C

i

n

é

t

i

c

a

E

n

z

i

m

á

t

i

c

aProfessora: Erika Liz

Elementos da Enzimologia

• Reações Químicas

– Termodinâmica – estuda a viabilidade e a reversibilidade das

reações, a partir da análise do conteúdo energético inicial e

final de uma transformação.

– Cinética – Trabalha com a velocidade com que as reações

acontecem.

– Teoria das colisões – As moléculas para reagirem em uma

solução devem colidir com orientação apropriada na qual

levará a um estado de transição.

Elementos da Enzimologia

• Energia livre de ativação

– É a energia inicial necessária para que a reação ocorra.

• Estado de transição

– É o ponto da reação que possui a maior energia de ativação.

– A reação está no ponto máximo da barreira energética que separa os reagentes e os produtos.

Elementos da Enzimologia

• Catalisadores - Compostos capazes de

aumentar a velocidade da reação sem alterar

a proporção entre reagentes e produtos.

– Criam novos caminhos para que a reação ocorra

com uma menor energia de ativação.

Reação não catalisada

Reação catalisada

Enzimas são agentes de função metabólicaSua função é a de acelerar as reações do metabolism o

Também chamados de catalisadores biológicos

Características

1) As enzimas possuem um enorme poder catalítico; p odem acelerar

reações em até 10 16 vezes em relação à reação não catalisada

2) Uma enzima é bastante seletiva, tanto em relação à substância com a

qual ela interage, como em relação à reação que ela catalisa

3) A atividade enzimática pode ser regulada de acor do com as necessidades

da célula

A noção de que há uma complementaridade entre a

enzima e o substrato é fundamental na

enzimologia

Mas, enzimas são moléculas grandes e os substratos moléculas pequenas, na maioria das vezes.

Assim, a complementaridade está restrita a um locus especifico, o

chamado sítio ativo.

É ali que a enzima liga o sustrato para formar o

complexo enzima-substrato.

Emil Fischer (1894): altograu de especificidadedas enzimas originou →→→→

ChaveChave--FechaduraFechadura, queconsidera que a enzimapossui sitio ativocomplementar aosubstrato.

Koshland (1958): EncaixeEncaixeInduzidoInduzido,, enzima e o substratosofrem conformação para oencaixe. O substrato édistorcido para conformaçãoexata do estado de transição.

9

ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons)1.1.atuando em CH-OH1.2.atuando em C=O1.3.atuando em C=O-1.4.atuando em CH-NH2

1.5.atuando em CH-NH-1.6.atuando em NADH, NADPH

2.Transferases (transferem grupos funcionais entre moléculas)2.1.grupos com um carbono2.2.grupos aldeído ou cetona2.3.grupos acil2.4.grupos glicosil2.7.grupos fosfatos2.8.grupos contendo enxofre

3.Hidrolases (reações de hidrólise)3.1.ésteres3.2.ligações glicosídicas3.4.ligações peptídicas3.5.outras ligações C-N3.6.anidridos ácidos

�Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

10

ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO

4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água,amônia e gás carbônico)

4.1. =C=C=4.2. =C=O4.3. =C=N-

5.Isomerases (transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros)

5.1.racemases

6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entreduas pré-existentes, sempre às custas de energia)

6.1. C-O6.2. C-S6.3. C-N6.4. C-C

�Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

11

ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO

� Subclasses

Exemplos deSubclasses

Tipo de reação catalisada Classe

Hidratases Adicionam H2O à ligas duplas LiasesQuinases Transferem fosforilas do ATP TransferaseMutases Movem fosforilas dentro da

mesma moléculaIsomerase

Sintases Síntese independente de ATP TransferasesSintetases Síntese dependente de ATP Ligases

Muitos agentes inibem (diminuem) a atividade de enz imas

Estes agentes recebem o nome genérico de INIBIDORES

Muitas drogas são inibidores de atividade enzimátic a (os anti-inflamatórios não-esteróides, por exemplo, inibem a ciclo-oxigena se)

Muitos reguladores metabólicos são inibidores

IRREVERSÍVEL ⇒⇒⇒⇒ causada em geral por agentes (inibidores) que reage m covalentemente com a enzima.

Inibição competitiva

Inibição não-competitiva

REVERSÍVEL ⇒⇒⇒⇒ os inibidores ligam-se à enzima através de interações não-covalentes (interação iônica, por exemplo)

Inibidores Reversíveis Competitivos

• Há competição pelo centro ativo do enzima

• O inibidor é estruturalmente semelhante ao substrato

• A inibição pode ser revertida adicionando mais substrato

ao meio

Inibidores Reversíveis Não competitivos

• O inibidor liga-se a um local específico da enzima (que

não o centro ativo)

• O inibidor liga-se tanto a enzima livre como ao complexo

ES

Fatores que influenciam a atividade enzimática

� Fatores decorrentes da natureza protéica (estrutura)

das enzimas

�pH;

�temperatura;

�Fatores decorrentes da formação do complexo ES

�concentração das enzimas;

�concentração dos substratos;

E + S ES E + P

Enzim a pH ótim oPepsina 1,5Tripsina 7,7Catalase 7,6A rginase 9,7Fumarase 7,8

R ibonuclease 7,8

pH ótimo de algumasenzimas

POR QUE O pH AFETA A ATIVIDADE ENZIMÁTICA?

A) a ligação do substrato pode depender de grupos d issociáveis (COOH/ NH3)no sítio ativo e no próprio substrato

B) o ato catalítico pode depender de grupos dissoci áveis

C) a conformação da proteína varia com o pH, podend o inclusive haver desnaturação em pHs extremos

Influência da temperatura do meio sobre a atividade enzimática

• a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria

das reações químicas;

• a estabilidade da proteína decresce

devido a desativação térmica.

Ativação

térmica

Desnaturação

térmica

Temperatura ótima

Influência da concentração da enzima sobre a atividade enzimática

� Recomenda-se:

� Enzimas com alto grau de pureza;

� Substratos puros;

� Métodos de análise confiável.

[E]

Velocidade de transformação do S em P -- Quantidade

de E.

Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática

[S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.

[S]

Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática

E E

E E

S+

E E

E E

S E E

E E

PP

+

Baixa concentração de substrato

Formação do produto é PROPORCIONAL à concentração de substrato

100 % de saturação do centro ativo da enzima

SS

SS

+

E E

E E

E E

E E

S S

S S

E E

E E+ P

P

P

P

P

PP

P

Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática

Formação do produto é PROPORCIONAL à concentração de substrato

[Substrato] em excesso

SS

SS

+

E E

E E

E E

E E

S S

S S

E E

E E+ P

P

P

P

P

PP

P

Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática

Velocidade da reação independe da [S]

S

SS

S

SS

S

SS

SS

S

Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática

Em baixas concentrações de substrato a velocidade de reação é

de primeira ordem – isto é, é proporcional a concentração de

substrato

Em altas concentrações de substrato, a velocidade da reação é de ordem zero

– isto é, é constante e independente da concentração de substrato

[S]

Cofator ⇒⇒⇒⇒ qualquer molécula não protéica que participa da catálise enzimática

Coenzima ⇒⇒⇒⇒ é um cofator orgânico que auxilia a enzima no ato catalítico (em geral transferência de grupos)

Pode estar ou não ligada covalentemente à proteínaQuando está ligada covalentemente constitui, adicionalmente, um grupo

prostético

Estrutura Estrutura EnzimáticaEnzimática

Covalente

Apoenzima ouApoproteína

Holoenzima

CofatorProteína

Pode ser:• íon inorgânico• molécula orgânica

Coenzima

Grupo Prostético

Cinética Enzimática• Medir as velocidades das transformações que se processam;

• Estudar a influência de condições de trabalho naquelas

velocidades;

• Correlacionar as velocidades das transformações com alguns

dos fatores que afetam;

• Colaborar na otimização do processo considerado;

• Estabelecer critérios para o controle do processo;

• Projetar o reator mais adequado.

Cinética Enzimática

• Estudo do mecanismo da combinação Enzima – Substrato;

• Compreensão da atividade enzimática;

E + S ES E + P

1913 Leonor Michaelis -Enzimologista

Maude Menten - Pediatra

L. M ichaelis e M . L. M enten propuseram um a teoria geral sobre a ação das enzim as em 1910, propondo um rápido equ ilíb rio entre o substra to e a enzim a:

E + S ESk1

k2

Para um equilíbrio pode-se escrever:

]ES[k]S][E[k 21 =

1

2s k

k]ES[]S][E[

k ==

O produto é fo rm ado num a segunda etapa:

E + S ES E + Pk

k

k1

2

3

No final E é liberado para ligar outra m olécula do substrato .

O que é uma “constante de velocidade”?

A constante de velocidade é um número, um parâmetro, a ser determinado empiricamente e que, quando multiplicado pela concentração nos fornece a velocidade de um processo.

Isto leva, finalmente, à EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN:

]S[K]S[V

vM

max

++++====

V=Vm . [S]

Km +[S]

Onde Vm é velocidade

máxima da reação

Km+ [S] = [S]. Vm

V

Quando V =Vm

2

Km= [S] . Vm . 2 [S]

Vm

Km= [S]

Vmax

K M

Vmax

0 5 10 15 20 25

0

5

10

15

20

/2

Concentração do substrato, [S]

O KM é a concentração de substrato para o qual

v = Vmax/2

Numericamente, Km pode ser expresso como a [substrato] necessária para que a velocidade da reação seja metade da velocidade máxima

KmKm

Afinidade da enzima pelo substrato

Afinidade da enzima pelo substrato

A constante de Michaelis, K M:

KM tem as unidades da molaridade, e é uma medida da af inidade da enzima pelo substrato; quanto menor K M, maior a afinidade da enzima pelo substrato.

1

32M k

kkK

++++====

O

B

R

I

G

A

D

A

!