LABIOCEL 1

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA

MANUAL DE TÉCNICAS EM HISTOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR DO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR DA FACULDADE DE MEDICINA DA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CONSOLIDAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

2002

LABIOCEL 2

ÍNDICE GERAL

Apresentação

Protocolo para obtenção e fixação de material a ser

processado no Laboratório de Biologia Celular

I. Preparo de soluções

1. Cálculos

2. Instruções gerais

3.Soluções mais usadas

II. Tampões

III. Microscopia de luz

1. Técnicas de Fixação

2. Descalcificação

3. Inclusão em Parafina

4. Microtomia

5. Preparação de lâminas e colagem de cortes

6. Digestões enzimáticas

7. Colorações (técnicas de uso corrente)

IV. Métodos histoquímicos

1. Metais e ânions

2. Detecção de radicais químicos em proteínas

3. Lípides

4. Polissacarídeos

5. Ácidos Nucleicos

6. Grânulos citoplasmáticos

7. Fibras da matriz extracelular

LABIOCEL 3

V. Historesina

VI. Processamento de Material para Microscopia Eletrônica

de Transmissão

VII. Uso do Microscópio Eletrônico

VIII. Revelação e Ampliação de Micrografias

IX. Arquivos e Registros no Laboratório de Biologia

Celular

X. Guia de Trabalhos Práticos

LABIOCEL 4

Apresentação

Este texto não pretende ser enciclopédico; assim reune, de forma sistemática, a descrição de apenas aqueles procedimentos que são utilizados rotineiramente no Laboratório de Biologia Celular (LIM/59) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo. Levou-nos a tomar a iniciativa de redigir este manual o fato de que os muitos profissionais das diversas áreas de saúde que fazem estágios no nosso Laboratório utilizam grande parte do seu

tempo para copiar nos seus cadernos pessoais as descrições dos procedimentos que utilizamos rotineiramente e nos quais solicitaram ser treinados. Com o objetivo de que possam aproveitar o estágio mais racionalmente, deliberamos que seria mais apropriado fornecer a eles um texto que reúna a descrição de todas as técnicas e assim lhes permita concentrar-se preferencialmente no

desenvolvimento de habilidades em lugar de desperdiçar tempo em longas sessões de transcrição manuscrita de receitas. Sugere-se ao leitor que, ao consultar o texto na busca de uma informação, tenha o cuidado

de ler toda a seção do capítulo correspondente. No processo de redação tentou-se evitar repetições; assim, pode existir alguma informação essencial em itens complementares, logo acima ou abaixo do assunto procurado.

Esta versão preliminar certamente poderá ser aperfeiçoada com o tempo, através da experiência do seu uso e das sugestões que vierem, tornando-a mais sucinta e de melhor apresentação. Assim, esperamos contribuições para seu aprimoramento.

Profa. Dra. Elia Garcia Caldini Chefe do Laboratório de Biologia Celular

PROTOCOL 1

PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO E FIXAÇÃO DE MATERIAL A SER

PROCESSADO NO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR

CUIDADOS:

Tanto para microscopia de luz quanto para microscopia

eletrônica, deve-se tomar cuidado com:

1) não deixar o material secar enquanto está sendo

recortado.

2) usar sempre uma gilete nova para recortar o material.

3) o volume do fixador deve ser, pelo menos, 20 vezes

maior que o volume do fragmento a ser fixado.

1. MICROSCOPIA DE LUZ

O material deverá ser fixado em paraformaldeído a 4% em

tampão fosfato. Este fixador poderá ser obtido no

Laboratório de Biologia Celular.

O material deverá ter, pelo menos um dos lados, com, no

máximo, 3 mm de espessura, podendo ter a forma de um

paralelepípedo. Assim, o fixador poderá penetrar no

interior do fragmento.

O material deve ser deixado no fixador por, no mínimo, 24

horas e, no máximo, 48 horas, devendo ser então colocado

no álcool 70 ou ser trazido para o Laboratório de Biologia

Celular para ser processado.

PROTOCOL 2

2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA

O material deverá ser fixado em glutaraldeído a 2% em

tampão fosfato 0,15M em dois frascos, sendo que, em um

deles, deve-se dissolver ácido tânico 0,1% no

glutaraldeído.

O glutaraldeído deve ser guardado congelado até a hora da

cirurgia. Na hora de usar, em um dos frascos colocar o

ácido tânico pesado na quantidade apropriada e, antes de

colocar o glutaraldeído, etiquetar os frascos

GLUTARALDEÍDO e GLUTARALDEÍDO COM ÁCIDO TÂNICO.

Pouco antes de usar, descongelar o glutaraldeído apenas

com o calor da mão e colocá-lo, na quantidade apropriada

nos frascos.

O material deve ter, pelo menos um dos lados, com, no

máximo, 1 mm de espessura. Aconselha-se a fazer com forma

de um paralelepípedo de 10 mm x 1 mm x 1 mm.

A fixação deve durar 2 horas. Deve-se anotar a hora em que

o material foi colocado no fixador e entregá-lo no

Laboratório de Biologia Celular antes de completar o tempo

de fixação; se isto não for possível, deixar o material na

geladeira (não no congelador) e entregá-lo ao Laboratório

o quanto antes. Isto é essencial, pois cada minuto a mais

no fixador contribui para piorar a qualidade do material.

Entrar em contato conosco pelo telefone (852.2188 ou

851.4011 ramal 241) para combinar horário de entrega.

PROTOCOL 3

PREP-SOL 1

I. PREPARO DE SOLUÇÕES

1. CÁLCULOS

1.1. CÁLCULO DA NORMALIDADE DE UM LÍQUIDO (ml/l) PESO MOLECULAR 1N= ------------------------------------- VALÊNCIA x PESO ESPECÍFICO x concent. (densidade) (%) Ex.: Ac. Sulfúrico: 98,078 1N = ------------------ = 28,032 ml/litro 2 x 1,83 x 0,96 1.2. CÁLCULO DA MOLARIDADE 1M = 1 mol/l = P.M./1 litro 1.3. CÁLCULO PARA DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES Ex: para obterem-se 100 ml de solução 0.15M a partir de uma solução estoque 1M. Deve-se, primeiro, dividir a molaridade da solução estoque pela molaridade da solução desejada. O resultado representa o número de diluições. 1M/0.15M = 6.66 Em seguida, deve-se dividir o volume desejado pelo número de diluições. 100 ml/6.66 = 15,01 Portanto, necessita-se de 15,01 ml da solução estoque 1M e 84,99 ml de água para obter-se 100 ml da solução a 0.15M.

PREP-SOL 2

2. INSTRUÇÕES GERAIS - Em qualquer solução que envolva a mistura de ácido e água, deve-se sempre ter o cuidado de jogar o ácido na água. - As diluições não alteram o pH de uma solução; o que se altera quando se dilui uma solução é a sua molaridade. 3. SOLUÇÕES MAIS USADAS: 3.1. SOLUÇÃO SULFOCRÔMICA (PARA LIMPAR VIDRARIA) Bicromato de Potássio......... 50 g Água destilada................500 ml Ácido sulfúrico conc......... 150 ml Dissolver o bicromato de potássio na água destilada quente. Resfriar. Colocar o balão dentro da pia cheia de água e adicionar lentamente o ácido sulfúrico. Deixar o material a ser limpo mergulhado na solução por algumas horas ou de um dia para outro. 3.2. PREPARO DO COLÓDIO A 1% Álcool Absoluto..............50 ml Éter Etílico.................50 ml Celoidina em pó...............1 g 3.3. NaOH 1 NORMAL NaOH pastilhas....................40 g Água destilada..................1000 ml 3.4. HCL 1 NORMAL Ácido clorídrico comercial................82 ml Água destilada..........................1000 ml 3.5. ÁLCOOL-ÁCIDO Ácido clorídrico....................1 ml Álcool 70°.........................99 ml

TAMPÃO 1

II. TAMPÕES 1. PBS (SOLUÇÃO SALINA TAMPONADA) Cloreto de sódio............................9 g Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,2 a 7,3).......100 ml Água destilada............completar para 1000 ml 2. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,1M a diferentes pHs. Solução A: solução 0,2M de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4H20; PM = 138,01): 27,6 g/1000 ml de água destilada. Solução B: solução 0,2M de fosfato de sódio bibásico (Na2HPO4; PM = 141,98): 28,4 g/1000 ml de água destilada. Misturando-se os volumes indicados na tabela abaixo e completando-se para 200 ml com água destilada pode-se fazer tampão fosfato 0,1M a diferentes pHs. ml A ml B pH 92,0 8,0 5,8 90,0 10,0 5,9 87,7 12,3 6,0 85,0 15,0 6,1 81,5 19,5 6,2 77,5 22,5 6,3 73,5 26,5 6,4 68,5 31,5 6,5 62,5 37,5 6,6 56,5 43,5 6,7 51,0 49,0 6,8 45,0 55,0 6,9 39,0 61,0 7,0 33,0 67,0 7,1 28,0 72,0 7,2 23,0 77,0 7,3 19,0 81,0 7,4 16,0 84,0 7,5 13,0 87,0 7,6 10,5 89,5 7,7 8,5 91,5 7,8

TAMPÃO 2

3. TAMPÃO VERONAL HCl Solução A: ácido dietil barbitúrico (sal disódico) 0,2M (PM= 206). Para obter-se a solução A, pesar 2,06 g do ácido e dissolver em 30 ml de água destilada. Completar para 50 ml com água destilada. Observação: deve-se usar sempre o ácido dietil barbitúrico e não o barbiturato de sódio, pois este não dissolve em água. Solução B: 0,2N de HCl (1,65 ml de HCl em 100 ml de água). Para pH 8,8 misturar: 50 ml de A 4 ml de B 146 ml de água destilada A molaridade final do tampão é 0,05M. 4. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,02M, pH 4,7 (para digestão com papaína) Solução A: solução 0,02M de NaH2PO4.H2O (PM= 138,01) pH 4,0: 0,276g/100 ml de água destilada Solução B: solução 0,02M de Na2HPO4.7H2O (PM= 267,98) pH 8,0: 0,536g/100 ml de água destilada ou solução 0,02M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) pH 8,0: 0,356g/100 ml Titular uma solução com a outra até que o pH seja 4,7. 5. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,05M pH 8,9 (para digestão com tripsina) Solução A: fosfato de sódio monobásico 1M Solução B: fosfato de sódio bibásico 1M Misturar 0,25 ml da solução A com 9,75 ml da solução B e completar para 200 ml com água destilada.

TAMPÃO 3

6. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09): 13,6 g/100 ml de água destilada 34,0 g/250 ml de água destilada Solução B: solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) 17,8 g/100 ml de água destilada 44,5 g/250 ml de água destilada ou solução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98) 26,8 g/100 ml de água destilada 67,0 g/250 ml de água destilada ou solução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98) 35,8 g/100 ml de água destilada 89,5 g/250 ml de água destilada 6.1. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,1M; pH = 7,0 a 7,2 Solução A Solução B Completar com H2O para 28,5 ml 71,5 ml 1000 ml 14,25 ml 35,75 ml 500 ml 2,85 ml 7,15 ml 100 ml 6.2. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,15M; pH = 7,0 a 7,2 Solução A Solução B Completar com H2O para 28,5 ml 71,5 ml 660 ml 14,25 ml 35.75 ml 330 ml 04,75 ml 11,91 ml 110 ml

TAMPÃO 4

6.3. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,2M; pH = 7,0 a 7,2 Solução A Solução B Completar com H2O para 57,0 ml 143,0 ml 1000 ml 28,5 ml 71,5 ml 500 ml 14,25 ml 35,75 ml 250 ml 5,7 ml 14,3 ml 100 ml 7. TAMPÃO TRIS-HCl pH 7,4 (para digestão com colagenase) Solução A: TRIS 0,2M 2,42 g/100 ml de água destilada Solução B: HCl 0,1N: 0,8 ml/100 ml de água destilada Para pH 7,4 misturar: 25 ml da solução A 42 ml da solução B 33 ml de água destilada TRIS = hidroxi methyl-aminomethan (PM = 121,14) 8. TAMPÃO ACETATO 0,2M, pH 5,8 (para Alcian Blue + concentração eletrolítica crítica) Solução A: ácido acético 0,2M: 1,2 ml/100 ml de água destilada Solução B: acetato de sódio 0,2M 1,64 g de acetato de sódio anidro (PM = 82)/100 ml de água ou 2,72 g de acetato de sódio trihidratado (PM = 136)/100 ml de água destilada. Medir o pH da solução B e ir pingar nesta a solução A, até atingir o pH desejado.

TAMPÃO 5

9. TAMPÃO SORENSEN pH 6,4 Solução A: solução 0,06M de KH2PO4 0,816 g/100 ml de água Solução B: solução 0,06M de Na2HPO4.12H2O 1,074 g/50 ml de água. Para 100 ml de tampão, misturar 70 ml da solução A e 30 ml da solução B.

III. MICROSCOPIA DE LUZ

FIXAÇÃO 1

1. TÉCNICAS DE FIXAÇÃO O volume do fixador deve ser sempre 20 vezes maior do que aquele da peça a ser fixada. A peça deve ter, pelo menos um dos lados, medindo 3 mm de espessura para que o fixador possa penetrar. 1.1. ACETONA-METANOL Partes iguais de acetona e metanol. 1.2. BOUIN Solução saturada aquosa de ácido pícrico......750 ml Formol 36-40%.................................250 ml Ácido Acético Glacial..........................50 ml Técnica de fixação: Fixar pedaços de até 0,5 cm de espessura em Bouin durante

24 horas (5 horas no mínimo). Lavar de um dia para o outro, em água corrente, dentro do

próprio frasco onde foi fixado. Para isto, cobrir o frasco com uma gaze (amarrada ou presa com um elástico na borda do frasco) e colocá-lo sob a água corrente. Cuidado com a intensidade do jato de água para não danificar o material.

Após a lavagem, passar para álcool 70, onde pode ser deixado por muito tempo, se a peça não for ser emblocada.

Observações: a) Ácido Pícrico Saturado: solução aquosa de ácido pícrico com concentração de 1,4%. b) Formol 36-40% é o formaldeído líquido (como vem). c) Extração do Ácido Pícrico de peças fixadas em Bouin: se a peça fixada pelo Bouin ainda ficar muito amarela, após ser lavada em água corrente a noite inteira, deixá-la por 3 horas na solução saturada de carbonato de lítio em álcool 50o. Em seguida, passar para álcool 70o, desidratar e emblocar. Da mesma forma, se o corte histológico ainda estiver amarelado depois da hidratação, deixá-la alguns minutos numa solução saturada de carbonato de lítio em álcool 50o. 1.3. CARNOY II (Carnoy dos patologistas) Etanol absoluto..............60 ml Clorofórmio..................30 ml Ácido acético...............10 ml Técnica de fixação:

FIXAÇÃO 2

Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100 de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão. 1.4. ETANOL-ACÉTICO Álcool 95...............75 ml Ácido acético...........25 ml Técnica de fixação: Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100 de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão. 1.5. SOLUÇÃO SALINA DE FORMOL 10% Formol 36-40%.....................100 ml NaCl................................9 g Água destilada....................900 ml Técnica de fixação: Fixar por 24 horas. 1.6. SOLUÇÃO NEUTRA FOSFATO TAMPONADA DE FORMOL Formaldeído 37-40%.........................100 ml Água destilada.............................900 ml Fosfato de Na monobásico (NaH2PO4.H2O).......4,0 g Fosfato de Na dibásico anidro (Na2HPO4)......6,5 g Técnica de Fixação: Fixar durante 6 a 24 horas, dependendo do tamanho da peça. 1.7. PARAFORMALDEÍDO A 4% EM PBS (pH 7.0) Tampão fosfato 0,1M...............100 ml NaCl.................................9 g paraformaldeído.....................40 g Colocar 800 ml de água destilada para aquecer (não deixar ferver). Colocar o NaCl e o tampão. Por último, dissolver o paraformaldeído. Completar para 1000 ml com água destilada. Técnica de fixação: Fixar o material de 6 a 24 hs. 1.8. METHACARN

Álcool metílico............60 ml Clorofórmio................30 ml

FIXAÇÃO 3

Acético acético............10 ml Técnica de fixação: Fixar por 24 horas. 1.9. GENDRE Solução saturada de ácido pícrico em álcool 90.......85 ml Formol 40%...........................................10 ml Ácido acético.........................................5 ml Técnica de fixação: Fixar por 4 horas. O líquido de Gendre é um fixador para glicogênio 1.10. SOLUÇÃO DE FORMOL COM CÁLCIO Formol 40%.........................10 ml Água destilada.....................90 ml Cloreto de cálcio anidro............1 g Este é um fixador ideal para estudar lípides. 1.11. CLARKE-CARNOY (Carnoy dos citologistas) Álcool 100....................... 75 ml Ácido acético.....................25 ml Fixador ideal para demonstração de proteínas. 1.12. HIDRATO DE CLORAL 25 g de hidrato de cloral 100 ml de álcool 50 Fixar por 24 a 48 horas. Fixador ideal para método de Nonidez para demonstração de terminações nervosas. 1.13. FORMOL BROMETADO 140 ml de formol 40% 20 g de brometo de amônia 1000 ml de água destilada Fixador ideal para tecido nervoso que será submetido a algum método de impregnação pela prata.

FIXAÇÃO 4

DESCALC 1

2. TÉCNICAS DE DESCALCIFICAÇÃO 2.1. DESCALCIFICAÇÃO PELO EDTA Deixar o fragmento em solução de EDTA a 5% em solução salina (5 g de EDTA em 100 ml de solução salina) até que a descalcificação esteja completa. Testar para verificar a descalcificação. Lavar abundantemente em água corrente antes de iniciar-se a desidratação. EDTA = Ac. Etilediamino Tetracético Sal Bisódico; PM = 372,24 2.2. DESCALCIFICAÇÃO PELO ACÍDO FÓRMICO Solução A: solução de citrato de sódio a 20% Citrato de Sódio 20% ......50 g Água destilada.............250 ml Solução B: solução de ácido fórmico 1:1 Ácido fórmico a 50%.........125 ml Água destilada..............125 ml Misturar partes iguais das soluções A e B. Colocar nesta mistura o fragmento ósseo já fixado. Renovar a solução a cada 48 horas e testar periodicamente para verificar-se a descalcificação. Após a descalcificação lave o tecido em água corrente durante 24 horas, pelo menos (para eliminar totalmente o ácido), antes de iniciar-se a desidratação. Usando-se este método, a descalcificação é lenta, porém preserva melhor as estruturas. 2.3. TESTE PARA VERIFICAR A DESCALCIFICAÇÃO 5 ml da solução descalcificante usada (que esteve em contato com a peça durante pelo menos seis horas) 5 ml de solução de oxalato de amônia a 5% 5 ml de hidróxido de amônia

DESCALC 2

Agitar. Esperar 30 minutos. Se ficar turvo é porque a descalcificação da peça não está completa ainda. Caso esteja pronta, lavar a peça abundantemente antes de iniciar-se da desidratação. 2.4. DESCALCIFICAÇÃO PELO ÁCIDO NÍTRICO Colocar a peça em solução aquosa de ácido nítrico a 4%. É um método muito drástico. Deve-se verificar o amolecimento da peça várias vezes.

INCLUSÃO 1

3. INCLUSÃO EM PARAFINA 3.1. TÉCNICA DE INCLUSÃO EM PARAFINA Depois de completa a fixação, o material deve ser lavado, se for o caso, e deixado em álcool 70° durante duas horas, no mínimo. Fazer 3 passagens de duas horas cada uma em álcool 96°. Fazer 3 passagens de 2 horas cada uma em álcool 100° (na última pode deixar de um dia para outro). Fazer 3 passagens de 30 minutos cada uma em xilol. Dar um primeiro banho de parafina na estufa 60°C durante uma hora. Dar um segundo banho de parafina na estufa (à vácuo, de preferência) durante uma hora. Incluir o material. Observações: a) A parafina usada nos banhos deve ser filtrada antes de ser reutilizada. b) Para amolecer peças muito duras usar banhos de benzol em vez de xilol. c) Para diafanizar peças muito grandes ou muito pequenas calcular o tempo de diafanização da seguinte maneira: deixar no primeiro banho de xilol até a peça ficar diafanizada (como que transparente). Os outros dois banhos de xilol que se seguem devem ter a mesma duração deste primeiro. d) Para peças muito fibrosas: depois dos banhos de álcool 100, dar 2 banhos com acetato amila ou éter. Em seguida, parafina + éter (1:1) a 38°C e depois parafina pura a 60°C. 3.2. PREPARAÇÃO DA PARAFINA 3.2.1. PARAFINA PURA Derreter a parafina Petrobrás na estufa, colocar para ferver, levantar a fervura três vezes, recolocar na estufa e pronto. 3.2.2. FÓRMULA DR. CARDOSO DE ALMEIDA Parafina Petrobrás 145o ....1000 ml ou 780 g Estearina.....................25 ml ou 21 g Cera de abelha...............130 ml ou 104 g Vaselina líquida...............2 ml 3.2.3. FÓRMULA DO BENIGNO ARROYO (ICB-USP) parafina pura..............................800 g

INCLUSÃO 2

cera purificada............................150 g ácido esteárico (ou estearina)..............50 g

MICROTOM 1

4. MICROTOMIA EM PARAFINA 4.1. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS Deve-se limpar previamente as lâminas onde serão colocados os cortes: retirar as lâminas da embalagem e colocá-las em uma solução de Extran a 1% em um recipiente grande. Deixar de um dia para o outro. Enxaguar em água corrente abundantemente até que o detergente tenha sido totalmente retirado. Colocar em álcool 95°. As lâminas devem permanecer no álcool até o momento de serem utilizadas, quando então devem ser secas com uma fralda. Se as lâminas estiverem fungadas ou muito sujas, deixar de molho em soluçào sulfocrômica ou em álcool-ácido preparado da seguinte maneira: Álcool 95 ou 100%...........1000 ml Água destilada................63 ml HCl..........................120 ml 4.2. OBTENÇÃO DOS CORTES Aparar lateralmente o bloco (deve-se aparar o máximo possível, pois se ficar excesso de parafina dos lados da peça emblocada os cortes sairão enrugados). Cortar rotineiramente com 4 a 7 µm. Com uma pinça colocar fragmentos da fita de cortes em Banho-Maria com água destilada a 45° a 50°C. Colocar a superfície brilhante da fita em contacto com a água e fazê-la caminhar sobre a superfície da água antes de soltá-la da pinça. Separar os cortes um a um usando delicadamente a pinça. Deixar os cortes no banho-maria até esticarem e pescá-los com as próprias lâminas que devem estar perfeitamente limpas e desengorduradas (ver "Preparação de lâminas"). Depois de pescar, colocar as lâminas com os cortes na estufa a 50 a 60° para secar, durante no mínimo duas horas, sendo que o melhor é deixá-las na estufa de um dia para o outro. Desta maneira, a parafina derrete bem e os cortes grudam satisfatoriamente na lâmina.

PREP-LAM 1

5. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS E COLAGEM DE CORTES 5.1. COMO DESPARAFINAR E HIDRATAR OS CORTES Este procedimento deve ser seguido rotineiramente, a menos que para o tipo de coloração desejada exista determinação específica em contrário. Passar as lâminas por: Xilol 1..........10 min. Xilol 2..........10 min. álcool 100°.......5 min. álcool 95°........5 min. álcool 70°.......10' a 15 min. Lavar em água corrente Corar. Observações: a) Diversos fatores (tipo de parafina, a utilização de cortes obtidos há muito tempo, a dimensão do corte) influem no tempo durante o qual as lâminas devem permanecer no xilol para a retirada da parafina. Imediatamente após colocar a lâmina no álcool 100°, retirá-la e, olhando a lâmina contra a luz, certificar-se de que toda parafina foi retirada pelo xilol; se isto não tiver ocorrido, voltar a lâmina para o xilol. 5.2. MONTAGEM DA LÂMINA APÓS COLORAÇÃO Passar as lâminas por: Álcool 70°.............5 min. Álcool 95°.............3 min. Álcool absoluto........3 min. Álcool absoluto........3 min. Álcool-xilol (1:1)....10 min. Xilol diafanizante.....5 min. Xilol montagem........30 min. ou mais Colocar a lamínula usando o meio de montagem apropriado.

PREP-LAM 2

5.3. MODELO DE ROTULAÇÃO Após o meio de montagem estar seco, deve-se limpar a lâmina para retirar o excesso deste que acumulou-se nas bordas da lamínula, limpando com um pano ou lenço de papel com xilol. Em seguida, as lâminas devem ser identificadas por etiquetas que contenham as seguintes informações: número do bloco (correspondente ao número registrado no livro de autópsias), identificação da espécie animal, identificação do órgão e da coloração. corte espécie coloração lamínula número do órgão registro 5.4. ESMERILHAMENTO DE LÂMINAS (PREPARO DE LÂMINA FOSCA) Com este procedimento consegue-se que uma das extremidades da lâmina fique fosca, e assim pode-se escrever sobre ela com um lápis, facilitando sua identificação. 5.4.1. RECEITA DO PROF. JUNQUEIRA Solução esmerilhadora: 150 g de fluoreto de amônia anidro 20 ml de ácido sulfúrico 150 ml de ácido fluorídrico 100 ml de água destilada Adicionar o ácido sulfúrico, em gotas, ao fluoreto de amônia agitando com cuidado. Depois adicionar o ácido fluorídrico da mesma maneira e a água por último. Técnica: Deixar as lâminas durante 1 minuto na solução esmerilhadora, retirar e lavar bem em água corrente.

PREP-LAM 3

Observações: a) É essencial adicionar os reagentes na ordem indicada. b) Não usar fluoreto de amônia hidratado. c) Tanto para a preparação como para estocar a solução usar recipiente de polietileno de parede espessa, pois a reação é exotérmica. d) A adição do ácido sulfúrico por gotejamento e sob constante agitação deve ser feita para evitar empedramento. e) Lembrar e avisar ao técnico que a solução ataca vidro em geral e não apenas as lâminas. f) À medida que a solução for envelhecendo, aumentar o tempo para o esmerilhamento, controlando o processo observando a lâmina contra luz. 5.4.2. RECEITA DA CLEUSA (ICB-USP) 150 g de fluoreto de amônia 30 ml de ácido sulfúrico 30 ml de ácido fluorídrico 75 ml de água destilada 10 ml de goma arábica Dissolver o fluoreto de amônia na água; adicionar o ácido sulfúrico gota a gota; juntar o ácido fluorídrico e a goma arábica também gota a gota. 5.5. COLAGEM DE CORTES Os cortes podem ser pescados em lâminas limpas (sem nenhuma substância adesiva) quando pretende-se fazer colorações rotineiras e que não agridam muito o material. Caso contrário, deve-se promover a colagem do corte na lâmina, dissolvendo-se a substância colante no banho-maria ou pescando-se os cortes em lâminas previamente preparadas. 5.5.1. GELATINA (para cortes que vão sofrer digestão enzimática)

Gelatina em pó..................1 colher café Bicromato de potássio...........1 colher café Água destilada..................200 ml

Ferver, filtrar, colocar no banho-maria e completar com água destilada. Trocar cada duas ou três semanas. 5.5.2. GELATINA (usada rotineiramente) 0,1 g gelatina

PREP-LAM 4

0,1 g dicromato de potássio 1 litro água destilada fervente 5.5.3. GELATINA (A Yara diz que esta não interfere na coloração e que as outras interferem) Dissolver na água do banho-maria um quadradinho de 4cm x 4cm de gelatina em folha. 5.5.4. ALBUMINA (Luna, 1968) Clara de ovo...............50 ml Glicerina..................50 ml Misturar bem. Filtrar em uma gaze. Colocar uma pequena gota em uma das extremidades da lâmina e espalhar de uma só vez com o dedo. Atenção: a albumina cora-se com muitos corantes, interfere no resultado final e a lâmina torna-se fungada com o tempo. 5.5.5. SUPER-COLAGEM PARA DIGESTÃO ENZIMÁTICA Colar os cortes com albumina. Deixar secar e colocar as lâminas apoiadas (com os cortes virados para baixo) sobre frascos contendo formol dentro da estufa a 60°C durante 1 hora. Retirar os frascos de formol e deixar as lâminas secando na estufa a 37°C de um dia para outro antes de desparafinar. Desparafinar. Deixar de um dia para outro secando na estufa. 5.5.6. SUPER-COLAGEM PARA RETICULINA. Colar os cortes com albumina. Colocar nos vapores de formol a 60°C durante uma hora (ver instruções na receita acima). Passar pela bateria de desparafinização e hidratação: xilol 1, xilol 2 e álcool 100°. Tirar do álcool 100° e colodionar os cortes, mergulhando-os em solução de celoidina 0,5% (ou nitrato de celulose 0,1%) em álcool-éter (1:1). Deixar secar coberto, à temperatura ambiente. Passar no álcool 70°, na água e proceder à coloração desejada.

PREP-LAM 5

5.5.7. GELATINA PARA LÂMINAS AO CRIOSTATO (usada para digestão enzimática e algumas reações imuno-histoquímicas) Solução A: Dissolver 1 g de gelatina incolor em 80 ml de água quente. Solução B: Dissolver 0,1 g de cromo alumen [CrK(SO4)2.12H2O;

PM = 499,40] em 20 ml de água. Misturar as duas soluções, imergir as lâminas e deixá-las enxugar verticalmente. Guardá-las no congelador da geladeira em caixas fechadas. 5.5.8. SILANE (3-aminopropyltriethoxysilane nº A-3648 Sigma) Usar lâminas perfeitamente limpas e desengorduradas. Fazer uma solução de silane 2% em acetona pura. Mergulhar a lâmina 2 vezes nesta solução. Mergulhar a lâmina 2 vezes na acetona pura. Mergulhar a lâmina 2 vezes em água. Secar em temperatura ambiente. 5.5.9. SILANE (receita que o Gregorio deu) Preparar uma solução de 0,5% de silane em acetona pura. Mergulhar as lâminas nesta solução por 10 a 15 segundos. Deixar secar de um dia para o outro. Lavar em três ou mais banhos de água destilada. Secar na estufa a 60ºC. 5.5.10. COLA TENAZ Dissolver um pouco (1 a 2 ml) de cola tenaz de rótulo azul em um recipiente com 50 ml de água. Mergulhar as lâminas. Colocá-las para secar na estufa (cerca de 15 minutos). Após a secagem as lâminas devem ficar praticamente transparentes, senão é porque tem cola em excesso. Pode-se colocar a cola direto no banho-maria onde os cortes são pescados.

PREP-LAM 6

5.5.11. COLÓDIO Esta técnica permite a adesão de cortes que foram pescados em lâminas sem nenhuma substância adesiva, possibilitando assim submeter lâminas já prontas a processos como hidrólise, acetilação, saponificação, metilação etc., que são muito agressivos e descolam os cortes. As lâminas devem ser colodionadas no momento adequado para cada tratamento, segundo as indicações específicas. Preparo do colódio a 1% ou 0,5% Álcool absoluto.....................50 ml Éter etílico........................50 ml Celoidina em pó..............1 g.ou 0,5 g No decorrer dos diversos procedimentos, o colódio deve ser removido das lâminas, passando-as por álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes iguais. 5.5.12. ADESÃO POR CALOR De modo geral, para todas as colorações sejam elas

agressivas ou não (exceto para digestão enzimática, que neccesita de uma substância adesiva), os cortes resistem muito bem se, após a desparafinização e passagem por álcool 100°, as lâminas forem colocadas para secar na estufa a 55°,por uma ou duas horas. A seguir, voltar as lâminas no álcool 100° e proceder a bateria de hidratação normal.

DIG-ENZ 1

6. TÉCNICAS DE DIGESTÃO ENZIMÁTICA 6.1. DIGESTÃO COM COLAGENASE Fazer uma solução de colagenase 0,1 a 0,4% (1 a 4 mg/ml) em Tampão Tris-HCl 0,05M (pH 7,4) contendo 0,0025M (2,5 mM) de NEM e 0,001M (1 mM) de CaCl2. Para 10 ml de solução: 10 a 40 mg de colagenase 3,1 mg de NEM 1,1 mg de CaCl2 Dissolver estes ingredientes em 5 ml de tampão e completar com o mesmo tampão para 10 ml. Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C durante 24 horas ou mais (testar o tempo de incubação para cada material). Observações: TRIS = hydroxymethil-aminomethan PM 121,14. NEM = N-ethyl- maleidemide PM 125,13. O NEM atua como inibidor de outras proteases. Pode-se fazer a digestão sem o NEM, caso este não esteja disponível. CaCl2 PM= 110,99. 6.2. DIGESTÃO COM ELASTASE Fazer uma solução de 0,5 mg de elastase por ml de tampão Veronal-HCl, pH 8,8. Pingar a solução sobre os cortes e deixar durante 30 a 60 minutos, à temperatura ambiente. Lavar em água corrente. Proceder à coloração desejada. 6.3.DIGESTÃO COM PEPSINA Fazer uma solução de 2 mg de pepsina cristalizada por ml de HCl 0,02N (pH 1,6). Pingar sobre os cortes e proceder à digestão a 37°C, durante 15 a 60 minutos.

DIG-ENZ 2

6.4. DIGESTÃO COM RNASE Fazer uma solução de 1 mg de RNAse por ml de água. Usar água deionizada com pH acertado a 6,8. Acertar o pH da água com solução de fosfato de sódio bibásico ou monobásico (dependendo do pH que está a água). Colocar 0,5 ml de solução de RNAse sobre o corte. Incubar os cortes na RNAse a 37°C durante 3 horas. Lavar e corar com Azul de Toluidina ou Galocianina. 6.5. DIGESTÃO COM TRIPSINA Tampão Fosfato 0,05M (pH 8,9)......1 ml Tripsina cristalizada............0,1 mg Dissolver a tripsina no tampão, pingar sobre os cortes e incubar a 37°C por duas horas. 6.6. DIGESTÃO COM PAPAÍNA Fazer uma solução de papaína 0,1% (1 mg/ml) em tampão fosfato 0,02M, pH=4,7, contendo 0,005M (5mM) de metabissulfito de sódio (PM=190,10) e 0,0005M (0,5mM) de EDTA (PM=372,24). Para 10 ml de solução: 10 mg de papaína 9,505 mg de bissulfito de sódio 1,86 mg de EDTA Dissolver estes ingredientes em uma quantidade de tampão suficiente para completar 10 ml. Desparafinar os cortes e levá-los até água. Pingar a solução sobre os cortes e deixar à temperatura ambiente por 2 horas. Lavar durante alguns minutos na água corrente. Realizar a coloração desejada. Sobre os cortes-controle pingar só a solução de tampão + bissulfito + EDTA. Observação: a) Ver Guia de Tabalhos Práticos, no ítem Interação Colágeno-Proteoglicanos.

DIG-ENZ 3

6.7. DIGESTÃO COM AMILASE (LISON, 1960) Fazer uma solução de amilase 0,1 a 0,5% em salina (1 a 5 mg/ml). Desparafinar e hidratar os cortes. Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C por duas horas. Os cortes controles devem ser submetidos à solução salina sem a enzima. Lavar em água destilada. Corar pelo Método do PAS. Resultado: Locais PAS positivos na lâmina controle que diminuirem ou perderem a positividade na lâmina digerida indicam presença de glicogênio. 6.8. DIGESTÃO COM AMILASE Amilase a 2% em solução aquosa de NaCl a 4%. Pingar a solução sobre os cortes e deixar a 37°C durante 30 minutos. 6.9. DIGESTÃO COM HIALURONIDASE TESTICULAR Fazer um solução de hialuronidase testicular 0,1% (1 mg/ml) em tampão Sorensen pH 6,4. Desparafinar e hidratar 2 cortes (A e B). Submeter o corte A à digestão enzimática, enquanto que o corte B recebe apenas o tampão. Corar os dois cortes pelo Alcian Blue pH 2,5 ou Azul de Toluidina. Resultado: Diminuição ou perda da positividade ao Alcian Blue no corte A indica a presença de ácido hialurônico e/ou condroitim-4 ou -6 sulfatado.

DIG-ENZ 4

6.10. DIGESTÃO COM NEURAMINIDASE Fazer uma solução de neuraminidase 500 U/ml em água destilada. Diluir esta solução em igual volume de tampão acetato 0,1M pH 5,5 contendo 1% de NaCl e 0,1% de CaCl2. Desparafinar e hidratar os cortes. Incubar os cortes com a solução enzimática, a 37° C, por 16 a 24 horas. Os cortes controles devem ser incubados no mesmo tampão acetato a 0,05M. Lavar com água destilada. Corar com Alcian Blue - PAS. Montar. Resultado: Locais menos corados pelo Alcian Blue no corte digerido indicam a presença de ácido siálico (sialomucinas).

COLOR 1

7. COLORAÇÕES (TÉCNICAS DE USO CORRENTE) 7.1. EOSINA (usar com hematoxilina de Harris) 0,25 g de eosina amarela em pó (solúvel em água) 100 ml de água destilada 7.2. EOSINA (para usar com Hematoxilina de Ehrlich) 2 g de eosina 1 g de bicromato de potássio 20 ml de solução aquosa saturada de ác. pícrico 20 ml de álcool absoluto 160 ml de água destilada 7.3. HEMATOXILINA DE HARRIS 1 g de hematoxilina cristalizada 10 ml de álcool absoluto 20 g de alúmen de potássio ou de amônio 200 ml de água destilada 0,5 g de óxido de mercúrio (vermelho) 8 ml de ácido acético glacial (optativo) Preparo do corante: Dissolver a hematoxilina no álcool ligeiramente aquecido, dissolver o alúmen em água aquecida. Misturar as soluções e aquecer até ferver. Tirar do fogo e adicionar imediatamente e aos poucos o óxido de mercúrio (agitando para não explodir). Resfriar a solução o mais rapidamente possível, mergulhando o frasco num vasilhame (ou na pia) contendo água fria. Acrescentar o ácido acético e filtrar. Estocar em vidro escuro. Dura cerca de 3 meses. Deve-se filtrar a solução toda vez que for usar.

COLOR 2

7.4. HEMATOXILINA DE EHRLICH 2 g de hematoxilina 100 ml de álcool absoluto 100 ml de glicerina 100 ml de água destilada 10 ml de ácido acético glacial 15 g de alúmen de potássio A hematoxilina deve ser dissolvida no álcool; o alúmen deve ser dissolvido na água. Misturar as duas soluções e adicionar os outros reativos. Deixar amadurecer no sol por 1 mês. Dura muitos anos. Observações: a) O amadurecimento pode ser apressado adicionando-se iodato de sódio, na proporção de 50 mg de iodato de sódio para cada grama de hematoxilina; porém o corante não dura muito tempo. b) Útil para corar tecidos que estiveram expostos a soluções ácidas; assim é recomendada para corar tecidos que sofreram descalcificação ou que ficaram muito tempo no fixador. c) Usar associada à eosina preparada com bicromato de potássio e ácido pícrico. 7.5. HEMATOXILINA DE MAYER 0,2 g de hematoxilina 200 ml de água destilada 0,4 g de iodato de sódio 10 g de alúmen de potássio 10 g de hidrato cloral 0,2 g de ácido cítrico Dissolver a hematoxilina, o alúmen e o iodato na água destilada. Isto pode ser feito a quente ou deixando de um dia para o outro à temperatura ambiente. Após a total dissolução, adicionar o hidrato cloral e o ácido cítrico. Ferver por 5 minutos, esfriar e filtrar. Pode ser usada imediatamente.

COLOR 3

Observação: a) Esta hematoxilina, por não precisar de diferenciação com álccol-ácido, é especialmente útil como corante nuclear nos casos em que é necessário realçar, por contraste, algum componente citoplasmático que tenha sido demonstrado por um corante que sofre descoloração com a diferenciação em álcool ácido (comum para outras hematoxilinas). 7.6. HEMATOXILINA-EOSINA Desparafinar e hidratar os cortes. Corar com hematoxilina, pelo tempo desejado, conforme o tipo e idade da hematoxilina; de modo geral: corar durante 15 a 20 minutos com hematoxilina de Mayer; corar de 2 a 10 minutos com a hematoxilina de Harris e corar de 2 a 10 minutos com a hematoxilina de Ehrlich. Lavar em água corrente por 10 minutos. Caso necessário, proceder à diferenciação em álcool-ácido: solução alcoólica de HCl a 1% (1 ml de HCl em 99 ml de álcool 70°). Controlar a diferenciação ao microscópio até chegar à intensidade desejada. Lavar rapidamente em água corrente, após a diferenciação. Corar pela eosina por 2 minutos. Lavar em água corrente (até que a água esteja limpa). Passar pela bateria de desidratação: passar rapidamente pelo álcool 70°, passar pelo álcool 95°, álcool 100°, xilol e montar. Observações: a) A hematoxilina cora os núcleos primariamente em vermelho e a posterior lavagem em água corrente converte a coloração para o azul (processo de azulecimento da hematoxilina). b) O procedimento de diferenciação da hematoxilina em álcool-ácido raramente é necessário e deve ser feito nos casos em que ocorre uma supercoloração. c) A eosina sofre diferenciação com o álcool 70°; por isso esta passagem deve ser rápida. Se, por acaso, o corte ficar muito descorado ao ser passado pelo álcool 70° , passá-lo novamente pela água e recolocá-lo na eosina. Às vezes, é preferível pular a passagem pelo álcool 70°, colocando diretamente em álcool 95°.

COLOR 4

7.7. SHORR - HEMATOXILINA (para esfregaços vaginais) Pode-se usar o corante comercial ou prepará-lo: 0,5 g de Biebrich scarlat red 0,25 g de Orange G 0,075 g de fast green FCF 0,5 g de ácido fosfotúngstico 0,5 g de ácido fosfomolíbdico 1 ml de ácido acético glacial 100 ml de álcool 50° Procedimento: Fazer o esfregaço numa lâmina e colocá-la imediatamente no álcool 95° para fixação. Deixar no álcool por 15 minutos (pode ficar até 72 horas). Lavar rapidamente em álcool 70°. Lavar rapidamente em água corrente. Corar pela hematoxilina por 30 segundos. Lavar em água corrente por 5 minutos. Lavar em álcool 90°. Corar no corante de Shorr por 5 minutos. Lavar em álcool 95°. Desidratar e montar. Resultado: Reconhecimento das fases do ciclo estral de ratas: No diestro tardio o esfregaço aparece tipicamente atrófico, consistindo de poucas células epiteliais pequenas, arredondadas e nucleadas, enorme quantidade de polimorfonucleares e muco. No começo do proestro decresce em muito a quantidade de polimorfonucleares e o esfregaço compõe-se principalmente de células epiteliais arredondas ou ovaladas e nucleadas. No fim do proestro predominam as células poligonais grandes, achatadas e com núcleo picnótico, sendo que já existem células anucleadas. Com a chegada do estro, o esfregaço apresenta-se basicamente constituído por células cornificadas (células poligonais, grandes, achatadas, anucleadas e acidófilas). No começo do metaestro o esfregaço constitui-se de células cornificadas, polimorfonucleares e muco. No metaestro tardio a imagem é de muitas células epiteliais ovaladas ou arredondadas e nucleadas, associadas a polimorfonucleares e muco. A fase seguinte é o diestro, onde nota-se que o esfregaço torna-se cada vez mais atrófico: as poucas células epiteliais que aparecem são pequenas, arredondadas,

COLOR 5

nucleadas e sempre acompanhadas de grande quantidade de polimorfonucleares e muco.

IV. MÉTODOS HISTOQUÍMICOS

MINERAIS 1

1. MINERAIS 1.1. VON KOSSA (para cálcio) Solução corante: solução aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 5% Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na solução de nitrato de prata, sob luz do dia forte (porém não luz solar direta), durante 10 a 60 minutos. Lavar em água destilada por 1 a 2 minutos. Deixar em água destilada, sob luz difusa, por 10 a 60 minutos (esta passagem pode ser omitida). Reduzir a prata, imergindo os cortes em solução de hidroquinona 0,5% ou solução diluída 1:3 de qualquer revelador fotográfico, durante 2 minutos, agitando sempre. Tratar com solução aquosa de hipossulfito de sódio a 5% durante 2 a 3 minutos, para remover o excesso de prata (controlar ao microscópio). Lavar em água destilada. Contracorar com safranina O a 0,2 a 0,5%, durante 20 a 30 segundos. Montar. Resultado: regiões contendo carbonato ou fosfato de cálcio aparecem coradas em negro; o método demonstra a presença de cálcio de maneira indireta, uma vez que, de fato, é específico para os íons fosfato e carbonato. Observações: a) se os cortes estiverem descolando da lâminas, colodionar com celoidina a 1%, depois do álcool absoluto de montagem, mergulhar no álcool 70° e seguir a montagem. b) a reação consiste em uma dupla troca entre o nitrato de prata e o fosfato ou carbonato de cálcio, levando à formação de carbonato e fosfato de prata insolúveis. Estes compostos são fotossensíveis e escurecem, sobre a ação da luz, formando um precipitado amarelo ou marrom. A passagem pela hidroquinona serve para reforçar a cor destes precipitados, tornando-os negros. c) o material de eleição para esta coloração é joelho de rato de 5 dias de idade, pois ainda é pequeno e permite cortes sem descalcificação.

MINERAIS 2

d) se houver grande quantidade de cálcio depositado, é melhor corar pelo nitrato de prata, em bloco, antes de descalcificar, pois deve-se remover um pouco do cálcio para poder cortar. 1.2. AZUL DA PRÚSSIA E TURNBULL (para Fe+3 ou Fe+2, respectivamente) Solução corante: Preparar na hora de usar: a) para testar a presença Fe+3: solução de ferrocianeto de potássio [K4Fe(CN)6.3H2O] a 1% em ácido clorídrico 0,5%. b) para testar a presença de Fe+2: solução de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 1% em ácido clorídrico 0,5%. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Deixar na solução corante por 60 minutos. Lavar em água corrente. Contracorar os núcleos com corante nuclear vermelho. Lavar em água corrente. Montar. Resultado: pigmentos de ferro coram-se em azul brilhante, núcleos em vermelho e citoplasma em rosa claro. Observação: a) a fixação do material deverá ser feita em formol isotônico (preparado com salina ou PBS) ao pH fisiológico, durante 24 horas. Fixadores ácidos solubilizam os íons ferro e são, portanto, contra-indicados. b) material de eleição: baço e rim de rato ou cobaia injetados, intraperitonialmente, com sangue, durante 6 dias, na dose diária de 1 ml de sangue para cada 100 g de animal.

MINERAIS 3

1.3. DETECÇÃO DE TÁLIO Solução de gás sulfídrico: 7,8 g de Na2S 0,56 ml de H2SO4 100 ml de água destilada Solução de sulfeto de amônia: Solução aquosa de sulfeto de amônia [(NH4)S] saturada com selênio preto (óxido de selênio) Soluções estoques para revelação: Preparar: solução aquosa de goma arábica a 10% (preparada 7 a 14 dias antes e agitada diariamente com um bastão de vidro) solução aquosa de nitrato de prata a 10% (mantida 14 dias no escuro, antes de usar) solução de ácido cítrico a 5% solução de hidroquinona a 2% Solução reveladora de trabalho (líquido de Timm): 100 ml da solução de goma arábica 1 ml da solução de nitrato de prata 2 ml da solução de ácido cítrico 10 ml da solução de hidroquinona Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Tratar pela solução de gás sulfídrico por 15 minutos. Imergir na solução de sulfeto de amônia por 10 minutos. Lavar em água destilada. Passar em H2O2 a 20% até descolorir. Colocar no líquido de Timm (solução de trabalho), durante 20 a 30 minutos, no escuro. Parar a revelação quando os cortes estiverem marrons e não pretos. Lavar em água corrente. Montar. Resultado: depósitos de tálio aparecem como grânulos negros.

MINERAIS 4

Observações: a) Deve-se fazer junto cortes controles, omitindo-se o gás sulfídrico, o óxido de selênio ou o procedimento de revelação. b) A prata e o mercúrio podem interferir na coloração, mas poderão ser identificados no controle sem o óxido de selênio.

RADQUIM 1

2. RADICAIS QUÍMICOS EM PROTEÍNAS 2.1. REAÇÃO PARA CITRULINA (Rogers, 1970) Preparo da solução corante: 1 g de p-dimetil-amino-benzaldeído (reagente de Ehrlich) 4 ml de ácido clorídrico concentrado 23,38 g de NaCl água destilada suficiente para completar 100 ml Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Colocá-los na solução corante e montar no próprio meio de reação. Observar seguidamente ao microscópio até o aparecimento de uma coloração amarelada (demora cerca de 15 a 20 minutos). Fotografar, pois a preparação não pode ser montada de maneira permanente. Resultado: Locais ricos em citrulina, principalmente folículos pilosos, coram-se em amarelho palha. 2.2. REAÇÃO PARA CISTEÍNA (SH) Preparo da solução corante: 30 ml de solução aquosa de cloreto férrico (FeCl3.6H2O) a 1% 4 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 1 % 6 ml de água destilada Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Deixá-los imersos na solução corante recém preparada, por 10 minutos, à temperatura ambiente. Lavar em solução de ácido ácético a 1%. Lavar em água corrente. Montar. Resultado: Locais ricos em radicais SH coram-se em azul. 2.3. REAÇÃO PARA CISTINA (SS) Barka e Anderson, 1963

RADQUIM 2

Preparo da solução corante: 60 ml de solução aquosa de cloreto férrico [FeCl3.6H2O] a 1% 20 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 1 % Preparo da solução de iodoacetamida: 2 g de acetamida 0,5 d iodo ressublimado 100 ml de água destilada Ajustar o pH para 8,5 com NaOH 1N Preparo do tioglicolato de sódio: 5 ml de ácido tioglicólico 50 ml de água destilada 50 ml de NaOH 1N Ajustar o pH para 8,5 com cerca de 5 ml de NaOH 1N Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Submetê-los à ação da iodoacetamida por 24 a 48 horas a 37°C. Lavar em água destilada. Deixar na solução de tioglicolato de sódio por 4 horas. Lavar em solução de ácido acético 1% por 2 minutos. Colocar na solução corante recém-preparada por 10 minutos, no escuro. Lavar demoradamente em água corrente (cerca de 15 minutos). Montar. Resultado: locais em que houve a redução dos grupos SS aparecem corados em pink, vermelho, lilás e azulado. 2.4. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS BÁSICAS EM GERAL Solução corante: naphtol yellow S...............1 g ácido acético..................1 ml água destilada...............100 ml

RADQUIM 3

Solução metiladora: HCl 1N...................0,8 ml álcool metílico...........100 ml Procedimento: Desparafinar, levar até álcool absoluto e colodionar os cortes. Metilar o tecido, à 60°, por cerca de 3 horas. Lavar em álcool e levar até a água. Imergir os cortes na solução corante durante 20 minutos. Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1 minuto cada banho. Desidratar diretamente em álcool butílico terciário, diafanizar e montar. Resultado: locais ricos em proteínas básicas aparecem corados de amarelo vivo. 2.5. DETECÇÃO DE HISTIDINA Solução corante: naphtol yellow S...............1 g ácido acético..................1 ml água destilada...............100 ml Solução metiladora: HCl 1N....................0,8 ml álcool metílico...........100 ml Solução acetiladora: Anidro acético.............40 ml Piridina...................60 ml Procedimento: Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. Metilar o material por 3 horas. Lavar em álcool absoluto. Recolodionar. Deixar na solução acetiladora, por 24 horas. Lavar em piridina por 2 minutos. Lavar em álcool absoluto e levar até a água. Corar pela solução corante por 20 minutos. Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1 minuto cada banho. Desidratar diretamente em álcool butílico terciário, diafanizar e montar.

RADQUIM 4

Resultado: locais ricos em histidina aparecem corados de amarelo vivo. 2.6. DETECÇÃO DE ARGININA Solução corante: 2 ml de solução aquosa de NaOH a 4% 2 gotas de água sanitária, "cândida", solução de hipoclorito de sódio a 5% comercial 4 gotas de solução de alfa naphtol a 1% em álcool 70° Misturar nesta ordem e imediatamente antes do uso. Procedimento: Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. Secar e mergulhá-los em álcool 70°. Levar até a água. Colocar os cortes na horizontal e cobrí-los com a solução corante. Preparar nova solução corante, desprezar a primeira e tornar a cobrir os cortes por 2 minutos. Montar no próprio meio de reação e observar imediatamente. Resultado: locais ricos em arginina coram-se em vermelho tijolo. Observação: a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles, bloqueando-se os radicais guanidil, através da acetilação, assim realizada: após a passagem pelo álcool 70°, lavar os cortes em piridina por 2 minutos e colocá-los na solução acetiladora por 24 horas; em seguida, lavar em álcool absoluto, recolodionar os cortes e realizar a reação para arginina. Solução acetiladora: Anidro acético.............16 ml Piridina...................24 ml

RADQUIM 5

2.7. DETECÇÃO DE TIROSINA Bensley & Gersh, 1933 Preparo do reativo de Millon: Preparar uma solução aquosa de ácido nítrico a 40%, dissolvendo o ácido gota a gota na água (40 ml de ácido em 60 ml de água). Deixar estabilizar por 48 horas. Diluir 40 ml desta solução em 360 ml de água, conseguindo-se assim 400 ml de uma solução de ácido nítrico a 4%. Deixe repousar por 24 horas. Saturar esta solução com excesso de cristais de nitrato de mercúrio. Filtrar e adicionar 1,4 g de nitrito de sódio e 4 ml da solução aquosa de ácido nítrico a 40% (aquela inicial). O reativo de Millon assim preparado pode ser guardado em geladeira por muito tempo. Procedimento: Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. Secar e mergulhá-los em álcool 70°, por 3 minutos. Mergulhar em acetona anidra e deixar secar ao ar. Cobrir com o reagente de Millon. Levar à chama do bico de Bunsen até o aparecimento da coloração tijolo. Lavar bem em solução de ácido nítrico a 2% a 37°C. Resultado: locais ricos em tirosina aparecem em vermelho tijolo. Observação: a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles, através do bloqueio dos radicais p-hidroxi-fenil, por processo de iodação, da seguinte maneira (Landing & Hall, 1956): Após colodionar os cortes, colocá-los diretamente na solução de iodação por 24 horas; em seguida, lavar em água corrente, voltar ao álcool absoluto, recolodionar os cortes e realizar o método para tirosina, a partir da etapa da acetona. Solução de iodação: Iodo.........................3 g Iodeto de potássio...........6 g Água destilada............100 ml

RADQUIM 6

2.8. DETECÇÃO DE TRIPTOFANO Soluções corantes: Solução de p-dimetiaminobenzaldeído (DMAB) a 5% em HCl concentrado Solução de nitrito de sódio a 1% em HCl concentrado. Os cristais de NaNO2 são postos no HCl imediatamente antes de se usar a solução. Mergulhar as lâminas enquanto está havendo formação de gás. Procedimento: Desparafinar e levar as lâminas até álcool absoluto. Recobrir o corte com celoidina, imergindo-o em solução 0,25% de celoidina em álcool absoluto e éter em partes iguais durante 1 minuto. Retirar o corte da celoidina e colocar diretamente na solução de DMAB por 1 minuto. Colocar diretamente na solução de NaNO2 por 1 minuto. Lavar em água corrente por 30 segundos. Passar em solução de álcool ácido (HCl concentrado a 1% em álcool 70°). Montar. Resultados: Locais contendo triptofano aparecem corados em azul. Grânulos de zimogênio das células principais do estômago: moderadamente corados. granulações eosinofílicas: fortemente coradas. queratina: não se cora. grânulos de zimogênio do pâncreas: muito corados. células alfa da ilhota pancreática: azul claro. células beta da ilhota pancreática: não se coram. célula de Paneth: fortemente corada. células absortivas do intestino: azul acinzentado claro. fibras elásticas das artérias: não se coram. Observações: a) o ácido clorídrico puro é extremamente corrosivo e fumegante; trabalhe com luvas e na capela. b) para demonstrar células de Paneth no intestino use animais que foram mantidos em jejum por um noite.

RADQUIM 7

c) pode-se bloquear a reação, utilizando-se o ácido perfórmico, da seguinte maneira: Após colodionar, mergulhar os cortes em solução de formol a 10% em álcool 70° e em seguida, colocá-los na solução de ácido perfórmico por 2 minutos; lavar em álcool absoluto, recolodionar os cortes e aplicar a técnica para triptofano. Preparo da solução de ácido fórmico: Ácido fórmico a 98%......................40 ml Ácido sulfúrico a 65%...................0,5 ml Água oxigenada 100 vol....................4 ml Preparar 3 horas antes de usar e agitar por diversas vezes para remover o gás formado. 2.9. DETECÇÃO DE GRUPOS NH2 (Yasuma & Ichikawa, 1953) Solução corante: solução aloxana a 1% em álcool absoluto Reativo de Schiff: ver método de PAS, em Histoquímica de polissacarídeos Solução de água sulfurosa: 10 ml de metabissulfito de sódio 10 ml de HCl 1N 180 ml de água destilada Procedimento: Desparafinar os cortes e levá-los até o álcool absoluto. Mergulhar as lâminas em solução de aloxana por 24 horas. Lavar em álcool absoluto e levar até a água. Colocar no reativo de Schiff por 30 minutos. Passar por três banhos de água sulfurosa de 2 minutos cada. Lavar em água corrente por 15 minutos. Montar. Resultado: locais ricos em radicais livres NH2 coram-se em vermelho.

RADQUIM 8

Observação: a) pode-se bloquear a reação, através do método de Barka & Anderson (1963), utilizando-se o seguinte procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes, colocá-los na solução bloqueadora por 24 horas; lavar em água e realizar o método da aloxana. Preparo da solução bloqueadora: misturar, na hora de usar, partes iguais de solução aquosa de ácido acético a 12,5% e solução de nitrito de sódio a 15% (ambas geladas).

LIPID 1

3. LÍPIDEOS 3.1. SUDAN BLACK B Preparo da solução corante: Preparar uma solução saturada de Sudan black em álcool 70° e filtrar. Procedimento: Usar cortes de material fresco ou fixado em formol. Cortar em congelação. Imergir os cortes por 10 minutos na solução corante filtrada. Lavar em álcool 70° para retirar o excesso de corante ou até que os cortes controles estejam descorados. Lavar em água corrente. Pode-se contracorar fracamente com hematoxilina. Montar em glicerina. Resultado: lipideos coram-se em negro. Observações: a) a adição de cálcio ao formol fixador contribui para a retenção dos lípides ao tecido. b) Sabe-se que os cristais de colesterol não se coram normalmente com o Sudan black; além disso, os fosfolipídeos se dissolvem no álcool (que é o solvente do corante). Estes dois problemas podem ser contornados usando-se uma solução de brometo da seguinte forma: Obtidos os cortes, deixá-los em uma solução aquosa de brometo a 2,5%, por 1 hora e, em seguida, lavar em uma solução aquosa de 0,5% de metabissulfito de sódio para retirar o excesso de brometo; lavar em água corrente e imergir na solução corante.

POLISS 1

4. POLISSACARÍDEOS 4.1. AZUL DE TOLUIDINA Solução corante: Azul de Toluidina 0,5% em água destilada Procedimento: Corar as lâminas durante 1 a 2 horas. Lavar em água destilada. Montar. Resultado: Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA e polissacarídeos ácidos, com diferentes intensidades de cor, conforme a quantidade de grupamentos ácidos. 4.2. ALCIAN BLUE, pH 2,5 Mowry, R.W.; Ann. N.Y. Acad. Sci, 106 (2): 402-423, 1963. Solução corante: Alcian Blue 8GX 1% em solução aquosa de ácido acético a 3% Preparo da solução corante: 97 ml de água destilada 3 ml de ácido acético glacial 1 g de Alcian Blue 8GX Medir o pH da solução e, se necessário, acertá-lo com HCl 1N ou NaOH 1N. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Passá-los em solução aquosa de ácido acético 3% durante 3 minutos. Corar pela solução corante, por 2 horas. Enxugar o excesso de corante. Lavar em ácido acético 3%, durante 3 minutos. Lavar em água corrente. Montar.

POLISS 2

Resultado: Coram-se, em azul turquesa, carboidratos complexos ricos em grupos carboxilas, ácido hialurônico, carboibratos fracamente sulfatados, carboidratos ricos em ácido siálico. Os carboidratos fortemente sulfatados coram-se fracamente ou não se coram. 4.3. ALCIAN BLUE pH 0,5 e 1,0 Solução corante: solução de Alcian Blue 1% em HCl 0,2 N. Preparo da solução: 1 g de Alcian Blue 8GX 100 ml de HCl 0,2N (para pH 0,5) ou 100 ml de HCl 0,1N (para pH 1,0). Para 100 ml de HCl 0,2N: 1,65 ml de HCl em 98,3 ml de H2O. Para 100 ml de HCl 0,1N: 0,83 ml de HCl em 99,17 ml de H2O. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Passar no HCl 0,2N ou 0,1N, por 3 minutos. Corar na solução corante por 30 minutos. Passar em HCl 0,2N ou 0,1N. Lavar rapidamente em água destilada. Desidratar e montar. Resultado: Locais ricos em polissacarídeos sulfatados coram-se em azul, portanto não cora ácido hialurônico (não-sulfatado). 4.4. METILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + ALCIAN BLUE, pH 2,5 O processo de metilação em alta temperatura promove o bloqueio da basofilia dos polissacarídeos sulfatados e carboxilados; a saponificação posterior restaura a basofilia somente dos polissacarídeos carboxilados. Solução para metilação: 99,2 ml de álcool metílico (metanol) 0,8 ml de HCl

POLISS 3

Solução para saponificação: Solução de BaOH a 4% em álcool 80° ou 1 g de hidróxido de potássio 70 ml de álcool absoluto 30 ml de água destilada Procedimento: Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcool absoluto. Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, passar 5 minutos no álcool 70° e levar até álcool absoluto. Colocar os cortes A e B na solução metiladora pré aquecida por 2 a 5 horas a 60°C. O corte C deve permanecer em água destilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura. Lavar em água corrente e colocar todos os cortes em álcool 70°. Tratar o corte A com uma das soluções saponificadoras, por uma hora à temperatura ambiente. Os cortes B e C devem permanecer em álcool 70°. Lavar em água corrente por 5 minutos. Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as por álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes iguais. Lavar em água, ou em solução de ácido acético a 3%, caso a manutenção do pH seja importante. Corar todos os cortes com Alcian Blue, pH 2,5, por 5 a 30 minutos. Lavar em água corrente. Montar. Resultado: Corte C (Alcian): coram-se os polissacarídeos carboxilados e sulfatados; Corte B (metilação + Alcian): bloqueia a coloração dos polissacarídeos carboxilados e sulfatados; Corte A (metilação + saponificação + Alcian): coram-se somente os polissacarídeos carboxilados.

POLISS 4

Interpretação: Caso o corte A fique tão corado quanto o corte C: indica a presença de polissacarídeos carboxilados somente. Caso o corte A fique menos corado que o corte C: indica a presença de polissacarídeos carboxilados e sulfatados. Caso o corte A não se core pelo Alcian: indica a presença de polissacarídeos sulfatos somente. Observações: a) Sempre que realizar este método colocar para correr junto três lâminas de um material já previamente testado com bons resultados. b) O colódio deve ser bem removido, pois ele se cora com o Alcian Blue, interferindo com o resultado. 4.5. MÉTODO DA HIDRÓLISE ÁCIDA + ALCIAN BLUE (Quintarelli) Solução para hidrólise: acetato de sódio a 0,02M: 0,164 g em 100 ml de água 0,273 g , se for trihidratado. ácido clorídrico a 0,02N: 0,164 ml em 100 ml água Misturar as duas soluções em partes iguais. Medir o pH e acertar para 2,5. Procedimento: Desparafinar e levar até álcool absoluto dois cortes (A e B). Colodionar os cortes. Deixar secar, passar no álcool e água destilada. Colocar o corte A na solução de hidrólise, durante 2 horas a 60°C. Acompanhar o procedimento com o corte B, coberto com água destilada. Descolodionar os cortes com mistura de álcool-éter (partes iguais). Corar pelo Alcian Blue pH 2,5, durante 30 minutos. Lavar em água corrente. Montar. Resultados: Estruturas Alcian Blue positivas na lâmina B, que diminuírem ou perderem positividade na lâmina A, indicam a presença de ácido siálico. Pode-se aumentar o tempo ou a temperatura de hidrólise para obtenção de melhores resultados. 4.6. ALCIAN BLUE + PAS

POLISS 5

Desparafinar e hidratar os cortes. Colocá-los por 30 minutos em solução de Alcian Blue, pH 2,5. Lavar em solução de ácido acético a 3%. Passar em água destilada. Deixar por 10 minutos em ácido periódico a 1%. Lavar rapidamente em água destilada. Deixar por 1 hora no Reativo de Schiff (ver preparo do reativo de Schiff no ítem PAS, em Histoquímica de Polissacarídeos). Lavar em água corrente por 10 minutos. Montar. Resultado: Glicogênio e polissacarídeos neutros em vermelho. Polissacarídeos ácidos em azul. A cor violeta representa associação de ambos. 4.7. ALCIAN BLUE + CONCENTRAÇÃO ELETROLÍTICA CRÍTICA Solução corante: 0,05 g de Alcian Blue 100 ml de tampão acetato 0,2M, pH 5.8 Adicionar MgCl2.6H2O (PM = 203,30) nas diversas molaridades requeridas 0,3M, 0,65M, 0,9M e 1M. Procedimento: Desparafinar e hidratar as lâminas. Corar pelas soluções de Alcian Blue com as diferentes concentrações de MgCl2, por 18 horas, à temperatura ambiente. Lavar em água corrente. Montar.

POLISS 6

Resultado: A presença de uma concentração eletrolítica maior na solução corante proporciona uma coloração seletiva dos polissacarídeos de acordo com o grau crescente de sulfatação. Com MgCl2 0,3M: coram-se todos os polissacarídeos carboxilados e sulfatados. Com MgCl2 0,65M: coram-se todos os polissacarídeos sulfatados. Com MgCl2 0,9M: coram-se heparina, heparam sulfato e queratam sulfato. Com MgCl2 1M: cora-se somente queratam sulfato. 4.8. REAÇÃO FERRO-COLOIDAL (Mowrey) Preparo da solução estoque de ferro-coloidal: Preparar 5 ml de solução de cloreto férrico a 29% (1,45 g de cloreto férrico em 5 ml de água). Ferver 250 ml de água destilada. Com a água fervendo, adicionar 4,4 ml da solução de cloreto férrico. Deixar ferver. Quando a solução ficar vermelho escuro suspender a fervura e deixar esfriar. Dializar a solução contra água destilada gelada 18-24 horas duas vezes. Guardar a solução estoque na geladeira. Dura muitos meses. Na hora de usar, diluir esta solução estoque na seguinte proporção: 12 ml de ácido acético 18 ml de água destilada 10 ml solução estoque de ferro-coloidal Preparo da solução de ferrocianeto clorídrica: Preparar 15 ml de solução de ferrocianeto de potássio a 2%: 0,3 g de ferrocianeto de potássio em 15 ml de água. Preparar 30 ml de ácido clorídrico 1%: 0,3 ml de HCl em 30 ml de água. Misturar as duas soluções na hora de usar. Procedimento para reação: Desparafinar e hidratar o corte. Lavar rapidamente em ácido acético 10%. Colocar na solução de ferro coloidal recém-preparada, durante 2 horas. Lavar em 3 banhos de ácido acético 10%, 3 minutos cada.

POLISS 7

Colocar os cortes expostos ao ferro e os cortes controles (que ficaram na água) durante 20 minutos na solução de ferrocianeto-clorídrica. Lavar em água corrente 5 minutos. Montar. Resultado: Cora polissacarídeos ácidos em azul Observação: a) O ferro coloidal é adsorvido pelos polissacarídeos e é visualizado com a subseqüente conversão para ferrocianeto-férrico (azul da Prússia). 4.9. REAÇÃO DO FERRO COLOIDAL (Muller, 1966) Preparo da solução estoque de hidróxido de ferro coloidal: solução aquosa de cloreto férrico a 32%............12 ml água destilada....................................750 ml Levar a água à ebulição e, quando ferver, ajuntar a solução de cloreto férrico. Dura um mês, no máximo. Solução de trabalho (preparar na hora de usar): solução de hidróxido de ferro coloidal..........100 ml ácido acético....................................10 ml Preparo da solução de ferrocianeto de potássio: Ferrocianeto de potássio..............1 g HCl concentrado......................1 ml Água destilada......................99 ml Procedimento: Desparafinar os cortes e levá-los até a água. Tratar com a solução de trabalho de hidróxido de ferro coloidal, durante 10 minutos. Lavar 5 vezes em água destilada. Tratar pela solução ferrocianeto clorídrica recém preparada, por 10 minutos. Lavar em água destilada. Montar. Resultado: Coram-se os polissacarídeos ácidos em azul. 4.10. PAS (ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF) Solução de ácido periódico a 1%:

POLISS 8

Esta solução pode ser preparada de duas maneiras: periodato de sódio ou potássio ............1 g ácido sulfúrico 1N.......................100 ml ou, a mais usada: ácido periódico............................1 g água destilada...........................100 ml

PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF: Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963 Água destilada........................192 ml Ácido clorídrico concentrado............8 ml Fucsina Básica (Color Index 42510)....0,5 g Sulfito de sódio (Na2SO3)...............5 g ou Metabissulfito de sódio (Na2S2O5).....3,8 g Carvão ativado........................0,5 g Dissolver a fucsina na água adicionada de ácido clorídrico. Junte o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos até que a mistura esteja límpida e de cor marrom avermelhado. Adicione o carvão ativado para descolorir. Agitar por 2 minutos e filtrar. O filtrado deverá ser incolor. O reativo somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 horas após sua preparação. Guardar na geladeira. Observações sobre o Reativo de Schiff: a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido; se não, rejeitá-lo. b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo este pode descolorir totalmente ou ficar com coloração amarelo palha; em qualquer dos casos está bom para ser utilizado. c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do mesmo em alguns mililitros de formol a 10%. Se a solução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode ser usado.

POLISS 9

Procedimento para a realização do método PAS: Desparafinar e hidratar os cortes. Colocar no ácido periódico, durante 10 a 15 minutos, na geladeira. Lavar em várias trocas de água destilada ou lavar 5 minutos na água corrente e, em seguida, passar pela água destilada. Colocar no reativo de Schiff durante 1 hora, no escuro, na geladeira ou durante 15 minutos, no escuro, à temperatura ambiente. Lavar em água corrente por 5 a 10 minutos. Montar. Resultado: Locais ricos em glicogênio ou polissacarídeos neutros, contendo grupos 1,-2 glicol, coram-se em vermelho. Os proteoglicanos não se coram. Observações: a) Ao retirar-se do Reativo de Schiff pode-se passar pelas seguintes soluções: bissulfito de sódio 2% durante 2 minutos ou vários banhos de HCl 3N durante 2 minutos ou 3 banhos de água sulfurosa de 2 minutos cada Preparo da água sulforosa: Metabissulfito de sódio a 10% ...............10 ml HCl 1N.......................................10 ml Água destilada...............................180 ml De modo geral, estes banhos são desnecessários. b) Para material incluído em historesina o ácido periódico deve ser a 0,4% e os cortes devem ficar no Reativo de Schiff por 30 minutos. 4.11. ACETILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + PAS Solução acetiladora: Anidrido acético..................32,5 ml Piridina..........................50,0 ml Solução saponificadora: Solução de BaOH a 4% em álcool 80°

POLISS 10

Procedimento: Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcool absoluto. Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, passar 5 minutos no álcool 70° e levar até álcool absoluto. Passar os corte A e B na piridina por 2 minutos. Colocar os cortes A e B na solução acetiladora recém-preparada, durante 24 horas à temperatura ambiente. O corte C deve permanecer em água destilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura. Lavar em álcool absoluto. Recolodionar os cortes. Passar no álcool 70° por 5 minutos. Passar no álcool 80°. Colocar o corte A na solução saponificadora, por 4 a 5 minutos, a temperatura ambiente. Os cortes B e C devem permanecer no álcool 80°. Lavar em água destilada. Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as por álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes iguais. Lavar em água. Realizar o método de PAS. Resultado: Corte C (PAS): coram-se o glicogênio e os polissacarídeos neutros. Corte B (acetilação + PAS): bloqueia a coloração dos polissacarídeos neutros. Corte A (acetilação + saponificação + PAS): polissacarídeos neutros bloqueados pela acetilação voltam a se corar. 4.12. P.A.S. + BOROHIDRIDO Solução de borohidrido de sódio: Borohidrido de sódio (NaBH4 ; P.M = 37,83)........0,1 g Na2HPO4 (anidro)..................................1,0 g Água destilada...................................100 ml Dissolver o fosfato de sódio na água e então acrescentar o borohidrido. Preparar solução nova cada vez que for usar. O pH deve ser 9,4.

POLISS 11

Procedimento: Desparafinar três lâminas (A, B e C) e levar até a água. Tratar a lâmina A e B com ácido periódico a 1%, por 30 minutos. A lâmina C deve permanecer no ácido periódico por 24 horas. Lavar bem as lâminas em água destilada. Tratar a lâmina B com a solução de borohidrido, por 30 minutos, enquanto a lâmina A espera em solução aquosa de Na2HPO4 .sem o borohidrido. Lavar as lâminas em água corrente. Tratar as lâminas com Reativo de Schiff, por 15 minutos. Lavar em água corrente. Montar. Resultado: Lâmina A: somente os polissacarídeos neutros e o glicogênio aparecem corados em magenta (P.A.S. normal). Lâmina B: bloqueio total da coloração dos polissacarídeos neutros e do glicogênio. Lâmina C: coram-se, em magenta, tanto os polissacarídeos neutros quanto os ácidos (glicosaminoglicanas). Observação: a) Com o tempo maior de exposição ao ácido periódico (24 horas) os grupamentos 1,2 glicol das glicosaminoglicas também dão origem a aldeídos e reagem com o Reagente de Schiff. b) o borohidrido serve para bloquear a positividade do P.A.S. c) Aconselha-se usar cortes colhidos em lâminas com algum tipo de adesivo e/ou colodionar os cortes. d) O tempo durante o qual as lâminas A e B permanecem no primeiro ácido é 30 minutos, ao invés dos 10 a 15 minutos do P.A.S. de rotina. Assim, as glicoproteínas neutras e o glicogênio produzam o máximo de grupamentos aldeídos neste estágio, para que sejam efetivamente bloqueados pelo borohidrido.

ACNUCL 1

5. ÁCIDOS NUCLÉICOS 5.1. COLORAÇÃO DE ACRIDINE ORANGE (Ganter e Jolles) Solução estoque de Acridine Orange: Acridine Orange....................1 g H2O destilada...................1000 ml Solução de Trabalho: Solução Estoque de Acridine Orange.........10 ml PBS (pH 6,0 a 6,5).........................90 ml Corar 15 minutos na solução de trabalho de acridine orange. Lavar em PBS. Cobrir a lâmina com glicerina e observar no microscópio de fluorescência. Observações: a) A fixação do material deve ser feita em Carnoy ou etanol acético; para esfregaços ou culturas de células a fixação deve ser feita em acetona metanol. b) O preparado descora e muda de cor depois de um tempo. c) Alguns autores recomendam, após lavar no PBS, passar em uma solução de cloreto de cálcio 0,1M, por 1 a 2 minutos e, em seguida, lavar em PBS por 10 segundos, antes de montar. Resultado: coram-se as estruturas ricas em ácidos nucléicos. 5.2. AZUL DE TOLUIDINA ÁCIDO Solução corante: Azul de Toluidina 0,5% em água; pH 3,5 (acertar com HCl 0,1N) Procedimento: Corar as lâminas durante 1 a 24 horas a 60°C (com o corante pré-aquecido a esta temperatura). Lavar em água destilada. Imergir em molibdato de sódio ou potássio 1%, por 30 segundos, para evitar descoloração posterior. Montar.

ACNUCL 2

Resultado: Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA e polissacarídeos ácidos. 5.3. MÉTODO DE FEULGEN PARA DNA Solução de ácido clorídrico 1N: 8,5 ml de HCl em 91,5 ml de água destilada. Solução aquosa de metabissulfito de sódio ou de potássio a 0,5%. Reativo de Schiff.

PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963. Água destilada.........................192 ml Ácido clorídrico concentrado.............8 ml Sulfito de sódio (Na2SO3)................5 g ou Metabissulfito de sódio (Na2S2O5)......3,8 g Fucsina Básica (Color Index 42510).....0,5 g Carvão ativado.........................0,5 g Dissolver a fucsina na água adicionada de ácido clorídrico. Juntar o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos até que a mistura esteja límpida e de cor marrom avermelhado. Adicionar o carvão ativado para descolorir. Agitar por 2 minutos e filtrar. O filtrado deverá ser incolor. O reativo somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 horas após sua preparação. Guardar na geladeira. Observações sobre o Reativo de Schiff: a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido; se não, rejeitá-lo. b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo este pode descolorir totalmente ou ficar com coloração amarelo palha; nos dois casos está bom para ser usado. c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do mesmo em alguns mililitros de formol a 10%; se a solução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode ser usado.

ACNUCL 3

Procedimento para realização do método de Feulgen: Desparafinar e hidratar os cortes. Hidrolisar os cortes, a 60°C, durante 5 a 20 minutos, no ácido clorídrico 1N pré-aquecido a esta temperatura. Interromper a hidrólise através de uma lavagem em água destilada. Transferir para o Reativo de Schiff, durante 45 minutos. Lavar os cortes em três banhos de metabissulfito de sódio ou potássio durante 2 minutos cada. Lavar em água corrente. Montar. Resultado: O DNA nuclear cora-se em vermelho escuro. Os núcleos de microorganismos, como plasmódios, sarcosporídeos, toxoplasma, histoplasma, etc., coram-se em vermelho pálido devido ao seu baixo teor de DNA. Observações sobre o método de Feulgen: a) O metabissulfito utilizado deve ser ativo. Conhece-se pelo seu forte cheiro característico. b) O tempo de hidrólise com ácido clorídrico varia com o tipo de fixador que foi usado e com o tempo de fixação. No caso do formol, o tempo de hidrólise é ao redor de 8 minutos; para o Bouin, deve ser um pouco menor; para o Helly, deve ser ao redor de 5 minutos. Para obter bons resultados convém testar vários tempos de hidrólise, entre 5 a 15 minutos para cada bloco utilizado. c) O método de Feulgen baseia-se no fato de que o HCl quebra a ligação purina-desoxiribose formando grupamentos aldeídicos, que podem ser visualizados pelo Reativo de Schiff pela formação de um novo composto de adição insolúvel e de cor vermelho forte. O processo de hidrólise não afeta o RNA, de modo que o método é específico para DNA. d) Se quiser, antes de montar, contracorar em solução 0,01% Fast Green - FCF em álcool 95° durante alguns segundos. e) Se a lâmina estiver colodionada, deve-se retirar o colódio antes de tratar pelo Reativo de Schiff.

ACNUCL 4

5.4. GALOCIANINA Solução corante: 10 g de alúmen de cromo 0,3 g de galocianina 200 ml de água destilada Dissolver o álumen em 200 ml de água e acrescentar a galocianina. Misturar por agitação e levar lentamente à fervura. Ferver por 10 a 20 minutos. Esfriar lentamente. Filtrar e completar para 200 ml com água destilada. A solução deve ter pH 1,8. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na solução corante por 24 a 48 horas. Lavar em água destilada. Montar. Resultado: Ácidos nucléicos corados em azul profundo. 5.5. LÍTIO-CARMIN (de Örth) Preparo da solução corante: Preparar 100 ml de solução saturada de carbonato de lítio (aproximadamente 1,25 g em 100 ml). Dissolver 2,5 a 5,0 g de carmin (C.C.) em 100 ml da solução de carbonato de lítio e levar à ebulição. Ferver durante 10 a 15 minutos. Quando esfriar, adicionar 1 g de timol e filtrar. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na solução corante por 2 a 5 minutos. Transferir diretamente para o álcool-ácido. Proceder a um ou mais banhos em álcool-ácido para fixar o corante no núcleo e para diferenciação; controlar a diferenciação ao microscópio. Lavar em água corrente. Desidratar em álcool 95° e 100°. Montar. Resultado: núcleos em vermelho; citoplasma rosa claro ou descorado.

GRANUL 1

6. GRÂNULOS CITOPLASMÁTICOS 6.1. SIRIUS RED ALCALINO - HEMATOXILINA Solução corante: Sírius Red F3B .........................0,5 g álcool absoluto.........................50 ml Solução aquosa de NaOH a 1%..............1 ml Solução aquosa de NaCl a 20%.............4 ml Água destilada..........................45 ml Dissolver o Sírius na água destilada; acrescentar o álcool e, em seguida, o NaOH. Agitar várias vezes até dissolver bem. Deixar repousar por duas horas; gotejar lentamente, agitando bem, o NaCl até obter um ligeiro precipitado; deixar repousar de um dia para o outro e filtrar; a solução se conserva, na geladeira, por um ou dois meses. Procedimento: Desparafinar e levar até a água. Corar pela hematoxilina por 2 a 3 minutos. Lavar em água corrente por 5 minutos. Passar pelo álcool 70°. Corar no Sírius alcalino por 1 hora. Lavar em água corrente por 10 minutos. Montar. Resultado: Coram-se em vermelho os eosinófilos e amilóide. Observações: a) Após o acréscimo do NaOH, o pH da solução ficará em torno de 12 e permanecerá assim até o final. A receita original manda acertar o pH para 10,5, o que pode ser feito acrescentando-se gotas de HCl 1N nesta etapa. Para evitar-se o acréscimo de HCl, pode-se omitir o NaOH, pois, em qualquer das três circunstâncias, ou seja, com NaOH (pH 12), com NaOH e HCl (pH 10,5) ou sem nenhum dos dois (pH 11), o corante funciona perfeitamente.

GRANUL 2

6.2. LEISHMAN (para esfregaços de sangue) Solução corante estoque: 0,2 g de Leishman 100 ml de álcool metílico p.a. O corante leva um mês para amadurecer e dura anos. Solução corante de trabalho: Na hora de usar, diluir o corante na proporção de 1 ml de corante para 3 ml de água tamponada. Procedimento: Fixar o esfregaço em metanol, por 2 a 3 minutos. Colocar sobre o esfregaço a solução corante de trabalho e deixar de 3 a 5 minutos. Lavar em água tamponada. Secar ao vento. Examinar ao microscópio com óleo de imersão. Resultado: grânulos dos eosinófilos: rosa alaranjado. grânulos dos neutrófilos: púrpura a violeta. grânulos dos basófilos: violeta escuro. núcleo dos monócitos: violeta claro. citoplasma dos monócitos: cinza claro. grânulos centrais das plaquetas: violeta. grânulos periféricos das plaquetas: azul claro. eritrócitos: coloração variando de rosa amarelado a cinza, dependendo do pH. Observação: a) a água tamponada deve ser feita adicionando-se 1 ml de tampão fosfato 0,1M (pH 6,5) para cada 30 a 40 ml de água destilada. b) aconselha-se, após a coloração, proceder a uma diferenciação com água destilada (que é ligeiramente ácida) ou com ácido acético muito diluído (0,05%) para retirar o excesso de azul, tornar as hemácias bem rosadas e realçar os grânulos dos eosinófilos.

FIBRMATR 1

7. FIBRAS DA MATRIZ EXTRACELULAR 7.1. ALDEÍDO-FUCSINA (Gomori) Solução corante: Fucsina básica...........0,5 g Álcool 70°...............100 ml Dissolver a fucsina, se necessário com ligeiro aquecimento. Deixar esfriar. Filtrar. Adicionar: Ácido clorídrico concentrado ...1 ml Paraldeído......................1 ml Deixar a solução amadurecer à temperatura ambiente (48 hs) ou a 50°C (menos tempo), em recipiente fechado. A solução passa de vermelho para roxo, quando estará em condições de ser usada. Quando guardada a 4°C pode ser usada por várias semanas. À temperatura ambiente dura até 4 dias. Solução Oxidante: Ácido per-acético a 40% encontrada comercialmente ou preparada da seguinte maneira: ácido acético........................9,5 ml ácido sulfúrico.....................0,25 ml peróxido de hidrogênio a 30%........30,0 ml A solução deve amadurecer por 1 a 3 dias e ser estocada em geladeira (4°C). Colocar 4 mg de fosfato dissódico após os 3 dias para estabilizar a solução. Procedimento para coloração: Desparafinar e hidratar os cortes. Oxidar os cortes com a solução de ácido per-acético a 40% por 30 minutos. Lavar em água corrente por 2 minutos. Corar com aldeído-fucsina por 10 a 20 minutos. Diferenciar os cortes: 4 trocas em álcool 95° por 2 minutos e uma troca em álcool 70° por 4 minutos; controlar ao microscópio. Desidratar, diafanizar e montar.

FIBRMATR 2

Resultado: Sistema elástico em púrpura. Omitindo-se a oxidação dos cortes, coram-se apenas as fibras elásticas e elaunínicas. Outras estruturas que também se coram: algumas glicosaminoglicanas (como por exemplo, aquelas presentes na matriz cartilaginosa e nos grânulos dos mastócitos), queratina, grânulos de zimogênio, células beta do pâncreas e hipófise. Observações: a) Recomenda-se fixar o material em fixadores aldeídicos como o formol ou o Bouin que praticamente não dão coloração de fundo. Fixadores com sais de mercúrio (como Helly ou Zenker) dão coloração de fundo lilás pálido. b) O aldeído-fucsina é um corante transitório. A fucsina básica (vermelha) com paraldeído, sob condições ácido-alcóolica, forma gradualmente um corante violeta denominado aldeído-fucsina (à temperatura ambiente). O corante forma-se lentamente, e após um período de 2 semanas ocorrem posteriores modificações, quando as substâncias formadas não são mais úteis como corante. Para preservar por mais tempo o corante costuma-se mantê-lo a 4°C. Alguns autores acham que mesmo nesse caso o corante não é muito confiável. c) Em vez de usar o ácido per-acético é preferível proceder a oxidação com solução 10% de OXONA, por 30 minutos (ver Técnica da Resorcina-Fucsina de Weigert) ou oxidar com solução de monoperssulfato de potássio, por 2 a 3 minutos; usar solução recém preparada, de acordo com a seguinte instrução: 10 ml de permanganato de potássio a 2,5%: 0,25 g/10 ml de água destilada 10 ml de ácido sulfúrico a 5%: 0,52 ml/10 ml de água 80 ml de água destilada d) Recomenda-se que o paraldeído usado na preparação do corante seja novo (não mais de 3 ou 4 meses).

FIBRMATR 3

7.2. CRESIL - VIOLETA (fibras oxitalânicas) Garotek & Jewemoka, 1964 (Cotta-Pereira) Solução corante: solução aquosa de cresil-violeta a 0,01% Solução oxidante: solução aquosa de Oxona a 10% (ver técnica da Resorcina Fucsina de Weigert) Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Oxidá-los pela Oxona, por 40 minutos. Lavar 5 minutos em água corrente. Corar 15 minutos na solução de cresil-violeta. Montar. Resultado: Coram-se as fibras oxitalânicas. 7.3. IMPREGNAÇÃO ARGÊNTICA (Gomori) Soluções necessárias: Solução de prata amoniacal: Preparar 20 ml de solução aquosa de nitrato de prata a 10%. Preparar 3,0 ml de sol. aquosa de hidróxido de potássio 10%. Preparar 50 ml de sol. aquosa de hidróxido de amônia a 28%. Misturar 10 ml da solução de nitrato de prata em 2,5 ml da solução de hidróxido de potássio. Adicionar, gota a gota, a solução de hidróxido de amônia, agitando energicamente o frasco somente até o ponto em que o precipitado se dissolva. Em seguida, adicionar, gota a gota, a solução de nitrato de prata, até que se forme um pouco de precipitado, o qual se dissolve facilmente com a agitação. Completar para o dobro de volume com água destilada e estocar em vidro escuro. Filtrar antes de usar. Imediatamente antes de usar, diluir 1:8 em água destilada. Solução de Permanganato de Potássio a 0,5% Solução de Metabissulfito de Potássio a 2%

FIBRMATR 4

Solução de Sulfato Férrico - Amoniacal a 2% Solução de Formalina a 20% Formaldeído (37-40%)......20 ml Água destilada............80 ml Solução de Cloreto de Ouro a 0,2% Solução de Cloreto de ouro a 1%.......10 ml Água destilada........................40 ml Para fazer a solução de Cloreto de ouro 1% quebre a ampola de cloreto de ouro (15 gramas) em um béquer com 100 ml de água destilada. Solução de Tiossulfato de Sódio a 2% Procedimento: Desparafinar e hidratar as lâminas Lavar em água destilada. Atenção: daqui para frente, pingar as soluções sobre os cortes. Oxidar em permanganato de potássio, por 1 minuto. Lavar em água corrente por dois minutos. Diferenciar com solução de metabissulfito, por 1 minuto. Lavar em água corrente por 2 minutos. Passar na solução de sulfato férrico-amoniacal, por 1 minuto. Lavar em água corrente, por 2 minutos. Lavar em duas passagens de água destilada, 30 segundos cada. Impregnar na solução de prata amoniacal, durante 10 segundos a 1 minuto. Mergulhar em água destilada por 20 segundos. Reduzir na solução de formalina, por 3 minutos, agitando suavemente durante o primeiro minuto. Lavar em água corrente por 3 minutos. Passar em água destilada (2 a 3 banhos). Fazer a viragem em cloreto de ouro, por 10 minutos (até ficar cinza). Mergulhar em água destilada. Reduzir na solução de metabissulfito de potássio, por 1 minuto. Fixar na solução de tiossulfato de sódio, por 1 minuto. Lavar em água corrente, por 2 minutos. Montar.

FIBRMATR 5

Resultado- fibras reticulares em negro, fibras colágenas em castanho e coloração de fundo em cinza. Observações: a) Este método é bastante complexo e deve ser seguido nos mínimos detalhes. b) Os frascos contendo as soluções devem ser perfeitamente limpos. c) Todos os reagentes devem ser da maior pureza possível e acuradamente medidos e pesados. d) Qualquer excesso de hidróxido de amônia na solução de prata amoniacal provoca perda da sensibilidade do método, resultando em preparados fracamente ou não corados. e) Devido ao fato dos reagentes empregados serem de natureza bastante alcalina, os cortes tendem a se soltarem da lâmina. Assim sendo, deve-se proceder à colagem dos cortes, tomando-se cuidado para não colocar colantes em excesso, pois resultam em formação de precipitados em lugares inadequados. f) Os reagentes devem ser sempre dissolvidos em água destilada ou deionizada, para evitar precipitação de sais de prata insolúveis. g) A solução de tiossulfato de sódio serve para remover o excesso de prata que fica no tecido sob a forma não-precipitada. h) A impregnação pela prata deve ser, ao final, convertida em impregnação pelo ouro para resultar em um preparado permanente e produzir uma coloração negra de alta densidade. i) Se for utilizar soluções preparadas há mais de um mês e estocadas na geladeira, antes de corar o material desejado, core um material já testado com bons resultados, pois alguma das soluções pode não estar funcionando mais. 7.4. ORCINOL - NEOFUCSINA (método usado por Cotta-Pereira para fibras elásticas) Fullmer & Lillie, 1956, 1958. Preparo da solução de orcinol-neofucsina: Colocar em ebulição 200 ml de água destilada. Adicionar 2 g de neofucsina (cuidado). Adicionar 4 g de orcinol (cuidado). Deixar em ebulição por 5 minutos. Adicionar 25 ml de solução aquosa de cloreto férrico a 30%. Deixar em ebulição por mais 5 minutos.

FIBRMATR 6

Deixar esfriar e filtrar. Descartar o filtrado e dissolver o depósito retido no papel de filtro em 100 ml de etanol 95°. Estocar na geladeira, por até 3 meses. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar em solução de orcinol-neofucsina, por 15 minutos, a 37°C (com o corante pré-aquecido a esta temperatura). Passar em três trocas de álcool 70°, por 5 minutos em cada troca. Desidratar, diafanizar e montar. 7.5. ORCEINA Solução corante: 1 g de orceína 100 ml de álcool 70° 0,6 ml de HCl concentrado Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar com a solução de orceína durante 30 a 60 minutos. Enxaguar em água destilada. Secar a água em excesso. Passar no álcool 95° para tirar o excesso de corante. Deixar no álcool absoluto durante 5 a 30 minutos até que o corte esteja castanho claro. Verificar ao microscópio se as fibras elásticas estão bem pretas. Descorar o fundo colocando os cortes no álcool ácido: 1 ml de HCl em 99 ml de álcool 70°; este procedimento deve ser feito, controlando ao microscópio, até que o fundo fique bem incolor. A descoloração é obtida entre 2 a 10 minutos. Lavar em água corrente durante 5 minutos. Montar. Resultado: fibras elásticas coradas em castanho-preto.

FIBRMATR 7

7.6. PICROSSÍRIUS - HEMATOXILINA Sírius Red..............................0,2 g Solução saturada de ácido pícrico.......100 ml Misturar e colocar um pouco de ácido pícrico (em pó) para que apareça um precipitado no fundo do frasco. Procedimento: Desparafinar e levar as lâminas até água. Corar durante 1 hora no Picrossírius à temperatura ambiente. Lavar em água corrente por 5 minutos. Corar pela Hematoxilina de Harris por 6 minutos (ou menos, se a hematoxilina for nova). Lavar por 10 minutos em água corrente. Montar. Observações: a) Trocar o corante uma vez por mês se este for muito utilizado. b) A solução deverá estar sempre saturada. c) Especificação do Sirius Red: F 3 B 200 (Mobay Chemical Co., Union, NJ). d) Para experimentos quantitativos deve-se omitir a contracoloração pela hematoxilina. e) Ler sobre o método do Picrossírius associado à digestão pela papaína em DIGESTÃO ENZIMÁTICA. 7.7. RESORCINA-FUCSINA DE WEIGERT COM E SEM OXIDAÇÃO Solução corante: Resorcina-Fucsina Solução oxidante: Oxona 10% em água destilada Preparo da Solução corante: Água destilada ..............200 ml Fucsina básica ................2 g Resorcina .....................4 g Cloreto férrico a 30%..........50 ml Álcool 95.....................200 ml HCl concentrado ................2 ml Adicionar a fucsina e a resorcina na água destilada. Colocar esta solução em ebulição. Adicionar o cloreto férrico. Continuar em ebulição por 4 minutos. Esperar esfriar e filtrar. Descartar o filtrado e deixar secar o depósito retido no papel de filtro. Dissolver este

FIBRMATR 8

depósito em 200 ml de etanol 95° aquecido. Deixar esfriar e adicionar o HCl. Guardar a solução na geladeira. Dura um ano ou mais. A) Procedimento para os cortes que não serão oxidados: Desparafinar e hidratar até álcool 95°. Corar pela Resorcina-fucsina, por 1 hora, à temperatura ambiente. A Resorcina-fucsina deve estar à temperatura ambiente antes de colocar os cortes para corar. Lavar na água corrente durante 5 minutos. Colocar em duas trocas de álcool 70°durante 10 minutos no total. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciação. Desidratar, diafanizar e montar. Se necessário, depois do álcool 70°,remover a coloração de fundo passando em uma solução de álcool-ácido a 1% (1 ml de HCl concentrado em 99 ml de álcool 70). Controlar ao ao microscópio tendo o cuidado de preservar a coloração das fibras mais finas; após a diferenciação em álcool-ácido lavar em água corrente. B) Procedimento para cortes que serão oxidados: Desparafinar e hidratar até água. Pingar sobre os cortes a solução aquosa de OXONA 10% e deixar oxidando durante 40 minutos (ver observação b.). Lavar em água corrente por 5 minutos. Passar pelo álcool 70°. Passar pelo álcool 95°. Corar pela Resorcina-fucsina durante 1 hora, à temperatura ambiente. Lavar na água corrente durante 5 minutos. Colocar em duas trocas de álcool 70°durante 10 minutos no total. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciação. Desidratar, diafanizar e montar. Se necessário, depois do álcool 70°,remover a coloração de fundo passando em uma solução de álcool-ácido a 1% (1 ml de HCl concentrado em 99 ml de álcool 70°). Controlar ao ao microscópio tendo o cuidado de preservar a coloração das fibras mais finas; após a diferenciação em álcool-ácido lavar em água corrente. Resultado: nos cortes que não foram submetidos à oxidação coram-se fibras elásticas e elaunínicas; nos cortes submetidos à oxidação coram-se fibras elásticas, elaunínicas e oxitalânicas.

FIBRMATR 9

Observação: a) Se o cloreto férrico contiver impurezas, a coloração não sairá bem; até mesmo o cloreto férrico novo pode ter sais ferrosos e pode ser substituído por nitrato férrico que é considerado livre de sais ferrosos. b) Referência da OXONA: composto monopersulfato, Du Pont, Wilmington, Delaware, E.U.A.). 7.8. HEMATOXILINA FÉRRICA DE VERHOEFF Preparo da solução corante: Hematoxilina..................................1 g Álcool 100°..................................20 ml Solução aquosa de cloreto férrico a 10%.......8 ml Solução de Lugol..............................8 ml Preparo da solução de Lugol: Iodo...........................2 g Iodeto de potássio.............4 g Completar para 100 ml com água destilada. Preparo do Bouin: Solução saturada aquosa de ácido pícrico........750 ml Formol 36-40%...................................250 ml Ácido acético glacial............................50 ml Preparo da solução diferenciadora: cloreto férrico...............1 g água destilada...............50 ml Dissolver a hematoxilina no álcool. Adicionar a solução de cloreto férrico. Misturar e adicionar o lugol. Procedimento: Desparafinar os cortes e levar até à agua. Colocar na solução de Bouin por 30 minutos. Lavar em água corrente. Colocar na solução corante por 20 a 30 minutos. Lavar em água corrente. Diferenciar por poucos segundos na solução de cloreto férrico, controlando ao microscópio até que estejam coradas somente as fibras elásticas; se diferenciar demais, voltar para a solução corante. Lavar em água corrente. Lavar em álcool 95° por 2 a 5 minutos para remover qualquer coloração devida apenas ao iodo. Lavar em água corrente. Desidratar rapidamente através do gradiente alcoólico.

FIBRMATR 10

Diafanizar e montar. Observações: a) Prepare todas as soluções na hora do uso e só core em solução corante recém preparada. b) Se o cloreto férrico contiver impurezas, a coloração não sairá bem; até mesmo o cloreto férrico novo pode ter sais ferrosos e pode ser substituído por nitrato férrico, que é considerado livre destes sais. c) O Bouin atua como mordente, aumentando o contraste das fibras elásticas após a diferenciação. 7.9. TRICRÔMICO DE MALLORY Soluções corantes: Solução A: 0,5 g de fucsina ácida 100 ml de água destilada Solução B: 0,5 g de azul de anilina 2,0 g de orange G 1,0 g de ácido fosfotúngstico Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar pela solução A durante 2 minutos. Passar diretamente para a solução B, corando durante 5 a 10 minutos. Lavar em água corrente até tirar o excesso de corante. Passar pelo álcool 80° por alguns segundos. Desidratar e montar. Resultado: Tecido conjuntivo cora-se em azul e tecido muscular em vermelho. 7.10. AZAN (modificado por Heidenhaim) Soluções corantes: Solução A (solução de azocarmin): 0,25 a 1,0 g de azocarmin B 100 ml de água destilada 1 ml ácido acético glacial Se for usado o Azocarmin G, saturar 100 ml de água destilada, por aquecimento, com 0,1 g do corante; esfriar e acidificar com 1 ml de ácido acético glacial.

FIBRMATR 11

Solução B (azul de anilina-orange G): Preparo da solução estoque: 0,5 g de azul de anilina solúvel em água 2,0 g de orange G 8,0 ml de ácido acético glacial 100 ml de água destilada Dissolver o orange G na água destilada; acrescentar lentamente e misturando sempre, o ácido acético; adicionar o azul de anilina e filtrar. Preparo da solução de trabalho: 33 a 50 ml da solução B estoque misturados à água destilada que seja suficiente para 100 ml. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na solução A, na estufa 50 a 55°, por 30 a 60 minutos e, em seguida, continuar corando pela solução, à temperatura ambiente, por 1 a 2 horas. Lavar em água destilada. Mergulhar em solução de ácido acético a 1% em álcool 95°. Colocar em solução aquosa de ácido fosfotúngstico a 5%, durante 30 minutos a 3 horas (mordente). Lavar em água destilada durante 3 minutos. Corar na solução B de trabalho, durante 1 a 3 horas. Lavar em água destilada. Dar dois banhos de álcool 95°, dois banhos de álcool 100° e dois banhos de xilol. Montar.

FIBRMATR 12

Resultado: vermelho: núcleo, osteócitos, eritrócitos, neuroglia, depósitos de imunocomplexos na membrana basal de alças capilares glomerulares. vermelho alaranjado: músculo. azul: membrana basal, fibras colágenas, fibras reticulares, fibrina, muco, saliva. Observação: a) a solução A e a solução estoque B devem ser guardadas em geladeira; a solução de trabalho B deve ser descartada.

HISTORES 1

V. HISTORESINA

HISTORES 2

ÍNDICE

1. FIXAÇÃO

2. DESIDRATAÇÃO

3. INCLUSÃO

4. MICROTOMIA

5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES

6. COLORAÇÃO

7. USO DO KNIFE-MAKER DO ADOLPHO LUTZ

HISTORES 3

1. FIXAÇÃO

Uma das dimensões do material a ser fixado deverá medir no

máximo 1 a 2 mm para que o fixador penetre bem. A fixação

deverá ser feita em solução de paraformaldeído a 4% em PBS

neutro ou solução de glutaraldeído a 2% isotônica e

neutra. O tempo de fixação deverá ser de 6 a 12 horas

(ideal é 8 horas).

2. DESIDRATAÇÃO

Álcool 70°, por uma noite (no mínimo por 2 horas);

Deixar em acetona pura, por 2 a 3 dias, trocando-a

diariamente.

A desidratação poderá ser feita também da seguinte maneira:

Desidratar em álcool 70°, por uma noite;

2 banhos em álcool 95°, de 30 minutos cada

4 banhos em álcool absoluto (total de 2 a 3 horas)

Órgãos que contenham ar, como o pulmão, devem ser

colocados no vácuo por aproximadamente 30 minutos, durante

a passagem no álcool 70°.

3. INCLUSÃO

O material pode ser incluído em cápsulas de gelatina

(formato de cápsulas de remédio) ou em forminhas

retangulares de plástico, que se prestam mais pelo próprio

formato e por permitirem mudar o plano de corte.

HISTORES 4

3.1. PREPARAÇÃO DA RESINA

Durante o processo de inclusão são utilizadas duas

soluções (A e B) preparadas a partir do kit para

Historesina adquirido comercialmente:

PREPARO DA SOLUÇÃO A:

Solução de peróxido de benzoila a 1% em Tecnovit 1 ou

Historesin (hidroxietil metacrilato), preparada da

seguinte maneira:

0,15 g de peróxido de benzoila

15 ml de Tecnovit 1

Agitar suavemente por 10 a 15 minutos.

Usa-se a solução A para a pré-inclusão.

Esta solução é estável à temperatura ambiente por 4

semanas.

Esta quantidade é suficiente para a inclusão de 10 blocos

em cápsulas de gelatina.

Pode-se guardar na geladeira por até uma semana.

PREPARO DA SOLUÇÃO B:

5 ml da solução A

0,33 ml do polimerizador (Tecnovit 2).

Misturar cerca de 5 minutos.

Esta solução é usada para a inclusão propriamente dita e

deve ser feita no momento de usar e colocada no gelo; caso

HISTORES 5

contrário, polimeriza em cerca de 10 minutos. Pode ficar

no gelo até por 1 hora sem polimerizar-se.

Se a resina for velha, pode-se agregar mais polimerizador,

até 0,46 ml em 5 ml da solução A.

Necessita-se cerca de para 0,5 ml por cápsula de gelatina.

3.2.PROCEDIMENTO PARA INCLUSÃO:

Colocar o material numa mistura 1:1 de solução A e acetona

(ou álcool absoluto, caso a desidratação tenha sido feito

nele), por 12 horas, girando.

Colocar em resina pura, a 24 horas, girando.

Encher as cápsulas de gelatina ou as forminhas de plástico

com a solução B recém-preparada; se usar forminhas de

plástico, untá-las com silicone antes de colocar a resina,

para evitar que se ressequem e assim, duram mais.

Colocar o material com a superfície de corte próxima ao

local que vai ser cortado; se a inclusão é em cápsula de

gelatina, deve-se colocar a superfície de corte para o

fundo da cápsula; se é forminha de plástico, deve-se

colocar a superfície de corte para baixo.

Se o material se deslocar ou estiver em posição

inadequada, pode-se posicioná-lo dentro da cápsula na

posição desejada, com a ajuda de um alfinete ou palito de

dente.

Encher totalmente a cápsula com a resina ou a forminha de

plástico (até ficar abaulado) e colocar um pedaço de

plástico transparente na superfície; este procedimento

HISTORES 6

serve para que a polimerização ocorra de maneira homogênea

em todo bloco, pois se a superfície ficar em contacto com

o ar demora mais a se polimerizar.

Deixar polimerizar na estufa a 37 a 45° (a estufa de

Junqueira é a 40°), por 24 horas, no mínimo. Após as

primeiras 6 a 8 horas, retirar o plástico da superfície

para que a polimerização se complete.

Depois de polimerizar, retirar a cápsula de gelatina em

que o bloco está envolto, mergulhando-a em água morna,

quase quente; esfregar o bloco com os dedos até que este

não esteja mais escorregadio; secar com papel absorvente.

Em seguida, colocar na estufa para secar; é interessante

colocar sílica na estufa, para absorver a umidade. Se a

inclusão for feita com forminhas de plástico, soltar os

blocos como se retira o gelo da forma.

4. MICROTOMIA EM HISTORESINA

Como regra geral, deve-se cortar um mesmo material em

várias espessuras (1 µm, 2 ou 3 µm e 5 µm) e pescá-los na

mesma lâmina.

O método para a microtomia varia de acordo com a inclusão

do material que pode ter sido feita em cápsulas de

gelatina (formato de cápsulas de remédio) ou em forminhas

retangulares plásticas.

No caso de inclusão em cápsulas, a microtomia pode ser

feita tanto no piramitomo do Laboratório de Microscopia

Eletrônica, quanto no micrótomo do Laboratório de

HISTORES 7

Microscopia Óptica (LEIKA). Se for cortar no piramitomo as

facas de vidro devem ser aquelas feitas no Knife-maker da

Microscopia eletrônica (são mais finas); se for cortar no

micrótomo deve-se usar facas de vidro mais grossas, feitas

no Knife-maker da Microscopia Óptica.

No caso de inclusão em forminhas plásticas, a microtomia

deve ser feita sempre no micrótomo Leica ou no micrótomo

de parafina, para o qual foi feito um adaptador para facas

de vidro. As facas devem ser aquelas grossas, feitas no

Knife-maker da Microscopia Óptica. Caso necessário, saiba

que existe um Knife-maker Dupond do Laboratório de

Microscopia Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, que

também faz facas grossas.

Os blocos provenientes de inclusão em forminhas de

plástico devem ser colados em cubinhos de madeira (2x2x2

cm), através de araldite.

4.1. Microtomia para blocos feitos em cápsulas

A microtomia deve ser feita no piramitomo ou no micrótomo

Leica, de acordo com as instruções de uso destes

aparelhos.

4.2. Microtomia para blocos incluídos em forminhas

plásticas

As facas de vidro utilizadas no micrótomo de parafina

devem ser feitas no knife-maker Leica da Microscopia

Óptica ou no Dupond do Laboratório de Microscopia

HISTORES 8

Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, pois são mais

resistentes, por serem feitas em vidro mais grosso que

aquelas feitas no knife-maker LKB da microscopia

eletrônica. Porém, em último caso, pode-se usar as facas

de vidro feitas neste, adaptadas ao micrótomo de parafina.

4.2.1. Microtomia no micrótomo de parafina:

Acopla-se o adaptador para facas de vidro ao micrótomo,

deixando-o bem firme na posição desejada, apertando-se o

parafuso A com a chave em forma de L.

Desaparafusa-se o botão B, que solta o carro C. Neste, há

uma fenda na ponta onde coloca-se a faca de vidro. Traz-se

o carro C totalmente para a direita para facilitar a

colocação da faca. Prende-se novamente o carro C,

aparafusando o botão B de forma que o carro C fique

imóvel.

Desaparafusa-se o botão D que dá uma mobilidade

independente à fenda. Coloca-se a faca de forma que o lado

que não é de corte fique rente ao lado inferior da fenda,

e o lado maior fique sobre a base larga da fenda. Aperta-

se bem o botão D, e assim, a faca e a fenda estão fixas.

Solta-se novamente o botão B, leva-se o carro C para a

esquerda de forma a acertar a posição da faca na frente do

bloco. Acerta-se o ângulo desejado observando a escala de

papel E no corpo do adaptador; o ângulo melhor é 7°.

Aperta-se novamente o botão D, determinando-se a micragem

desejada e pode-se iniciar a microtomia.

HISTORES 9

4.2.2. Microtomia no micrótomo Leica:

Ligar o estabilizador de voltagem.

Ligar o aparelho.

Apertar o botão TRIM e ajustar a micragem desejada para

trimar o bloco.

Colocar o bloco no suporte.

Ajustar a sua posição com a ajuda dos botões laterais após

destravá-los, girando a trava em forma de L que fica em

cima à esquerda.

Colocar a faca e travá-la com a avalanca da direita no

próprio suporte de faca.

Verificar se o carrinho da faca está travado (botão na

frente do aparelho).

Regular a micragem desejada para o corte (botão preto à

direita do aparelho em cima).

Programar o curso do canhão (1, 2 ou 3).

Proceder à trimagem.

Desligar o botão TRIM e começar a cortar com a micragem

estabelecida.

OBS: Tanto para começar ou parar de trimar ou cortar deve-

se apertar o botão RUN/STOP.

CUIDADO: o aparelho possui um sistema automática de trava

(botào vermelho à esquerda) que serve para parar todas as

suas funções em caso de emergência. Para que isto ocorra

deve-se apenas empurrá-lo para dentro. Nada mais vai

funcionar até que este botão seja novamente puxado para

frente com um leve giro para à direita.

HISTORES 10

HISTORES 11

5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES

Tanto para materiais incluídos em cápsulas quanto para

aqueles incluídos em formas plásticas, os cortes obtidos

devem ser esticados em água limpa à temperatura ambiente.

Para cortes difíceis de esticar, molhar a ponta de um

pincel em clorofórmio puro e encostá-lo bem perto do corte

na água.

Pesca-se em lâminas limpas. Não é necessário nada para

grudar os cortes nas lâminas. Se quando o corte está

flutuando perceber que há bolhas de ar embaixo, prender a

ponta do corte (segurando com uma pinça pela resina) e,

passar um estilete debaixo do corte para que as bolhas

saiam; fazer isto com o corte flutuando sobre a água o

tempo todo.

As lâminas podem ser secas em estufa à temperatura de

cerca de 37°C, caso não haja especificação em contrário.

6. COLORAÇÃO

6.1. AZUL DE TOLUIDINA - FUCSINA BÁSICA

Solução corante de Azul de toluidina 0,1% em solução

aquosa

Preparo da solução:

0,3 g de Toluidina

HISTORES 12

300 ml de água destilada

Filtrar no dia seguinte. Deixar o frasco imóvel, à

temperatura ambiente.

Pode-se usar o azul de toluidina usado para corar os

cortes grossos da microscopia eletrônica, porém o

Junqueira não recomenda.

Solução corante de fucsina básica: solução aquosa de

fucsina básica (pararosaniline ou fucsina diamante) a 0,1

ou 0,2%.

Preparo da solução:

0,1 ou 0,2 g de fucsina básica (pararosaniline da Sigma ou

fucsina diamante)

100 ml de água destilada

Filtrar.

Procedimento para coloração:

Colocar a solução de azul de toluidina sobre as lâminas

utilizando-se uma pipeta Pasteur comum e deixar corando

por 1 a 4 minutos (conforme o material: por exemplo,

órgãos como o baço, o fígado e pâncres, devem corar por

cerca de 1,5 minutos, enquanto que órgãos cujas células

tem pouco RNA devem ficar corando por mais tempo). O

frasco com o corante, depois de filtrado, deve ser mantido

HISTORES 13

imóvel (nunca tirá-lo do lugar, nem levantá-lo, nem

sacudí-lo). Além disso, deve-se tomar o cuidado de retirar

a solução sempre do meio do frasco: não enfiar a pipeta

até o fundo do frasco e nem retirar o corante da

superfície.

Lavar jogando água destilada sobre os cortes com uma

pisseta.

Colocar uma gota de água destilada e deixar sobre o corte

por 30 segundos. Escorrer.

Cobrir os cortes com a solução de fucsina, por 6 a 30

segundos. A fucsina diferencia ligeiramente o azul de

toluidina; assim sendo deve-se colocar a fucsina sobre o

corte e ficar observando; quando começar a sair uma nuvem

azulada retirar imediatamente a fucsina.

Lavar jogando água destilada sobre os cortes com uma

pisseta.

Colocar uma gota de água destilada e deixar sobre o corte

por 30 segundos. Escorrer. A fucsina deve ser bem lavada

para não formar uma semi-lua de corante em volta do corte.

Depois de lavar, cobrir os cortes com uma solução aquosa

de molibdato de sódio a 0,1%, por 30 segundos; escorrer

bem, agitando bem ao ar, para que não fique depósito.

Secar, com um papel de filtro, ao redor do corte.

Colocar na estufa a 37°,para secar.

Montar.

Resultado:

HISTORES 14

Coram-se em azul as substâncias ácidas, como ácidos

nucléicos e alguns grânulos de secreção; coram-se em

fucsia as mitocôndrias e outros grânulos de secreção.

HISTORES 15

Observação:

a) Pode-se corar somente com o azul de toluidina, pulando-

se a coloração pela fucsina. Se não for corar pela fucsina

deve-se deixar no azul de toluidina por somente 1 a 2

minutos, para não corar demasiadamente.

b) É importante passar pelo molibdato; caso contrário, o

azul de toluidina descora com o tempo.

7. USO DO KNIFE-MAKER LEICA

Este Knife maker deve ser usado para fazer facas de vidro

grossas para microtomia de blocos de historesina que foram

incluídos tanto em forminhas retangulares plásticas como

em cápsulas de gelatina e que serão cortados no micrótomo

Leica ou no micrótomo de parafina antigo usado com

adaptador.

Manipular os vidros pegando sempre nas superfícies, nunca

dos lados.

Lavar as barras de vidro com detergente fraco em água em

água fria e secar com lenço de papel.

Cortar as barras em retângulos sucessivamente menores

(sempre nas metades) até obter quadrados. Para isto

colocar o botão 1 na posição "barras". Levantar a alavanca

3; colocar a barra de forma a encostá-la no pino à

esquerda e encaixá-la no suporte preto; observe que o

risco do fabricante deve ficar para baixo. Abaixar a

HISTORES 16

alavanca 3 com um pouco de pressão; puxar o riscador 2 e

girar a alavanca 4, segurando-a com um pouco depressão até

que o vidro se quebre. Como o vidro vai ficando cada vez

menor e deve ser cortado sempre na metade usar os outros

dois pinos guias para apoiar o vidro.

Os quadrados devem agora ser cortados em triângulos, que

serão as facas propriamente ditas. Para isto, deve-se

mudar o botão 1 para a posição "losango com uma barra

atravessando-o de um lado para o outro totalmente";

levanta-se a alavanca 3; coloca-se o quadrado de vidro com

a parte mais perfeita voltada para o aparelho e não para o

operador; coloca-se a pinça 6 sob o quadrado de vidro e

abaixa-se a alavanca 3; traz-se com cuidado o botão 6 para

a frente até encostar no vidro. Ajuste-se a alavanquinha 5

de modo a somente prender o vidro, sem apertá-lo (este

procedimento tem por função segurar as facas para que no

final elas não caiam e quebrem). Abaixe a alavanca 3 com

leve pressão dos dedos de cima para baixo na parte

superior (branca); risca-se o vidro, trazendo-se o

riscador 2 para frente; coloca-se devagar a alavanca 4

para a direita até que faca começe a quebrar; a partir

daí, esperar até que a faca se quebre sozinha.

8. USO DO KNIFE-MAKER DUPOND DO ADOLPHO LUTZ

Este knife-maker está no Laboratório de Microscopia

Eletrônica do Instituto Adolpho Lutz e deve ser usado para

HISTORES 17

fazer facas de vidro para microtomia de blocos de

historesina que foram incluídos em forminhas retangulares

de plástico.

Manipular os vidros pegando sempre nas superfícies, nunca

dos lados.

Lavar com detergente fraco em água fria e secar os

retângulos de vidro (10x5 cm).

Cortar os retângulos de vidro em quadrados grandes de 5x5

cm.

Cortar os quadrados grandes em retângulos de 2,5 x 5 cm e

estes, por sua vez, em quadrados de 2,5 x 2,5 cm.

PROCEDIMENTO PARA CORTAR OS VIDROS:

Passar pincel a superfície do aparelho para eliminar

esquírolas de vidro.

Centrar o retângulo grande no aparelho com a parte riscada

pelo fabricante para baixo. Abaixar a alavanca (1),

rodando a manivela no sentido do relógio até encostar as

borrachas laterais no vidro. Nesta altura a manivela

endurece. A partir daí girar a manivela mais uma volta e

meia, para prender bem o vidro.

Trazer o controle (2) para fora.

Puxar o riscador de vidro (3) para fora, apertar o botão

desse riscador e impulsionar de maneira contínua e

ininterrupta o riscador para dentro. Esta etapa é crítica;

se o botão for apertado demais o risco será fundo e

HISTORES 18

irregular e não se obtém facas boa; se apertar pouco, o

vidro não risca. A intensidade do aperto do botão depende,

pois, da experiência. Colocar a tampa de plástico (medida

de segurança).

Rodar o apertador de vidro (4) sempre em sentido horário,

gradualmente, por etapas até quebrar o vidro. Este

processo deverá ser lento. Após cortar o retângulo, virar

a manivela (1) em sentido anti-horário, e retirar o vidro.

Nunca girar o apertador de vidro (4) em sentido anti-

horário (ele volta à posição inicial sozinho).

Seguir sempre o mesmo procedimento de cortar o vidro até

obter quadrados de 2,5 x 2,5 cm.

OBTENÇÃO DAS FACAS DEFINITIVAS:

Colocar os quadrados de 2,5 x 2,5 com o canto mais regular

e mais perpendicular olhando para o aparelho. A borda

irregular do vidro deve ser colocada para cima, isto é, ao

contrário do que foi feito até agora.

Centrar o quadrado na sua posição correta empurrando para

a frente o centrador preto. Com o centrador preto

pressionando a faca, prender o quadrado, girando a

manivela (1) como descrito anteriormente.

Apertar o controle (2) para dentro do aparelho, trazer o

riscador (3) para fora, apertar o botão e riscar o vidro,

colocar a tampa de plástico e girar o apertador (4)

lentamente até quebrar o vidro.

PROCE-ME 1

VI. PROCESSAMENTO DE MATERIAL

PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA

DE TRANSMISSÃO

PROCE-ME 2

ÍNDICE

1. FIXAÇÃO

1.1. Glutaraldeído

1.2. Tetróxido de Ósmio

1.3. Acetato de Uranila

1.4. Rotina de Fixação

2. DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO

2.1. Em araldite 6005

2.2. Em Resapol

2.3. Em Medcast

2.4. Em Araldite CY-205

3. MICROTOMIA

3.1. Uso do piramitomo para desbastar o bloco

3.2. Uso do ultramicrótomo para desbastar o bloco

3.3. Obtenção dos cortes finos

3.4. Coloração dos cortes finos

3.5. Obtenção de cortes ultra-finos

3.6. Coloração de cortes ultra-finos

4. CARBONIZAÇÃO

5. PREPARAÇÃO DE TELAS

5.1. Lavagem de telas

5.2. Cobertura da tela com parlódio

6. MÉTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS

BACTERIANOS EM PREPARADO TOTAL

PROCE-ME 3

1. FIXAÇÃO:

Os fixadores usados rotineiramente são: glutaraldeído,

ósmio e uranila. O glutaraldeído fixa as proteínas, o

tetróxido de ósmio fixa principalmente lipídeos, enquanto

que o acetato de uranila reduz a extração de ácidos

nucléicos, fosfolipídeos, proteínas.

1.1. GLUTARALDEÍDO 2,0 % EM TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO E POTÁSSIO 0,15M, pH 7,2 1.1.1. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09): 13,6 g/100 ml de água destilada 34,0 g/250 ml de água destilada Solução B: solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) 17,8 g/100 ml de água destilada 44,5 g/250 ml de água destilada ou solução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98) 26,8 g/100 ml de água destilada 67,0 g/250 ml de água destilada ou solução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98) 35,8 g/100 ml de água destilada 89,5 g/250 ml de água destilada Guardar as soluções A e B no congelador.

PROCE-ME 4

Na hora de usar, descongelar as soluções estoques e

misturá-las de acordo com a tabela abaixo para fazer

solução tampão sódio-potássio 0,15M; pH = 7,0 a 7,2

Solução A Solução B Completar com H2O para

28,5 ml 71,5 ml 660 ml

14,25 ml 35.75 ml 330 ml

04,75 ml 11,91 ml 110 ml

Medir o pH do tampão e corrigí-lo, se necessário.

Congelar de novo as soluções estoques.

1.1.2. PREPARO DO GLUTARALDEÍDO:

Existem várias embalagens de glutaraldeído: frascos

grandes de 250 ml e ampolas de 10, 25 e 70 ml com

glutaraldeído. Nestas embalagens o glutaraldeído pode

estar em diferentes porcentagens: 10, 25, 50 ou 70%.

No caso de ampolas, deve-se lavá-las bem com EXTRAN e

enxaguar abundantemente; deixar secar.

Colocar luvas e quebrar a ampola envolvendo-a em uma gaze

limpa, para não deixar a gordura da mão no vidro. Evitar

qualquer contato manual. Deve ser feito em capela, pois é

tóxico.

No caso de frascos com grande quantidade de líquido, deve-

se retirar a quantidade de glutaraldeído desejada com um

pipeta muito bem lavada (com Extran ou solução

sulfocrômica), muito bem enxaguada e seca.

PROCE-ME 5

1.1.3. PREPARO DO GLUTARALDEÍDO A 2%:

Colocar o tampão fosfato 0,15M, pH 7,0 a 7,2, em uma

proveta e por cima despejar o glutaraldeído com um pipeta

muito limpa, misturar e dividir em vidrinhos.

Se a ampola de GA for a 70%, misture 10 ml GA em 340 ml de

tampão;

Se a ampola de GA for a 50%, misture 10 ml GA em 240 ml de

tampão;

Se a ampola de GA for a 25%, misture 10 ml GA em 115 ml de

tampão.

Estocar em vários vidrinhos de tamanhos diversos (10 ml,

20 ml, 40 ml) e deixar rotulado (nome, data, pessoa que

fez a solução), no congelador.

Observação: se não for diluir todo o glutaraldeído que

tinha na ampola, deve-se vedar o frasco muito bem e

colocar no congelador, rotulado. Porém, uma vez aberta a

ampola, sempre é melhor diluir todo o seu conteúdo e

estocar o glutaraldeído já a 2%.

PROCE-ME 6

1.1.4. FIXAÇÃO DE FRAGMENTOS DE TECIDO POR GLUTARALDEÍDO

Descongelar os vidrinhos de glutaraldeído,

imediatamente antes da cirurgia, aquecendo-os apenas com o

calor da mão. Colocar os fragmentos em vidrinhos contendo

glutaraldeído a 2% em tampão fosfato 0,15M, pH 7,2, e

deixar por 2 horas, à temperatura ambiente.

Se o material for usado para o estudo das fibras do

sistema elástico deve-se dissolver 0,1% de ácido tânico na

solução fixadora de glutaraldeído 2%, na hora de usar,

para aumentar o contraste. Em todo caso, deve-se sempre

fixar fragmentos com e sem ácido tânico.

O fragmento a ser fixado deve ter um dos lados com 1

mm de espessura, para permitir a penetração do fixador.

Aconselha-se a cortar o material na forma de um palito de

cerca de 3 a 5 mm de comprimento, 1 mm de lagura e 1 mm de

espessura.

Após as duas horas, cada minuto a mais que o material

ficar no fixador, só contribui para piorar sua qualidade;

assim sendo é essencial que ele seja submetido à rotina de

fixação (lavagem, tratamento pelo tetróxido de ósmio,

seguido de lavagem e colocação no acetato de uranila: ver

ROTINA DE FIXAÇÃO).

Se por acaso, o material for entregue ao Laboratório

no final da tarde e na impossibilidade de alguém ficar por

cerca de 1 hora a mais para seguir a rotina até o acetato

de uranila, então deve-se esperar completar as duas horas

de fixação, lavar em solução de lavagem por um minuto e

deixar em solução de lavagem por, no máximo, 40 horas,

tendo-se o cuidado de retomar o quanto antes a rotina de

fixação.

PROCE-ME 7

1.1.5. FIXAÇAO DE CULTURA DE CÉLULAS Tratar cada garrafa ou tubo de cultura com 2,0 ml de EDTA

0,02% em PBS, por tempo suficiente para descolar a monocamada.

Colher a suspensão de células num tubo de ensaio, tipo "Ependorff" ou similar, centrifugar a baixa rotação para formar um "pellet". A centrifugação deve ser feita por 4 minutos a ½ ponto da centrífuga CELM, cerca de 200 a 500 giros por minuto.

Escoar o sobrenadante. Ressuspender, adicionando glutaraldeído 2% em tampão

fosfato; com delicadeza, deve-se descolar o "pellet" das paredes do tubo; deixar no fixador por 5 minutos.

Centrifugar novamente e seguir as demais etapas da rotina de fixação.

1.1.7. APROVEITAMENTO PARA ME DE PEÇAS INCLUÍDAS EM

PARAFINA Desbastar o bloco, retirando o máximo de parafina. Escolher a região que vai ser incluída para microscopia

eletrônica. Com um bisturi, separar a região escolhida do resto do

bloco. Deixar overnight no xilol para dissolver a parafina. No dia seguinte, recortar para o tamanho adequado para

Microscopia eletrônica e hidratá-lo, segundo a bateria a seguir:

1 banho de álcool 100° por 15 minutos. 1 banho de álcool 95° por 15 minutos. 1 banho de álcool 70° por 15 minutos. Ápos a hidratação, lavar em solução de lavagem. Colocar no glutaraldeído a 2% em tampão fosfato. Seguir a rotina de fixação, desidratação e inclusão.

PROCE-ME 8

1.2. TETRÓXIDO DE ÓSMIO

Fazer uma solução-mãe de tetróxido de ósmio a 4% (1,0 g de

ósmio para 25 ml de água deionizada). Para isto:

Lavar bem a ampola de tetróxido de ósmio, com Extran,

lavar em água corrente por 3 minutos (ou deixar de molho

por 4 horas em solução sulfocrômica e lavar por 1 hora em

água corrente). Passar por água deionizada e deixar secar.

Colocar 10 ml de água deionizada no frasco onde será feita

a solução-mãe, colocar a ampola dentro e quebrá-la com

auxílio de bastão de vidro. Acrescentar 15 ml de água

deionizada. Não filtrar (deixar a ampola quebrada dentro

do frasco).

Colocar na geladeira e só usar no dia seguinte, quando

deverá estar totalmente dissolvido.

A solução de tetróxido de ósmio deve ser guardada na

geladeira na seguinte embalagem:

Dentro de um vidro coberto com papel alumínio, com tampa

fechada com fita crepe e coberta com papel alumínio;

colocar este vidro dentro de uma embalagem hermética.

Rotular (nome, quantidade, data e quem fez a solução).

Sempre que usar, marcar quem usou, quantidade e data.

Solução de trabalho de tetróxido de ósmio:

Na hora de usar, preparar solução de tetróxido de ósmio a

1%, diluindo a solução-mãe 1:3 em solução de lavagem.

PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM:

NaCl.....................6,0 g

Sacarose................73,0 g

PROCE-ME 9

Água destilada......... completar para 1 litro

GUARDAR NA GELADEIRA

Verificar se não tem fungo antes de usar a solução de

lavagem.

1.3. ACETATO DE URANILA PARA FIXAÇÃO

Fazer uma solução mãe de acetato de uranila a 3% (3 g de

acetato de uranila em 100 ml de água deionizada). Não

filtrar.

Estocar sempre em vidro com tampa de rosca; não usar tampa

de vidro para evitar contaminação.

Guardar na geladeira envolvido por papel alumínio e

rotulado.

Solução de trabalho de acetato de uranila para fixação:

Na hora de usar, diluir a solução-mãe para 1%, misturando

2 ml solução de lavagem e 1 ml de uranila a 3%.

1.4. ROTINA DE FIXAÇÃO

Fazer toda a manipulação dentro da capela

1) Deixar o material na solução fixadora de glutaraldeído

2% em tampão fosfato sódio-potássio 0,15M, pH 7,2, à

temperatura ambiente por 2 horas; jogar o fixador em um

vidro de descarte de glutaraldeído.

2) Lavar 3 vezes em solução de lavagem: tempo total de 1

minuto; jogar a solução de lavagem usada no vidro de

descarte de glutaraldeído.

PROCE-ME 10

3) Para cada vidro com material colocar 2 ml de solução de

tetróxido de ósmio a 1% e deixar 1 hora na geladeira.

Jogar o descarte em um vidro de ósmio usado.

4) Lavar três vezes em solução de lavagem, 1 minuto cada

lavagem, colocando o descarte num vidro de ósmio usado.

5) Para cada vidro com material colocar 2 ml de solução de

acetato de uranila a 1% e deixar "overnight" na

geladeira.

6) Lavar três vezes em solução lavagem.

2. DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO

Este processo deve ser feito em um único dia, não podendo

ser interrompido em nenhuma etapa.

A inclusão pode ser feita em diversos tipos e marcas de

resina e o procedimento para a desidratação varia de

acordo com a resina.

As resinas ficam estocadas na geladeira juntamente com o

óxido de propileno e devem ser retiradas da geladeira duas

horas antes do uso.

Enquanto o material está na estufa em resina pura, colocar

resina nas forminhas próprias para inclusão, de maneira a

encher totalmente a barquinha.

Neste momento, coloque também um pedacinho de papel

vegetal (ou manteiga) com o número do registro do

material; escrever com tinta nanquim ou à lápis.

Deixar à temperatura ambiente.

Retire os frascos da estufa e, com o auxílio de um palito

de dente, retire o material e coloque-o nas forminhas na

posição adequada (de acordo com a orientação desejada).

PROCE-ME 11

Após a polimerização (ver o tempo para cada tipo de

resina), retirar os blocos da forminha como se fossem

cubos de gelo; se estiverem grudados, deixe de um dia para

outro à temperatura ambiente. Se os blocos estiverem

grudando sempre, passe um pouco de silicone na forminha

antes de colocar a resina.

Arquive os blocos que não serão cortados imediatamente.

PROCE-ME 12

2.1. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO COM ARALDITE

6005

2.1.1. Desidratação

1 banho de acetona 30°, por 10 minutos

1 banho de acetona 70°, por 10 minutos

1 banho de acetona 95°, por 10 minutos

2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada

2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada

2.1.2. Preparação do Araldite 6005

Quando o material estiver no primeiro banho de óxido de

propileno, prepare a resina.

Esta receita dá para a inclusão completa de 4 frascos

contendo material a ser processado.

10 g de Araldite 6005

9,0 g de DDSA (plastificador)

0,46 ml de BDMA (endurecedor)

2.1.3. Infiltração do Araldite 6005

Preparar uma solução de resina diluída em óxido de

propileno, na proporção de 1:2, em quantidade suficiente

para colocar-se 2 ml desta solução em cada frasco contendo

material.

Colocar esta solução nos frascos contendo material e

deixar durante 30 minutos no girador.

Após este tempo, retire a solução 1:2 e coloque 2 ml de

solução de resina diluída em óxido de propileno, na

proporção de 1:1, em cada frasco. Deixar no girador por 2

horas.

Após as duas horas, retirar a solução de resina diluída em

óxido de propileno e colocar cerca de 2 ml de resina pura,

PROCE-ME 13

em cada frasco de material. Deixar 40 minutos na estufa

58°C.

Incluir o material(Ver Ítem Desidratação e Inclusão).

Manter na estufa 58/60°, por 72 horas, antes de cortar.

2.2. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM RESAPOL

2.2.1. Desidratação

1 banho de acetona 30°, por 10 minutos

1 banho de acetona 70°, por 10 minutos

1 banho de acetona 95°, por 10 minutos

2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada

2.2.2. Preparação do Resapol

Fazer uma solução que contenha 80% de Resapol 8001 (duro)

e 20% de Resapol T208 (mole). Adicionar peróxido de

benzoila anidro, na proporção de 0,5 g para cada 100 ml de

resina.

Fazer uma quantidade de Resapol que seja suficiente para

colocar em cada frasco 5,5 ml de solução até a fase

overnight e 0,4 ml de resina pura por bloco.

2.2.3. Infiltração e Inclusão em Resapol

Colocar nos frascos com o material as seguintes soluções,

nesta ordem:

Solução de Resina Resapol + acetona (1:3), por 30 minutos

Solução de Resina Resapol + acetona (1:1), por 30 minutos

Solução de Resina Resapol + acetona (3:1), por 30 minutos

Resina Resapol pura, na estufa a 55°, por 12 horas.

Incluir o material (Ver Ítem Desidratação e Inclusão)

PROCE-ME 14

Deixar 3 a 4 dias na estufa 60° para endurecer, antes de

cortar.

PROCE-ME 15

2.3. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM MEDCAST

2.3.1. Desidratação

1 banho de acetona 30°, por 10 minutos

1 banho de acetona 70°, por 10 minutos

1 banho de acetona 95°, por 10 minutos

2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada

2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada

2.3.2. Preparação do Medcast

Misturar nesta ordem:

Medcast (resina)..........11,9 g (equivalente a 9,8 ml)

DDSA (plastificador).......2,3 g (equivalente a 2,4 ml)

NMA (endurecedor).........10,1 g (equivalente a 0,3 ml)

DMP-30 (acelerador)........0,4 g (equivalente a 0,4 ml)

2.3.3. Infiltração e Inclusão em Medcast

Colocar nos frascos contendo material uma mistura de óxido

de propileno e resina Medcast, na proporção de 1:1.

Deixar por 1 hora, no girador.

Em seguida, dar 2 banhos de resina Medcast pura, com a

duração de 30 minutos cada, no vácuo.

Incluir o material (Ver ítem Desidratação e Inclusão)

Deixar 3 a 4 dias na estufa a 60°, antes de cortar.

2.4. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM ARALDITE CY-

205

2.4.1. Desidratação:

1 banho de acetona 30°, por 10 minutos

1 banho de acetona 70°, por 10 minutos

PROCE-ME 16

1 banho de acetona 95°, por 10 minutos

2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada

2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada.

2.4.2. Preparação do Araldite CY-205:

Araldite CY-205...........10 g

DDSA........................8 g

DMP30......................0,6 ml

Dibutil fitalato.........0,035 ml

Misture na seqüência acima e coloque para homogeinizar na

batedeira em rotação lenta (em torno de 30 ac.volts),para

que não se formem bolhas.

Esta receita é suficiente para a inclusão de seis

vidrinhos contendo material.

2.4.3. Infiltração e inclusão em Araldite CY-205:

Colocar o material em uma mistura (1:1) de resina e óxido

de propileno e deixar no girador por 2 a 3 horas à

temperatura ambiente.

A sguir, retirar a mistura anterior dos vidrinhos, colocar

resina pura e colocar na estufa a 37º, por 1 hora.

Retirar da estufa e incluir o material nas barquinhas (ver

ítem Desidratação e Inclusão).

Deixar na estufa a 60º, por 72 horas.

3. MICROTOMIA

3.1. FAZER FACAS DE VIDRO NO KNIFE-MAKER LKB

3.1.1. Corte do retângulo maior:

PROCE-ME 17

Lavar os vidros com detergente neutro (nunca segurá-lo

pelas laterais) e secar com lenço de papel.

O ângulo do Knife-maker deve estar entre 90 e 100° para

que sejam obtidas facas de 50 graus, que são as que se

usam normalmente para microtomia.

Colocar o vidro inteiro no Knife Maker com o lado

serrilhado do fabricante para cima, o vidro deve estar

rente a chapa bege de plástico (A), que determina o

ângulo, e a extremidade direita da faca deve estar na

mesma direção do pontinho (B) no próprio Knife Maker à

direita do suporte do vidro (C). Nesta fase o botão

seletor (1) acima do riscador deve estar nos risquinhos.

Baixar a braçadeira de pressão (2) através da alavanca (3)

fazendo uma leve pressão segurando-a para não dar tranco

sobre o vidro.

Puxar o riscador (4), e girar o botão preto (5) para fazer

pressão até que se possa observar uma "barriguinha" no

interior do vidro; esperar; cortar e separar o retângulo

em dois menores.

3.1.2. Obtenção dos losangos

Colocar um dos retângulos menores de vidro rente a chapa

(A); conforme descrito anteriormente, sendo que a

extremidade esquerda do vidro deve estar encostada no

primeiro pininho de metal à esquerda do riscador (4) e

seguir normalmente como descrito anteriormente até que os

losangos estejam prontos.

3.1.3. Obtenção das facas

Os losangos obtidos devem ser colocados no Knife Maker:

PROCE-ME 18

a) com o lado serrilhado do fabricante para baixo, e os 2

pontos observados no vidro do lado que foi cortado devem

estar para cima, para esquerda e para frente.

b) o botão seletor (1) acima do riscador, deve estar no

25.

c) a escala atrás do vidro deve estar sempre no 2.

d) Encaixe do losango:

prender o botão (6) que está na lateral do aparelho

baixar a braçadeira de pressão (2)

puxar o riscador (4)

girar o botãozinho de escala (35,45,55) (6) até final.

fazer pressão com botão preto (5) até que se possa

observar a formação de "barriguinha" no vidro, o barulho

que indica que o vidro quebrou deve ser seco e oco.

3.2. DESBASTAR O BLOCO

Primeiramente deve-se desbastar o excesso de resina do

bloco.

Para isto pode-se usar o piramitomo ou então, prender o

bloco no ultramicrótomo e apará-lo com uma gilete.

3.2.1. USO DO PIRAMITOMO PARA DESBASTAR O BLOCO

Regras Gerais:

- Travar (LOCKED) 41, cada vez que for mexer nos

parafusos.

- Quando começar a aparecer vermelho na janela (33),

travar e com o 40 voltar tudo até o branco total.

- Após trimar cada face, recuar o braço pora-bloco; para

isto, zerar a escala de espussura, travar o braço e voltar

com o 40.

PROCE-ME 19

Procedimento:

No caso do material ser pequeno, e portanto estar sobrando

muita resina ao seu redor, antes de colocar no piramitomo,

dar uma debastada com a serra ou lima retirando a resina

ao redor do material e também da superfície.

Colocar o bloco no suporte do piramitomo (20) e prender

bem, apertando os três parafusos.

Colocar o suporte na peça 22 do piramitomo.

Colocar a faca de vidro (17) na peça 14 e olhando na lupa,

acertar o fio da faca no eixo X.

Aproximar a faca soltando alavanca 13, e empurrando todo o

suporte (12) colocar a escala em 90° do lado esquerdo do

aparelho. Dessa maneira expõe-se o material a ser cortado.

Colocar o 29 na posição indicada pelo diagrama mexendo o

último parafuso (30).

Começar a cortar com a manivela 42, acertando a micragem

desejada no pino da direita (39).

Aproximar e cortar até chegar na peça.

Afastar a faca.

Acertar o cabeçote com desenho da base menor na marca da

esquerda.

Para fazer as bases e os lados colocar sempre o suporte no

60° do lado esquerdo do aparelho.

Faca a 60°.

Aproximar e cortar até que entre base maior e menor tenha

0,3 mm no aumento I (escala na objetiva da esquerda).

Acertar cabeçote com desenho de um dos lados de pirâmide

na marca da esquerda.

Faca a 60°.

Aproximar e cortar até chegar bem perto da peça.

Afastar a faca.

PROCE-ME 20

Mudar cabeçote para a posição com o desenho do outro lado

da pirâmide na marca da esquerda.

Ver esquema no interior da tampa do aparelho (38).

Aproximar e cortar até chegar bem perto da peça e medir na

escala, deixando entre um lado e outro 0,6 mm tomando por

referência a base maior (aumento 1 X).

Afastar faca, retirar faca, retirar bloco, escovar

aparelho, desligar luz e cobrir o aparelho com o plástico.

3.2.2. USO DO ULTRAMICRÓTOMO PARA DESBASTAR O BLOCO

Acoplar o bloco no suporte apropriado para blocos do

ultramicrótomo e, olhando na lupa, aparar a superfície e

as laterais com uma gilete.

3.3. OBTENÇÃO DE CORTES SEMI-FINOS

São cortes de cerca de 1 a 2 µm, também chamados de cortes

grossos, e podem ser obtidos tanto no ultramicrótomo como

no piramitomo.

3.3.1. NO PIRAMITOMO

Coloca-se o bloco de maneira apropriada para cortar-se a

superfície, calibrar para cortes de 2 µm e cortar.

Colocar o corte na superfície de água destilada em uma

cuba; o corte vai esticar. Juntar cerca de 4 a 5 cortes e

colhê-los mergulhando uma lâmina sob os cortes; arrumá-los

com o auxílio de um pincel fino. Secar rapidamente a

lâmina em chapa aquecida ou na estufa. Está pronta para a

coloração.

PROCE-ME 21

3.3.2. NO ULTRAMICRÓTOMO

Acopla-se o bloco no suporte do ultramicrótomo e procede-

se à microtomia, obtendo-se cortes esverdeados (cerca de 2

µm). Os cortes cairão automaticamente na água da barquinha

acoplada à própria faca de vidro utilizada no

ultramicrótomo.

Com auxílio de uma alça de platina ou de um pelo duro

(cílio ou cabelo de japonês) na ponta de um palito, colher

os cortes em uma lâmina. Secar e corar.

4. COLORAÇÃO DE CORTES SEMI-FINOS

Solução corante: Azul de Toluidina a 0,25% em solução

aquosa de borato de sódio a 1%

Preparo da Solução:

1 g de Toluidina

4 g de Borato de Sódio

4 ml de álcool absoluto

400 ml de água destilada

Dissolver 1 g de Azul de toluidina em 4 ml de álcool

absoluto.

Dissolver 4 g de borato de sódio em 400 ml de água

destilada.

Misturar as 2 soluções e filtrar.

PROCE-ME 22

Procedimento para coloração:

À FRIO: Colocar 1 gota sobre os cortes (que deverão estar

sobre uma lâmina de vidro) e deixar corar por cerca de 1

minuto. Lavar em água destilada. Secar no papel de filtro.

À QUENTE: Colocar 1 gota sobre os cortes, aquecer na chapa

rapidamente até formar um halo metalizado. Lavar em água

destilada. Secar no papel de filtro.

Se quiser, pode montar a lâmina com lamínula e resina de

montagem.

5. OBTENÇÃO DE CORTES ULTRAFINOS (ULTRAMICROTOMIA)

Aparar o bloco de modo a conter o local desejado na

superfície de corte.

Colocar o bloco no porta-espécime e fixá-lo no braço do

ultramicrótomo.

Colocar a faca (de vidro ou de diamante) no suporte.

Verificar o grau de inclinação na escala ao lado do

suporte da faca: para facas de vidro deve marcar dois

traços a partir do zero e para facas de diamante deve-se

seguir as instruções do fabricante da faca que estão na

sua embalagem.

Colocar água destilada na barquinha da faca, acertando a

quantidade de água até obter uma superfície espelhada em

função do ângulo de iluminação. Procure obter o máximo de

superfície espelhada

PROCE-ME 23

Para aproximar a faca em relação ao bloco, procure o

reflexo na superfície do bloco; para isto movimente o

bloco e desloque a fonte de luz.

Aproximar a faca lentamente em relação ao bloco,

utilizando sempre a lupa, até o reflexo na superfície do

bloco desaparecer.

Procurar de novo a maior superfície espelhada possível na

água e cortar.

Desprezar os primeiros cortes. Os cortes deverão sair em

tiras, de cor prateada.

Pescar mais ou menos 4 a 5 cortes com o auxílio de uma

pinça em uma tela de cobre, coberta pelo Parlódio (Ver

PREPARO DAS TELAS).

A faca de diamante só deve ser usada para quem já tem

prática em usar faca de vidro.

6. COLORAÇÃO DOS CORTES ULTRAFINOS

6.1 PRERARO DA SOLUÇÃO DE URANILA

Uranila................0,4g

Etanol 70%.............20 ml

Estocar em geladeira.

6.2. PREPARO DA SOLUÇÃO DE REYNOLDS

PROCE-ME 24

Coloque num béquer limpo 500 ml de água destilada e deixe

ferver até chegar a 250 ml; deixe esfriar um pouco até

ficar morna.

Num balão volumétrico contendo 1,76 g de citrato de sódio

e 1,33 g de nitrato de chumbo, colocar 30 ml de água morna

e agitar na mão por 30 minutos. Esta solução deverá ficar

leitosa. Colocar 8 ml de NAOH 1,0N (preparada no momento

do uso) e a solução ficará transparente. Completar com

água até 50 ml. Agitar sem fazer bolhas e medir o pH, que

deve ser cerca de 12 ou 13. Guardar à temperatura

ambiente; quando começar a ficar turvo jogar fora e fazer

outro; antes de desprezar, precipitar o chumbo com algumas

gotas de ácido acético glacial.

PROCE-ME 25

6.3. PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO

Atenção: os cortes devem estar secos e tomar cuidado para

não respirar sobre as telas.

1) Corar com uranila 2% em etanol 70%.

Colocar numa placa de Petri parafinada uma gota da solução

de uranila para cada tela e enfiar a telinha na gota de

maneira que fique coberta. Deixar 30 minutos no escuro.

2) Pegar a tela com uma pinça e sobre um béquer ir

pingando água destilada com uma pinseta, por cerca de 40

segundos. Isto deve ser feito pingando-se a água sobre a

pinça de maneira que ela escorra da pinça para a tela.

3) Deixar secar cerca de 5 minutos numa placa de Petri

forrada com papel de filtro e tampada.

4) Corar com citrato de chumbo (solução de Reynolds).

Para isto, proceder como com a solução de uranila,

deixando a tela mergulhada em uma gota de Reynolds por 15

minutos.

A placa de Petri onde faz-se a coloração pelo chumbo deve

conter umas 20 pastilhas de NaOH para absorver o CO2.

5) Como no caso da uranila, lavar as telas sobre um bequer

durante cerca de 40 segundos.

Ao final, colocar o bequer na pia e deixar escorrer

bastante água.

6) Deixar as telas secarem em placa de Petri tampada por

30 minutos e carbonizá-las.

PROCE-ME 26

4. CARBONIZAÇÃO

4.1. Uso do carbonizador (ou evaporador)

1) Apontar os carbonos e alinhar os suportes. Verificar a

mola que pressiona os eletrodos para que as pontas dos

carbonos estejam em contato.

2) Ligar a chave geral na parede

3) Ligar a água

4) Colocar a válvula 2 vias para cima

5) Ligar o marcador de tempo (Voltar o botão até zerar o

timer)

6) Ligar a bomba mecânica (na segunda chave da esquerda

para a direita). Esperar 3 minutos.

7) Voltar com a válvula 2 vias para a posição preliminar.

Esperar 5 minutos.

8) Colocar a válvula 2 vias em vácuo bomba

9) Ligar a bomba difusora e esperar 2 a 3 minutos

10) Abrir válvula alto vácuo

11) Ligar o vacuômetro de vácuo preliminar e esperar

chegar no final da escala (seta verde)

12) Ligar o vacuômetro de alto vácuo e esperar marcar

entre 10-4 e 10-5 na escala de cima (seta verde). Até aqui

gasta-se cerca de 45 minutos.

13) Desligar os dois vacuômetros

14) Colocar o seletor em 2

15) Ligar a voltagem (Volt)

PROCE-ME 27

16) Girar lentamente o variador de voltagem até o nº 32 e

esperar até a marca do carbono ficar semelhante à da

sombra.

17) Desligar o variador de voltagem (girando rapidamente)

18) Desligar a voltagem

19) Voltar o seletor para o 0

20) Fechar a válvula de alto vácuo

21) Desligar a bomba difusora e esperar 25 minutos

22) Colocar a válvula 2 vias em preliminar

23) Desligar a bomba mecânica

24) Apertar o botão de entrada de ar (rapidamente no

início e mais lentamente depois) até parar o barulho de

entrada de ar.

25) Tirar a campânula, com cuidado para não batê-la nos

suportes do carbono.

26) Desligar o marcador de tempo

27) Desligar a chave geral

28) Esperar 20 minutos e fechar a torneira da água.

PROCE-ME 28

5. PREPARAÇÃO DAS TELAS:

5.1. LAVAGEM DE TELAS

As telas utilizadas em microscopia eletrônica podem ser

novas ou reaproveitadas e devem ser processadas da

seguinte maneira:

Tela nova:

Passar pela acetona 5 minutos e secar em papel de filtro

em placa de Petri. Deixar na estufa 1O minutos.

Tela reaproveitada:

Ferver as telas a serem reaproveidas em Extran 2%.

Colocar no Ultrasom, durante 5 minutos.

Lavar bem em água corrente.

Colocar em amoníaco 10% no ultrasom, durante 3 minutos.

Lavar uma vez em água corrente e duas vezes em água

destilada.

Passar em acetona pura, por uma vez.

Secar em papel filtro na placa de Petri a 60° C, por 10

minutos.

5.2. COBERTURA DAS TELAS COM PARLÓDIO

Não colocar os dedos no Parlódio para não engordurá-lo;

pegar com luvas ou pinças.

PROCE-ME 29

Num frasco de vidro com tampa colocar:

Parlódio................................... 1 g

Acetato de amila anidro (geladeira)........ 5O ml

Atenção: quebrar as tiras deparlódio sem contacto manual.

Deixar de um dia para o outro para dissolver. Separar em

frasquinhos de 5ml e deixar a temperatura ambiente.

ATENÇÃO: o PARLÓDIO não pode ser jogado na pia.

No dia de cobrir as telas com a película, se for fazê-lo

na sala do microscópio eletrônico, desligar o ar

condicionado da sala (não esquecer de desligar o ME e

deixar o deumidificador ligado). A umidade relativa do ar

deverá estar em torno de 50%.

Na capela da sala do ME, colocar dentro de uma bandeja de

plástico um pirex com água até a boca (até transbordar).

Com uma fonte de luz ver se a água está suja e limpá-la

passando um papel de limpeza de lentes (lens clean paper)

sobre sua superfície.

Com uma pipeta Pasteur de ponta boa colocar uma gota de

parlódio na água (desprezando as primeiras gotas na

bandeja). Na superfície da água vai se formar uma película

de parlódio.

Observe que a tela tem duas faces: uma brilhante e uma

fôsca. Entortar a tela ligeiramente, com auxílio de uma

pinça, de modo a fazer uma concavidade do lado brilhante.

Colocar cerca de dez telas com o lado fosco em contato com

a película. Cobrí-las com um pedaço de Parafilm e com uma

pinça mergulhar as bordas do Parafilm de modo que o

PROCE-ME 30

parlódio recubra todo o perímetro do Parafilm. Puxar na

direção da pessoa, de uma só vez, tirar sem água e sem

encostar no pirex. Evitar contaminar a água com os dedos.

Em uma placa de Petri com papel de filtro, colocar o

Parafilm para baixo, as telas para cima. Deixar secar até

o dia seguinte, à temperatura ambiente, coberto com tampa.

Verificar se a película está boa, olhando as telas no ME.

Se quiser película mais grossa, colocar 2 gotas de

PARLÓDIO na água do pirex, em vez de uma só.

6. MÉTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS

BACTERIANOS EM PREPARADOS TOTAIS

6.1. SUPORTE:

- Montar uma câmara úmida, contendo um suporte de papel

parafilm ou parafina.

- Utilizar telas de cobre de "300 mesh" previamente

recobertas com película de formvar-carbono. Recomenda-se

empregar Bacitracina (0,01ug/ml em água destilada) como

agente umectante.

- Empregar pinças e vidraria de boa qualidade, limpas,

pipetas descatáveis e tubos Ependorff estéreis.

PROCE-ME 31

6.2. SUSPENSÕES:

6.2.1. Bacteriana

- Partir de uma suspensão de bactérias padronizadas por

método imunológico (por exemplo Imuno DotBlot).

Para o H. influenzae, utilizou-se uma densidade óptica

(DO) = 0,25 p/ 540nm, após a diluição em PBS 0,1M, pH 7,2.

6.2.2. Antissoro

- Determina-se anteriormente a concentração ótima para se

obter melhor título, por método imunológico (Imunno

DotBlot), para que todos os sítios antigênicos estejam

saturados pelo soro policlonal. Empregou-se a diluição

1:100 do anti-25kD (sub-unidade proteica de fímbria

bacteriana) em PBS 0,1M, pH 7,2.

6.2.3. Proteina A-Au (Sigma):

Empregou-se a diluição 1:50 do complexo numa solução

contendo BSA 1,0% em PBS 0,1M de pH 7,2 (nesta diluição o

Au está em excesso e é capaz de saturar, todos os sítios

Fc das Imunoglobulinas).

6.2.4. Solução para contrastação

Solução de sílico-tungstato de sódio (SST) a 1,0% em água

de pH 6,4 até 7,2.

PROCE-ME 32

6.3. PROCEDIMENTO

1) Colocar uma gota (40ul) da suspensão bacteriana no

suporte e sobre ela uma tela (filme voltado para a

suspensão) durante 30 minutos à temperatura ambiente

(aproximadamente 25oC); retirar o excesso com papel de

filtro;

2) Em seguida, colocar a grade sobre uma gota (10ul) do

antissoro específico diluido, durante 60 minutos à

temperatura ambiente (aproximadamente 25oC); retirar o

excesso com papel filtro;

3) Colocar imediatamente a grade sobre uma gota (10ul) da

suspensão de Proteínas A-Au diluida 1:50, durante 20

minutos à temperatura ambiente (aproximadamente 25oC).

4) Lavar a preparação com PBS 0,1M de pH 7,2 durante 1

minuto, empregando-se um jato suave de pipeta Pasteur e

logo em seguida com um jato suave de água bidestilada ou

deionizada durante 1 minuto.

5) Contrastar pelo sílico-tungstato de sódio 1,0% de pH

7,2.

Obs: A contrastação é opcional uma vez que esta promove a

remoção das partículas de ouro.

6) Recobrir com carvão e observar ao M.E.

GUIA-TP 0

X. GUIA DE TRABALHOS PRÁTICOS

GUIA-TP 1

ATIVAÇÃO ESPERMÁTICA, REAÇÃO DO ACROSOMA E FECUNDAÇÃO IN VITRO.

a) Obtenção e manuseio de gametas in vitro Superovulação Injetam-se fêmeas adultas de hamster com 25 u.i. de PMSG (Pregnant mare's Serum Gonadotropin) no dia de post-estro (Orsini, 1961) e com 25 u.i. de HCG (Human Chorionic Gonadotrophin) na tarde do 3º dia após a descarga de post-estro. As fêmeas são sacrificadas por deslocamento cervical entre 12 e 16 horas após a injeção de HCG. Procede-se a uma laparotomia através da linha medio-ventral, rejeitando as alças intestinais para um lado e expondo-se a via genital feminina. Uma vez isolados, os ovidutos são postos em uma placa de cultura de tecido contendo BMOC - 2 ou BWW (meios de cultura). Com um par de pinças de relojoeiro rompe-se a ampola do oviduto para que saiam os ovócitos com células do cúmulo. Também pode-se lavar o oviduto com o mesmo meio usando uma seringa com agulha Nº 30 e de ponta romba. Se os óvulos são recém ovulados, coloca-se a agulha na extremidade uterina do oviduto, porém se são passadas 24 horas ou mais após a ovulação faz-se a lavagem desde a fímbria.

b) Remoção das células foliculares Prepara-se uma solução de hialuronidase a 0,01% em BMOC-2 na qual se colocam as massas do cúmulo. Ao cabo de

GUIA-TP 2

poucos minutos pode-se observar ao microscópio de contraste de fase que os ovócitos se desnudam das células foliculares. Os ovócitos devem ser manipulados com pipetas de vidro de 5 cm de comprimento e cujo diâmetro distal não ultrapasse 0,2 a 0,3 mm. Pode-se usar a pipeta acionada mediante uma chupeta (fig. 2) ou com a boca. Com ajuda da pipeta com pouco fluído, os ovócitos ou ovos fecundados são colocados em uma lâmina com dois fios de parafina-vaselina paralelos. Coloca-se a lamínula sobre os fios de parafina, tendo cuidado para que a gota não se desloque para um dos extremos. Comprimem-se suavemente os fios de parafina-vaselina, obtendo-se entre lâmina e lamínula uma câmara de altura adequada para a observação (recomenda-se uma altura de 20 a 40 um).

c) Obtenção dos espermatozóides

Machos adultos de fertilidade comprovada são sacrificados por deslocação cervical. Com uma incisão médio-ventral expôem-se os testículos e respectivos epidídimos. Com um par de tesouras corta-se a porção mais caudal do epidídimo, evitando contaminá-lo com sangue e logo coloca-se em uma placa de Petri contendo o meio de cultura cobrindo-se com azeite mineral. Em seguida, juntam-se 0,2 a 0,3 ml de meio de cultura para permitir a dispersão dos espermatozóides. Após 5 a 10 min retiram-se os epidídimos ficando só a suspensão de espermatozóides. Calcula-se a concentração com um hemocitômetro e ajusta-se para que na solução de incubação fique 106 espermatozóides/100 microlitro de meio.

d) Capacitação dos espermatozóides

GUIA-TP 3

Incubam-se 104 espermatozóides/1 ml de soro sanguíneo (ver mais adiante) a 370C por 3 ou 4 horas em uma placa de cultura. Cobrir com azeite mineral. Ao cabo desse tempo pode-se examinar os espermatozóides com o microscópio de contraste de fases para avaliar a ativação e reação do acrosoma (ver Barros, 1974).

e) Inseminação artificial Fêmeas induzidas a ovular ou superovular são anestesiadas com Avertina, Nembutal ou éter e, através de uma incisão médio-ventral, injetam-se nos cornos uterinos 0,2 ml de uma suspensão de espermatozóides (2 epidídimos para 4 cornos uterinos). Em seguida liga-se o corno uterino cranialmente da entrada da agulha. Sutura-se o animal e, aos diferentes tempos desejados, obtém-se os ovos fecundados. Para uma maior segurança (não muita) convém inseminar umas 12 horas após a injeção de HCG.

f) Preparação do soro sanguíneo 70oC Deixa-se coagular sangue humano obtido sem anticoagulante e depois o submete a centrifugação para a obtenção do soro. Aquece-se em banho-maria a 70oC por 1 hora o soro obtido com a centrifugação. Passa-se este soro coagulado por homogenizador e centrifuga-se novamente a 15 000 rpm (± 27 000 g) durante 30 minutos. Obtém-se um sobrenadante fluído que, depois de ser esterilizado por filtração, pode ser envasado em alíquotas de 1cc a -40oC. Uma vez descongelado, o soro só deve ser usado uma única vez.

g) Fecundação "in vitro"

GUIA-TP 4

Espermatozóides capacitados (ver ítem d) são utilizados para inseminar ovócitos "in vitro". O tempo de incubação durante o qual ficarão ambos os gametas depende do estágio da fecundação que se deseja,. Ao término da incubação observa-se com o microscópio de contraste de fase.

REFERÊNCIAS ORSINI, M.W. (1961) The external vaginal phenomena

characterizing the stages of the oestrous cycle, pregnancy, pseudopregnancy, lactation and the anestrous hamster Mesocricetus auratus, Waterhouse. Proc. Anim. Car. Panel 11: 193.

BARROS, C. (1974) - Capacitation of mammalian spermatozoa.

En Physiology and Genetics of Reproduction, part B, capítulo 27 (E.M. Coutinho & F. Fuchs, eds). Plenum Publ. Corp., New York.

GUIA-TP 5

TRANSFERÊNCIAS EMBRIONÁRIAS EM COELHOS

1- COLETA DE OVOS

a) Superovulação: As coelhas doadoras superovulam quando procede-se à injeção de gonadotrofinas combinadas da seguinte maneira:

Primeiramente faz-se uma injeção intramuscular ou sub-cutânea de 150 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrophin). Após 66 a 72 horas procede-se à inseminação artificial (ou pareamento natural com dois machos férteis) e aplica-se uma injeção endovenosa de 50 UI de HCG.

Um outro procedimento que também provoca a superovulação é a aplicação de duas injeções diárias intramuscular ou sub-cutânea, durante 3 dias, de 0,5mg de FSH (Hormônio Folículo Estimulante). No 4º dia proceder à inseminação artificial (ou pareamento natural) e aplicar uma injeção endovenosa de no mínimo 1,5mg de LH por quilo de peso do animal. Consegue-se assim cerca de 40 a 60 ovulações. A sobre-estimulação reduz a porcentagem de recuperação embrionária pois os estrógenos endógenos influem sobre o transporte através do trato genital feminino. Além disto, alguns ovos permanecem nos folículos. A superovulação também pode ser induzida em fêmeas imaturas, por exemplo nos coelhos brancos neo-holandeses as 12 semanas de idade e nas fêmeas holandesas listradas as 16 semanas de idade.

GUIA-TP 6

Os animais doadores são sacrificados por deslocamento cervical ou por comoção cerebral, golpeando a nuca com um pau ou com a mão. Os ovos podem ser recuperados (colhidos) entre 40 e 50 horas "post-coitum" (após pareamento); extraem-se os ovidutos que são colocados em placas de Petri esterilizadas e a seguir lavados com uma solução fisiológica estéril e soro homólogo. Também podem ser colhidos ovos de coelhos anestesiados, insertando uma cânula no orifício infundibular do oviduto e injetando-se líquido pelo vértice do corno uterino: os embriões devem ser contados e examinados (para poder-se distinguir anomalias grosseiras) com a ajuda do microscópio estereoscópico binocular. Os blastocistos uterinos também podem ser recolhidos in vivo.

b) Manipulação dos ovos: Tipos distintos de soluções têm sido utilizadas para manipular ovos incluindo a solução de Krebs e a soluçõo de Ringer-Dale tamponada com fosfato contendo glicose. As pipetas de vidro e todo material utilizado para manipular ovos devem estar esterilizados e mantidos entre 30 e 37oC, seja em uma platina térmica ou em uma incubadora. Os ovos devem ser manipulados em uma placa de cultura parcialmente fechada e isenta de luz ultravioleta; deve-se também evitar, na medida do possível, exposiçõo ao sol ou luz elétrica. Para exposições prolongadas, recomenda-se a luz vermelha, pois as menores exposições à luz ultravioleta podem inibir a segmentação.

c) Seleção dos ovos: As anormalidades estruturais dos ovos

podem resultar de fatores citológicos, genéticos, do meio circundante ou patológicos; os três primeiros são aparentemente os responsáveis pela variação no êxito do armazenamento dos ovos. As anormalidades dos ovos

GUIA-TP 7

incluem: aberrações de tamanho, forma e grau de granulação ou pigmentação citoplasmática.

2- ARMAZENAMENTO DOS OVOS a) Meios de armazenamento: A maior parte dos meios de

armazenamento são compostos de solução salina, soro, proteínas e antibióticos. Por curtos períodos, a solução fisiológica (0,9% NaCl aquoso) mantém a tonicidade do ovo; porém não sendo tampão e não contendo os íons orgânicos não apresenta uma ótima pressão coloido-osmótica. As soluções fisiológicas se utilizam como: 1. líquidos para lavar o tracto genital, que mantenham a

tonicidade do vitelo; 2. tampão que mantém limite de pH fisiológico (entre 7,2

e 7,6); 3. meios iônicos aquosos imprescindíveis para o metabo-

lismo celular. Os meios de armazenamento rotineiros contém entre 25 e 50% do soro de coelho. Soro de outras espécies também têm sido utilizados: os de cavalo, cachorro, cobaia, rato e porco são adequados para ovos de coelhos, enquanto que o soro do homem, ovelha, vaca, cabra e aves contém um fator ovicida. O soro congelado, o soro reconstituído depois de liofilizado, liquor de blastocistos e a solução de gema de ovo citratada, podem substituir o soro fresco. O sangue do coelho se obtém por punção cardíaca ou da veia marginal da orelha. Assim obtido, permite-se coagular à temperatura ambiente (durante 30 minutos) antes de ser centrifugado por 20 a 3000 rotações por minuto. O soro é decantado, centrifugado, filtrado através de um filtro milipore de 0,45 u e, em seguida, a este volume de soro adiciona-se igual volume de solução salina fisiológica estéril.

GUIA-TP 8

Tudo isto se mantém entre 3 e 4oC. Recomenda-se a adição de 7% de gelatina ao meio de armazenamento: prepara-se um meio de gelatina a 14% dissolvendo 14 g de gelatina em 100 ml de solução fisiológica e autoclavando-o imediatamente para evitar crescimento bacteriano; a este meio logo se junta solução de soro: salina na concentração de 1:1 (quer dizer volume a volume). Depois de armazenar em gelatina a 7% a porcentagem de implantações dos ovos de coelho ainda se mantém em 53% até 7 dias, porém transcorridos 14 dias vai declinando gradualmente até 3%. A sobrevida dos embriões não é afetada pelo armazenamento a baixas temperaturas quando a solução contém 7,5 mg de estreptomicina, 4 mg de cloromicetina, 6,5 mg de paranomicina e 23,9 mg de penicilina por mililitro de meio líquido. Porém, concentrações mais altas de antibióticos são tóxicas para os ovos.

b) Recipientes para o armazenamento: Os ovos são armazenados em tubos de vidro de 4 ml de capacidade com um diâmetro interno de 8 mm. A gelatina, a solução salina fisiológica e o soro são medidos e transferidos aos tubos com seringas estéreis. Mistura-se cuidadosamente usando uma pipeta de vidro com chupeta de borracha. Tem-se que ter o cuidado de evitar que se formem bolhas de ar. Se os tubos são cheios completamente até a boca, a evaporação e condensação do meio não vai acontecer durante o armazenamento. Em um destes tubos podem armazenar-se entre 10 e 100 ovos. Também usam-se ampolas de vidro seladas que contenham 0,3 ml de meio e entre 10 e 15 ovos.

c) Temperatura e duração do armazenamento: A temperatura

ótima para o armazenamento é 10oC. O choque "a frigori"

GUIA-TP 9

reduz a viabilidade embrionária e isto pode ser evitado por aclimatação, ou seja, um esfriamento lento. A velocidade do esfriamento de 0,01oC por minuto pode ser obtida colocando-se os tubos de armazenamento (que contém ovos) dentro de um banho de 20oC, que é colocado em um esfriador que o mantenha a 10oC constante. Os ovos de coelho são armazenados sem que percam sua vitalidade por períodos maiores que qualquer outro ovo de mamífero. Está claro que os ovos de coelho diferem daqueles da maior parte das outras espécies no fato de que durante seu transporte ao longo do oviduto são recobertos por uma camada de mucina. Ainda que não haja nenhuma evidência que demonstre isto, pode ser que esta camada de mucina proteja os ovos de coelho durante sua manipulação e armazenamento in vitro. Depois de 5 dias de armazenamento aparece um acentuado declínio na porcentagem de sobrevida dos ovos de coelho, porém é possível armazenar-se ovos com este método e com grande êxito até 14 dias.

3- TÉCNICA DE TRANSFERÊNCIA Os ovos têm que ser examinados microscópicamente antes de serem transferidos a uma receptora apropriada, sã, e de fertilidade conhecida. O estadio do ciclo reprodutivo do animal receptor deve corresponder ao estadio do desenvolvimento do ovo. Por exemplo, se na transferência o ovo tem dois dias de idade, o receptor terá que ser injetado intravenosamente com 20 U.I de hormônio gonadotrófico coriônico (HCG) dois dias antes da transferência. O receptor deve ser anestesiado e os ovos transferidos ao oviduto por meio de uma laparotomia medial ou por duas incisões nos flancos. As incisões nos flancos são as mais recomendadas porque é mais fácil encontrar-se o oviduto e o animal sofre menos trauma. O tecido adiposo

GUIA-TP 10

que rodeia a ampola é levado para fora da cavidade corporal o que expõe o ovário e o infundíbulo. Transfere-se entre 3 e 6 ovos à ampola utilizando uma pipeta pasteur cujos bordos tenham sido arredondados pelo fogo e que mantenham um diâmetro de 2 mm na ponta. O volume do fluido que acompanha o ovo terá que ser o mínimo possível. É conveniente evitar a deposição de grandes bolhas de ar no oviduto, apesar de que pequenas bolhas possam ser utilizadas para marcar a posição do ovo na pipeta. Para transferência ao útero usa-se uma pipeta cujos bordos não tenham sido arredondados pelo fogo. Assim pode-se picar a parede do útero para a deposição do ovo em seu lúmen. Para transferir blastocistos grandes utiliza-se uma pipeta maior (de 3 mm de diâmetro na ponta) e torna-se necessária uma pequena incisão da parede uterina para passar essa pipeta tão grossa; a incisão deve ser fechada com catgut após a transferência. Os animais receptores são laparotomizados 8 dias "post-coitum" para contagem do nº de implantações e, em seguida, sacrifica-se na data que tenha sido planejada pelo experimentador, antes do nascimento, para contar-se o nº de fetos viáveis. Nas fêmeas prenhas em que se desejam, ou que se necessitam as crias, pode-se permitir a parição. Para laparotomias e cirurgia menores é imprescindível conhecer algumas técnicas de anestesias e manter a esterilidade cirúrgica. ANESTESIA Os estudos sobre coelhos freqüentemente requerem procedimentos cirúrgicos para os quais necessitamos de uma anestesia adequada. O pentobarbital sódico é injetado via intravenosa à razão de 30 mg por Kg/peso. Pode ser utilizado apenas o pentobarbital ou sua associação com éter. Um simples catéter pode ser

GUIA-TP 11

utilizado para injeção intravenosa (quer dizer um tubo de polietileno de 30 cm de comprimento unido a uma agulha em uma ponta e na outra extremidade uma seringa). O barbiturato e/ou o éter podem produzir colapso respiratório e/ou convulsões que provocam fraturas nas vértebras ou nos membros. Conseqüentemente tanto a propiopromazina como o diazepam em combinação com o paraldeido são recomendáveis para anestesia geral. Pode-se usar um tranqüilizante e o nembutal. Paraldeído 1 mg por Kg/peso pode ser injetado intramuscularmente ou intraperitonealmente. O lugar preferido para a injeção é a região cranial da coxa. Utilizam-se o reflexo conjuntival e o reflexo do beliscão para ver a profundidade da anestesia. Quando a conjuntiva do canto medial do olho é tocada com o dedo o movimento das pálpebras indica que o animal ainda não alcançou o plano cirúrgico de anestesia. Se as almofadas plantares dos pés e das mãos forem beliscadas com as unhas, um movimento de flexão dos membros indica que o coelho não está convenientemente anestesiado. Há variações individuais quanto as raças que sào responsáveis pelas acentuadas diferenças no que diz respeito aos anestésicos. LAPAROTOMIAS Os receptores são anestesiados e laparotonizados através de uma incisão medial. Cortam-se os músculos sub-peritoniais ao mesmo tempo expondo os órgãos viscerais, os ovários e os ovidutos se localizam afastando os órgãos para fora da cavidade. Deve-se manipular o mesosalpinx e não tocar no oviduto. Para fechar a cavidade abdominal deve-se reunir os bordos peritoneais e os músculos abdominais e suturar

GUIA-TP 12

com catgut cromado (00). Os bordos da pele devem ser reunidos com clips metálicos.

4- TRANSFERÊNCIA DE OVOS A OUTRAS ESPÉCIES O ovo de uma espécie pode temporariamente estar armazenado no oviduto ou útero de outras espécies e logo transferido a um receptor apropriado. Porém os ovos de furão dividem-se e desenvolvem-se apenas no oviduto de coelho e os ovos de coelho não sobrevivem nem no oviduto nem no útero de furão. Os ovos ovinos de dois blastômeros vivem pelo menos cinco dias e se desenvolvem até o estadio de blastocisto no tracto genital do coelho. Esses ovos sobrevivem melhor no coelho do que quando armazenados durante três dias in vitro a 7oC. Esse "incubador" pelo que tem sido demonstrado é útil para transportar ovos ovinos de um continente a outro.

5- CULTIVO DO EMBRIÃO

Existem vários métodos para cultivo de ovos "in vitro" que facilitam o desenvolvimento do ovo antes da implantação; estes métodos têm sido especialmente utilizados para estudar o efeito dos hormônios e dos compostos que produzem antifertilidade sobre o ovo. Utilizam-se micropipetas acopladas a seringas para transplantar ovos à câmara anterior do olho. Os ovos intra-oculares mostram desenvolvimento normal até o estágio de mórula, porém, se cultivados em uma câmara rodeados por filtros de milipore, ou em placas de Petri cobertos por azeite mineral, se desenvolvem até o estágio de blastocisto.

BIBLIOGRAFIA

GUIA-TP 13

Hafez, E.S.E (ed). Reproduction and breeding techniques

for laboratory animals. Philadelphia, Lea & Febiger, 1970.

GUIA-TP 14

OBTENÇÃO DA CAMADA MUSCULAR INTERNA DE INTESTINO DELGADO DE CACHORRO

I. MATERIAL NECESSÁRIO: 01 cachorro vivo anestesiado. 2 ampolas (0,5 mg cada) de atropina Recipiente com 300 ml de água destilada a 37ºC Recipiente com 300 ml de salina a 37ºC mais 0,5 mg de

atropina. Éter etílico Gelo 1 seringa de 1 ml com agulha 1 seringa de 5 ml com agulha 1 seringa de vidro de 10 ml com agulha Material cirúrgico (bisturi, tesoura, pinças dente de

rato, pinças anatômicas) II. PROCEDIMENTO: Aplicar 1 ml de atropina no animal. Se for por via intramuscular deve ser aplicado 15 minutos antes do animal ser sacrificado. Se for por via intravenosa deve ser aplicado 5 minutos antes do sacrifício. Para sacrificar o animal deve ser aplicado aproximadamente 10 ml de éter em seu pulmão. Caso o animal não morra deve-se aplicar um pouco mais de éter por via intravenosa em sua língua. Assim que o animal tenha morrido, passa-se álcool 70% em seu abdomem evidenciando a linha mediana do corpo na altura do umbigo. O animal deve ser aberto nessa região com um corte de aproximadamente 15 cm de comprimento, até alcançar a cavidade abdominal. Nesta encontra-se primeiramente o

GUIA-TP 15

epiplon que deve ser afastado ou retirado; a seguir encontra-se o intestino delgado de aspecto liso e claro. Com o auxílio de uma tesoura, retirar um pedaço de aproximadamente 30 cm de intestino delgado e recortá-lo em pedaços de aproximadamente 5 cm de comprimento. Esses fragmentos devem ser imediatamente lavados em água a 37ºC. Após a retirada do conteúdo intestinal, o material deve ser transferido para um recipiente com salina e atropina. Observando o relaxamento total do intestino este deve ser virado com o auxílio de uma pinça dente de rato de tal modo que tenhamos a luz do intestino (mucosa) voltada para o lado externo. Depois deste procedimento todos os fragmentos devem ser mantidos sob baixa temperatura (gelo). A seguir, deve-se retirar a mucosa juntamente com a submucosa. Para isto, deve-se fazer, com uma lâmina de aço, um corte firme e pequeno no sentido longitudinal de tal maneira alcançar a submucosa (de aspecto branco e rígido; abaixo dela encontra-se a camada muscular interna que apresenta estriações no sentido transversal em forma de anéis). Assim que tenha alcançado a submucosa este corte deve ser prolongado no sentido longitudinal com o auxílio de duas pinças dente de rato que irão ampliando a separação da submucosa produzida pelo corte até obtermos o corte completo no sentido longitudinal. A camada interna deve então ser desprendida da sub-mucosa com o auxílio de uma pinça anatômica. Em seguida, deve-se "revirar" o intestino, com auxílio de uma pinça dente de rato, de tal modo que tenhamos a serosa do intestino novamente voltada para fora. Então junto a porção onde estava inserido o mesentério deve-se fazer um pequeno corte no sentido longitudinal (com cuidado para cortar somente a camada muscular externa, que apresenta estriações no sentido longitudinal, enquanto a

GUIA-TP 16

camada interna apresenta estriações no sentido transversal. Após esse pequeno corte a camada externa deve ser "rasgada" com auxílio de duas pinças e ser desprendida da camada interna com auxílio de uma pinça anatômica. A camada interna é obtida em forma de anéis. O importante é não deixar nenhum resíduo da camada externa e da submucosa, podendo-se, para isto, até perder um pouco da camada interna.

GUIA-TP 17

PROCESSAMENTO DE ENCÉFALO DE RATOS: CONGELAÇÃO E PARAFINA

I. SOLUÇÕES 1. Solução Salina Tamponada - 9 g de cloreto de sódio - 100 ml de Tampão Fosfato 0,1 M Dissolver e filtrar. 2. Tampão fosfato 0,2M (ph 7,4) A: Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O) 12,5 g para 2 litros de H2O B: Fosfato de sódio Dibásico (Na2HPO4.7H2O) 83 g para 2 litros de H2O Misturar os dois e filtrar. 3. Corante de Nissl Tampão I: H2O destilada - 994 ml Ác. acético glacial - 6 ml Tampão II: Acetato de sódio - 13,6 g H2O destilada - 1000 ml (completar para) Solução de Cresil Violeta: ...100 ml de H2O destilada 1 g de cresil violeta Aquecer sem deixar ferver. Corante de Nissl: Tampão I.....................230 ml Tampão II.....................20 ml Solução de Cresil Violeta.....12,5 ml

GUIA-TP 18

4. Subbing Solution 250 ml de H2O 0,16 g de Sulfato de Potássio e Cromo 1,25 g de gelatina Misturar à temperatura de 70°C e depois filtrar a solução. 5. Solução de Montagem 200 ml de H2O aquecida 0,5 g de gelatina 50 ml de álcool absoluto 50 ml de Tampão Fosfato 0,1M 200 ml de Tampão Fosfato 0,2M Dissolver a gelatina em 200 ml de água aquecida a 70°C, acrescentando 200 ml de Tampão Fosfato 0,2M, 50 ml de Tampão Fosfato 0,1M e 50 ml de álcool absoluto. Filtrar. 6. Solução de Sacarose a 30% 30 g de Sacarose 100 ml de Tampão Fosfato 0,1M Misturar os dois e filtrar. Autoclavar. II. MÉTODOS 1. Obtenção do encéfalo Perfundir o animal com Solução Salina e posteriormente com Formol a 10% em H2O destilada. A perfusão é feita pela aorta, fechando-se a veia cava. Com isso economizam-se as soluções de perfusão e tempo, já que, dessa maneira, perfunde-se somente a parte de cima do animal. Gasta-se nisso, aproximadamente 200 ml de cada uma das duas soluções. Essa perfusão é melhor executada com a ajuda de uma bomba peristáltica. Após isso feito, retirar o cérebro e mantê-lo por 4 horas em Formol a 10%. Colocá-lo na solução de sacarose, na geladeira, até o momento de ser cortado (no máximo um mês, porque funga).

GUIA-TP 19

2. Cortes por congelamento Preparação das lâminas - Lavar as lâminas com sabão de côco - Enxaguar com H2O corrente e depois com H2O destilada - Deixar em álcool após a lavagem - Enxaguar em H2O destilada e secar com um pano limpo - Passar as lâminas na “Subbing Solution” - Deixar secar por 24 horas Cortes no micrótomo de congelação O cérebro retirado da solução de sacarose é aparado na região posterior, de modo a que tenha uma base reta para poder ser fixado (com a solução fixadora Tissue Tek ou com a própria sacarose congelada) no suporte do micrótomo de congelação. Cobre-se o material com gelo seco triturado por, aproximadamente, 3 minutos. Esse processo de congelação deve ser repetido sempre que necessário. Tira-se o gelo da parte superior do cérebro e inicia-se a microtomia (cortes de 3µm). Os cortes obtidos são colocados, com a ajuda de um pincel fino, na solução de montagem. Novamente, com a ajuda do pincel, “pescam-se” os cortes nas lâminas previamente preparadas. Deixam-se as lâminas secando em estufa a 37°C por 24 horas. Corar com Cresil Violeta: Coloração dos cortes por congelamento: Passar os cortes por: - Água destilada - 3 a 5′ - Corante de Nissl - 5′ - Água destilada - lavar o excesso de corante - Álcool 75° - 3′ - Ácido Acético + Álcool 95° (1:10) - diferenciar até quanto se queira - Álcool 95° - 3 a 5′ - Álcool Butílico + Álcool Absoluto (1:1) - 3′ - Álcool Absoluto - 3 a 5′ - Xilol - 5′ - Montar as lâminas

GUIA-TP 20

3.Inclusão em parafina Fixação: - Formol a 10% - 24 h Desidratação - H2O corrente - 3 h - Álcool 70° - 3 h - Álcool 95° - 12 h - Álcool Absoluto - 12 h - Álcool Absoluto - 12 h - Álcool Absoluto + clorofórmio (1:1) - 2 h - Benzol (2 h) - Benzol (2 h) - Benzol (1 h) Inclusão - Parafina 58-60°C (1,5 h) - Parafina 58-60°C (1,5 h) - Parafina 58-60°C (1,5 h) - Incluir - Cortar Coloração de cortes em parafina - Desparafinar e levar até a água - 20′ no corante de Nissl - Deixar escorrer (± 2′) - Lavar 3 vezes em água - ± 10′ fora - 3 vezes no álcool 70° (diferencia muito o corante. Deve-se passar rapidamente) - 3 vezes no álcool 96° - 3 vezes no álcool absoluto - ± 10′ fora - ± 10′ xilol - ± 10′ xilol - ± 10′ xilol - Montar

GUIA-TP 21

INTERAÇÃO COLÁGENO-PROTEOGLIGANAS 1. Com cortes de parafina Usar 14 lâminas: 7 controles e 7 digeridas pela papaína. Proceder à digestão pela papaína. Corar as lâminas pelo Picrossírius durante uma hora. Lavar em água corrente. Lavar duas vezes com água destilada. Deixar as lâminas secarem bem, cobertas, na estufa. Raspar os cortes com uma gilete transferindo-os para pequenos tubos de ensaio. Retirar o corante dos cortes colocando NaOH 0,1N no tubo de ensaio. A quantidade de NaOH depende do tamanho dos cortes, porém deve-se colocar a mesma quantidade para os cortes controles e os digeridos. Esperar alguns minutos para que o corante reaja com o NaOH. Ler a absorbância em espectofotômetro em comprimento de onda de 540 nm. Se possível, ler alguns cortes controles e alguns digeridos com a papaína em citofotômetro ou em um analisador de imagens digital. Para calcular a interação colágeno-proteoglicanas: Absorbância digerido = 100% (máxima captação do Picrossírius pelo colágeno, sem bloqueio pelas proteoglicanas). Absorbância do controle = X (captação do Picrossírius possível, com bloqueio do colágeno pelas proteoglicanas) 100 - X = % de captação do Picrossírius que foi impedida pelas proteoglicanas, portanto este é um índice da interação do colágeno com as proteoglicanas.