UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCODEPARTAMENTO DE AGRONOMIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS

DIVERSIDADE GENÉTICA E FENOTÍPICA DE ACESSOS DE SABIÁ QUANTO À FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

Mestrando: Paulo Geovani Silva MartinsOrientador: Prof. Dr. Mario de Andrade Lira Junior

Co-orientador: Prof. Dr. Márcio Vieira da CunhaCo-orientadora: Dra. Maria do Carmo Catanho P. de Lyra

ROTEIRO DA APRESENTAÇÃO

����Introdução

����Objetivo Geral

����Objetivos Específicos

����Metodologia����Metodologia

����Principias Contribuições

����Cronograma de Atividades

����Orçamento

INTRODUÇÃO

����Satisfaz necessidades humanas

����Melhoria ou manutenção da qualidade ambiental

Agropecuária sustentável

����Utilização eficiente dos recursos

����Viabilidade econômica

����Qualidade da vida

Aptidão Agroecológica

Pastagens Naturais30%

Aptidão Agroecológica brasileira

INTRODUÇÃO

Fonte: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

Pastagens Naturais

Florestas e bosques

Pastagens Cultivadas

Outras áreas

30%

22%18%

�Maior intensificação da pecuária

Mata Atlântica brasileira

INTRODUÇÃO

Fonte: Fundação SOS Mata Atlântica

�Áreas de pecuária agricultura

�Baixa fertilidade natural dos solos

� Declínio dos pastos ocasionado pela deficiências de Nitrogênio (N) eFósforo (P) (BODDEY et al, 2004)

�Perdas de N no sistema solo / planta / animal são elevadas

�Perdas de P podem ser consideradas pequenas

INTRODUÇÃO

�As leguminosas surge como uma alternativa devido à fixação de N2atmosférico

�Poucos casos de sucesso relatados em pastagens tropicais(SHELTON et al, 2005)

�Sucesso relatados no Acre - Arachis pintoi e Pueraria

phaseoloides (VALENTIM e ANDRADE, 2005)

�Espécies arbustivo-arbórea em sistema silvo-pastoril

Gado Pastagem

Árvores

INTRODUÇÃO

Árvores

Benefícios:

�Melhoria do ambiente para os animais

�Aumento da produtividade por área

�Diversificação da renda

Área

Sucesso = Escolha acertada das espécies

As melhores opções são:�Espécies do gênero Sesbania

�Leucena (Leucaena leucocephala)

�Gliricidia (Gliricidia sepium)

INTRODUÇÃO

�Gliricidia (Gliricidia sepium)

Sabiá (Mimosa caesalpiniifolia)

�Leguminosas arbustivas

�Distribuição geográfica: Maranhão até Pernambuco

�Nativa da região Nordeste

Divisão: Magnoliophyta (Angiospermae)Classe: Magnoliopsida (Dicotyledoneae)Ordem: FabalesFamília: Mimosaceae (Leguminosae:Mimosoideae)Gênero: Mimosa

Classificação Taxonômica

INTRODUÇÃO

Foto: Paulo E. R. Carvalho

Gênero: Mimosa

Espécie: Mimosa caesalpiniifolia Benth.

Fotos: Marcos Antônio Drumond

�Cerca viva;

�Proteção e delimitação de pomares;

�Alimentação para o gado (folhas);

�A madeira é usada na produção de estacas

�Utilização

INTRODUÇÃO

�A madeira é usada na produção de estacas

�Espécie pioneira

�Utilizada para recomposição de área degradada

Rápido crescimento - associação simbiótica com grupo dosrizóbios – enriquecimento do sistema em N

Fixação N - rizóbio/leguminosas

�A associação das bactérias com as raízes formam os nódulos

�Reconhecimento e adesão

�Resultado de complexas interações bioquímicas, metabólicas efísicas entre a planta hospedeira e o microssimbionte

INTRODUÇÃO

�Reconhecimento e adesão

�Enrugamento do pêlo

(“bastão de pastor”)

�Formação do nódulo

Fonte: Nitragin Argentina

Soja

INTRODUÇÃO

Foto: Portal do Agronegócio

Feijão-caupi

Foto: Stephen Temple (New Mexico State University)

�A eficiência da simbiose pode ser afetada

Variações genotípicas dos simbiontes

�Diferenças significativas entre estirpes de R. meliloti e cultivares dealfafa em sua capacidade de fixar N (GIBSON, 1962)

INTRODUÇÃO

alfafa em sua capacidade de fixar N2 (GIBSON, 1962)

�Seetin e Barnes (1977) – Descreveram diferenças na nodulaçãoentre alfafa e inoculantes, concluindo que a capacidade da simbiosepara fixar N2 foi afetada pelo genótipo da planta

�Incompatibilidades foram relatadas em ervilhas por Laguerre et al(2003) e em soja Hungria et al (2006)

Verificar se há efeito de local de origem nacompatibilidade entre acessos de sabiá e estirpes

OBJETIVO GERAL

compatibilidade entre acessos de sabiá e estirpesrizobianas

�Avaliar variabilidade genética e fenotípica de estirpes rizobianasisoladas de sabiá em cinco diferentes áreas de acesso;

�Avaliar variabilidade genética de acessos de sabiá de cincodiferentes áreas de acesso;

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

diferentes áreas de acesso;

�Avaliar a compatibilidade entre acessos de sabiá e isoladosrizobianos de diferentes áreas de origem;

�Avaliar a estabilidade da fixação biológica de nitrogênio deacessos de sabiá sob diferentes fontes de N

���� Coleta

Crato (CE)

Gravatá (PE)

METODOLOGIA

Matas nativas ou naturalizadasSementes

Serra Talhada (PE)

Itambé (PE)

Mossoró (RN)

Gravatá (PE)

�De cada área

�1kg de sementes

�Solo

�Nódulos

(Conservadas em sílica-gel – refrigerador)

(Caracterização físico-química)

(Conservados em tubos com sílica-gel e sob refrigeração)

METODOLOGIA

�Nódulos (Conservados em tubos com sílica-gel e sob refrigeração)

5 cinco estirpes

Caracterização morfológica

Caracterização genética

�Velocidade de aparecimento de colônias;

�Forma;

�Cor;

�Brilho;

METODOLOGIA

�Caracterização morfológica

�Brilho;

�Superfície;

�Borda e tamanho da colônia;

�Produção e consistência de muco;

�Absorção de corantes;

�Modificação do pH do meio de cultura

� Caracterização genética das estirpes

� Fingerprinting genético utilizando o espaço intergênico (ITS)

�primers fD1 e rD1

METODOLOGIA

�Os isolados com padrões diferentes serão considerados comoestirpes diferentes

� Análises dos amplicons (RASBAND 2008)

�Cada estirpe será submetida ao sequenciamento completo do 16S

� PCR (TAURIAN et al, 2006; XU, 2006)

���� Condição de PCR

METODOLOGIA

���� Condição de PCR

�95°C por 3 min, 30 ciclos (94 °C por 1 min, 54 °C por 45 s e 72°C por 2 minutos) e alongamento final por 7 min a 72°C

�Os amplicons serão analisados em gel de agarose

���� Análise das sequências

�Comparação - GenBank

METODOLOGIA

�Alinhamento – Mega4

Estirpes não identificadas a nível de espécies serão utilizadas emoutras pesquisas com grupos de trabalho mais especializados emtaxonomia rizobiana

���� Experimento em casa de vegetação

� Folhas jovens dos acessos de sabiá serão coletadas para estudosgenéticos

� Isolamento do DNA genômico

METODOLOGIA

� Isolamento do DNA genômico

� Genotipagem por marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

� Amplificação da região ITS (Espaçador Transcrito Interno) do rDNA

primers ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990)

� Sequenciamento Embrapa – CENARGEN

���� Experimento em casa de vegetação

� Avaliação do potencial de fixação de N dos acessos de sabiá

� Vasos de Leonard;

METODOLOGIA

�Os cinco acessos de sabiá de cada localidade serão testados com 30 fontes de N;

�As cinco estirpes obtidas nas coletas, duas estirpes atualmenterecomendadas, uma estirpe considerada promissora e doistratamentos não inoculados

� Será utilizada a solução nutritiva de Hoagland sem N

� Experimento em casa de vegetação

� Delineamento em blocos casualizados

� Composto por três repetições, por 60 dias

�

METODOLOGIA

�Matéria seca da parte aérea; �Matéria seca das raízes;�Matéria seca dos nódulos;�Número de nódulos;�Teor de N de toda a planta (método de Kjehdahl);�N total

�Ao final do experimento serão determinados:

� Análise de dados

�Análise de variância

METODOLOGIA

�Variância e teste de comparação de médias

�Análise de estabilidade para os acessos de sabiá, considerando as fontes de nitrogênio como os diferentes ambientes, através dos procedimentos de Eberhart - Russel e de análise multivariada.

� Científicas

� Identificar a eventual existência de diferenças entre acessos desabiá e estirpes rizobianas quanto à compatibilidade e eficiênciana fixação biológica de nitrogênio

PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES

� Tecnológicas

�Avaliação inicial da possibilidade de seleção de acessos desabiá com maior potencial para fixação biológica de nitrogênio;

�Avaliação do potencial de fixação biológica de nitrogênio deleguminosas forrageiras com potencial para uso no Trópico Úmido

FASE 2009 2010 2011

M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F

Disciplinas X X X X X X X X X X

Amostragem X X X X X X

Isolamento X X X X X X X X

CRONOGRAMA

Isolamento X X X X X X X X

Caracterização genotípica dos isolados X X X X X

Experimento de compatibilidade e fixação X X X X X X

Caracterização genotípica dos acessos de sabiá

X X X X X X X X

Análises dos dados X X X X X X

Previsão de defesa da dissertação X

Itens R$ Quantidade Total em R$

Sílica gel Azul 4-8 mm, frasco 500g 17,65 4 70,60

Kit de PCR 130,00 3 390,00

DNA Lader, 100 pbMarcador de ácidosNucleicos, 250ul 298,00 1 298,00

CHEF DNA Ladder, Marcador de ácidos Nucleicos, lambda ladder, 5Kb

623,00 1 623,00

dNTP Mix (25mM, 250uL) 198,38 1 198,38

ORÇAMENTO ESTIMADO

dNTP Mix (25mM, 250uL) 198,38 1 198,38

Ponteiras universal amarela 0 a 1000 UL 15,53 5 pct.c/1000 77,65

Ponteiras universal azul 200 a 1000 UL 28,22 5 pct.c/1000 141,10

Tubos para PCR 500 UL livre de DNAse e RNAse 92,66 Pct.c/1000 96,66

Tubos para PCR 0,2 ml incolor 213,00 cx.c/1000 213,00

Tubo Eppendorf 2,0 ml graduado e autoclavável 34,34 1 pct.c/500 34,34

Syber Green 60,00 1 60,00

Agarose (500 g) 1.200,00 1 1.200,00

Primers 90,00 21 1.890,00

Vasos de Leonard 3,00 500 1.500,00

Total: 6.792,73

APOIO FINANCEIRO E INSTITUCIONAL

Paulo Geovani Silva Martins

Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia - Melhoramento Genético de Plantas - UFRPE

E-mail: paulo_geo@yahoo.com.br