fpen AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

CARACTERIZAO DOS EFEITOS DA RADIAO

IONIZANTE EM PELE HUMANA PARA ALOENXERTO

SELMA CECLIA BOURROUL

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear-Aplicaes.

Orientadora: Dra. Monica Beatriz Mathor

So Paulo 2004

48

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES Autarquia associada Universidade de So Paulo

CARACTERIZAO DOS EFEITOS DA RADIAO

IONIZANTE EM PELE HUMANA PARA ALOENXERTO

SELMA CECLIA BOURROUL / /

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de iviestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear -Aplicaes

Orientadora:

Dra. Monica Beatriz Mathor

SO PAULO 2004

minha me, por ter me mostrado os primeiros caminhos.

Ao Armando, por ter tornado minha escolha possvel.

Ao Giuliano, por sua alegria.

Agradecimentos

A Dra. Mnica Beatriz Mathor, pela orientao sempre presente, por sua amizade e

principalmente compreenso.

Ao CNPq, pela bolsa de Mestrado.

Ao IPEN, pela oportunidade do desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Jos Roberto Rogero, Presidente da Comisso de Ps Graduao, pelo apoio

nossa participao em Congressos, que se traduziu na divulgao e enriquecimento deste

trabalho.

Diviso de Ensino, em especial ao Fernando Moreira, Ilze Puglia, Vera Lucia

Garcia e Ana Maria Benassi, pelo apoio e ateno.

Ao CTR, pelo acolhimento e por propiciar condies para o desenvolvimento do

nosso trabalho.

Dra. Marisa Roma Herson, por seu interesse, sugestes e inestimvel colaborao

pessoal que possibilitaram a realizao deste trabalho.

Ao Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clnicas da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo, pelo fornecimento dos tecidos necessrios

pesquisa.

Ao Dr. Eddy Segura Pino, por ter tomado possvel a caracterizao biomecnica da

pele, mas principalmente, por suas importantes sugestes neste estudo.

Ao Dr. Sergio Ferreira de Oliveira, por seu interesse neste trabalho, por ter

realizado o estudo e anlise ultra-estrutural dos tecidos iiTadiados.

Ao amigo Msc. Alex Kors Vidsiunas, pela preparao e incluso das amostras para

observao no microscpio eletrnico de transmisso.

Ao Gaspar Ferreira de Lima, por seu profissionahsmo nos cortes e contrastao do

material para microscopia eletrnica.

Dra. Kayo Okasaki, Msc. Mriam Suzuki e Dra. Mrcia Silva, pelas

instrues nas observaes e registros fotogrficos da microscopia ptica.

Ao Dr. Jarbas Arruda Bauer, excelente professor, por apresentar a histologia como

um estudo dinmico e integrado.

Ao Dr. Wilson Aparecido Parejo Calvo, pela colaborao e informaes sobre

irradiao no acelerador de eltrons.

Aos Eng. Eifsabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira, pela irradiao das

amostras, sugestes e explicaes. Ao Hlio Antonio Paes, pela fabricao do dispositivo

de proteo do termopar para as medidas de temperatura no acelerador de eltrons.

Msc. Clia Marina Napolitano e ao Ethel Martins Pedroso pela dosimetria.

Ao Manuel Nunes Mori, pela padronizao do corte das amostras e pela realizao

dos primeiros ensaios biomecnicos.

Ao Djalma Batista Dias, pela realizao dos ensaios biomecnicos e por suas

explicaes sobre a tcnica de funcionamento da mquina Instron, que possibilitaram

minha independncia na realizao dos ensaios de trao .

Ao Daniel Cavalh, pela ajuda na padronizao das amostras para o estudo

biomecnico.

amiga Elisa Santos, pela colaborao nas primeiras lminas histolgicas.

Wilma Conceio Montilha pela reahzao da anlise estatstica.

Ao Laboratrio de Histologa do Departamento de Patologia da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo, pela preparao das lminas histolgicas. A

Silvana Altran do Laboratrio de Cirurgia Plstica e Microcirurgia da FM-USP, por sua

colaborao na entrega das amostras para histologa.

amiga Dra. Suzi Frey Sabato, companheira de congi-esso, por sua amizade e

incentivo.

amiga Dra. Sueli Borrely, pelo incentivo e conselhos.

Aos amigos de equipe Maria Ftima Klingbell, Andrea Cecilia Dorion Rodas,

CjTiara Viterbo, Karina Lima e Lus Otvio Carvalho Kosmiskas, pelo apoio.

Aos amigos de CTR, Msc. Icimone Oliveira, Maria Fernanda Romanelh, Maria

Cristina Moraes, Daniela Nardi e David Tsai, por sua amizade e ajuda.

Aos amigos do ICB Ana Luca Mota, Augusto Montezano e Angela Bruni, por suas

sugestes e amizade.

s amigas Mrcia Celina Valdez dos Santos e Nancy Umisedo , que mesmo

distncia sempre deram seu apoio e carinho.

Agradeo especialmente ao Prof Flavio Delmanto, Diretor do Ncleo de Sade do

Centro Universitrio UnFMU, pois foram sua compreenso e generosidade que

possibHtaram a minha dedicao integral a este trabalho.

cmssho NKomi D Emm\ HCLEAR/SP-PEM

CAKACTERIZA.O DOS EFEITOS DA RADIAO IONIZANTE EM PELE

HUMANA PARA ALOENXERTO

Selma Ceclia Bourroul

RESUMO

A pele desempenha papel fundamental na viabihdade do organismo. Nos casos de leses extensas, os aloenxertos apresentam-se como uma alternativa para cobrir temporariamente essas reas. Aps triagem do doador, a pele processada em ghcerol concentrado (acima de 85%), pode ser armazenada nos Bancos de Tecidos. O glicerol nessa concentrao possui efeito bacteriosttico porm h necessidade de quarentena. A esterilizao da pele por radiao ionizante o mtodo mais indicado pois reduz o prazo para transplante do enxerto em pacientes e sua confiabilidade considerada excelente. Os objetivos deste trabalho foram estabelecer procedimentos de utilizao de duas fontes distintas de radiao ionizante para esterihzao de pele humana destinada ao aloenxerto, e avaliar a pele aps exposio irradiao gama e feixe de eltrons. Foi realizada a caracterizao do tecido quanto a resposta aos ensaios de trao por meio da comparao dos valores do mdulo de elasticidade entre amostras-controle e irradiadas. Amostras de pele foram submetidas a doses de 25 kGy e 50 kGy no in-adiador de ^Co e no acelerador de eltrons. Foram reahzados tambm estudos de morfologa e ultra-estmtura. As amostras irradiadas com gama a 25kGy, no apresentaram diferena sigTiicava quanto aos valores do mdulo de elasticidade em relao ao controle. As amostras submetidas irradiao gama a 50 kGy e ao feixe de eltrons a 25 kGy e 50 kGy apresentaram diferena significativa quanto aos valores do mdulo de elasticidade em relao ao controle. A anlise das ultramicrografas revelaram modificaes na estrutura e modificao no padro de estriao das fibrilas de colgeno da derme das amostras irradiadas.

COESO mioim. DE Em\^ HuaiAwsp-PEM

CHARACTERIZATION OF IONIZING RADIATION EFFECTS ON HUMAN

SKIN ALLOGRAFTS

Selma Ceclia Bourroul

ABSTRACT

The skin has a fundamental role in the viabihty of the human body, hi the cases of extensive wounds, allograft skin provides an alternative to cover temporarily the damaged areas. After donor screening and preservation in gtycerol (above 85%), the skin can be stored in the Skin Banks. The glycerol at this concentration has a bacteriostatic effect after certain time of presei-vation. On the other hand, skin sterilization by ionizing radiation may reduces the quarantine period for transplantation in patients and its safety is considered excellent. The objectives of this work were to establish procedures using tvvo sources of ionizing radiation for sterilization of human skin allograft, and to evali.iate the skin after gamma and electron beam irradiation. The analysis of stress-strain intended to verify possible effects of the radiation on the structure of preserved grafts. Skin samples were submitted to doses of 25 kGy and 50 kGy in an irradiator of ^Co and in an electron beam accelerator. Morphology and ultra-structure studies were also accomplished. The samples irradiated with a dose of 25kGy seemed to maintain the biomechanic characteristics. The gamma irradiated samples with a dose of 50 kGy and submitted to an electron beam at doses of 25 kGy and 50 kGy presented significant differences in the values of the elasticity modulus, in relation to the control. The analysis of the ultramicrographies revealed modifications in the structure and alterations in the pattern of collagen fibrils periodicity of the irradiated samples.

CCMSSO W\Qr^L C i ENER&iA KuCLEAR/SP-IPEh!

SUMARIO

Pgina

1 INTRODUO 17

2 OBJETIVOS 20

3 CONSIDERAES GERAIS 21

3.1 A PELE HUMANA 21 3.1.1 Funes 21 3.1.2 Morfologa 22 3.1.2.1 Epiderme 22 3.1.2.2 Membrana Basal 23 3.1.2.3 Derme 23 3.1.2.3.1 Fibras Colgenas 24 3.1.2.3.1 Fibras Elsticas 28 3.1.3 Caracterizao Biomecnica da Pele Humana 29 3.2 ALOENXERTO 30 3.3 ESTERILIZAO 32 3.3.1 Esterilizao por Radiao Ionizante 32 3.4 RADIAO IONIZANTE 33 3.4.1 Radiao Gama 33 3.4.2 Feixe de Eltrons 34 3.4.3 Efeito Direto e Efeito Indireto da Radiao Ionizante 35 3.5 FONTES DE RADIAO IONIZANTE 35 3.5.1 Irradiador de Cobalto 60 (''"Co) 35 3.5.2 Acelerador de Eltrons 36

4 MATERIAIS E MTODOS 39

4.1 MATERIAIS 39

4.1.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS 39 4.1.2 IRRADIADORES 40 4.1.2.1 Irradiador de CobaIto-60 40 4.1.2.2 Acelerador de Eltrons 40 4.1.3 ENSAIOS BIOMECNICOS DE TRAO 40 4.1.3.1 Corte do corpo de prova 40 4.1.3.2 Ensaios de resistencia trao 41 4.1.4 ESTUDOS MORFOLGICOS 41 4.1.4.1 Microscopio ptico 41 4.1.4.2 Microscopio eletrnico de transmisso 41

4.2 MTODOS 42

4.2.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS 42 4.2.1.1 Manipulao do material biolgico e instrumentos 43 4.2.1.2 Descarte do material biolgico 43

4.2.2 ENSAIOS BIOMECNICOS DE RESISTENCIA TRAO 43 4.3 HISTOLOGIA 45 4.4 ULTRA-ESTRUTURA 46 4.5 ANALISE ESTATSTICA 47 4.5.1 Anlise estatstica descritiva 47 4.5.2 Teste de significncia 47

5 RESULTADOS 50

5.1 CARACTERIZAO DAS AMOSTRAS 50 5.2 TESTES BIOMECNICOS DE RESISTNCIA TRAO 51 5.2.1. Amostras submetidas irradiao gama e ao feixe de eltrons com dose de

25 kGy 52 5.2.1.1 Anlise estatstica 55 5.2.1.1.1 Anlise estatstica descritiva 55 5.2.1.1.2 Teste de significncia 56 5.2.2 Amostras submetidas ao feixe de eltrons com modificao do sistema de

transporte e da temperatura com dose de 25 kGy 58 5.2.2.1 Registro de temperaturas no acelerador de eltrons 60 5.2.2.1.1 Sistema de transporte de esteira 60 5.2.2.1.2 Sistema de transporte de bandeja 61 5.2.2.2 Anlise estatstica 64 5.2.2.2.1 Anlise estatstica descritiva 64 5.2.3 Amostras submetidas irrradao gama e feixe de eltrons com dose de

SOkGy 65 5.2.3.1 Anlise estatstica 67 5.2.3.1.1 Anlise estatstica descritiva 67 5.2.3.1.2 Teste de significncia 68 5.2.4 Amostras submetidas a irradiao gama e feixe de eltrons irradiadas com

doses crescentes de 10 kGy a 50 kGy 70 5.3 ESTUDO HISTOLGICO 72 5.3.1 Hematoxilina-eosina 72 5.3.2 Mallory 72 5.3.3 Picro-sirius 72 5.3.4 Resorcina 72 5.4 ESTUDO ULTRA-ESTRUTURAL 73

6 DISCUSSO 84

7 CONCLUSES 92

APNDICE A - Valores do mdulo de elasticidade (MPa) das amostras do grupo controle e dos grupos irradiados a 25 kCy !00

APNDICE B - Valores do mdulo de elasticidade (em MPa) das amostras do grupo controle e dos grupos irradiados a 50 kGy 101

APNDICE C - Teste de Mann-Whitney para pequenas amostras (n

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 3.1 - Representao da molcula de colgeno formada por 3 cadeias alfa. O aminocido glicina est indicado em cor mais forte na regio interna da molcula (modificado de Alberts, 1997). 2S

FIGURA 3.2 - Estrutura da fibra de colgeno: as fibras de colgeno so formadas por unidades menores, as fibrilas, constitudas por macromolculas denominadas tropocolgeno que esto paralelamente organizadas. O tropocolgeno formado por trs cadeias peptdicas de estrutura alfa- ligadas por pontes de hidrognio (modificado de Gartner & Hyatt, 2001). 26

FIGURA 3.3 - Pontes de hidrognio na molcula de colgeno: (A) entre tomos que formam a alfa-hhce (intra-molecular); (B) entre as trs molculas alfa que fonnam o tropocolgeno (intermolecular), (modificadas de Lehninger, 1976). 27

FIGURA 3.4 -Mquina Universal de Ensaios Instron.(A) Aspecto geral , controles e sistema computacional. (B) Garras segurando corpo de prova.. 30

FIGLIRA 3.5 - Irradiador de cobalto-60 Gammacell-220. (1) cmara secundria com recipiente para amostras; (2) cmara primria (3) Painel de controle. 36

FIGURA 3.6 - Acelerador de eltrons Dynamitron JOB-188. (1) sistema de varredura; (2) bomba de vcuo; (3) bandeja com suporte para simostras; (4) esteira transportadora. 38

FIGURA 4.1 - Exemplo de amostras de tiras de pele de espessura parcial acondicionadas em embalagem selada trmicamente, com identificao de que o material foi irradiado (seta). 39

FIGURA 4.2 - (A) Faca de ao, em foniiato de halteres, para corte de corpo de prova, montada em suporte de madeira; (B) dimenses do corpo de prova; (G) extensmetro; (C) corpo de prova de pele. 41

FIGUHA 4.3 - Grfico obtido com o software Merlin 2.21, mostrando o prolongamento da poro linear ( / ) e a indicao dos valores de tenso (aj e (J2) e de alongamento ( 8 1 6 8 2 ) para clculo do mdulo de elasticidade de acordo com a equao E = Aa/Ae (3). 45

FIGLTIA 5.1 - Grfico obtido com o software Merlin 2.21 para a amostra n 3 do gi-upo controle do doador VlIIb. (/) A reta em azul foi construda manualmente para evidenciar a parte linear da curva. 51

FIGURA 5.2 - Relao entre "stress" x "strain" em 5% das amostras testadas. A seta indica a resistncia trao da camada comeificada da epiderme aps a niptiira da demie. 52

FIGURA 5.3- Valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) para amostras irradiadas com gama e submetidas ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy. 53

FIGURA 5.4 - Grfico comparativo dos valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) das amostras dos grupos controle dos seis doadores. 54

FIGURA 5.5- Grfico de porcentagem dos grupos experimentais submetidos irradiao gama e ao feixe de eltrons, com dose de 25kGy, em relao ao controle. 55

CCMSSO !#tC10mL D B^mik m(iEmsp-?m

FIGURA 5.6 - Mdulo de Elasticidade dos grupos irradiados com gama e com eltrons, em porcentagem em relao ao grupo controle de cada doador. (-) A reta em vermelho representa o valor limite entre os dois efeitos. 56

FIGURA 5.7 - Grfico comparativo dos valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) para amostras ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy transportadas por esteira e bandeja temperatura ambiente (ta) e sob resfriamento (resf). 59

FIGURA 5.8 - Grfico de porcentagem dos grupos experimentais submetidos ao feixe de eltrons, com dose de 25kGy, transportados em esteira e bandeja temperatura ambiente (ta) e sob resfiiamento (fesf), em relao ao controle. 60

FIGURA 5.9 - Variao da temperatura durante a irradiao a 10 kGy pelo sistema de esteira e de bandeja no acelerador de eltrons, com e sem resfiiamento (em porcentagem). A reta () indica a temperatura ambiente utilizada como referncia. 63

FIGURA 5.10 - Variao das temperaturas durante a irradiao a 25 kGy pelo sistema de bandeja no acelerador de eltrons, com e sem resfriamento (porcentagem). A reta () indica a temperatura ambiente utilizada como referncia. 64

FIGURA 5.11 - Mdulo de Elasticidade dos grupos submetidos ao feixe de eltrons, em porcentagem em relao ao grupo controle de cada doador. () A reta representa o valor limite mximo para as amostras transportadas por esteira temperatura ambiente. 64

FIGURA 5.12 - Valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) pai'a amostras controle e irradiadas com gama e submetidas ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. 66

FIGURA 5.13 - Valores do mdulo de elasticidade (em MPa) das amostras dos grupos controle para amostras irradiadas com dose de SOkGy. 66

FIGURA 5.14 - Grfico de porcentagem dos grupos experimentais submetidos irradiao gama e ao feixe de eltrons, com dose de SOkGy, em relao ao controle. 67

FIGURA S.15 - Mdulo de Elasticidade dos grupos irradiados a SOkGy com gama e com eltrons, em porcentagem em relao ao grupo controle de cada doador. () A reta em vermelho representa o valor limite entre os dois efeitos. 68

FIGURA 5.16 - Efeito da irradiao crescente sobre os valores das mdias do mdulo de elasticidade das amostras submetidas radiao gama e ao feixe de eltrons. 71

FIGURA 5.17 - Efeito da irradiao crescente sobre os valores das mdias do mdulo de elasticidade das amostras submetidas radiao gama e ao feixe de eltrons, em porcentagem. 71

FIGURA 5.18 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com hematoxilina-eosina, observadas ao microscpio de luz. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de elfi-ons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. Aumento: 400x. 74

FIGURA 5.19 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com Mallory, observadas ao microscpio de luz. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao

feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. Aumento: 400x. 75

FIGURA 5.20 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com picro-sirius, observadas ao microscpio de luz polarizada. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. As setas (->) indicam feixes de fibras de colgeno I. Aumento: 400x. 76

FIGURA 5.21 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com resorcina, observadas ao microscpio de luz. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. As setas ( ^ ) indicam fibras de elastina. Aumento: 400x. 77

FIGURA 5.22 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. As setas ( ^ ) indicam fibrilas de colgeno I em corte longitudinal. Aumento: lOOOOx. 78

FIGURA 5.23 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso. Amostra controle (ampliada). Aumento: lOOOOx. 79

FIGURA 5. 24 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx. 80

FIGURA 5.25 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx.. 81

FIGURA 5.26 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx. 82

FIGURA 5. 27 - Ultramicrografias de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de >0 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx.. 83

LISTA DEJTABELAS

TABELA 5.1 - Caracterizao das amostras de pele para pesquisa. 50

TABELA 5.2 - Mdia dos valores de espessura das amostras de pele (em mm) para os lotes irradiados a 25 kGy e 50 kGy. 51

TABELA 5.3 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em MPa) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do gnipo submetido ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy. 53

TABELA 5.4 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em porcentagem) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do grupo submetido ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy. 54

TABELA 5.5 - Medidas centrais e de disperso do mdulo de elasticidade das amostras dos seis doadores para os grupos irradiados com gama e com eltrons (em proporo) a 25kGy. 56

TABELA 5.6 - Teste de significncia de "Student" para mdia do mdulo de elasticidade (E, em. MPa) dos gi'upos in-adiados com gama e com eltrons com dose de 25 kGy, comparados mdia do grupo controle. Nvel de significncia=l%. 57

TABELA 5.7 - Teste de significncia de "Student" para mdias do mdulo de elasticidade (E, em MPa) de todos os doadores nos grupos irradiados com gama e com eltrons com dose de 25 kGy, comparados mdia do grupo controle p. Nvel de significncia=l% (a

TABELA 5.14 - Temperaturas do ambiente e das amostras irradiadas a 25 kGy com resfriamento no sistema de transporte de bandeja no acelerador de eltrons. Dados apresentados em graus Celsius (C)e em porcentagem (%). 62

TABELA 5.15 - Temperaturas do ambiente e das amostras irradiadas a 25 kGy com resfriamento no sistema de transporte de bandeja no acelerador de eltrons. Dados apresentados em graus Celsius (C)e em porcentagem (%). 63

TABELA 5.16 - Medidas centrais e de disperso do mdulo de elasticidade das amostras dos oito doadores para os grupos submetidos ao feixe de eltrons (em proporo)em sistema de transporte de esteira e de bandeja, temperatura ambiente e com resfriamento. 65

TABELA 5.17 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em MPa) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do grupo submetido ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. 65

TABELA 5.18 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em porcentagem) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do grupo submetido ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. 67

TABELA 5.19 - Medidas centrais e de disperso do mdulo de elasticidade (em proporo) das amostras dos trs doadores para os grupos irradiados com gama e com eltrons a 50kGy. 68

TABELA 5.20 - Teste de significancia de "Student" t para mdia do mdulo de elasticidade (E, em MPa) dos grupos irradiados com gama e com eltrons com dose de 50 kGy, comparados mdia do grupo confrole no irradiado. Nvel de significncia=5% (p

LISTA TfE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas.

AIEA - Agencia Internacional de Energia Atmica.

ANSI - American National Standard.

ASTM - American Standard Test Method.

BT-ICHC - Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clnicas.

CNEN/SP - Comisso Nacional de Energa Nuclear / So Paulo.

CTR - Centro de Tecnologa das Radiaes.

DNA - Deoxyribonucleic Acid (= cido desoxinibonucleico),.

FM - Faculdade de Medicina.

IAEA - International Atomic Energy Agency.

ICB - histituto de Ciencias Biomdicas.

DPEN - Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares.

LBM - Laboratrio de Biologia Molecular.

NBR - Norma Brasileira.

REG - Retculo Endoplasnitico Granular

USP - Universidade de So Paulo.

UV - ultra-violeta (radiao).

L I S T A DE SMBOLOS

A - rea.

cal - calora (unidade de medida de energa: 1 cal = 4,18 J).

^Co " cobalto-60 (istopo radioativo do ^^Co).

C - Graus Celsius (unidade de medida de temperatura).

E - mdulo de elasticidade.

s - alongamento.

Ae - variao do alongamento.

d - diferena das mdias.

F - fora.

Gy - gray (unidade de medida de dose absorvida: 1 Gy = 1 J/kg)

g - graus de liberdade.

Ho - hiptese de nulidade.

Hi - hiptese alternativa.

Hz - hertz (unidade de medida de freqncia).

,T - joule (unidade de medida de energia).

kCi - quilocurrie (unidade de medida de atividade: 1 Ci = 3,7x10' desintegraes/seg).

keV - quiloeltronvolt (unidade de medida de energa: 1 eV = 23.060 kcal/mol).

kGy - quilogray (10" Gy).

kGy/h - quilogray por hora (unidade de medida de taxa de dose absoi-vida).

kGy/s - quilogray por segundo (unidade de medida de taxa de dose absorvida).

kN - quilonewton (unidade de medida de fora: 10^ N).

kV - quilovolt (unidade de medida de energa: 10^ V).

L - comprimento.

M - molar (concentrao: n de moles do soluto dissolvidos em 1 L de soluo).

mA - mih ampre (imidade de medida de corrente eltrica).

MeV - milho de eltronvolt (10* eV).

MPa - megapascal (unidade de medida do mdulo de elasticidade; 1 MPa = 1 N/mm ) .

mm - milmetro (unidade de medida de comprimento).

mm^ - milmetro quadrado (unidade de medida de rea).

[im - micrmetro (unidade de medida de comprimento: 1 im = 10'^ mm).

N - newton (unidade de medida de fora).

n - nmero de amostras.

COWSSO m.l(M.l DE EMtRJA MUCLEAl-^SP-iPEN

mn - nanmetro (tmidade de medida de comprimento: 1 nm = 10'^ [im).

s - desvio padro,

s ~ varincia

a - tenso.

Aa - variao da tenso.

t - varivel do teste de significncia de Student.

3c - mdia das amostras.

17

1 I N T R O D U O

A pele, considerada o maior rgos do corpo humano, representa 16 % do peso

coiporal (Junqueira & Carneiro, 1995) e se constitui em eficiente barreira contra urna

variedade de agentes fsicos, qumicos e biolgicos, alm de participar de processos

homeostcos e fisiolgicos de regulao (Hlaeac, 1995).

Em fiino de sua importancia, extensas leses na pele comprometem a recuperao

do individuo. o caso, por exemplo, de queimaduras graves, extensas e promdas, que

destroem epidenne, derme e tecidos subcutneos impossibilitando a regenerao

espontanea da pele e muitas vezes levando o paciente a bito. A reduo da mortahdade

est relacionada, portanto, eficcia da proteo precoce da regio queimada de modo a

diminuir substancialmente a desidratao, possibilitar o controle de infeces (Hemdon,

1997) e permitir a regenerao adequada da pele, evitando a ocorrncia de retrao dos

tecidos adjacentes e fonnao de cicatrizes defoiTnantes (Borojevic & Semcella, 1999).

Para a maioria dos ferimentos causados por queimaduras, a melhor opo de

cobertura o enxerto antologo (tecido do prprio indivduo) pois pode ser permanente,

uma vez que no existe risco de rejeio imunolgica. No entanto, se a disponibilidade de

rea doadora para autoenxerto limitada, outros tipos de substitutos, sintticos ou

biolgicos, podem ser utizados (Sheridan & Tompkins, 1999).

Pesquisas com biomateriais tm desenvolvido e colocado no mercado substitutos

drmicos ou compostos dermo-epidrmicos sintticos, polimricos ou de origem biolgica,

destinados ao tratamento de queimados (Balasubramani et al. 2001; Rennekampff &

Schaller, 2002).

Entretanto, apesar dos avanos no campo da bioengenharia de tecidos, os

aloenxertos de pele ainda se mantm como "padro ouro" na cobertura temporria de

queimaduras extensas e profiindas (Mackie, 2001) e tm sido preferencialmente utilizados

nesses procedimentos, em detrimento dos curativos sintticos ou de biomaterias (Richters

et a l , 1996). Este fato est relacionado comprovada diminuio da mortahdade e do

sofrimento dos pacientes, s propriedades do aloenxerto em favorecer a re-epitehzao da

rea injuriada, e simplicidade do processo de conservao e manuteno da pele em

18

Bancos de Tecidos (Bolgiani & Benain, 1993; Mackie, 1997; Freedlander et a l , 1998;

Kearney, 1998; Bravo et al., 2000; Robb et al., 2001).

As principais crticas utilizao dos enxertos algenos, se referem ao estoque

limitado de tecidos (Hemdon, 1997) e ao risco de contaminao microbiolgica (Eastlimd,

1995; Kealey, 1997; Pimay et al., 1997). No entanto, Hemdon (1997) considera que a

disponibilidade de pele para enxerto pode ser otimizada com a divulgao e sensibilizao

pblica, dirigida ao aumento da captao de tecidos. Quanto segurana, o autor faz

referncia necessidade de normas especficas de controle de qualidade nos Bancos de

Tecidos.

Nesse sentido, a Agncia Internacional de Energia Atmica (AIEA), com sede em

Viena, tem contribudo para a criao de bancos de tecidos, na promoo de encontros,

fornecimento de suporte tecnolgico, elaborao e publicao de normas e padres

aplicveis esterilizao por radiao ionizante (Pedraza, 2003).

Os bancos de tecidos devem garantir a integridade e esterilidade dos tecidos

armazenados. Uma vez que os mtodos de processamento para conservao de tecidos

(congelamento, liofilizao e imerso em glicerol concentrado) podem no ser

esterilizantes, faz-se necessrio adicionar ao processo, mtodos de esterilizao (lAEA,

2002a), que, alm de confiveis, no alterem significativamente a morfologia destes

tecidos e mantenham suas caractersticas, o mais prximo possvel das do tecido fi-esco.

Assim como determinados produtos polimricos, tecidos biolgicos no podem ser

esterilizados pelo calor, pois em temperaturas acima de 56 C ocorre desnaturao de suas

protenas. A esterilizao por xido de etileno (EtO) requer monitorao, aerao e

quarentena, para remoo dos resduos do gs (lAEA, 2002a). Dziedzic-Goclawska &

Stachowicz (1997) so da opinio de que o EtO no deveria ser utilizado para esterilizao

de aloenxertos, principalmente devido aos efeitos txicos de seus resduos e dos produtos,

potencialmente cancergenos, resultantes da reao do gs com componentes orgnicos.

A radiao ionizante, por sua vez, apresenta uma srie de vantagens: no produz

resduos radioativos, no origina substncias txicas nem oferece riscos de contaminao

(por isso no h necessidade de quarentena); a estrutura dos tecidos e uma embalagem

adequada no interferem no resultado da esterilizao; a esterilizao pode ser feita na

temperatura de armazenamento e embalagem final; e sua confiabilidade considerada

excelente (Phillips, 1997).

Existem, entretanto, importantes diferenas no mecanismo de absoro de energia

pelos tecidos biolgicos, dependendo da fonte que utilizada: raios gama dos irradiadores

19

de ^Co ou feixes de eltrons gerados em aceleradores (Dziedzic-Goclawska &

Stachowicz, 1997). Essas diferenas e os efeitos do tipo de radiao ionizante, devem ser

estudados e conhecidos para a escolha da fonte de irradiao.

Os efeitos da radiao tambm variam de acordo com o tecido irradiado e como

este foi processado e armazenado.

Em tecidos biolgicos "ex vivo", destinados a enxerto, foram constatadas diferentes

alteraes na estrutura das molculas de colgeno, em amostras de ossos e tendes,

dependendo do tipo de conservao do tecido (congelado ou liofilizado) comparados ao

tecido fresco (Dziedzic-Goclawska, 2000).

Especificamente em relao pele, vrios estudos foram realizados sobre o efeito

da radiao ionizante no tecido "in vivo". Trott et al., (1999) {apud Schmuth et al., 2001),

constataram, em modelo animal, mudanas degenerativas da epiderme, morte das clulas

epiteliais, hipoplasia, inibio da proliferao celular e ocorrncia de apoptose na

epiderme. Schmuth et al. (2001), relataram a ocorrncia de alterao funcional na

permeabilidade do estrato crneo da epidenne humana nas dermatites por radiao, em

pacientes de radioterapia por ftons e por eltrons. Outras pesquisas "in vivo" realizaram

estudos morfomtricos em fibrilas de colgeno tipo I da derme irradiada de camundongos

por baixas doses de irradiao gama. Entre eles, Leontiou et al. (1993) descreveram o

aumento de dimetro das fibrilas de colgeno, e Tzaphlidou et al. (2002), verificaram a

modificao da arquitetura da fibrila de colgeno na derme irradiada com raios gama.

A degradao do colgeno modifica suas propriedades biomecnicas (Olde Damink

et al., 1995) e conseqentemente interfere nas caractersticas biomecnicas da pele, uma

vez que essa protena fibrosa, inelstica e flexvel da derme responsvel pela integridade

e resistncia s tenses multi-direcionais a que o tecido pode ser submetido (Ottani, 2001).

O trabalho que a AIEA tem desenvolvido, resultou no criao de programas

nacionais de bancos de tecidos que utilizam a radiao ionizante para a esterilizao de

tecidos em pelo menos trinta pases, dentre os quais, o Brasil (Pedraza, 2003).

O Instituto Central do Hospital das Clnicas (ICHC) da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo (FM-USP) em convnio com o Instituto de Pesquisas

Energticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP), e financiado pela AIEA, implantou em 2000, o

primeiro Banco de Tecidos no Brasil, a utilizar radioesterilizao em tecidos conservados

em glicerol concentrado (mnimo 85%), para transplantes algenos, proporcionando a

20

viabilizao de estudos e avaliao dos tecidos submetidos a esse processo (Bourroul et al.,

2002).

Durante o binio 2001-2002, especialistas de diferentes reas do Programa de

Radiao e Bancos de Tecidos, prepararam os seguintes documentos, concludos em

agosto de 2002, que regulamentam o funcionamento dos bancos de tecidos e a utilizao

da radiao ionizante como mtodo esterilizante:

1. Padres internacionais em bancos de tecidos;

2. Cdigo de prticas para esterilizao por radiao de tecidos para aloenxerto;

3. Estratgias de conscientizao pblica para bancos de tecidos.

Para 2003-2004, um dos maiores objetivos do programa ser o de promover a

utilizao desses docimientos pelos pases participantes (lAEA, 2004).

2 OBJETIVOS

Em funo do que foi exposto, os principais objetivos deste trabalho foram:

> Avaliar os efeitos da radiao na pele conservada em glicerol concentrado por meio da

caracterizao do tecido quanto morfologia e resposta aos ensaios de resistncia

trao.

> Estabelecer procedimentos de utilizao de duas fontes distintas de radiao ionizante

para esterilizao de pele humana destinada ao aloenxerto: irradiador de ^Co e

acelerador de eltrons.

21

3 CONSIDERAES GERAIS

3.1 A PELE HUMANA

3.1.1 Funes

A pele, cuja espessura varia de 0,5 mm a 6,0 mm, reveste externamente o corpo

humano, garante a proteo do indivduo e sua interao com o meio circundante.

formada por duas camadas, epiderme e derme.

A pele ntegra uma efetiva barreira contra invaso de microorganismos, ao de

toxinas, traumas mecnicos, temperaturas extremas e baixas doses de radiao ionizante

(Schmuth et al., 2001). A proteo do organismo contra os efeitos prejudiciais dos raios

solares, especialmente dos ultra-violeta, se deve pigmentao da pele fornecida por

grnulos de melanina que, produzidos pelos melancitos, so transferidos aos

queratincitos (Junqueira & Carneiro, 1995).

Exposta ao meio ambiente, a pele capaz de responder s modificaes externas e

internas. E responsvel pela manuteno dos processos homeostticos, participa da

termorregulao corporal, dos equilbrios hdrico e osmfico, e dos processos fisiolgicos

de regulao, como na sntese de vitamina D \ colesterol e melanina (Hlaeac, 1995;

Schmuth et al., 2001). Possui um complexo sistema antioxidante, que inclui componentes

enzimticos e no enzimticos, constituindo-se na primeira defesa contra radicais livres

(Pugliese, 1998). A sensibilidade sensorial e percepo do meio extemo est relacionada s

inmeras terminaes nervosas, neurorreceptores, localizados na derme. A resposta

imunolgica da pele aos alrgenos, ocorre graas aos linfcitos presentes na derme e s

clulas apresentadoras de antgenos da epiderme (Junqueira, 1995).

A pele possui anexos - pelos, unhas, glndulas sudorparas e sebceas - com

funes protetoras especializadas (Kerr, 2000).

Danos ou perda de grandes reas de pele, tais como queimaduras extensas, podem

causar severas alteraes sistmicas, tais como, hipotermia, perda de fludos, infeces, ou

ainda, cicatrizes e alteraes na imagem corporal, ou at mesmo acarretar a morte do

indivduo. (Hlaeac, 1995; Kofler, 2001).

'A vitamina D atua no metabolismo do clcio, promovendo sua absoro pelo epitelio intestinal e reduzindo a secreo de Ca*^ pelos rins).

22

3.1.2 Morfologa :

Anatmicamente, a pele formada por duas camadas, epiderme e derme, com

caractersticas e origem embrionaria distintas, mas que possuem uma grande adeso e

interatividade. Abaixo da derme, a hipoderme formada por tecido adiposo e no faz parte

da pele; constituindo-se em tecido subcutneo de suporte e unio com os rgos

subjacentes (Junqueira & Carneiro, 1995; Herson, 1999; Kerr, 2000,).

A caracterizao das camadas da pele j foi amplamente estudada e aparece na

maioria dos artigos que abordam o assunto e nos livros-texto de histologa e dermatologia.

As descries sintticas da epiderme, membrana basal e derme, abaixo descritas, foram

baseadas em Junqueira & Carneiro (1995); Holbrook & Wolff (1999); Kerr (2000) e Koller

(2001).

3.1.2.1 Epiderme

A epiderme, que constitui a interface com o meio externo, formada por tecido

epitelial estratificado pavimentse queratinizado de origem ectodrmica com pouqussima

matriz extracelular. Geralmente muito delgada na maior parte do corpo (no ultrapassando

0,12 mm), toma-se mais espessa nas reas de constante presso e atrito, tais como solas

dos ps e palmas das mos. considerada o componente mais ativo da pele pois, medida

que a camada crnea, mais superficial, sofre descamao, constantemente substituda por

novas clulas originadas das camadas mais profimdas.

A epiderme composta por cinco camadas. As caractersticas de cada uma refletem

as propriedades mitticas e sintticas dos queratincitos e seu estgio de diferenciao:

1. Camada cmea: Formada por escamas comeas, que perderam ncleo e organelas, mas

que permanecem aderidas umas s outras e so preenchidas por queratina. Essa camada

impermevel, resistente s presses mecnicas e ao cisalhamento, s mudanas de pH e de

temperatura e digesto enzimtica. medida em que se desprendem, as escamas so

continuamente repostas por queratincitos da camada lcida.

2. Camada lcida: Ausente nas regies onde a pele mais fina, possui intensa atividade

enzimtica.

3. Camada granulosa: Os queratincitos acumulam queratohialina, protena que est

provavelmente relacionada rigidez da clula que est morrendo. Essa camada tambm

responsvel pela sntese de involucrina que exocitada acumula-se sobre as clulas

promovendo a impermeabilizao do epitelio, garantindo o equilbrio hdrico e

homeosttico do organismo.

23

4. Camada espinhosa: As clulas possuem tonofibrilas (feixes de filamentos de

citoqueratina) que juntamente com os desmossomos mantm a coeso entre as clulas e

conferem resistncia ao atrito.

5. Camada basal ou germinativa: A camada basal possui clulas indiferenciadas que

apresentam intensa atividade mittica originando continuamente os queratincitos,

medida que as clulas amadurecem, so empurradas para as camadas mais superficiais,

diferenciam-se e assumem novas funes.

3.1.2.2 Membrana Basal

A membrana basal estrutura identificada no microscpio ptico, composta pela

lmina basal (observada somente no microscpio eletrnico) e parte da matriz extracelular

da derme adjacente. A lmina basal presente no contato entre epiderme e derme,

produzida por ambas as camadas. As protenas transmembrnicas das clulas epitehais

mantm interao com as fibrilas de colgeno produzidas pelos fibroblastos, o que garante

a adeso e continuidade fsica entre as duas camadas (Alberts et a l , 1997).

A interface entre derme e epiderme papilar, o que aumenta a superfcie de contato

entre elas e permite que a pele estique sem romper .

3.1.2.3 Derme

A derme, camada mais profunda da pele, constituda por tecido conjuntivo de

origem mesodnuica, onde h maior quantidade de matriz extracelular do que clulas. A

matriz extracelular formada por grande quantidade de substncia amorfa, representada

pelos proteoghcanos, e um integrado sistema de fibras de colgeno e elastina produzidas

pelas clulas do conjuntivo, os fibroblastos. Essa camada garante a integridade fsica da

pele e tambm participa de sua regenerao.

Na derme encontram-se os vasos sangneos e linfticos que irrigam e nutrem a

epiderme, assim como os neurorreceptores que percebem estmulos tteis, variaes de

temperatura e sensaes dolorosas. Presentes nessa camada esto tambm estruturas da

epiderme como os folculos pilosos e as glndulas sebceas e sudorparas (Holbrook &

Wolf, 1999).

A derme distingue-se em duas regies: derme papilar (poro superior da derme,

adjacente epiderme) e derme reticular (regio mais profunda).

A derme papilar irregular na regio de interdi girt ao com a epiderme. E

constituda por tecido conjuntivo frouxo, fibras reticulares, fibras do sistema elsticos

24

(oxitalnicas) e muitas alas capilares. Continuamente regio papilai^ a camada reticular

da derme formada por tecido conjuntivo denso no modelado com fibras colgenas

firmementeagrupadas em feixes e fibras elsticas espessas (Gartner & Hyatt, 2001).

3.1.2.3.1 Fibras Colgenas

O colgeno constitui a famlia de protenas mais abundante nos vertebrados

superiores (Lehninger, 1976) compreendendo cerca de 25% das protenas totais do

organismo (Gartner & Hyatt, 2001). Dos 15 tipos de molculas de colgeno conhecidos, os

freqentemente encontrados nos tecidos conjuntivos so os tipos I, II, III, V e XI, sendo

todos de estrutura fibrilar (Alberts, 1997). O principal componente fibroso da derme o

colgeno tipo I, protena insolvel (Stryer, 1996), que corresponde a cerca de 75% da pele,

em peso seco. As fibras de colgeno, formadas por colgeno I, esto presentes na derme

reticular e so responsveis pela resistncia do tecido s foras de tenso. As fibras

reticulares, mais finas, so formadas por colgeno tipo III e encontram-se na regio papilar

da derme (Holbrook & Wolff, 1999).

Para reconhecer o tpo de estrutura que se observa no microscpio ptico e no

microscpio eletrnico de transmisso, necessrio entender a sntese das fibras de

colgeno.

A molcula de colgeno formada por uma tripla hlice a partir de 3 cadeias alfa

que se enrolam umas nas outras formando um tipo de corda supertorcida. Uma cadeia alfa-

hlice a estrutura secundria de um polipeptdeo formado por vrias subunidades

semelhantes, no qual um aminocido se liga com o quarto aminocido da cadeia, dando

uma volta em si mesmo. Cada cadeia de alfa-colgeno possui cerca de 1000 aminocidos e

contm 3 aminocidos por volta onde o 3 sempre ghcina (Gly) na seqncia: X-Y-Gly,

onde X e Y podem ser quaisquer aminocidos mas geralmente X prolina e Y

hidroxiprolina. O fato da Gly ser o menor aminocido da natureza (pois seu radical

apenas constitudo pelo hidrognio), que mantm as 3 cadeias alfa prximas, pois ele

ocupa o interior da molcula (FIG.3.1).

25

FIGURA 3.1 - Representao da molcula de colgeno formada por 3 cadeias alfa. O aminocido glicina est indicado em cor mais forte na regio interna da molcula (modificado de Alberts, 1997).

A sntese de colgeno se inicia no retculo endoplasmco granular (REG) onde so

formadas as 3 cadeias-alfa (cada uma possui um peptdeo de sinal na poro terminal da

molcula). Algumas prolinas e lisinas da cadeia a so hidroxiladas (insero do anion OH

nesses aminocidos) auxiliadas pelo co-fator vitamina C no Complexo de Golgi. Na falta

de vitamina C, a tripla hlice fica frgil e os tecidos conjuntivos no se mantm ntegros.

Cada cadeia alfa combina-se com duas outras formando uma molcula helicoidal de tripla

fita Ugada por pontes de hidrognio (H) e denominada de pr-colgeno. O pr-colgeno

lanado para fora do REG em vescula secretora que leva a molcula para o meio

extracelular. No meio extemo recebe o nome de tropocolgeno. Aps serem secretados

pelos fibroblastos, as molculas de colgeno agmpam-se em polmeros ordenados,

denominados fibrilas de colgeno, graas remoo da seqncia final da molcula de

colgeno (peptdeo de sinal ou pr-peptdeo), pela enzima colagenase sintetizada pelos

prprios fibroblastos. O peptdeo de sinal tem a funo de guiar a formao intracelular da

fita tripla e impedir a formao de fibrilas dentro da clula. As fibrilas de colgeno

normalmente se agregam em fibras de colgeno. As fibras de colgeno se agregam em

feixes de colgeno (Alberts, 1997). As fibras e feixes de colgeno podem ser observados

no microscpio ptico. As fibrilas de colgeno podem ser individuazadas somente no

microscpio eletrnico. A FIG.3.2, sintetiza o que foi descrito.

26

feixe

^^0=1 fibra fibrila

regio de superposio

tropocolgeno

regio lacunar

FIGURA 3.2 - Estrutura da fibra de colgeno: as fibras de colgeno so formadas por unidades menores, as fibrilas, constituidas por macromolculas denominadas tropocolgeno que esto paralelamente organizadas. O tropocolgeno formado por trs cadeias peptdicas de estrutura alfa- ligadas por pontes de hidrognio (modificado de Gartner & Hyatt. 2001).

A estrutura da molcula proteica de colgeno mantida, em grande parte, graas s

pontes de hidrognio que mantm a estrutura da alfa-hlice e est presente entre molculas

alfa-hlice, formando a molcula tripla-hlice (FIG.3.3). Esse tipo de ligao ocorre devido

ao aspecto altamente eletronegativo do tomo de oxignio, que em ligao covalente com o

hidrognio, tende a atrair o seu nico eltron. O hidrognio assume carga positiva parcial

local, enquanto que o oxignio fica com carga negativa parcial local na zona das rbitas

no compartilhadas. Na regio em que pores de molculas se aproximam muito ocorre

atrao eletrosttica entre a carga negativa parcial do tomo de oxignio de uma poro da

molcula e a carga positiva parcial do tomo de hidrognio ligado covalentemente a outro

tomo eletronegativo. Essa unio eletrosttica denominada ponte de hidrognio

(Lehninger, 1976).

27

Pontos de hidfngpnio iniertvidow

QO Oo c O ViM,i (lo.ill.i

FIGURA 3.3 - Pontes de hidrognio na molcula de colgeno: (A) entre tomos que formam a alfa-hlice (intra-molecular); (B) entre as trs molculas alfa que formam o tropocolgeno (intermolecular), (modificadas de Lehninger, 1976).

As pontes de hidrognio nas molculas proteicas so relativamente fracas se

comparadas s ligaes covalentes. A ttulo de comparao, a ponte de hidrognio entre O

e H tem uma energia de ligao'^ de 4,5 kcal/mol enquanto a ligao covalente entre O e H

possui uma energia de ligao de 110 kcal/mol. Num sistema aquoso, como nos tecidos

biolgicos, as molculas de gua competem para formar pontes de hidrognio com as

molculas de protena. Por outro lado, a formao da primeira ponte de hidrognio entre

molculas de peptdeos, por questes geomtricas, favorece muito a formao da segunda

ligao, esta segunda ligao aumenta a probabilidade de se formar uma terceira, e assim

por diante, resultando numa ligao muito forte entre duas ou mais cadeias peptdicas. Essa

facilitao de formao de pontes de hidrognio chamada de cooperatividade,

caracterstica das molculas proteicas que podem conter at milhares de ligaes

cooperativas de pontes de hidrognio (Lehninger, 1976).

Alm das ligaes por ponte de hidrognio, j citadas, o reforo intra e

intermolecular tambm dado por ligaes covalentes cruzadas entre as lisinas que

compe as molculas de colgeno. Se a ligao cruzada inibida, a fora tensora das

fibrilas reduz e o tecido toma-se frgil (Alberts, 1997; Stryer, 1992).

possvel identificar o colgeno com coloraes especficas, em lminas

histolgicas. A colorao com tricromo de Mallory, por exemplo, comumente utilizada

C(MSSO W!CIOM\L D EUEHm ^SJCLEAR/SP-IPEN

28

para diferenciao entre fibras de colgeno e fibras musodares, entretanto, no apresenta

resultados satisfatrios para distino entre os tipos de colgeno (Montes, 1996).

Montes (1996) afirma que o mtodo picrosirius um processamento histoqumico

especfico para deteco de colgeno em cortes histolgico. As molculas de colgeno

possuem uma orientao paralela, uma em relao s outras, que lhe conferem uma

birrefringncia natural. O corante "sirius red" alinha-se paralelamente ao longo eixo de

cada uma das molculas, realando sua birrefringncia; a incidncia de luz polarizada cria

uma imagem brilhante e colorida das fibras de colgeno que se destacam de outras

estruturas no orientadas. Pela diferena de intensidade e cor, possvel distinguir os tipos

de colgeno do tecido observado. Assim, o colgeno tipo I forma fibras espessas {fibras

colgenas) que apresentam intensa birrefiingncia de colorao amarela ou vermelha. O

colgeno tipo III forma fibras finas {fibras reticulares) frouxamente dispostas e por isso

apresentam birrefringncia esverdeada

Estudos de microscopia eletrnica mostram o colgeno tipo I como grossas fibras

formadas por uma srie de fibrilas densamente empacotadas. Observadas no microscpio

eletrnico de transmisso, as fibrilas de colgeno apresentam estriaes transversais

caractersticas a cada 67 mn, o que reflete a alternncia regular das molculas de colgeno

(tropocolgeno) paralelamente ordenadas na fibrila (FIG. 3.2). O corante penetra na regio

lacimar, preenchendo o espao entre as molculas e formando bandas coradas fortemente

(Alberts, 1997). Stryer (1996) atenta para o fato de que as fileiras de tropocolgeno no

esto em fase, indicando que as fileiras adjacentes esto deslocadas de aproximadamente

67 nm. Em recente estudo Tzaphhdou (2004) descreve a no uniformidade das bandas mas

a ocorrncia de 12 bandas de diferentes espessuras, denominadas "perodo D".

3.1.2.3.1 Fibras Elsticas

Uma rede de fibras elsticas na derme fornece a elasticidade pele, de tal modo que

aps uma distenso temporria, o tecido volta conformao original. O principal

componente das fibras elsticas a elastina, protena hidrofbica rica em prolina e lisina

(assim como o colgeno). Alberts (1997) descreve a formao das fibras elsticas e seus

trs tipos: oxitalnicas, elaunnicas e elsticas. Existe uma aumento de complexidade da

fibras oxitalnica para a elstica. A fibra oxitalnica constituda apenas por microfibrilas

agrupados; a elaunnica apresenta substncia amorfa (elastina) entre as microfibrilas e as

fibras elsticas apresentam um cerne de elastina circundado por microfibrilas (Alberts,

^ Energia de ligao a energia necessria para romper uma ligao entre os, tomos.

29

1997; Gartner & Hyatt, 2001). Existe uma continuidade entre as fibras elsticas,

elaunnicas e oxitalnica, da regio mais profimda da derme at a regio papilar.

Montes (1996), descreve os principais mtodos de colorao para fibras elsticas,

que so precedidos por digesto com elastase. Entre esses mtodos, a colorao por

resorcina-fiicsina de Weigert a mais sensvel e ainda cora fibras elaunnicas. As fibras

oxitalnicas so coradas quando previamente feita uma oxidao com oznio

aquoso 10%.

Ao mVel ultraestrutural, as fibras elsticas compreendem um cerne com abundante,

homogneo e amorfo material rodeado de microfibrilas.

3.1.3 Caracterizao Biomecnica da Pele Humana

As caractersticas biomecnicas da pele so determinadas principalmente pela

direo e resistncia apresentadas pela rede de colgeno da derme mais profunda e pelas

fibras oxitalnicas locahzadas na derme papilar. Biomecnicamente, a pele no se

comporta como um material homogneo. Segundo Gibson (1967), a anUse de uma lmina

histolgica de pele que foi fixada em estado relaxado, mostra fibras colgenas dispostas

aparentemente ao acaso. No entanto se a pele mantida distendida durante a fixao, as

fibras apresentam-se orientadas no sentido do alongamento; quanto maior a fora a que a

pele submetida, maior a quantidade de fibras colgenas alinhadas. Submetidas baixa

tenso, as fibras de colgeno deslizam com relativa facilidade umas sobre as outras e a pele

distende. medida em que as fibras tomam-se alinhadas, a resistncia contra o

estiramento aumenta e necessrio aplicar uma fora maior, que acaba provocando a

deformao do tecido e, finalmente, seu rompimento.

Recentemente, Noorlander (2002) desenvolveu um mtodo para determinar

mudanas mensurveis na orientao das fibras colgenas na derme resultantes de tenses

mecnicas. Baseando-se em mtodo descrito por Junqueira (1979) opw/Noorlander (2002)

de colorao com picrosirius e observao com microscpio de epipolarizao, o autor

converte imagens digitais em imagens binarias que so analisadas quantitativamente.

A epiderme tambm contribui para a caracterizao biomecnica da pele. Chistolini

(1999) sugere que a fora biomecnica da epideraie devida s junes adesivas

intercelulares e reao tenso oferecida pelo citoesqueleto, En-e os queratincitos

estabelecem-se junes adesivas (desmossomos) que mantm as clulas muito unidas

mesmo quando morrem, as escamas comeas permanecem aderidas superfcie do epitelio

por causa das junes adesivas.

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Os estudos biomecnicos podem ser realizados em equipamentos especicos. A

Mquina Universal de Ensaios Instron, modelo 5567, do CTR/DPEN possui cmara para

ensaios a temperaturas de -70C a 250C, mdulos de carga de 1 kN e de 10 kN e conjunto

de garras adequadas para materiais rgidos, semi-rgidos e no rgidos. Possui tambm

sistema pneumtico de ajuste de garras para fixao das amostras. Na Mquina Universal

de Ensaios Instron, podem ser realizados ensaios de trao, compresso e flexo. (FIO.3.4).

O sistema de comando e aquisio de dados composto por microcomputador PC e

programa Merlin 2.21, e impressora matricial.

FIGURA 3.4 -Mquina Universal de Ensaios Instron.(A) Aspecto geral , controles e sistema computacional. (B) Garras segurando corpo de prova..

3.2 ALOENXERTO

A possibilidade de armazenamento de pele humana para posterior aproveitamento

como enxerto no recente. Desde o inicio do sculo XX, vrios so os registros de

estudos do desenvolvimento de diferentes mtodos de conservao.

PHILLIPS (1997) alirma serem o congelamento, a liofilizao e a imerso em

glicerol concentrado, os principais mtodos de conservao utilizados em Bancos de

Tecidos A retrigerao mtodo freqentemente empregado para conservao de

autoenxertos, no sendo apropriado para armazenagem de enxertos por longo tempo pois a

viabilidade da pele no refrigerador de apenas 14 dias.

No processo de congelamento so empregadas substancias crioprotetoras como o

glicerol em baixas concentraes (de 5% a 30%) que promovem uma diminuio do ponto

de congelamento da soluo. Os crioprotetorea ajudam a diminuir a formao de cristais de

gelo, que so muito prejudiciais viabilidade das clulas cutneas. A pele congelada deve

31

ser armazenada em freezer -80C e para sua utilizao^deve-se proceder a um rpido

descongelamento e inativao do crioprotetor (Phillips, 1997).

A liofdizao um mtodo de conservao bastante utilizado pois inativa as

enzimas que provocam autlise das clulas logo aps sua morte, sem porm, desnaturar as

protenas, garantindo as propriedades estruturais importantes do enxerto. Nesse processo

combina-se congelamento e secagem a vcuo, durante o qual a gua removida da clula

no estado congelado. (Gava, 1979). Tecidos biolgicos liofilizados devem ter um contedo

de umidade residual menor do que 5%, podem ser mantidos temperatura ambiente,

reidratam-se facilmente e mantm sua estrutura inicial. (Phillips, 1997). Ainda que inative

algumas formas vegetativas de microorganismos, como alguns tipos de fungos e bactrias,

que necessitam de nveis de umidade ao redor de 30% para desenvolver suas atividades

metablicas (Gava, 1979), a liofihzao no esteriliza os tecidos (IAEA, 2002'*).

O glicerol em altas concentraes (acima de 85%) pode ser utilizado como

conservante de tecidos biolgicos a longo prazo (Pigossi et al., 1971) . Ao desidratar a

pele, o glicerol preserva sua estrutura, pois substitui a gua extrada das clulas e distribui

a gua remanescente pelo tecido (Marshall, 1995; Richters, 1996). Alm disso, no afeta as

fibras de colgeno e elastina presentes na derme (Richters, 1996). Aliado simplicidade

tcnica da conservao, o glicerol apresenta ainda ao bacteriosttica comprovada

(Baare,1994; Marshall, 1995). Os autores recomendam, porm, a utilizao dos enxertos

somente aps, no mnimo, quatro semanas, para garantir a efetividade do processo. A

utilizao de um mtodo de esterilizao aliada conservao em glicerol contribui, entre

outras vantagens, para diminuir o tempo de quarentena dos enxertos.

Os tecidos adequadamente conservados so armazenados em Bancos de Tecidos.

Em So Paulo, o Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clnicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (BT-ICHC) referncia na

conservao e armazenagem de pele humana destinada a aloenxerto.

Herson (2004) descreve os procedimentos e os rgos responsveis pela seleo de

doadores, os critrios para aceite ou recusa do doador (entre eles os resultados da sorologia

e microbiologia), a retirada com dermtomo eltrico e avaliao do tecido.

Resumidamente, so considerados doadores para transplante de pele, idivduos

entre 15 e 60 anos dos quais se conhece os antecedentes mdicos, em morte cerebral

(considerados tambm doadores de rgos) ou doadores cadver aps parada cardaca. A

disponibilizao de tecidos humanos para transplante foi regulamentada no Brasil pela Lei

n 9.434 (1997), cujo contedo estabelece critrios para a retirada de tecidos de doadores in

,A0 !#JO*L D Wmh NUCLE'lR/SP-iPEf'

32

vivo ou post mortem ('precedida de morte enceflica) para transplante ou outras

modalidades de tratamento.

So excludos como doadores os portadores de: doenas autoimunes; enfermidades

malignas (cncer, carcinoma, leucemia, linfoma, sarcoma., nevus malignos, nevus

mltiplos benignos); doenas transmissveis bacterianas ou virais, tais como: tuberculose,

Aids, hepatite, doenas venreas. Outras manifestaes que excluem o doador, podem ser:

infeces na pele, dermatites, leses inflamadas ou abrases na rea; intoxicaes por

agentes qumicos. Tambm no so aceitos como doadores, os indivduos que tenham

pertencido a grupos de risco quanto ao comportamento sexual promscuo, consumidores de

drogas injetveis e tatuados (a menos de 12 meses). Por meio dos exames sorolgicos do

doador, podem ser detectadas patologias no diagnosticadas.

A pele destinada pesquisa no caso de resuhados desfavorveis da triagem ou dos

testes microbiolgicos e sorolgicos.

3.3 ESTERILIZAO

O conceito de esterilidade refere-se inativao ou destruio de microorganismos

capazes de reproduo. O nvel de eficcia obtido com determinado processo esterilizante

aceito para itens que apresentem a probabilidade de serem no estreis, a um nvel de

garantia de esterilidade ou Sterility Assurance Levei (SAL) igual ou superior a 10'^. "Esta

definio de esterilidade, como funo probabilstica, no significa porm inferir que se

admita a no esterilidade de um em cada milho de unidades e sim agregar cuidados

adicionais que efetivamente, permitam o emprego seguro do produto" (Pinto, 2000).

3.3.1 Esterilizao por Radiao Ionizante

A inativao de microorganismos por agentes esterihzantes envolve dano

irreversvel de molculas essenciais clula (DNA, protenas). Da mesma forma, a

exposio a estes agentes pode provocar danos ao tecido (Pinto, 2000).

Tecidos biolgicos no podem ser esterilizados pelo calor em funo da

desnaturao de suas protenas; a utilizao de xido de etileno tambm no

recomendvel pois libera resduos txicos que ficam impregnados no tecido.

A radiao ionizante, de acordo com Phillips (1997), apresenta imia srie de

vantagens como agente esterilizante de tecidos biolgicos, quando comparada aos mtodos

33

tradicionalmente utilizados para esterilizao de produtos mdico-hospitalares (citados

acima):

> no produz resduos radioativos, no origina substncias txicas nem oferece riscos de

contaminao;

> a estrutura do tecido no interfere na esterilizao;

> os tecidos podem ser esterilizados na embalagem final e temperatura de

armazenamento;

> no h necessidade de quarentena e a confiabilidade excelente.

Os princpios adotados no cdigo de prticas para a esterilizao de tecidos

destinados aloenxerto por radiao ionizante, so similares queles usados para

esterilizao de produtos para cuidados com a sade (lAEA, 2002b), isto , a referncia

normativa para o estabelecimento da dose esterilizante a ISO 13409 (1996), que

estabelece 25 kGy a dose esterilizante. Entretanto, os vrus so mais radiorresistentes do

que outros microorganismos e para garantir a esterilidade nos casos de contaminao viral

necessrio irradiar os tecidos com doses mais elevadas. Sulvan (1971) encontrou

valores de dose entre 35kGy e 48kGy para inativao de vrus irradiados em suspenso de

meio mnimo Eagle.

O efeito da radiao ionizante nos tecidos vivos bem conhecido. Especificamente,

a radiao gama altera o colgeno tipo I da derme em sua estrutura molecular e ocorre

aumento da fireqncia de formao de feixes anormais (Tzaphlidou, 2002).

Em tecidos para aloenxerto, estudos realizados com amostras de tendes e ossos

"firescos", indicam que radicais Uvres (principalmente OH) formados pela radilise da gua

disponvel nos tecidos, promovem 'cross-linking' (ligaes cruzadas) entre as molculas de

colgeno, tomando-as mais unidas. A ciso das cadeias de polipeptideos do colgeno

ocorre predominantemente quando o ossos e tendes so irradiados em amostras

Ik^lizadas, onde no h disponibilidade de gua no tecido (Dziedzic-Goclawska, 2000).

3,4 RADIAO IONIZANTE

A absoro de energia da radiao nos materiais pode induzir a uma excitao ou

ionizao. O aumento do nvel de energia de um eltron em um tomo ou molcula sem

sua ejeo denominado excitao. Se a radiao tem suficiente energia para ejet-lo a um

ou mais orbitais do tomo, o processo denominado ionizao, e esta radiao dita

radiao ionizante. As radiaes ionizantes podem ser emitidas por elementos com ncleos

34

atmicos instveis ou produzidas em equipamentos conhecidos como fontes intensas de

radiao (Spinks, 1990). As radiaes ionizantes so classificadas em eletromagnticas e

particuladas.

A seguir, sero caracterizadas apenas os tipos de radiao que sero utilizadas no

processamento das amostras neste trabalho (a caracterizao de todos os tipos de radiao

ionizante podem ser encontrados em Spinks, 1990).

3.4.1 Radiao Gama

Os raios gama so emitidos por istopos radioativos; representam o excesso de

energia que lanada pelos ncleos instveis que decaem para formar elementos estveis

(Hall, 1994). So radiaes eletromagnticas de origem nuclear, com pequeno

comprimento de onda, monoenergticas ou com ura pequeno nmero de energias discretas.

O ^Co, por exemplo, emite ftons de energia igual a 1,332 e 1,173 MeV.

Os raios gama tendem a perder a maior parte de sua energia em uma nica coliso. O

resultado que quando uma frao dos raios gama colide com a completamente

absorvida mas os ftons restantes so transmitidos com sua energia inicial total.

No caso do ^Co a interao da radiao com a matria se d, principaknente pelo

efeito Compton, no qual um fton interage com um eltron livre ou com um eltron

fracamente ligado a um tomo. Uma parte da energia do fton incidente transmitida ao

eltron que acelerado e ionizado; a outra parte da energia utilizada na criao de um

outro fton, com energia menor que a do fton incidente.

A energia total transferida pela absoro Compton, em qualquer volume,

diretamente proporcional densidade eletrnica do meio irradiado. O efeito Compton

predomina para energias de ftons entre 1 e 6 MeV. O efeito Compton pode ser tratado

como um choque elstico entre o fton e o eltron (HALL, 1994).

3.4.2 Feixe de Eltrons

Os eltrons so partculas muito pequenas e leves, com carga negativa.

Os feixes de eltrons podem ser produzidos por Aceleradores Industriais de Eltrons,

por um ctodo aquecido, por onde passa uma alta corrente que provoca uma sada de

eltrons do material. Esses eltrons so acelerados por uma diferena de potencial aplicada

entre o ctodo e o nodo. A formao dos feixes de eltrons est condicionada ao

funcionamento dos aceleradores. Uma vez desligado o aparelho no h emisso de

Omskj HKiOt^i ENER%.! P4LIC.LEA.R/SP-IPEM

eltrons. O feixe de eltrons possui alta taxa de dose porm com baixo poder de penetrao

na matria.

O feixe de eltrons monoenergtico, e por meio da variao do potencial aplicado

acelerao dos eltrons possvel variar a energia cintica dos mesmos aumentando seu

poder de penetrao. A trajetria do eltron no linear; os eltrons so desviados e

seguem um caminho em "zig-zag" conforme vo perdendo energia para a excitao

eletrnica ou ionizao dos tomos, de tal forma que o alcance menor do que a trajetria.

Os eltrons podem provocar diversos eventos ao longo de sua trajetria. Em

materiais, cuja densidade prxima a 1,0 (pele humana, por exemplo), a dose aumenta nos

primeiros centmetros de profundidade em decorrncia do aumento do nmero de eventos,

devido aos eltrons secundrios. Imediatamente abaixo da superfcie um pequeno volume

do material, interage com os eltrons secundrios gerados do feixe primrio de eltrons na

regio e fora da regio por espalhamento. Desse modo, os tomos do material interagem

com eltrons retro-espalhados vindos de todas as direes. Um pouco mais abaixo da

superfcie o nmero de eltrons secundrios cai, assim como o feixe primrio atenuado

(Spinks, 1990).

3.4.3 Efeito Direto e Efeito Indireto da Radiao Ionizante

A aherao qumica de uma macromolcula, cujos eltrons foram ejetados

ocasionada por colises com partcula carregada de alta energia ou atravs da ionizao

direta por ftons. Este efeito denominado efeito direto da radiao ionizante. O efeito

indireto devido aos radicais hvres e molculas muito reativas produzidos pela radiao

em meio aquoso (Biral, 2002).

Alexander (1967) descreve de maneira bem completa, as interaes, atravs dos

efeitos direto e indireto, da radiao iorzante com as macromolculas biolgicas.

3.5 FONTES DE RADIAO IONIZANTE

3.5.1 Irradiador de Cobalto 60 ( "Co)

As fontes de ^Co so fontes seladas que apresentam o ncleo radioativo de cobalto

em um compartimento hermeticamente fechado, que no tem contato direto com os

materiais externos. O ^Co utilizado nas fontes de irradiao produzido pela irradiao do

de ^^Co, istopo estvel, sendo formado por uma reao de captura de 1 nutron.O ^Co

decai com uma meia-vida de 5,27 anos para o istopo estvel ^Ni: pCo Ni + e'

36

O decaimento caracterizado pela emisso de dois ftons gama, com energias de

1.17MeV e l,33MeV, com eficincia de aproximadamente 100% para os dois ftons, e

emisso de partcula p, que no atinge o material a ser irradiado pois barrada pela

blindagem da fonte.

O irradiador GammaceU-220, do Centro de Tecnologa das Radiaes do Instituto de

Pesquisas Energticas e Nucleares (CTR-IPEN/SP), possui 48 lpis de ^Co de 20cm de

altura que circundam internamente a cmara primaria totalmente isolada; essa disposio

do material radioativo garante uniformidade de dose numa altura de 10 cm do material pois

as regies superior e inferior do cilindro recebem uma dose 15% menor. As amostras so

colocadas na cmara secundria, com dimenses limitadas a altura de 20.47 cm e dimetro

de 15.49 cm^, e volume total de 3,9 litros. A cmara secundria desce at a meia altura da

fonte por um sistema de elevador numa velocidade de 2.8 seg. Dentro da cmara

secundria podem ser colocados atenuadores de dose, de chumbo, com diferentes

espessuras para 50%, 70% e 90% de atenuao (Silva, 2002) (FIG.3.5).

FIGURA 3.5 - Irradiador de cobalto-60 Gammacell-220. (1) cmara secundria com recipiente para amostras; (2) cmara primria (3) Painel de controle.

S7

O tempo de irradiao, determinado pela taxa de do^e do irradiador, programado no

painel de controle e o trmino da irradiao ocorre automaticamente. As taxas de dose do

irradiador so calculadas mensalmente devido ao decaimento do Co ' .

5.2 Acelerador de Eltrons

No acelerador, os eltrons so produzidos em um ctodo aquecido mantido em uma

regio de potencial mais elevado. Estes eltrons so ento acelerados por uma diferena de

potencial aplicada entre o ctodo e o nodo.

Com a acelerao, os eltrons adquirem energia suficiente para atravessar a janela

de sada, constituda de uma folha fina de titnio (espessuras entre 20 e 40 \im), que

apresenta resistncia mecnica suficiente para suportar a presso atmosfrica do exterior.

Toda a regio de produo e acelerao dos eltrons mantida em alto vcuo para permitir

que a focalizao e a acelerao do feixe em direo janela sejam adequadas. O

acelerador de eltrons deve ser blindados ou estar contido em uma cmara de irradiao

construda em concreto para conter os feixes de raios-X gerados pelo freamento de eltrons

de alta energia.

O produto da intensidade do feixe ou corrente eltrica formada pelos eltrons em

movimento (expressa em mA), pela energia do feixe (expressa em eV), corresponde a

potncia do feixe de eltrons. A potncia mdia do feixe de eltrons est diretamente

relacionada com a taxa de dose de irradiao (SILVA, 2002).

SILVA (2002), descreve os principais componentes do JOB-188 do CTR/IPEN

utilizado nos experimentos. Este acelerador possui energia varivel entre 0,5 e 1,5 MeV,

corrente de at 25 mA e a taxa de dose pode variar de 1,07 kGy/s a 161,67 kGy/s.

O sistema de varredura ("optical and sean system") contm vrias bobinas que so

utilizadas para centralizar e varrer o feixe de eltrons de 60 a 120cm. Essas bobinas

polarizadas determinam a freqncia de varredura. O sistema de vcuo no Dynamitron

JOB 188 utiliza uma bomba mecnica de vcuo e tmia difusora para chegar a um valor de

10" Torr (FIG.3.6). Ficam em vcuo o filamento, parte interna do tubo de acelerao e o

sistema de varredura que fechado pela janela de titnio.

38

FIGURA 3.6 - Acelerador de eltrons Dynamitron JOB-188. (1) sistema de varredura; (2) bomba de vcuo; (3) bandeja com suporte para amostras; (4) esteira transportadora.

39

4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS

Foram utilizadas amostras de pele humana para aloenxerto de espessura parcial,

(FIG.4.1) retiradas de doador de mltiplos rgos, com dermtomo eltrico, conservadas

em glicerol concentrado (mnimo 85%). As amostras foram cedidas pelo Banco de Tecidos

do histituto Central do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de

So Paulo.

As amostras embaladas receberam sensor indicador de radiao e dosmetro. Para

amostras irradiadas com gama foi utilizado o dosmetro de polimetilmetacrilato Red

Perpex, com range de 5 a 50 kGy. Para amostras irradiadas no acelerador de eltrons foi

utilizado o dosmetro de nitrato de celulose CTA Fuji, com range de 5 a 300 kGy.

No irradiador de ^Co, as amostras foram acondicionadas em recipiente plstico

cilndrico com tampa (14 cm de dimetro e 20 cm de altura) revestido com espuma de

poliuretano

FIGI.TIA 4.1 Exemplo de amostras de tiras de pele de espessura parcial acondicionadas em embalagem selada trmicamente, com identificao de que o material foi irradiado (seta).

40

4.1.2 IRRADIADORES

4.1.2.1 Irradiador de Cobalto-60

As amostras foram irradiadas no irradiador Gammacell-220, do Centro de

Tecnologia das Radiaes do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (CTR-

IPEN/SP). Em outubro de 2003, a atividade da Gammacell-220 era de 5,54 kCi e a taxa de

dose 4,58 kOy/h.

4A.2.2 Acelerador de Eltrons

O acelerador de eltrons modelo JOB-188 do Centro de Tecnologia das Radiaes do

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (CTR-IPEN/SP), foi ajustado para atingir os

seguintes parmetros de irradiao:

> Energia dos eltrons: 0,73 MeV (clculo em funo da espessura e da densidade da

pele, considerada a mesma do glicerol em que estava imersa, 1,26 g/cm^).

> Corrente: 0,4 mA.

> Freqncia de varredura do feixe de eltrons: lOOHz.

> Velocidade do sistema de transporte (esteira ou bandeja): 3,36 m/min.

> Taxa de dose: 2,44 kGy/s.

> Tempo de exposio da amostra ao feixe de eltrons: 0,5 seg.

Nas condies descritas a dose por uma passagem da amostra sob o feixe de eltrons

foi de 1,0875 kGy.

4.1.3 ENSAIOS BIOMECNICOS DE TRAO

4.1.3.1 Corte do corpo de prova

O corte do corpo de prova foi feito com faca de ao em formato padro de halteres

{'dumbbel') montada em suporte de madeira, com dimenses de acordo com a norma

ASTM D 638: comprimento total de 50 mm e extensmetro (G) com largura de 4 mm e

comprimento de 30 mm. (FIG. 4.2 A e B).Pira realizao dos cortes, as amostras de pele

foram apoiadas em placa de acrlico com a epiderme voltada para cima; sobre ela foi

colocada a faca com a parte cortante voltada para a pele. O corte foi feito com ajuda da

prensa hidrulica Carver modelo C com carga de 1500 kg.

41

FIGURA 4.2 - (A) Faca de ao, em formato de halteres, para corte de corpo de prova, montada em suporte de madeira; (B) dimenses do corpo de prova; (G) extensmetro; (C) corpo de prova de pele.

4,1.3.2 EnsaJos de resistncia trao

Os ensaios de resistencia trao foram realizados na Mquina Universal de

Ensaios Instron, modelo 5567, do CTR/IPEN temperatura ambiente, com mdulo de

carga de 1 kN e garras adequadas para materiais no rgidos.

4.1.4 ESTUDOS MORFOLGICOS

4.1.4.1 Microscpio ptico

As observaes das lminas histolgicas e registros fotogrficos foram realizados

no microscpio ptico Axioplan Cari Zeiss, binocular (ocular lOx e objetiva 40x), dotado

de filtro polarizador e cmara fotogrfica, do Laboratrio de Biologa Molecular do IPEN

(LBM/IPEN).

4.1.4.2 Microscopio eletrnico de transmisso

O estudo ultra-estrutural foi realizado no microscpio eletrnico de transmisso

JEOL JEM-IOOCXII a uma voltagem de 80kV, do Instituto de Cincias Biomdicas da

Universidade de So Paulo (ICB/USP).

CCMSSO HKKmi De EMERilA PiJCLEAR/SP-iPEl

42

4.2 MTODOS

Antes de seu incio, este projeto foi submetido e aprovado pelo Comit de tica em

Pesquisa do Ipen, processo nmero 028/CEP-IPEN/SP (ANEXO A).

Foram disporbilizadas para pesquisa pelo BT-ICHC pele, conservada em glicerol

concentrado (mnimo 85%) de oito doadores (ANEXO B).

4.2.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS

De cada doador, foram selecionados conjuntos de amostras de pele por meio da

tcnica de amostragem sistemtica (VIEIRA, 2000) limitando a espessura das amostras

entre 0,15 mm e 0,25 mm. A espessura foi medida com paqumetro com preciso de

0,05 mm (Mitutoyo), antes e aps a irradiao.

As tiras de pele selecionadas como amostras foram cortadas em retngulos de

aproximadamente 6,0 x 5,5 cm e seladas trmicamente em embalagem poli-nylon 5

camadas, com espessura de 0,05 mm e densidade de 1,15 g/cm^. Na face extema da

embalagem foi fixada o identificador de irradiao (FIG.4.1) e o dosmetro adequado para

o tipo de irradiao utilizado.

As amostras levadas para o irradiador de ^Co foram acondicionadas em recipiente

plstico cilindrico tampado. Para evitar o aquecimento das amostras devido ao tempo de

irradiao (5h45min para dose de 25 kGy e l lhSlmin para dose de 50 kGy) foi adicionado

gelo picado dentro do recipiente com as amostras.

Para irradiao com dose de 25 kGy foram selecionados trs conjimtos de amostras

de seis doadores. O primeiro conjimto de amostras foi mantido nas condies iniciais, no

irradiado, denominado gmpo controle. O segundo conjunto de amostras foi submetido

irradiao gama em irradiador de ^Co, Gammacell-220. O terceiro conjunto de amostras

foi exposto ao feixe de eltrons, temperatura ambiente, com sistema de transporte de

esteira no Acelerador Dynamitron JOB 188.

Estudos comparativos, do sistema de transporte no acelerador de eltrons - esteira e

bandeja - na dose de 25kGy temperatura ambiente e em recipiente resfriado com gelo,

foram realizados em amostras de oito doadores.

Para irradiao com dose de 50 kGy foreim selecionados trs conjuntos de amostras

de trs doadores. O primeiro conjunto de amostras foi mantido nas condies iniciais, no

irradiado, denominado grapo controle. O segundo conjunto de amostras foi submetido

43

irradiao gama em irradiador de ^Co, Gammacell-220. O terceiro conjunto de amostras

foi exposto ao feixe de eltrons no Acelerador Dynamitron JOB 188.

Para estudo do efeito de doses crescentes sobre os valores do mdulo de

elasticidade da pele irradiada em comparao pele no irradiada foram selecionadas

amostras de trs doadores para as doses de 15, 25, 30, 40 e SOkGy no irradiador gama e

para as doses de 5, 10, 20, 25, 40 e SOkGy no acelerador de eltrons.

4.2.1.1 Manipulao do material biolgico e instrumentos

Todas as amostras foram manipuladas com equipamento individual de proteo,

isto , luvas de procedimento, mscara cirrgicas e avental, em laboratrio adequado. O

equipamento utilizado (faca de corte, Instron) foram higienizados com lcool ethco 70%

antes e aps sua utilizao. Os instrumentos cirrgicos (pina, bistur, tesoura, frascos)

foram lavados com sabo lquido especial 'Extran', em seguida embalados em envelope

grau cirrgico e autoclavados. O material plstico, que no suporta autoclavagem, foi

embalado adequadamente e esterilizado com radiao ionizante a 25 kGy.

4.2.1.2 Descarte do material biolgico

A pele descartada durante os experimentos foi mergulhada em frasco tampado com

hipoclorito de sdio. O descarte final foi feito em saco plstico apropriado, e o material foi

ento autoclavado. Aps esse procedimento, reahzado no prprio laboratrio, o material

foi embalado em saco branco e depositado em "container" prprio para descarte de

material biolgico de acordo com a NBR-ABTN 12809/1993, que dispe sobre o manuseio

de resduos de servios de sade, e a Portaria Estadual CVS 01, de 18 de janeiro de 2000,

que estabelece que a unidade (laboratrio de pesquisa) deve instituir aes para garantir o

princpio da biossegurana nos programas de garantia da qualidade.

4.2.2 ENSAIOS BIOMECNICOS DE RESISTNCIA TRAO

Aps a irradiao e antes dos ensaios biomecnicos, as amostras foram lavadas em

soluo salina 0,9% estril e mergulhadas em nova soluo por 15 minutos para retirada do

glicerol, reidratao e recuperao das caractersticas fsicas normais do tecido como a

maleabilidade e opacidade (HERSON, 1999), simulando as condies rotineiras de uso no

cenfro cirrgico.

44

Os ensaios de resistncia trao foram realizados segundo a norma ASTM D638

(1977) na Mquina Universal de Ensaios Instron com o mdulo de carga de 1 kN (FIG.

3.4). Nos ensaios, o corpo de prova (FIG. 4.2 C) foi fixado a uma distncia de 27 mm entre

garras e submetido trao at a ruptura da amostra. A velocidade de afastamento das

garras foi de 30 mm/min. Os ensaios foram realizados temperatura ambiente de

aproximadamente 23 C e umidade relativa do ar de 50 %.

Os grficos, obtidos com o programa Merlin 2.21 da Mquina de Ensaios Instron,

apresentaram a curva da relao entre a tenso de trao aplicada e o correspondente

alongamento da amostra.

A resistncia trao na ruptura representada pela tenso ou "stress" (a, em MPa)

que a razo entre a fora aplicada (F, em N) e a rea da seo transversal (A, em mm):

a = F/A (1)

A deformao ou "strain" (s, em mm/mm) da amostra o resultado da variao do

comprimento (L) pelo comprimento inicial (Li):

s = L / L i ; sendo que L = L 2 - L 1 (2)

onde, L2= comprimento final.

O mdulo de elasticidade (E) foi calculado na poro linear da curva, como

ilustrado na FIG.4.3, dividindo-se a variao de tenso ("stress") correspondente a urna

seco do segmento, pela correspondente variao de alongamento ("strain"):

E = Aa/As ou E = oi-ai /s2- i (3)

O mdulo de elasticidade (E) ou mdulo de Young a relao entre a tenso e o

alongamento do tecido, na regio elstica da curva. Assim, quanto mais resistente o tecido

ao alongamento, maior o valor do mdulo de elasticidade.

A FIG.4.3 ilustra o procedimento de clculo do mdulo de elasticidade no grfico

obtido pelo software Merlin 2.21, programa da Mquina Universal de Ensaios Instron

compatvel com Windows 3.1.

45

FIGURA 4.3 - Grfico obtido com o software Merlin 2.21, mosfi-ando o prolongamento da poro linear ( / ) e a indicao dos valores de tenso (CTI e 0 2) e de alongamento (E 1 e E 2) para clculo do mdulo de elasticidade de acordo com a equao E = Aa/Ae (3).

4.3 HISTOLOGIA

Foram preparadas amostras de pele ( 3 x 1 0 mm) do grupo controle e dos grupos

experimentais para montagem de lminas histolgicas. As tcnicas de colorao utilizadas

foram a colorao de rotina com hematoxilina-eosina, tricromo de Mallory e picro-sirius

(sendo as duas ltimas coloraes especficas para colgeno), e resorcina de Weigert

(colorao especfica para fibras do sistema elstico).

As amostras, inicialmente fixadas em formaldedo 10%, foram desidratadas em

banhos com solues crescentes de etanol (de 70% at o lcool absoluto) e diafanizadas

com xilol. Em seguida, foram imersas em parafma e mantidas em estufa. Procedeu-se,

ento, a incluso em parafina e montagem em bloco de parafma. Os cortes histolgicos

foram realizados no micrtomo, com os blocos de parafinas endurecidos e esfriados com

gelo, na espessura final de 5 |am. Os cortes foram colocados em banho-maria (40 C) e em

seguida distendidos em lminas de vidro apropriadas para microscopia de luz. As lminas

secaram em estufa a 56 C.

Previamente colorao foi promovida a desparafinizao do tecido com xilol e

sua hidratao com banhos subseqentes de lcool etlico absoluto at a soluo diluda de

70%. A colorao se processou mergulhando-se as lminas em cubetas com os corantes e

seqncia especficos de acordo com o protocolo de determinada tcnica de colorao. Os

procedimentos descritos foram realizados no Laboratrio de Histologia do Departamento

de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Os protocolos para

os tipos de colorao utilizados so encontrados em Behmer (1976).

46

As observaes das lminas e registro fotogrfico foram realizados no LBM/IPEN

em microscopio Axioplan Cari Zeiss (ocular lOx e objetiva 40x) dotado de cassete

fotogrfico. Para as observaes e registro fotogrfico das lminas coradas com picro-

sirius utilizou-se o filtro polarizador e analisador.

4.4 U L T R A - E S T R U T U R A

Foram preparadas amostras de pele do grupo controle e dos grupos experimentais,

fixadas em Kamovsky 2% (glutaraldedo 2%: paraformoldedo 2%: tampo cacodilato de

sdio 0 , lMpH 7,3).

Os procedimentos descritos a seguir (Bozzola, 1992) foram realizados no

Laboratorio de Biologa do Endomtrio do Departamento de Histologa e Embriologa do

Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo.

Aps a fixao, os fragmentos de 1 x 1 mm foram lavados em tampo cacodilato de

sdio 0,1 M com pH 7,3 e ps-fixados em tetrxido de osmio a 1% em tampo fosfato

0,1M temperatura ambiente. Em seguida, os fragmentos foram desidratados em uma srie

crescente de concentraes de etanol e infiltrados com resina Sprr e xido de propileno

na proporo de 1:1. Para incluso os tecidos foram deixados em resina pura temperatura

ambiente. Em seguida os fragmentos foram orientados em forma apropriada para obteno

de corte transversal no qual possam ser obsei-vadas epidemie e demie. Os fragmentos

permaneceram em estufa seca a 60 C para polimerizao da resina e formao dos blocos.

Os blocos foram cortados em micrtomo com navalha de vidro em cortes semi-

finos de 1 |im, que foram corados com azul de toluidina a 0,25% em borato de sdio a 1%

em gua destilada. A partir da observao dos cortes semi-finos ao microscpio de luz,

foram definidos os melhores campos para a realizao dos cortes ultrafinos. Os cortes

ulfrafmos com cerca de 60 nm de espessura, foram identificados por sua cor prateada

devido ao ndice de refrao quando flutuam na gua da cuba do micrtomo.

Os cortes selecionados foram depositados em tela de cobre sobre a qual foi

realizada a contrastao com soluo de acetato de uranila 2%, seguida de contrastao

com cfralo de chumbo.

As observaes e registro fotogrfico foram realizadas no microscpio eletrnico

de fransmisso JEOL JEM-IOOCXII a uma voltagem de 80kV (ICB/USP).

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47

4.5 ANALISE ESTATSTICA

Os valores do mdulo de elasticidade para as amostras de pele apresentaram grande

disperso, por isso se fez necessrio aplicar testes estatsticos para verificar a significncia

dos resultados.

4.5.1 Anlise estatstica descritiva

Inicialmente, foi realizada a anlise exploratria dos dados e a eliminao de

valores ''outliers " que pudessem comprometer o estudo.

Definiu-se como unidade amostrai, o conjunto de dados de um doador. As medidas

estatsticas de tendncia central e medidas de variabilidade foram calculadas para os

valores do mdulo de elasticidade dos grupos controle e de cada um dos grupos

experimentais.

4.5.2 Teste de signifcncia

Foi proposto o teste de significncia t de Student, entre os grupos da mesma

unidade