aula 07 - métodos experimentais utilizados em estudos com proteínas- final
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04/03/2011
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Métodos experimentais utilizados em estudos com proteínas
Profa. Nídia
Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)
2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas
moléculas:
4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que
interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de
biomoléculas.
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína,(o grupo
de moléculas com maior diversidade) as metodologias de separação de proteínas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F1 F
2F
3F
4
F2 .1
F2 .2 F
2 .3
F2 .3.1
F2 .3.2 . . . . . . F
2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) •O fluxograma ao lado representa a
“marcha” de purificação de uma proteína,
mostrando as etapas sucessivas, cada
uma consistindo de método, que levam ao
isolamento de uma proteína presente
numa mistura complexa.
•Observe a quantidade de proteínas
(100g) presente no material inicial e
quanto da proteína purificada se obtém no
final (0,001g). Esses números são típicos
para a purificação da maioria das
proteínas, em especial enzimas.
•Em cada etapa, a proteína de interesse é
separada das demais com base em uma
propriedade diferente.
•Conseqüentemente, as proteínas ainda
misturadas com aquela que está sendo
isolada são cada vez mais semelhantes
em suas características físico-químicas,
exigindo métodos cada mais sensíveis,
capazes de explorar pequenas diferenças,
para se chegar à proteína pura.
Extrato bruto
• Medida da atividade biológica
- particular para cada proteína
- deve ser quantitativa, para estimar quanto
da proteína de interesse há em cada fração.
• Medidas do conteúdo protéico (diversos)
- absorbância de luz UV de 280 nm
- métodos colorimétricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises
complementares devem ser feitas ao longo da
purificação, para verificar se o processo de
separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína
de interesse e do conteúdo de proteínas de
cada fração resultante do processo de
separação devem ser feitas a cada passo.
Assim, apenas a fração que contém a
proteína de interesse, marcada com um
círculo vermelho no fluxograma, é submetida
à próxima etapa de purificação.
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F1 F
2F
3F
4
F2 .1
F2 .2 F
2 .3
F2 .3.1
F2 .3.2 . . . . . . F
2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
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Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).
tecidos
células
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material
de
partida
Material na
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são
possíveis para transformar
células, órgãos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto.
sangue centrifugado: separação de plasma e células
A centrifugação freqüentemente é uma das primeiras
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto.
Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga,
uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus
componentes através de suas massas e/ou densidade,
conforme a técnica.
Através de sucessivas etapas de centrifugação com
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se
obter diferentes frações de um homogenado de células ou
tecidos.
centrifugação diferencialhomogenado
células intactas
pedaços de membrana
núcleos
mitocôndrias
lisossomos
ribossomos
fração
citoplasmática
A centrífuga
Câmara blindadaAmostra sedimentando
refrigeração vácuo
rotor
ângulo
fixo
As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas
são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos
é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
- adição de sais (Precipitação salina)
- adição de solventes
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
So
lub
ilid
ad
e d
a h
em
og
lob
ina
(S
/S’)
KCl
NaCl
MgSO4
(NH4)2SO4
K2SO4
Concentração do Sal,, Molar
Salting-in X Salting-out
O gráfico ilustra o efeito de
diferentes sais sobre a solubilidade
da hemoglobina.
Em baixa concentração salina, a
solubilidade das proteínas aumenta,
pois os íons do sal ajudam a reforçar
a camada de solvatação.
Em alta concentração salina, a
solubilidade das proteínas diminui
pois os íons do sal competem pelas
moléculas de água disponíveis para
formar a sua própria camada de
solvatação.
Diferenças na solubilidade
proteíca.
So
lub
ilid
ad
e,
log
FibrinogênioPseudoglobulina
MioglobinaAlbumina
Hemoglobina
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar
Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água
de solvatação.
Considere uma solução com fibrinogênio,
albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
mioglobina e observe o gráfico.
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4,
pode-se purificar completamente o fibrinogênio
a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois
este precipita totalmente em uma saturação de
2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o
fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais
sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-
se obter um novo precipitado contendo
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina,
ainda solúvel na presença de 7M do sal, e que
ficou sozinha no sobrenadante.
Proteínas apresentam diferente sensibilidade
para a precipitação salina.
- precipitam primeiro:
proteínas maiores
proteínas mais hidrofóbicas
possuem camadas de solvatação maiores
ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.
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Solventes miscíveis com a água diminuem a constante
dielétrica do meio e desorganizam a camada de
solvatação das proteínas.
Os mais utilizados são etanol e acetona.
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.
Água
Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofórmio
Benzeno
78.5 1.85
48.9 3.96
32.6 1.66
24.3 1.68
20.7 2.72
4.8 1.15
2.3 0.00
Solvente Constante
Dielétrica
Momento
Dipolar
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI
tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
a camada de solvatação menos organizada.
• a amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
• o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja.
• excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
• após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário
reverter as condições que levaram à precipitação.
Membrana
de celofane
solvente
solução a
ser dialisada
Aos precipitados obtidos com sal ou
solvente, adiciona-se água.
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
início finalDt
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se
a diálise.
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F1 F
2F
3F
4
F2 .1
F2 .2 F
2 .3
F2 .3.1
F2 .3.2 . . . . . . F
2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as
etapas iniciais de purificação de
proteínas, como a centrifugação
diferencial e precipitação
fracionada.
Esses métodos, apesar de terem
baixo poder de resolução (exploram
diferenças grosseiras entre as
proteínas), permitem processar
grandes volumes ou massas, típicos
das etapas iniciais de isolamento.
Quando já houve redução significa-
tiva dos montantes de proteínas a
serem processados, iniciam-se as
cromatografias, que irão explorar as
diferenças mais sutis entre as
moléculas.
Não esquecer que todas as frações
obtidas devem ter o conteúdo de
proteínas e de atividade biológica
medidos, para se decidir qual/quais
deverão passar para o passo
seguinte da purificação.
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
A absorbância de uma solução de proteínas a 280nm é diretamente proporcional
ao seu conteúdo protéico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua
composição, especialmente triptofano.
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína.
Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração
de 1 mg/mL.
Comprimento de onda
Ab
so
rtiv
idad
e m
ola
r, e O gráfico mostra o
espectro de absorção de
luz UV dos aminoácidos
aromáticos Trp, Tyr ou
Phe.
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Cromatografia
Esta técnica consiste na passagem da proteína através de uma coluna (faseestacionária) que é desenhada para reter ou diminuir a velocidade da passagem da fasemóvel onde estão as macromoléculas (proteínas);
A técnica baseia-se numa propriedade particular:
• como o tamanho, carga ou afinidade química.
A solução a analisar deve conter a proteína concentrada e o método deve ser rápidopara evitar a degradação da mesma, devendo no entanto, utilizar-se inibidores deproteases.
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem caráter hidrofóbico
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Cromatografia em Coluna
Con
cen
traçã
o
Tempo ou volume
Coletor de
frações
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilíndrico aberto nas duas extremidades e preenchido com a
resina ou matriz ou gel cromatográfico.
A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e
forçando o contato desta com as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo 1
Mais tampão é
colocado na
coluna, forçando os
componentes
da amostra a
interagirem
com a resina
Componentes da
amostra se
separam e saem da coluna com
diferentes
volumes de
tampão
Tempo 2 Tempo n
Líquido
que sai da
coluna é recolhido
em tubos
de um
coletor de
frações
Os componentes da mistura são
separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como:
• massa molecular
• carga elétrica
• solubilidade
• afinidade
Amostra com
diferentes
componentes
Resina
embebida
em tampão
Tempo zero
Um cromatograma, como o
gráfico ao lado, é a maneira
usual de se representar o resultado de uma cromatografia.
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Cromatografia de Troca Iônica
A cromatografia de troca iônicaexplora as diferenças no sinal e namagnitude das cargas líquidas dasproteínas em um dado pH.
Cromatografia de troca iônica
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.
Trocadora de ânions Trocadora de cátions
DEAE CM
Existem dois tipos básicos:
resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil
(DEAE)-celulose e;
resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil
(CM)-celulose.
Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto
o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos
50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
Cromatografia de troca iônica
O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa
de pH.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
Eluição
++
+
+
++
+
+
Moléculas com a mesma carga,
ou sem carga, não interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia de troca iônica compreende duas
etapas:
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a
mesma carga;
2) eluição das proteínas adsorvidas.
++
+
+
++
+
+
+
++
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose:
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a
interação entre as proteínas e a resina.
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
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Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com
a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo
simplesmente “arrastadas” pelo tampão.
_
=
=_
+
++++
(+)
(+)
(+)
(+)
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
Não retidas
DEAE++
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
+
(-)
(-)
(-)
+++
_ =
=_(-)
Não retidas
CM
Cromatografia de Gel-Filtração (ou Cromatografia de
exclusão ou peneira molecular )
A cromatografia de exclusão portamanho, também chamada de gel-filtração, separa as proteínas deacordo com seu tamanho.
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
grãos (beads) da
resina com poros
grão da resina poroso
proteína grande
proteína pequena
Tampão
“empurra”
moléculas através da
resina
tubos
Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam de diferentes
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos em que cada molécula entrar durante
o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco
tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio
gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
Ab
sorb
ân
cia
a 2
80
nm
volume
Med
ida
da
ati
v. b
ioló
gic
a
Moléculas
maiores
Moléculas
menores
Kav
Ma
ssa
mo
lecu
lar
(kD
)
20 40 60 80 100 120 mL
25 50 75 100 125 mL
volume de eluição
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
traçado da medida de atividade
biológica nas frações
Medir o volume de eluição da
fração mais ativa. Transportar
para a curva de calibração.
Ler a massa
correspondente
Observar
a escala
log
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Resinas para Gel-Filtração
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70
Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600
Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8
Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1 - 6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400
Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000
Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO(kD)
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo
de moléculas ou partículas a serem separadas
indica quais os tamanhos das
partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
fracionados. Acima ou abaixo
da faixa, não há separação.
Cromatografia de Afinidade
A cromatografia de afinidadesepara proteínas por suasespecificidades de ligação.
Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
por competição com o ligante livre.
Desprezar
proteínas não
retidas
Lavagem
Eluição
pH 2,0 ou sal
Antígeno A
puro
Anti-A
interage
apenas
com a
proteína A
-
Mistura de proteínas
Coluna
empacotada
com esse gel
Partículas de
gel recobertas
de anticorpos
anti-A
Adsorção
Complexo
Ag-AC é
desfeito
A separação de moléculas
tem como base a interação
específica do analito
(molécula-alvo) com um
ligante imobilizado na matriz.
Forças envolvidas nessa
interação podem ser não
covalentes (eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H) ou
covalentes (p.e., ponte
dissulfeto).
Ex: cromatografia de
imunoafinidade
Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto
rendimento com número reduzido de etapas.
Ligante
grupo-específico
Especificidade
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases,
hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos
1. Mono-específicos: ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP
ou cGMP)
Sítios de ligação das proteínas
A, G e L à imunoglobulina, que
permitem a purificação de
anticorpos por cromatografia
de afinidade
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Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos,
açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença
de solvente orgânico.
AMOSTRAS
Fase estacionária
(suporte sólido)X Fase móvel
(líquido ou gás)
- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel
Duas Possibilidades
- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária
Consiste de 2 sistemas:
Suporte: PAPEL
Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose)
Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico)
CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO
Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC)
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Fase Estacionária: sílica (mineral apolar)
Fase Móvel: Solvente aquoso ou água
Dois tipos de montagem:
Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um
valor de Rf característico (razão de retardação).
Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem
identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação)
diferentes compostos.
Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o
composto isolado.
distância de migração da substância
distância de migração do solvente
Rf =
Papel
ou placa
de sílica
Amostra
na origem
tempo 0 t 1 t2 tn
direção do
fluxo do
solvente
Compostos
separados
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
Cromatografia de Partição
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida
através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína
de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de
partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-
sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às
diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de
interesse.
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de
proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.
Fornece informações sobre a massa molecular e composição
de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.
A poliacrilamida funciona como uma
peneira, deixando passar através de seus
poros as moléculas pequenas e retendo
as grandes;
A poliacrilamida é um polímero que
forma um gel de malha porosa.
poliacrilamida
Catalisador
(persulfato de amônio)
+
acrilamida N,N´-metilenobisacrilamidaacrilamida
• É formado a partir da reação de acrilamida e
bisacrilamida.
• concentração de acrilamida variando de 7-
20% determina o diâmetro dos poros
• uso de gradiente de acrilamida aumenta o
poder de resolução
• o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na
presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)
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H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- Sódio dodecil sulfato
Desnaturação de proteínas por SDS
• desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração
através dos poros da poliacrilamida;
• mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas
moléculas migrem para o anôdo;
• facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
A porção hidrocarboneto do
detergente interage com as regiões
hidrofóbicas da proteína, dispondo
o grupo sulfato carregado na
superfície, em contato com o meio
aquoso.
A repulsão entre os grupos
fosfato desestabiliza os laços não
covalentes que mantém a estrutura
3D da proteína, desnaturando-a. Efeito do SDS
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
Na cuba, o gel é polimerizado entre duas
placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm
uma da outra.
Antes da polimerização, um pente é
colocado na parte superior do gel para formar
os poços onde serão colocados de 5 a 20
microlitros de cada amostra, misturadas com
azul de bromofenol, um indicador da corrida.
As partes superior e inferior do gel fazem
contato com recipientes de tampão, onde
estão os eletrodos que estabelecerão o
campo elétrico (~100V) durante a corrida
(1 a 2h).
Terminada a corrida, as placas são retiradas
da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente
retirado e corado para revelar as bandas de
proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie
Blue ou nitrato de prata.
catodo
anodo
tampão
Poços para
as amostras
amostra
Placas
de vidro
1 mm
tampão
gel
Tipo mais comum de cuba para PAGE.
Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe
pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a
determinação do número de cadeias e tipo de
ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas
Padrões
AB
A
B
Sem Com
2 - Mercaptoetanol
2 - Mercaptoetanol
B
s s
SH SH
A
B
A
Eletroforese em Meio RedutorSDS-PAGE das proteínas da bactéria
Salmonella tiphymurium
Direção
da
migração
Cada linha (banda) corada no gel
representa uma proteína
04/03/2011
10
SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas
Mobilidade relativa
Ma
ssa
mo
lecu
lar
(kD
) 97.4
87.0
45.0
29.0
21.0
12.5
6.5
(-)
(+)
Curva de calibração de SDS-PAGE
Utiliza-se proteínas padrões com Mr (mobilidade relativa )
conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada
corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína
desconhecida na curva pode-se estimar a sua massa molecular.
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Mr
Focalização Isoelétrica
Um gradiente de pH estável éestabelecido em um gel pelaadição de anfólitos apropriados.
Uma mistura de proteínas éinserida em um poço gel.
Com a aplicação de um campoelétrico, as proteínas entram no gele migram até que cada umaalcance um pH equivalente a seupI.
Lembre-se que, pH=pI, a cargalíquida da proteína é zero.
Técnica que separa proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos.
Eletroforese em duas dimensões
As proteínas são inicialmente separadaspor focalização isoelétrica em um gelcilíndrico.
O gel é então colocado horizontalmentesobre um segundo gel de forma achatada,e as prote[inas são separadas poreletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.
A separação horizintoal reflete asdiferenças em pI;
A separação vertical reflete as diferençasem massa molecular.
Mais de 1000 proteínas podem seranalisadas por esta técnica.