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ELERSON CARLOS COSTALONGA
Análise do efeito do ácido valpróico no modelo
experimental de fibrose peritoneal em ratos
São Paulo
2017
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para a obtenção do título de
Doutor em Ciências
Programa de Nefrologia
Orientadora: Profa. Dra. Irene de Lourdes Noronha
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Costalonga, Elerson Carlos
Análise do efeito do ácido valpróico no modelo experimental de fibrose
peritoneal em ratos / Elerson Carlos Costalonga. -- São Paulo, 2017.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Nefrologia.
Orientador: Irene de Lourdes Noronha.
Descritores: 1.Diálise peritoneal 2.Fibrose peritoneal 3.Ácido valpróico
4.Histona desacetilases 5.Fator de crescimento transformador beta 6.Ratos Wistar
USP/FM/DBD-314/17
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Nefrologia Celular,
Genética e Molecular – Laboratório de Investigação Médica 29, Disciplina
de Nefrologia, Departamento de Clínica Médica, da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo, com apoio financeiro da CAPES através de
concessão de bolsa.
Aos meus exemplos de vida, de onde eu tirei força para
concluir essa jornada, minha mãe, meu pai
e minha querida irmã.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Elida e José Carlos, agradecimentos não bastam para retribuir por todo
esforço para me proporcionar condições de chegar até aqui. À minha mãe, professora e
pesquisadora de alma, filósofa nas horas vagas, com quem aprendi a ter prazer no
aprendizado e no saber, puro e simples. Ao meu pai, que com seu dia a dia na
marcenaria e suas atitudes me ensinou que trabalhar duro e humildemente é o caminho a
ser seguido, pelo menos, sem dúvida, é o meu.
À minha irmã Everlayny, meu maior exemplo de dedicação e bondade, minha principal
influência para eu seguir esse caminho.
À minha esposa, obrigado pelo companheirismo, por cuidar de mim e por fazer minha
vida mais alegre.
À Professora Dra Irene Noronha, pela liberdade para desenvolviver minhas idéias, pelo
incentivo de tentar sempre fazer a mais e por ter me ensinado a valorizar os detalhes.
Agradeço tanto as orientações no doutorado quanto na “vida de médico”.
Imenso obrigado a todos do LIM 29 que de alguma forma contribuíram para o
desenvolvimento desse trabalho, em especial à Cleo, Priscila, Margoth e ao Rafael pela
ajuda na execução e discussão dos experimentos. Ao Filipe Miranda, que atualmente
não faz mas parte do time, mas que esteve presente em praticamente todas as etapas
desse trabalho.
Às alunas de iniciação científica, Deise e Luiza Justini, que em muitos momentos foram
meus dois braços no laboratório, agradeço muito a dedicação e comprometimento de
ambas. Espero que tenha conseguido ensinar algo a vocês, biologia molecular que não
foi...
Não poderia deixar de lembrar de pessoas importantes na minha formação como médico
e incentivadores para os meus primeiros passos na pesquisa dentro do HCFMUSP. Dr
Luis Estevam Ianhez, exemplo de liderança tão em falta hoje em dia e primeiro
incentivador durante a residência para realização pesquisa científica e Dra Viktoria
Woronik com quem aprendi a transformar as dúvidas do dia a dia em trabalhos
científicos “simples” mas muito relevantes para o cuidado com os nossos pacientes.
Essa tese de doutorado encerra um capítulo de anos de dedicação aos estudos e à
medicina. Agradeço a todos que de alguma maneira me ajudaram ou atrapalharam, tudo
na vida é aprendizado.
“A instrução liberta”
Fiódor Dostoiévski
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação.
Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese
Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão,
Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e
Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index
Medicus.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Siglas
Lista de Símbolos
Resumo
Summary
1. Introdução .......................................................................................................................... 1
1.1. Histórico da diálise peritoneal........ ................................................................................................ 2
1.2 Diálise peritoneal – Epidemiologia ....................................................................................... 4
1.3. Anatomia e fisiologia da membrana peritoneal .................................................................... 5
1.4. Modificações da membrana peritoneal durante a diálise peritoneal............................................... 8
1.4.1. Alterações no transporte de solutos e ultrafiltração ......................................................... 9
1.4.2. Inflamação e neoangiogênese.................................................................................. 10
1.4.3. Fibrose peritoneal .................................................................................................. 12
1.5. Peritonite esclerosante encapsulante...................................................................................... 16
1.6. Modelo experimental de fibrose peritoneal........................................................................... 17
1.7. Histona desacetilases e a fibrogênese ............................................................................................. 19
1.8. Ácido valpróico (VPA) ................................................................................................................. 23
2. Racional..................................................................................................................... 26
3. Objetivos ............................................................................................................................. 28
4. Materiais e Métodos .......................................................................................................... 30
4.1. Animais ......................................................................................................................................... 31
4.2. Modelo experimental ...................................................................................................................... 31
4.3. Administração do ácido valpróico .................................................................................................. 31
4.4. Grupos experimentais e desenho do estudo ................................................................................... 32
4.5. Análise da espessura da membrana peritoneal ............................................................................... 33
4.5.1. Coloração Tricrômio de Masson.......................................................................... 33
4.5.2. Histomorfometria................................................................................................... 34
4.6. Imuno-histoquímica ...................................................................................................................... 34
4.6.1. Macrófagos .................................................................................................................... 34
4.6.2. Miofibroblastos .............................................................................................................. 36
4.6.3. Smad3 fosforilada ........................................................................................................... 37
4.7. Imunofluorescência................................................................................................................ 39
4.7.1. Smad7...................................................................................................................... 39
4.7.2. Isolectina-B4 ........................................................................................................... 39
4.7.3. Quantificação da densidade capilar da membrana peritoneal................................ 40
4.8. Expressão de citocinas no peritôneo por Multiplex............................................................... 40
4.9. PCR em tempo real................................................................................................................ 41
4.9.1. Extração de RNA................................................................................................... 41
4.9.2. Síntese de cDNA.................................................................................................... 42
4.9.3. PCR em tempo real................................................................................................ 42
4.10. Análise da função peritoneal................................................................................................ 44
4.11. Análise estatística ......................................................................................................................... 45
5. Resultados........................................................................................................................... 46
5.1. Mortalidade e evolução do peso dos animais ................................................................................. 47
5.2. O VPA preveniu a fibrose peritoneal e preservou a função peritoneal .......................................... 48
5.3. O VPA atenuou o aumento da expressão de fatores pró-fibróticos e e miofibroblastos no
peritôneo.....................................................................................................................................
50
5.4. O VPA protegeu contra a fibrose peritoneal interferindo na via TGF-β/Smad...................... 54
5.5. O VPA reduziu a inflamação e neoangiogênese da membrana peritoneal............................ 59
5.5.1. Inflamação ...................................................................................................................... 59
5.5.2. Neoangiogênese...................................................................................................... 64
6. Discussão............................................................................................................................. 66
7. Conclusão ........................................................................................................................... 74
8. Referências ......................................................................................................................... 76
Lista de figuras
Figura 1. Proporção de pacientes em diálise peritoneal em relação ao total de pacientes
dialíticos…………….. ..................................................................................... 5
Figura 2. Estrutura da membrana peritoneal .................................................................... 6
Figura 3. Modificações da membrana ao longo da diálise peritoneal .............................. 8
Figura 4. Mecanismos envolvidos nas modificações da membrana peritoneal induzidas
pela diálise peritoneal .................................................................................... 11
Figura 5. Via de sinalização TGF-β/Smad. .................................................................... 15
Figura 6. Evolução para peritonite esclerosante encapsulante. ...................................... 16
Figura 7. Controle da conformação da cromatina. ......................................................... 20
Figura 8. Papel dos inibidores das histona desacetilases na fibrose ............................... 21
Figura 9. Estrutura química do ácido valpróico ............................................................. 23
Figura 10. Desenho do estudo ......................................................................................... 32
Figura 11. Efeito do VPA no espessamento da membrana peritoneal. ........................... 49
Figura 12. Expressão de genes pró-fibróticos e BMP-7 no peritôneo. ............................ 52
Figura 13. Efeito do VPA na expressão de miofibroblastos na membrana peritoneal ... 54
Figura 14. Efeito do VPA na expressão peritoneal de Smad3 fosforilada (pSmad3) e
mRNA Smad3 ............................................................................................... 55
Figura 15. Expressão de Smad7 na membrana peritoneal. .............................................. 58
Figura 16. Infiltração da membrana peritoneal por macrófagos ..................................... 61
Figura 17. Concentração de fatores quimiotáticos para macrófagos no peritôneo .......... 62
Figura 18. Expressão gênica e concentração das citocinas pró-inflamatórias na
membrane peritoneal ..................................................................................... 63
Figura 19. Densidade capilar e expressão gênica do VEGF na membrana
peritoneal ....................................................................................................... 64
Figura 20. Possível efeito do VPA sobre a degradação da Smad7 .................................. 71
Lista de tabelas e quadros
Tabela 1. Efeitos dos inibidores das histona desacetilases na fibrose. ............................ 22
Tabela 2. Primers utilizados para os experimentos de PCR em tempo real. ................... 43
Tabela 3. Evolução do peso dos animais. ........................................................................ 47
Tabela 4. Quantificação da espessura da membrana peritoneal. ..................................... 48
Tabela 5. Análise da função da membrana peritoneal. .................................................... 50
Tabela 6. Expressão gênica de fatores pró-fibróticos e BMP-7 no peritôneo. ................ 51
Tabela 7. Quantificação da expressão de miofibroblastos (α-SMA) no peritôneo .......... 53
Tabela 8. Expressão gênica da Smad3 e quantificação das células positivas para Smad3
fosforilada no peritôneo.. ............................................................................... 56
Tabela 9. Expressão gênica e proporção de células marcadas para Smad7 no
peritôneo.... ..................................................................................................... 57
Tabela 10. Quantificação dos macrófagos e densidade capilar na membrana
peritoneal.... ................................................................................................... 60
Tabela 11. Análise da concentração de quimiocinas de macrófagos e citocinas pró-
inflamatórias no tecido peritoneal ................................................................. 60
Tabela 12. Expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias ........................................... 62
Tabela 13. Expressão gênica do VEGF ........................................................................... 65
Quadro 1. Resumo dos mecanismos de ação do ácido valpróico na prevenção da fibrose
peritoneal experimental... .............................................................................. 73
Lista de Siglas
AEC Aminoetilcarbazol
BMP Bone-Morphogenic Protein
cDNA DNA complementar
CAPD Diálise peritoneal ambulatorial contínua
CT Threshold Cycle
CTGF Connective tissue growth factor
dATP Deoxyadenosine triphosphate
dCTP Deoxycytidine triphosphate
dGTP Deoxyguanosine triphosphate
DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol
DP Diálise peritoneal
DRC Doença renal crônica
DTT Dithiothreitol
dTTP Deoxythymidine triphosphate
EMT Epithelial-Mesenchymal Transition
EUA Estados Unidos da América
FITC isotiocianato de fluoresceína
FSP-1 Fibroblast Specific Protein-1
FP Fibrose Peritoneal
GC Gluconato de clorexidina
GDP Produtos de degradação da glicose
HAT Histona acetiltransferase
HD Hemodiálise
HDAC Histona desacetilase
HDACi Inibidor da histona desacetilase
HGF Hepatocyte Growth Factor
IF Imunofluorescência
IH Imuno-histoquímica
IL-1β Interleucina 1β
IL-6 Interleucina 6
iHDAC Inibidor das Histona desacetilases
LSAB-AP Labeled Streptavidin-Biotin Alcaline Phosphatase
MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1
MEC Matriz extracelular
MgCl2 Cloreto de Magnésio
MIP-2 Macrophage inflammatory protein-2
M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus
MP Membrana peritoneal
mRNA RNA mensageiro
pb pares de base
PBS Phosphate buffered saline
PCR-RT Reação em cadeia de polimerase em tempo real
PEE Peritonite esclerosante encapsulante
PET Teste de equilíbrio peritoneal
pH Potencial de hidrogênico
pmp por milhão de população
RNA Ribonucleic Acid (ácido ribonucleico)
RPM Rotações por minuto
SAHA Ácido hidroxâmico suberoilanilida
SMA Smooth muscle actin
TBS Tris buffered saline
TGF-β Transforming Growth Factor beta
TNF-α Tumor Necrosis Factor-alfa
TTSP Taxa de transporte de soluto peritoneal
Tris 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
Tris-HCL TRIS hydrochloride
TβR Transforming Growth Factor beta Receptor
UF Ultrafiltração
VEGF Vascular endothelial growth factor
VPA Ácido valpróico
vs Versus
Lista de símbolos
cél/mm2 Células por milímetro quadrado
cm2
Centímetro quadrado
dL decilitro
Delta
g Grama
°C Graus centígrados
kg Kilograma
L Litro
µg Micrograma
µL Microlitro
mg Miligrama
mL Mililitro
M Molar
nM nanoMolar
% Porcentagem
RESUMO
Costalonga EC. Análise do efeito do ácido valpróico no modelo experimental de fibrose
peritoneal em ratos [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo; 2017.
Pacientes submetidos por longos períodos à diálise peritoneal (DP) podem evoluir com
fibrose e redução da capacidade de ultrafiltração da membrana peritoneal (MP). Essas
alterações da MP são desencadeadas pela exposição prolongada às soluções de diálise
peritoneal, peritonites de repetição e irritantes químicos que induzem inflamação,
neoangiogênese e fibrose da MP. A ativação da via Transforming Growth Factor (TGF-
β)/Smad é um fundamental mecanismo mediador da fibrogênese peritoneal. Sendo
assim, drogas que inibam a via TGF-β/Smad são de especial interesse no tratamento da
FP. O ácido valpróico (VPA) é um inibidor das histona desacetilases (iHDAC), enzimas
que regulam a conformação da cromatina e a expressão gênica, com atividade anti-
inflamatória e antifibrótica. O presente estudo tem como objetivo principal avaliar o
efeito do VPA em um modelo experimental de fibrose peritoneal em ratos. Vinte e
quatro ratos Wistar machos (peso inicial de 280 - 320g) foram dividos em 3 grupos
experimentais: CONTROLE (n=8), animais normais que receberam injeções de salina
intraperitoneal (IP); FP (n=8), animais que recereberam injeções IP de gluconato de
clorexidina (GC) diariamente por 15 dias para indução de fibrose peritoneal; FP+VPA
(n=8), animais com FP e tratados com VPA. O ácido valpróico (300mg/kg) foi
administrado por gavage diariamente por 15 dias, simultaneamente à indução de fibrose
peritoneal. Ao fim dos experimentos, amostras do tecido peritoneal foram coletadas
para realização de histologia, imunho-histoquímica (IH), imunofluorescência (IF) e
biologia molecular. A análise da MP dos animais do grupo FP revelou um espessamento
significativo da camada submesotelial devido ao acúmulo de matriz extracelular e
infiltrado inflamatório. O tratamento com VPA foi capaz de prevenir significativamente
o espessamento da MP, mantendo a espessura do peritôneo do grupo FP+VPA similar a
do grupo CONTROLE. Com relação à função peritoneal, a administração de VPA
evitou a queda da ultrafiltração e aumento do transporte peritoneal de glicose induzidos
pelo GC. Além disso, o VPA impediu o aumento da expressão de miofibroblastos e de
fatores associados à fibrose (TGF-β, FSP-1 e fibronectina) induzidos pelo GC.
Interessantemente, o VPA reduziu de maneira significativa a expressão da Smad3,
mediador intracelular crítico da sinalização TGF-β/Smad, em relação ao grupo FP. Por
outro lado, os animais tratados com VPA apresentaram um aumento da expressão
peritoneal de fatores antifibróticos como a BMP-7 e Smad7, proteínas que
contrarregulam as ações do TGF-β. Além de atenuar a fibrose peritoneal, o VPA
apresentou efeitos anti-inflamatório e antiangiogênico, demonstrado pela menor
expressão de citocinas pró-inflamatórias, fatores quimiotáticos para macrófagos (MCP-
1) e VEGF no grupo FP+VPA quando comparado ao grupo FP. Em resumo, o VPA foi
capaz de bloquear o espessamento por fibrose da MP e preservar a sua função, além de
proteger o peritônio contra a neoangiogênese e inflamação. Além disso, o VPA induziu
um aumento da expressão de fatores antifibróticos na MP. Os resultados apresentados
neste trabalho chamam a atenção para mecanismos envolvidos nas modificações da MP
induzidas pela DP ainda pouco explorados e que podem constiuir potenciais alvos na
prevenção do desenvolvimento da fibrose peritoneal associada à DP.
Descritores: Diálise peritoneal; Fibrose peritoneal; Ácido valpróico; Histona
desacetilases; Fator de crescimento transformador beta; Ratos Wistar.
SUMMARY
Costalonga EC. Analysis of the effect of valproic acid in the experimental model of
peritoneal fibrosis in rats [Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade
de São Paulo”; 2017.
Long term peritoneal dialysis (PF) can induce peritoneal fibrosis and loss of
ultrafiltration capacity of peritoneal membrane (PM). These peritoneal changes are due
to prolonged exposure to peritoneal dialysis solutions, chemical irritants and acute
peritonitis episodes that induce inflammation, neoangiogenesis and PM fibrosis. The
Transforming Growth Factor (TGF-β) is the main mediator involved in the development
of peritoneal fibrosis. Thus, drugs that inhibit the TGF-β/Smad pathway or
inflammation are of particular interest in the treatment of PF. Valproic acid (VPA) is an
histone deacetylase (HDAC) inhibitor. HDACs are enzymes that regulate chromatin
conformation and gene expression. Recent studies have described HDACi as promising
drugs in the treatment of inflammatory and fibrotic diseases. The main aim of this study
was to evaluate the effect of VPA in an experimental model of peritoneal fibrosis in
rats. Twenty four Wistar rats (initial weight of 280-320g) were divided into three
experimental groups: CONTROL (n = 8), normal animals that received only saline ip;
FP (n = 8), peritoneal fibrosis was induced by daily Gluconate Clorhexedine (GC)
intraperitoneal (IP) injections for 15 days; FP+VPA (n = 8), animals with peritoneal
fibrosis and treated with VPA. Daily valproic acid (300mg/kg) doses were administered
by gavage simultaneously with the induction of peritoneal fibrosis in the FP+VPA
group. At the end of experiments, the animals were submitted to euthanasia and samples
of peritoneal tissue were collected for histology, immunocytochemistry,
immunofluorescence, and molecular biology. Also, a functional peritoneal test was
performed. The FP group showed a significant thickening of PM due to the
accumulation of extracellular matrix and inflammatory cellular infiltration. VPA
treatment was able to significantly prevent PM thickening, maintaining the peritoneal
thickness of the VPA group similar to that of the CONTROL group. The VPA
administration also preserved peritoneal function in the FP+VPA group, avoiding the
reduction of ultrafiltration and increasing of peritoneal glucose transport induced by
GC. According to the histological changes mentioned above, the VPA hampered the
upregulation of the pro-fibrotic genes (TGF-β, FSP-1, and fibronectin) and increase in
the myofibroblasts expression induced by GC injections. Interestingly, the peritoneal
expression of phosphorylated Smad3 detected by immunohistochemistry and Smad3
mRNA was significantly higher in the FP group. However, this effect was attenuated by
VPA treatment. On the other hand, VPA was able to induce an increase in the
expression of the antifibrotic factors, such as BMP-7 and Smad7, in the peritoneal
membrane. Besides its antifibrotic activity, VPA also showed anti-inflammatory and
anti-angiogenic effects. Animals of the FP+VPA group showed a significant reduction
of the PM expression of pro-inflmmatory cytokines, macrophage chemoattractants and,
VEGF expression when compared with FP group. In conclusion, we have shown that
VPA inhibits the progression of peritoneal fibrosis in a CG-induced peritoneal fibrosis
model in rats. VPA inhibited different and important mechanisms involved in peritoneal
membrane modifications induced by PD, as activation of TGF-β/Smad pathway,
inflammation, and angiogenesis. Notably, VPA induced the expression of antifibrotic
factors. Our results are very interesting and shed lights on a new perspective for the
treatment of peritoneal fibrosis. However, this is an exploratory study and future studies
are needed before to translate this experimental finding into clinical application.
Descriptors: Peritoneal dialysis; Peritoneal fibrosis; Valpróic Acid; Histone
deacetylases; Transforming growth factor beta; Wistar, rats.
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
2
1. INTRODUÇÃO
A doença renal crônica (DRC) dialítica afeta um grande número de pacientes.
Segundo o último censo brasileiro de diálise publicado, o número total estimado de
pacientes em diálise no país em 1 de julho de 2014 foi de 112.004. Este número
representa um aumento de 20 mil pacientes em um período de 4 anos (92.091 em 2010).
Nesse mesmo período, houve um aumento anual médio no número de pacientes de 5%.
A taxa de prevalência de tratamento dialítico em 2014 foi de 552 pacientes por milhão
da população (pmp), variando por região entre 364 pacientes pmp na região Norte e 672
pacientes pmp na região Sudeste. O número estimado de pacientes que iniciaram diálise
em 2014 no Brasil foi de 36.548, correspondendo a uma taxa de incidência de 180
pacientes pmp (1). Apesar de significativos, esses números ainda podem estar
subestimados. Nos Estados Unidos (EUA), no final de 2014, estimava-se uma
prevalência 6 vezes maior que a brasileira e um número absoluto de 678.000 pacientes
em diálise. Os gastos acompanham a magnitude dos números de pacientes, em 2014
foram gastos nos EUA 32 bilhões de dólares com pacientes em diálise (2). Embora a
hemodiálise (HD) seja mais utilizada do que a diálise peritoneal (DP) como terapia de
substituição renal, o número absoluto de pacientes em DP ainda assim é significativo.
Atualmente estima-se em cerca de 270.000 o número de pacientes que realizam DP no
mundo, representando 11% da população global em diálise (3).
1.1. Histórico da diálise peritoneal
O primeiro registro da utilização do peritôneo como membrana de troca para
tratamento de uremia em humanos data de 1923, quando na Universidade de Würzburg,
Georg Ganter infundiu solução fisiológica na cavidade peritoneal de uma paciente com
uropatia obstrutiva (4). Diversas adaptações técnicas no tipo e no modo de infusão do
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
3
fluido permitiram o desenvolvimento da DP, de modo que ao final da década de 60
alguns centros utilizavam a DP de forma intermitente para o tratamento da uremia,
principalmente em casos de injúria renal aguda. No entanto, a necessidade de punção
peritoneal a cada sessão para instalação do cateter dificultava a aplicação mais ampla da
DP para pacientes com DRC. Foi somente a partir do desenvolvimento de um cateter de
silicone por Tenckhoff (5) em 1973 que a DP intermitente passou a ser mais utilizada
como terapia de substituição renal de longo prazo.
Em 1978 Robert Popovich e cols descreveram uma nova técnica, a diálise
peritoneal ambulatorial contínua (CAPD). No entanto, elevadas taxas de peritonite
foram observadas uma vez que era necessário desconectar e conectar o paciente dos
frascos de vidro onde as solucões de DP eram armazenadas (6). No mesmo ano,
Oreopoulos descreveu uma técnica de CAPD utilizando bolsas plásticas contendo
solução de DP, o que permitiu a expansão da DP como uma forma de terapia de
substituição renal domiciliar (7).
Nas últimas décadas, o aprimoramento técnico permitiu a padronização e
disseminação mundial da DP. A melhora da sobrevida e manutenção dos pacientes em
DP por longos períodos fez com que surgissem novos desafios. Em 1981, Dobbie e cols
foram os primeiros a relatar alterações da membrana peritoneal em pacientes
submetidos à CAPD. Desde então diversos estudos clínicos e experimentais tem
investigado as alterações inflamatórias e fibróticas da membrana peritoneal que ocorrem
no curso da terapia. Atualmente, grande parte do esforço científico no campo da DP é
dirigido no sentido do desenvolvimento de drogas ou novas soluções de diálise menos
bioincompatíveis que atenuem a inflamação e fibrose peritoneal com o objetivo final de
aumentar a sobrevida da técnica e do paciente (8).
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
4
1.2. Diálise peritoneal - Epidemiologia
Em comparação com a HD, a DP oferece algumas vantagens como uma
melhor qualidade de vida, uma maior independência do paciente e a preservação dos
acessos venosos e da função renal residual (9, 10). Mais importante ainda, estudos
epidemiológicos têm demonstrado que a mortalidade nos primeiros dois anos dos
pacientes incidentes submetidos à DP pode ser inferior quando comprada à HD (11, 12).
No entanto, a permanência dos pacientes na DP está limitada por diversos fatores. Por
exemplo, dados brasileiros apontam que somente cerca de 40% dos pacientes
conseguem se manter em DP ao fim dos primeiros 3 anos. Dentre as principais causas
de falha de técnica estão peritonites recorrentes (65%) e a falha de ultrafiltração (19%)
(13).
Apesar das vantagens já demonstradas na literatura, de maneira geral a DP
ainda é subutilizada. Melhorias contínuas nos desfechos clínicos e demonstração de
vantagens socioeconômicas da DP em relação à HD resultaram na adoção por alguns
países de políticas que favoreceram o uso da DP como modalidade inicial de terapia de
substituição renal, de modo que os regimes de reembolso e políticas governamentais são
atualmente os principais determinantes da taxa de utilização da DP em determinados
países. Em decorrência disso, o uso desta terapia está aumentando na China, nos EUA e
na Tailândia, mas diminuindo proporcionalmente em partes da Europa e no Japão.
Atualmente Hong Kong e México, com taxa de utilização da DP em torno de 70 %, são
os países em que a modalidade está mais difundida (3). No Brasil, em julho de 2014,
91,4% dos pacientes em diálise crônica realizavam hemodiálise e 8,6% DP (Figura 1).
Uma porcentagem maior de pacientes pagos pela saúde suplementar faziam diálise
peritoneal, particularmente a DPA, em relação àqueles reembolsados pelo Sistema
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
5
Único de Saúde (SUS). No SUS 8,4% dos pacientes faziam diálise peritoneal contra
9,9% dos planos de saúde suplementar (1).
Figura 1. Proporção de pacientes em diálise peritoneal em relação ao total de pacientes
dialíticos (3).
1.3. Anatomia e fisiologia da membrana peritoneal
O peritônio é a maior membrana serosa do corpo humano com uma área de
superfície de aproximadamente 1,8 m2. O peritôneo parietal recobre a superfície interna
da parede abdominal enquanto que o visceral integra-se com as camadas serosas
externas de órgãos viscerais. O fornecimento de sangue do peritônio parietal é derivado
das artérias da parede abdominal pélvicas enquanto que o peritôeno visceral é irrigado
pelas artérias mesentérica e celíaca principalmente. Do ponto de vista da diálise
peritoneal o peritôneo parietal é mais importante. Aproximadamente 80% de toda a
drenagem linfática da cavidade abdominal é realizada pelo ducto torácico esquerdo e
ducto linfático direito condutor (14).
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
6
A membrana peritoneal (MP) é composta por 3 camadas: o mesotélio, a
lâmina basal e a camada submesotelial (Figura 2). O mesotélio, de origem
mesodérmica, é formado por uma monocamada de células epiteliais sobreposta à lâmina
basal. A camada submesotelial, que suporta as anteriores, consiste em fibras de
colágeno, particularmente tipo I, fibronectina, proteoglicanos, raros fibroblastos,
adipócitos, vasos linfáticos e sanguíneos. Geralmente, as células da camada
submesotelial estão em baixo número e estão inativas, mas em condições
fisiopatológicas específicas são activadas, proliferam e ativam a angiogênese (14).
Figura 2. Estrutura da membrana peritoneal. (A) Membrana peritoneal formada pelo mesotélio
e camada submesotelial composta basicamente por matriz extracelular (15). (B) Fotomicrografia
representativa de uma secção da parede anterior abdominal corado por Tricrômio de Masson,
com identificação das células mesoteliais pelas setas e coloração da camada submesotelial em
azul.
Mesotélio
CamadaSubmesotelial
Cavidade PeritonealA B
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
7
O peritônio é uma membrana semipermeável que permite o transporte de
fluidos e solutos por gradiente de concentração (difusão), pressão hidrostática e
osmótica. Em situações normais, a resistência para o transporte de fluidos e solutos
entre o sangue e fluido intracavitário é dada pelo endotélio dos vasos peritoneais (14).
Esse transporte ocorre através de poros de diferentes tamanho. De acordo Rippe e cols.,
poros de três tamanhos regulam a passagem de moléculas através da MP: os poros
grandes (raio 250 angstron) representam menos de 0,01% e permitem a passagem de
moléculas como proteínas; os poros pequenos que regulam o transporte de 99,7% dos
solutos de baixo peso molecular; e os ultraporos (aquaporina-1) que são responsáveis
pelo transporte de água livre (16).
Na DP, o transporte de eletrólitos, toxinas urêmicas e outros solutos ocorre
entre o sangue contido nos capilares peritoneais e a solução de diálise infundida na
cavidade peritoneal do paciente. Os principais processos que permitem a utilização da
DP como método de diálise são a difusão e a ultrafiltração (UF). Na difusão, ocorre a
passagem das toxinas urêmicas em maior concentração no sangue através da MP para a
solução de diálise. Substâncias cuja concentração na solução de diálise estão em maior
concentração (por exemplo, glicose) do que no sangue, se difundem para o sangue no
sentido inverso. A capacidade de difusão está diretamente relacionada à área de
superfície vascular peritoneal efetiva que tem contato direto com a solução de diálise.
Na UF ocorre a passagem de água do intravascular para a cavidade peritoneal
promovida principalmente por gradiente osmótico que é estabelecido pela elevada
concentração de glicose ou outros agentes osmóticos presentes na solução de diálise. A
estrutura morfológica da MP deve ser mantida saudável para o funcionamento adequado
desses mecanismos (17).
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
8
1.4. Modificações da membrana peritoneal durante a DP
Apesar dos avanços e benefícios observados em relação à DP, alterações
morfofuncionais da membrana peritoneal que se desenvolvem ao longo da terapia
comprometem sua eficácia. Tais alterações ocorrem de forma progressiva e se
expressam clinicamente por aumento do transporte de solutos bem como por falha de
ultrafiltração e, histologicamente, por perda da camada mesotelial, inflamação,
neoangiogênese e fibrose peritoneal (Figura 3). Essas alterações estão associadas a um
aumento da morbimortalidade dos pacientes e falência deste método dialítico (18, 19).
Portanto, estudos que explorem os mecanismos envolvidos nas modificações da MP
induzidas pela DP, bem como estratégias que possam impedi-las, são importantes para
estender a sobrevida da técnica.
Figura 3. Modificações da membrana peritoneal ao longo da diálise peritoneal. Ao longo dos
anos os pacientes evoluem com redução da capacidade de ultrafiltração, desnudamento do
mesotélio, transição epitélio mesquenquimal (EMT), inflamação e fibrose da membrana
peritoneal.
Tempo em DP (anos)
0 2,5 5 7,5 10
Integridade mesotelial
Inflamação
EMT
Fibrogênese
Ultrafiltração
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
9
1.4.1. Alterações no transporte de solutos e ultrafiltração
A velocidade com que pequenos solutos atravessam a MP, denominada taxa
de transporte de soluto peritoneal (TTSP), é uma medida chave da permeabilidade da
MP. Classicamente avaliada através do Teste de Equilíbrio Peritoneal (PET), permite
determinar a permeabilidade da membrana de cada paciente longitudinalmente e tem
valor prognóstico. Pacientes com alta permeabilidade da membrana, denominados alto
transportadores, tendem apresentar menor sobrevida comparados aos outros pacientes,
principalmente quando submetidos à CAPD (20).
Admite-se que o aumento da TTSP seja a primeira indicação funcional do
prejuízo da DP à MP. Embora a ocorrência desse fenômeno seja variável entre os
pacientes, os principais fatores desencadeantes parecem ser a duração da exposição à
diálise, exposição à glicose e produtos de degradação da glicose (GDPs) e episódios de
peritonite (21). Esses fatores induzem inflamação crônica da MP e neoangiogênese
(20). Uma vez que o principal determinante do transporte peritoneal de solutos é a
densidade de capilares em contato com a solução de diálise intraperitoneal, a
neoangiogênese induzida por inflamação tende a aumentar a difusibilidade dos solutos
através da MP (22). O estudo GLOBAL suporta esta conjectura, mostrando fortes
evidências para a produção local de citoquinas na MP, especialmente da interleucina-6
(IL-6), do Fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e da interleucina-1β (IL-1β), e que esta
produção está positivamente correlacionada com TTSP de maneira mais significativa do
que com qualquer outra variável clínica (23).
Pacientes submetidos à DP por tempo superior a dois anos, tendem a evoluir
com perda da capacidade de ultrafiltração (24, 25). O aumento da TTSP tem papel
fundamental nesse processo. O aumento da velocidade de transporte da glicose da
solução de diálise intraperitoenal para o sangue do paciente dissipa o gradiente osmótico
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
10
reduzindo assim a taxa de ultrafiltração. Outro fator importante, principalmente após 5
anos de DP, é a formação de fibrose peritoneal que leva a redução da área efetiva da
MP bem como aumenta o espaço intersticial dificultando o movimento das moléculas
de água entre o capilar e a cavidade peritoneal (26). Evidências recentes sugerem que a
redução do transporte de água livre através da MP, aferida por meio de medidas de
sieving de sódio, é um importante fator preditor de ocorrência de peritonite esclerosante
encapsulante (27).
1.4.2. Inflamação e neoangiogênese
Inflamação e fibrose peritoneal são processos que se estimulam
bidirecionalmente. As soluções de DP são consideradas bioincopatíveis pela sua
hipertonicidade, baixo pH, elevada concentração de glicose e produtos de degradação de
glicose. A exposição prolongada a essas soluções induz lesão das células mesoteliais,
resultando em um desaparecimento gradual da camada serosa. Progressivamente a zona
submesotelial se espessa pela deposição de matriz extracelular (MEC) e infiltração por
células inflamatórias. Paralelamente, também ocorre formação progressiva de novos
vasos no peritôneo (Figura 4) (24). A transdiferenciação das células mesoteliais que
passam a se comportar como células mesenquimais ativadas e migram para a camada
submesotelial, num processo de transição epitélio-mesenquimal (EMT), tem papel
importante nesse processo (28). Tantos as células mesoteliais quanto os miofibroblastos
sintetizam citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e MCP-1) e fatores angiogênicos
como o Vascular endothelial growth factor (VEGF) (29). Além disso, episódios de
peritonite induzem a infiltração da MP inicialmente por neutrófilos e,
subsequentemente, por macrófagos (24). Essas alterações inflamatórias têm impacto
direto na capacidade dialítica da MP. Pecoits e colaboradores, no nosso laboratório,
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
11
demonstraram que existe relação direta entre inflamação e a situação de alto transporte
em DP. Nesse estudo, pacientes com características de transporte alto e médio-alto da
membrana peritoneal apresentaram níveis plasmáticos e no fluido peritoneal mais
elevados de IL-6 (30).
Figura 4. Mecanismos envolvidos nas modificações da membrana peritoneal induzidas pela
diálise peritoneal (18). DP = diálise peritoneal; EMT = transição epitélio mesenquimal; MEC =
matriz extracelular; IL = interleucina; TGF = Transforming growth factor; TNF = Tumoral
necrosis factor; VEGF = Vascular endothelial growth factor.
Neoangiogênese, inflamação e fibrose peritoneal parecem estar intimamente
relacionados através de fatores de crescimento e citocinas inflamatórias que atuam
nesses processos (24). A análise de biópsias peritoneais de pacientes em DP tem
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
12
demonstrado um aumento do número de vasos associado às alterações fibróticas (25,
31). O VEGF parece ter um papel central nessas alterações. Um estudo em humanos
demonstrou uma correlação positiva entre os níveis de VEGF no efluente peritoneal,
aumento do transporte de solutos e o tempo em DP (32). Estudos in vitro suportam
esses achados ao demonstrar que células mesoteliais transdiferenciadas (processo de
transição mesotélio mesenquimal) produzem grandes quantidades de VEGF (33). Além
disso, a redução da expressão do VEGF (34) ou seu bloqueio farmacológico (35)
preservou a estrutura da membrana peritoneal em animais submetidos à indução de
fibrose peritoneal. Portanto, entender a interação entre a vasculogênese e fatores de
crescimento que a promovem com o desenvolvimento de fibrose, pode auxiliar no
desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
1.4.3. Fibrose peritoneal
Sem dúvida um aspecto marcante nos estudos de biópsias peritoneais de
pacientes em DP é o acúmulo de matrix extracelular (MEC) na camada submesotelial
levando a um espessamento da MP. Alterações estruturais de todas camadas da MP
ocorrem em todos os pacientes com tempo de tratamento maior que 2 anos, sendo que
alterações fibróticas mais significativas são mais frequentes após o 4º. ano de terapia.
Essas alterações compreendem principalmente desnudação das células mesoteliais e
fibrose submesotelial. As áreas fibróticas contém colágeno I, colágeno IV e
miofibroblastos (18). Estudos experimentais têm auxiliado o entendimento dos
mecanismos envolvidos nessas alterações e, notadamente, a origem dos miofibroblastos
e as vias de sinalização do Transforming Growth Factor (TGF-β) têm sido foco de
diversos trabalhos.
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
13
Fibroblastos, miofibroblastos e outras células inflamatórias são responsáveis
pelas fibrose da MP. A perda de células mesoteliais com espessamento de matriz
extracelular submesotelial tem sido interpretada na última década como consequência
da transformação das células mesoteliais em células fibroblastóides (miofibroblastos) e
migração para a camada submesotelial através da EMT. Os miofibroblastos derivados
do mesotélio seriam as responsáveis pela produção de colágeno e fibronectina
resultando na fibrose peritoneal (28, 36). No entanto, estudos in vivo não foram capazes
de demonstrar esse fenômeno e recentemente, Chen YT e cols, demonstraram
elegantemente que os miofibroblastos da camada submesotelial peritoneal se originam
dos fibroblastos residentes predominantemente (37). A ativação desses fibroblastos
resultaria na produção de fatores prófibróticos bem como no aumento da expressão
VEGF que contribui para a neoangiogênese (38).
A superfamília TGF-β consiste em uma grande variedade de proteínas de
sinalização, incluindo as isoformas de TGF-β, Bone morphogenic protein (BMP) e
ativinas. Essas proteínas exercem diversas atividades biológicas como proliferação
celular, desenvolvimento embrionário e fibrogenese. A produção de TGF-β1 induzida
pela glicose e seus produtos de degradação presentes nas soluções de DP é passo
fundamental para o estabelecimento da fibrose peritoneal (18, 19, 24). Por exemplo,
pacientes com peritonite encapsulante esclerosante apresentam expressão peritoneal do
TGF-β 24 vezes maior comparado com os controles (39). Esse fator de crescimento atua
induzindo a síntese e inibindo a degradação dos componentes da MEC e, juntamente
com o TNF-α, regula a transformação de fibroblastos e células mesoteliais em
miofibroblastos (18, 24). Diversas estratégias de tratamento da fibrose peritoneal
experimental que bloquearam a expressão do TGF-β foram eficazes em proteger a
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
14
membrana peritoneal (40, 41). A maioria das ações fibróticas do TGF-β1 são mediadas
pelas proteínas Smads.
Os membros da família TGF-β são capazes de estimular a expressão de genes
pró-fibróticos (Fibronectina, colágeno e FSP-1) através dos fatores de transcrição
conhecidos como Smad. Das oito Smads identificadas, apenas cinco – Smad1, Smad2,
Smad3, Smad5 e Smad8 – atuam como sinalizadores dos receptores TGF-β. As Smad2
e Smad3 são as principais envolvidas na fibrose, sendo a Smad3 mais importante na
fibrose peritoneal (42). As Smads 1, 5 e 8 atuam como mediadores intracelulares da
BMP, proteína com funções antagônicas ao TGF-β. Além da BMP, a Smad7 exerce
uma ação de feedback negativo da via TGF-β/Smad. A Smad7 é induzida por um
mecanismo dependente de Smad3 e, por sua vez, inibe a fosforilação da Smad2/3 pelo
receptor de TGF (43).
Resumidamente, o TGF-β se liga a receptores serina/kinase, conhecidos como
TGF-β tipo I (TβR-I) e tipo II (TβR-II). O TβR-II fosforila a região GS localizada na
parte N-terminal do TβR-I. A fosforilação do TβR-I transforma a região GS deste
receptor em um sítio de ligação para Smad2/3. Logo após, as Smads2/3 são fosforiladas
pelo TβR-I. A Smad3 fosforilada, forma um heterodímero com a Smad4, que transloca-
se para o núcleo e ativa regiões promotoras de genes indutores de fibrose (43) (Figura
5).
Dados da literatura indicam uma importante participação da via
TGF-β/Smad na FP. Por exemplo, animais knockout para Smad3 não desenvolvem
fibrose peritoneal induzida por soluções de diálise (42). Em outro estudo, Hong Guo e
cols demonstraram um aumento da expressão do TGF-β associado à ativação das
Smad2 e 3 como mecanismos responsáveis pela fibrose peritoneal em um modelo
experimental utilizando animais urêmicos. Interessanmente, ratos transfectados e
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
15
hiperexpressando o gene da Smad7 tiveram a estrutura da membrana peritoneal
protegida, abrindo perspectivas de que a manipulação da expressão das Smads poderia
se tornar uma estratégia terapêutica para fibrose peritoneal (44).
Figura 5. Via de sinalização TGF-β/Smad. TGF-β ativa cascata de sinalização intracelular em
que a Smad3 fosforilada liga-se à Smad4, transloca-se para o núcleo e ativa genes relacionadas à
fibrose. A Smad7 inibe a fosforilação da Smad3 e atua como um feedback negativo dessa
cascata (45). CTGF = Connective Tissue Growth Factor; p = fosforilação.
Fibronectina
Colágeno IIICTGF
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
16
1.5. Peritonite esclerosante encapsulante
A peritonite esclerosante encapsulante (PEE) foi definida pela Sociedade
Internacional de Diálise Peritoneal como "uma síndrome com sintomas de obstrução
intestinal causadas por adesões de um peritôneo difusamente espessado e que o
diagnóstico é puramente clínico” (46). As alterações histológicas observadas em
pacientes com PEE são similares as descritas anteriormente em pacientes submetidos à
diálise peritoneal por longo tempo, sugerindo que a PEE faz parte de um espectro de
alterações da MP induzidas por inflamação. No entanto, a PEE é evento raro. A teroria
mais aceita atualmente como justificativa para o desenvolvimento de PEE (two hit
theory), admite que a além da inflamação peritoneal crônica induzida pela DP (first hit),
a exposição a um segundo fator (peritonites e irritantes químicos) seria necessário como
gatilho para desencadear um processo fibrosante mais intenso (Figura 6).
Figura 6. Evolução para peritonite esclerosante encapsulante. Além da inflamação peritoneal
crônica induzida pela DP (first hit), a exposição a um segundo fator (second hit – peritonites,
irritantes químicos, interrupção da DP) seria o gatilho necessário para o desencadear um
processo fibrosante mais intenso levando à peritonite esclerosante encapsulante (46).
Mesotélio
Camada submesotelial
Proliferaçãovascular
Espessamento peritonealEncapsulamento
Segundo “Hit”
-Peritonite
-Irritante químico
- Interrupção da DP
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
17
Esclerose peritoneal simples desenvolve-se no maioria dos pacientes que
realizam DP por um longo período (47). PEE é rara antes dos 5 anos e considerada
praticamente inexistente antes dos 3 anos de DP. Em um estudo de registro australiano,
a incidência de PEE foi de 19,4% após 8 anos de DP (48). Resultados semelhantes
foram relatados em um estudo prospectivo, em que a incidência de PEE foi de 0,7%
após 5 anos, 5,9% depois de 10 anos, e 17,2% após 15 anos de terapia (49). Apesar de
estudos recentes sugerirem que a utilização de soluções de diálise com pH neutro
podem reduzir a incidência de PEE (50), essa doença persiste com alta taxa de
morbidade e mortalidade (25-50%). As medicações atualmente utlizadas no tratamento
dessa condição, tamoxifeno, corticosteróides e azatioprina, possuem eficácia limitada e
estão associadas a efeitos adversos graves como trombose venosa profunda, aumento do
risco de câncer e imunossupressão (49). Dado o impacto na mortalidade e limitações
terapêuticas, o desenvolvimento de novas estratégias que auxiliem no controle dessa
doença são muito relevantes.
1.6. Modelo experimental de fibrose peritoneal
O peritôneo humano é estruturalmente igual ao dos roedores (24). Em virtude do
tempo necessário para o desenvolvimento das alterações peritoneais em humanos e
dificuldade de se obter amostras de tecido peritoneal nos pacientes, grande parte do
conhecimento acerca da fibrose peritoneal induzida pela diálise deriva de estudos
experimentais. Dentre os diversos modelos descritos, um dos mais utilizados é o que
simula a fibrose peritoneal através da exposição crônica do peritôneo ao gluconato de
clorexidina (GC) (51, 52).
Uma forte associação foi descrita entre o uso de clorexedina, antisséptico
utilizado para esterilizar os sistemas de tubos para DP na década de 80, e o
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
18
desenvolvimento de PEE em pacientes (53). Suga e colaboradores foram os primeiros a
descrever o desenvolvimento de fibrose peritoneal em ratos através da administração
intermitente de GC (52). O modelo é essencialmente baseado na irritação química e
peritonite asséptica através da injeção intraperitoneal de solução salina contendo 0,1%
de gluconato de clorexidina em 15% etanol. O GC induz a lesão da membrana
peritoneal através do rompimento das junções entre as células mesoteliais, com dano
subsequente ao tecido subseroso causando uma resposta inflamatória que, quando
perpetuada, leva à fibrose. Histologicamente os animais evoluem com infiltrado
inflamatório, aumento do número de vasos e progressivo espessamento e fibrose da
zona compacta submesotelial. Na imuno-histoquímica, evidencia-se infiltração por
macrófagos predominantemente, acompanhada de uma maior expressão de VEGF. Os
achados histológicos são semelhantes aos observados nas biópsias peritoneais de
pacientes submetidos à DP (52, 54).
Outros modelos como a lesão mecânica de peritônio por raspagem e utilização
de solução de diálise a 4,25% através de cateter peritoneal requerem anestesia para
processo o cirúrgico e, mesmo após longo período experimental, não induzem fibrose
peritoneal intensa como observado no modelo induzido pelo GC. Além disso, a taxa de
retirada do estudo por complicações infecciosas e mecânicas associadas ao cateter é
elevada (51), gerando uma grande perda de animais. A capacidade de induzir fibrose
peritoneal intensa em um curto período de tempo e com baixa mortalidade dos animais
faz o modelo de PF induzido pela clorexedina ser adequado para o estudo de fibrose
peritoneal e da peritonite esclerosante encapsulante. Por estas razões, o modelo de
indução de fibrose peritoneal por GC foi utilizado no presente estudo.
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
19
1.7. Histona desacetilases e a fibrogênese
Além das vias que classicamente levam à fibrose, nos últimos anos tem crescido
o interesse a respeito do papel das histona desacetilases na fibrogênese (55).
Nas células eucarióticas, a interação entre a dupla hélice de DNA e os
nucleossomos formados pelas histonas forma a cromatina, que por sua vez, permite a
compactação do material genético no núcleo celular. Além da seqüência primária de
nucleotídeos do DNA, a conformação da cromatina exerce função chave na
determinação de padrões de expressão gênica: regiões menos compactadas
(eucromatina) são mais acessíveis à transcrição. Assim, a mesma seqüência gênica pode
ser expressa normalmente ou transcricionalmente silenciada dependendo da
conformação da cromatina. A acetilação das histonas controla a conformação da
cromatina e constitui-se em importante mecanismo epigenético de regulação da
expressão gênica. As histona acetiltransferases (HATs) e histona deacetilases (HDACs)
são as principais enzimas envolvidas nesse processo. As HDACs removem grupos
acetila das histonas, levando à compactação e inatividade da cromatina (Figura 7).
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
20
Figura 7. Controle da conformação da cromatina. A acetilação das histonas controla a
conformação da cromatina. As histona acetiltransferases (HATs) e histona deacetilases
(HDACs) são as principais enzimas envolvidas no remodelamento da cromatina. As HDACs
removem grupos acetila das histonas, levando à compactação da cromatina e silenciamento
gênico. H = histonas, Ac = radical acetil.
Doenças fibróticas se caracterizam por um aumento da expressão das HDACs,
levando a um estado de repressão transcripcional e, consequentemente, silenciamento
genético (55, 56). Recentemente, diferentes inibidores das HDACs tem demonstrado
efeito antifibrótico em doenças cardíacas (57), hepáticas e renais (56). Essas drogas
previnem a desacetilação das histonas, induzindo a descompactação da cromatina que
por sua vez pode facilitar a expressão de alguns genes antifibróticos como o BMP-7 e o
Fator de Crescimento do Hepatócito (HGF) (58) (Figura 8). Durante o desenvolvimento
do nosso estudo foi publicado um artigo demonstrando que o ácido hidroxâmico
Histona Acetiltransferase
(HAT)
Histona Desacetilase(HDAC)
DNA
DNA
H
H
H H H
HH
Cromatina Condensada inativa
Cromatina Descompactada Ativa
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
21
suberoilanilida (SAHA, Vorinostat), um inibidor das HDACs, foi capaz de previnir o
desenvolvimento de fibrose peritoneal em camundongos através do aumento da
expressão da BMP-7 (59).
Figura 8. Papel dos inibidores das histona desacetilases na fibrose. (1) Um aumento da
expressão das HDACs foi demonstrado nas doenças fibróticas com consequente compactação
da cromatina e repressão transcripcional. (2) Inibidores das HDAC impedem a desacetilação das
histonas, induzindo a descompactação da cromatina, que por sua vez pode facilitar a expressão
de alguns genes antifibróticos como o BMP-7 e HGF (3). BMP = Bone Morphogenic Protein;
HDACi = inibidor da HDAC; HGF = Hepatocyte Growth Factor; H = histonas, Ac = radical
acetil.
Além da regulação da expressão gência, a inibição das HDAC pode modular
diretamente a atividade de proteínas envolvidas na inflamação e fibrose, como por
expemplo a IL-6, STAT3 (57, 60) e Smad7 (61). A Smad7, um antagonista do TGF-β,
quando acetiladada se torna mais resistente à degradação (61). Logo a inibição das
H
H
H H H
HH
HDACiHDACHAT
↑ BMP-7
↑ HGF
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
22
HDACs pode favorecer a acetilação da Smad7, prevenir sua degradação e promover a
inibição da fibrose.
Os inibidores das histona desacetilases (Tabela 1) podem ser classificados em
inibidores específicos das HDACs classe I (p. ex. ácido valpróico e vorinostat) ou pan-
inibidores das HDACs (p. ex. tricostatina A) (56). Embora inibidores das HDAC sejam
majoritariamente estudados como agentes antineoplásicos, muitos estudos
demonstraram sua capacidade de suprimir a fibrose e também a atividade inflamatória.
Por exemplo, em um modelo de artrite reumatóide experimental, a Tricostatina A inibiu
a expressão do TNF-α e reduziu a translocação nuclear NF-kB (62).
Uma vez que os inibidores das HDAC são capazes de inibir os processos de
fibrose e inflamação, essas drogas podem se tornar alternativas para o tratamento das
modificações da MP induzidas pela DP.
Tabela 1. Efeito dos inibidores das histona desacetilases na fibrose.
HDACi Especificidade Modelo Mecanismo
Ácido Valpróico HDAC Classe I NDM, Nefropatia
por adriamicina
↓ TGF-β, ↓ MCP-1
↓ Macrófagos
↓ TNF-α
SAHA HDAC Classe I Fibrose peritoneal ↑ BMP-7
TSA Paninibidor UUO ↓ EMT, ↓ SMA
Legenda: BMP = Bone morphogenic protein; EMT = transição epitélio mesenquimal; HDAC =
histona desacetilase; HDACi = inibidor de histona desacetilase; MCP = Monocyte
chemoattractant protein; SMA = alfa actina de músculo liso; SAHA = ácido hidroxâmico
suberoilanilida, TSA = tricostatina A, UUO = obstrução ureteral unilateral, NDM = nefropatia
diabética.
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
23
1.8. Ácido valpróico
O ácido valpróico (ácido 2-propilvalérico, VPA), um ácido graxo de cadeia curta
(Figura 9) derivado do ácido valérico, foi sintetizado inicialmente em 1882 e foi
utilizado como um solvente para compostos orgânicos por quase um século (63, 64).
Em 1963, durante um estudo de moléculas com potencial anti-convulsivante, no qual o
VPA foi utilizado como uma molécula carreadora, foi incidentalmente descoberta a
propriedade anti-epiléptica do VPA (65). O VPA, na forma do valproato de sódio, vem
sendo utilizado clinicamente como anti-convulsivante e estabilizador do humor pela sua
capacidade de aumentar a atividade do neurotransmissor inibitório ácido gama-amino-
butírico (63). Apesar de preocupações quanto à indução de infertilidade e
hepatoxicidade, o VPA é uma droga segura, com janela terapêutica ampla, disponível
no mercado e barato (66).
Figura 9. Estrutura química do ácido valpróico.
A descoberta recente de que o valproato é um inibidor efetivo das HDACs abriu
novas perspectivas para utilização dessa droga em situações clínicas como as
neoplasias, doenças inflamatórias e doenças fibrosantes crônicas (63). O VPA é capaz
de alterar a expressão de diversos genes envolvidos no controle do ciclo celular,
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
24
apoptose e reparo do DNA de células tumorais, sendo capaz de induzir morte,
diferenciação e/ou interrupção do ciclo celular dessas células. Além de modular a
expressão gênica através de modificações das histonas, o VPA regula a atividade de
proteínas não histonas por promover a acetilação destas. (66). Atualmente existem mais
de 100 ensaios clínicos registrados e abertos no Clinical trials.gov avaliando a eficácia
anti-neoplásica de inibidores das HDACs incluindo o VPA (67).
O efeito antifibrótico dos inibidores das HDACs já foi demosntrado em modelos
experimentais de uropatia obstrutiva unilateral (68), nefropatia diabética induzida por
estreptozotocina (69) e nefropatia por adriamicina (70). Van Beneden et al.
demonstraram que o VPA pode prevenir a lesão renal e a proteinúria no modelo de
nefropatia induzida por adriamicina por inibir a apoptose e atenuar a expressão de genes
pró-fibróticos (TGF-β) e pró-inflamatórios (TNF-α e MCP-1) (70). Além disso, a
capacidade do VPA de inibir a infiltração por macrófagos (71) e bloquear a transição
epitélio mesenquimal (58) já foi demonstrada previamente. Além da ação antifibrótica,
o VPA possui efeito anti-inflamatório. Em trabalho desenvolvido no nosso laboratório,
o VPA foi capaz de prevenir a lesão renal aguda induzida por isquemia e reperfusão em
ratos bloqueando a expressão de TNF-α bem como reduzindo a migração de macrófagos
e linfócitos (72).
Para inibição das HDACs doses elevadas do VPA são necessárias. Em trabalhos
experimentais, administração de VPA 300 mg/kg promove uma rápida e intensa
elevação do nível de acetilação das histonas (73). Em outros estudos experimentais, as
doses utilizadas para obtenção da inibição das HDACs variaram entre 300 mg/kg/dia a
600 mg/kg/dia por até 8 semanas (72, 74-76). Em humanos, a dose máxima tolerada
descrita é de 140 mg/kg por via endovenosa (77).
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
25
Até o momento nenhum estudo utilizando o VPA no tratamento da fibrose
peritoneal foi publicado e o mecanismo molecular envolvido no efeito antifibrótico
dessa droga ainda não está completamente elucidado. Sabendo das atividades anti-
inflamatórias e antifibróticas do ácido valpróico foi formulada a hipótese de que essa
droga poderia ser efetiva na prevenção da fibrose peritoneal experimental.
RACIONAL
RACIONAL
_______________________________________________________________
27
2. RACIONAL
A DP é uma modalidade estabelecida de terapia de substituição renal com
vantanges em relação à hemodiálise, incluindo melhor sobrevida nos primeiros dois
anos. No entanto, fatores como peritonites de repetição e a exposição prolongada às
soluções de DP levam a modificações da membrana peritoneal que determinam a
falência da técnica. Essas alterações compreendem graus variados de inflamação,
neoangiogênse e, principalmente, fibrose peritoneal. Portanto, estratégias que previnam
ou bloqueiem a progressão dessas complicações e a perda da função da MP são de
grande relevância.
O ácido valpróico é uma droga classicamente utilizada para tratamento de
epilepsia e amplamente disponível no mercado. Além do efeito anticonvulsivante,
estudos recentes têm demonstrado que essa droga possui atividades anti-inflamatória e
antifibrótica decorrente da sua capacidade de inibição das histona desacetilases. Com
base nisso, foi formulada a hipótese de que a administração do ácido valpróico poderia
ser eficaz em bloquear o processo de fibrose peritoneal experimental.
OBJETIVOS
OBJETIVOS
_______________________________________________________________
29
3. OBJETIVOS
O objetivo central do presente estudo foi analisar o efeito do ácido valpróico na
fibrose peritoneal experimental em ratos.
Os seguintes objetivos específicos foram delineados:
1. Avaliação histológica do efeito do ácido valpróico no peritônio de ratos
submetidos ao modelo de fibrose peritoneal induzido quimicamente,
analisando o grau de espessamento peritoneal e a fibrose da camada
submesotelial do peritônio (coloração com Tricrômio de Masson);
2. Análise da expressão de fatores envolvidos na fibrogênese peritoneal
(fibronectina, TGF-β1 e FSP-1) no peritônio, através de PCR em tempo
real;
3. Análise da via de sinalização das Smads no processo de fibrogênese no
peritônio, através de PCR em tempo real para Smad3 bem como imuno-
histoquímica para Smad3 fosforilada;
4. Análise da expressão de fatores antifibróticos (BMP-7 e Smad7) no
peritôneo através de PCR em tempo real e imunofluorescência.
5. Análise imuno-histoquímica do peritôneo para identificar e quantificar a
infiltração por macrófagos (ED1) e miofibroblastos (α-actina);
6. Análise da expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-
1β) e quimiocinas (MCP-1 e MIP-2) no peritônio, através de PCR em
tempo real e Multiplex;
7. Análise da neoangiogênese e expressão do VEGF por PCR no peritôneo;
8. Avaliação da função peritoneal através da medida do transporte de
glicose e ultrafiltração peritoneal.
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E MÉTODOS
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31
4. MATERIAIS e MÉTODOS
4.1. Animais
Os experimentos foram realizados em ratos Wistar machos pesando entre 280 e
320g obtidos do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo. Os animais foram mantidos em gaiolas para roedores, a uma temperatura de 22ºC
e com livre acesso à água e ração padrão. Toda a metodologia aplicada para o estudo foi
aprovada pela Comissão de Ética em Pesquisa da FMUSP (protocolo 145/14).
4.2. Modelo experimental
A fibrose peritoneal foi induzida através de injeções intraperitoneais de
gluconato de clorexidina (GC) a 0,1% em etanol a 15% dissolvido em salina, como
descrito previamente (54). Os ratos receberam injeções de GC na dose de 1 mL/100g de
peso diariamente do 15º ao 30º dia do protocolo.
4.3. Administração do ácido valpróico
O ácido valpróico (Depakene, Abbott, Illinois, EUA) foi administrado
diariamente via gavage na dose de 300 mg/kg/dia do 15º ao 30º dia, ou seja,
concomitante com a indução da fibrose peritoneal.
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
32
4.4. Grupos experimentais e desenho do estudo
Depois de um período de adaptação de 15 dias foram formados 3 grupos com 8
animais cada. Esses animais foram divididos da seguinte forma (Figura 10):
Grupo Controle: animais que receberam veículo por gavage (salina) e injeções
intraperitoneais de salina;
Grupo FP: animais que receberam injeções intraperitoneais de GC e veículo;
Grupo FP+VPA: animais com FP tratados com VPA;
Figura 10. Desenho do estudo. Após 15 dias de adaptação os animais foram divididos em 3
grupos: Controle, FP e FP+VPA. No 30º. dia os animais foram submetidos à eutanásia para
coleta de material biológico. GC = injeções diárias de gluconato de clorexedine;
IP = intraperitoneal; VPA = administração de ácido valpróico diariamente 300 mg/kg via
gavage; PCR = reação em cadeia de polimerase; † = eutanásia dos animais.
†Dia 30Dia 0
Controle(n=8)
FP(n=8)
FP+VPA(n=8)
†
Dia 30Dia 0
Ácido Valpróico
†
Dia 30Dia 0
Salina
HistologiaFunção peritoneal
ImunohistoquímicaImunofluorescência
MultiplexPCR
Dia 15
Dia 15
Dia 15
Salina IP
Salina
GC IP
GC IP
MATERIAIS E MÉTODOS
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33
Um grupo (Controle + VPA, n=5) de animais controles foram tratados com
ácido valpróico para avaliar o efeito da medicação no peso, morfologia e função
peritoneal na ausência do estímulo da fibrose pelo GC.
Após o período do protocolo experimental, os animais foram submetidos à
eutanásia através de injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico 100 mg/kg.
Amostras da parede abdominal anterior contralateral ao local das injeções foram
coletadas. Amostras do peritôneo foram cuidadosamente dissecadas e imediatamente
congeladas em nitrogênio líquido e, posteriormente, armazenadas em freezer -70 ºC.
Uma secção da parede abdominal permaneceu 45 minutos em solução de Duboscq-
Brazil, sendo em seguida transferida para solução de formol 10% em tampão fosfato até
a inclusão em blocos de parafina.
4.5. Análise da espessura da membrana peritoneal
4.5.1. Coloração Tricômio de Masson
Para a realização da coloração histológica, lâminas com fragmentos peritoneais
de 3µm de espessura passaram por um processo de desparafinização. Após 30 minutos
em estufa a 60C, as lâminas foram imersas em xilol durante 9 minutos, por 3 vezes.
Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em etanol absoluto (Merck, Darmstadt,
Alemanha) por 5 minutos (2 vezes), em etanol 96% por 3 minutos (2 vezes) e em água
destilada.
Para analisar o espessamento e o grau de fibrose na membrana peritoneal foi
empregada a técnica de Tricrômio de Masson. Após a desparafinização, as lâminas
foram incubadas em Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha) por 3
minutos e 30 segundos e, em seguida, em solução de Cromotrop (Cromotrop + Azul de
MATERIAIS E MÉTODOS
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34
Anilina + Ác. Fosfotungstico) por 25 minutos. As lâminas foram então lavadas em água
destilada e imediatamente desidratadas na sequência de banhos de etanol e xilol a partir
do etanol 96%.
4.5.2. Histomorfometria
Para cada animal, fotos de campos microscópicos (aumento 200 x) de toda a
extensão peritoneal foram obtidas. Em cada campo, a espessura da membrana peritoneal
foi medida em três locais diferentes e a média do campo foi calculada. A média de todos
os campos de cada animal foi determinada e utilizada para as análises estatísticas. Para
este procedimento utilizamos imagens digitalizadas e software de análise de imagens
(Image Pro Plus Software 7.0, Media Cybernetics Inc, Bethesda, EUA). A medida da
espessura da MP foi expressa em μm.
4.6. Imuno-histoquímica
4.6.1. Macrófagos
Os macrófagos foram identificados no peritônio através do anticorpo
monoclonal anti-monócito/macrófago de rato (anti-CD68, clone ED-1) (Serotec,
Raleigh, EUA), produzido em camundongo.
O método de imuno-histoquímica (IH) utilizado para a marcação deste anticorpo
foi o LSAB-AP (Labeled Streptavidin-Biotin Alcaline Phosphatase – Dako, Carpinteria,
EUA). Todo o processo foi realizado em câmara úmida.
Com o objetivo de aumentar a expressão antigênica, após a desparafinização, as
lâminas foram imersas em tampão citrato 10 mM, pH=6,0 e levados em forno micro-
ondas com potência de 2400 watts durante 15 minutos. Após atingir a temperatura
MATERIAIS E MÉTODOS
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35
ambiente as lâminas foram lavadas com água destilada para a retirada do tampão citrato
e transferidas para Tris buffered saline (TBS) pH=7.
Para o bloqueio da biotina endógena os cortes foram incubados com solução de
avidina D (Vector, Burlingame, EUA) durante 15 minutos, sendo posteriormente
lavadas com TBS durante 5 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados com uma
solução de biotina (Vector, Burlingame, EUA) durante 15 minutos e posteriormente
lavados com TBS por 5 minutos. O bloqueio de ligações inespecíficas foi realizado
incubando o tecido com albumina sérica bovina a 1% por 15 minutos e, após a retirada
do excesso, os cortes foram incubados com o anticorpo primário anti-ED-1 (1:200),
durante a noite a 4ºC.
No dia seguinte, os cortes foram lavados em TBS por 5 minutos e incubados
com o pool de anticorpos biotinilados anti-camundongo, anti-coelho e anti-cabra (Dako,
Carpinteria, EUA) por 30 minutos. Após lavagem com TBS, para completar a reação, os
cortes foram incubados com o complexo estreptavidina-biotina-fosfatase alcalina
(Dako, Carpinteria, EUA) por 30 minutos e lavados novamente com TBS e destinados à
revelação.
Para a revelação, os cortes foram incubados com uma solução contendo
substrato para a enzima fosfatase e o corante fast-red (Sigma Chemical Co, Saint Louis,
EUA), preparada da seguinte maneira: 1 mg de fosfato de naftol AS-MX (Sigma
Chemical Co, Saint Louis, EUA) foram diluídos em 100 μL de dimetilformamida
(Merck, Darmstadt, Alemanha). Em seguida, a solução foi diluída em 4,9 mL de tampão
Tris 0,1M (pH=8,2) e 10 μL de levamisol 1M (Sigma Chemical Co, Saint Louis, EUA)
foram acrescentados. Esta solução ficou armazenada a –20ºC e, no momento da
revelação foi misturada com 5 mg do corante fast-red.
MATERIAIS E MÉTODOS
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36
A revelação foi realizada sob microscopia em aumento de 100 X e as células
positivas apresentaram coloração avermelhada. O tempo de revelação foi de
aproximadamente 15 minutos. As lâminas foram contra coradas com hemalunbre de
Mayer (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante 2 minutos, lavadas em água destilada e
montadas com glicergel (Merck, Darmstadt, Alemanha).
As células com marcação positiva para ED-1 (coloração vermelha) presentes
na membrana peritoneal foram quantificadas no aumento microscópico de 200 x e o
número ajustado pela área da membrana peritoneal analisada. Fotos de toda a extensão
do peritôneo de cada animal foram avaliadas e uma média final de todos os campos foi
determinada. A área da membrana peritoneal foi calculada usando o software Image-Pro
Plus 7.0 (Media Cybernetics Inc., Bethesda, EUA). A quantificação foi expressa como
células/mm2.
4.6.2. Miofibroblastos (α-SMA, actina de músculo liso)
Para a realização da técnica de IH, os fragmentos de tecido aderidos às lâminas
foram desparafinizados, e em seguida foram transferidas para tampão citrato 10 mM pH
6,0 e levadas ao forno de micro-ondas com potência de 2400 watts durante 15 minutos
para a exposição antigênica. Ao término, as lâminas foram resfriadas lentamente até
atingir a temperatura ambiente, lavadas com água destilada para a retirada do tampão
citrato e transferidas para TBS.
Em seguida foi realizado o bloqueio da biotina endógena do tecido, incubando-o
por 15 minutos com solução de avidina e por 15 minutos com solução de biotina
(Vector, Burlingame, EUA). O bloqueio de ligações inespecíficas foi realizado
incubando o tecido com albumina sérica bovina a 1% por 15 minutos. Os cortes foram
então incubados com o anticorpo monoclonal de camundongo anti-alfa-actina de
MATERIAIS E MÉTODOS
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37
músculo liso (Sigma Chemical CO, St. Louis, EUA) na diluição de 1:800, durante à
noite a 4°C e em câmara úmida.
A seguir, os fragmentos foram incubados com o pool de imunoglobulinas
biotiniladas anti-camundongo, anti-coelho e anti-cabra (LSAB Biotinylated Llink
Universal, Dako Carpenteria, EUA) por 30 minutos, seguida pela incubação com o
complexo estreptavidina-biotina/fosfatase alcalina (LSAB Streptavidin-AP, Dako,
Carpenteria, EUA) por 30 minutos.
A revelação foi realizada incubando o tecido por cerca de 10 minutos em
solução de substrato para fosfatase alcalina (naftol fosfato 0,54 mM, dimetilformamida
0,005%, Tris 0,098 M e levamisol 0,002M) contendo o corante fast-red a 0,01%. A
contra coloração foi feita com hemalumbre de Mayer (Merck, Darmstadt, Alemanha)
por 1 minuto. As lâminas foram montadas com glicergel (Merck, Darmstadt,
Alemanha).
A área marcada para α-SMA (%) relativa à toda a área peritoneal de cada campo
microscópico foi realizada usando o software Image-Pro Plus 7.0 (Media Cybernetics
Inc., Bethesda, EUA). Fotos de toda a extensão do peritôneo de cada animal foram
avaliadas e uma média final de todos os campos foi determinada. A quantificação foi
expressa percentual da área peritoneal.
4.6.3. Smad3 fosforilada
A detecção da proteína Smad3 fosforilada foi realizada através do anticorpo
Rabbit anti-Smad3 fosforilada (Abcam, Cambridge, Reino Unido), utilizando o kit
NovoLink (Leica Biosystems Newcastle LTDA, Newcastle, Reino Unido). Após a
desparafinização, as lâminas foram colocadas no tampão citrato 10 mM pH 6,0 para
recuperação do antígeno e levadas ao forno de micro-ondas com potência de 2400 watts
MATERIAIS E MÉTODOS
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38
durante 15 minutos para a exposição antigênica. Ao término, as lâminas foram
resfriadas lentamente até atingir a temperatura ambiente, lavadas com água destilada
para a retirada do tampão citrato e transferidas para TBS. Em seguida foi realizado o
bloqueio da peroxidase por 5 minutos. Ao término, foram realizadas duas lavagens com
TBS por 5 minutos cada. O próximo passo foi incubação por 5 minutos também com
Protein Block pertencente ao kit. A lavagem com TBSfoi realizada novamente por duas
vezes para posterior incubação overnight a 4ºC com o anticorpo anti-Smad3 fosforilada
na diluição 1:1000.
No outro dia, as lâminas foram lavadas duas vezes no TBS por 5 minutos. Após
isso foram incubadas com bloqueio pós-primário por 30 minutos, seguido por lavagens
com TBS. Em seguida foi realizada a incubação com polímero por 30 minutos. Após a
última incubação, as lâminas foram lavadas mais duas vezes com TBSpor 5 minutos.
Por fim, foi realizada a revelação com Aminoetilcarbazol (AEC) por 6 minutos e contra
coloração com banho na hemalunbre de Mayer (Merck, Darmstadt, Alemanha) e
montadas com glicergel (Merck, Darmstadt, Alemanha).
As células com marcação positiva para Smad3 fosforilada presentes na
membrana peritoneal foram quantificadas no aumento microscópico de 200 x e o
número ajustado pela área da membrana peritoneal. Fotos de toda a extensão do
peritôneo de cada animal foram avaliadas e uma média final de todos os campos foi
determinada. A área da membrana peritoneal foi calculada usando o software Image-Pro
Plus 7.0 (Media Cybernetics Inc., Bethesda, EUA). A quantificação foi expressa como
células/mm2.
MATERIAIS E MÉTODOS
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4.7. Imunofluorescência
4.7.1. Smad7
Após desparafinização e recuperação antigênica por calor em tampão citrato
(pH 6,0), as secções foram permeabilizadas com Triton x-100 a 0,2% em solução
tamponada com fosfato (PBS), seguido de bloqueio com albumina sérica bovina a 5%
por 30 minutos. Após lavagem, as lâminas foram incubadas a 4 ºC durante a noite com
anticorpo anti-Smad7 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, Reino Unido) diluído a
1:100. No dia seguinte, as secções foram então incubadas com IgG de cabra anti-coelho
marcada com FITC (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA) diluída a 1:50 durante 1 hora e
coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Thermo Scientific, Waltham, EUA)
durante 7 min, e montado em glicerol. Os controles foram tratados por omissão do
anticorpo primário. As secções foram examinadas sob o microscópio Nikon Eclipse 80i
(Tóquio, Japão). Pelo menos dez campos microscópicos foram obtidos de cada rato sob
ampliação 400 x. A proporção de células Smad7 positivas (Smad7+) em relação à todas
as células coradas pelo DAPI no peritôneo em cada campo microscópico foi calculada.
Estabeleceu-se então a proporção (Smad7+/DAPI
+) média de todos os campos para cada
rato a fim de se realizar as análises estatísticas.
4.7.2. Isolectina-B4
A imunofluorescência (IF) para isolectina-B4 foi realizada para estudar a
neoangiogênese na MP. Após desparanifinização e recuperação antigência, as laminas
foram incubadas com albumina sérica bovina a 5% em PBS-Tween (pH 7,4) durante 60
minutos. As lâminas foram então incubadas a 4ºC durante a noite com anti-isolectina-B4
conjugada com Dy Ligth 594 Griffonia Simplicifolia (Vector Laboratories, Burlingame,
EUA) diluída a 1: 100. No dia seguinte, após lavagem, as seções foram montadas com
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
40
reagente ProlongGold anfifade com DAPI (Life Technologies, Carlsbad, EUA). No
mínimo 10 campos microscópicos foram retirados de cada rato sob ampliação x 400
utilizando com filtro de 594 nm para isolectina e 540 nm para DAPI (microscópio
Nikon Eclipse 80i, Tóquio, Japão).
4.7.3. Quantificação da densidade capilar da membrana peritoneal
Para avaliação da neoangiogênese na membrana peritoneal foi utilizado um
índice de densidade vascular composto pelo número de vasos sanguíneos na camada
submesotelial dividido pela área da membrana peritoneal. Em cada campo microscópico
o número de vasos corados pela isolectina na zona submesotelial foram contados e
ajustados pela área. Um índice de densidade capilar foi calculado e expresso em número
de vasos/mm2. A média de cada animal foi calculado a partir dos índices de densidade
vascular de todos os respectivos campos microscópicos. Essa média foi utilizada para
análise estatística.
4.8. Expressão de citocinas no peritôneo por Multiplex
As amostras de tecido peritoneal foram lisadas em tampão RIPA (EMD
Millipore, Billerica, EUA) com inibidor de protease. Utilizou-se um kit de ensaio de
citocinas / quimiocinas para ratos MILLIPLEX (EMD Millipore, Billerica, EUA) para
medir a concentração de TNF-α, IL-1β, IL-6, Monocyte chemoattractant protein-1
(MCP-1) e Macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) no homogeneizado de
amostras do peritôneo. O ensaio foi lido no sistema de matriz de suspensão Bio-Plex e
os dados foram analisados utilizando o software Bio-Plex Manager versão 4.0 (Life
Science, Hercules, EUA). Os resultados foram expressos como pg/mg de proteína.
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
41
4.9. PCR em tempo real
4.9.1. Extração de RNA
Todas as soluções utilizadas para a extração de RNA foram feitas com água
deionizada através do sistema Milli-Q (Millipore, Milli-Q Element A10 System,
Billerica, EUA) e tratada com dietilpirocarbonato (Sigma, St Louis, EUA). Para cada
litro de água deionizada, foram adicionados 1,0 mL de dietilpirocarbonato e a solução
foi mantida a 60ºC sob agitação por aproximadamente 12 horas, sendo em seguida
autoclavada (121ºC por 20 minutos). RNA total foi extraído da membrana peritoneal
com o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EUA), seguindo-se o protocolo sugerido
pelo fabricante. Cada 100 mg de tecido foi homogenizado com 1 mL de Trizol com
auxílio de um dispersador de tecidos (IKA – Labortechnik Ultra Turrax T25 Janke &
Kunkel, Alemanha). A cada mL de homogenato, foram adicionados 200µL de
clorofórmio (Merck, Darmstadt, Alemanha), a mistura foi novamente homogeneizada e
mantida por 3 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, a mistura foi
centrifugada a 12.000 g a 4°C por 20 minutos. A fase superior contendo RNA foi
transferida para um microtubo de 2 mL contendo o mesmo volume de isopropanol
gelado (Sigma Chemical Co, Saint Louis, EUA). As amostras foram centrifugadas a
12.000g durante 10 minutos, o sobrenadante foi descartado, o pellet de RNA foi
ressuspendido em 1 mL de etanol 70% (Merck, Darmstadt, Alemanha) e centrifugado
novamente a 12.000g por 10 minutos. Este procedimento foi repetido e o pellet foi
ressuspendido com 50 µL de água previamente tratada com dietilpirocarbonato.
A quantificação do RNA foi feita em espectrofotômetro (NanoDrop, Thermo
Fisher Scientific, Marietta, EUA) medindo-se absorbância nos comprimentos de onda
260 e 280 nm. Foi feito o cálculo da concentração de RNA expresso em µg/mL a partir
da absorbância a 260 nm. A leitura de 1 OD corresponde a uma solução pura de RNA
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
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em fita-simples na concentração de 40 µg/mL. A leitura a 280 nm foi utilizada para
determinar a contaminação das amostras com proteínas. A análise foi feita baseando-se
na razão entre as absorbâncias a 260 e 280 nm e o valor aceitável foi de 1,7 a 2,0.
4.9.2. Síntese de cDNA
Todos reagentes utilizados para a reação de síntese do DNA complementar
(cDNA) foram da marca Promega (Promega, San Luis Obispo, EUA). Um microlitro de
oligo dT primer (500 µg/ml) foi misturado a 11 µl de uma solução de RNA a 50 ng/µl.
A solução foi aquecida a 70ºC por 10 minutos e resfriada em gelo por 5 minutos. Em
seguida, foi acrescentado 4 µl de tampão [5X] (Tris-HCl 250 mM pH=8,3, KCL 375
mM, MgCl2 15 mM) , 2 µl de DTT 0,1M, 1 µl de dNTP Mix (10mM de dATP, dGTP,
dCTP e dTTP) e 1 µl (200u) da enzima transcriptase reversa M-MLV (Moloney Murine
Leukemia Virus). A reação foi realizada a 42ºC por 50 minutos, passando
posteriormente por um período de 15 minutos a 70ºC para a inativação da enzima. O
cDNA foi mantido em freezer a –20ºC até a realização da reação em cadeia de
polimerase (PCR) em tempo real.
4.9.3. PCR em tempo Real
Para esta etapa foram confeccionados pares de primers para a obtenção de
amplicons com no máximo 250 pb (pares de base), conforme a recomendação para PCR
em tempo real. Os primers utilizados estão representados na Tabela 2.
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
43
Tabela 2. Primers utilizados para os experimentos de PCR em tempo real
Para a PCR em tempo real foi utilizado o kit SYBR GreenEr qPCR SuperMix
Universal (Invitrogen, Carlsbad, EUA). Um microlitro de cDNA foi acrescido de 7,5 µL
de mix do kit, 0,6 µL de primer foward (10 µM), 0,6 µL de primer reverse (10 µM),
5,75 µl de água deionizada e 0,15 µl de Rox. Todas as reações foram realizadas em
triplicatas. A mistura foi aquecida a 50ºC por 10 minutos e depois a 95ºC por 5 minutos,
seguindo 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por 30
segundos. A curva de melting foi feita à 65ºC com variação de 1ºC.
Gene alvo Primers
β-Actina Sense 5’ AGGAGTACGATGAGTCCGGCCC 3’
Antisense 5’ GCAGCTCAGTAACAGTCCGCCT3’
IL-1β Sense 5’CCTTGTGCAAGTGTCTGAAGCAGC3’
Antisense 5’GCCACAGCTTCTCCACAGCCA3’
TNF-α Sense 5’TGGCCCAGACCCTCACACTCA3’
Antisense 5’GGCTCAGCCACTCCAGCTGC3’
Fibronectina Sense 5’TGACCCAGACTTACGGTGGCA3’
Antisense 5’GGAGTAGAAGGTCCTACCGTTGTAGTG3’
TGF-β Sense 5’CAACCCGGGTGCTTCCGCAT3’
Antisense 5’TGCTCCACCTTGGGCTTGCG3’
VEGF Sense 5’ACTGTGAGCCTTGTTCAGAGCGG3’
Antisense 5’TCAAGCTGCCTCGCCTTGCA3’
FSP-1 Sense 5’GGCAACGAGGGTGACAAGTT3’
Antisense 5’CCCTGGTCAGTAGTCCCTTGA3’
Smad3 Sense 5’TCAACGGAACTTGGGAATGAG3’
Antisense 5’GTAGTGCGGAGCTCTCCTTCA3’
Smad7 Sense 5’CCTGGCCGGTGTAAATGTCT3’
Antisense 5’GCGGATCCCTTGGAAAGG3’
BMP-7 Sense 5’TGGCGGTGGAGGAGAGTGGG3’
Antisense 5’CTGCAGGCTGGCCAAAGGGG3’
Smad5 Sense 5’GGGCTGCTGTCCAACGAA3’
Antisense 5’GATGTGCCGCCTGGTGTT’
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
44
O equipamento utilizado foi o StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Singapura, Singapura). A expressão gênica foi determinada como a
expressão relativa entre o gene alvo e o gene housekeeping β-actina, calculadas pelo
software do aparelho StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems,
Singapura, Singapura), a partir dos cycle threshold (CT) das reações.
4.10. Análise da função peritoneal
Um teste de equilíbrio peritoneal (PET) modificado de 2 horas foi realizado
em todos os ratos no final dos experimentos. Cada rato recebeu injeção intraperitoneal
de 0,09 ml/g de peso de solução de diálise peritoneal a 4,25% de glicose (Baxter,
Dianeal PD-2) e, 2 horas após da permanência da solução na cavidade peritoneal, os
animais foram anestesiados. A cavidade abdominal foi então aberta ao longo da linha
alba para coleta do líquido remanescente com seringa descartável em condições estéreis
para a dosagem da glicose e sódio. As amostras do efluente peritoneal foram
centrifugadas a 2.000 rpm por 10 minutos e armazenadas a – 20 ºC. Determinou-se o
volume de ultrafiltração (UF) subtraindo o volume drenado do volume infundido. A
concentração de glicose no efluente drenado da cavidade após 2 horas de permanência
(D2) divida pela concentração da glicose na solução infundida (D0) – razão D2/D0 – foi
utilizada como uma medida para avaliação do transporte de solutos pela MP. O gap de
sódio (Na gap), determinado subtraindo a concentração de sódio do efluente peritoneal
coletado ao fim da permanência da concentração sódio do fluido infundido, foi usado
como um marcador substituto do transporte de água livre pelo peritônio. A concentração
de glicose e sódio foi analisada utilizando o aparelho Cobas C111 analyzer (Roche,
Indianápolis, EUA).
MATERIAIS E MÉTODOS
_______________________________________________________________
45
4.11. Análise estatística
A análise estatística foi realizada para comparação de grupos utilizando para os
cálculos o software GraphPad Prism versão 5.0 (Graphpad Software, La Jolla, EUA).
Inicialmente as diversas variáveis foram testadas para normalidade e então o teste
ANOVA com pós-teste de Tukey foi aplicado. Em relação aos resultados de PCR em
tempo real, após a obtenção dos valores de cicle treshold (CT) de cada amostra
referente ao gene alvo, foi determinado a diferença de CT entre o gene constitutivo e o
gene de interesse. Após, foi realizada a normalização destes valores, sendo que para o
resultado final é calculado o logarítmo da média dos valores normalizado. O desvio
padrão foi calculado a partir dos valores normalizados de CT. Todos os resultados
foram apresentados como média ± erro padrão. A significância estatística foi
considerada a partir do p<0,05.
RESULTADOS
RESULTADOS
_______________________________________________________________
47
5. RESULTADOS
5.1. Mortalidade e evolução do peso dos animais
Não ocorreu nenhum óbito antes do dia da eutanásia em todos os grupos. Os
dados relativos ao peso dos animais durante os experimentos estão demonstrados na
Tabela 3. A administração do VPA aos animais normais (Grupo Controle+VPA) não
resultou em perda de peso ou alteração do comportamento. O grupo FP apresentou um
ganho de peso significativamente menor comparado com o grupo Controle (p<0,01). O
tratamento com VPA (grupo FP + VPA) resultou em ganho ponderal normal dos ratos.
Tabela 3. Evolução do peso dos animais
Dia 0
(g)
Dia 15
(g)
Dia 30
(g)
Δ
(g)
Controle 296 ± 4 352 ± 1 392 ± 11 96 ± 5
Controle+VPA 292 ± 3 356 ± 3 384 ± 2 91 ± 3
FP 291 ± 7 353 ± 7 347 ± 11* 56 ± 8
**
FP+VPA 295 ± 7 350 ± 1 376 ± 14† 81 ± 7††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. *p<0,05,
**p<0,01
comparado com grupo
Controle; †p<0,05,
††p<0,01
comparado com grupo FP. Δ = ganho de peso durante os
experimentos; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
RESULTADOS
_______________________________________________________________
48
5.2. O ácido valpróico preveniu a fibrose peritoneal e preservou a
função de peritoneal
Conforme Tabela 4 e Figura 11, na análise histomorfométrica das lâminas
coradas pela técnica de Tricrômio-Masson, foi observado que o peritôneo dos animais
do grupo Controle era formada por uma camada de células mesoteliais sobreposta a uma
fina camada de tecido conjuntivo, a camada submesotelial. De outro modo, a MP do
grupo FP apresentou espessamento acentuado da zona submesotelial (26,2 ± 3 µm vs
123,8 ± 18 µm, respectivamente, p<0,001). Em contraste, o tratamento com VPA
reduziu significativamente o espessamento peritoneal (38,9 ± 5 µm, p<0,001). A
espessura da MP não foi afetada pela administração de VPA no grupo Controle+VPA
(21,0 ± 5 µm) em relação ao grupo Controle.
Tabela 4. Quantificação da espessura da membrana peritoneal
Espessura
(µm)
Controle 26,2 ± 3
Controle+VPA 21,0 ± 5
FP 123,8 ± 18***
FP+VPA 38,9 ± 5†††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. ***
p<0,001 comparado ao grupo
Controle; †††
p<0,001 comparado ao grupo FP. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
RESULTADOS
_______________________________________________________________
49
Controle FP VPA
0
50
100
150***
†††
Es
pe
ss
ura
Pe
rito
ne
al
( m
)
Figura 11. Efeito do VPA no espessamento da membrana peritoneal. (A-C) Fotomicrografias
representativas de amostras de peritôneo parietal corado com Tricrômio de Masson (x200). (A)
Secção da parede abdominal anterior de uma rato normal demonstrando uma fina camada
submesotelial. (B) A membrana peritoneal do Grupo FP demonstrando espessamento
importante da camada submesotelial. (C) Tratamento com VPA impediu a progressão do
espessamento peritoneal. (D) Análise da quantificação do efeito do VPA sobre o espessamento
peritoneal. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
Para avaliar se a preservação estrutural da MP pelo tratamento com VPA se
traduziu na preservação da função peritoneal, foram analisadas a ultrafiltração (UF), a
relação de glicose D2/D0 e o transporte de água livre no peritônio (Na gap). A função
peritoneal foi significativamente afetada no grupo FP demonstrado pelos valores de UF,
D2/D0 e Na gap significativamente menores do que nos animais do grupo Controle
(p<0,001). O tratamento com VPA manteve esses parâmetros no grupo FP+VPA
semelhantes aos do grupo Controle. A função peritoneal não foi afetada no grupo
Controle+VPA (Tabela 5).
Controle FP FP+VPA
A B C
*** p<0,001 vs Controle †††
p<0,001 vs FP
D
RESULTADOS
_______________________________________________________________
50
Tabela 5. Análise da função da membrana peritoneal
UF
(mL)
D2/D0
Na gap
(meq/L)
Controle 15,9 ± 3 0,18 ± 0,01 9,8 ± 0,7
Controle+VPA 15,2 ± 1 0,2 ± 0,01 10 ± 0,6
FP -1,0 ± 1***
0,11 ± 0,02***
1,8 ± 2,1**
FP+VPA 11,2 ± 2†††
0,21 ± 0,01†††
9,4 ± 0,5†††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. **
p<0,01, ***
p<0,001 comparado ao
grupo Controle; †††
p<0,001 comparado ao grupo FP. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido
valpróico; UF = volume de ultrafiltrado; D2/D0 = razão entre a concentração de glicose no
efluente peritoneal após 2 horas de permanência na cavidade peritoneal pela concentração da
glicose inicial; Na gap = redução da concentração do sódio no efluente peritoneal após 2 horas
de permanência na cavidade peritoneal em relação à concentração do sódio inicial.
5.3. O VPA atenuou o aumento da expressão de fatores pró-fibróticos e
miofibroblastos no peritôneo
A expressão de marcadores pró-fibróticos, tais como fibronectina, TGF-ß e
proteína-1 específica de fibroblastos (FSP-1) foi analisada no peritônio por meio de
qPCR. A expressão do mRNA destes genes foi significativamente aumentada no grupo
FP quando comparada com os controles normais (p<0,001). O tratamento com VPA
reduziu significativamente a expressão de todos eles para níveis iguais aos dos animais
controle (Figura 12, Tabela 6). Por outro lado, verificou-se que a expressão de BMP-7,
um fator antifibrótico que neutraliza a ação do TGF-β, foi significativamente maior no
grupo FP+VPA comparado ao grupo FP (p<0,05, Figura 12, Tabela 6). Em paralelo ao
comportamento observado pela BMP-7, observamos uma maior expressão do mRNA da
Smad 5, uma das Smads mediadoras do sinal intracelular de ativação dos receptores de
RESULTADOS
_______________________________________________________________
51
BMP, no grupo FP+VPA em relação ao FP (expressão relativa Grupo FP 0,5 ± 0,2 vs
1,6 ± 0,1; p<0,01).
Tabela 6. Expressão gênica de fatores pró-fibróticos e BMP-7 no peritôneo.
TGF-β
Fibronectina FSP-1
BMP-7
Controle 1 ± 0,2 1 ± 0,2 1 ± 0,2 1,0 ± 0,1
FP 2,2 ± 0,1
*** 3,1 ± 0,2
*** 2,2 ± 0,1
** 0,3 ± 0,5
FP+VPA 1,1 ± 0,2
††† 1,0 ± 0,2
††† 1,3 ± 0,2
†† 1,0 ± 0,2
†
Dados apresentados como média ± erro médio padrão. **
p<0,01, ***
p<0,001 comparado com
o grupo Controle; †p<0,05,
††p<0,01,
†††p<0,001 comparado com o grupo FP. BMP-7 =
Bone Morphogenic Protein; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico; TGF =
Transforming Growth Factor; FSP = Fibroblast Specific Protein.
RESULTADOS
_______________________________________________________________
52
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
†††
***
TG
F-
(exp
ressã
o r
ela
tiva
)
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
†††
***
Fib
ron
ecti
na
(exp
ressã
o r
ela
tiva
)
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
††
**
FS
P-1
(exp
ressã
o r
ela
tiva
)
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
†
BM
P-7
(exp
ressã
o r
ela
tiva
)
Figura 12. Expressão de genes pró-fibróticos e BMP-7 no peritôneo. O tratamento com VPA
impediu o aumento da expressão de genes pró-fibróticos observado no grupo FP e aumentou a
expressão de BMP-7. Dados apresentados como média ± erro médio padrão. BMP-7 = Bone
morphogenic protein; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico; TGF = Transforming
Growth Factor; FSP = Fibroblast Specific Protein.
** p<0,01 vs Controle
*** p<0,001 vs Controle † p<0,05 vs FP †† p<0,01 vs FP ††† p<0,001 vs FP
RESULTADOS
_______________________________________________________________
53
A expressão de α-SMA, que é um marcador de miofibroblastos, foi avaliada por
imuno-histoquímica. No grupo Controle, poucas células positivas para α-SMA foram
observadas no peritôneo. O grupo FP apresentou um siginificativo aumento da
expressão de α-SMA. O tratmento com VPA reduziu significativamente a área marcada
para α-SMA de 4,2 ± 0,4% no grupo FP para 0,8 ± 0,1% no grupo VPA (p<0,001;
Tabela 7; Figura 13).
Tabela 7. Quantificação da expressão de miofibroblastos (α-SMA) no peritôneo
α-SMA
(% área)
Controle 0 ± 0
FP 4,2 ± 0,4**
FP+VPA 0,8 ± 0,1††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. **
p<0,01 comparado com grupo
Controle; ††
p<0,01 comparado com grupo FP. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico;
SMA = actina de músculo liso.
RESULTADOS
_______________________________________________________________
54
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
**
††
Exp
ressão
de
-SM
A(á
rea
em
%)
Figura 13. Efeito do VPA na expressão de miofibroblastos na membrana peritoneal. (A-C)
Fotomicrografias representativas da imuno-histoquímica para α-SMA no peritôneo parietal
(x200). (A) Ratos do grupo Controle com poucas células positivas. (B) Grupo FP demonstrando
acúmulo de miofibroblastos (coloração vermelha) na membrana peritoneal. (C) Redução da
expressão de α-SMA nos animais tratados com VPA. (D) Análise da quantificação do efeito do
VPA na expressão de α-SMA (% da área). Dados apresentados como média ± erro padrão
médio. SMA = actina do músculo liso; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
5.4. O VPA protegeu contra a fibrose peritoneal interferindo na via
TGF-β/Smad
As Smad3 e Smad7 são mediadores intracelulares críticos envolvidos na
sinalização de TGF-β. Enquanto que a fosforilação intracelular de Smad3 conduz à
transcrição de genes pró-fibróticos, a regulação positiva de Smad7antagoniza a
sinalização de TGFβ/Smad. A expressão peritoneal de Smad3 fosforilada (pSmad3)
detectada por imuno-histoquímica e Smad3 mRNA foi significativamente maior no
Controle FP FP+VPA
A B C
** p<0,01 vs Controle ††
p<0,01 vs FP
D
RESULTADOS
_______________________________________________________________
55
grupo FP em comparação com o grupo Controle. Contudo, o tratamento com VPA
reduziu significativamente o número de células positivas para pSmad3 e a sua
expressão gênica na MP (Figura 14, Tabela 8).
Controle FP VPA0
50
100
150
***
†††
pS
mad
3(c
élu
las/m
m2)
Figura 14. Efeito do VPA na expressão peritoneal de Smad3 fosforilada (pSmad3) e
mRNA Smad3. (A-C) Fotomicrografias representativas da imuno-histoquímica para pSmad3
no peritôneo parietal (x200). (A) Somente algumas poucas células positivas foram observadas
na membrana peritoneal do grupo Controle. (B) Grupo FP com aumento importante de células
marcadas para pSmad3 (coloração marrom) infiltrando o peritôneo. (C) Expressão de pSmad3
significativamente reduzida pelo tratamento com VPA. (D-E) Análise da quantificação do efeito
do VPA na expressão de células positivas para pSmad3 (D) e mRNA do Smad3 (E). Dados
apresentados como média ± erro médio padrão. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
Controle FP FP+VPA
A B C
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
†
*
Sm
ad
3(e
xpre
ssã
o r
ela
tiva
)
* p<0,05 vs Controle
*** p<0,001 vs Controle †
p<0,05 vs FP †††
p<0,001 vs FP
RESULTADOS
_______________________________________________________________
56
Tabela 8. Expressão gênica da Smad3 e quantificação das células positivas para Smad3
fosforilada no peritôneo.
Smad3 mRNA
(expressão relativa)
pSmad3
(células/mm2)
Controle 1,0 ± 0,1 30,1 ± 5
FP 2,3 ± 0,5* 118 ± 17***
FP+VPA 1,0 ± 0,2† 34 ± 7†††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. *p<0,05,
***p<0,001 comparado ao grupo
Controle; †p<0,05,
†††p<0,001 comparado ao grupo FP. FP = fibrose peritoneal; pSmad3 =
Smad3 fosforilada; VPA = Ácido valpróico.
Por outro lado, os animais tratados com VPA demonstraram uma expressão de
Smad7 aumentada, detectada por imunofluorescência e PCR (Tabela 9 e Figura 15). No
grupo Controle e no grupo FP apenas algumas células Smad7+ foram detectadas (3,9 ±
2,8% e 19,8 ± 3,6%, respectivamente). No entanto, a proporção de células Smad7+ em
relação a todas as células coradas pelo DAPI na membrana peritoneal dos ratos tratados
com VPA foi significativamente aumentada (56,2 ± 3,4%, p <0,001). Paralelamente, os
níveis do mRNA de Smad7 foram mas significativamente aumentados no grupo
FP+VPA em comparação ao grupo FP (Tabela 9, Figura 15).
RESULTADOS
_______________________________________________________________
57
Tabela 9. Expressão gênica e proporção de células marcadas para Smad7 no peritôneo.
Smad7 mRNA
(expressão relativa)
Smad7+
(%)
Controle 1,0 ± 0,1 3,9 ± 2,8
FP 0,2 ± 0,2*** 19,8 ± 3,6***
FP+VPA 1,7 ± 0,2††† 56,2 ± 3,4†††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. ***
p<0,001 comparado ao grupo
Controle; †††
p<0,001 comparado ao grupo FP. FP = fibrose peritoneal; Smad7+ = células
positivas para Smad7; VPA = ácido valpróico.
RESULTADOS
_______________________________________________________________
58
Controle FP FP+VPA
0
20
40
60
80
100
***
***
†††
Sm
ad
7(%
cé
lula
s p
osit
iva
s)
Figura 15. Expressão de Smad7 na membrana peritoneal. (A-I) Fotomicrografias
representativas da imunofluorescência para células Smad7+ (coradas em verde) e células DAPI
+
(coradas em azul) na membrana peritoneal (x400). Quase nenhuma expressão de Smad7 foi
detectada no grupo Controle (A) e somente algumas células Smad7+ foram observadas no grupo
FP (B). (C) No grupo FP+VPA, mais da metade das células na membrane peritoneal
apresentaram positividade para Smad7 (setas brancas). (J) Quantificação das células Smad7+ em
relação a todas as células DAPI+ na membrane peritoneal. (L) Efeito do VPA na expressão do
mRNA da Smad7 por qPCR. Dados apresentados como média ± erro médio padrão. FP =
fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
Controle FP
Dapi
Smad 7
Smad 7/Dapi Smad 7/Dapi Smad 7/Dapi
Smad 7 Smad 7
Dapi Dapi
FP+VPA
A B C
D E F
G H I
J L *** p<0,001 vs Controle †††
p<0,001 vs FP
Controle FP VPA0
1
2
3
4
5
†††
***
***Sm
ad
7(e
xp
ressã
o r
ela
tiva
)
RESULTADOS
_______________________________________________________________
59
5.5. O VPA reduziu a inflamação e neoangiogênese na membrana
peritoneal
5.5.1. Inflamação
Para analisar os possíveis efeitos anti-inflamatórios do VPA na membrana
peritoneal, os macrófagos foram analisados por imuno-histoquímica e as citoquinas pró-
inflamatórias e quimiocinas foram analisados por qPCR e Multiplex. No peritônio do
grupo FP, o número de macrófagos (células ED1+, Tabela 10, Figura 16) e a
concentração de fatores quimiotáticos para macrófagos MCP-1 e MIP-2 (Tabela 11,
Figura 17), aumentaram em relação ao grupo controle. Foi observada uma tendência não
significativa de redução no número de macrófagos na membrana peritoneal dos animais
do grupo FP+VPA em relação ao FP. Entretanto, os níveis aumentados de MCP-1 e
MIP-2 observados no grupo FP foram significativamente reduzidos pela administração
de VPA (Tabela 11, Figura 17). De forma semelhante, os animais tratados com VPA
demonstratam uma expressão significativamente menor da proteína (Tabela 11) e do
mRNA (Tabela 12) do TNF-α no tecido peritoneal quando comparados com o grupo FP
(Figura 18). Apesar da atenuação da expressão do mRNA da IL-1β observada no grupo
FP+VPA em relação ao FP (Tabela 12), não houve diferença estatística na concentração
dessa interleucina entre os dois grupos quando avaliada pelo Multiplex. Também na
análise por Multiplex não foi possível demonstrar diferença estatísticamente signficativa
entre os grupos com relação às concentrações de IL-6 no peritôneo (Controle = 78 ± 20,
FP = 692 ± 282, FP+VPA = 158 ± 80 pg/mg de proteína).
RESULTADOS
_______________________________________________________________
60
Tabela 10. Quantificação dos macrófagos e densidade capilar na membrana peritoneal.
ED1+
(células/mm2)
Densidade capilar
(vasos/mm2)
Controle 133 ± 90 12,5 ± 10
FP 826 ± 375** 671 ± 63***
FP+VPA 443 ± 222 120 ± 49†††
Dados apresentados como média ± erro padrão médio. **
p<0,01, ***
p<0,001 comparado ao
grupo Controle; †††
p<0,001 comparado ao grupo FP. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido
valpróico; ED1+ = macrófagos.
Tabela 11. Análise da concentração de quimiocinas de macrófagos e citocinas pró-
inflamatórias no tecido peritoneal.
MCP-1
(pg/mg)
MIP-2
(pg/mg)
TNF-α
(pg/mg)
IL1-β
(pg/mg)
Controle 13,5 ± 2,5 23 ± 10 3,8 ± 0,6 10,4 ± 3
FP 158 ± 45* 774 ± 319 71 ± 23* 255,5 ± 124
FP+VPA 11 ± 2,5† 31 ± 10† 3,9 ± 0,8† 6,5 ± 0,7
Dados apresentados como média ± erro médio padrão. *p<0,05 comparado ao grupo Controle;
†p<0,05 comparado ao grupo FP. MIP-2 = Macrophage inflamatory protein-2; MCP-1 =
Monocyte Chemoattractant Protein-1; TNF = Tumoral necrosis factor; FP = fibrose peritoneal;
VPA = ácido valpróico.
RESULTADOS
_______________________________________________________________
61
Controle FP FP+VPA0
250
500
750
1000
1250
1500
**
Macró
fag
os
(célu
las/m
m2)
Figura 16. Infiltração da membrana peritoneal por macrófagos. (A-C) Fotomicrografias
representativas da imuno-histoquímica para macrófagos (x200). Comparado com grupo
Controle (A), o grupo FP apresentou um aumento do número de macrófagos (células com
coloração vermelha) infiltrando a membrana peritoneal (B). A expressão de macrófagos foi
reduzida pelo tratamento com VPA de maneira não significativa (C). (D) Quantificação do
número macrófagos na membrana peritoneal. Dados apresentados como média ± erro médio
padrão. FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico.
Controle FP FP+VPA
A B C
D ** p<0,01 vs Controle
RESULTADOS
_______________________________________________________________
62
Figura 17. Concentração de fatores quimiotáticos para macrófagos no peritôneo. Dados
apresentados como média ± erro médio padrão. MIP-2 = Macrophage inflammatory protein-2;
MCP-1 = Monocyte Chemoattractant Protein-1; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido
valpróico.
Tabela 12. Expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias.
TNF-α
(expressão relativa)
IL-1β
(expressão relativa)
Controle 1 ± 0,4 1 ± 0,4
FP 2,6 ± 0,4* 3,8 ± 0,6*
FP+VPA 0,9 ± 0,3† 2,1 ± 0,2†
Dados apresentados como média ± erro médio padrão. TNF = Tumoral necrosis factor; IL =
interleucina; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico. *p<0,05 comparado com o
grupo Controle; †p<0,05 comparado com o grupo FP.
Controle FP FP+VPA0
50
100
150
200
250
*
†
MC
P-1
(pg/m
g p
rote
ína)
Controle FP FP+VPA0
500
1000
1500
†
MIP
-2(p
g/m
g p
rote
ína)
* p<0,05 vs Controle † p<0,05 vs FP
RESULTADOS
_______________________________________________________________
63
Controle FP FP+VPA0
1
2
3
4
5
†
*
TN
F-
(exp
ressã
o r
ela
tiva
)
Controle FP FP+VPA0
20
40
60
80
100*
†
TN
F-
(pg
/mg p
rote
ína
)
Controle FP FP+VPA0
1
2
3
4
5
†
*
IL -
1
(exp
ressã
o r
ela
tiva
)
Controle FP FP+VPA
0
100
200
300
400
IL -
1
(pg
/mg
pro
teín
a)
Figura 18. Expressão gênica e concentração das citocinas pró-inflamatórias na membrana
peritoneal. Dados apresentados como média ± erro médio padrão. FP = grupo fibrose peritoneal;
TNF = tumoral necrosis factos; VPA = grupo ácido valpróico; TNF = tumoral necrosis factor.
* p<0,05 vs Controle †
p<0,05 vs FP
RESULTADOS
_______________________________________________________________
64
5.5.2. Neoangiogênese
O VPA também apresentou efeito antiangiogênico. No grupo FP observamos um
aumento da densidade capilar da membrana peritoneal em relação aos outros dois
grupos. O tratamento com VPA foi capaz de atenuar significativamente a
neoangiogênse peritoneal induzida pelo GC (Tabela 10, Figura 19). Os resultados para a
expressão gênica do VEGF acompanharam os encontrados para densidade vascular
(Figura 19E, Tabela 13).
Controle FP FP+VPA0
200
400
600
800
**
†††
***
Den
sid
ad
e c
ap
ilar
(vasos/m
m2)
Figura 19. Densidade capilar e expressão gênica do VEGF na membrana peritoneal. (A-C)
Fotomicrografias representativas da imunofluorescência para Isolectina-B4 (corada em
vermelho), um marcador de endotélio, e células DAPI+ (coradas em azul) na membrana
peritoneal (x400). Enquanto praticamente nenhum vaso foi identificado no grupo de Controle
(A), observou-se uma neoangiogênese intensa (setas brancas) na zona submesotelial no grupo
FP (B). (C) O tratamento com VPA atenuou a neoformação vascular. (D) Quantificação da
densidade capilar na membrana peritoenal. (E) Expressão do mRNA do VEGF no tecido
peritoneal por qPCR. Dados apresentados como média ± erro médio padrão. FP = fibrose
peritoneal; VPA: ácido valpróico; VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor.
Controle FP FP+VPA
A B C
** p<0,01 vs Controle
*** p<0,001 vs Controle †† p<0,01 vs FP ††† p<0,001 vs FP
Controle FP FP+VPA0
1
2
3
4
5
††
**
**
VE
GF
(expre
ssão r
ela
tiva)
RESULTADOS
_______________________________________________________________
65
Tabela 13. Expressão gênica do mRNA do VEGF.
VEGF
(expressão relativa)
Controle 1 ± 0,3
FP 4 ± 0,7**
FP+VPA 2,2 ± 0,5** ††
Dados apresentados como média ± erro médio padrão. VEGF = Vascular endothelial growth
factor; FP = fibrose peritoneal; VPA = ácido valpróico. **
p<0,01 comparado com o grupo
Controle; ††
p<0,01 comparado com o grupo FP.
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
67
6. DISCUSSÃO
Neste trabalho, a administração de ácido valpróico preveniu a progressão da
fibrose peritoneal induzida por gluconato de clorexedine em ratos. O tratamento com
VPA preservou a função peritoneal, reduziu o espessamento da camada submesotelial,
limitou a infiltração por miofibroblastos e atenuou o aumento da expressão dos fatores
pró-fibróticos. Esses achados estão de acordo com outros trabalhos que demonstraram o
efeito antifibrótico do VPA e outros inibidores das HDACs (56, 70, 78). Por exemplo, o
tratamento de ratos diabéticos com VPA 300 mg/kg por via oral por um período de 8
semanas consecutivas impediu a fibrose renal, reduzindo a expressão de TGF-β1, α-
SMA e fibronectina renal (76). Além disso, Io e cols. demonstraram o efeito protetor
do SAHA, um inibidor das HDACs, na progressão da fibrose peritoneal em
camundongos (59). O VPA é um inibidor das HDACs atrativo pois já vem sendo
utilizado na prática clínica há décadas e é facilmente obtido no mercado. O presente
estudo foi o primeiro a demonstrar o efeito antifibrótico do ácido valpróico na fibrose
peritoneal.
A exposição prolongada às soluções não-fisiológicas de DP induz
neoangiogênese resultando no aumento da área de superfície vascular da membrana
peritoneal, e consequentemente, no aumento da velocidade de absorção de glicose pela
MP. A dissipação precoce do gradiente osmótico de glicose leva por fim à falha de
ultrafiltração (79). O transporte peritoneal de glicose (Dt\D0) tem sido utilizado
classicamente no teste de equilíbrio peritoneal para monitorização da função da
membrana peritoneal de pacientes em diálise. A relação é calculada dividindo-se a
concentração de glicose do efluente peritoneal pela concentração da glicose na solução
de DP infundida. Uma relação Dt\D0 baixa indica uma elevada permeabilidade à
DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
68
glicose. O grupo FP apresentou valores mais baixos de D2\D0, indicando um transporte
de glicose mais rápido pela membrana peritoneal. Nos animais tratados com VPA o
aumento do transporte de glicose foi evitada, provavelmente devido ao fato do VPA ter
bloqueado a neoangiogênse. Além da área de superfície capilar, a distância para difusão
entre a solução de DP intraperitoenal e o lúmen capilar também influencia as
características de transporte da MP. Um aumento da densidade e da estrutura do
colágeno no interstício peritoneal tem sido sugerido como uma barreira restritiva ao
transporte de água livre que não depende do transporte de solutos (79). O processo de
ultrafiltração peritoneal na primeira hora após a infusão do dialisato na cavidade
peritoneal se dá principalmente através de ultraporos que permitem a passagem de água
livre somente, levando a uma redução da concentração sódio intraperitoneal. O sieving
de sódio, que é a queda na concentração intraperitoneal de sódio nas primeiras horas da
permanência com solução hipertônica, é utilizado para monitorizar o transporte de água
livre através da MP. A ausência dessa queda inicial da concentração de sódio no
dialisato intraperitoneal, indica redução da condutância osmótica, e tem sido sugerido
como um marcador de fibrose peritoneal. Em alguns estudos, o sieving de sódio, foi
apontado como o principal preditor da ocorrência de peritonite esclerosante, mais
importante até que o alto transporte da MP (27). Nesta tese, diferentemente dos grupos
FP+VPA e Controle, foi observada uma menor redução do sódio (Na Gap, Tabela 1) no
efluente peritoneal, refletindo menor transporte de água livre, no grupo FP. Portanto, a
perda da capacidade de ultrafiltração no grupo FP pode ser explicado como decorrente
tanto do aumento do transporte de glicose e dissipação do gradiente osmótico em
virtude do aumento da vasculatização da MP, bem como secundário ao aumento da
resistência ao transporte de água imposto pelo espessamento fibroso da camada
submesotelial da MP. Ambos fatores foram melhorados com a administração de VPA.
DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
69
Embora o potencial antifibrótico e anti-inflamatório do VPA e outros inibidores
de HDACs esteja estabelecido na literatura (57, 68, 71, 76), os mecanismos subjacentes
a essas ações ainda não estão determinados. O espessamento fibroso da MP e a
expressão de α-actina, um marcador para miofibroblastos, foram reduzidos pelo
tratamento com VPA em comparação com os animais que somente receberam injeções
intraperitoneais de GC. A administração de VPA também resultou no bloqueio da up-
regulation de fatores pró-fibróticos, notadamente do TGF-β e fibronectina. De maneira
similar, Van Beneden e cols demonstraram que o efeito antifibrótico do VPA na
nefropatia induzida pela adriamicina resultou da redução da expressão do TGF-β e α-
actina (56, 70). Além disso, a Tricostatina A, um outro inibidor das HDACs, suprimiu a
EMT induzida pelo TGF-β em cultura de células epiteliais renais humanas (58).
Embora, o papel da transição epitélio-mesenquimal na fibrose peritoneal tenha sido
recentemente questionado (37), o efeito inibidor do VPA sobre a EMT, demonstrado
pela redução da expressão de α-actina no grupo FP+VPA, pode ser responsável em
parte por seu efeito antifibrótico. Além do efeito supressor da expressão de fatores pró-
fibróticos, o VPA induziu um aumento na expressão do mRNA da BMP-7 e da Smad5
no grupo FP+VPA. A BMP-7 contraregula a ação do TGF-β1 e essa inibição é mediada
pela fosforilação das Smads 1/5/8 (80). Estados pró-fibróticos são caracterizados por
silenciamento gênico e repressão da expressão do BMP-7 (81). Sendo assim, o VPA ao
inibir as HDACs poderia estar facilitando a expressão do BMP-7 pela descompactação
da cromatina. Corroborando nossos resultados, Io e cols. demonstraram que um inibidor
das HDACs (SAHA) induziu uma maior expressão do BMP-7 e preveniu a FP
experimental em camundongos (59).
A via de sinalização do TGF/Smad tem um papel central na fisiopatologia da
fibrose peritoneal. A transferência do gene TGF-β1 através de adenovirus para as
DISCUSSÃO
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70
células mesoteliais peritoneais induz aumento de matriz extracelular e infiltração por
fibroblastos, demonstrando a capacidade do TGF-β isoladamente induzir FP (41). A
fosforilação da Smad3 é uma das características marcantes da ativação do receptor de
TGF-β (43). Duan e cols. demonstraram a importância da Smad3 na patogênese da FP
ao verificar que camungos knockout para Smad3 não desenvolvem FP quando expostos
à soluções de DP (42). No presente estudo, o bloqueio da via TGF-β/Smad foi
evidenciado pela menor expressão do mRNA do TGF-β e da Smad3, bem como pelo
menor número de células marcadas para Smad3 fosforilada na imuno-histoquímica, no
grupo FP+VPA em relação ao grupo FP.
A ação do TGF-β induz o aumento da Smad7, que por sua vez inibe a
fosforilação da Smad3, antagonizando as ações do TGF-β numa alça de feedback
negativo (44). Guo Hong et al. demonstraram que em ratos cujas células mesoteliais
foram transfectados com gene da Smad7 e, portanto, hiperexpressavam essa proteína, a
fibrose peritoneal induzida por solução de diálise foi bloqueada e a ativação da Smad3
inibida (44). O tratamento com VPA induziu uma maior expressão gênica da Smad7 no
grupo FP+VPA comparado ao grupo FP. Além disso, foi detectado por
imunofluorescência um número maior de células positivas para Smad7 no peritôneo dos
animais tratados com VPA. A degradação da Smad 7 é regulada por um balanço entre
acetilação, desacetilação e ubiquitinação. A acetilação da Smad7 impede a sua
ubiquitinização e degradação (82). A Smad7 interage com as HDACs sendo
desacetilada por essas enzimas, facilitando a sua degradação (61, 83). Ao inibir as
HDACs, o VPA pode ter mantido a Smad7 acetilada, protegendo-a contra degradação e
aumentando a sua ação inibitória sobre o TGF-β (Figura 20).
DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
71
Figura 20. Possível efeito do VPA sobre a degradação da Smad7. A inibição das HDACs pelo
ácido valpróico impede a desacetilação e degradação da Smad7, favorecendo a inibição da
fosforilação da Smad3 diante do estímulo do TGF-β e bloqueio do processo de fibrogênese. Ac
= radical acetil; HDAC = histona desacetilase; TGF = Transforming growth factor; VPA =
ácido valpróico.
Existe crescente evidência sobre o efeito anti-inflamatório do VPA (63). Uma
tendência de redução no número de macrófagos infiltrando a MP acompanhado de uma
redução significativa na concentração das quimiocinas para macrófagos foi observado
no grupo FP+VPA comparado ao grupo FP. Através de mecanismos ainda não
determinados, o VPA reduziu a expressão de MCP-1 e a infiltração por macrófagos em
diferentes modelos experimentais (70, 84). Em um estudo prévio do nosso laboratório, a
administração do VPA preveniu a lesão renal aguda isquêmica em ratos através de
mecanismos anti-inflamatórios como inibição da expressão do TNF-α, MCP-1 e
infiltração por macrófagos no tecido renal (72). Portanto, a inibição do MCP-1 e MIP-2
pelo VPA pode ter atenuado a infiltração macrofágica e inflamação da MP. Além disso,
o tratamento com VPA impediu o aumento dos níveis de TNF-α e IL-1β induzidos pelo
GC no peritôneo. A ação do VPA e outros inibidores das HDACs como inibidor das
citocinas anti-inflamatórias já foi previamente demonstrada. Por exemplo, o VPA inibe
Ac
HDAC
VPA
DEGRADAÇÃO
DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
72
a produção TNF-α por macrófagos estimulados com lipopolissacáride (85). Além disso,
em um modelo de artrite reumatóide experimental, a Tricostatina A inibiu a expressão
do TNF-α e reduziu a translocação nuclear NF-kB (62). Portanto, a inibição da
produção do TNF-α pelo VPA pode ter contribuído para o efeito anti-inflamatório
observado no presente estudo.
No grupo FP, as injeções de GC induziram um signficativo aumento da
vascularização peritoneal e expressão do mRNA do VEGF e ambas alterações foram
atenuadas no grupo tratado com VPA. Esse efeito pode em parte explicar a preservação
do transporte de glucose (D2/D0) e da capacidade de UF no grupo FP+VPA, uma vez
que são dependentes da área vascular efetiva peritoneal. Como a neoangiogênese está
intimamente relacionada inflamação, o bloqueio da neoangigênse podem ser decorrente
do efeito anti-inflamatório do VPA. No entanto, um efeito direto do VPA na ação do
VEGF não pode ser descartado. Trabalhos prévios demonstraram que os inbidores das
HDAC em geral possuem efeito antiangiogênico em diversas linhagens de células
tumorais. Por exemplo, o VPA foi capaz de bloquear a expressão gênica e proteica do
VEGF em células leucêmicas transplantadas em ratos, prevenindo a neoangiogênse e o
crescimento tumoral (86). Além disso, o VPA reduz a meia vida dos receptores do
VEGF (VEGFR-2) em células endoteliais (87). Como a fibrose peritoneal e a
neoangiogênese estão intimamente relacionadas (24), terapias que reduzam a atividade
do VEGF são promissoras.
DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
73
Quadro 1. Resumo dos mecanismos de ação do ácido valpróico na prevenção da
fibrose peritoneal experimental.
Antifibrótico
Redução da expressão de TGF-β e fibronectina
Redução da expressão de Smad3 fosforilada
Redução da expressão de miofibroblastos
Aumento da expressão de BMP-7 e Smad7
Anti-inflamatório
Redução da expressão de fatores quimiotáticos para macrófagos
Redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β)
Antiangiogênico
Redução da expressão de VEGF
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
_______________________________________________________________
75
7. CONCLUSÃO
Concluindo, a administração do ácido valpróico concomitantemente à indução
de injúria peritoneal inibiu a progressão para fibrose peritoneal em um modelo
experimental em ratos. O VPA inibiu diferentes mecanismos envolvidos nas alterações
funcionais e morfológicas da membrana peritoneal induzidas pelo GC. O VPA inibiu a
inflamação por reduzir a expressão de citocinas e quimiocinas, atenuou a angiogênese
reduzindo a expressão do VEGF e preveniu a fibrose modulando a atividade da via
TGF-β/Smad. No que diz respeito à esse último mecanismo, o VPA atenuou a
expressão do TGF-β e a fosforilação da Smad3. Notadamente, o VPA tanto por
modificações da expressão gênica quanto por regulação pós traducional da atividade
protéica, induziu um aumento da expressão de BMP-7 e Smad7, ambos relevantes
fatores antifibróticos e reguladores negativos da sinalização do TGF-β. Os resultados
apresentados nesse trabalho apontam para mecanismos envolvidos no dano à MP
associado à DP ainda pouco explorados e que podem constiuir novos alvos terapêuticos.
Entretanto, esse é um estudo experimental exploratório e outros estudos são necessários
para que os resultados sejam transportados para a prática clínica.
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