Unitermos: lesiio de isquemia reperfusiio, endotilio, oxido nitrico, musculoesquelitico.

-DISFUNCAO ENDOTELIAL NAISQUEMIA EREPERFUSAO DOMUSCULO ESQUELETICO.

Os mecanismos das oclusoes arteriais relacionam-se, com certeza, afunvao doendotelio vascular, que e profundamente afetada pela isquemia seguida de reper­fusao sangtifnea. A chamada "Iesao de isquemia reperfusao" e urn fenomenouniversal e de extremo interesse, haja vista a existencia de incontaveis investiga­voes sobre 0 fenomeno. Como esta lesao parece estar mais relacionada com areperfusao, cria-se um impasse fisiopatologico, qual seja, criar-se urn novo pro­blema serio apos a renutrivao aerobica de urn determinado tecido ou orgao.Os mecanismos da "lesao de isquemia reperfusao" relacionam-se com uma dis­funvao endotelial que, entre outros processos biofarmacologicos, deve-se adi­minuivao da produvao de oxido nftrico (NO) ou com a diminuivao da sua biodis­ponibilidade, submetendo os vasos sangtimeos ao risco de espasmo e trombose.A motivavao do presente texto foi a de revisar os conceitos relacionados com adisfunvao endotelial dependente do NO, apos isquemia seguida de repelfusao demusculo esqueletico. Esta revisao incluiu: 1) Aspectos gerais da lesao de isque­mia reperfusao; 2) Aspectos especfficos da lesao de isquemia reperfusao domusculo esqueletico; 3) A via de liberavao endotelial do NO e a hipotese dadisfunvao endotelial por comprometimento da transduvao de sinal pelas G-prote­mas; 4) A experiencia laboratorial da Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto­U.S.P. e; 5) As possibilidades de modificavao da lesao de isquemia reperfusao domusculo esqueletico.

A s causas de oclusoes art~riais

agudas associadas a lesao dereperfusao em extremidades co­

mumente relatadas sao: 0 embolismo ar­terial, a trombose aguda, a trombose deenxertos ou proteses arteriais, 0 pinva­mento de arterias principais ou troncula­res durante cirurgia reconstrutiva, a ca­nulavao arterial durante circulavao extra­corporea e 0 trauma arterial. 0 conceitode oclusao ou interceptavao do fluxo ar­terial foi apresentado, ja em 1628, porWilliam Harvey. No seculo seguinte, em1798, John Hunter, propos a embolecto­mia como procedimento para restauravao

CIR VASC ANGIOL: 17: 49-58

do fluxo sangtifneo. Cento e quarentaanos mais tarde Labey, pela primeira vez,executou este procedimento com exito 19.

20. A evoluvao clfnica e determinada parvanos fatores dentre os quais podemosdestacar 0 numero, a extensao e 0 nfvelda oclusao arterial. Alem destes, a dura­vao e a extensao do envolvimento de ar­terfolas e venulas intramusculares asso­ciadas ao tempo de reconhecimento eintervenvao, sao de importancia vital.Os mecanismos das oclusoes arteriaisrelacionam-se, com certeza, afunvao doendotelio vascular, que e profundamen­te afetada pela isquemia seguida de re-

Edwaldo E. JovilianoMedico-assistente e P6s-graduan­do da Disciplina de CirurgiaVascular Periferica.

Fernanda ViaroBiomedica do Laborat6rio de Fun­9ao Endotelial da Divisao de Ci­rurgia Experimental.

Jesualdo CherriProfessor-doutor em Cirurgia e

Chefe da Disciplina de CirurgiaVascular Periferica.

Takachi MoryiaProfessor-doutor em Cirurgia e 00­cente da Disciplina de CirurgiaVascular Periferica.

Carlos E. PiccinatoProfessor-associado e Docente daDisciplina de Cirurgia Vascular Pe­riferica.

Paulo Roberto B. EvoraProfessor Livre-docente em Cirur­gia Toracica e Cardiovascular eCoordenador do Laborat6rio deFun9ao Endotelial da Divisao deCirurgia Experimental.

Trabalho realizado no Laborat6riode Fun9ao Endotelial da Divisaode Cirurgia Experimental do De­partamento de Cirurgia e Anato­mia da Faculdade de Medicina deRibeirao Preto -USP

Apoio FAPESP - Funda9ao deAmparo aPesquisa do Estado deSao Paulo

Rua Rui Barbosa, 367. Apt. 714015-120 Ribeirao Preto, SP.E-mail: prbevora@keynet.com.br

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DISFUNyAO ENDOTELIAl NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCUlO ESQUElETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COlS.

Figura 1:. Agonistas e seus locais de agao. AOP = adenosina difosfato; R = receptor demembrana; Gp = G-proternas; PL-C = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bifosfato;IPs = inositoltrifosfato; OAG = diacilglicerol; ecNOS = 6xido nrtrico sintetase endotelialconstitutiva.

ASPECTOS GERAIS DA LESA.O DE IS­QUEMIA REPERFUSA.O

cionaram-se, entao, no sentido de deter­minar como 0 endotelio produz 0 radical,e, culminaram com a proposi<;ao de Pal­mer e colaboradores 32, que postularamser a L-arginina a fonte de NO sob a a<;aode uma enzima, a oxido nftrico sintetase.Alem da atua<;ao original na musculaturalisa, como originalmente descrito, 0 NOtambern atua de maneira importante namusculatura esqueletica. Fisiologicamen­te 0 NO regula a contratilidade do mus­culo esqueletico e 0 consumo de glicoseinduzido pelo exercfcio. A enzima ecNOSsitua-se ao nfvel de membrana no mus­culo esqueletico, a qual facilita a difusaodo NO para a vasculatura atuando na re­gula<;ao da perfusao muscular 4.

A motiva<;ao do presente texto foi a derevisar os conceitos relacionados com adisfun<;ao endotelial dependente do NO,apos isquemia seguida de reperfusao demusculo esqueletico, uma vez que, umamelhor compreensao da patofisiologiadeste evento, desde seu inicio, pode re­sultar em oportunidades de aprimora­mento das interven<;6es terapeuticas.

MusculoLiso

CelulaEndotelialCa++ CALMODULINA

YOXIDO

L-ARGININA ----+~NITRICO

Reticuloendoplasrruitico

!on%ro/do cdlcio

citoplasma

membrnna.

perfusao sangiifnea. A chamada "lesaode isquemia reperfusao" e urn fenomenouniversal e de extremo interesse, haja vis­ta a existencia de incontaveis investiga­<;6es sobre 0 assunto. Como esta lesaoparece estar mais relacionada com are:perfusao, cria-se urn impasse fisiopato­logico, qual seja, criar-se urn novo pro­blema serio apos a renutri<;ao aerobicade urn determinado tecido ou orgao.Considera-se 0 endotelio, na atualidade,como urn orgao que exerce imimeras fun­<;6es metabolicas, participando da regu­la<;ao do tono vascular. Esta regula<;aoutiliza variados mecanismos (metaboli­cos, miogenicos e neuroendocrinos), exis­tindo, na verdade, uma importante inte­ra<;ao entre todos esses mecanismos.Furchgott & Zawadski II, descobriram

urn fato que durante muitos anos foi urngrande enigma da farmacologia: 0 por­que da acetilcolina em algumas situa<;6esser urn vasoconstritor e em outras agircomo urn vasodilatador. A simples verifi­ca<;ao de que a acetilcolina so age comovasodilatador na presen<;a do endotelioiniciou uma era de intensos trabalhos nadecada de 80, a qual estabeleceu 0 endo­telio como a sede do desencadeamentoda maioria das doen<;as cardiovascula­res. Postulou-se, entao, a existencia deurn fator relaxante derivado do endote­lio, que em 1982 foi denominado de "en­dothelium-derived relaxing factor" ­EDRF. Apos as proposi<;6es independen­tes de Furchgott 12 e Ignarro e colabora­dores 17 de que 0 EDRF era 0 oxido nftri­co (nitric oxide - NO), as pesquisas dire-

Ebern reconhecido que a isquemia podeinduzir morte celular e necrose tecidual,o que e evidentemente secundario afaltade energia 38. Muitos estudos tern mos­

trado que a lesao tecidual em determina­dos orgaos ocorre nao somente duranteo perfodo de isquemia, mas tambem noperfodo de reperfusao. Este evento de­sencadeia uma serie de fen6menos dele­terios como 0 edema celular, 0 aumentoda permeabilidade na microcircula<;ao, aprodu<;ao de radicais livres pelas celulasisquemicas, a degrada<;ao de fosfolfpidesde membrana, e ainda 0 fenomeno do "noreflow". Historicamente quatro teoriastern sido descritas para explicar esse fe­nomeno. A primeira hipotese e a de queo edema intersticial, 0 edema celular, ou

o CIR VASC ANGIOL: 17:49-58

DISFUN2AO ENDOTELIAl NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCUlO ESQUElETICO. EDWAlDO E. JOVILIANO E COlS.

Figura 2: Meeanismo proposto para 0 eomprometimento da vasodilatat;ao dependente doendot€ilio ap6s lesao de reperfusao. Existem dois loeais que podem ser eomprometidos pelareperfusao: a via de transdut;ao do sinal entre 0 reeeptor(R) e a fosfolipase C(PLC) e a viaque ativa 0 influxo extraeelular de ealeio para manter a produt;ao de 6xido nftrieo(NO). PIP

2= fosfatidilinositol 4,5-bifosfato; IP

3= inositoltrifosfato; DAG = diaeilglieerol.

ambos podem causar compressao vas­cular de arterias e arteriolas, comprome­tendo 0 fluxo sangtiineo normal 43. Outrateoria seria a de que 0 decrescimo no flu­xo poderia resultar da piora da autoregu­la~ao, ou ainda, uma auto-regula~ao ina­propriada causada pelo decrescimo nademanda metab6lica do tecido p6s-is­quemico. A terceira ideia e a de que alesao da musculatura lisa vascular alte­raria 0 tono deteriorando a capacidadede relaxamento em resposta aos meca­nismos normais. Finalmente, a piora naprodw~:ao de fatores relaxantes derivadosdo endotelio (EDRF), prostaciclinas, ouambos poderia diminuir 0 fluxo sangtii­neo vascular pelo aumento no tono arte­rial 22.

As celulas endoteliais sao particularmen­te sensiveis areperfusao. A lesao resul­tante desse processo e manifestada peloaumento da permeabilidade e pela perdada vasorreatividade dependente do en­dotelio. Intera~6es entre os elementos

/.lIII---:'-.~Calmodulina

de isquemia e reperfusao produz altera­s:6es estruturais e funcionais semelhan­tes a aquelas encontradas em tecidosp6s-isquemicos 5. 0 tratamento comsubstancias que limitam a produs:ao deoxidantes, ou mesmo que efetivamenteeliminem sua as:ao ("scavenger") ap6ssua produs:ao, atenua a lesao da isque­mia-reperfusao 13. A geras:ao de especi­es reativas de oxigenio durante a reper­fusao pode contribuir diretamente na pa­togenese da isquemia-reperfusao, mo­dificando por oxidas:ao a estrutura dasbiomoleculas encontradas nos tecidos,provocando alteras:6es na funs:ao celu­lar I.

Outro aspecto a ser considerado e a inte­ras:ao dos neutr6filos com as celulas en­doteliais na reperfusao tecidual. Os neu­tr6filos tern sido implicados como urn me­diador fundamental no mecanismo delesao. Uma vez ligados asuperficie en­dotelial, os neutr6filos aceleram a disfun­s:ao celular alem de causar destruis:ao te­cidual atraves de vanos mecanismos ci­tot6xicos, que incluem a produs:ao desubstancias deleterias como radicais deoxigenio, enzimas citot6xicas, e citocinas18. Muitas dessas substancias tambernrecrutam leuc6citos adicionais com ade­sividade acentuada ao endotelio vasc'u­lar. Esses eventos nao sao restritos asu­perficie da celula endotelial. Com le­s6es mais severas os neutr6filos infiltramos tecidos envolvidos onde enzimas eradicais de oxigenio podem causar danatecidual. Os neutr6filos sao fontes im­portantes de per6xido de hidrogenio eanions super6xidos, os quais inativam 0

NO e contribuem para a formas:ao de pe­r6xinitrito; esse podendo desencadear aperoxidas:ao de fosfolipides de membra­na e a inativas:ao de uma serie de enzimas28. Os fatores responsaveis pela intera­s:ao entre os neutr6filos e as celulas en­doteliais sao complexos e somente parci­almente compreendidos. A adesao dosneutr6filos ao endotelio vascular e medi-

NO

Ca2+

/

sangtiineos e 0 endotelio vascular saoresponsaveis pela injuria tecidual. A ob­servas:ao, de que a reintrodus:ao molecu­lar do oxigenio na reperfusao e necessa­ria para produzir lesao celular p6s-isque­mica e a disfuns:ao, e consistente com 0

ponto de vista de que a lesao decorrenteda isquemia-reperfusao pode resultar daformas:ao de radicais de oxigenio. Mui­tos estudos suportam esse conceito esao baseados em algumas evidencias. Aprodus:ao de substancias oxidantes emtecidos p6s-isquemicos pode ser detec­tada pelo uso de espectroscopia de res­sonancia do spin eletron (eletron spinresonance-ESR) 29. A demonstras:ao que,produtos de oxidas:ao, derivados de pe­roxidas:ao lipidica (malondialdeido, hidro­xiper6xidos lipidicos, etc.) sao formadosem tecidos p6s-isquemicos, tambem ternsido utilizado como evidencia da produ­~ao de radicais durante a reperfusao 26.

A exposis:ao de tecidos a oxidantes ex6­genos gerados em sistemas na ausencia

Proteina Proteina(inativa) (ativa)

NO sintetaseL-Arginina

PIP2Citoplasma

ReticuloEndoplasmatico

IR VASe ANGIOL: 17:49-58 51

DISFUN2Ao ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUsAo DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.

Ach(-logM)___ controle/E+ -.- 190R60/E+

____ Isquemia120/E+ --.- 1120R90/E+

Figura 3: Curvas dose-respostas a aceti/colina g(10'9 a 10'4 M) em arterias femorais cani­nas com endotelio(E+) contrafdas com norepinefrina 10'6M na presen9a de indometacina 10'5M. Resultados foram expressos em porcentagem sob a forma de medias ± erros-padr6es(N=6).

456

colaboradores 42 observaram, em umaserie de experiencias com caes, que anecrose do musculo esqueletico ap6s 5horas de isquemia total pode ser reduzi­da controlando-se 0 fomecimento de oxi­genio no perfodo de reperfusao. 0 efeitobenefico de uma hemodilui~ao aumentaquando sao ministrados varredores deradicais Iivres. Em urn modele de oclusaoa6rtica infr"a-renal temporaria no rato,Perry & Fantini 34 notaram que a super6­xido dismutase impede a progressao dadisfun~ao da membrana celular se admi­nistrada simultaneamente arestaura~ao

do fluxo sangiifneo a6rtico. Recentemen­te, Grisotto e colaboradores 15 demons­traram tambem que, depois de uma isque­mia total de 3 horas(tomiquete), pode-seobservar sinais de lesao de fosfolipidesde membrana e pouca ou nenhuma alte­ra~ao oxidativa, e que, depois de 45 mi­nutos de reperfusao, altera~6es oxidati­vas de componentes lipoproteicos da

789

0 0...s:::G) 20ECO>< 40CO-G)'-G) 60"C

~800

100

rancia do tecido especffico ahip6xia e adura~ao da interrup~ao circulat6ria, como

tambem de altera~6es locais que prejudi­cam a restaura~ao de urn fluxo sangiif­neo normal depois da corre~ao das cau­sas precipitantes 31. Seria 0 fenomeno do"no reflow'" anteriormente descrito.Varios estudos sugerem que curtos perf­odos de isquemia podem causar lesaocelular que pode nao ser evidente quan­do se examina a fun~ao global por siste­ma organico. Por exemplo, demonstrou­se que a oclusao a6rtica temporaria empacientes submetidos a cirurgia vascu­lar deterrnina altera~6es metab61icas nomusculo esqueletico das pernas, queduram pelo menos 16 horas 9. Perry e as­sociados demonstraram, em dois estudosexperimentais em caes, que 3 horas deisquemia parcial resultam em uma disfun­~ao duradoura da membrana celular, quee maior do que 3 horas de isquemia comtomiquete 33. Posteriormente, Walker e

ASPECTOS ESPECfF!COS DA LESAODEISQUEMIAREPERFUSAONOMUS­CULOESQUELEnCO.

Ate 0 final da decada de 80, a lesao dereperfusao do musculo esqueletico foiestudada do ponto de vista metab61ico,ja se ressaltando a importancia dos radi­cais livres na sua fisiopatologia. A partirda identifica~ao do NO, como sendo 0

EDRF, as pesquisas sobre a fun~ao en­dotelial aumentaram em ritmo vertigino­so.Ediffcil avaliar a tolerancia das extremi­dades aisquemia porque algumas celu- •

las sao mais susceptfveis, provavelmen­te como resultado de diferen~as nas ne­cessidades de oxigenio. Por exemplo, osnervos e musculos perifericos tern umaresistencia relativamente menor aisque­mia do que a pele e parece que a pele e 0

tecido subcutaneo sao capazes de so­breviver a perfodos de hip6xia que naoserao tolerados pelo musculo esqueleti­co ou pelos nervos perifericos 30. Ha urn

volume consideravel de evidencias su­gerindo que 0 resultado final de urn perf­odo de isquemia depende nao s6 da tole-

ada pela adesao de complexos de glico­protefnas, ambas na superffcie dos neu­tr6filos e na superffcie da cHula endote­lial. Muitos fatores influenciam a expres­sao dessas glicoprotefnas, regulando acapacidade de conexao entre as celulas.o complexo glicoproteico de adesao dosneutr6filos, ou complexo CDll/CD18,atua mediando distintas intera~6es 8. Aexpressao do complexo CDll1CD18 nasuperffcie do neutr6filo e induzida parradicais super6xidos 35 e e inibida peloNO. Ap6s isquemia-reperfusao, a abun­dancia de super6xidos combinado com adiminui~ao da produ~ao de NO aumentaa expressao na superffcie celular do neu­tr6filo do complexo de adesao CDIIICD18, aumentando a afinidade do neu­tr6fJlo pela celula endotelial.

2 CIR VASC ANGIOL: 17:49-58

DISFUNCAO ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.

Figura 4: Curvas dose-respostas ao fluoreto de sodio (0.5 a 9.5 mM) em arterias femoraiscaninas com endotelio(E+) contrafdas com norepinefrina (106M) na presenya de indome­tacina (105M). Resultados foram expressos em porcentagem sob a forma de medias ±

erros-padr8es (N=6).

Existe hoje uma serie de eventos que par­ticipam de uma cascata de formac;ao doNO. Tomando-se como, por exemplo, 0

relaxamento dependente do endotelio, in­duzido pela acetilcolina, simplificadamen­te 0 processo assim ocorreria: a acetilcoli­na estimula urn receptor muscarfnico, libe­

ra NO que se difunde para a musculaturalisa vascular, provocando urn aumento doGMP cfclico com vasodilatac;ao. Esta eapenas uma visao parcial, ja que 0 proces­so e urn pouco mais elaborado, envolven­

do urn sistema de transduc;ao com mensa­geiros secundarios que incluem G-protef­nas, as quais fazem a conexao com a viafosfatidilinositol que, por sua vez, mobili­za 0 calcio intracelular necessario para aformac;ao do 6xido nftrico, a partir da L­arginina pela ac;ao da 6xido nftrico sinte­tase. 0 sistema envolvido na liberac;ao doNO pode ser estudado pela utilizac;ao deseus agonistas e receptores. (Figura I)No caso especffico do estudo no endote­lio vascular, investigadores tern sugeri­do que receptores da celula endotelial saoligados com a produc;ao e liberac;ao doNO atraves de G-protefnas. Estudos an­teriores realizados por Evora e colabora­dores 10 evidenciaram urn possfvel meca­nismo de comprometimento seletivo daliberac;ao do NO mediada por receptorap6s isquemia global e reperfusao docorac;ao. Acresc;a-se ao fato de que as G-

A VIADELIBERAc;AOENDOTELIALDO OXIDO NfrRIco EA HIP6TESEDADISFUNc;AO ENDOTELIALPOR COM­PROMETIMENTO DA TRANSDUc;AoDO SINAL PELAS G-PROTEINAS

presente estudo ap6iam a hip6tese deque, na verdade, ocorreria uma menorproduc;ao do NO, dependente de umadisfunc;ao seletiva de mecanismos de­pendentes de receptores de membranada celula endotelial, ou uma maior des­truic;ao de NO, pela participac;ao do es­tresse oxidativo 14.

9.57.5

-.- 190R60/E+

-'-1120R90/E+

36. Se os dados obtidos com ratos foremvaIidos para comparac;oes com 0 modelocanino, pode-se inferir que no caso dalesao de isquemia e reperfusao do mus­culo esqueletico, a disfunc;ao endotelialprecede a lesao celular.Trabalhos anteriores, com outros mode­los experimentais com isquemia total, jademonstravam uma disfunc;ao endotelialassociada a reperfusao 6, porem os me­canismos farmacol6gicos envolvidos noevento permaneciam sem esclarecimen­to. A discussao basica consistiu em seatribuir como causa dessa disfunc;ao,uma maior destruic;ao do NO normalmen­te produzido. Porem, esta teoria nao ecompatfvel com achados recentes de quena isquemia-reperfusao do musculo es­queletico ocorre uma diminuic;ao na con­centrac;ao de metab6litos derivados doNO, como os nitritos e nitratos 3. Efato,que anions super6xidos podem destruiro NO, mas os resultados encontrados no

3.5 5.5NaF(mM)

1.5

-e-controle/E+

---Isquemia120/E+

0.5

5090r100

o -10...s:::CU

~ 10><CO-e 30CU"C

'if!.

membrana celular puderam ser constata­dos.Esses estudos sugerem que 0 musculoesqueh~tico e sensfvel a lesao por radi­cais livres derivados do oxigenio, comofoi demonstrado no intestino, no rim eno corac;ao. Alem do mais, parece que aisquemia parcial, geralmente 0 caso napnitica clfnica de cirurgia vascular, e ca­paz de lesar a celula e que, em algunscasos, essa lesao e mais grave do que acausada pela isquemia total.A adesao leucocitaria no musculo esque­letico de ratos submetidos a 90 minutosde isquemia com 0 pinc;amento a6rtico e60 minutos de reperfusao foi demonstra­da por Kishi e colaboradores 21. Outrosautores encontraram danos mfnimos (2%)no musculo esqueletico de caes subme­tidos a isquemia total de 3 horas, lesoesmoderadas (30, I %) com 4 horas de is­quemia, porem, lesoes graves (90%) nogrupo submetido a isquemia de 5 horas

•

CIR VASe ANGIOL: 17:49-58 53

DISFUN2Ao ENDOTELIAL NA ISQUEMIA E REPERFUsAo DO MUSCULO ESQUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.

Nitroprussiato de Sadio, 10·sM

Figura 5: A90es do nitroprussiato de sodio (1o-SM) administrado em banho organico, napresen9a de indometacina, em aneis com e sem endotelio. Os asteriscos indicam quehouve diferen9a estatfstica significante entre os aneis com e sem endotelio do IV e osdemais grupos (P<O.05).

proteinas sao mediadores de muitas vias

dependentes de receptores. Estes estu­

dos sugerem que a isquemia global e re­

perfusao do miocardio pioram a produ­

~ao de NO devido a mecanismos demembrana, mas nao afeta a capacidade

da ceIula endotelial em produzi-Io a partir

da L-arginina. Em outras palavras, os

mecanismos intracelulares da produ~ao

de NO pela celula endotelial parecem pre- ~

servados na lesao de isquemia global

seguida de reperfusao. Existem eviden­

cias da importincia das G-proteinas tam­

bern no mtisculo esqueletico. Liu e cola­

boradores 27 relacionaram em seu estudo

a possivel disfun~ao de G-proteinas no

endotelio do mtisculo esqueletico com a

deteriora~ao da resposta vasodilatadora

a acetilcolina, em ratos hipertensos ou

normotensos com ingestao cronica de

NaCI em nlveis elevados (Figura 2).

Considerando-se 0 papel dos calcios in­

tra e extracelulares na sintese do NO, Como ja foi mencionado, a celula endo-

AEXPERIENCIA LABORATORIAL DA

FACULDADEDEMEDICINADERIBEI­

RAOPRETO- USP.

fatidilinositol, pode-se inferir a importin­

cia deste mecanismo para a eleva~ao ini­

cial do calcio intracelular associada com

a produ~ao do NO 25, isto pode explicar a

atenua~ao da sua libera~ao dependente

do endotelio ap6s a reperfusao coronari­

ana, e finalmente; 3) A G-proteina asso­

ciada com 0 canal de caIcio na membrana

celular pode estar disfuncional, deven­

do-se levar em conta este fato no com­

prometimento do relaxamento dependen­

te do endotelio mediado por receptores

ap6s a reperfusao coronariana. 0 calcio

extracelular e necessario para 0 relaxa­

mento normal dependente do endotelio,

eo ion fluoreto e urn ativador especffico

de uma G-protefna associada ao canal de

calcio presente na membrana da celula

endotelial. Logo, pode-se inferir que 0

comprometimento do relaxamento depen­

dente do endotelio a agonistas que agem

atraves de receptores, ap6s a reperfusao,

deve-se a uma atenua~aodo influxo ex­

tracelular do calcio necessario para a pro­

du~ao continua de NO. Outros autores

constataram urn decrescimo de niveis de

nitritos e nitratos, metab6litos do NO,

ap6s isquemia-reperfusao de extremida­

des sugerindo urn decrescimo da produ­

~ao do NO. 0 fato e que 0 mecanismo

exato da lesao endotelial pela reperfusao

permanece sem elucida~aocompleta, pro­

vavelmente devido a sua alta complexi­

dade. A hip6tese de lesao seletiva de re­

ceptores e mecanismos de transdu~aode

sinais, como, por exemplo, a disfun~ao

das G-proteinas, deve ser investigada

tambem no endotelio dos vasos segmen­

tares de extremidades ja que fortes evi­

dencias indicam a sua participa~ao no

mecanismo de lesao da celula endotelial

coronariana.

**

~190R60/E+

rn:m 190R60/E­rnm 1120R90/E+~ 1120R90/E-

pode-se considerar como hip6teses pelo

menos tres mecanismos para 0 compro­

metimento da libera~ao mediada por re­

ceptor do NO ap6s a lesao de reperfu­

sao: 1) Receptores da superficie da celu­

la endotelial, que se Iigam a compostos

que induzem relaxamento dependente do

endotelio, podem estar lesados ou inca­

pazes de ligar-se, eficientemente, a urn

agonista. Entretanto, cronicamente, ap6s

oclusao coronariana aguda, 0 relaxamen­

to dependente do endotelio a alguns

agonistas dependentes de receptores e

normal, ao passo que aqueles relaxamen­

tos dependentes do endotelio mediados

pelas plaquetas encontram-se compro­

metidos. Com base nestes dados pode­

se propor uma disfun~aoseletiva de cer­

tas popula~6es de receptores na superfi­

cie celular; 2) A G-proteina que liga 0

receptor da celula endotelial afosfolipa­

se C pode ser disfuncional. Como a fos­

folipase C promove a ativa~ao da via fos-

40

o

60

20

80

100 controle/E+c::::J controle/E­~ Isquemia120/E+IZ::2Z) Isquemia120/E-

o...c:Q)

Eco><co-!Q)

"C

~o

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DISFUN9AO ENDOTELIAL NA ISaUEMIA E REPERFUSAO DO MUSCULO ESaUELETICO. EDWALDO E. JOVILIANO E COLS.

telial produz NO em resposta a uma seriede agonistas incluindo noradrenalina,histamina, ADP, trombina, fluoreto des6dio, fosfolipase C, ion6foro do calcio(A23 187), serotonina, angiotensina, pros­taglandina F, ions potassio, endotelina,e estimulac;ao eletrica. Estes farmacospertencem a duas classes distintas deagonistas: agonistas dependentes de re­ceptores - acetilcolina, ADP, serotonina,noradrenalina, e histamina - e agonistasindependentes de receptores - fluoretode s6dio, fosfolipase C, ions potassio, eion6foro do calcio (A23l87). Utilizando­se alguns desses agentes farmaco16gi­cos foi possivel investigar "in vitro"cada passo da via de produc;ao do NOidentificando e localizando os mecanis­mos que sao afetados nessa fase inicialdo evento. 0 modelo empregado foi 0 deisquemia parcial e reperfusao de muscu­10 esqueletico em des, obtido pelo pin­c;amento a6rtico infra-renal.Recentes estudos realizados no Labora­t6rio de Func;ao Endotelial da Divisao deCirurgia Experimental da Faculdade deMedicina de Ribeirao Preto - USP mos­

traram alguns achados fundamentais: 1)o modelo experimental do pinc;amentoinfra-renal mostrou-se adequado e de fa­cil padronizac;ao para 0 estudo da dis­"func;ao endotelial causada pela isquemiaseguida de reperfusao da pata traseirade caes; 2) A isquemia da pata traseirapelo pinc;amento a6rtico infra-remi!, por120 minutos, nao foi capaz de causar dis­func;ao endotelial da arteria femoral; 3) Aisquemia da pata traseira pelo pinc;amen­to a6rtico infra-renal por 90 minutos, se­guidos de urn perfodo de 60 minutos dereperfusao, tambem nao causou disfun­c;ao endotelial, embora ja se observasseuma tendencia a comprometimento dosrelaxamentos dependentes do endoteliopela ac;ao do fluoreto de s6dio; 4) A is­quemia da pata traseira pelo pinc;amentoa6rtico infra-renal por 120 minutos, se­guidos de urn periodo de 90 minutos de

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reperfusao causou disfunc;ao, endoteli­aI, constatada pela diminuic;ao da capa­cidade de liberar NO pelo endotelio daarteria femoral; 5) 0 mecanismo alteradoda liberac;ao do NO ocorreu ao nivel damembrana da celula endotelial, revelan­do urn comprometimento de receptores(Figura 3) e da transduc;ao do sinal pelasG-proteinas (Figura 4); 6) A isquemia dapata traseira pelo pinc;amento a6rtico in­fra-renal por 120 minutos, seguidos deurn perfodo de 90 minutos de reperfusaocausou, tambem, disfunc;ao da muscula­tura lisa vascular da arteria femoral (Fi­gura 5).A ideia de que a disfunc;ao endotelial,com diminuic;ao da produc;ao de NO, pelocomprometimento da transduc;ao do si­nal pela fallllua das G-proteinas, e que acelula endotelial manteria a capacidadede produzir NO, foi a principal hip6tesedesta investigac;ao. Esta hip6tese foiembasada na ja mencionada evidenciaexperimental obtida por Evora e colabo­radores 10, estudando a disfunc;ao endo­telial de arterias coronarianas que se se­gue aisquemia global miocardica segui­da de reperfusao. Neste estudo, as res­postas aos agonistas da via de liberac;aodo NO foram absolutamente uniformes,com comprometimento dos relaxamentosdependentes do endotelio estimuladospela acetilcolina e ADP (receptores demembrana) e pelo fluoreto de s6dio(transduc;ao do sinal pelas G-proteinas).Tambem, de modo absolutamente unifor­me, os relaxamentos dependentes do en­dotelio estimulados pela fosfolipase C epelo ion6foro do calcio, que sao agonis­tas nao dependentes de receptores, fo­ram normais. Por outro lado, constatou­se uma func;ao normal da musculatura lisavascular mediada pelos sistemas GMPc(nitroprussiato de s6dio) e AMPc (iso­proterenol). Quando se comparam estesdados obtidos pelo estudo da circulac;aocownariana, com os dados do estudoenvolvendo a musculatura esqueletica,

algumas diferenc;as foram observadas: a)A arteria femoral apresentou, alem da dis­func;ao endotelial, tambem uma disfun­c;ao da musculatura lisa vascular quandose aumentou os periodos de isquernia(120 minutos) e reperfusao (90 minutos);b) Ao contrario da circulac;ao coronaria­na, observou-se uma inesperada respos­ta alterada ao ion6foro do calcio. A dis­func;ao da musculatura lisa pode ser fa­cilmente explicada pelos tempos de is­quernia e reperfusao, pois nos experimen­tos com a circulac;ao coronariana os tem­pos adotados foram, respectivamente, 45e 60 minutos para a isquemia global (pin­c;amento da aorta) e reperfusao. Ja a dife­renc;a encontrada para as respostas aoion6foro do calcio nos dois protocolosde isquemia-reperfusao, fica mais diffcilde explicar. Por este achado, seria obri­gat6rio concluir-se por urn comprometi­mento da capacidade da celula endoteli­al de liberar calcio do reticulo endoplas­matico, e, consequentemente, da sua ca­pacidade de produzir NO, a partir da L­arginina. Embora, envolva especulac;ao,e provavel que 0 comprometimento daac;ao do ion6foro do calcio, esteja relaci­onado com 0 tipo de caes utilizados, quesao caes capturados nas ruas e, nao cri­ados em bioterios. Alguns caes apresen­taram respostas normais ao ion6foro docalcio. A resposta normal afosfolipase Creforc;a esta ideia. Talvez urn aumento donumero de experimentos, pudesse rever­ter esta perspectiva.Do ponto de vista experimental 0 pinc;a­mento a6rtico infra-renal, como metodoexperimental indutor de isquemia, ternsido utilizado em varios estudos e emvarios modelos animais, para a compre­ensao dos efeitos da isquemia reperfu­sao no musculo esqueletico. Outros mo­delos de estudo experimentais, utilizan­do-se de caes, propuseram avaliar altera­c;6es metab6licas decorrentes do pinc;a­mento a6rtico infra-renal e da reperfusaosecundaria ao evento 40. Baue & Mac-

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clerkin 2 estudaram a funs.;ao miocardicaem caes submetidos a isquemia parcial ereperfusao tambern utilizando a tecnicade pins.;amento a6rtico infra-renal. Estu­dos experimentais com caes demonstra­ram que as extremidades inferiores saoresponsaveis por consumir 6% do debi­to cardiaco antes do pins.;amento a6rtico,0,6% durante 0 pins.;amento, e 24% ap6surn pins.;amento de 4 horas 37.

POSSIBILIDADES DE MODIFICA<;AODA LESAO DE ISQUEMIA REPERFU­SAO DO MUSCULO ESQUELETICO.

oprocesso bioquimico normal dentro dascelulas metabolicamente ativas resulta naformas.;ao de radicais livres de oxigenio.Para se proteger dos efeitos adversosdestes produtos metab6licos, as celulasproduzem uma serie de seqiiestradores eantioxidantes tais como: glutationa, glu­tationa peroxidase, catalase e a super6xi­do dismutase. Portanto, tais elementos eo manitol podem atuar no processo deprevens.;ao e tratamento da lesao de re­perfusao. Embora muito da as.;ao do ma­nitol na isquemia se deva ao efeito os­m6tico, e importante ressaltar a sua as.;aocomo seqiiestrador de radicais hidroxila.A hip6xia causa a redus.;ao na concentra­s.;ao de antioxidantes end6genos e, simul­taneamente, a reperfusao ativa mon6ci­tos, macr6fagos e neutr6filos levando aurn aumento da produs.;ao e liberas.;ao dos'radicais livres de oxigenio. De maneirasemelhante, a xantina oxidase endotelial,a ciclooxigenase, a lipooxigenase, a mi­toc6ndria, 0 reticulo sarcoplasmatico e aauto-oxidas.;ao das catecolaminas, fome-

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cern fontes adicionais de radicais livres.Assim, em teoria, 0 bloqueio das reas.;6esdesencadeadas por estes elementos po­deria ter urn papel na modificas.;ao da le­sao de reperfusao. 0 bloqueio da xantinaoxidase pelo alopurinol tern sido testa­do, experimental e clinicamente, com estafinalidade. Existem evidencias de que osantagonistas do calcio, como 0 verapa­mil e 0 diltiazem, possam prevenir ou di­minuir as conseqiiencias da lesao de re­perfusao por diminuir 0 influxo celular docalcio. A habilidade da amilodipina emlimitar a lesao da celula endotelial podeestar relacionada com a formas.;ao do ionper6xinitrito. Alem disso, a via comumda NO sintetase envolve a formas.;ao decomplexos calcio-calmodulina. Assim,bloqueando-se a entrada do calcio extra­celular, a arnilodipina pode diminuir a for­mas.;ao destes complexos, interferindo naliberas.;ao do NO que em meio rico emanions pode limitar a formas.;ao do iont6xico per6xinitrito, lirnitando a lesao tis­sular 39.

A modificas.;ao da lesao de reperfusaorelacionada com os neutr6filos e motivode grandes controversias. Modelos ex­perimentais utilizando musculo esquele­tico sugerem que a deples.;ao de neutr6fi­los reduz a severidade da lesao de reper­fusao 23,24. Epreciso, entretanto, ressal­

tar que a depressao neutrofilica nuncafoi demonstrada como uma maneira deprevens.;ao da lesao de reperfusao, so­mente diminui sua severidade. A impos­sibilidade dos seqiiestradores de radicaislivres em reverter a lesao mediada porneutr6filos sugere outros mecanismospara a sua citotoxicidade 18. Existem evi-

dencias experimentais de que 0 bloqueioda aderencia neutrofilica, utilizando anti­corpos monoclonais, possa ser beneficapor reduzir 0 acumulo de neutr6filos quese segue a isquemia-reperfusao. Entre­tanto, os trabalhos nesta area, que estu­dam a eficacia da limitas.;ao do acumulode neutr6filos, sao extremam~nte confli­tantes 41. Outros metodos de modifica­s.;ao da lesao de isquemia-reperfusao me­nos citados incluem a inibis.;ao da sintesede prostaglandinas por varios antiin­flamat6rios nao ester6ides e as tentati­vas de preservas.;ao da funs.;ao mitocon­drial.A possibilidade da utilizas.;ao de doa­dores de NO e da L-arginina para setentar a modificas.;ao da lesao de isque­mia-reperfusao tern sido estudada emmodelos de isquemia regional ou infar­to. Investigas.;6es laboratoriais sugeremque 0 NO tenha urn efeito cadioprote­tor na isquemia-reperfusao, 0 que evi­dentemente deve ser avaliado tambemna musculatura esqueletica. Os poten­ciais mecanismos deste efeito incluem:o seqiiestro de radicais livres de oxige­

nio, melhora da microcirculas.;ao e dimi­nuis.;ao da interas.;ao entre leuc6citos eplaquetas com 0 endotelio.Utilizando-se de modelo com isquemiatotal estudos previos tern verificadobons resultados com 0 uso de pentoxi­filina, na prevens.;ao da deterioras.;ao dorelaxamento arterial induzido pela ace­tilcolina no evento isquemia-reperfu­sao 7. Observou-se, tambem, que a con­centras.;ao de NO aumenta ap6s a admi­nistras.;ao, em humanos, de heparina soba forma de bolus endovenoso 16.

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DISFUNc;:Ao ENDOTELIAl NA ISQUEMIA E REPERFUsAo DO MUSCUlO ESQUElETICO.

SUMMARY

EDWAlDO E. JOVILIANO E COlS.

ENDOTHELIUMDYSFUNCTIONINISCHEMIAREPERFUSIONOFTHESKELETALMUSCLE.

The mechanisms of the arterial occlusions link, with certainty, to the vascular endothelium function, which it is deeply affected

by ischemia following by blood reperfusion. The "ischemia reperfusion injury," is a universal target of experimental and

clinical interests have seen the existence of countless investigations about the phenomenon. As this lesion might be more

related with the reperfusion, it grows up a physiopatological dilemma, which is to create a new serious problem after the

aerobics nutrition of a certain tissue or organ.

The mechanisms of the "ischemia reperfusion injury" link with an endothelial dysfunction, which, among other biopharmaco­

logical processes, it is due to the impairment of nitric oxide release (NO) or with the decrease of its biodisponibility, submitting

the blood vessels to risk of spasm and thrombosis.

The motivation of the present text was it of revising the concepts related with the endothelial dysfunction NO-dependent,

after ischemia following by reperfusion of skeletal muscle. This review includes: 1) General aspects of the ischemia reperfusion

injury; 2) Specific aspects of the skeletal muscle ischemia reperfusion injury; 3) The pathway of endothelial NO release and the

hypothesis of the endothelium dysfunction caused by impairment of the G-proteins signal transduction; 4) The Ribeiriio Preto

School of Medicine - U.S.P. laboratorial experience and; 5) The possibilities of modification of the skeletal muscle ischemia

reperfusion injury.

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