezes por semana a

60% do VO2max aumentaram a utilização da gordura corporal durante o exercício.

Arent et al. (2010) relataram que a suplementação de extratos de chá

preto resultou em aumento de desempenho, redução das taxas de dor muscular

de início retardado, diminuição dos marcadores de estresse oxidativo e

recuperação do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal melhorando a resposta a

crises agudas de exercícios de alta intensidade, indicando que o chá preto possui

aplicação em potencial para a recuperação de exercícios de alta intensidade,

especialmente se estiver usando intervalos anaeróbicos repetidos. Portanto, uma

melhor recuperação pode promover o aumento da frequência e da qualidade do

treinamento, levando a um melhor desempenho.

Todos os tipos de C. sinensis, têm propriedades estimulantes, deste

modo, gestantes ou pessoas que sofrem de ansiedade, insônia ou batimentos

cardíacos irregulares devem limitar o seu consumo diário em 1 ou 2 xícaras,

sendo a última consumida, pelo menos, 3 horas antes de dormir (Ferrara et al.,

2001).

30

3.3.1 Absorção dos antioxidantes

A quantidade de compostos bioativos presentes nos alimentos não

reflete a quantidade absorvida e metabolizada pelo organismo. O entendimento

dos fatores que liberam o composto da matriz do alimento, a extensão da sua

absorção e seu papel no organismo é importante para determinar o mecanismo

de ação e sua influência na promoção e manutenção da saúde humana (Horst &

Lajolo, 2009). Para os polifenóis, somente pelo aumento da capacidade

antioxidante do plasma após o consumo de alimentos ricos nesses compostos é

possível evidenciar a absorção através da barreira intestinal (Scalbert et al.,

2002).

Segundo Ferruzzi (2010), a biodisponibilidade dos compostos fenólicos

pode ser definida como a proporção de constituintes fenólicos e seus metabólitos

(incluindo a fase intestinal e hepática) secretados dentro da circulação disponíveis

para subsequente captação pelo tecido e metabolismo. Já a bioacessibilidade

pode ser definida como a fração de fenólicos transferidos da matriz da bebida

para fase contínua e estar disponível para a captação pela mucosa intestinal.

Para a absorção de compostos fenólicos é necessário que ocorra a:

• Liberação do composto específico da matriz da bebida;

• Solubilização no lúmen intestinal;

• Estabilidade do composto nas condições digestivas;

• Captação pelas células absortivas no intestino delgado;

• Potencial para o metabolismo intracelular;

• Secreção para a corrente sanguínea onde os compostos

fenólicos são distribuídos para os tecidos.

31

O metabolismo dos polifenóis começa no lúmen do intestino delgado e

modificações após a absorção também ocorrem no fígado e em outros órgãos.

Além da absorção pelo intestino delgado, compostos fenólicos podem alcançar o

intestino grosso, sendo metabolizados pela microbiota para fenólicos simples,

ácidos orgânicos e muitos outros produtos que são subsequentemente absorvidos

e distribuídos para os tecidos (Gonthier et al., 2003; Lee et al., 2006; Hsu et al.,

2008).

Os compostos da classe dos flavanóides e dos flavonóides são

submetidos a uma extensa biotransformação incluindo a metilação, sulfatação,

glicuronadação (o ácido glicurônico é ligado via ligação glicosídica com a

substância e o resultante glicuronídeo possui uma maior solubilidade na água

comparada à substância original) e quebra de seus anéis no enterócito, enquanto

a metilação e outros passos também podem acontecer nas células hepáticas (Del

Rio et al., 2010; Khan & Mukhtar, 2007). A recuperação na urina após a ingestão

de quantidades dadas de um polifenol em particular permite a comparação da

biodisponibilidade dos diferentes tipos de moléculas presentes nas dietas,

variando de um composto fenólico para outro (Scalbert et al., 2002).

De um modo geral, nenhum traço de flavonóides pode ser encontrado

no plasma e na urina de humanos. As únicas exceções parecem ser da (-)-EGCG

e traços de (-)-ECG que estão presentes no sistema circulatório sem serem

metabolizados (Stalmach et al., 2009). A presença desses compostos está em

maior concentração em tecidos danificados (dentro de células espumosas

derivados dos macrófagos) do que em tecidos saudáveis por motivos

desconhecidos (Del Rio et al., 2010).

A estrutura dos polifenóis tem um impacto importante na absorção

intestinal. Os parâmetros mais importantes são o peso molecular, a glicosilação e

esterificação. O alto peso molecular das teaflavinas dos chás (M=568) deve

explicar sua baixa recuperação na urina (Déprez, et al., 2001; Donovan et al.,

2002), por exemplo.

A absorção intestinal também é influenciada pela esterificação com

ácido gálico para catequinas. A recuperação de catequinas galato na urina

32

humana após consumo de chá preto foi cerca de 10 vezes menor que a das

catequinas sem galato (Warden et al., 2001).

Muitos dos polifenóis na dieta são rapidamente eliminados na urina e

pela bile após a ingestão. Em humanos, o pico pós-prandial é observado 1-2h

após a ingestão de flavonóides, mas pode ser maior para outros tipos de

polifenóis, pois devem ser antes metabolizados pelas bactérias do intestino para

então serem absorvidas (Scalbert & Williamson, 2000).

Os polifenóis são amplamente metabolizados, tanto nos tecidos, uma

vez que são absorvidos através da barreira intestinal; quanto pela microbiota do

cólon, para a fração não absorvida e a fração re-excretada na bile. Todos os

polifenóis são conjugados para formar Ο-glucuronidos, ésteres de sulfato e O-

metil éter. Esta conjugação ocorre pela primeira vez na barreira intestinal, como

tem sido demonstrado em experimentos nos quais a quercetina foi perfundida no

intestino de ratos vivos (Crespy et al., 1999).

Glucuronidos de quercetina são formados na mucosa intestinal e

secretados tanto para o lúmen intestinal quanto para o lado seroso. Em ratos, o

maior nível de atividade transferase glucuronil foi observado no intestino (Piskula

& Terao, 1998). Estes conjugados, em seguida, chegam ao fígado, onde são

posteriormente metabolizados. Por exemplo, a catequina é extensivamente

metilada no fígado. Quando foi perfundido no intestino de ratos, apenas metade

da catequina presente no plasma mesentérico antes de atingir o fígado foi a forma

metilada (O-metilada), enquanto que 99% da catequina excretada na bile foram

as O-metilados (Donovan et al., 2001).

3.4 Cuidados na produção

A maior industrialização e comercialização de fitoterápicos tornaram

seu uso um problema de Saúde Pública. O aumento da demanda, associado à

falta de fiscalização efetiva que garanta desde a exploração racional dos recursos

naturais empregados como matéria-prima, até a liberação do produto acabado,

contribuem para a disponibilidade e acesso a produtos muitas vezes sem

condições adequadas ao uso, sem garantia da qualidade, segurança e eficiência,

33

fundamentais para a recuperação ou preservação da saúde do consumidor (De

Smet, 2004; Giveon et al., 2004). Além desses fatores, a legislação que instituía

valores aceitáveis para a contaminação por fungos em chás foi revogada e não foi

substituída por nenhuma outra norma.

Na etapa final do processamento das folhas de chá, quando a secagem

é mecânica, com temperatura de aproximadamente 80 °C, pode até reduzir a

carga microbiana, porém não é suficiente pra eliminar endosporos, esporos e

alguns fungos patogênicos. As etapas seguintes à secagem, como na estocagem,

manuseio e embalagem representam um risco para que haja uma

recontaminação. Somando-se a isso, a recomendação pelo uso de água não

fervente, ao contrário da água em ebulição, para o preparo do chá, com o objetivo

de manter o “flavor” o mais intacto possível, faz com que a quantidade de

microrganismos destruídos seja menor (Mishra et al., 2006).

Fatores como poluição na água de irrigação, atmosfera, solo,

condições da coleta, manipulação, secagem e estocagem são importantes a

serem considerados no controle de produtos naturais, por permitirem altos níveis

de contaminação microbiana, por vezes patogênica (Mandeel, 2005). A presença

de fungos potencialmente toxigênicos podem ser encontrados nesses produtos,

indicando um grande potencial para a presença de micotoxinas que podem

causar efeitos agudos e crônicos nos diferentes órgãos e sistemas do corpo

humano (Aquino et al., 2010).

Efuntoye (1999) avaliou a relação entre tempo de estocagem das

plantas, por um período de até três meses e níveis toxigênicos, demonstrando

que, quanto maior o tempo de armazenamento, maior era a produção de toxinas.

Após 90 dias, os níveis toxigênicos apresentaram elevação máxima. Bugno et al.,

(2005) avaliaram 91 amostras de plantas com propriedades fitoterápicas,

compostas por 65 espécies vegetais distintas e considerando as especificações

farmacopéicas para a enumeração de populações microbianas presentes e para

pesquisa de microrganismos específicos, verificaram que 92,3% das drogas

vegetais analisadas estavam em desacordo com um ou mais parâmetros

microbiológicos.

34

Fungos já foram encontrados em todas as etapas na produção de

chás. Estudos realizados em chá preto verificaram a presença de Aspergillus,

Penicillium, Paecilomyces, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Fusarium, Rhizopus,

Absidia e Trichoderma. As espécies como Aspergillus, Penicillium, Fusarium e

Alternaria são conhecidas como toxigênicas por produzirem micotoxinas

(Monbaliu et al., 2010).

Rizzo et al. (2004) observaram que 79% de um total de 152 amostras

de plantas medicinais comuns na Argentina estavam contaminadas com

Aspergillus ssp. e em 40 amostras havia a presença de micotoxinas. Hell et al.

(2009) também verificaram a presença dessa espécie de fungo em 72% das suas

amostras que compreendiam de diversos vegetais desidratados vendidos em

mercados de três países da África Ocidental.

3.5 Irradiação

O início da história da irradiação de alimentos surgiu com a própria

história da radiação. Com o descobrimento dos raios-X por Röentgen (Dezembro

de 1895) e a identificação da radioatividade por Becquerel (Fevereiro/Maio 1896),

várias pesquisas surgiram sobre os efeitos biológicos da radiação em organismos

vivos. Rapidamente inventores descobriram aplicações práticas para a radiação.

A principal vantagem na aplicação da radiação ionizante em alimentos observada

era a total ausência do emprego de compostos químicos (Morrissey & Herring,

2002).

Com o desenvolvimento tecnológico durante a segunda guerra

mundial, foram produzidos equipamentos que poderiam ser adaptados e

aumentar a aplicação do processamento por radiação e estudos realizados pelos

Estados Unidos estimularam a realização de experimentos por outros países. Um

dos primeiros usos comerciais da irradiação de alimentos na Europa ocorreu na

Alemanha em 1957, quando produtores de condimentos começaram a melhorar

qualidade higiênica de seus produtos (Diehl, 2002).

No Brasil, a irradiação de alimentos começou a se intensificar no final

da década de 60. Em 1974, o Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares

35

instalou no Centro de Tecnologia das Radiações um acelerador de elétrons de 1,5

MeV para aplicações industriais e em 1975 criou-se um convênio com a

Universidade de São Paulo, para implantação de cursos de pós-graduação no

instituto (IPEN, 2004).

As décadas de 70 e 80 foram mundialmente dedicadas às pesquisas

toxicológicas para comprovar a inocuidade dos alimentos irradiados, uma vez que

esse era o aspecto mais questionado. Os projetos foram desenvolvidos em 24

países sob a coordenação de um Comitê formado pela “International Atomic

Energy Agency” (IAEA/Viena), “Food Agriculture Organization” (FAO/Roma) e

“Organization for Economic Cooperation” (OEC/Paris) e teve como órgão

consultivo a “World Health Organization” (WHO). Após intensivos estudos, que

envolveram, além de testes químicos, experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados, o Comitê concluiu, em novembro de 1980, “que

a exposição de qualquer produto alimentício a doses de até 10,0 kGy não

apresenta perigo toxicológico; portanto, testes toxicológicos com alimentos assim

tratados não são mais necessários” (WHO, 1999).

O termo radiação se refere aos processos físicos de emissão e

propagação de energia (CNEN, 2009a), enquanto o termo irradiação é utilizado

para a aplicação desta energia a um determinado material, atingindo objetivos

pré-estabelecidos (CNEN, 2009b). A principal aplicação da radiação de alta

energia é que ela causa ionização no meio que é absorvida, ou seja, é capaz de

remover elétrons de suas órbitas em átomos ou moléculas. Por essa razão é

denominada radiação ionizante (Molins, 2001).

A quantidade de radiação ionizante absorvida é chamada de dose de

radiação absorvida e a unidade utilizada é o Gray (Gy), sendo que 1 Gy é igual à

energia de 1 Joule absorvido por 1 kg de material (Olson, 1998).

De acordo com o Codex General Standard for Irradiated Foods (2003),

para irradiação de alimentos só são permitidos os raios gama, provenientes de

radionuclídeos de 60Co, com energia podendo chegar até 1,33 MeV e 137Cs, com

energia de 0,662 MeV; raios X, com energia máxima de 5 MeV e feixes de

elétrons, que são gerados por aceleradores que podem atingir energia máxima de

36

10MeV. Esses tipos de radiação são permitidos, porque além de produzirem os

efeitos desejados nos alimentos, não induzem a radioatividade nestes ou em

materiais que os acompanham, como por exemplo, as embalagens (Farkas, 2006;

Farkas & Mohácsi-Farkas, 2011).

Estas fontes de radiação não induzem radioatividade mensurável no

alimento porque a energia limiar para a reação (γ,n) está bem acima de 10 MeV

para todos os isótopos presentes no alimento (Findlay et al., 1993; ICGFI, 1995;

Wakeford et al., 1991; Woods & Pikaev, 1994). O processamento de alimentos

por radiação requer uma exposição controlada e cuidadosa frente à radiação

ionizante de energia conhecida. A exposição deve ser adequada para produzir o

resultado desejado (Farkas, 2001).

A escolha da fonte para a irradiação vai depender do material a ser

irradiado e do objetivo a ser atingido. O uso da radiação proveniente de 60Co

possui grande penetrabilidade e são utilizadas na irradiação de produtos de

grande espessura. Os aceleradores de elétrons possuem a penetração de apenas

alguns milímetros e são usados para a irradiação superficial de alimentos ou para

produtos a granel, de fina espessura (Fanaro et al., 2007a;b). Irradiadores com

fontes de 60Co são os mais utilizados, atualmente, para o processamento de

alimentos (IAEA, 2001).

O tratamento com radiações ionizantes pode ser usado de forma

independente ou combinado às técnicas já existentes, tais como secagem,

fermentação, tratamento químico, tratamento pelo calor, conservação a baixas

temperaturas ou em atmosferas modificadas (Rossi & Jesus, 1994). Uma grande

vantagem do processo de irradiação é que ele permite a diminuição do uso de

produtos químicos, usados como conservantes e antibióticos, em alimentos

(IAEA, 2001).

Essa técnica é recomendada por diversas autoridades de diversos

países, como o “Food and Drug Administration” (FDA), a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA), o Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA) e o “Food and Agriculture Organization” (FAO) e o “World

Health Organization”. Cada país possui uma legislação específica sobre quais

37

alimentos podem ser irradiados e quais são as doses máximas permitidas para

cada um deles.

Nos EUA o processamento de carne suína, bovina e de frango e ovos

com casca podem ser irradiados com doses de até 4,5 kGy e especiarias

desidratadas com doses de até 30,0 kGy (Morehouse, 2002). Na Europa, o

conselho de União Europeia aprova o uso da radiação ionizante apenas para

ervas aromáticas secas, especiarias e temperos vegetais com doses de até 10,0

kGy (EU, 1999), entretanto alguns países membros da União Europeia (Bélgica,

República Checa, França, Itália, Holanda, Polônia e o Reino Unido) possuem

permissões para irradiar, além dos já permitidos, 29 tipos de alimentos ou

ingredientes, entre eles carnes, clara de ovos, frutas, vegetais, cereais e frutos do

mar com doses máximas estabelecidas para cada alimento (EU, 2009).

A legislação brasileira aprova o uso da radiação ionizante por meio da

RDC n° 21/2001, desde que seu uso seja para a finalidade sanitária,

fitossanitárias e/ou tecnológicas e a dose mínima absorvida seja suficiente para

alcançar a finalidade pretendida e a dose máxima seja inferior a dose que

comprometa as propriedades funcionais ou quaisquer atributos do alimento. Uma

das principais observações, e que deve ser sempre ressaltada, é que o processo

de radiação, bem como qualquer outro tratamento aplicado nos alimentos não

deve substituir as boas práticas de fabricação e manuseio (Brasil, 2001a).

A resolução ainda descreve que a embalagem deve ter condições

higiênicas aceitáveis, ser apropriada para o procedimento de irradiação, estar de

acordo com a legislação vigente e aprovada pela autoridade sanitária competente.

Na rotulagem dos alimentos irradiados, além dos dizeres exigidos para os

alimentos em geral e específico do alimento, deve constar no painel principal:

"ALIMENTO TRATADO POR PROCESSO DE IRRADIAÇÃO", com as letras de

tamanho não inferior a um terço (1/3) do da letra de maior tamanho nos dizeres

de rotulagem. Quando um produto irradiado é utilizado como ingrediente em outro

alimento, deve declarar essa circunstância na lista de ingredientes, entre

parênteses, após o nome do mesmo.

38

Existe ainda, um símbolo internacional, a radura, utilizado para

identificar os alimentos que sofreram tratamento por radiação ionizante (FIG. 4).

FIGURA 4 - Símbolo internacional para alimentos irr adiados

Os dados mais recentes sobre a quantidade de alimentos irradiados foi

realizado por Kume et al. (2009) em 2005. A América (Estados Unidos, Canadá e

Brasil) é o segundo continente que mais irradia alimentos no mundo (166.400

toneladas), perdendo apenas para o continente asiático (183.309 toneladas),

entretanto é o que mais utiliza a radiação ionizante em especiarias, frutas, grãos e

hortaliças. O Brasil é o quarto maior irradiador de alimentos (23.000 toneladas),

atrás da China (146.000 toneladas), Estados Unidos (92.000 toneladas) e Ucrânia

(70.000 toneladas). A estimativa foi que 404.804 toneladas de alimentos foram

irradiados no mundo em 2005.

A radiação pode causar uma variedade de efeitos físicos e bioquímicos

nos microrganismos. Uma vez absorvida por um material biológico, a radiação

ionizante pode ter ação direta ou indireta sobre o material que recebeu este

processamento (Hansen & Shaffer, 2001).

Quando a radiação age de forma direta no material biológico, ocorre a

excitação ou ionização de moléculas de ácido nucléico e a partir daí serão

conduzidas mudanças biológicas que podem levar a morte celular (Alcarde et al.,

2003). Considerando que a sensibilidade à radiação de macromoléculas é

aproximadamente proporcional a sua massa molar, Pollard (1966) estimou que

uma dose de 100 Gy danificaria 2,8% do DNA de uma célula bacteriana,

39

enquanto que a mesma dose danificaria 0,14% das enzimas e apenas 0,005%

dos aminoácidos.

O dano correspondente a 2,8% do DNA pode ser letal para uma ampla

fração de organismos vivos, principalmente para organismos complexos. Os

efeitos da quebra do DNA em alimentos são mostrados por diversos autores

(Araújo et al., 2004; Fanaro et al., 2007a,b; Villavicencio et al., 2000). Em

contraste, o dano de 0,14% causado às moléculas das enzimas seria difícil de ser

detectado, mesmo com métodos analíticos sofisticados e uma mudança de

0,005% nos aminoácidos em sistemas biológicos não pode ser detectada. Essas

considerações explicam o porquê uma dada dose pode ter um efeito letal nos

microrganismos em uma amostra de alimento irradiado sem causar muita

alteração na composição química (Aquino, 2003).

O efeito indireto é ocasionado pela interação da radiação com a

molécula de água (radiólise), gerando os chamados radicais livres. Estes irão

interagir com outros constituintes do material biológico tratado com radiação,

podendo trazer sérias consequências (Tritsch, 2000).

3.6 Radiólise da água

Assim como os estudos da irradiação de alimentos, os estudos sobre a

radiólise da água também começaram imediatamente após as descobertas de

Röentgen e Becquerel. Em 1902, Giesel começou os primeiros estudos com a

irradiação de água pura. Entretanto os estudos mais aprofundados só foram

realizados em 1944 por Weiss que assumiu que íons formados inicialmente na

água são transformados em radical (Samuel & Magee, 1953).

A água é o maior constituinte das células. A absorção de radiações

energéticas pela água resulta tanto na excitação, quanto ionização levando a

produção de radicais livres que podem atacar outras moléculas presentes no meio

(Azzam et al., 2012). Sabe-se que boa parte dos danos causados a uma célula

pela radiação ionizante ocorre pela ação indireta da radiação. Isto se deve ao fato

de que a maioria das células vivas apresenta em média 80% de água em sua

composição. Mesmo produtos aparentemente secos contêm água, como farinha

40

de trigo (13%), vegetais desidratados (10%), nozes (5%) entre outros (WHO,

1994).

A radiação ionizante causa a ionização e excitação da água, levando a

formação de produtos radiolíticos como o elétron hidratado ou aquoso (e-aq), água

ionizada (H2O+), radical hidroperoxila (HO2

•), radical hidroxila (•OH), radical

hidrogênio (H•) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em um curto período de tempo

(cerca de 10-8s) em sistemas biológicos. Devido suas naturezas instáveis, com

exceção do H2O2, eles desaparecem em menos de 10-3 s (Breen & Murphy, 1995;

Riley, 1994).

Resumidamente, os eventos que acompanham a absorção de fótons

de alta energia ou a passagem rápida de partículas carregadas podem ser

divididos em quatro, onde suas fases são demarcadas pelo o tempo em que

ocorrem (Azzam et al., 2012):

• A primeira fase (10-16 s), ou estágio físico, a deposição de

energia é causada pela radiação incidente e elétrons

secundários são gerados, criando espécies extremamente

instáveis.

• Na segunda fase (10-15 s a 10-12 s), ou estágio físico-químico,

essas espécies geradas passam por uma rápida reorganização.

Esse processo produz produtos radicais e moleculares da

radiólise que são distribuídos em estrutura não homogenia.

Elétrons secundários desaceleram para energias de sub-

excitação e após a termalização, os elétrons tornam-se

hidratados.

• Durante a terceira fase (10-12 s a 10-6 s) as várias espécies

químicas reativas são formadas (H•, •OH, H2, H2O2, H+, OH−,

O2...), difundem e reagem com outras espécies ou com o

ambiente, até todas as reações estejam completas.

41

• Em sistemas fisiológicos, a quarta fase segue o estágio biológico

em que as células respondem ao dano resultante dos produtos

formados nos estágios anteriores. Nessa fase a resposta

biológica pela exposição à radiação é induzida.

Uma parte significante dos danos iniciais causadas nas células pela

irradiação é através dos danos no DNA, onde os produtos da radiólise da água

(principalmente o •OH) possuem um papel importante (Wallace, 1998). Além

disso, alguns produtos da radiólise da água, como o •OH e o HO2•, são

considerados Espécies Reativas do Oxigênio (ERO).

Já foi reportado que em células, a irradiação não somente leva a

geração de ERO derivada da radiólise da água. Esse processamento também

aumenta o nível intracelular de ERO, incluindo o •OH horas depois a exposição à

radiação ionizante. Essas ERO geradas em processos secundários possuem

papéis importantes dentro das células, como a sinalização apoptótica e

instabilidade do DNA (Yamamori et al., 2012).

A radiólise da água resulta em numerosos produtos, onde o radical OH

é o mais reativo. Esse radical retira átomos de hidrogênio do açúcar e das bases

ou adiciona esses átomos nas bases, conduzindo assim, a lesões no DNA. Essas

lesões podem ser através da quebra da fita simples ou da dupla fita, modificações

na desoxirribose e nas bases nitrogenadas, gerando reticulações intracadeia,

entre fitas e “crosslinks” entre DNA-proteína (Spotheim-Maurizot et al., 1996).

Os íons radicais e produtos da radiólise da água já foram identificados

em uma série de trabalhos entre as décadas de 1960 e 1980 e a partir desses

trabalhos, Ershov e Gordeev (2008) descreveram 32 reações químicas entre as

espécies formadas pela radiólise.

As espécies reativas que mais são formadas após a quebra da

molécula da água são o radical hidroxila e o elétron aquoso e ambos são

altamente reativos. O rendimento das espécies reativas é expresso em valor G,

onde G é definido como a transformação química induzida pela energia cedida

para o meio pela radiação (Ferradini & Jay-Gerin, 1999):

42

� =�ú��é��í��

100��

Onde os valores de G para os principais produtos da radiólise da água

estão no Quadro1 (Ferradini & Jay-Gerin, 1999):

Quadro 1 – Rendimento das principais espécies reati vas formadas pela radiólise da água

Espécie Rendimento (G)

•OH 2,6 - 2,7

e-aq 2,7 - 2,87

H2O2 0,61 - 0,7

H• 0,55 - 0,61

H2 0,43 - 0,45

A capacidade de um antioxidante em estabilizar um radical livre, ao que

parece, não depende somente do número duplas ligações ou anéis aromáticos

em sua composição. O tipo de radical livre e como os átomos estão dispostos na

molécula antioxidante irão influenciar na capacidade de neutralização. É sabido

que a presença de dupla ligação entre C2 e C3, do gurpo C3-OH e glicosilação

são estruturas-chave que influenciam a capacidade antioxidante de compostos

fenólicos, porém na presença do e-aq, antioxidantes como a quercetina/rutina que

possuem grupos ceto no C4 são mais efetivos (Cai et al., 1999).

43

3.7 Radicais livres

Os estudos sobre radicais iniciaram no fim do século XIX com Fenton

em 1894, passando por Gomberg em 1900 e Haber e Weiss em 1934 e pode ser

definido como uma espécie que perdeu ou ganhou um elétron, ficando com um

elétron desemparelhado (Buechter, 1988; Halliwell & Gutteridge, 1985).

Os radicais livres contém um número ímpar de elétrons. Esse elétron

sozinho confere ao radical livre certo grau de instabilidade em termo de energia e

cinética. Energeticamente, para alcançar a estabilidade, os radicais livres

eliminam esse elétron da sua composição eletrônica. Para isso, o radical pode

perder um elétron, que nesse caso é uma espécie reduzida ou ganhar um elétron,

que nesse caso é um radical oxidado e, dependendo se o composto apresentar o

mesmo radical, ele pode ser tanto oxidado quanto reduzido. Além disso, um

radical pode frequentemente se auto-oxidar, através da reação chamada

dismutação, onde nessa reação, um dos radicais é oxidado enquanto o outro é

reduzido (Valko et al., 2007).

Cineticamente, o fato de o radical livre ter um elétron desemparelhado

na sua última camada favorece consideravelmente seus pareamentos com outras

moléculas durante as colisões biomoleculares. A taxa da reação química,

entretanto, é determinada pela eficiência das colisões, e com o aumento desse

parâmetro no caso dos radicais, as reações são frequentemente mais rápidas

(Pierrefiche & Laborit, 1995).

A presença de um elétron desemparelhado é um fator de instabilidade

que determina as propriedades dos radicais livres. Quando o radical reage com a

molécula vizinha, ela é transformada em um radical livre, que ira procurar um

elétron para se estabilizar. Esse processo vai se perpetuando como uma reação

em cadeia (Pierrefiche & Laborit, 1995).

As ERO são mediadores muito importantes dos danos e da morte

celular. Essas espécies químicas altamente reativas não são importantes

somente no processo do envelhecimento, mas também nos processos que

envolvem diversas doenças como aterosclerose, dano de reperfusão e câncer,

além de serem fundamentais nos danos celulares induzidos por processos

44

inflamatórios crônicos e diversas desordens no sistema nervoso central (Cross,

1987; Halliwell & Gutteridge, 1985; Zwart et al., 1999). Estes radicais

frequentemente atacam as moléculas no organismo, retirando uma molécula de

hidrogênio e quebrando insaturações (Zwart et al., 1999).

A abstração de um ou dois elétrons do oxigênio produz radicais

superóxido e peróxido, respectivamente, amplamente encontrados nos complexo I

e II da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria e pode ser produzido na

taxa de 1 a 4% de cada molécula de oxigênio usada (Brand et al., 2004). Essa

produção de radicais é particularmente alta quando o terminal de aceitação de

elétrons é limitado (no caso de hipóxia, anóxia ou esquemia), ou quando há

substrato em excesso (Clancy & Birdsall, 2012).

Mudanças atribuídas a reações de radicais livres incluem alterações na

vida útil de moléculas de longa vida, como na transformação do colágeno em N´-

(carboximetil)lisina; danos oxidativos no DNA, onde danos no DNA mitocondrial

são cerca de 16 vezes maior do que no DNA molecular; e na glicação, uma

modificação nas proteínas, resultante de reações entre a glicose e grupos de

aminoácidos das proteínas (Harman, 1992).

A peroxidação lipídica é um fenômeno muito importante, uma vez que

todas as células possuem uma membrana fosfolipídica, e os locais onde os

radicais são geralmente e mais especificamente as espécies reativas do oxigênio

são formadas, tornando a membrana mais suscetível aos ataques dos radicais

livres. Especialmente os ácidos graxos poli-insaturados que são ainda mais

suscetíveis aos radicais livres (Zwart et al., 1999).

A peroxidação pode resultar na geração de radicais lipídicos (L•),

radicais alcoxil (LO•), peróxidos (LOO•) e hidroperóxidos (LOOH•). Uma vez que o

radical lipídico é formado, ele pode propagar uma cadeia de reações que pode

resultar no dano na membrana celular e, além disso, pode interagir com

proteínas, resultando na formação de radicais proteicos e, portanto, afetar o

funcionamento da célula (Burton, 1988).

As proteínas constituem uma grande parte de toda a massa orgânica

oxidável nos seres vivos e diversos trabalhos demonstraram que as proteínas são

45

alvos para as ERO. Altos níveis de proteínas com grupos carbonil (como

aminoácidos ácidos) e aminoácidos com grupo amida são utilizados como

marcadores iniciais de danos em sistemas biológicos submetidos ao estresse

oxidativo, mesmo naqueles que se verifica a presença de antioxidantes

endógenos. Elevados níveis de oxidação proteica foi medido em tecidos humanos

envelhecidos (Domazou et al., 2009).

46

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostras

Amostras de chá verde foram doadas pelo Herbarium Laboratório

Botânico Ltda. (Colombo/PR) e as amostras de chá preto foram doadas pela Leão

Junior S/A (Fernandes Pinheiro/PR). Todas as amostras foram processadas em

triplicata.

4.2 Atividade de água (Aw)

Foram determinas três Aw para esse trabalho. Uma Aw alta (↑Aw), uma

Aw média (→Aw) e uma Aw baixa (↓Aw). Para a Aw alta, o valor deveria ser maior

que 0,85; que é o valor onde normalmente há crescimento de diversas espécies

de fungos. Para a Aw baixa, o valor deveria estar abaixo de 0,25; que é o valor

onde não há praticamente água livre nos alimentos.

As amostras foram pesadas (o peso variou dependendo do

experimento) e então foram submetidas aos processos de aumento e diminuição

da Aw. As amostras foram pesadas antes para que a quantidade de água ganha

ou perdida não interferisse no peso ao realizar a pesquisa. Os procedimentos

para aumento e diminuição da Aw seguiram-se as seguintes etapas realizadas no

laboratório:

• Para aumentar a Aw, as amostras foram colocadas em placas

de petri sem tampa em um dessecador com água destilada até o

nível do disco de porcelana por 48h a temperatura ambiente

(±25 °C).

47

• Para diminuir a Aw, as amostras foram colocadas em placas de

petri sem tampa em uma estufa a 35 °C/48h.

• As amostras com Aw média tiveram seus valores mantidos

iguais aos dos fornecedores e foram armazenadas em

temperatura ambiente (±25 °C).

Os valores de Aw das amostras foram obtidos utilizando-se

equipamento Aqualab 4TE Duo (Decagon Devices Inc.) e cada placa foi medida

em duplicata. Após esses processos as amostras foram colocadas em sacos de

“stomacher”, fechados e identificados com sua respectiva dose. O período entre a

medição da Aw e o início do processo de irradiação foi menor que 24h.

4.3 Irradiação

As amostras foram irradiadas no Centro de Tecnologia das Radiações

do IPEN, em fonte de 60Co utilizando-se a Gammacell 220 (Nordion Inc., Canadá)

em temperatura ambiente (±25 °C). Inicialmente as doses foram de 0; 2,5; 5,0; 7,5

e 10,0 kGy e após o andamento do trabalho, foram adicionadas as doses de 1,0;

1,5 e 2,0 kGy. A taxa de dose variou de 2,16 a 1,43 kGy/h durante o período e o

dosímetro Harwell Amber 3042 foi utilizado para medir as doses de radiação.

4.4 Microbiologia

No saco de “stomacher”, 10 g de amostra foram misturadas com 90 mL

de água estéril (diluição 10-1) e agitadas por 30 minutos. Alíquotas de 1 mL foram

repassadas em tubos de ensaio com 9 mL de água estéril e realizadas diluições

seriadas até a diluição 10-8. A fração de 0,1 mL foi semeada superficialmente em

placas de petri (em triplicata) contendo ágar Dicloran Glicerol 18% (DG-18) (o pó

para preparo foi da Acumedia, Michigan, EUA e o glicerol da Dinâmica,

Diadema/SP) e incubadas a 25±0,2 °C/5 dias. A contagem foi determinada por

unidades formadoras de colônias por grama da planta de chá (UFC/g) (Pitt et al.,

1983).

48

4.4.1 Contaminação artificial

Devido a baixa contaminação fúngica em ambas as amostras doadas,

elas foram contaminadas com cepas de Aspergillus ssp. e Rhizopus ssp.

fornecidas pelo Laboratório de Fungos Toxigênicos e Micotoxinas do Instituto de

Ciências Biomédicas II da Universidade de São Paulo. Para isso, uma alçada de

cada cepa foi dissolvida em 10 ml de água destilada com uma gota de Tween 20

e então adicionada nas amostras em um saco de polietileno e misturadas

manualmente. Os sacos foram incubados em estufa a 25±0,2 °C/2 semanas e

então repetidos os passos 4.2, 4.3 e 4.4.

4.5 Extração de compostos solúveis

Foi realizada uma infusão com 5 g em 500 mL água destilada fervente

por 10 min. com ligeiras agitações no início, meio e final do período. Em seguida,

a mistura foi filtrada a vácuo em papel filtro e após resfriada em temperatura

ambiente o volume foi ajustado para 500 mL com água destilada. As amostras

foram aliquotadas e armazenadas (-18 °C) para as análises (Matsubara &

Rodriguez-Amaya, 2006a,b). As extrações foram realizadas em triplicata.

4.6 Determinação de compostos fenólicos totais

Os compostos fenólicos totais foram determinados através do reagente

Folin-Ciocalteu. Para isso, em um balão volumétrico de 20 mL, 50 µL dos

extratos, 10 mL de água e 1 mL de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis,

EUA) foram adicionados, misturados e deixado em repouso por 3 min. Então, 8

mL de carbonato de sódio (75 g/L) foram adicionados e o volume final ajustado

para 20 mL com água destilada. Os balões foram imediatamente encubados por

2h/37 °C ao abrigo de luz. A absorbância foi lida em um Espectrofotômetro de UV

visível (UV-1601, Shimadzu), em cubetas de quartzo, no comprimento de onda de

765 nm (Singleton & Rossi Jr, 1965).

Para quantificação dos compostos fenólicos, uma curva de calibração,

utilizando o ácido gálico como padrão, foi realizada com concentrações de 50, 60,

49

70, 80, 90 e 100 µg/mL seguindo o mesmo método. Os resultados estão

expressos em miligrama de Equivalência de Ácido Gálico por 100 mL de extrato

(mgEAG/100 mL).

As análises foram realizadas em triplicata e em ambos os casos, uma

solução branca foi realizada substituindo o extrato/padrão por água destilada.

4.7 Atividade antioxidante

A atividade antioxidante foi medida no Laboratório de Bromatologia da

Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo (FSP/USP) através

do teste de capacidade antioxidante ao radical oxigênio (ORAC) (Ou et al., 2001)

em duplicata.

Resumindo, 50 µL de cada extrato diluído em água destilada (1:500

v/v), 150µL (93,54 nmol/L) de fluoresceína (3’,6’-dihidroxi[isobenzofurano-

1[3H],9’[9H]- xanten]-3-ona, Sigma-Aldrich) foram adicionados na microplaca e

incubado a 37 °C/15 min. ao abrigo da luz. Então, 50 µL (221mM) do gerador de

radicais livres AAPH (2,2′-azobis(2-amidinopropano) dihidroclorida, Sigma-Aldrich)

foi adicionado. A leitura da fluorescência foi lida a 493 nm de excitação e 515 nm

de emissão em um leitor de fluorescência em microplaca Spectramax M5

(Molecular Devices), a cada 1min por 60min, com temperatura controlada (37 °C).

Foi utilizado o Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácido

carboxílico, Sigma-Aldrich) como padrão e a solução fosfato como branco. O valor

de ORAC foi avaliado como a área embaixo da curva (AUC) e expresso em mmol

de equivalente de Trolox por 100mL de extrato (mmolET/100 mL) através das

equações:

�� = 1 +�1

�0+�2

�0+�3

�0+�4

�0+⋯

�60

�0

onde: f 0 foi a leitura da fluorescência no tempo 0.

f n foi a leitura da fluorescência no tempo n.

50

$%�� = 20 × �'��çã�� ×(�� − ��,��)

(��ã� − ��,��)

onde: 20 foi a concentração do Trolox utilizado como padrão (20 µmol/L).

4.8 Separação, identificação e quantificação de bio compostos

A separação, identificação e quantificação dos biocompostos foram

realizadas no Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental da Faculdade

de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (FCF/USP).

Foi utilizado um Cromatógrafo Líquido Hewlett-Packard Infinity 1120

Series (Palo Alto, EUA) equipado com detector de arranjo de diodos (DAD). A

coluna utilizada foi a Prodigy ODS3 (250 mm x 4,60 mm x 5 µm) (Phenomenex

Ltda, Reino Unido).

A fase móvel para eluição foi constituída por gradiente (Quadro 2)

utilizando os reagentes ácido fórmico 0,5% em água (A) e acetonitrila (B) (ambos

da Merck, Darmstadt, Alemanha). O fluxo foi de 1 mL/min e com temperatura de

25 ºC. O tempo total da corrida foi de 45min. O sistema foi controlado pelo

programa ChemStation.

As amostras foram injetadas em duplicata, em volumes entre 2 e 10 µL.

Os compostos foram identificados através de seu tempo de retenção e da

comparação com o espectro de absorção obtido de padrões.

Os padrões utilizados foram (Sigma-Aldrich): Catequina, Catequina

galato, Epicatequina, Epicatequina galato, Epigalocatequina, Epigalocatequina

galato, Teaflavinas (soma de teaflavina, teaflavina-3 galato, teaflavina-3´ galato e

teaflavina-3,3´ digalato), Quercetina, Miricetina, Kaempferol, Ácido gálico e

Cafeína.

51

Para a quantificação, utilizou-se curva de calibração dos padrões

injetados em triplicata, em cinco concentrações distintas. A quantificação das

catequinas foi realizada no comprimento de onda de 370nm, enquanto que do

ácido gálico e cafeína em 270 nm. Os compostos foram expressos em mg/100 mL

de amostra.

Os cromatogramas das amostras, dos padrões e seus espectros UV

encontram-se anexos.

Quadro 2 - Gradiente de solventes, em porcentagem, para eluição dos compostos fenólicos por HPLC/DAD

Tempo (min) Solução A Solução B

0 90 10

5 90 10

15 80 20

25 75 25

33 65 35

38 50 50

43 10 90

44 10 90

45 10 90

4.9 Análise sensorial

As amostras foram preparadas pela infusão de 10 g em 1L de água

fervente, filtradas em papel filtro e armazenadas em garrafas térmicas de 1L.

O preparo e análise foram realizados no Laboratório de Técnica

Dietética da FSP/USP. O teste foi feito em cabines individuais iluminadas por

lâmpada fluorescente. As amostras foram servidas em copos plásticos

52

transparentes, codificados com três dígitos randômicos, mais um copo com água

para 32 provadores voluntários não treinados para o chá verde e 25 para o chá

preto.

Foi solicitado que o provador analisasse os parâmetros odor, sabor e

aparência e fornecesse apenas uma nota que englobasse essas três qualidades

(características globais)de cada bebida. As amostras foram avaliadas baseadas

em uma escala hedônica de nove pontos (onde 9 significava gostei extremamente

e 1 significava desgostei extremamente).

Esse procedimento foi aprovado pelo comitê de ética da mesma

instituição (FSP/USP) sob o protocolo número 1985.

4.10 Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada aplicando-se a análise

de variância ANOVA e quando foi detectada alguma diferença entre as médias

dos grupos, elas foram comparadas pelo teste de comparação múltipla de Tukey,

ambas com um nível de significância de p≤0,05.

53

5 RESULTADOS

5.1 Aw

Os valores de atividade de água alta, média e baixa dos chás verde e

pretos estão na TAB. 1. Em ambas as plantas, os valores ajustados em cada

parâmetro foram estatisticamente iguais.

TABELA 1- Diferentes valores de atividade de água d os diferentes tipos de chá utilizados

Tipo de chá ↓ Aw → Aw ↑ Aw

Verde 0,170±0,050a 0,651±0,001a 0,931±0,009a

Preto 0,183±0,038a 0,651±0,001a 0,924±0,010a

Valores representam a média±devio padrão. Letras iguais na mesma coluna indica igualdade estatística (p>0,05).

Esses são os valores de Aw medidos antes da irradiação. O valor de

Aw não foi medido após o processamento devido a trabalhos relatarem que a Aw

não se alterar após esse tratamento (Chosdu et al., 1995; Mishra et al., 2006;

Pezzutti et al., 2005).

5.2 Microbiologia

Ao avaliar a contaminação microbiológica das ervas, foi possível

constatar que tanto a planta do chá verde, quanto do chá preto estavam com

baixa contaminação fúngica (TAB. 2 e TAB. 3 respectivamente).

54

TABELA 2 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da plant a de chá verde irradiada com diferentes doses de radiação e Aw

Aw Doses (kGy)

0 2,5 5,0 7,5 10,0

↓ Aw 8,33x102a *ND ND ND ND

→ Aw 23,0x102a ND ND ND ND

↑ Aw 103,0x102b ND ND ND ND

Letras diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). *Não detectado (limite de detecção é de 1,0x102 UFC/g).

TABELA 3 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da plant a de chá preto irradiada com diferentes doses de radiação e Aw

Aw Doses (kGy)

0 2,5 5,0 7,5 10,0

↓ Aw 7,0x102a *ND ND ND ND

→ Aw 10,3x102a ND ND ND ND

↑ Aw 90,0x102b ND ND ND ND


Em ambos os casos, quando a Aw de água foi aumentada, mesmo que

em um período relativamente curto (48h), a contaminação inicial foi maior. Isso

pode ser explicado, pois a Aw de água relativamente baixa (0,65) das plantas

contribuiu para a baixa contaminação e baixo metabolismo celular dos

microrganismos. Independentemente da Aw e da contaminação inicial, a dose de

2,5 kGy foi suficiente para reduzir a contaminação a níveis considerados não

detectáveis.

O Brasil não possui uma legislação em relação à contaminação por

fungos em plantas de chá. A resolução vigente sobre os padrões de

55

contaminação microbiológica de alimentos (RDC 12/2001) apenas inclui valores

para Salmonella sp. e Coliformes (Brasil, 2001b). A Organização Mundial da

Saúde recomenda que plantas que irão ser utilizadas em infusões quentes

tenham uma contaminação fúngica de até 105 UFC/g de planta (WHO, 1998). Os

valores encontrados nesse trabalho estão dentro do recomendado.

Apesar de esse trabalho ter encontrado valores baixos de

contaminação por fungos, diversos autores encontraram níveis altos de

contaminação de fungos em diversos tipos de plantas utilizada em infusões

(Aquino et al., 2010; Araújo & Ohara, 2000; Martins et al., 2001) e mesmo aqueles

em que a contaminação foi baixa, a maioria dos fungos eram produtores de

micotoxinas como os do gênero Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Fusarium

(Bernardi et al., 2005; Bugno et al., 2005; Carvalho et al., 2009; Rocha et al.,

2005).

Devido à baixa contaminação microbiológica das amostras e também

das doses inicialmente escolhidas, não foi possível verificar se a radiólise possui

algum efeito significativo na descontaminação. Portanto, as plantas foram

contaminadas artificialmente e doses intermediárias entre 1,0, 1,5 e 2,0 kGy foram

adicionadas. Os valores da contaminação artificial dos chás irradiados com

diferentes doses e Aw estão na TAB. 4 (chá verde) e TAB. 5 (chá preto), onde foi

possível verificar que quanto maior a Aw, menor foi a dose de radiação

necessária para diminuir a contaminação microbiológica.

56

TABELA 4 – Valores da contaminação artificial por f ungos, em UFC/g, da planta de chá verde irradiada com diferentes doses de radiação e Aw

Aw Doses (kGy)

0 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 7,5 10,0

↓ Aw 1,1x108a 3,3x105a 4,0x104a 2,7x103a 2,7x102 ND ND ND

→ Aw 1,2x108a 5,2x104b 3,7x103b 1,6x102b ND ND ND ND

↑ Aw 1,8x108b 2,0x104b 1,7x102b *ND ND ND ND ND


TABELA 5 – Valores da contaminação artificial por f ungos, em UFC/g, da planta de chá preto irradiada com diferentes doses de radiação e Aw

Aw Doses (kGy)

0 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 7,5 10,0

↓ Aw 3,7x107a 7,7x105a 2,0x104a 2,4x103a 3,7x102 ND ND ND

→ Aw 1,2x108b 6,2x104b 1,6x103b 9,3x102b ND ND ND ND

↑ Aw 1,4x108b 6,1x104b 8,3x102c *ND ND ND ND ND


Em relação ao chá verde, com o aumento da Aw, maior foi a presença

de fungos em comparação a Aw média e baixa, entretanto, a radiação foi mais

eficaz em diminuir a carga microbiana. Com 1,0 kGy os valores de contaminação

ficaram iguais para as atividades média e alta e a dose de 2,0 kGy foi suficiente

para reduzir ao nível não detectado, enquanto para Aw média a dose foi de 2,5

kGy e para a baixa Aw foi o dobro.

O mesmo aconteceu ao chá preto, onde a contaminação inicial na Aw

baixa foi cerca de 10 vezes menor comparada com as outras Aw, entretanto com

57

1,0 kGy a contaminação foi mais que 10 vezes maior comparada com as outras

Aw e a dose para diminuir completamente a carga microbiana também foi o dobro

quando comparada com a Aw média e maior ainda quando comparada com a de

Aw alta.

A dose de 5,0 kGy, que foi a dose mínima para que não apresentasse

crescimento de fungos nos chás com Aw baixa, está de acordo com a literatura.

Katusin-Razem et al. (2001) relataram que a faixa de dose entre 5,0 a 8,0 kGy é

suficiente para descontaminar diversos materiais vegetais secos (Aw não foi

medida) com uma contaminação fúngica maior que 104 UFC/g.

Mishra et al. (2006) verificaram que a dose mínima de 5,0 kGy foi

necessária para eliminar o crescimento de fungos, principalmente do gênero

Aspergillus em C. sinensis com a Aw por volta de 0,39 e contaminação inicial na

faixa de 104 UFC/g e mesmo armazenando em uma umidade de 99,9% não

apresentou crescimento no período de 11 dias.

Aquino et al. (2010) observaram que C. sinensis com Aw de 0,58

irradiadas com 5,0 kGy tiveram a carga fúngica diminuída a níveis não detectados

em 17 de 20 amostras e em apenas uma amostra daquelas onde houve o

crescimento ainda estava contaminada com 5x102 UFC/g após 30 dias. Os

autores recomendam então a dose de 10,0 kGy onde não houve crescimento em

nenhuma amostra após o tempo de armazenamento.

Thomas et al. (2008) descreveram que dois tipos de chá preto irradiado

com 7,0 kGy tiveram seus níveis de contaminação diminuídos ao nível não

detectado, porém nenhuma dose mais baixa foi utilizada e a Aw não foi medida.

O fato de o chá irradiado com alta Aw necessitar de uma dose menor

para reduzir a contaminação não está somente pelo efeito da radiólise. Segundo a

curva de crescimento microbiano, há quatro fases que caracterizam as fases de

crescimento. A fase Lag (não há variação do número de células), fase Log

(crescimento exponencial), fase estacionária (diminuição da velocidade de

crescimento) e a fase de morte celular. Como a Aw normalmente em chá é baixa,

a maioria dos microrganismos está ou em latência ou com baixa velocidade em

seu metabolismo ou encontram-se na forma de esporos. Com o aumento da Aw,

58

as células microbianas aumentaram seus metabolismos, entrando na fase Log e

nessa fase, devido à alta velocidade de reprodução e metabolismo, essas células

são mais sensíveis à radiação (Tortora et al., 2002). A sinergia desse fenômeno

com a radiólise faz com que a dose de radiação seja menor para diminuir a

contaminação microbiológica em plantas de chá com alta Aw.

5.3 Fenólicos totais

A quantificação dos compostos fenólicos totais foi realizada através da

expressão da curva de calibração, utilizando o ácido gálico como padrão (FIG. 5).

FIGURA 5 – Curva de calibração utilizada para quant ificação de fenólicos totais nos chás verde e preto irradiados com difere ntes doses e atividade de água, utilizando ácido gálico como p adrão

Diferente da contaminação microbiológica, a análise de fenólicos totais

no chá verde demonstra o efeito da radiólise nesses compostos, uma vez que a

planta irradiada com baixa Aw não apresenta diferença estatística entre as

diferentes doses de radiação (TAB. 6), assim como a planta irradiada com a Aw

média, onde apenas na dose de 5,0 kGy foi diferente das demais doses.

y = 0,0093x + 0,0168R² = 0,9974

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0,9000

1,0000

40 50 60 70 80 90 100 110

Abs

orbâ

ncia

(AU

)

Concentração ( µµµµg/ml)

59

Entretanto, quando a planta é irradiada com alta Aw as diferenças observadas

entre as doses são maiores.

TABELA 6 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG /100 mL de chá verde, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água

Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw

0 93,7±7,8aA 90,6±1,2aA 89,5±0,5aA

1,0 97,2±0,5aA 92,5±0,2aB 91,9±0,5bB

1,5 95,9±0,8aA 94,3±2,9abA 88,2±0,3aB

2,0 98,4±0,6aA 96,1±2,1abA 83,4±0,1cB

2,5 95,7±0,2aA 91,7±1,1aB 80,7±1,7dC

5,0 99,7±1,7aA 98,9±4,5bA 83,4±1,3cB

7,5 100,3±1,3aA 96,4±1,9abB 84,8±0,2cC

10,0 99,9±1,9aA 93,3±4,0abB 89,8±0,2aB

Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença

estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença

estatística (p≤0,05).

A planta do chá verde irradiada com alta Aw demonstrou a menor

quantidade de fenólicos detectados nesse trabalho. Até mesmo na dose de 1,0

kGy, que foi a dose em que se detectou a maior quantidade de fenólicos totais, foi

menor que a quantidade detectada na planta com baixa e média Aw, exceto nas

doses controle. Comparando com as outras doses, a radiação diminuiu a

quantidade de fenólicos nas doses de 2,0, 2,5, 5,0 e 7,5 kGy, porém não houve

diferença entre a dose controle e a dose de 10,0 kGy. No caso da Aw média, a

60

diferença apresentada com 5,0 kGy não foi negativa, uma vez que essa dose

aumentou a quantidade de fenólicos detectados.

Ao comparar as diferentes Aw na mesma dose de radiação, apenas a

dose controle mostrou ser igual nas três Aw e nas outras doses o comportamento

variou. Nas doses de 2,5 e 7,5 kGy a quantidade de fenólicos detectados foram

diferentes, sendo a quantidade maior na planta irradiada com baixa Aw, com

destaque para a dose de 7,5 kGy onde foi detectado a maior quantidade de

fenólicos e a planta com alta Aw apresentou os menores valores, onde a maior

diferença entre elas foi na dose de 5,0 kGy (16,3 mg).

Nas doses de 1,0 e 10,0 kGy as plantas com alta e média Aw tiveram

uma quantidade de fenólicos totais detectados menor daquela que foi irradiados

com baixa Aw e nas doses de 1,5, 2,0 e 5,0 kGy a quantidade de fenólicos foi

menor na amostra com baixa Aw em relação as amostras com alta e média Aw.

Em relação às doses identificadas na microbiologia a dose de 2,0 kGy

que foi a dose em que na planta irradiada com alta Aw diminuiu a contaminação a

níveis não detectáveis a quantidade de fenólicos foi menor que na dose de 2,5

kGy da planta com média Aw e bem menor que na dose de 5,0 kGy na planta

irradiada com baixa Aw, mostrando que os radicais formados pela quebra da água

interagem tanto com os microrganismos quanto em compostos fenólicos.

A análise do chá preto mostrou um comportamento diferente da planta

quando irradiada com a mesma Aw comparada com o chá verde (TAB. 7). Isso

pode ser explicado pelo próprio processamento que o chá é submetido,

transformando-o de chá verde para preto através da oxidação enzimática pela

indústria produtora de chá. O mesmo efeito foi observado ao analisar o perfil de

compostos voláteis (Fanaro, 2009). Como no chá verde, maiores quantidades de

fenólicos foram encontrados nas amostras com baixa Aw.

61

TABELA 7 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG /100 mL de chá preto, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água


0 84,5±1,0aA 84,9±0,4acA 85,2±0,1abA

1,0 96,7±7,7bcA 91,6±0,3bA 88,6±0,9bcA

1,5 94,9±0,6bcA 87,3±1,0acB 85,6±1,6abB

2,0 101,0±0,2cA 93,0±1,5bB 84,0±2,9aC

2,5 96,8±3,9bcA 87,7±1,7acB 85,4±0,3abB

5,0 93,4±1,1bA 92,0±0,3bA 91,6±1,4cA

7,5 95,1±0,1bcA 90,6±0,8bcB 88,2±0,1bcC

10,0 89,9±0,5abA 86,4±2,3acB 87,4±1,8bB




Com baixa Aw, conforme a dose de radiação é aumentada até a 2,0

kGy, maior é a quantidade de fenólicos detectados, porém com doses maiores, as

quantidades são estatisticamente iguais às doses menores que 2,0 kGy, com

exceção da dose de 10,0 kGy em que a quantidade foi estatisticamente igual a

amostra controle.

Conforme houve o aumento da Aw, menor foi a influência da radiação

na quantidade de fenólicos em relação ao chá com baixa Aw. Enquanto nessa

última amostra a diferença entre a menor e maior quantidade foi de 16,45 mg (0 e

2,0 kGy), nas a mostras com Aw média a diferença foi de 8,09 mg (0 e 2,0 kGy) e

na de Aw alta foi de 7,62 mg (2,0 e 5,0 kGy).

62

Analisando as amostras com a mesma dose, mas diferentes Aw, foi

possível constatar um maior número de doses em que a quantidade de fenólicos

não variou entre as três Aw. Nas doses de 0, 1,0 e 5,0 kGy a quantidade de

fenólicos foi estatisticamente igual nas três Aw e ao contrário do chá verde, as

plantas irradiadas com Aw média e alta tiveram uma quantidade mais parecida,

pois nas doses de 1,5, 2,5 e 10,0 kGy a quantidade de fenólicos foi

estatisticamente igual nessas condições. Em nenhuma dose os valores entre as

amostras com Aw baixa e média foram iguais.

Em relação às doses identificadas na microbiologia para diminuir a

contaminação a níveis não detectáveis, nas amostras com média e alta Aw (2,5

kGy e 2,0 kGy respectivamente) as quantidades de fenólicos foram

estatisticamente iguais ao seus respectivos controle. A amostra com baixa Aw

apesar de necessitar uma dose maior para a diminuição da contaminação (5,0

kGy) aumentou a quantidade de fenólicos totais detectados em comparação ao

seu controle.

Independente da dose de radiação e da atividade de água, os valores

encontrados para o chá verde e para o chá preto estão de acordo com a literatura.

Rusak et al. (2008) quantificaram os fenólicos totais em dois tipos de chá verde e

a quantidade variou entre 700 a 1.100 mgEAG/g. Komes et al. (2010) verificaram

que a quantidade de fenólicos em 11 amostras de chá verde variou de 88 a 256,6

mgEAG/100 mL.

Costa et al. (2012) observaram uma quantidade menor de fenólicos em

suas três amostras de chá verde, quantidades essas que variaram de 13,5 a 29,1

mgEAG/100mL. Essas quantidades foram menores devido ao pouco tempo que

os autores utilizaram para extração (5 minutos). Oh et al. (2013) constataram uma

quantidade de 82,21 mgEAG/g para o chá verde e 82,86 mgEAG/g para o chá

preto.

Atoui et al. (2005) detectaram uma quantidade superior a deste

trabalho com um total de 506,66mgEAG/100ml para o chá verde e 352

mgEAG/100mL para o chá preto, porém a quantidade da planta tanto de chá

63

verde quanto de chá preto utilizada para a extração foi 25% maior a utilizada

nesse trabalho.

A quantificação de 8 tipos de chá preto de três países diferentes

realizado por Ramalho et al. (2013) variou de 50,3 a 274,0 mgEAG/g. Turkmen et

al. (2006) observaram uma quantidade menor de fenólicos (30,5 mgEAG/g) em

sua amostra de chá preto e a quantidade de erva utilizada na extração foi o dobro

do que a utilizada nesse trabalho.

Mishra et al. (2006) verificaram que em chá verde irradiado com uma

Aw de 0,38 a quantidade de fenólicos variou de 89,4 a 92,7 mgEAG/g entre as

doses de 0 e 10,0 kGy respectivamente, sendo que essa diferença não foi

estatística. Furgeri et al. (2009) trabalhando com erva mate (Ilex paraguariensis)

observaram um efeito parecido a esse trabalho onde algumas doses aumentaram

e outras diminuíram a quantidade de fenólicos detectadas, sendo que a dose de

3,0 kGy e 7,0 kGy foram as doses em que se mais detectou fenólicos e a dose de

10,0 kGy foi estatisticamente igual a amostra controle.

Nagy et al. (2011) constataram que a irradiação com 10,0 kGy não

alterou a quantidade de fenólicos em sálvia (Folium salviae officinalis), tomilho

(Folium thymi) e orégano (Folium origani cretici) desidratados. Almeida (2012)

observou o mesmo efeito em açafrão (Curcuma longa L.), gengibre (Zingiber

officinale Roscoe) e zedoária (Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe) e, com

exceção do açafrão, as doses de 15,0 e 20,0 kGy aumentaram a quantidade de

fenólicos detectados.

Diferenças encontradas nesse trabalho com outros da literatura podem

ser explicadas uma vez que muitos dos compostos em plantas vaiam de acordo

com tipo de extrato, idade, região de cultivo e características genéticas da planta

(Cardozo Jr. et al, 2007; Dartora et al., 2011), além do tipo e tempo de extração

(Ramalho et al., 2013).

Tanto no chá verde, quanto no chá preto houve uma variação da

quantidade de fenólicos quantificados nas diversas doses de radiação e não foi

possível relacionar esse ganho ou perda diretamente com a dose de radiação em

64

que isso ocorreu. Esse efeito também é observado em trabalhos na literatura que

utilizaram outras plantas submetidas a diferentes doses de radiação.

Essa variação tanto para mais quanto para menos ao que tudo indica é

independente da dose de radiação utilizada, pois não é possível relacionar a

quantidade de fenólicos em uma determinada dose de radiação e verificar que em

doses maiores ou menores a quantidade irá aumentar ou diminuir. Além disso, os

valores encontrados, mesmo que apresentam diferenças estatísticas, são

próximos. A literatura é escassa em explicar o porquê desse fenômeno ocorrer.

5.4 Atividade antioxidante

Os resultados encontrados no chá verde em relação aos fenólicos

totais onde foi observado que quanto maior a Aw, menor a quantidade desses

compostos encontrados aparentemente não interferiram na capacidade

antioxidante dessa bebida analisada pelo método ORAC (TAB. 8).

Foi possível verificar que nas doses de 1,5 e 2,0 kGy quanto maior a

Aw menor foi a capacidade antioxidante. Nenhuma explicação foi encontrada

explicando o porquê isso ocorreu, mas provavelmente a radiólise não foi o que

causou esse efeito, uma vez que nas doses mais altas esse fenômeno não foi

observado. É possível constatar que nem a quantidade de água nem a radiação

com dose de até 10,0 kGy interferem na capacidade antioxidante do chá verde.

65

TABELA 8 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá verde, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de águ a


0 21,0±2,3aA 21,3±2,1abcdeA 21,1±2,1aA

1,0 22,6±0,88aA 22,4±0,9adeA 21,0±3,6aA

1,5 22,5±1,1aA 18,8±0,9bcdB 19,4±1,8aB

2,0 22,0±1,7aA 18,3±1,2bcB 19,3±0,9aB

2,5 21,4±2,9aA 21,7±1,9adeA 21,7±2,3aA

5,0 21,3±2,8aA 22,5±1,3adeA 21,0±2,3aA

7,5 22,5±0,9aA 20,4±1,3abcdeA 20,1±3,4aA

10,0 22,0±1,4aA 20,8±0,6abcdeA 21,0±3,0aA




Em relação ao chá preto, assim como na análise de fenólicos totais que

mostraram uma menor interferência da radiólise quando comparada com o chá

verde, o mesmo comportamento pode ser observado na capacidade antioxidante

dessa bebida, onde não foi encontrada nenhuma diferença estatística entre as

diferentes variáveis utilizadas (TAB. 9).

66

TABELA 9 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá preto, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de águ a


0 16,4±1,4aA 16,5±1,1aA 16,8±1,6aA

1,0 18,4±1,7aA 16,9±1,2aA 19,2±3,9aA

1,5 18,9±1,3aA 18,2±1,4aA 19,8±4,9aA

2,0 18,0±1,9aA 14,4±0,9aA 17,3±2,7aA

2,5 17,4±2,1aA 17,3±1,6aA 17,9±2,4aA

5,0 17,0±0,7aA 18,5±3,7aA 15,7±0,9aA

7,5 18,2±2,3Aa 15,7±4,6aA 15,3±0,9aA

10,0 18,1±1,1aA 16,4±4,3aA 16,4±1,3aA

Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas iguais na mesma coluna significa igualdade

estatística (p>0,05). Letras maiúsculas iguais na mesma linha significa igualdade

estatística (p>0,05).

Comparado com o chá verde a capacidade antioxidante do chá preto é

menor. Isso é devido ao processamento que esse chá é submetido. Carloni et al.

(2012) utilizando a mesma planta para fazer chá branco, verde e preto

encontraram no chá verde uma maior capacidade antioxidante do que no chá

preto.

Rusak et al. (2008) verificou que em suas amostras de chá verde a

capacidade antioxidante foi menor do que encontrado nesse trabalho (variou de

34 a 1.090 µmolET/100 mL), assim como Kodama et al., (2010) em suas nove

amostras de chá verde (600 a 2.550 µmolET/100mL). Essas diferenças

encontradas entre esse trabalho e a literatura já foram explicadas no item 5.3.

Kumar et al. (2010) trabalhando com diversos fitoterápicos verificou

que a radiação não diminuiu a atividade antioxidante em doses de 10,0 kGy

67

através do método DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil). Mishra et al. (2006)

verificaram também por DPPH que a atividade antioxidante de C. sinensis não se

alterou nas diversas doses de radiação utilizada, onde a dose máxima foi de 10,0

kGy.

5.5 Identificação e quantificação dos biocompostos

Devido aos resultados encontrados nas etapas da microbiologia e

fenólicos totais, a identificação e quantificação dos flavonóides tanto no chá

verde, quanto no chá preto, foram realizadas somente nas doses de 5,0 kGy, que

foi a dose mínima para garantir a segurança microbiológica nesse trabalho e na

dose de 10,0 kGy, que é a dose recomendada por diversos órgãos em diversos

países para o processamento desse tipo de planta (os cromatogramas estão

anexos).

Igualmente aos resultados encontrados nos fenólicos totais, a radiólise

mostrou ter certa influência na quantidade dos principais flavonóides do chá

verde. Na maioria dos compostos identificados, a planta quando irradiada com Aw

baixa apresentou uma quantidade maior da maioria das catequinas identificadas

comparado com as plantas irradiadas com Aw mais alta (TAB. 10).

O aumento da quantidade do ácido gálico pode representar a

degradação de compostos galatos. Foi possível verificar que, na Aw alta conforme

houve o aumento da radiação, maior foi a presença desse composto, apesar

desta diferença não ser significativa, entretanto a diferença foi significativa na

dose de 10,0 kGy, onde quanto maior a Aw, maior foi a quantidade de ácido

gálico identificado.

68

TABELA 10 - Quantidade de flavonóides e cafeína, em mg/100 mL de chá verde, identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água

Compostos Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw

Ácido Gálico

0 3,41±0,18aA 3,42±0,05aA 3,44±0,37aA

5,0 3,41±0,09aA 3,60±0,18aA 3,65±0,51aA

10,0 3,30±0,09aA 3,45±0,05aB 3,77±0,22aC

EC

0 11,8±0,1aA 11,9±0,1aA 11,8±0,1aA

5,0 12,1±0,2bA 11,5±0,1bB 11,5±0,1bB

10,0 12,1±0,3bA 11,7±0,3abB 11,4±0,1bB

ECG

0 18,4±0,1aA 18,3±0,1aA 18,4±0,3aA

5,0 19,0±0,1bA 18,3±0,1aB 18,3±0,2aB

10,0 18,5±0,5aA 17,9±0,8aA 17,9±0,1bA

EGC

0 62,9±1,0aA 62,2±0,6aA 62,7±0,7aA

5,0 61,8±0,7aA 60,2±0,3bB 60,5±1,2bB

10,0 61,6±0,8aA 60,7±0,9bA 58,9±0,7cB

EGCG

0 43,1±0,9aA 42,5±0,1aA 42,8±0,6aA

5,0 43,0±0,7aA 41,6±0,6aB 42,8±0,6aA

10,0 42,5±1,4aA 42,5±1,5aA 42,0±0,3bA

Cafeína

0 38,5±0,9aA 37,8±0,2aA 38,5±0,5aA

5,0 39,3±0,9aA 37,6±0,9aA 38,4±1,5aA

10,0 38,4±0,9aA 37,4±0,8aA 37,2±0,4aA

Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença estatística (p≤0,05).

69

Com relação ao composto epicatequina a planta do chá verde quando

irradiada com 5,0 kGy com Aw acima de 0,6 tem a quantidade desse composto

diminuída, enquanto ao ser irradiada com Aw baixa, sua quantidade aumenta.

Além disso, quando irradiada com Aw alta, conforme houve o aumento da dose,

menor foi a quantidade de EC detectada. Um efeito similar também foi verificado

na epigalocatequina.

Para a epicatequina galato, com uma Aw baixa, a dose de 5, 0kGy

aumentou a quantidade desse composto, enquanto nas Aw mais altas não houve

diferença, tendo sua quantidade diminuída apenas quando irradiada com 10,0

kGy. A epigalocatequina galato apresentou a diminuição da sua quantidade

quando irradiada com 5,0 kGy com uma Aw média e também quando aplicado

10,0 kGy com Aw alta.

A cafeína mostrou ser estável, não sofrendo influência tanto do efeito

direto, quanto do efeito indireto da radiação nas diferentes doses de radiação e

atividades de água utilizadas. A literatura ainda relata a presença de outros tipos

de catequinas e de alguns flavonóis nessa bebida, entretanto os compostos

catequina, catequina galato, quercetina, miricetina e kaempferol não foram

identificados.

Apesar de a radiação causar a diminuição nos principais compostos do

chá verde, principalmente quando irradiados com alta Aw, essa redução, mesmo

que estatística, pode ser considerada insignificante, uma vez que a maior

diferença encontrada foi no composto EGC irradiado com Aw alta entre a dose

controle e 10,0 kGy (diferença de 3,8 mg/100 mL) e a menor diferença estatística

foi no composto EC (0,3 mg/100 mL). Além disso, os dados sobre a capacidade

antioxidante mostraram que não houve diminuição da capacidade antioxidante

nos diferentes tratamentos utilizados.

A análise do chá preto mostrou que nem a radiólise, nem o efeito direto

da radiação mostraram ter influência no conjunto de teaflavinas, pois não houve

diferença estatística nas diferentes doses de radiação e Aw utilizadas (TAB. 11).

70

TABELA 11- Quantidade de teaflavinas totais e cafeí na, em mg/100 mL de chá preto, identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água

Compostos Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw

Ácido Gálico

0 6,87±0,17aA 6,84±0,14aA 6,85±0,13aA

5,0 6,91±0,20aA 7,06±0,10bA 6,87±0,10aA

10,0 6,94±0,21aA 6,91±0,07aA 7,03±0,28aA

Teaflavinas*

0 1,04±0,12aA 1,06±0,06aA 1,05±0,06aA

5,0 1,03±0,12aA 1,09±0,06aA 1,13±0,07aA

10,0 1,12±0,14aA 1,08±0,06aA 1,17±0,08aA

Cafeína

0 44,6±0,9aA 44,4±0,9aA 44,7±1,7aA

5,0 45,4±0,6aA 45,2±0,6aA 44,9±0,8aA

10,0 47,2±0,4bA 47,3±0,3bA 48,3±3,4bA

*Corresponde a soma da quantidade de teaflavina, teaflavina-3 galato, teaflavina-3´ galato e teaflavina-3,3´ digalato.

Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença estatística (p≤0,05).

Ao contrário dos resultados encontrados no chá verde, no chá preto, a

quantidade de ácido gálico identificado não variou entre as diferentes doses de

radiação, com exceção na dose de 5,0 kGy com Aw média, porém com 10,0 kGy,

a quantidade foi estatisticamente igual a amostra controle.

Com um comportamento também diferente ao encontrado no chá

verde, a dose de 10,0 kGy aumentou a quantidade de cafeína identificada no chá

preto e esse aumento foi independente da atividade de água. Além disso, a

quantidade foi maior comparada com o chá verde.

71

Isso se deve ao fato de a cafeína ser armazenada dentro do vacúolo da

planta na forma de complexos com ácidos clorogênicos (Baumann & Rohing,

1989; Waldhauser & Baumann, 1996). Para se fabricar o chá preto, as folhas de

C. sinensis são esmagadas e trituradas, com o objetivo de quebrar o vacúolo da

célula para liberar a polifenoloxidase (Matsubara & Rodriguez-Amaya, 2006a,b) e

com isso há também uma liberação da cafeína. Ao irradiar esse tipo de chá, as

estruturas dos vacúolos que não foram quebradas no processo de fabricação do

chá preto, foram quebradas pela dose de 10kGy, aumentando assim a quantidade

de cafeína extraída pela infusão.

As quantidades de catequinas e cafeína identificadas no chá verde

foram maiores do que relatados por Reto et al. (2007), que quantificaram nove

tipos de chá verde de Portugal e El-Shahawi et al. (2012) em suas 29 amostras

provenientes de um mercado da Arábia Saudita.

Em quatro amostras de chá verde da China, Wu et al. (2012)

identificaram uma maior quantidade de EGCG, uma quantidade menor de EGC e

EC e uma quantidade similar de ECG que neste trabalho. Matsubara e Rodrigues-

Amaya (2006) verificaram quantidades semelhantes desses compostos em dois

tipos de chá verde adquiridos em Campinas-SP.

Nesse mesmo trabalho, os autores verificaram que a quantidade de

teaflavinas foi maior comparado a este trabalho, assim como os trabalhos de

realizados por Wang et al., (2010) e Lee et al. (2004). Entretanto, Lee e Ong

(2000) encontraram em chás preto de Singapura valores de teaflavinas

semelhantes.

Apesar da quantidade de flavonóides encontrado no chá verde variar

dependendo da dose de radiação e Aw, isso não significa que ingerindo o chá

com alta Aw, que possuiu uma quantidade menor de catequinas, trará menos

benefícios para a saúde de um indivíduo. Outros fatores como a absorção,

metabolização e excreção influenciam na ingestão dessa bebida.

Estudos com ratos indicaram que a EGCG é principalmente excretada

através da bile, enquanto a EGC e a EC são excretadas através da urina e bile,

indicando que as catequinas são rapidamente e extensivamente metabolizadas.

72

Enquanto a EGCG não foi detectada na urina, 90% do total de EC e EGC foram

excretadas na urina por 8 horas e nenhum composto foi detectado no organismo

após 24 horas (Yang et al., 1998).

Higdon e Frei (2003) compararam a farmacocinética de doses

equimolares de EGC, ECG e EGCG puras em 10 voluntários saudáveis. Os picos

médios de concentração no plasma depois de uma dose única de 1,5 mmol foram

de 5µmol/L para EGC, 3,1 µmol/L para ECG e 1,3 µmol/L para EGCG. A EGC e a

EGCG plasmática voltaram para o valor base, mas o valor plasmático de ECG

permaneceu elevado depois de 24h.

Portanto, a manutenção da alta concentração plasmática das

catequinas requer a ingestão repetida desses flavonóides ao longo do tempo e

não somente do consumo de chás com alta concentração de catequinas, como

tem sido observado em voluntários consumindo chá a cada 2h (Scalbert et al.,

2002).

5.6 Análise sensorial

Devido à série de resultados encontrados nesse trabalho, onde a

radiação e radiólise até causaram variações em alguns parâmetros analisados,

porém essas diferenças, mesmo que estatísticas, podem ser consideradas

insignificantes, pois variaram muito pouco. Por isso, a análise sensorial foi

realizada apenas nas doses de 5,0 kGy e 10,0 kGy com a Aw média.

Os resultados fornecidos pela a análise sensorial são de extrema

importância para determinar se processos utilizados nos alimentos, como a

irradiação, vão interferir nas características como odor, sabor, cor e textura do

alimento. Uma vez que esses parâmetros mudam, o produto pode não ser mais

aceito pelo consumidor devido a essas mudanças. Um procedimento que é muito

eficiente em diminuir a carga microbiana ou aumentar a vida útil de um alimento,

porém se não há a aceitação pelo consumidor, esse processo não deve ser

aplicado. É baseado na aceitação do alimento pelo consumidor que a legislação

da irradiação de alimentos no Brasil (RDC n° 12/2001) se basea.

73

A TAB. 12 mostra que não houve diferença estatística entre as doses

para os dois tipos de chá. A nota baixa se deve ao fato dessas bebidas serem um

pouco amargas e como os chás foram servidos sem açúcar ou qualquer outro

melhorador de sabor, os voluntários levaram esse parâmetro em consideração ao

fornecer suas notas.

TABELA 12 – Valores das características globais (od or, aparência e sabor) de chá verde e preto irradiados com diferentes dose s de radiação

Tipo de Chá Doses (kGy)

0 5 10

Verde 5,8±2,0a 5,9±1,8a 5,2±2,1a

Preto 3,0±1,9a 3,3±2,1a 3,0±1,8a

Valores representam a média±devio padrão. Letras iguais na mesma linha indica igualdade

estatística (p>0,05).

Mishra et al., (2006) encontraram os mesmos resultados que este

trabalho em chás de C. sinensis irradiados com até 10,0 kGy. Fanaro et al. (2012)

observaram que apesar de a radiação com 5,0 kGy interferir no perfil de

compostos voláteis em chá oolong (C. sinensis), não foi encontrado nenhuma

diferença nas característica sensoriais por voluntários em doses de até 20,0 kGy.

Furgeri et al. (2007) trabalhando com erva mate (Ilex paraguariensis)

irradiada, demonstraram que não houve diferença estatística entre as amostras

irradiadas com até 10,0 kGy e a não irradiada. Salum et al. (2007), verificaram

que os provadores não souberam a diferença entre as amostras de canela e noz

moscada irradiadas e não irradiadas.

Rodrigues et al. (2012) observaram que biscoitos feitos com farinha de

linhaça irradiada com doses de até 1,5 kGy tiveram a mesma aceitação que os

biscoitos com farinha não irradiada. Os biscoitos possuíam uma Aw de 0,38.

74

Khattak et al. (2009) trabalhando com rizomas de lótus frescas constataram que a

radiação com doses de até 6,0 kGy não interferem nas características sensoriais,

preservando essas características até o tempo de estocagem de 12 dias a 4 ºC.

Wen et al. (2006) verificaram que a provadores não diferenciaram goji (Lycium

chinense Mill) desidratados irradiados com doses de até 14,0 kGy da fruta não

irradiada.

75

6 CONCLUSÃO

A irradiação com 5,0 kGy garante um controle microbiológico em chá

verde e chá preto quando irradiados com diferentes atividades de água sem

interferir na quantidade de fenólicos totais, na quantidade de diversos flavonóides

e na atividade antioxidante em ambos os chás.

76

7 TRABALHOS FUTUROS

• Verificar a influência da alta Aw na atividade enzimática nos

chás armazenados por 1 ano.

• Verificar a formação de produtos radiolíticos únicos nas

diferentes doses de radiação e Aw.

77

ANEXOS

78

FIGURA 6 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw baixa

79

FIGURA 7 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw média

80

FIGURA 8 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw alta

FIGURA 9 - Cromatogramas do chá verde irradiado com diferentes doses de radiação e Aw

81

82

FIGURA 10 - Cromatogramas do chá preto irradiado co m Aw baixa

83

FIGURA 11 - Cromatogramas do chá preto irradiado co m Aw média

84

FIGURA 12 - Cromatogramas do chá preto irradiado co m Aw alta

FIGURA 13 - Cromatogramas do chá verde irradiado co m diferentes doses de radiação e Aw

85

86

FIGURA 14 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. dos padrões: (1) Epigalocatequina; (2) Epicatequina; (3) Epicate quina galato

1

2

3

1 2

3

87

FIGURA 15 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. dos padrões: (1) Catequina; (2) Epicagalotequina galato; (3) Cat equina galato

1

1

2

2

3

3

88

FIGURA 16 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. do mix de padrões de Teaflavina

3

3

2

1

Catequina

2 1

89

FIGURA 17 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. dos padrões: (1) Cafeína; (2) Miricetina; (3) Kaempferol

3

2 1

2

1

90

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efeito da radiaÇÃo ionizante em chÁs da planta

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