diferentes métodos de conjugação de proteínas

Diferentes métodos de conjugação de proteínasPlasmídios, incompatibilidade, transferência lateral de gens. Conjugação. Descrição geral de plasmídios:Geralmente DNA circulares, feixe duplo, em forma de círculo fechado na célula, contendo uma origem de replicação. Forma supertorcida é a principal vista em gel de agarose (e uma minoria de "círculo aberto").Também existem alguns plasmídios lineares (ex, Borrelia e Streptomyces). Maioria das bactérias contem plasmídios. Algumas diferenças entre plasmídios de gram positivas e gram negativas.Tamanho de plasmídio: pode ser bem pequeno, da ordem de 2kb ou bem grande da ordem de 200kb.Número de cópias de um determinado plasmídio pode ser pequena (1 cópia por célula), ou grande (100 cópias por célula), mas cada plasmídio mantem seu número característico de cópias.Pode ter mais de um tipo de plasmídio diferente dentro da mesma célula. Tipo de informação contida nos plasmídios. Geralmente informações não essenciais, mas podendo dar vantagem ecológica.Plasmídios encontrados até em organismos eucarióticos tais como leveduras, onde o plasmídio denominado de 2u é bem estudado. Espectro de hospedeiras:Alguns plasmídios são de espectro de hospedeiro estreito, presentes em só uma ou poucas espécies. Outros são denominados de promíscuos, se replicando em muitas espécies.Os de gram negativas geralmente não se replicam em muitas espécies, mas tem exceções importantes. RK2 e outros da familia P se replicam em muitas espécies gram negativas.Plasmídios de gram positivas geralmente se replicando em várias gram positivas. Replicação e sua regulação em gram negativas:Geralmente origem de replicação (centenas de bp), e elementos controladores, em 3kb ou menos. Inclui sítios de reconhecimento para proteinas envolvidas na iniciação.A maioria dos plasmídios tem tambem gen rep, plasmidial, necessário para o início da replicação. Esta proteina Rep pode normalmente atuar em trans.Para a maioria dos plasmídios de gram negativas, a replicação pode ser uni ou bidirecional, mas em forma da letra teta, ou seja, sem desfazer o círculo. Alguns poucos plasmídios se replicando por círculo rolante.Diferente de gram positivas, onde a maioria se replica por círculo rolante.Geralmente uma única origem de replicação, mas às vezes tem mais. Plasmídio R6K tem 3 origens de replicação. Gram negativas e regulação da replicação: feedback negativo responsável pela manutenção do plasmídio em certo numero de cópias.Controle do número de cópias deve ter ajuste fino para equilibrar pequenas flutuações no número de plasmídios ou conseguir replicar bastante no caso de entrada numa nova célula após transformação por exemplo.Dois modos básicos de regulação estudados em gram negativas: Regulação por RNA (transcrito antisenso), fazendo uma regulação negativa num ponto chave da replicação.Outro modo: plasmídios com iterons, série de repetições diretas na origem de replicação, necessárias para início e regulação.

Plasmídios regulados por RNAs: mais estudados é ColE1.ColE1 pequeno RNA, RNAI controla funcionamento do iniciador de RNA, RNAII que é necessário para a iniciação.ColE1 não tem proteina Rep de iniciação de replicação.ColE1 usa DNA polI para síntese inicial de feixe lider (lembrar que a replicação geral do DNA é feita pela DNApolIII).Hibridização do RNAII com o DNA depende da formação de estrutura secundária na parte 5', que permite a formação de uma região secundária na parte 3'. Esta estrutura secundária na parte 3' é reconhecida por RNase H que faz um corte no ponto onde vai ser a origem. Aí a DNA polI começa a sintetisar.Controle negativo feito por pequeno RNAI, de 108bp. Ele se pareia ao RNAII, impedindo a formação de híbrido RNAII/DNA.ColEI tem proteina Rop que baixa número de cópias, estabilizando complexo RNAI/RNAII, se ligando a ambas as moleculas. Com isso menos iniciação de replicação.Alguns outros plasmídios também dependem de DNA polI. Plasmídios regulados por iterons, de gram negativas, por exemplo, pSC101 e F.Um ou mais grupos de repetições diretas na região da origem, chamados iterons, com tamanho da ordem de 20bp.Servem para ligação de proteina de iniciação.Uma região típica de iniciação deste tipo de plasmídio contem uma regiao rica em A/T, alguns sítios de ligação de DnaA da hospedeira, e a série de repetições (iterons) onde se liga a proteina Rep feita pelo plasmídio.Forma-se um complexo DNA-proteina. DNA polIII usada na replicação.Dois caminhos possíveis para os plasmídios. Ou tem pouco plasmídio e vai replicar, ou tem muito plasmídio e 2 plasmídios se acoplam via Rep, modelo de algemas ou acoplamento. Replicação de plasmídios e sua regulação em bactérias gram positivas.Circulares, dupla fita, supertorcidos, tamanho variável. Alguns plasmídios são lineares.Tipos de replicação descritas em gram positivas.

Por círculo rolante, maioria dos plasmídios, geralmente plasmídios menores, até 10kb.

Replicação em forma teta. Linear, do tipo de Borrelia, com grampo nas extremidades. Linear, do tipo de Streptomyces. Proteina covalentemente ligada nas

extremidades 5' terminais.

Replicação de círculo rolante: Iniciação do feixe lider por quebra num único feixe, a partir do feixe duplo.Algumas vezes proteina que cortou fica ligada na ponta 5' por ligação fosfo-tirosina. Estrutura da região de início: região rica em AT, depois grampo GC que forma região cruciforme, depois uns sítios de ligação da proteina de iniciação. As proteinas de iniciação também tem papel na terminação da síntese. Síntese do outro feixe ocorrendo após afastamento da parte 5'. São bastante comuns em gram positivas. Replicação de plasmídios lineares:Streptomyces, tem plasmidios lineares com proteinas nas pontas que serviriam como primers para síntese de DNA No entanto, nos dois plasmídios de Streptomyces analisados a replicação começa no

interior e é bidirecional. A replicação iniciada nas proteinas serviria apenas para fazer os términos nas extremidades. Já em Borrelia existem plasmídios lineares com extremidades covalentemente fechadas, em grampo com os 2 feixes ligados por alça. Na replicação uma dos feixes de uma das pontas seria cortado e esticado, permitindo a duplicação de uma das extremidades, começando o processo de cópia de todo o plasmídio. Mecanismos de manutenção estável de plasmídios (ou mecanismos para evitar a perda de plasmídios):Plasmidios naturais normalmente são muito estáveis. A estabilidade é dividida em estabilidade hereditária (manutenção no hospedeiro) e estabilidade estrutural (manutenção da estrutura do plasmídio). Instabilidade dos dois tipos acontece principalmente por transferência para outros hospedeiros ou manipulação in vitro.Estabilidade estrutural. Questão de modificações ocorridas nos plasmídios em outros hospedeiros, tais como deleções. Estabilidade hereditária. Mudanças de hospedeiros, mutações ou DNA extra podem alterar a estabilidade hereditária. Os plasmídios asseguram sua estabilidade hereditária usando um alto número de cópias ou por mecanismos genéticos específicos.Entre os mecanismos genéticos específicos temos:

resolução de multímeros, equipartição, morte pos segregação (sistemas toxina-anti-toxina.)

. Quando os plasmídios se replicam mas não se separam eficientemente temos na verdade uma diminuição do número de cópias, que poderia levar a uma perda do plasmídio.Alguns plasmídios evitam isto codificando proteinas envolvidas exatamente com a recombinação das cópias terminadas, levando a uma separação mais eficiente dos plasmídios. Por exemplo o plasmídio ColE1. Equipartição, também denominada de mecanismo de partição.Geralmente usada por plasmídios de pequeno ou médio número de cópias.Emprega sítios do plasmídio que se ligam a sítio da membrana, para garantir pelo menos uma cópia do plasmídio em cada célula-filha. Plasmídios também sintetizam proteinas que se ligam a estes sítios e à membrana. Sistemas toxina-antitoxina.Alguns plasmídios sintetizam uma toxina e uma anti-toxina. Assim, as células que contem o plasmídio não são afetadas por esta toxina.No entanto, existe uma meia vida maior da toxina que da antitoxina. Assim, células que perderam o plasmídio são mortas pela toxina residual. Incompatibilidade de plasmídios.Plasmídios muito semelhantes normalmente não se mantem juntos dentro de uma mesma linhagem.Uma classificação importante de plasmídios é feita de acordo com seu grupo de incompatibilidade, por exemplo, IncF, IncW.Plasmídios muito semelhantes compartilham mecanismos de início de replicação e de partição para as células filhas. Desta forma não conseguem se manter, ambos, de forma estável numa linhagem.

Seleção aleatória para replicação causa disparidades nos números de dois plasmidios semelhantes e dentro do mesmo hospedeiro. O mesmo ocorre na partição dos plasmídios. ( Obs:Sistemas de partição em gram positivas ainda não foram caracterizados). Artigo: Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation (2000) Ochman, H, Jeffrey LG & Groisman, EA. Nature 405(6784): 299-304.Bactérias obtem uma fração significativa da diversidade genética através da aquisição de sequências de organismos mais distantes.A transferência horizontal de gens produz um genoma dinâmico, com introduções e deleções de gens.Importância da transferência lateral de gens reconhecida nos anos 50 com a rápida disseminação dos gens de resistência a antibióticos. Como detetar a transferência horizontal de gens?Dois métodos: comparação de gens específicos entre diferentes espécies e comparação global de genomas.Gens transmitidos por transferência lateral, normalmente vão estar presentes em algumas linhagens da espécie receptora, mas não como um traço comum da espécie. Além disso estas regiões transferidas mostram uma grande homologia entre as duas espécies envolvidas na transferência ao contrário de outros gens das duas espécies. Existem testes estatísticos para verificar isso.A outra forma e comparar o genoma todo verificando a taxa de GC ao longo do mesmo. Isto normalmente é homogêneo ao longo do genoma, e regiões que se afastam muito dos valores médios podem ter vindo de outro organismo. Também o uso de codons da espécie e o uso de di e trinucleotídeos são checados, e se forem discordantes podem indicar uma transferência lateral de gens. A abrangência da transferência lateral de gens:A disponibilidade de sequências de genomas completas permitindo uma análise da quantidade de DNA das sequencias adquiridas pelo genoma.19 genomas comparados. Existe boa variação de tamanho no genoma e também na quantidade de DNA vindo de transferencia lateral.Genomas com nada detetado e outros com 15-17% de DNA adquirido.Uma certa fração do DNA transferido é constituida de fagos, plasmídios ou elementos de transposição. No entanto uma boa fração do DNA transferido é constituido de outros gens.Um caso interessante de transferência: duas espécies bacterianas, hipertermófilas, Aquifex aeolicus e Thermotoga maritima, contem um grande número de gens homólogos a gens de Archae termofílicas. Isto já não acontece numa comparação entre bactérias mesofílicas e Archaes.Ambos os metodos de detecção, gens ou genoma, revelam o potencial de genomas bacterianos de incorporar um grande numero de sequências, mesmo de organismos bem divergentes. Como é que sequências são adquiridas.É necessário que haja a entrada do DNA na célula receptora e que ela se incorpore ao genoma, ou faça parte de algum replicon na célula. Estas duas etapas podem ocorrer indistintamente com qualquer sequência.Uma terceira etapa no processo de aquisição de novas sequências (e sua manutenção na espécie) tem a ver com a sequência mesmo, e se ela beneficia de alguma forma o novo hospedeiro. A introdução dos gens pode ocorrer por transformação, conjugação ou transdução.Algumas poucas espécies permanentemente transformáveis, e apresentam alto índice de transformação. Não quer dizer no entanto que receba muito DNA de outras espécies. No

caso de H. influenzae tem bem pouco DNA adquirido.Por transdução também pode introduzir DNA, mesmo se bactérias não estão juntas. A conjugação pode ocorrer entre organismos diversos, inclusive entre domínios distintos, tais como bactérias e plantas ou bactérias e leveduras. Mecanismos de permanência na receptora: manutenção como plasmídio, ou integração no genoma por recombinação homóloga, ou outros mecanismos de recombinação. Importante: o tamanho total do genoma não vai aumentando paulatinamente, assim espera-se que ocorram perda de gens também. Traços introduzidos por tranferência lateral.Resistência a antibióticosBenefício da aquisição de gens de resistência e transiente, geralmente estão em DNAs móveis.Gens de virulência Conjugação: Transferência de DNA por conjugação.Característica importante de plasmídios: habilidade que alguns plasmídios tem de se transferir para outras células, ou mesmo de mobilizar outros DNAs celulares para transferência para outras células.A habilidade de uma célula ser doadora vem da presenca de um agente de DNA infeccioso. Uma classificação de plasmídios em:

Conjugativos ou transmissíveis ou fatores sexuais, Mobilizáveis, Não transmissíveis.

Conjugação ocorre em gram negativas e gram positivas e todos os tipos de plasmídios, conforme a classificação acima, são encontrados em gram positivas e gram negativas.Descrição básica, após contato celular, plasmídio tem um feixe do feixe duplo quebrado, e vai passando um feixe de DNA (iniciando na ponta 5') para dentro da célula receptora. Processo denominado de círculo rolante. Na receptora este plasmídio se torna feixe duplo. Por outro lado, na doadora, também ocorre síntese de DNA na ponta 3' do mesmo feixe que foi quebrado, refazendo o feixe que foi transferido para a receptora. Ao final do processo as duas células contem o plasmídio em feixe duplo. Alguns plasmídios se transferam só para a mesma espécie ou outras muito próximas. Outros, os plasmídios promíscuos, se transferem para espécies distantes, ou mesmo entre reinos.Existe passagem descrita até de plasmídios de E. coli para leveduras (Heinemann, Nature 340:205, 1989).Importância fundamental evolutiva e ecológica. Estudos de transferência de DNA em gram-negativas:Estudos com plasmídio F e outros plasmídios de bacterias entéricas e pseudomonas.Contatos celulares iniciados pelos pili F, presentes na célula doadora, que contatam a célula receptora, trazendo-a para perto.Pilus é receptor para diversos bacteriófagos, icosaédricos, que se ligam aos lados dos pili, ou filamentosos, que se ligam na ponta do pilus. Estrutura de F, 100kb.Região lider, vai de oriT, origem de transferência, até repFIA, região de replicação de F. Gens presentes aí ajudam estabelecimento de F na receptora.RepFIA, replicação de F, 2 ori de replicação, uma unidirecional (oriS) e outra bidirecional (oriV), que é a que funciona normalmente na replicação do plasmídio.

RepIB é região secundaria de replicação, pode funcionar na ausência de RepIA. RepIC não é funcional apesar de homologias. Tem uma cópia do transposon gama delta, ou Tn1000 e IS2, e 2 cópias de IS3. IS3 dentro de finO (sem inibição de conjugação).Região de transferência, região tra, tem 33,3kb, e é a última a passar. Vai de oriT ao IS3 no alto. Este fragmento clonado faz outros plasmídios se tornarem conjugativos. Existem vários outros plasmídios semelhantes a F, com afinidades similares por bacteriófagos.Subdivisão em grupos de incompatibilidade, Inc, 7 grupos, IncFI a IncFVII.Plasmídios semelhantes a F em toda a família Enterobacteriaceae. Outros tipos de plasmídios, variados Inc, mas basicamente 2 tipos, por causa do pilus formado:

flexível, transmissível em líquido, susceptível ao fago filamentoso M13, outro tipo de pilus, pequeno e rígido, conjugação sobre superfícies, sensíveis a

fagos do tipo PR4.

Processo de conjugação de F:contato: ponta de pilus e superficie da célula recipiente. Retração do pilus, despolimerização no envelope da doadora e/ou na receptora. Depois ocorre a estabilização do contato doadora/receptora, região maior do que so ponto de passagem.Formação de poro para passagem de DNA, diretamente para o citoplasma da receptora. (Obs: DNA não passa através do pilus!)Mecanismo de transferência do DNA: oriT forma complexo com proteina TraI. Um feixe então cortado. TraI funciona no corte de DNA e como helicase, na separação dos feixes. Esta proteina fica ligada na extremidade 5' do DNA. O feixe de DNA vai sendo separado e transferido, mas região 5' fica associada a ponto de passagem intercelularTraI fica associada com a conexão intercelular durante a transferência, e também cataliza a recircularização do feixe transferido. Organização da região de transferência tra do plasmídio F.36 ORFs na região. Um grande transcrito, e alguns outros. O transcrito maior comeca em pTraY e tem uns 34 gens, e 32kb. Existem na região tra vários gens envolvidos com a síntese e a montagem do pilus. Estrutura e formação do pilus F.Pilina F é produto do gen traA. Proteina fica arranjada de forma helicoidal no pilus. Inicialmente prepilina é formada, de 12,8kDa, depois vira pilina de 7,2kDa.Para processamento depende da expressão de traQ, usada no transporte da membrana interna, e traX, usada na acetilação da extremidade N da pilina.As subunidade de pilina estão na maioria na membrana interna, em grupos em determinados locais, que também contem as outras proteinas de montagem de F, formando um "complexo de montagem".A montagem do filamento depende de energia, e começa a partir da base do pilus. Proteinas TraN e TraG envolvidas na estabilização dos pares. TraN está na membrana externa e tra G na membrana interna. Pode haver interações entre porções periplasmáticas destas proteinas. Fenômeno de exclusão de superfície (Sfx):células hospedeiras de F não atuam como receptoras na conjugação. Pilus F não a reconhece como receptora, por ter proteinas codificadas por FtraS na membrana interna e traT na membrana externa, responsáveis por diferentes

aspectos do fenômeno.Existem 5 classes de exclusão de superfície descritas, de SfxI a V, para diferentes plasmídios.A proteina TraT é comum ou pelo menos similar em todas elas. A TraS é diferente.Função de TraT inibição da formação de agregados e TraS previne o início do metabolismo de DNA da doadora. Regulação da expressao da região tra.O promotor principal é traYp, que dá origem ao transcrito longo, envolvendo quase todos os gens. A proteina TraJ faz a regulação positiva de traYp.Assim, a expressão de TraJ é importante, pois ela por sua vez regula os outros gens.A expressão do gen traJ é regulada por um fenômeno denominado inibição de fertilidade FinOP.Ocorre com a maioria de plasmídios semelhantes a F, mas não com o F propriamente dito.A expressão de traJ é inibida pelos produtos combinados dos gen finO e finP.O produto de finP é um pequeno RNA, estabilizado pelo polipeptideo que é o produto de finO.No caso de F em si mesmo não tem FinO porque existe um elemento de inserção IS3 inserido dentro do gen finO.FinP é um RNA de 78 nucleotídeos, sintetisado na direção oposta a traJ, e na região lider de traJ.RNA finP se pareia ao mRNA traJ, e acontece o corte por RNase III.FinO estabiliza RNA finP, mudando a vida média de 2 min para mais de 40min. Assim, um plasmídio que tenha uma sistema de inibição de fertilidade, será transmissível com frequência logo após a sua introdução dentro da célula, mas depois terá a região tra reprimida, diminuindo a frequência de transferência do plasmídio. Existem outros sistemas de inibição de fertilidade, pelo menos outros 5 sistemas descritos, atuando sobre diversos plasmídios. Plasmídios mobilizáveis e sua transferência para receptoras:Estes plasmídios não fazem todos os produtos para transferência autônoma, mas conseguem se transferir na presença de plasmídios conjugativos.A passagem do plasmídio mobilizável se faz de forma independente ao plasmídio transmissível. Para uma receptora pode passar só um dos plasmídios, ou o outro, ou os dois, e eles não estão ligados entre si.Na presença de plasmídios transmissíveis, a passagem do plasmídio mobilizável se faz com alta frequência, comparável à do outro plasmídio.Em particular o plasmídio mobilizável deve ter a oriT, e geralmente tem ainda gens envolvidos na transferência de DNA, mas não na formação do pilus. Plasmídios não mobilizáveis e sua transferência para receptoras.Estes plasmídios não se transferem nem na presença de plasmídios transmissíveis. No entanto, com baixa frequência, podem ainda ser transferidos por eles. Isto ocorre, quando os dois plasmídios sofrem fusão, havendo então a transferência deste plasmídio maior.Este processo recebe o nome de "condução" de um plasmídio por outro. Mecanismo de passagem de marcadores cromossômicos por plasmídios.Alguns plasmídios podem também se incorporar ao cromossoma bacteriano e fazer a passagem de gens cromossômicos para uma receptora.Formação de linhagens Hfr (alta frequência de recombinação.Mecanismos de integração de plasmídio F ao genoma: geralmente mediado por

recombinação homóloga entre elementos de inserção do plasmídio e sequências iguais presentes no cromossoma, em diferentes posições.F pode se integrar nas duas orientações possíveis, dependendo da orientação da sequência de inserção homóloga que encontra no cromossoma. Os gens cromossomicos que vão ser transferidos inicialmente podem estar à direita ou esquerda do local onde F se integrou. Isto depende da orientação de entrada do plasmídio F.

Funcionamento do sistema imunológico: Ensaios atividade funcional de anticorpos

Curso de

Imunologia Clínica

MÓDULO II

Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para este Programa de Educação Continuada, é proibida qualquer forma de comercialização do mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores descritos na Bibliografia Consultada.

MÓDULO II

2.3. ANTICORPOS

Os anticorpos são imunoglobulinas sintetizadas por linfócitos B, principalmente por plasmócitos, após estímulo de um antígeno. E desde os primórdios da imunologia, o anticorpo já era conhecido por suas propriedades de neutralização, aglutinação, lise e por provocar choque anafilático em pessoas e animais sensibilizados.

A molécula de anticorpos de todas as classes é representada por um modelo básico constituído de duas cadeias polipeptídicas leves e duas cadeias polipetídicas pesadas. Existem cinco classes, ou isotipos, de anticorpos que diferem entre si pela estrutura da cadeia pesada, sendo as cadeias leves iguais para todas as classes.

As classes de anticorpos que existem são IgA, IgG, IgM, IgD e IgE (onde Ig, significa Imunoglobulina, seguida pelas letras) ().

Fig. 11.Isotipos de Imunoglobulinas. (a) IgG, (b) IgD, (c) IgE, (d) IgA dimérica, (e) IgM pentamérica.

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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

2.3.1. DESCRIÇÃO DA ESTRUTURA MOLECULAR DOS ANTICORPOS

As cadeias polipetídicas, pesada e leve são constituídas por uma porção aminoterminal e uma porção carboxiterminal. A união intercadeias e intracadeias é feita por pontes de dissulfeto. Tanto as cadeias pesadas como as leves possuem uma porção constante e variável ().

Fig. 12.Estrutura básica de um anticorpo. A seleção rosa indica a cadeia leve e a seleção cinza indica a cadeia pesada. A seta preta indica a ponte dissulfeto intercadeias e a seta verde indica a ponte dissulfeto intracadeias. As seleções marcadas em azul tanto da cadeia leve quanto da cadeia pesada indicam a região constante do anticorpo e a seleção vermelha indica a região variável do anticorpo.

2.3.2. PROPRIEDADES E FUNÇÕES DOS ANTICORPOS

As classes de moléculas de anticorpos podem ser divididas em subclasses distintas, ainda com base nas diferenças na estrutura pesada das cadeias pesadas. Nos seres humanos as classes IgA e IgG são subdivididas em IgA1, IgA2 e IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. O quadro 1 mostra os anticorpos relacionando com suas principais propriedades.

30


Quadro. 1. Propriedades dos anticorpos. Sinal positivo indica atividade (maior ou menor de acordo com a quantidade de sinais) e o sinal negativo indica a ausência da atividade.

Atividade

funcional dos

anticorpos no

IgM

IgG1

IgG2

IgG3

IgG4

IgA

IgE

homem

Neutralização

+

+

+

+

+

+

-

Opsonização

-

+

-

+

+

+

-

Citotoxicidade

-

Degranulação

-

de mastócitos

Ativação de

+

complemento

+

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

+

+

+

+

-

+

-

2.3.3. ABORDAGENS SOBRE A GERAÇÃO DA DIVERSIDADE DOS ANTICORPOS

O grande número de especificidades anticórpicas que um organismo pode sintetizar sempre impressionou os imunologistas. O fenômeno da diversidade dos anticorpos foi, por muitos anos, alvo de tentativas de explicação através de teorias.

Dentre as diversas teorias formuladas destacam-se as: da linhagem germinativa e da mutação somática. A teoria da linhagem germinativa predizia

que a produção de um anticorpo era estimulada pelo encontro com o antígeno, levando a proliferação e secreção do anticorpo. Para tal fato, era necessária a existência de milhares de genes, representando todas as possíveis especificidades anticórpicas.

31


Em contraste, a teoria da mutação somática postulava a existência de um número restrito de genes para os anticorpos e que os rearranjos e as mutações somáticas seriam os fenômenos responsáveis pela geração da diversidade.

2.3.4. DEFINIÇÃO DE AFINIDADE E ESPECIFICIDADE

Uma das propriedades das moléculas de anticorpos é a de se ligar, através de sítios de combinação, a outras moléculas que lhes sejam complementares, por exemplo, os antígenos. Os antígenos podem estar na forma solúvel ou aderido sobre uma superfície.

A reação entre um anticorpo e um antígeno correspondente é de natureza química, e, portanto vários tipos de forças podem agir cooperando nesta união, como mostra a .

Interações Hidrofóbicas

Forças de Van der Waal Ligações Iônicas

Antígeno

Pontes de

Hidrogênio

Anticorpo

Fig. 13.Antígeno ligado ao anticorpo pela interação de diferentes ligações químicas.

Quando os anticorpos são produzidos pelos linfócitos B ou pelos plasmócitos são obtidas moléculas específicas, com especificidade frente ao determinante antigênico

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estimulador. Desta forma podemos definir especificidade como, a produção de anticorpos que são capazes de reconhecer apenas o estimulante antigênico.

Enquanto que a afinidade pode ser definida como o grau de interação entre o anticorpo e este determinante antigênico. Um anticorpo de alta afinidade apresenta boa complementariedade com o antígeno, que engloba praticamente toda estrutura do determinante antigênico. Já os anticorpos de baixa afinidade são representados por pequena complementariedade com o antígeno, reconhecendo apenas uma parte do determinante antigênico.

2.3.5. CARACTERÍSTICAS DA REAÇÃO ANTÍGENO E ANTICORPO

A interação entre antígeno e anticorpo ocorre em duas etapas: na primeira, há combinação específica entre o anticorpo correspondente e o determinante antigênico. E na segunda, ocorre o fenômeno visível de aglutinação, ou precipitação.

Outro fato que merece comentário é a capacidade de reversibilidade e principalmente a de haver combinação em proporções não fixas o que distingue a reação antígeno/anticorpo das reações químicas clássicas.

3. PRINCIPAIS MÉTODOS IMUNOLÓGICOS UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Muitas técnicas de laboratório que são rotina em ambientes clínicos e de pesquisa se baseiam no uso de anticorpos. Alem disso, muitas das técnicas da biologia molecular moderna tem fornecido informações importantes e inestimáveis acerca do sistema imune.

A Imunologia Clínica se faz por técnicas laboratoriais com métodos de identificação: i) que utilizam anticorpos, ii) que analisam a estrutura e expressão gênica,

iii) que utilizam camundongos transgênicos e Knockouts (KO) para um gene alvo. O método laboratorial que utiliza anticorpos é de valiosa importância, por ser

possível produzir anticorpos contra qualquer tipo de molécula e composto químico. A produção de anticorpos monoclonais aumentou enormemente a capacidade de gerar

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anticorpos com a especificidade desejada. As técnicas que utilizam anticorpos para identificação clínica são: (a) Imunoensaios

Radioimunoensaios

Ensaio de Imunoabsorção por Ligação Enzimática (b) Purificação e Identificação de proteínas

Imunoprecipitação e Cromatografia por afinidade

Western Blot

(c) Marcação e Detecção de Antígenos em células/tecido Citometria de fluxo

Imunofluorescência e Imunohistoquímica

(d) Medição de Interações Antígeno/Anticorpo

As principais técnicas que fazem a análise da estrutura e expressão gênica são:

1)Hibridização por Southern blot

2)Hibridização por Northern blot

3)Reação em Cadeia da Polimerase PCR

As técnicas laboratoriais que utilizam camundongos transgênicos e Knockouts para um gene-alvo têm como objeto de estudo duas estratégias que são:

1)Criação de camundongos transgênicos

2)Criação de camundongos Knockouts para um gene

Como fora dito anteriormente as reações antígeno/anticorpo ocorrem em dois estágios. Após o segundo estágio iniciam-se as manifestações biológicas, os efeitos deletérios da interação antígeno/anticorpo, pela deposição renal de imunocomplexos, ou pela deposição de complexos insolúveis no fenômeno de Arthus, na transfusão sangüínea e na hipersensibilidade imediata. Nos capítulos a seguir abordaremos as principais técnicas que auxiliam no diagnóstico clínico.

3.1. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

A reação de precipitação é um processo de separação em que o soluto dissolvido

é separado do solvente através de um processo que torna o soluto insolúvel. Dois métodos são utilizados, um em meio líquido e outro em meio semi-sólido (gelificado).

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3.1.1. MEIO LÍQUIDO

Os antígenos multirreativos solúveis, na presença dos seus anticorpos correspondentes, formam um precipitado, desde que a concentração dos reagentes, permita a constituição de complexos para atingir o ponto de precipitação ou insolubilização.

A concentração do complexo antígeno/anticorpo em que se inicia a insolubilização representa o máximo de sua solubilidade, e acima desta concentração há precipitação (de modo reversível).

A curva de precipitação é obtida a partir de vários tubos, onde é adicionada quantidade fixa de anticorpo e quantidades crescentes de antígeno. São observadas três fases na curva: uma primeira fase que é caracterizada pelo excesso de anticorpo, uma segunda fase que é caracterizada pela equivalência de anticorpos e antígenos (zona de equivalência) e uma terceira fase caracterizada pelo excesso de antígeno ().

anticorpo antígeno

O

Ã

Ç

A

T

I

P

I

C

E

R

P

Excesso

anticorpo

Equivalência

Excesso

antígeno

Fig. 14.Reação de precipitação em meio líquido

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Em determinados sistemas, ao se atingir a zona de equivalência há a formação de malhas, ou redes, alterando as moléculas de anticorpos e antígenos. Nesta situação formam-se agregados grandes e não se detecta antígeno nem anticorpo no sobrenadande (teoria da malhas). Alguns anticorpos de baixa afinidade ou por se comportarem como monovalentes são classificados como não precipitantes e se encaixa neste sistema de malhas, por não precipitarem na zona de equivalência. No entanto, quando se faz a adição de mais antígeno na zona de equivalência, consegue-se muitas vezes precipitar o anticorpo não precipitante.

3.1.2. MEIO GELIFICADO

As reações de precipitação em meio gelificado podem ser realizadas nos ensaios de imunodifusão simples (unidimencional), imunodifusão dupla (unidimencional), imunodifusão simples (radial), imunodifusão dupla (radial) e imunoeletroforese.

A reação da imunodifusão simples, unidimensional, ocorre em um tubo de ensaio, no qual o antígeno em uma solução é sobreposto em uma coluna de gel de ágar em que foi incorporado o sistema de anticorpos. Os antígenos difundem pelo gel, influenciados pela concentração e velocidade característica de cada molécula antigênica. Ao final da difusão cada antígeno forma com seu anticorpo correspondente um disco ou zona de precipitação que se observa pela opacificação do gel.

A reação da imunodifusão dupla, unidimensional, ocorre quando se colocam para difundir ambos os reagentes (antígeno/anticorpo). Tanto antígeno, como anticorpo migra no gel e se encontram. O precipitado se forma na zona de equivalência entre antígeno e anticorpo.

A reação de imunodifusão simples, radial, é muito sensível e mostra larga aplicação na quantificação de componentes protéicos de soro ou fluidos biológicos (liquor, saliva e urina). A reação ocorre em uma lâmina, placa de Petri ou similar, o gel contendo o anticorpo específico é distribuído, e em posições adequadas são cavados pequenos poços no gel que são preenchidos com o antígeno em questão. Ao final da reação ocorre a difusão do antígeno em várias direções do poço, formando uma região de opacificação em forma circular ao redor do poço.

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Na reação de imunodifusão dupla, radial, o antígeno e o anticorpo são colocados cada um em um poço na camada de gel, posta em posição horizontal. Os reagentes migram, um de encontro ao outro formando o precipitado. Este método é utilizado para comparação de diferentes antígenos contra o mesmo sistema de anticorpos. A difusão é rápida e ocorre em todas as direções.

A imunoeletroforese é a combinação da eletroforese com a imunodifusão radial em gel de ágar, realizada em dois tempos: na primeira etapa ocorre a separação eletroforética, que permite a discriminação dos componentes da mistura de antígenos por diferenças de cargas elétricas. Na segunda etapa ocorre a difusão desses componentes, contra anticorpos específicos para estes antígenos. Este método tem alto poder resolutivo, por caracterizar simultaneamente, uma substância por três parâmetros, características eletroforéticas, difusibilidade e especificidade imunoquímica.

3.2. REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

O princípio das reações de aglutinação e precipitação, fundamentalmente é o mesmo. Os resultados obtidos é que tomam rumos diferentes. A aglutinação promove a fixação do anticorpo na superfície das hemácias (para posterior lise, se necessário) e a fixação do alérgeno na superfície da IgE ().

Com a aglutinação formam-se agregados suficientemente grandes, de células interligadas por pontes moleculares de anticorpos que se combinam simultaneamente com determinantes antigênicos iguais, porem situados em células diferentes.

Na reação de aglutinação ocorre o fenômeno de pró-zona, semelhante ao processo que ocorre na reação de precipitação onde alguns anticorpos não conseguem precipitar o antígeno quando estão em maiores quantidades. Para evitar este fenômeno, se faz necessário utilizar soros diluídos para se observar à aglutinação.

Alguns anticorpos, ditos incompletos ou bloqueadores, são incapazes de aglutinar as hemácias. A explicação está na dificuldade de acessar o antígeno na superfície da hemácia, porque o determinante antigênico deste antígeno está localizado na região intramembranar, e/ou as cargas elétricas presentes na membrana da hemácia dificultam o acesso do anticorpo. Um tratamento enzimático da hemácia com tripsina, papaína ou

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bromelina melhor expõem estes antígenos e altera as cargas elétricas da membrana da hemácia favorecendo a reação com o anticorpo.

Anticorpo solúvel

Anticorpo aderido a superfície

Fig. 15.Reação de aglutinação. O anticorpo forma grandes agregados de células interligadas, por pontes moleculares de anticorpos que se combinam simultaneamente com determinantes antigênicos iguais, situados em células diferentes.

3.3. REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO.

Quando se forma um complexo antígeno/anticorpo há, muitas vezes, a possibilidade de que ocorra fixação do complemento, correspondente a uma série reações seqüenciais como já foi discutido.

Os anticorpos IgM, IgG1 e IgG3 humanos são bons fixadores do complemento. Por outro lado, todos os antígenos solúveis ou aderidos a uma superfície podem formar complexos fixadores do complemento.

As reações de fixação do complemento podem ser usadas para determinar a presença ou quantificar antígenos ou anticorpos, quando um dos elementos é conhecido.

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A detecção da presença, reação qualitativa, ocorre quando temos uma reação antígeno/anticorpo e subseqüentemente a fixação do complemento. Assim, um soro que não contém anticorpos específicos para o antígeno em questão não fixa o complemento. E quando estamos procurando um antígeno com um soro conhecido, e este não está presente na amostra em questão também não fixará complemento.

As reações de quantificação seguem o mesmo princípio da reação qualitativa, apenas são feitas diluições seriadas do soro em que se vai pesquisar e são adicionadas quantidades fixas de antígeno.

3.4. REAÇÕES DE CITOTOXICIDADE

As reações de citotoxicidade ocorrem quando os determinantes antigênicos fazem parte da estrutura da membrana celular. Assim, anticorpos específicos ligados nos determinantes antigênicos, na presença de complemento, induzem uma alteração da permeabilidade da membrana celular, podendo ou não levar a ruptura total desta.

Outro exemplo de citotoxicidade é a prova de linfocitotoxicidade usada em teste de histocompatibilidade.

3.5. REAÇÕES IMUNOLÓGICAS REVELADAS COM MARCADORES.

3.5.1. IMUNOFLUORESCÊNCIA

Os ensaios de imunofluorescência são de grande importância na imunologia clínica e necessitam de considerações especiais.

A primeira técnica utilizada foi a imunofluorescência direta, onde se pesquisou um antígeno em uma reação com anticorpo preparado com o fluorocromo. Para este tipo de reação são utilizados anticorpos purificados específicos para um determinado antígeno ou grupo de antígenos conjugados com um fluorocromo. Esta técnica também é chamada de técnica de camada simples.

A reação da imunofluorescência indireta, ou técnica de dupla camada (),

é realizada por antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente. E por último coloca-se um anticorpo fluorescente com

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especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. Esta técnica apresenta como vantagem à possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários. Outra vantagem é que por esta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos para diferentes tipos de antígenos e pode-se identificar qual a classe que o anticorpo pertence.

A técnica de imunofluorescência por sanduíche recebe este nome porque o antígeno fica entre dois anticorpos. Esta técnica é aplicada para estudar tecidos linfóides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido.

Fig. 16.Imunofluorescência indireta. O anticorpo primário marcado com um fluorocromo (A) é excitado a emitir cor (B), que é visualizado na foto de uma lâmina (C).

3.5.2. IMUNOENZIMÁTICA

O ELISA (do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) se baseia na identificação de anticorpos e ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor (Figura 17). O produto da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir do local da formação.

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Amostra 1 Amostra 2

Antígeno/anticorpo

Antígeno/anticorpo

não específico

específico

Reação

Ausência

Antígeno/anticorpo

de reação

Mudança

de cor

Reação

positiva

Ausência

de cor

Reação

negativa

Fig. 17.Reação enzimática. ELISA.

A reação é desenvolvida, freqüentemente, em microplacas contendo vários poços onde são depositados os reagentes. Há várias maneiras (métodos) de se processar o ensaio imunoenzimático.

O método competitivo é mais usado para identificação de antígenos, mas pode também ser empregado para a detecção de anticorpos. Neste método primeiro se adsorve o anticorpo no poço da microplaca. Após a adsorção do anticorpo, uma solução que possivelmente contém o antígeno é adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O próximo passo é adicionar o antígeno marcado com

uma enzima. Os poços que não possuem o antígeno primário (da solução problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos,

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enquanto que os poços que possuem antígenos aderidos aos anticorpos não mudam de cor.

O método indireto é utilizado para detecção de anticorpos. Neste caso o antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do anticorpo em questão.

O método de sanduíche, ou captura, é indicado para identificação de antígenos, e este antígeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca. Em seguida o antígeno na solução problema é adicionado. Depois o segundo anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão.

3.5.3. RADIOIMUNOENSAIO

Esta técnica é de grande importância dentro da imunologia clínica, pois pequenas quantidades de anticorpos ou antígenos podem ser detectadas depois de marcadas com isótopos radioativos. Desta forma, há um grande aumento na sensibilidade das reações imunológicas. E não há perda das características físicas, químicas e biológicas das moléculas marcadas com os compostos radioativos.

A radioimunodifusão é o método que aplica os princípios da imunodifusão simples, radial, para identificação de anticorpos, por exemplo, IgE humana (que está em presente em pequenas quantidades no soro).

3.5.4. CITOMETRIA DE FLUXO.

A citometria de fluxo tem como particularidade à análise rápida, quantitativa e multiparamétrica de uma célula individual (viva ou morta), entre diversas células de uma

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população. Ou seja, esta técnica possibilita que um determinado tipo celular seja rapidamente identificado, caracterizado, quantificado e selecionado.

A análise quantitativa e a separação de células são as duas aplicações gerais deste método. Freqüentemente é empregado para investigar a expressão de certas moléculas intracelulares ou moléculas de membrana.

Neste método são utilizados anticorpos marcados com fluorocromo e análise dos parâmetros é mensurada através da intensidade de fluorescência produzida por estes

marcadores ().

Células marcadas em suspensão

Espelho

dicróico

Sistema de

informatização

Fig. 18.Acima temos principio da citometria de fluxo. Um laser age sobre as células em suspensão e as classifica quanto ao tamanho, granularidade e quanto ao fluorocromo presente. Abaixo/esquerda temos o aparelho e abaixo/direita temos um resultado onde A/B/C/D representam diferentes populações de células.

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3.6. AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM IMUNOLOGIA CLÍNICA.

Muitos avanços tecnológicos, para pesquisa e diagnóstico em imunologia clínica foram desenvolvidos durante as duas últimas décadas. As técnicas que surgiram tem sido resultado direto da caracterização da estrutura, da expressão gênica, da síntese de genes escolhidos e da manipulação em células e em animais.

A biologia molecular é o estudo da biologia em nível molecular, com especial foco no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a biologia molecular investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica.

A seguir discutiremos algumas técnicas de genética molecular que são amplamente utilizadas para o diagnóstico clínico da ação do sistema imune.

3.6.1. IMMUNOBLOTTING

O método consiste na detecção de seqüências específicas de DNA, RNA ou proteínas em cortes de tecidos ou preparados citológicos, utilizando uma seqüência complementar de ácidos nucléicos marcada com cromógeno (probes ou sondas) (Figura 19).

Sob condições apropriadas, ocorre a hibridização (através do estabelecimento de pontes de hidrogênio) da sonda com a seqüência-alvo da molécula em questão, que pode ser visualizada através de marcadores, que são ligados às sondas. Hoje é bastante utilizado o método de amplificação dos sinais de detecção que aumenta a sensibilidade da hibridização in situ em cerca de 100 a 1.000 vezes, sendo mais rápida e mais simples, com melhor preservação da morfologia e melhor reprodutibilidade, tornando possível à detecção de apenas uma cópia do material analisado.

Uma das principais ferramentas de trabalho é a eletroforese em gel ().

Em geral, DNA, RNA e proteínas podem ser separados segundo o seu tamanho numa matriz usando um campo elétrico aplicado. Na eletroforese, o DNA ou o RNA é separado através da migração no gel de agarose e as proteínas são normalmente separadas segundo o seu tamanho. As proteínas também podem ser separadas segundo a sua carga elétrica usando focagem isoelétrica.

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DNA

Digestão do

DNA/RNA/Proteína

Resolução dos

fragmentos com

Migração

eletroforese em gel

de agarose

Papel

Transferência da

Filtro

amostra para uma

Gel

Esponja

membrana

Solução

Fragmentos

da amostra

Filtro

Hibridização com

Resultado

uma sonda

radioativa ou

quimioluminescente

Fig. 19.Esquema da técnica de Immunobloting.

O Southern blot é uma técnica que permite obter informação sobre a massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada seqüência de DNA. A técnica é uma combinação de eletroforese em gel do DNA (este é freqüentemente fragmentado por enzimas de restrição antes de fazer o ensaio), transferência do DNA para uma membrana e hibridização com uma sonda marcada (radioactiva ou fluorescente). Após a hibridização, a membrana é lavada para remover sonda não ligada a DNA e obtém-se uma imagem através de autoradiografia ou autofluorescência.

O Northern blot estuda o perfil de expressão de RNA mensageiro, onde, quando e quanto de determinado RNA mensageiro que correspondente à expressão de um determinado gene está presente numa dada amostra. É uma das formas mais simples de

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determinar em que altura certos genes estão a ser expressos em sistemas vivos. Neste processo, o RNA é separado numa eletroforese em gel, transferido para uma membrana e detectado de forma similar ao DNA no Southern blot.

O Western blot usa o mesmo princípio do Southern blot e do Northern blot mas é aplicado a proteínas. Estas são separadas usando eletroforese em gel, na presença do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS).

Fig. 20.Cuba do aparelho de eletroforese com gel. As cores azuis indicam a migração da amostra no gel.

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3.6.2. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR

A reação em cadeia da polimerase (PCR do inglês Polimerase Chain Reaction) é uma técnica de grande versatilidade que permite obter múltiplas cópias de um segmento de DNA (Figura 21). Resumidamente, o PCR permite que uma seqüência de DNA seja copiada milhões de vezes, com ou sem introduzir especificamente alterações pretendidas nessa seqüência. A PCR é utilizada para introduzir locais de restrição, para introduzir mutações pontuais ou para identificar um fragmento.

Uma adaptação da PCR foi desenvolvida para ampliar o DNA complementar (cDNA) de um gene de interesse. Neste método, denominado de reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR), o RNA é isolado de uma célula que expressa o gene e os cDNA são sintetizados usando a mesma enzima transcriptase reversa. Em seguida o cDNA de interesse é amplificado pela técnica da PCR convencional com seqüências específicas para o gene.

DNA+Primer

Primer

DNA

Amplificação

Fig. 21. Esquema simplificado da PCR. Uma seqüência gênica pode ser amplificada em muitas cópias após a união com o primer específico. Desta forma pode-se detectar a presença (ou não) de um determinado gene na amostra teste.

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O constante desenvolvimento de métodos de isolamento, de identificação, de amplificação e de análise dos dados/resultados cria-se um novo horizonte para a ciência biológica. Esta tecnologia baseada na biotecnologia abre novas perspectivas para um controle mais eficiente de doenças que ocorrem na espécie humana.

Testes biológicos e físicoquímicos controle processos e produtos

Controle de Qualidade em Esterilização

STERILIZATION AND disinfection are part of the daily routine in microbiological laboratories and constitute vital activities which ensure that cultures, containers, media and equipment are treated in such a way that only the desired organisms that are inoculated will grow and all others will be eliminated. Esterilização e desinfecção são parte da rotina diária em laboratórios de microbiologia e constituem atividades vitais que asseguram que as culturas, contentores, meios e equipamentos são tratados de forma a que apenas os organismos desejado que são inoculados vai crescer e todos os outros serão eliminados. These are accomplished by the use of heat, chemicals, radiation or filtration. Estas são realizadas pelo uso de calor, produtos químicos, radiação ou filtração. A few important definitions which are frequently used are provided below: Um importante algumas definições que são frequentemente utilizados são apresentados a seguir:

Sterilization is the destruction or removal (by filtration) of all microorganisms, including bacteria, viruses, fungi and .esterilização é a destruição ou remoção (por filtração) de todos os microorganismos, incluindo bactérias, vírus, fungos e príons. It is conceived as an absolute. Foi concebida como um absoluto.

Disinfection describes a procedure of treatment to render a contaminated item into a state that it will be no more infectious. The procedure implies the destruction of bacteria, fungi and viruses but not necessarily of spores. Desinfecção descreve um processo de tratamento para tornar um item contaminado em

um estado que não haverá mais infeccioso. O processo implica a destruição de bactérias, fungos e vírus, mas não necessariamente de esporos.

Antisepsis is a process involving the destruction or inhibition of in living tissue thereby limiting or preventing the harmful effects of infection. Anti-sepsia é um processo que envolve a destruição ou inibição da micoorganisms em tecido vivo limitando ou evitando os efeitos prejudiciais da infecção.

Over the years, heat has proved to be the most popular method of sterilization. Ao longo dos anos, o calor tem provado ser o método mais popular de esterilização. It is the most economical, safe and reliable method. É econômica, segura e confiável método mais. Heat is believed to kill microorganisms by coagulation of their vital protein systems. O calor é acreditado para matar microorganismos por desnaturação e coagulação das proteínas dos seus sistemas vitais. Oxidation and other chemical reactions are also greatly accelerated as the temperature is increased, roughly doubling for every rise of 10° C. There are principally two methods of thermal sterilization: moist heat (saturated steam) and dry heat (hot air) sterilization. Oxidação e outras reações químicas são também muito acelerado, como a temperatura aumenta, praticamente dobrando a cada aumento de 10 ° C. Existem essencialmente dois métodos de esterilização térmica: calor úmido (vapor saturado) e calor seco (ar quente) de esterilização. Moist heat has the advantage of acting more rapidly and requiring lower temperatures. O calor úmido tem a vantagem de agir mais rapidamente e exigem temperaturas mais baixas.

Relatively few chemicals are capable of performing sterilization and have the additional properties of stability, safety, lack of etc that make them acceptable. Relativamente poucos produtos químicos são capazes de realizar a esterilização e tem as propriedades adicionais de estabilidade, segurança, ausência de cor etc, que tornam aceitáveis. Some of these may be dispensed as gases which gives them the ability to penetrate deep into materials ( ethylene oxide, formaldehyde) whereas others are used as liquids in applications where the volatility of gases would not be suitable (eg , hydrogen peroxide). Alguns deles podem ser dispensadas como gases que lhes dá a capacidade

de penetrar em materiais (por exemplo, óxido de etileno, formaldeído), enquanto outros são usados como líquidos em aplicações em que a volatilidade dos gases não seria adequado (por exemplo, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio).

15.1 Indicators of the Sterilization Process 15,1 Indicadores do processo de esterilização

The wide application of sterilization processes makes it mandatory to impose strict control measures to validate the results obtained (Table 15.1). A ampla aplicação dos processos de esterilização torna obrigatória a imposição de medidas rigorosas de controle para validar os resultados obtidos (Tabela 15.1). These processes are of three broad types: physical, chemical and biological. Esses processos são de três tipos: físicas, químicas e biológicas. In addition, sterility tests on the treated products are necessary. Além disso, testes de esterilidade nos produtos tratados são necessários. Of various indicators, the biological indicators have gained maximum popularity. Em vários indicadores, os indicadores biológicos ganharam popularidade máxima.

Tabela 15.1: Métodos de validação de processos de esterilização

Process Processo

Physical Física methods métodos

Chemical Química methods métodos

Biological test organism organismo teste biológico

Dry heat Calor seco

Temperature recording charts gráficos de temperatura gravação

change indicator Cor indicador de mudança

var B.subtilis Níger

Moist heat O calor

Temperature recording charts

change indicator Cor

B.stearothermophilus

úmido gráficos de temperatura gravação

indicador de mudança

Biological Indicators Indicadores Biológicos

Bacillus was earlier considered ideal for monitoring because this organism lacks , and toxicity. Bacillus stearothermophilusanteriormente considerado ideal para o acompanhamento, porque este organismo carece, pirogenicidade patogenicidadetoxicidade. Biological indicators manufactured today are generally impregnated with a spore population to meet a performance requirement of surviving a certain period of time in a sterilizing atmosphere but being killed in a longer period of time at the same sterilizing conditions. Indicadores biológicos fabricados hoje são geralmente impregnado com uma população de esporos para atender a uma exigência de desempenho de sobreviver a um determinado período de tempo em uma atmosfera de esterilização, mas ser morto em um período maior de tempo na esterilização nas mesmas condições. The number of spores that should be present when sterilization is being monitored is 10 4 to 10 6 for and around 10 6 for Bacillus número de esporos, que deve estar presente quando a esterilização está sendo monitorado é 10 abril - 10 junho de B.stearothermophilus e cerca de 10 6 de Bacillus subtilis varNíger . .

15.2 General principles for testing sterilizing agents 15,2 Princípios gerais para o teste de agentes esterilizantes

It is necessary to know whether or not the sterilizing agent is effectively doing the job intended for it. É necessário saber se o agente esterilizante é efetivamente fazendo o trabalho destinado a ela. Each method of sterilization is different and each requires its own test procedure. Cada método de esterilização é diferente e cada um requer o seu procedimento próprio teste.

Heat Sterilization Esterilização por calor

For heat sterilization, the first requirement is knowledge that the temperature is recording correctly. Para a esterilização por calor, o primeiro requisito é o conhecimento que a temperatura está

gravando corretamente. Furthermore, the operator must know that the temperature is reaching all the parts of the load and is maintained for the desired length of time. Além disso, o operador deve saber que a temperatura está chegando a todas as partes da carga e é mantida para o período de tempo desejado. Recording thermometers and barometers for steam sterilizers should be employed for the chambers and thermocouples can be buried inside the load. termómetros e barómetros de gravação para esterilizadores a vapor deve ser empregado para as câmaras e termopares podem ser enterrados no interior da carga. Paper strips treated with chemicals that change at the required temperature may be used. Tiras de papel tratados com produtos químicos que mudam de cor na temperatura necessária pode ser usado. a steam autoclave, a container is tightly closed and receives no steam, it may reach the correct temperature, but this will not ensure that sterilization will occur. Se, em uma autoclave, um container é bem fechado e não recebe a vapor, ela pode atingir a temperatura correta, mas isso não irá garantir que a esterilização vai ocorrer. To give this assurance requires the use of biological testing in the form of heat-resistant spores. Para dar essa garantia requer o uso de testes biológicos sob a forma de esporos resistentes ao calor. With moist heat, spores of B. used, and with dry heat sterilizers, spores of Com o calor húmido, esporos de B. stearothermophilus são usados, e com os esterilizadores, os esporos de B.subtilis var Níger are selected. são selecionados. The spores are dried on paper treated with nutrient medium and chemicals. Os esporos são secos em papel tratados com média de nutrientes e produtos químicos. After the sterilization treatment, they are incubated for germination and growth and a change indicates whether they have or have not been activated. Após o tratamento de esterilização, que são incubados durante a germinação e crescimento e uma mudança de cor indica se eles têm ou não foi ativado. This method may take several days of incubation, whereas physical and chemical methods are immediate, but the biological tests are more dependable. Este método pode levar vários dias de incubação, ao passo que os métodos físicos e químicos são imediatos, mas os testes biológicos são mais confiáveis.

Chemical Sterilization A esterilização química

For chemical sterilization, there are indicator tapes for ethylene dioxide and formaldehyde, which show whether or not these gases have penetrated in sufficient quantity at the prescribed temperature to provide sterilization. Para a esterilização química, existem fitas de cor indicador para o dióxido de etileno e formaldeído, que mostram ou não, esses gases têm penetrado em quantidade suficiente, a temperatura prevista para proporcionar a esterilização. But here, as with other methods, biological methods are preferable. Mas aqui, como com outros métodos, métodos biológicos são preferíveis. With ethylene oxide, strips treated with Com óxido de etileno, tiras tratados com B.subtilis var Níger are employed, whereas with formaldehyde is used. estão empregados, enquanto que com B.stearothermophilus formaldeído é usado.

In the case of liquid , spores of No caso dos esterilizantes líquidos, esporos de var B.subtilis Níger and Clostridium both tested. e Clostridium sporogenes são testados. The spores are dried onto carriers that may be porcelain or stainless steel or suture loops. Os esporos são secos para as transportadoras que podem ser ou aço inoxidável ou sutura loops de porcelana. They are exposed to the solution of chemical at the desired concentration, given a specified temperature and time of immersion, after which they are incubated in a rich medium for germination and growth. Eles estão expostos à solução de esterilizante químico na concentração desejada, dada uma determinada temperatura e tempo de imersão, após o que são incubados em um meio rico para a germinação eo crescimento. These tests are replicated many times and, if any of the replicates show growth, the candidate fails the test. Estes testes são replicadas inúmeras vezes e, se qualquer uma das repetições mostram um crescimento, o esterilizante candidato não passar no teste.

Sterilization by Filtration Esterilização por Filtração

With filtration sterilization, membrane filters may be readily tested for passage of microorganisms of different sizes. Com a esterilização de filtragem, filtros de membrana pode ser facilmente testada para a passagem de microrganismos de diferentes tamanhos. Spores of Esporos de B.subtilis var Nígercells of P. , and other viruses give a range of sizes. , Células de

P. diminuta, bacteriófagos e outros vírus dar uma variedade de tamanhos. The bubble point test can also be used. O ensaio de ponto de bolha também pode ser usado. This correlates the pore diameter with the air pressure required to cause the first bubble to break through a filter. Isso se correlaciona com o diâmetro dos poros da pressão de ar necessária para causar a primeira bolha de romper um filtro. Depth filters may be tested by the passage of selected organisms or by the penetration of aerosols made up of chemical dusts of known particle size. filtros de profundidade pode ser testada pela passagem de organismos selecionados ou pela penetração de aerossóis feita de pó químico de tamanho de partículas conhecidas. For example, dry particles of sodium chloride can be detected and quantitatively determined with a hydrogen flame photometer. Por exemplo, partículas secas de cloreto de sódio pode ser detectada e quantificada com um fotômetro de chama de hidrogênio.

Combined Treatments Tratamentos Combinados

Enhanced sterilizing activity can take place if two or more processes, chemical or physical, are employed together.aumento da atividade esterilizante pode ocorrer se dois ou mais processos, química ou física, são empregados em conjunto. There are various kinds of such treatments as discussed below: Existem vários tipos de tratamentos, como discutido a seguir:

Treatment: With an increase in temperature the antimicrobial activity of various compounds increases. O tratamento termoquímico: Com o aumento da temperatura a atividade antimicrobiana dos compostos diferentes aumentos. Use of ethylene oxide at 60 o C and low temperature steam with formaldehyde are salient examples of these combined treatments. Uso de óxido de etileno a 60 º C e vapor a baixa temperatura com formol são exemplos marcantes desses tratamentos combinados.

Chemical Treatment and Irradiation : During radiation if certain chemicals are also present, spores get sterilized and respond better to the action of irradiation. Tratamento químico e Irradiação: Durante a radiação, se determinados produtos químicos também estão presentes, os esporos obter esterilizados e responder melhor à ação da radiação. These

findings have yet to find application. Estes resultados ainda têm que encontrar aplicação.

: Simultaneous use of heat and ionizing radiation can provide good results provided the temperature is carefully selected to avoid paradoxical inversion of which may occur at certain temperatures. Thermoradiation: O uso simultâneo de calor e radiação ionizante pode proporcionar bons resultados desde que a temperatura é cuidadosamente selecionado para evitar a inversão paradoxal de thermorestoration que podem ocorrer em determinadas temperaturas.

Tabela 15.2: Métodos preferidos de esterilização de artigos de uso comum

Autoclaving Autoclavage

m

Hot air oven

Estufa de ar quent

e

Ethylene oxide O óxido de etileno

- Glutaral -

maldeído

Filtration

Filtração

Animal cages Animal gaiolas

Glass ware ware de vidro

Fabric Tecido

3 in 1 syringe tips 3 em 1 dicas seringa

Antibiotics Antibióticos

Sugar tubes tubos de Açúcar

Beakers Copos

Bedding Fundamento

Cystoscopes

Sera Sera

Lab. Laboratório. coats demãos

Flasks Frascos

Blanket Cobertor

Endoscopes Endoscópios

Vaccines Vacinas

Cotton Petri Clothing

Algodão dishes placas de Petri

Vestuário

Filters Filtros Pipette Pipeta

Mattresses Colchões

Instruments Instrumentos

Slides Slides

Pillows Almofadas

Culture media Os meios de cultura

Syringes Seringas

Disposables Descartáveis

Rubber Borracha

Test tubes Tubos de ensaio

Blades Lâminas

gloves luvas

Glicerina

Knives Facas

stopper rolha Needles Agulhas

Scalpels Bisturis

tubing tubulação

Oils Óleos

Scissors Tesoura

Glass Vidro Paper Livro

slides slides cups copos

syringe and plates

needles seringas e agulhas

placas

test tubes tubos de ensaio

Plastics Plásticos

Enamel metal trays bandejas de metal esmaltado

flasks Balões

Wire baskets cestas de fio

dish placa de Petri

Wood Madeira

tubes tubos

tongue depressors abaixadores de língua

Rubber tubos de borracha

applicator aplicador

catheters cateteres

Steel tumbler tambor de aço

drains drenos

diferentes métodos de conjugação de proteínas

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