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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE AGRONOMIA
MORGANA COELHO MAMEDE
DETECÇÃO DE Pantoea ananatis EM SEMENTES DE MILHO
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
UBERLÂNDIA – MG
JULHO DE 2015
MORGANA COELHO MAMEDE
DETECÇÃO DE Pantoea ananatis EM SEMENTES DE MILHO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Agronomia, da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção do grau de Engenheira Agrônoma.
Orientadora: Profª. Drª. Nilvanira Donizete Tebaldi
UBERLÂNDIA – MG
JULHO DE 2015
MORGANA COELHO MAMEDE
DETECÇÃO DE Pantoea ananatis EM SEMENTES DE MILHO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Agronomia, da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção do grau de Engenheira Agrônoma.
Aprovado pela Banca Examinadora em 09 de julho de 2015
Profª. Drª. Maria Amelia dos Santos Enga. Agra. Lara Caroline B. M. Mota
Membro da Banca Membro da Banca
_____________________________________
Profª. Drª. Nilvanira Donizete Tebaldi
Orientadora
i
RESUMO
A cultura do milho (Zea mays L.) tem grande importância no cenário brasileiro,
compreendendo todas as regiões do país. Com a expansão das áreas cultivadas, o
aumento de doenças foi inevitável, tendo como fatores limitantes de produtividade, as
doenças foliares. A mancha branca do milho causada pela bactéria Pantoea ananatis é
considerada, atualmente, como uma das principais doenças foliares desta cultura no
Brasil, estando presente em, praticamente, todas as regiões produtoras. O presente
trabalho teve como objetivo detectar a bactéria P. ananatis em sementes de milho. O
experimento foi conduzido no Laboratório de Bacteriologia Vegetal e na casa de
vegetação, do Instituto de Ciências Agrárias, da Universidade Federal de Uberlândia.
Para detecção da bactéria nas sementes foram utilizadas três amostras de sementes,
através da diluição em série e o plaqueamento em três meios de cultura 523, YDC e
PA20 com três repetições para cada diluição. Os isolados obtidos foram caracterizados
bioquímica e fisiologicamente e pelo teste de patogenicidade no hospedeiro. Na
avaliação da supressividade e repressividade dos meios de cultura 523, YDC e meio
semi seletivo PA20 não houve diferença significativamente entre eles. Desta forma, o
meio semi-seletivo PA20 pode ser utilizado para detecção da bactéria P. ananatis,
facilitando sua detecção. A bactéria P. ananatis foi detectada em duas amostras de
sementes de milho, os isolados bacterianos caracterizados bioquímica e
fisiologicamente e a patogenicidade no hospedeiro foi confirmada, atendendo o
postulado de Koch. Este é o primeiro relato da detecção de P. ananatis em sementes de
milho
Palavras-chave: Etiologia, mancha branca, meio de cultura, Zea mays.
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
2- REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 3
2.1 A cultura do milho ....................................................................................................... 3
2.2 A mancha branca do milho .......................................................................................... 3
2.3 Pantoea ananatis ......................................................................................................... 4
2.4 Ocorrência de Pantoea ananatis em semente.............................................................. 5
2.5 Meio de cultura semi seletivo. ..................................................................................... 5
3- MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 7
3.1 Obtenção do inóculo e preparo da suspensão bacteriana ............................................ 7
3.2 Supressividade e repressividade dos meios de cultura ................................................ 7
3.3 Detecção de Pantoea ananatis em sementes de milho ................................................ 8
3.3.1 Reações de hipersensibilidade ................................................................................. 8
3.3.2 Teste de patogenicidade .......................................................................................... 8
3.3.3 Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos .......................... 9
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 10
4.1 Avaliação da supressividade e repressividade dos meios de cultura ......................... 10
4.2 Detecção de Pantoea ananatis em sementes de milho .............................................. 11
4.2.1 Isolamento de Pantoea ananatis a partir de extratos de sementes ........................ 13
4.2.2 Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos ........................ 13
5. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 14
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 15
1
1- INTRODUÇÃO
A cultura do milho (Zea mays L.) tem grande importância no cenário brasileiro,
compreendendo todas as regiões do país. Na safra 2013/2014, o Brasil produziu cerca
de 75 milhões de toneladas de milho (CONAB, 2014), sendo o terceiro maior produtor
mundial da cultura (USDA, 2014).
A produção intensa da cultura do milho exige que sejam feitas semeaduras
antecipadas sob irrigação, semeaduras nas primeira e segunda safra (PEREIRA et al.,
2005). Com isso, houve uma modificação na dinâmica populacional dos patógenos que
prejudicam a cultura do milho, tendo um aumento na incidência e na severidade de
doenças nas regiões produtoras dessa cultura (LANZA, 2009). Estima-se que as perdas
geradas por doenças chegam a 60% (PEDRO et.al., 2010).
Com a expansão das áreas cultivadas o aumento de doenças foi inevitável, tendo
como fatores limitantes de produtividade as doenças foliares. Dentre estas cabe
ressaltar: mancha-foliar-de-cercospora (Cercospora zea-maydis), míldio
(Peronosclerospora sorghi (W. Weston & Uppal); ferrugem (Puccinia polysora
(Underw.); ferrugem-tropical (Physopella zeae (Mains); mancha branca do milho
(Pantoea ananatis (Serrano) e a podridão-bacteriana (Dickeya zeae = Erwinia
chrysanthemi pv. Zeae (Sabet). É difícil afirmar qual ou quais das doenças ocorrentes
no milho sejam a mais importante. A incidência de cada doença varia de região para
região além do ano agrícola (CASELA et al., 2006).
A mancha branca é considerada, atualmente, uma das principais doenças foliares
da cultura do milho no Brasil, estando presente em, praticamente, todas as regiões
produtoras (COSTA et al., 2010). Folhas com 10 a 20% de severidade da doença
apresentam uma redução na taxa fotossintética líquida em torno de 40%, em cultivares
suscetíveis, podendo reduzir a produção de grãos em até 60% (GODOY et al., 2001).
Os sintomas iniciam-se pelo aparecimento de lesões foliares aquosas com formato
circular, do tipo anasarca, de coloração verde-claro que depois se tornam necróticas de
cor palha. Em ataques mais severos há coalescência de lesões (FERNANDES;
OLIVEIRA, 1997).
Os plantios tardios de milho favorecem condições ambientais para o rápido
desenvolvimento da doença. O uso de cultivares resistentes e a aplicação de defensivos
químicos são indicados para o controle da doença (COSTA et al., 2010).
2
A bactéria P. ananatis já foi descrita sendo transmitida pelas sementes de
cebola, arroz, capim sudão e trigo (GOSZCZYNSKA et.al, 2006a). Para detecção da
bactéria os autores descreveram um meio de cultura semi seletivo, PA 20, o qual reprimi
o crescimento de diversos microorganismos saprófitos dando suporte ao crescimento e
visualização de P. ananatis.
Os meios de cultura semi-seletivos são de fundamental importância para
diagnóstico de doenças, estudos epidemiológicos, etiológicos e para a detecção de
bactérias em sementes (RABALHO, 2007).
A semente é a principal fonte de inóculo do patógeno, levando a ocorrência de
epidemias. Assim, o presente trabalho teve como objetivo detectar a presença de P.
ananatis em sementes de milho.
3
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura do milho
A produção mundial de milho nos últimos vinte anos teve aumento significativo.
Na safra 2013/2014 o Brasil produziu cerca de 75 milhões de toneladas de milho
(CONAB, 2014), sendo o terceiro maior produtor mundial da cultura (USDA, 2014).
A cultura do milho no Brasil é de grande importância para o agronegócio
nacional, além de ser à base de sustentação para a pequena propriedade, devendo ser
interpretada sob a ótica da cadeia produtiva ou dos sistemas agroindustriais, uma vez
que o milho é insumo para uma centena de produtos (DUETEET al., 2008).
O milho é usado em grande escala tanto pela produção de alimento animal (cerca
de 60% a 80%) quanto para exportação e consumo humano (OLIVEIRA; BEZERRA,
2013).
2.2 A mancha branca do milho
A mancha branca do milho (MBM) foi inicialmente identificada como mancha
de Phaeosphaeria, causada pelo fungo Phaeosphaeria maydis (FANTIN, 1994) e
anamorfo Phyllosticta sp. Contudo, diversos autores manifestaram a dificuldade em
isolar e cumprir os postulados de Koch com este fungo (CERVELATTI et al., 1998,
2002; AMARAL et al., 2002). Foi então que Paccola-Meirelles et al. (2001) isolaram e
identificaram a bactéria Pantoea ananatis (sin. Erwinia ananas), a partir de lesões de
estágio inicial da mancha foliar de Phaeosphaeria, em uma freqüência de 86% e 77%.
Esta bactéria, quando inoculada em plantas de milho reproduziu, em casa de vegetação,
sintomas semelhantes aos da doença no campo. A bactéria foi reisolada a partir das
lesões, concluindo assim os postulados de Koch. Os autores demonstraram ser a
bactéria, o agente causal da doença, e não um fungo como postulado inicialmente.
Também, ao avaliar o desempenho de diversos genótipos de milho, previamente
selecionados entre suscetíveis e resistentes, quando inoculados com a bactéria, de forma
artificial, as reações foram análogas à analisada em condições de campo (PACCOLA-
MEIRELLES et al., 2002). A transferência do nome de Erwinia ananas para o Pantoea
4
ananas foi proposta por Mergaert et al. (1993) e Truper & Clari, (1997) surgindo o
nome Pantoea ananatis.
A MBM é caracterizada pelo aparecimento de manchas cloróticas, aquosas do
tipo anasarca no limbo foliar que ao se desenvolverem podem adquirir coloração palha
(PEDRO et al., 2010).
2.3 Pantoea ananatis
Segundo Paccola-Meirelles et al. (2001), a MBM é causada pela bactéria P.
ananatis - bactéria Gram-negativa, não esporulante, anaeróbia facultativa, formadora de
colônias com crescimento mucoso e de coloração amarelo brilhante quando em meio de
cultura.
A bactéria possui um mecanismo chamado quórum-sensing que permite
comunicação através de uma substância química sinalizadora denominada acil-
homoserinas lactonas. Esta substância produz um exopolissacarídeo que protege a
célula bacteriana de mecanismos de defesa do hospedeiro e obstrui a circulação da seiva
nas folhas que originam o tecido necrosado. Em relação à virulência, o patógeno produz
cristais de gelo em temperaturas onde não poderiam ser formados, fenômeno da “ice
nucleation” que em culturas que não toleram o congelamento do meio intercelular faz
com que as lesões sejam exteriorizadas; como na cultura do milho (GONÇALVES et
al., 2010).
De acordo com Sauer et al. (2010), a sobrevivência da bactéria em restos
culturais ocorre mesmo em condições desfavoráveis, através de um mecanismo
conhecido por latência.
Em relação ao tamanho populacional para que a bactéria desenvolva os sintomas
em condições controladas, a MBM se desenvolve bem em condições de alta
precipitação, alta umidade relativa e baixas temperaturas noturnas (14ºC) do ar. Quanto
maior a população bacteriana, maior o número de lesões levando a prejuízos na
produção de até 60% (CASELA, et al., 2006).
As medidas de controle indicam o uso de híbridos resistentes como BRS 1030 e
BRS 1035 (COSTA et al., 2012) sendo que no plantio de cultivares suscetíveis, a
utilização de fungicidas tem sido ajustada em produtos pertencentes aos seguintes
grupos: triazóis, estrobilurinas, benzimidazol e oxitetraciclin (PEDRO et al., 2010).
5
A identificação de P. ananatis na semente como agente causal da mancha branca
é de suma importância, visto que esforços para controlar a qualidade comercial das
sementes produzidas concentram-se na detecção de fungos, e pouco é conhecido
referente à patogenicidade da bactéria (GOSZCZYNSKA et al, 2006a).
2.4 Ocorrência de Pantoea ananatis em semente
A bactéria P. ananatis já foi descrita sendo transmitida pelas sementes de
cebola, arroz, capim sudão e trigo (GOSZCZYNSKA et al, 2006a).
A podridão central das escamas da cebola causada pela P. ananatis foi
responsável pela devastação de quase 100% dos campos de produção na Georgia em
1997. Foi constatada a transmissão da bactéria pela semente (GOSZCZYNSKA et al,
2006a). Walcott et al. (2002) afirmam que o primeiro surto da podridão central das
escamas da cebola na Geórgia, foi introduzido a partir de sementes produzidas na África
do Sul.
Aproximadamente 90% das culturas exploradas agronomicamente são
propagadas por sementes. Todas podem ser afetadas por patógenos, a bactéria P.
ananatis é responsável por causar grande variedade de sintomas tanto em plantas
monocotiledôneas como dicotiledôneas. Sua ocorrência nestes hospedeiros leva a surtos
de doenças esporádicas que resultam em grandes perdas econômicas. Como resultado
do aumento da circulação de produtos agrícolas, a extensão desta ameaça aumentou
dramaticamente ao longo das últimas duas décadas entre os países (COUTINHO;
VENTER, 2009).
2.5 Meio de cultura semi seletivo
Os meios de cultura semi seletivos são de fundamental importância para
diagnóstico de doenças, estudos epidemiológicos, etiológicos e para a detecção de
bactérias em sementes. A avaliação da seletividade dos meios de cultura é o principal
critério, a qual pode ser obtida a partir de fontes específicas de carbono e nitrogênio,
que são capazes de estimular o crescimento de uma determinada espécie e inibir outra
(RABALHO, 2007).
6
Considerando a grande quantidade de microorganismos, além do patógeno de
interesse, que constituem a flora microbiana associada às sementes, a eficiência do meio
semi-seletivo está diretamente relacionada à seletividade exercida pelo mesmo, com alta
supressividade para micro-organismos saprófitas e baixa repressividade para bactérias
fitopatogênicas que se deseja detectar e/ou quantificar (ROMEIRO, 2001). Dessa forma,
entende-se por supressividade a competência que um meio possui de inibir o
desenvolvimento da flora microbiota que não o organismo que se espera isolar, e por
repressividade a aptidão que um meio tem de inibir o desenvolvimento do organismo
que se deseja isolar (FRARE, 2005).
O meio semi-seletivo possui como vantagens à facilidade de uso, e o menor
custo quando comparado a técnicas imunológicas ou moleculares e, também, a
diversidade de amostras que podem ser empregadas, como: solo, água e tecido foliar
(TOUSSAINT et al., 2001).
Uma das principais medidas de controle de bactérias é o uso de sementes sadias.
Assim os meios de cultura semi seletivos devem ser práticos, simples e de fácil
execução para a detecção de bactérias nas sementes.
7
3- MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Bacteriologia Vegetal e na Casa
de Vegetação, do Instituto de Ciências Agrárias, da Universidade Federal de Uberlândia
no período de março a abril de 2015.
3.1 Obtenção do inóculo e preparo da suspensão bacteriana
Os isolados UFU A18 e UFU E43 de Pantoea ananatis, proveniente de folhas de
planta de milho de Morrinhos, GO e Uberlândia, MG, respectivamente, pertencentes à
coleção de trabalho do Laboratório de Bacteriologia Vegetal do Instituto de Ciências
Agrárias da UFU foram cultivados em meio de cultura 523 (KADO; HESKETT, 1970)
por 48h.
A suspensão bacteriana foi preparada em solução de NaCl 0,85%, e ajustada em
espectrofotômetro para OD550 = 0,5 correspondendo a, aproximadamente, 1x1010 UFC
mL-1.
3.2 Supressividade e repressividade dos meios de cultura
Para avaliação da supressividade e repressividade dos meios de cultura foi
realizada diluição em série da suspensão bacteriana do isolado UFU E43 e o
plaqueamento nos meios de cultura 523 e YDC e o meio semi seletivo PA20 (20 g de
NaCl, 1 g de K2HPO4, 1 g de NH4H2PO4, 0.2 g de MgSO47H2O, 1 ml da solução
aquosa a 1.6% de azul de bromotimol, 2 ml da solução aquosa a 0.075% de cristal
violeta, 15 g de agar, 1 L de água, pH=8.0 ajustado com 1,0 N NaOH
(GOSZCZYNSKA et al., 2006b). Para cada diluição, foram replicadas três placas de
Petri.
Aos três meios de cultura foi adicionado 0,04 mg L-1 de thiophanato metílico
(BOMFETI et al., 2007) para evitar o crescimento de fungos, principalmente para a
detecção da bactéria nas sementes.
As placas foram incubadas a 28 oC por 4 dias. Em seguida, foram contadas as
colônias, calculando-se o índice conhecido como UFC.mL-1.
8
Para análise estatística as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade (FERREIRA, 2008).
3.3 Detecção de Pantoea ananatis em sementes de milho
Para detecção de P. ananatis em sementes de milho foram avaliadas três
amostras de milho provenientes de campos de produção em Formosa, GO.
Para extração da bactéria foram utilizadas amostras, que continham 100g de
sementes imersas em 200 mL de solução salina 0,85% durante 16 h em geladeira. A
partir do extrato de semente obtido foi feita a diluição em serie e plaqueamento nos
meios de cultura descritos anteriormente.
As placas de Petri foram incubadas a 28ºC por 4 dias. Após esse período, foram
detectadas as colônias da bactéria alvo, que foram, então, repicadas para o meio de
cultura 523, e calculado o número de UFC g-1 de sementes.
Os isolados de bactéria obtidos foram preservados e mantidos na coleção do
Laboratório de Bacteriologia do ICIAG/UFU
3.3.1 Reações de hipersensibilidade
O teste de hipersensibilidade foi realizado em plantas de fumo (White Burley). O
teste de reação de hipersensibilidade (HR) é utilizado na evidenciação da condição de
uma determinada bactéria ser fitopatogênica ou não, obtendo-se uma resposta rápida e
de fácil interpretação. A suspensão bacteriana foi inoculada por infiltração nos espaços
entre nervuras laterais na face dorsal das folhas de fumo. A avaliação foi feita de 24 a
48 h após a inoculação, observando a reação, caracterizada por necrose e dessecamento
do tecido da região infiltrada (MARIANO et al., 2000).
3.3.2 Teste de patogenicidade
Plantas de milho foram cultivadas em vasos plásticos de 500 g contendo
substrato solo (Latossolo Vermelho), areia grossa e vermiculita na proporção de 3:1:1,
com 2 plantas por vaso. O teste de patogenicidade foi realizado quando as plantas
estavam no estádio de desenvolvimento que apresentava de 3 a 4 folhas, com
aproximadamente 10 dias após a semeadura. As plantas foram submetidas à câmara
9
úmida 24 h antes e após a inoculação. A inoculação foi feita com algodão umedecido
contendo suspensão bacteriana (1010 UFC.mL-1, OD550 = 0,5) de cada isolado obtido na
detecção das sementes.
3.3.3 Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos
Os isolados bacterianos obtidos foram caracterizados bioquímica e
fisiologicamente pelos testes: Gram em KOH 3%, crescimento em meio YDC, oxidação
ou fermentação da glicose, motilidade, produção de ácidos a partir da glicose de
inositol, sorbitol, sucarose e D-arabinose, pela produção das enzimas arginina
dihidrolase, liquefação da gelatina, oxidase, catalase e crescimento a 37 oC, para a
identificação da bactéria.
10
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da supressividade e repressividade dos meios de cultura
Para avaliação da supressividade e repressividade, os meios de cultura 523, YDC
e meio semi seletivo PA20 (Tabela 1), com e sem a adição de thiophanato metílico, não
diferiram significativamente entre si, no número de unidades formadoras de colônia por
mL (UFC mL-1), que variou de 3,9x109 a 4,9x109. Desta forma, o meio semi-seletivo
PA20 pode ser utilizado para detecção da bactéria P. ananatis.
Resultados semelhantes foram descritos por Mehta et al. (2005), na detecção de
Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em sementes de algodão, em que os meios
de cultura semi seletivo e o padrão não diferiram estatisticamente no número UFC.mL-1.
Quanto ao uso de fungicida nos meios de cultura, Bomfeti et al., (2007) em
experimentos “in vitro” observaram que o comportamento da bactéria quando cultivada
em presença de diferentes agentes químicos (oxitetraciclina e streptomicina, benomyl,
triadimenol, tebuconazole, oxicloreto de cobre, hidróxido de cobre e thiophanato
metílico) não foram efetivos no seu controle, enquanto que impediram a formação de
estruturas reprodutivas fúngicas.
Tabela 1. Detecção de Pantoea ananatis (UFC.mL-1) em meios de cultura 523, YDC e
PA20 sem e com adição de thiophanato metílico. Uberlândia - MG, 2015.
Meio de cultura Nº UFC mL-1
523 4,2 x 109
523 + Thiophanato Metílico 4,9 x 109
YDC 3,7 x 109
YDC + Thiophanato Metílico 4,4 x 109
PA20 3,9 x 109
PA20 + Thiophanato Metílico 4,3 x 109
CV (%) = 14.78
No meio semi-seletivo PA20 (Figura 1) houve redução no diâmetro das colônias
e formação de um halo amarelo em torno das inclusões amarelas escuras internas das
colônias individuais de P. ananatis quando comparado com os meios 523 e YDC,
independente do uso de thiophanato metílico. De acordo com Goszcynska et al.,
11
(2006b) esse comportamento se deve a redução do pH do meio PA20 que a bactéria
promove. Para detecção de Xanthomonas axonopodis pv. vignicola em videira, no meio
semi-seletivo CCM, também, houve redução no tamanho das colônias da bactéria alvo
(PEIXOTO et al., 2006).
Figura 1 - Pantoea ananatis em meios 523 (A e D), YDC (B e E), PA20 (C e F) sem e
com a adição de thiophanato metílico, respectivamente, aos 5 dias após
incubação. Fonte: Mamede, M.C., 2015.
4.2 Detecção de Pantoea ananatis em sementes de milho
Na detecção de P. ananatis nas sementes de milho, a bactéria não foi detectada
na amostra 1 (Tabela 2). Na amostra 2, a bactéria foi detectada nos meios YDC e PA20
com adição de thiophanato metílico e na amostra 3, somente no meio PA20.
As colônias de P. ananatis (Figura 2) no meio de cultura semi seletivo PA20
apresentam característica de “ovo frito”, com o centro da colônia de coloração amarelo
escuro à marrom, envolvida por um halo mais claro de cor amarela, facilitando a
12
detecção e a identificação da bactéria, diferenciando das demais bactérias e das
saprófitas.
Este é o primeiro relato da detecção de P. ananatis em sementes de milho.
Segundo Rabalho (2007), ao desenvolver meio de cultura semi-seletivo para
detecção de Xanthomonas spp. em sementes de tomateiro, o meio apresentou alta
eficácia, devido à sua baixa repressividade, alta supressividade e baixo custo.
Tabela 2. Número de colônias de Pantoea ananatis detectadas em extratos de sementes
de milho, em diferentes meios de cultura com adição de thiophanato metílico.
Meio de cultura Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
523 + Thiophanato Metílico 0 0 0
YDC + Thiophanato Metílico 0 2 0
PA20 + Thiophanato Metílico 0 9 1
Figura 2 - Detecção de Pantoea ananatis em extratos de sementes de milho, em meio
de cultura semi seletivo PA20, aos 8 dias após o plaqueamento. Fonte: Tebaldi, N.D.,
2015.
13
4.2.1 Isolamento de Pantoea ananatis a partir de extratos de sementes
A partir do extrato das sementes de milho foram preservados dez isolados
bacterianos, na coleção do Laboratório de Bacteriologia do ICIAG/UFU, sob os
números UFU G13, UFU G41, UFU G47, UFU G48, UFU G72, UFU G73, UFU G74,
UFU G75, UFU G76 e UFU G77.
4.2.2 Caracterização bioquímica e fisiológica dos isolados bacterianos
Os isolados UFU A18 e UFU E43 (Tabela 3) foram usados como parâmetro
comparativo para os testes bioquímicos em relação aos demais isolados, pois já haviam
sido caracterizados molecularmente como P. ananatis.
Todos os isolados bacterianos detectados nas sementes de milho (Tabela 3)
foram caracterizados como: Gram negativos, fermentação da glicose, colônias amarela
em meio YDC, oxidade, catalase, arginina dihidrolase, produção de ácidos a partir do
inositol, sorbitol, sacarose, D-arbinose, motilidade, liquefação da gelatina e crescimento
a 37ºC todos positivos, sendo caracterizados como P. ananatis.
Todos os isolados bacterianos foram patogênicos em plantas de milho (Tabela
3), reproduzindo os sintomas de lesões encharcadas, característico de P. ananatis,
confirmando o postulado de Koch. Todos os isolados bacterianos obtidos de extratos de
sementes de milho apresentaram a reação de hipersensibilidade em plantas de fumo.
O meio de cultura semi seletivo PA 20 foi usado para a detecção de P. ananatis
em sementes de cebola (GOSZCZYNSKA et al., 2006b), com uma média de 6-7 dias
após incubação as colônias apresentavam-se amarelas, brilhantes, formato circular e
com centro escurecido. Entre os lotes de sementes infestadas houve variação para
presença de colônia de 2.2 x 103 UFC.g-1 a 5.0 x 106 UFC.g-1.
14
Tabela 3 - Características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de isolados de Pantoea ananatis em sementes de milho. Uberlândia, MG, 2015.
Testes Bioquímicos
Isolados UFU
A18
E43
G13
G41
G77
G47
G48
G72
G73
G74
G75
G76
GRAM - - - - - - - - - - - -
Oxidativa/Fermentativa F F F F F F F F F F F F
YDC (cor da colônia amarela) + + + + + + + + + + + +
Oxidase - - - - - - - - - - - -
Catalase + + + + + + + + + + + +
Arginina dihidrolase + + + + + + + + + + + +
Produção de ácidos – Inositol + + + + + + + + + + + +
Produção de ácidos – Sorbitol + + + + + + + + + + + +
Produção de ácidos – Sacarose + + + + + + + + + + + + Produção de ácidos – D- arabinose + + + + + + + + + + + +
Motilidade + + + + + + + + + + + +
Liquefação da gelatina + + + + + + + + + + + +
Crescimento a 37ºC + + + + + + + + + + + + Reação de hipersensibilidade (Fumo) + + + + + + + + + + + +
Inoculação no hospedeiro + + + + + + + + + + + +
5. CONCLUSÕES
Este é o primeiro relato da detecção de Pantoea ananatis em sementes de milho.
O meio de cultura semi seletivo PA20 foi eficiente para a detecção da bactéria
Pantoea ananatis nas sementes.
15
REFERÊNCIAS
AMARAL, A. L.; DAL SOGLIO, F. K.; WERNZ NETO, A. W.; PEGORARO, D. G.;
VACCARO, E.; FANTIN, G. M. & BARBOSA NETO, J. F. Determinação de agentes
causais de manchas semelhantes a mancha de Phaeosphaeria em milho (Zea mays
L.). In: XXIV CONGRESSO BRASILEIRO DE MILHO E SORGO, 2006,
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