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- Índice de Tabelas -

Rafael de Cirne e Patacas

Dissertação de Mestrado em Química

Orientador: Professor Doutor Carlos Pereira

Desenvolvimento, Caracterização e Optimização

de um biossensor amperométrico para a

determinação de Nitrato baseado em

microinterfaces gelificadas


Rafael de Cirne e Patacas

Dissertação submetida para obtenção do grau de mestre em Química pela

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Junho de 2007

Orientador: Professor Doutor Carlos Pereira

Desenvolvimento, Caracterização e Optimização

de um biossensor amperométrico para a

determinação de Nitrato baseado em

microinterfaces gelificadas


Agradecimentos

Aos meus Pais que me convenceram a fazer o mestrado.

Aos meus irmãos que não fizeram nada mas são decorativos.

Ao Prof. Carlos Pereira pela pessoa fantástica e paciente que é e por sempre me ter

ajudado até ao fim neste trabalho.

À Susana por me ter aliviado e por estar sempre disponível para mim.

Aos meus amigos, em especial a beta por me ter obrigado a trabalhar, pelo apoio pela

amizade e por me ter feito companhia este tempo.

Um agradecimento ao grupo de Electroquímica e Química Analítica que me recebeu,

assim como aos colegas de laboratório com quem convivi e que alegravam o

ambiente.

Um agradecimento à colaboração que existiu com o Grupo Ferroeléctricos do

Departamento de Física, nomeadamente, pela disponibilidade e simpatia

demonstradas pelo Prof. Doutor Paulo Simeão.

A todos um Muito Obrigado


i

Índice Geral ÍNDICE GERAL ........................................................................................................................................ I ÍNDICE DE TABELAS .......................................................................................................................... III ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................... IV ÍNDICE DE EQUAÇÕES......................................................................................................................VII LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS...................................................................................... IX OBJECTIVO ........................................................................................................................................ XIII 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................1

1.1 BIOSSENSORES....................................................................................................................................1 1.1.1 Retrospectiva da história dos biossensores ...............................................................................3 1.1.2 Tipos de biossensores ................................................................................................................8 1.1.3 Detecção amperométrica .........................................................................................................11 1.1.3.1 Oxidorredutases como biorreagentes ...................................................................................11 1.1.3.2 Selectividade e controlo da medida de metabolitos ..............................................................12 1.1.3.3 Tipos de eléctrodos enzimáticos............................................................................................14 1.1.3.3 Imunossensores amperométricos ..........................................................................................16

1.2 ENZIMAS...........................................................................................................................................16 1.2.1 Generalidades ..........................................................................................................................16 1.2.2 Especificidade enzimática e nomenclatura..............................................................................18 1.2.3 A nitrato redutase ....................................................................................................................19 1.2.4 Cinética enzimática..................................................................................................................21 1.2.5 Co-factores enzimáticos...........................................................................................................23 1.2.6 Efeitos da temperatura, pH e força iónica...............................................................................24 1.2.7 Processos de imobilização de moléculas .................................................................................28

1.3 ITIES – INTERFACES ENTRE DUAS SOLUÇÕES ELECTROLÍTICAS IMISCÍVEIS....................................32 1.3.1 Evolução ..................................................................................................................................32 1.3.2 Aplicações analíticas das ITIES ..............................................................................................33 1.3.3 Polarizabilidade das ITIES......................................................................................................34

1.4 TENSÃO SUPERFICIAL E ÂNGULOS DE CONTACTO..............................................................................35 1.4.1 A goniometria ..........................................................................................................................38 1.4.2 Medição dos ângulos de contacto ............................................................................................39

1.5 CONSTANTES DIELÉCTRICAS E DE RELAXAÇÃO DIELÉCTRICA ...........................................................39 1.6 DESENHO FACTORIAL .......................................................................................................................45

1.6.1 Desenhos factoriais a dois níveis.............................................................................................47 2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ..............................................................................................52

2.1 MATERIAL E REAGENTES UTILIZADOS AO LONGO DO TRABALHO......................................................52 2.2 MÉTODOS UTILIZADOS AO LONGO DO TRABALHO.............................................................................54

2.2.1 Preparação dos eléctrodos de Ag/AgCl ...................................................................................54 2.2.2 Síntese do tetrafenilborato de tetraoctilamónio (TOATPB).....................................................54 2.2.3 Preparação dos géis ................................................................................................................55 2.2.4 Preparação da célula electroquímica de 4 eléctrodos.............................................................55 2.2.5 Técnica: Voltametria cíclica....................................................................................................57 2.2.6 Técnica: Espectroscopia de Impedância Electroquímica ........................................................59 2.2.7 Caracterização da interface.....................................................................................................63 2.2.8 Técnica: Goniometria, medição de ângulos de contacto .........................................................65

3 RESULTADOS......................................................................................................................................67 3.1 OPTIMIZAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMA................................................................................67 3.2 DADORES ENZIMÁTICOS...................................................................................................................75 3.3 CARACTERIZAÇÃO DOS SUPORTES ENZIMÁTICOS..............................................................................99


ii

3.4 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ASSOCIADOS ÀS PROPRIEDADES DIELÉCTRICAS.......................105 4 CONCLUSÕES E SUGESTÕES DE TRABALHO FUTURO .......................................................111

REFLEXÃO FINAL..................................................................................................................................112 ANEXOS .................................................................................................................................................113 BIBLIOGRAFIA....................................................................................................................................121

- Ìndice de figuras-

iii

Índice de Tabelas Tabela 1: ........................................................................................................................... 7 Tabela 2: ......................................................................................................................... 10 Tabela 3: ......................................................................................................................... 15 Tabela 4: ......................................................................................................................... 31 Tabela 5: ......................................................................................................................... 47 Tabela 6: ......................................................................................................................... 48 Tabela 7: ......................................................................................................................... 50 Tabela 8: ......................................................................................................................... 52 Tabela 9: ......................................................................................................................... 62 Tabela 10: ....................................................................................................................... 76 Tabela 11: ....................................................................................................................... 94 Tabela 12:. ...................................................................................................................... 99 Tabela 13: ....................................................................................................................... 99 Tabela 14: ..................................................................................................................... 102 Tabela 15: ..................................................................................................................... 108 Tabela 16: ..................................................................................................................... 113 Tabela 17: ..................................................................................................................... 114 Tabela 18: ..................................................................................................................... 116 Tabela 19: ..................................................................................................................... 117 Tabela 20: ..................................................................................................................... 118 Tabela 21: ..................................................................................................................... 119 Tabela 22: ..................................................................................................................... 120 Tabela 23: ..................................................................................................................... 120

- Ìndice de figuras-

iv

Índice de Figuras Figura 1:............................................................................................................................ 2 Figura 2:............................................................................................................................ 2 Figura 3:............................................................................................................................ 3 Figura 4:............................................................................................................................ 9 Figura 5:.......................................................................................................................... 13 Figura 6:.......................................................................................................................... 17 Figura 7:.......................................................................................................................... 20 Figura 8:.......................................................................................................................... 26 Figura 9:.......................................................................................................................... 27 Figura 10:........................................................................................................................ 28 Figura 11:........................................................................................................................ 29 Figura 12:........................................................................................................................ 35 Figura 13:........................................................................................................................ 36 Figura 14:........................................................................................................................ 37 Figura 15:........................................................................................................................ 41 Figura 16:........................................................................................................................ 42 Figura 17:........................................................................................................................ 56 Figura 18:........................................................................................................................ 56 Figura 19:........................................................................................................................ 57 Figura 20:........................................................................................................................ 58 Figura 21:........................................................................................................................ 60 Figura 22:........................................................................................................................ 61 Figura 23:........................................................................................................................ 63 Figura 24:........................................................................................................................ 64 Figura 25:........................................................................................................................ 65 Figura 26:........................................................................................................................ 66 Figura 27:........................................................................................................................ 67 Figura 28:........................................................................................................................ 68 Figura 29:........................................................................................................................ 69 Figura 30:........................................................................................................................ 70 Figura 31:........................................................................................................................ 71 Figura 32:........................................................................................................................ 72 Figura 33:........................................................................................................................ 73 Figura 34:........................................................................................................................ 73 Figura 35......................................................................................................................... 74 Figura 36:........................................................................................................................ 75 Figura 37:........................................................................................................................ 76 Figura 38:........................................................................................................................ 77 Figura 39:........................................................................................................................ 78 Figura 40:........................................................................................................................ 78 Figura 41:........................................................................................................................ 79 Figura 42:........................................................................................................................ 79 Figura 43:........................................................................................................................ 80 Figura 44:........................................................................................................................ 81 Figura 45:........................................................................................................................ 81

- Ìndice de Figuras-

v

Figura 46:........................................................................................................................ 82 Figura 47:........................................................................................................................ 82 Figura 48:........................................................................................................................ 83 Figura 49:........................................................................................................................ 83 Figura 50:........................................................................................................................ 83 Figura 51:........................................................................................................................ 84 Figura 52:........................................................................................................................ 84 Figura 53:........................................................................................................................ 85 Figura 54:........................................................................................................................ 85 Figura 55:........................................................................................................................ 86 Figura 56:........................................................................................................................ 86 Figura 57:........................................................................................................................ 87 Figura 58:........................................................................................................................ 87 Figura 59:........................................................................................................................ 88 Figura 60:........................................................................................................................ 88 Figura 61:........................................................................................................................ 88 Figura 62:........................................................................................................................ 88 Figura 63:........................................................................................................................ 89 Figura 64:........................................................................................................................ 90 Figura 65:........................................................................................................................ 90 Figura 66:........................................................................................................................ 91 Figura 67:........................................................................................................................ 91 Figura 68:........................................................................................................................ 92 Figura 69:........................................................................................................................ 92 Figura 70:........................................................................................................................ 92 Figura 71:........................................................................................................................ 92 Figura 72:........................................................................................................................ 92 Figura 73:........................................................................................................................ 94 Figura 74:........................................................................................................................ 95 Figura 75:........................................................................................................................ 95 Figura 76:........................................................................................................................ 96 Figura 77:........................................................................................................................ 97 Figura 78:........................................................................................................................ 97 Figura 79:........................................................................................................................ 98 Figura 80:........................................................................................................................ 98 Figura 81:...................................................................................................................... 101 Figura 82:...................................................................................................................... 101 Figura 83:...................................................................................................................... 103 Figura 84:...................................................................................................................... 104 Figura 85:...................................................................................................................... 105 Figura 86:...................................................................................................................... 106 Figura 87:...................................................................................................................... 107 Figura 88:...................................................................................................................... 109 Figura 89:...................................................................................................................... 110 Figura 90:...................................................................................................................... 115 Figura 91:...................................................................................................................... 115 Figura 92:...................................................................................................................... 115 Figura 93:...................................................................................................................... 115 Figura 94:...................................................................................................................... 117

- Ìndice de Figuras-

vi

Figura 95:...................................................................................................................... 117 Figura 96:...................................................................................................................... 117 Figura 97:...................................................................................................................... 117 Figura 98:...................................................................................................................... 119 Figura 99:...................................................................................................................... 119 Figura 100:.................................................................................................................... 119 Figura 101:.................................................................................................................... 119

- Ìndice de Equações-

vii

Índice de Equações Eq. 1................................................................................................................................ 12 Eq. 2................................................................................................................................ 12 Eq. 3................................................................................................................................ 12 Eq. 4................................................................................................................................ 19 Eq. 5................................................................................................................................ 21 Eq. 6................................................................................................................................ 21 Eq. 7................................................................................................................................ 21 Eq. 8................................................................................................................................ 21 Eq. 9................................................................................................................................ 21 Eq. 10.............................................................................................................................. 22 Eq. 11.............................................................................................................................. 22 Eq. 12.............................................................................................................................. 22 Eq. 13.............................................................................................................................. 22 Eq. 14.............................................................................................................................. 23 Eq. 15.............................................................................................................................. 25 Eq. 16.............................................................................................................................. 25 Eq. 17.............................................................................................................................. 26 Eq. 18.............................................................................................................................. 27 Eq. 19.............................................................................................................................. 38 Eq. 20.............................................................................................................................. 40 Eq. 21.............................................................................................................................. 40 Eq. 22.............................................................................................................................. 40 Eq. 23.............................................................................................................................. 41 Eq. 24.............................................................................................................................. 41 Eq. 25.............................................................................................................................. 42 Eq. 26.............................................................................................................................. 42 Eq. 27.............................................................................................................................. 43 Eq. 28.............................................................................................................................. 43 Eq. 29.............................................................................................................................. 44 Eq. 30.............................................................................................................................. 44 Eq. 31.............................................................................................................................. 44 Eq. 32.............................................................................................................................. 44 Eq. 33.............................................................................................................................. 44 Eq. 34.............................................................................................................................. 44 Eq. 35.............................................................................................................................. 45 Eq. 36.............................................................................................................................. 48 Eq. 37.............................................................................................................................. 49 Eq. 38.............................................................................................................................. 49 Eq. 39.............................................................................................................................. 49 Eq. 40.............................................................................................................................. 58 Eq. 41.............................................................................................................................. 60 Eq. 42.............................................................................................................................. 60 Eq. 43.............................................................................................................................. 61

- Ìndice de Equações-

viii

Eq. 44.............................................................................................................................. 71 Eq. 45.............................................................................................................................. 72

- Lista de Símbolos e Abreviaturas-

ix

Lista de Símbolos e Abreviaturas

1,2-DCE 1,2-dicloroetano 1,4-DBB 1,4-dibromobutano a Actividade da espécie

A Área interfacial (cm2) A Factor de Arrhenius ou factor pré-exponencial a parâmetro interacção entre as moléculas A. m. m. Área média por molécula ADN Ácido desoxirribonucleico ARF / FRA Analisador de Resposta de Frequência BTPPACl Cloreto de bis(tetrapentilfenil)amónio BTPPA-Ps - Sal de Fenosafranina e Bis(trifenil fosphoranilideno) Amónio BTPPATPBCl Tetraquis(4-clorofenil)borato de bis(tetrapentilfenil)amónio C Capacidade CAGR Crescimento composto anual composto (Compound Annual GRowth) CAT Complexação Aquosa seguida de Transferência Cdc Capacidade da dupla camada

Cenz Capacidade de determinada concentração da enzima Clb Capacidade da linha de base Cr Capacidade de relaxação dieléctrica

Cv Capacidade no vazio

Cys Cisteína D Coeficiente de difusão (cm2.s-1) DBS 1,3:2,4-dibenzilideno sorbitol DMF Decametilferroceno (C20H30Fe)

E Enzima Ea Energia de activação

EIE / EIS Espectroscopia de Impedância Electroquímica ES Complexo enzima-substrato ESI Eléctrodo selectivo de iões FAD FLAVINA ADENINA DINUCLEÓTIDO FET Field Effect Transistor – FET) FET Field Effect Transistor – FET) gi Factor característico do modo de relaxação dieléctrica

GOx Glucose oxidase heme-Fe Grupo Heme

- Objectivo

x

I Intensidade de corrente I0 Intensidade de corrente de um dieléctrico ideal

Ic Intensidade de corrente capacitiva

Icond Intensidade de corrente de condução de um dieléctrico

If Intensidade de corrente faradaica

Ip Intensidade de corrente de pico

Ip- Intensidade de corrente para a transferência iónica catódica

Ip+ Intensidade de corrente para a transferência iónica anódica

Ir Intensidade de corrente de relaxação dieléctrica

ITIES Interface entre duas soluções electrolíticas imiscíveis ITO Óxido de índio e estanho IUB International Union of biochemistry IUB International Union of biochemistry IUBMB International Union of biochemistry and molecular biology IUBMB International Union of biochemistry and molecular biology IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada / International Union for

Pure and Applied chemistry k Constante de velocidade da reacção K Constante de equilíbrio kDa KiloDalton KM Constante de Michaelis-Menten

KMapp Constante de Michaelis-Menten aparente

KTPBCl Tetraquis(4-clorofenil)borato de potássio L Indutância LCR METER Medidor de Indutâncias, Capacidades e Resistências M Molar, Mole.litro-1

M Molar, Mole.litro-1

macro-ITIES Macrointerface entre duas soluções electrolíticas imiscíveis micro-ITIES Microinterface entre duas soluções electrolíticas imiscíveis Mo-MPT Mo-molibdenopterina n Número de electrões n Número de moles NAD(H) Nicotinamida adenina dinucleótido NAD(P)H Nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato) NAD(P)H Nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato) NADH Nicotinamida adenina dinucleótido NaR Nitrato redutase NaTPB Tetrafenilborato de sódio o-NPOE Éter orto-nitrofeniloctílico P Produto

- Objectivo

xi

PDT 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazina PET Polietilenoteraftalado pH -log |H+| PI Ponto isoeléctrico de enzimas pKa Logaritmo da constante de acidez. Definido como -Log10(Ka) o pH ao qual

metade dos grupos estão ionisados.

pKa Logaritmo da constante de acidez. Definido como -Log10(Ka) o pH ao qual metade dos grupos estão ionisados.

PsTPBCl - Sal de Fenosafranina e Tetraquis(4-Clorofenil)-Borato, síntese própria PVC Policloreto de vinilo Q Elemento de fase constante r Coeficiente de correlação r Raio R Constante dos gases R Resistência Rc Resistência de condução dieléctrica

Rr Resistência de relaxação dieléctrica

Rsol Resistência da solução

Rtc Resistência à transferência de carga

S Substrato T Temperatura TCI Transferência por Complexação Interfacial TCO Transferência seguida de Complexação em fase Orgânica TDI Transferência por Dissociação Interfacial THF Tetraidrofurano THpABr Brometo de tetraheptilamónio TOABr Brometo de tetraoctilamónio TOATPB Tetrafenilborato de tetraoctilamónio TOATPBCl Tetraquis(4-clorofenil)borato de tetraoctilamónio UV Ultravioleta V Potencial V Volume da camada enzimática Vmax Velocidade máxima

W Warburg YSI Yellow Spring Instruments Z Impedância total Z’ Componente real da impedância Z’’ Componente imaginária da impedância Zf Impedância faradaica

Zw Impedância de Warburg

- Objectivo

xii

β Parâmetro polidispersivo do sistema

∆E Campo eléctrico

∆ε Amplitude dieléctrica

AdsG∆ energia de Gibbs do processo de adsorção

ε Constante dieléctrica

ε’ Componente real da constante dieléctrica

ε’’ Componente imaginária da constante dieléctrica

ε0 Constante dieléctrica no vazio

εr Constante dieléctrica relativa

σ Desvio padrão

σr Desvio padrão relativo

φ Ângulo de fase

γ Tensão superficial

γlv Tensão superficial líquido-vapor

γsl Tensão superficial sólido-líquido

γslv Tensão superficial sólido-líquido-vapor

γsv Tensão superficial sólido-vapor

λ Parâmetro relativo à dispersão dos tempos de condução dieléctrica

ν Velocidade da reacção enzimática

v Velocidade de varrimento

θ Ângulo de contacto

θa Ângulo de contacto de avanço

θh Ângulo de contacto de histerese

θr Ângulo de contacto de regresso

τc Tempo de condução dieléctrica

τr Tempo de relaxação dieléctrica

ω Frequência angular

ωc Frequência de condução dieléctrica

ωr Frequência de relaxação dieléctrica

- Objectivo

xiii

Objectivo

Na sequência do trabalho desenvolvido neste grupo de investigação, pretendeu-se

com a realização deste trabalho estudar o comportamento de adsorção de nitrato em

interfaces líquido-líquido. Pretendendo-se ainda estudar o comportamento das

interfaces líquido-líquido em presença da enzima nitrato redutase em diferentes

condições experimentais de modo a optimizar as condições de adsorção quando se

introduzem espécies como o anião nitrato ou a molécula dadora. Com este propósito,

procedeu-se à caracterização dos vários componentes do biossensor que se pretendia

modificar, nomeadamente, da biomolécula e das características específicas deste tipo

de interfaces. A caracterização foi efectuada utilizando técnicas electroquímicas como

a voltametria cíclica ou a espectroscopia de impedâncias, seguida utilizando um

desenho factorial de planeamento experimental.

Pretendeu-se ainda dar continuidade ao trabalho de mestrado efectuado por Ricardo

M. Silva avaliando as características dieléctricas de diferentes soluções. O objectivo

deste trabalho foi, assim, o de tentar estabelecer relações entre os dados obtidos a

baixas frequências 20 Hz e 1 MHz com as de elevadas frequências 0,1 MHz a 1000

MHz.

-Capítulo 1-

1

1 Introdução

A análise de aniões, especialmente oxo-aniões, apresenta um desafio interessante

para todos os analistas. Por exemplo, em efluentes de estações nucleares e numa

ampla variedade de contaminações em aquíferos o nitrato apresenta-se como um

contaminante importante. Apesar de o anião nitrato não ser uma substância com

toxicidade elevada, a sua presença em produtos alimentares, fertilizantes e sistemas

aquáticos (em particular águas de consumo) é um factor importante visto poder causar

a oxidação da hemoglobina e ser um composto de partida para a síntese de

compostos tóxicos com o grupo nitrito ou compostos N-nitroso que apresentam

actividade carcinogénica1 daí a importância de se realizar um controlo in situ.

1.1 Biossensores Os biossensores são definidos como qualquer dispositivo de detecção que incorpore tanto um

organismo vivo ou produtos derivados de sistemas biológicos (enzimas, anticorpos, DNA, etc.), como um

transdutor que fornece a indicação, sinal ou outra forma de reconhecimento de uma substância específica

no ambiente2.

Os objectivos de simplificação dos métodos analíticos e portabilidade são comuns a

todas as áreas da química analítica. Assim nos últimos anos tem-se tornado

disponíveis no mercado um maior número de detectores portáteis que permitem a

redução do tamanho da amostra e economias de tempo de análise. Os biossensores

potenciaram o desenvolvimento de uma família de técnicas electroquímicas que

oferecem rapidez e simplicidade3. Este género de detector permite realizar as mais

variadas tarefas como: efectuar controlo em-linha a nível industrial, análise ambiental

em tempo real, automatização de análises bioquímicas, análise in-vivo, detecção de

substâncias biológicas relevantes (como hormonas e drogas de abuso) e detecção de

guerra química4,5. Geralmente um biossensor permite o uso de métodos “limpos” e de

baixo custo sem recurso a pré-tratamentos morosos e com necessidade de grandes

volumes de amostra. O seu uso, na maioria dos casos, não obriga ao recurso a

técnicos especialistas podendo nalguns casos dispensar o uso de reagentes, e

aparecendo tanto como aparelhos de uso contínuo como descartáveis. A área de

diagnóstico, como um todo, representa um mercado imenso, bem implementado e em

-Capítulo 1-

2

contínua expansão. Neste mercado encontra-se uma das maiores razões de sucesso

e a maior área de aplicação dos biossensores. Prevê-se que o mercado global de

biossensores e outros produtos bioelectrónicos cresça dos $6.1 mil milhões de dólares

em 2004 para $8.2 mil milhões de dólares em 2009 (Figura 1), tendo um crescimento

anual médio da ordem dos 6.3%6. Os biossensores de glucose constituíram a quase

totalidade das vendas em 2003, no entanto, as vendas de outro material bioelectrónico

estão em ascensão. Assim as aplicações às ciências biomédicas e da vida dominam o

mercado com 99% deixando a monitorização ambiental num distante segundo lugar.

Figura 1: Valores projectados para o Mercado de biossensores e bioelectrónica até 20096 (fonte: BUSINESS COMMUNICATIONS COMPANY, INC., 25 Van Zant Street, Norwalk)

Figura 2: Expansão esperada para o mercado para nano biossensores que se prevê que venha a ser de um crescimento composto anual (cagr) de 92% até 2008 apenas com as aplicações devidas à aplicação da nanotecnologia ao diagnóstico médico7. (fonte: Front line Strategic Consulting Inc. (San Mateo ,CA), 2003)

Assim a pesquisa de biossensores tornou-se bastante atraente. Apesar da sua

importância económica emergente convém não esquecer da sua origem como simples

método de diagnóstico para quantificar glucose no sangue. O seu sucesso gerou uma

-Capítulo 1-

3

miríade de novos métodos de preparação de biossensores. Um tema comum em

muitas aproximações é a utilização de reagentes biológicos. Este tema tem como

expoente máximo de simplificação a integração do elemento biológico com o elemento

de medição num dispositivo em bloco. Isto corresponde ao conceito básico de

biossensor, uma fase “biológica” que interactua com a amostra em contacto com uma

parte “física” ou transdutor químico. Um biossensor típico apresenta três componentes,

o elemento de reconhecimento, uma estrutura de transdução e um elemento de

amplificação.

Figura 3:Representação esquemática de um biossensor 5

A utilização de um elemento biológico permite fazer uso da especificidade única das

biomoléculas para as espécies alvo. O sinal traduzido no biossensor é secundário

resultante da reacção entre o material de bio-reconhecimento e o analito alvo (por

oposição ao sinal obtido num eléctrodo clássico que provém directamente da reacção

do analito com este).

Para se obter um bioeléctrodo é necessário conseguir elevados níveis de

especificidade, boa estabilidade nas condições de operação (temperatura, pH, força

iónica, etc.) e também nas condições de armazenamento bem como retenção de

actividade biológica, resposta em tempo útil precisa e reprodutível.

1.1.1 Retrospectiva da história dos biossensores

A selectividade é um dos maiores problemas na química analítica, geralmente, é

apenas obtida através de um apertado controlo das condições experimentais. Ora, na

-Capítulo 1-

4

natureza encontram-se reagentes altamente selectivos na forma de enzimas

anticorpos e outros.

O recurso a enzimas apresenta várias vantagens, em particular uma feliz

combinação de selectividade com sensibilidade. Permitem ainda a utilização de várias

tecnologias de transdução. Free e Free revolucionaram os procedimentos analíticos

com a implementação de tiras enzimáticas8. No entanto estas apresentavam diversos

inconvenientes de modo que se procurou uma nova abordagem, conseguida por Clark

e Lyons9 que prepararam o primeiro biossensor propriamente dito alterando um

eléctrodo de oxigénio e, subsequentemente modificando-o com recurso a enzimas

O conceito foi testado numa experiência usando glucose oxidase imobilizada na

superfície de um eléctrodo de oxigénio. Observando-se uma diminuição da

concentração de oxigénio proporcional à concentração de glucose. No artigo

correspondente apareceu pela primeira vez o termo “eléctrodo enzimático”. Apesar

disto, foram Updike e Hicks10 que, extrapolando o conceito, resolveram os problemas

de ordem prática necessários para construir um eléctrodo enzimático sensível a

glucose.

O sensor foi a base de numerosas variações do seu desenho básico e muitas outras

enzimas (oxidases) foram imobilizadas. Assim o desenho de Clark foi tão bem

sucedido que muitos biossensores experimentais e pelo menos um biossensor

comercial ainda são construídos segundo o original. No entanto, hoje em dia, prefere-

se, como alternativa, a medição de peróxido de hidrogénio. Destes destacam-se os

biossensores produzidos pela companhia Yellow Springs Instrument Company (Ysi,

Ohio, EUA). O seu biossensor de glucose foi criado em 1975 baseado na detecção

amperométrica do peróxido de hidrogénio. Este foi o primeiro biossensor a ser

produzido com fins comerciais.

O primeiro eléctrodo enzimático potenciométrico foi construído por Guibault e

Montalvo11. Tratava-se de um sensor de ureia baseado em urease imobilizada num

eléctrodo de membrana selectivo a amónio.

O uso de transdutores térmicos em biossensores foi proposto em 197412 sendo os

novos dispositivos baptizados como sondas térmicas enzimáticas ou termístores

enzimáticos.

Em 1975 apareceram os primeiros óptodos, sensores de fibra óptica com indicador

imobilizado aplicados na detecção e quantificação de dióxido de carbono ou oxigénio

criados por Lubbers e Opitz12. Existem também óptodos sensíveis a etanol que usam a

respectiva oxidase imobilizada. Estes sistemas são utilizados para monitorização in-

-Capítulo 1-

5

vivo de pH, CO2 e O2 apesar de ainda não estarem disponíveis comercialmente em

grande variedade.

No mesmo ano os biossensores sofreram outro avanço importante quando Divie12

sugeriu que se imobilizassem bactérias usando-as depois como elemento biológico

criando um eléctrodo microbiano para a medição de álcool.

No ano subsequente, Clemens et al12,13. Incorporaram um biossensor de glucose

num pâncreas artificial (que foi mais tarde comercializado sob o nome de Biostator).

Também nesse ano foi desenvolvido um sensor de lactato que recorria a um mediador

solúvel, que, apesar de não ter sido comercializado, se revelou o precursor de uma

nova geração de biossensores.

Uma das maiores inovações deu-se em 1982 quando Shichiri et al12. Descreveram o

primeiro eléctrodo enzimático em forma de agulha para implantação subcutânea. No

entanto também neste caso não está ainda disponível uma versão comercial.

A ideia de construir imunossensores imobilizando anticorpos na superfície de um

transdutor electrostático ou piezoeléctrico data da década de 1970 mas, foi o artigo de

Liedberg et al12. Que abriu caminho para o seu sucesso comercial. Nele era descrito o

uso de ressonância de plasma de superfície para seguir reacções de afinidade em

tempo real. Daqui nasceu o BIAcore (Pharmaca, Suécia) lançado em 1990 com base

nessa tecnologia.

Durante os anos 80 foi, pela primeira vez, atingido o sucesso económico em grande

escala. A companhia YSI construiu um negócio regular e florescente, não chegando no

entanto a cumprir as previsões optimistas da década anterior. O problema residia no

custo dos biossensores da época que os tornava pouco competitivos face a outras

tecnologias disponíveis à época.

Em 1984 foi publicado um artigo sobre o uso de ferroceno e dos seus derivados

como mediadores imobilizados para uso com oxidorredutases. Estes eram

componentes essenciais para a construção de eléctrodos enzimáticos pouco

dispendiosos, e como tal, formaram a base para os primeiros eléctrodos enzimáticos

impressos em placas lançados pela companhia MediSense (Cambridge, EUA) em

1987. Este sistema do tamanho de uma caneta destinava-se à medição caseira de

glucose no sangue. Com as diferentes formas deste eléctrodo a MediSense aumentou

o seu volume de vendas abruptamente atingindo 175 milhões de dólares por ano em

1986 quando foram absorvidos pela Abbot. A Boehringer Mannheim (actual Roche

Diagnostics), Bayer e Lifescan começaram mais recentemente a produzir sensores

mediados concorrentes e em conjunto dominam o mercado de medições domésticas

-Capítulo 1-

6

de glucose a nível mundial estando a substituir rapidamente a fotometria de

reflectância de Clemens.

As publicações científicas actuais contêm agora descrições de uma larga variedade

de dispositivos que exploram as enzimas, ácidos nucleicos, anticorpos, células

intactas e receptores celulares em combinação com transdutores electroquímicos,

ópticos, piezoeléctricos e termométricos. Com cada permutação obtêm-se miríades de

estratégias alternativas de transdução, e, com cada uma, novas soluções para

problemas analíticos nas mais variadas áreas.

Estes acontecimentos mostram que, apesar de o grande crescimento na área se ter

dado nos anos 90 e de a época dos maiores avanços se ter dado nos anos 80, esta

década promete seguir-lhes os passos. No entanto convém recordar que o sucesso e

a maturidade comercial dos biossensores são restritos a algumas, poucas, aplicações

e que estas são o resultado de muita pesquisa e desenvolvimento tornando-se

importantes apenas aonde o mercado justificava o investimento.

-Capítulo 1-

7

Tabela 1: Marcos na história dos biossensores14

BIOSSENSORES

Marcos da história dos biossensores

1916 Primeira comunicação referente à imobilização de proteínas: adsorção da invertase em carvão activado.

1922 Primeiro eléctrodo de vidro para a medição de pH. 1956 Aparecimento do eléctrodo de oxigénio. 1962 Primeira descrição de um biossensor: eléctrodo enzimático amperométrico

para glucose. 1969 Primeiro biossensor potenciométrico: Urease imobilizada num eléctrodo de

amónia permite detectar ureia. 1970 Invenção do transístor de campo-efeito sensível a iões. (Ion-Selective Field-

Effect Transistor (ISFET)) 1972/5 Primeiro biossensor comercial: biossensor de glucose produzido por Yellow

Springs Instruments . 1975 Primeiro biossensor baseado em micróbios.

Primeiro imunossensor: ovalbumina num fio de platina. Invenção do óptodo pO2 / pCO2 .

1976 Primeiro pâncreas artificial de cabeceira (Miles). 1980 Primeiro sensor óptico de pH para gases no sangue. 1982 Primeiro biossensor baseado em fibras ópticas. 1983 Primeiro imunossensor de ressonância de superfície de plasma 1984 Primeiro biossensor amperométrico mediado: ferroceno usado em conjunto

com glucose oxidase para a detecção de glucose. 1987 Lançamento do biossensor de glucose no sangue MediSense ExacTech™. 1990 Lançamento de um biossensor baseado em SPR Pharmacia BIACore . 1992 Lançamento de um analisador de sangue do tamanho de uma mão pela i-

STAT. 1996 Lançamento do Glucocard. 1996 A empresa Abbott compra a MediSense por 867 milhões de dólares. 1998 Lançamento do biossensor de glucose no sangue LifeScan FastTake. 1998 Fusão da Empresa Roche com a Boehringer Mannheim para formar a Roche

Diagnostics. 2001 A empresa LifeScan compra o negócio de testes de glucose à Inverness por

1.3mil milhões de dólares.

-Capítulo 1-

8

1.1.2 Tipos de biossensores

Provavelmente é mais correcto afirmar que a maioria dos analisadores biológicos

tradicionais se baseiam em métodos espectro-fotométricos, em que a reacção de

reconhecimento está relacionada com a determinação de um indicador colorimétrico,

fluorescente ou luminescente. Por outro lado os sensores químicos têm recorrido

frequentemente a técnicas electroquímicas, por exemplo o eléctrodo de pH

(potenciometria) e o eléctrodo de oxigénio de Clark (amperometria)15.

Os biossensores não estão restritos às três categorias acima descritas. Em princípio

qualquer variável que esteja relacionada com a reacção de reconhecimento poderá ser

usada para gerar o sinal traduzido.

De facto, o campo dos biossensores está a ser desenvolvido na interface entre as

tecnologias emergentes combinando várias disciplinas (física, química e biologia) com

a electrónica. Os avanços em várias áreas tais como: produção de polímeros, óptica,

electrónica, etc. revelaram novos materiais e métodos disponíveis para a exploração

como biossensores. Pode-se, por isso, esperar que os parâmetros de medição

relacionados com os sistemas biossensores se tornem cada vez mais diversificados,

bem como as técnicas de detecção empregues.

Fundamentalmente existem dois tipos de biossensores, dependendo do modo de

geração de sinal16. Os sensores de bioafinidade directa utilizam o evento de ligação

para detectar as substâncias. A ligação do analito ao bioligando, que está imobilizado,

resulta numa alteração conformacional da biomolécula e/ou alteração física no meio

de imobilização (alteração de carga, temperatura ou cor, etc.). O segundo tipo de

sensor é o biossensor enzimático/metabólico. Aqui, o reconhecimento do substrato

pelo receptor imobilizado (enzimas ou outro derivado biológico) é seguido

imediatamente pela conversão no correspondente produto, o qual é detectado.

Uma combinação de ambos os princípios, ligação do analito sem a sua conversão

química e geração do sinal por conversão em substância auxiliar, é efectuada nos

biossensores catalíticos usados para detecção de grupos prostéticos, inibidores em

imunossensores enzimáticos.

As vantagens de um procedimento de imobilização irreversível das moléculas à

superfície do biossensor são várias tais como a possibilidade de construir analisadores

compactos e portáteis que sejam ao mesmo tempo reprodutíveis17. Particularmente

interessante, desde que a biomolécula de reconhecimento se mantenha ligada ao

-Capítulo 1-

9

transdutor, é a sua reutilização. Em alguns casos a molécula imobilizada é mais

estável do que as espécies em solução. São igualmente influenciadas, aquando da

imobilização, pelo microambiente podendo ter cinéticas consideravelmente diferentes

do que teriam em solução (o que não será uma vantagem em todos os casos). A

imobilização da enzima no sensor não é apenas dependente da natureza da molécula

biológica ou das características da interface do transdutor, devendo ser levado em

conta a eficiência do sinal de transdução e a dependência do analito. Por exemplo, se

o pH vai ser monitorizado, então a molécula deverá ser resistente ao microambiente

criado na zona imobilizada. Se, por outro lado, é utilizada apenas uma enzima redox e

o sinal a ser “traduzido” é a transferência de electrões, então, têm de estar

asseguradas as condições devidas para que se dê uma transferência eficaz entre a

enzima e o transdutor.

Figura 4: Esquema reaccional de uma enzima redox

Por vezes essa eficácia não é facilmente obtida recorrendo apenas ao simples

contacto entre a superfície do eléctrodo e a proteína redox, nesses casos recorre-se

ao uso de mediadores que promovem o transporte de electrões entre a enzima e o

eléctrodo. De uma forma genérica, o mediador deve ser um composto de baixo peso

molecular e com um par de electrões próximos do grupo prostético da enzima15.

Scheler et al.18, entre outros, classificaram os biossensores em três gerações de

acordo com o método de reconhecimento e tipo de imobilização da molécula. A

abordagem mais simples consiste em aprisionar a biomolécula de reconhecimento

entre o transdutor e uma membrana de diálise (primeira geração). A adsorção directa

ou fixação covalente da biomolécula de reconhecimento à superfície do transdutor

permite a eliminação de camadas inactivas. A ligação adicional do co-substrato,

através de ligações covalentes, é uma pré-condição das medições na ausência de

reagentes19, bem como o abandono do uso de O2 como mediador/dador electrónico

por dadores sintéticos como as quinonas, os viologénios ou o ferroceno20 (segunda

-Capítulo 1-

10

geração). A eliminação da dependência de O2 deve-se ao facto de a maioria das

enzimas oxidases não serem selectivas no respeitante ao agente oxidante permitindo

a sua substituição. Particularmente nos casos em que os biossensores recorrem a

técnicas electroquímicas, isto permite escolher um mediador adequado a gamas de

potencial nas quais não existam outros componentes da matriz a serem reduzidos ou

oxidados. Isto permitiu também o uso de enzimas desidrogenases e peroxidases que

não conseguem usar o O2.

Por fim temos os biossensores (de terceira geração) que se baseiam na co-

imobilização do biocomponente e do mediador directamente no meio electrónico,

transístor de efeito de campo (Field Effect Transistor – FET) que capta directamente e

amplifica as variações nas propriedades da superfície e processo o sinal electrónico.

Esta imobilização pode ser feita tanto por deposição directa, deposição num polímero

redox ou imobilização num polímero condutor. Isto permite maior numero de usos do

biossensor devido á natureza auto-contida do biossensor.20,21,22

Como foi referido anteriormente, vários mecanismos de transdução têm sido usados.

Na Tabela 2 resumem-se alguns dos mecanismos de transdução mais importantes:

Tabela 2: Principais sistemas de transdução usados em biossensores5

BIOSSENSORES

Principais sistemas de transdução usados em biossensores

Sistema de transdução Medida Electroquímico Amperometria (corrente a potencial constante)

Potenciometria (potencial a corrente zero)

Eléctrico Condutividade

Óptico Luminescência

Fluorescência

Índice de refracção

Térmico Calorimetria

Piezoeléctrico Massa - Microbalanças de quartzo cristalino

- Ondas acústicas de superfície

-Capítulo 1-

11

1.1.3 Detecção amperométrica Método de detecção em que a corrente é proporcional à concentração da espécie geradora

de corrente

de ”IUPAC Compendium of Chemical Terminology 2nd Edition (1997)”23

Nos métodos de detecção amperométrica é aplicado uma diferença de potencial ao

eléctrodo de trabalho, conseguindo-se assim que a espécie a ser determinada reaja e

uma corrente seja gerada. Se esse potencial tiver sido escolhido convenientemente, a

intensidade da corrente é directamente proporcional à concentração. Nos casos em

que se usa convecção constante, então obtém-se um sinal constante caso a

concentração de espécies electroactivas seja uniforme. O uso de microeléctrodos

permite, também, a obtenção de correntes de estado estacionário. No geral esta

técnica permite limites de detecção da ordem dos micromolar24.

O sistema fundamental de medida é constituído, tipicamente, por três eléctrodos. Um

eléctrodo de trabalho onde vai ocorrer a reacção que se quer seguir, um eléctrodo de

referência que regula o potencial aplicado no primeiro, e um contra-eléctrodo que

fornece a corrente ao primeiro. Na prática, para algumas aplicações, apenas os dois

primeiros eléctrodos serão suficientes. Naturalmente a escolha de potencial é

influenciada pela presença de ruído de fundo, possíveis interferentes (outras espécies

electroactivas) e pelos limites de detecção que seja necessário atingir.

1.1.3.1 Oxidorredutases como enzimas

Os biossensores que usam métodos de transdução electroquímicos, em particular os

métodos amperométricos, são de longe os mais frequentemente citados5. A maior

vantagem desta família de métodos reside na possibilidade de uso em meios

fortemente corados ou turvos, o que permite que por exemplo amostras de sangue

sejam analisadas sem tratamento prévio5,25. Para além disto existe uma vasta gama de

sistemas substrato-enzima que permitem modificar um ou outro componente redox

(como exemplo podemos citar os biossensores para a glucose26,27 , lactato28,29,

piruvato30, ureia31, l-alanina5, fenil-alanina5 e colesterol32).

Particularmente importante é o facto de as reacções das oxo-enzimas (tais como a

glucose oxidase) poderem ser seguidas através da monitorização tanto do consumo

-Capítulo 1-

12

de oxigénio como; sendo isto preferível, pela detecção do produto (peróxido de

hidrogénio) (Eq. 1 e Eq. 2). No caso de se utilizar um eléctrodo com uma oxo-enzima e

um eléctrodo de referência Ag/AgCl o sinal voltamétrico correspondente à presença de

H2O2 pode ser medido a +650 mV:

Substrato + O2 → Produto + H2O2 Eq. 1

H2O2 → O2+ 2H+ + 2e

Eq. 2

As enzimas desidroxigenases oferecem uma maior flexibilidade comparadas com as

outras famílias de biomoléculas usadas17 (coenzimas, anticorpos, células, tecido

biológico, etc.). No entanto, apesar de poderem ser utilizadas como agentes de

reconhecimento para biossensores, apresentam algumas dificuldades quanto à sua

aplicação.

O maior problema que se põe reside nos elevados potenciais de polarização

(+800mV contra Ag/AgCl) necessários à oxidação de NADH/ NAD+ par iónico usados

pelas desidrogenases e a correspondente degradação da superfície do eléctrodo

devida a reacções laterais de radicais gerados electroquimicamente.

Substrato + NAD+ ↔ Produto + NADH + H+ Eq. 3

Assim poucos eléctrodos enzimáticos baseados em desidrogenases têm sido

explorados o que não impede que algumas possibilidades promissoras surjam com o

aparecimento de novos reagentes capazes de acelerar o fluxo electrónico entre o co-

factor e o eléctrodo.

1.1.3.2 Selectividade e controlo da medida de metabolitos

Um dos maiores problemas de trabalhar com amostras clínicas, ainda que a

potenciais moderadamente oxidantes, é a presença de espécies redutoras como o

ascorbato e o ureato que, sendo eles próprios electroactivos, interferem quando se

-Capítulo 1-

13

usam as condições para a detecção do peróxido de hidrogénio (Eq. 2). Várias

estratégias têm sido desenvolvidas de modo a ultrapassar este problema. Assim, as

superfícies dos eléctrodos passaram a ser protegidas com membranas ultra-finas

directamente polimerizadas (electroquimicamente) na superfície destes (como por

exemplo o uso de polifenóis5). Esses filmes são formados pela oxidação de um

monómero fenólico na superfície do eléctrodo de modo a criar uma camada protectora

que confere tanto características de selectividade como de longevidade. Os filmes

polifenólicos reduzem a interferência tanto de ascorbatos como de ureato e

paracetamol em concentrações encontradas em amostras clínicas. Isto é conseguido

através da exclusão tanto por diferenciação de tamanho como de carga, permitindo o

acesso aos produtos do processo enzimático (normalmente peróxido de hidrogénio)

(ver Figura 5).

Figura 5 : Localização da enzima (E) num filme electro-polimerizado , indicando a rejeição do interferente (I) e a conversão do substrato (S) no produto electro-activo (P) 5.

Outras membranas como por exemplo as membranas de acetato de celulose,

poliuretano e policloreto de vinil são também usadas com vista a proteger os

eléctrodos de trabalho5 e reduzir o efeito de interferentes. Devido à estrutura da

superfície destes filmes é ainda possível aumentar a biocompatibilidade (importante

em dispositivos que têm de operar em amostras de sangue ou com grandes

quantidades de colóides.

Um ponto importante a referir é a contaminação por deposição de proteínas e células

na superfície do dispositivo. De modo a poder evitar a contaminação biológica foram

desenvolvidos modificadores de membrana que minimizam as interacções superficiais.

De referir, por exemplo, o uso de organosilanos para reduzir a coagulação superficial,

carbono vítreo para obter superfícies amorfas e surfactantes para conseguir fluidez

superficial.

-Capítulo 1-

14

1.1.3.3 Tipos de eléctrodos enzimáticos

As características de alguns eléctrodos enzimáticos amperométricos são

apresentadas na Tabela 3. Dos analitos incluídos, os mais importantes continuam a

ser a glucose e em menor grau o lactato. No entanto muitos dos sensores requerem

diluição da amostra (no caso de uso clínico) e carecem de melhorias tanto em termos

de tempo de vida, como no tocante ao uso em amostras de sangue de densidade

variável antes de poderem ser comercializados.

O aparecimento das técnicas de impressão de eléctrodos em painéis em que se faz

uso de tintas com carga metálica (metais em suspensão) para deposição de camadas

metálicas em suportes planos abriu o caminho à produção em massa de eléctrodos,

aumentando a precisão e reprodutibilidade durante a manufactura. Devido à variedade

de materiais de suporte disponível as possibilidades são muitas, desde plástico à

cerâmica. Os custos individuais dos eléctrodos são mantidos baixos recorrendo às já

referidas técnicas de impressão permitindo assim que o uso de sensores descartáveis

reduzindo ainda os problemas com contaminações.

-Capítulo 1-

15

Tabela 3: Características de alguns eléctrodos enzimáticos

BIOSSENSORES

Características de alguns eléctrodos enzimáticos

Analito Amostra Gama de linearidade

Limite de detecção

Tempo de vida em armazém

Tempo de resposta

Referência

Glucose Sangue 2µmol/L-3mmol/L

0.5µmol/L >3 meses T95 = 10s 26

Glucose In vivo - >3 meses 3-7 min 27

Lactato Sangue 0.4±0.15 mmol/L

- T95 = 80 s 28

Lactato Sangue - - T98 = 2min

29

Lactato Solução tamponada

0.2µmol/L >3 semanas T95 < 10 s 33

L-alanina Sangue - >1 mês < 5 min 30

L-fenilalanina

Soro 5µmol/L 1 mês 45-60 s 34

Piruvato Sangue - >1 mês <5min 30 Salicilato Tampão - >10 dias 40 s 35 Ureia Plasma 1.0µmol/L 2 semanas - 31

Creatinina Soro 30µmol/L >3 meses T95 = 1min

36

No caso dos sensores amperométricos, a superfície do eléctrodo de trabalho é muito

importante tornando-se necessária uma superfície fisicamente bem definida e

reprodutível. No entanto a introdução de enzimas nestes sensores complica o

processo ao adicionar um componente com falta de estabilidade. Para a resolução

deste problema surgiram várias aproximações, entre as quais se destaca a

imobilização numa matriz polimérica polielectrólitica de açúcares (polióis) que tem

vindo a mostrar-se particularmente vantajosa37. Nestes casos, o complexo enzima-

polielectrólito tendem a formar um arranjo em que a primeira é estabilizada numa

“gaiola electroestática” que suporta a conformação da enzima ao longo do tempo

-Capítulo 1-

16

(apesar de por vezes alterar a cinética do processo). Alguns trabalhos publicados

relatam a existência de eléctrodos enzimáticos com tempos de vida até 2 meses em

uso e de armazenamento a -18 ºC até 2 anos ou até um ano à temperatura

ambiente38.

1.1.3.3 Imunossensores amperométricos

Os sensores que empregam marcadores enzimáticos com detecção amperométrica

têm vindo a surgir para algumas classes de analitos orgânicos39,40 permitindo, em

alguns casos, determinar quantidades inferiores a 1x10-18mol.dm-3 41.

Outros sensores que despertaram as atenções são os sensores pré-carregados de

anticorpos para detecção electroquímica42,43 que permitem construir imunossensores

sensíveis a vários analitos44. Um dos maiores problemas de adaptar a adsorção de um

analito numa superfície de um sensor no caso de ensaios com duas fases, reside na

necessidade de lavagem que separe o marcador livre do fixo, o que introduz

complexidade no método analítico. Existindo, no entanto, alguns métodos que

dispensam esse passo45,46.

1.2 Enzimas

1.2.1 Generalidades Enzima n.-qualquer número de proteínas ou proteínas conjugadas produzidas por organismos vivos e, que funcionem como catalisadores bioquímicos. O termo enzima provem do grego zymosis, a palavra grega para fermentação, um processo realizado pelas leveduras e, à muito conhecido da indústria cervejeira que ocupou a atenção dos químicos do século XIX.47

As enzimas são, na sua maioria, proteínas globulares que apresentam elevada

actividade catalítica. Como todos os catalisadores, aumentam a velocidade de

determinadas reacções diminuindo a sua energia de activação através da ligação

temporária a um ou mais dos reagentes da reacção que catalisam. Ao fazê-lo verifica-

se o abaixamento na energia de activação necessário e assim aumenta a velocidade

da reacção.

-Capítulo 1-

17

Figura 6: Contraste de perfis energéticos de uma reacção exotérmica não catalisada – (verde) e

catalisada – (azul).

As enzimas são constituídas por aminoácidos que determinam a sua estrutura. A

sequência e organização desses aminoácidos resultam na sua estrutura

tridimensional, que, por sua vez é responsável pela especificidade e actividade da

enzima como catalisador. Este tipo de moléculas consiste, frequentemente, em várias

cadeias peptídicas ligadas numa estrutura quaternária (estrutura formada pela

interacção não covalente de duas ou mais macromoléculas, tal como a formada por

quatro moléculas de globina para formar a hemoglobina48), variando em tamanho

desde 10.000 até vários milhões de Daltons.

Para além de aminoácidos, muitas enzimas possuem grupos prostéticos, por

exemplo Flavina Adenina Dinucleótido (FAD). A actividade das enzimas é,

frequentemente, dependente da presença de um co-substrato (co-enzima), por

exemplo Nicotinamida Adenina Dinucleótido (NAD(H)), o qual se liga reversivelmente à

estrutura proteica aumentando a actividade enzimática. Outras podem ainda ter

ligados grupos Heme e iões metálicos (Ca2+ , Mg2+, etc.)16. as enzimas são

sintetizadas a nível celular em todos os organismos vivos estando envolvidas nas mais

variadas reacções relacionadas com o metabolismo. Frequentemente possuem

actividade a pH aproximadamente neutro, ao qual estão limitadas devido à sua

natureza proteica (noutras condições que não as ideais é comum dar-se a

desnaturação e perda de actividade), estão também limitadas a uma gama

temperaturas específica (geralmente correspondente às condições do ser vivo de onde

são originárias) não produzindo produtos secundários.

-Capítulo 1-

18

1.2.2 Especificidade enzimática e nomenclatura

Além da capacidade das enzimas de aumentarem substancialmente a velocidade de

uma reacção, estas possuem uma especificidade quer para com um substrato quer

para o tipo de reacção a ser catalisada. São também estéreo-selectivas e estéreo-

especificas o que faz com que sejam usadas com alguma frequência para aplicações

analíticas.

A IUPAC (International Union for Pure and Applied chemistry) e a IUBMB

(International Union of Biochemistry and Molecular Biology (antigo IUB)) adoptaram

regras para a classificação sistemática de enzimas tendo por base a especificidade da

sua actividade. De acordo com a 6ª revisão (1992) da nomenclatura enzimática

devemos considerar as seguintes classes:

1. Oxidorredutases

2. Transferases

3. Hidrolases

4. Liases

5. Isomerases

6. Ligases

Cada classe é depois subdividida em subclasses específicas do tipo de reacção. Por

exemplo especificando o dador de electrões de uma reacção redox ou o grupo

funcional transportado por uma transferase. Por sua vez cada subclasse é dividida em

sub-subclasses, no caso das oxidorredutases temos, por exemplo, os aceitadores

electrónicos. Cada enzima possui um número sistemático, pois, frequentemente, têm nomes

sistemáticos longos. Visto que as enzimas com diferentes origens biológicas, quase

sempre, diferem nas suas propriedades, a fonte, quando conhecida, é também

especificada. Por exemplo a Glucose Oxidase obtida a partir do Aspergillus niger tem

o número sistemático EC 1.1.3.449 e a nitrato redutase [NAD(P)H] EC 1.7.1.2 (1.6.6.2

em algumas publicações mais antigas).

-Capítulo 1-

19

1.2.3 A nitrato redutase

A nitrato redutase (NaR), que cataliza a reacção de NO3- a NO2

-, é produzida por

uma grande variedade de plantas, animais e microorganismos incluindo fungos. Está

ligada a duas vias metabólicas importantes: a assimilação e absorção de NO3- com

propósitos biossintéticos, e a utilização deste anião como oxidante na cadeia

respiratória em condições anaeróbias. A reacção global que a NaR catalisa é:

NO3- +NAD(P)H + H+ → NO2

- + H2O +NAD(P)+ Eq. 4

A enzima é um homo-dímero composto de duas subunidades idênticas de cerca de

100kDa, contendo cada uma dessas subunidades três co-factores, flavina adenina

dinucleótido (FAD -local onde se dá a oxidação do NAD(P)H ), um grupo Heme (heme-

Fe) e Mo-molibdenopterina (Mo-MPT local onde se dá a redução do nitrato) na razão

1:1:150. Cada co-factor constitui um elemento estrutural autónomo, e, mesmo que

isolado, retém a sua actividade parcial. Assim o co-factor Mo-MPT é o responsável

pela redução do nitrato sendo também activo na presença de dadores de electrões

sintéticos1.

Todas as sequências conhecidas de NR contêm um resíduo de cisteína (cys)

localizado no citocromo-b da enzima, não sendo no entanto essencial ao

funcionamento da enzima, tanto na ligação com NADH como na actividade

NADH:NaR, mas essencial para a transferência electrónica de alta eficiência entre

NAD(P)H e FAD. Foi também determinada a existência de outros resíduos Cys

presentes na maioria das enzimas NaR que estão envolvidos na ligação do grupo Mo-

MPT e na junção das subunidades enzimáticas. A presença destes vários resíduos de

Cys na enzima tornam-na altamente susceptível a sofrer inibição da parte de metais

pesados, pois muitos destes metais, tais como Cu e Pb, têm grande afinidade com os

grupos tiol das cadeias laterais da Cys.

-Capítulo 1-

20

Figura 7 : NADH-nitrato redutase (do milho) complexo com FAD e ADP 51

A enzima produzida pelo Aspergillus niger é uma forma bi-específica à NAD(P)H de

NaR assimilatória (NR (EC 1.7.1.2)52 (1.oxido-redutase; 1.7.usa outros compostos

nitrogenados como dadores; 1.7.1. com NAD+ ou NADP+ como aceitador; 1.7.1.2

Nitrato redutase[NAD(P)H] ).

Devido à sua reacção particular a sua actividade pode ser facilmente determinada

por um ensaio colorimétrico que é amplamente utilizada (tendo devido a essa relativa

abundância de bibliografia sido seleccionada para este trabalho). Esta nitrato redutase

apresenta um valor de KM (constante de Michaelis-Menten) de aprox. 199µmol/L em

tampão fosfato, pH 7,5 contendo 100µmol/L NAD(P)H e 2,5 µmol/L de FAD a 25Cº

As propriedades gerais destas enzimas estão mais detalhadamente referidas na

bibliografia53.

-Capítulo 1-

21

1.2.4 Cinética enzimática

O conceito de complexo enzima-substrato (denominado por ES) é fundamental para a

compreensão das reacções enzimáticas, tendo este sido introduzido em 1913 por

Michaelis e Menten54. A formação do complexo e a posterior separação deste podem

ser resumidas pela equação:

PEESSE +↔↔+3

4

1

2

k

k

k

k

Eq. 5 A constante de dissociação do equilíbrio envolvendo o complexo ES é conhecida pela

constante de Michaelis-Menten, KM, em que:

41

32

kkkkKM +

+=

Eq. 6 Todavia, o passo E + P ES é tão lento que pode ser negligenciado, assim,

para o estado estacionário temos que:

[ ] [ ] [ ]( ) [ ] [ ] 0231 =−−−= ESkESkESEkdtESd

Eq. 7 verifica-se então que:

[ ] [ ]( ) [ ]

[ ] MKES

SESEk

kk=

×−=

+

1

32

Eq. 8

rearranjando esta última expressão, vem que:

[ ] [ ] [ ][ ]ES

SESKM×

=+

Eq. 9

Por definição, a velocidade de formação de produto é proporcional à concentração do

complexo ES.

-Capítulo 1-

22

[ ]ESkv 3=

Eq. 10

O que substituindo na Eq. 9, dá:

[ ] [ ]

[ ]SKSEkv

M +×

= 3

Eq. 11

Para a condição em que [S] >> KM , atinge-se a velocidade máxima, Vmax . Em que:

[ ]EkV 3max =

Eq. 12

O que substituindo na Eq. 11, dá:

[ ][ ]SKSV

vM +×

= max

Eq. 13

Esta equação é conhecida como a equação de Michaelis-Menten. Através dela é

possível obter o valor de KM e a velocidade máxima, se utilizarmos concentrações de

substrato suficientemente elevadas. Verifica-se que para Vmax/2 o valor de KM é

numericamente igual à concentração de substrato correspondente.

A actividade catalítica é afectada por vários factores, como:

presença de inibidores;

pH;

temperatura;

Estes factores podem aumentar, diminuir ou até mesmo suprimir a velocidade da

reacção catalítica. Uma alteração destes parâmetros conduz a uma não-linearidade da

equação de Michaelis-Menten. Surge então uma variante que acrescenta um factor de

correcção à equação, denominada de representação de Hill55, descrita pela Eq. 14:

-Capítulo 1-

23

[ ]

α

+

=

SK

Vvapp

M1

max

Eq. 14

Em que α representa um desvio do comportamento ideal da equação de Michaelis-

Menten, esta assim passa a ser representada por KMapp, v é a velocidade da reacção

enzimática, Vmax é a velocidade máxima da reacção para uma determinada

concentração de enzima, em que a enzima se encontra saturada com substrato.

1.2.5 Co-factores enzimáticos

Análises rigorosas da estrutura de várias enzimas demonstraram que muitas delas

não são constituídas apenas por cadeias de aminoácidos. Para além da estrutura

proteica encontram-se, como referido acima, iões metálicos e/ou moléculas orgânicas

de natureza não proteica de baixo peso molecular.

Para exibirem actividade muitas enzimas requerem a presença de um ou mais

destes co-factores Estes constituintes não proteicos são assim denominados co-

factores. Assim temos que os co-factores se dividem em duas categorias:

1. Grupos prostéticos

2. Cosubstratos

A diferença entre eles reside na ligação do grupo à enzima. No primeiro caso os

grupos prostéticos estão fortemente ligados à enzima mantendo-se assim durante a

catálise, contrariamente, um co-substrato liga-se apenas de um modo temporário e

fraco à enzima sendo necessário para as reacções que existam em quantidades

estequiométricas.

Um exemplo de grupo prostético é a FAD presente em várias enzimas estando

envolvido em reacções de transferência de electrões. Quanto a co-factores temos, por

exemplo, o NADH do qual a nitrato redutase está dependente.

Os iões metálicos são também co-factores muito importantes para muitas enzimas,

podendo contribuir para a estabilização conformacional desta ou terem uma

participação na ligação ao substrato participando nas reacções de catálise como

ácidos de Lewis ou dadores electrónicos

-Capítulo 1-

24

Os grupos prostéticos podem estar localizados à superfície ou no interior da

estrutura da enzima. No último caso, a carga “aprisionada” não é facilmente transferida

para o eléctrodo pois a transferência electrónica decai exponencialmente com a

distância. Assim torna-se improvável conseguir transferir electrões do centro activo de

uma grande enzima se este for muito “blindado”. A dificuldade da transferência de

electrões para o ou do centro activo coloca um problema grave à aplicação de

enzimas no desenvolvimento de biossensores. Para o resolver recorre-se a

mediadores (por exemplo o ferroceno) que são capazes de aceder ao centro activo e

são, frequentemente, usados para assistir na transdução da actividade enzimática

numa resposta amperométrica mensurável.

1.2.6 Efeitos da temperatura, pH e força iónica

As enzimas são moléculas anfotéricas que contêm um elevado número de grupos

ácido e básicos à superfície. As cargas destes grupos variam, de acordo com as suas

constantes de acidez, e consequentemente com o pH do meio. Isto vai afectar a carga

total e a sua distribuição na superfície das enzimas tal como os seus grupos com

actividade catalítica. Assim as mudanças de pH podem afectar a actividade,

estabilidade estrutural (provocar desnaturação) e solubilidade da enzima.

Cada enzima possui um pH característico no qual a carga total na molécula é zero.

Este é o chamado ponto isoeléctrico no qual a solubilidade da enzima em solução

aquosa é mínima. De um modo semelhante o pH da solução também vai afectar o

substrato, os produtos e os co-substratos (quando presentes). O aumento da

concentração de H+ vai, adicionalmente, aumentar a competição dos iões hidrogénio

pelas ligações de qualquer metal catiónico presente na enzima reduzindo a

concentração de metal ligado. Diminuir a concentração de H+ pode, por sua vez,

aumentar a concentração de ião hidróxido que compete com os ligandos da enzima

pelos catiões di e trivalentes formando hidróxidos e, a pH’s elevados acaba por causar

a sua remoção da enzima.

A temperatura é também um parâmetro com um efeito marcante, dependendo do

seu efeito sobre as entalpias de ionização dos grupos em questão. A relação entre a

mudança de pKa e a mudança de temperatura é dada pela seguinte equação derivada

da equação de Gibbs-Helmholtz que relaciona a mudança de pKa e a temperatura:

-Capítulo 1-

25

Eq. 15

Em que T é a temperatura absoluta em Kelvin, R a constante dos gases (8.314

J.mole-1.K-1), ∆H é entalpia de ionização e a constante numérica (2.303) é o logaritmo

neperiano de 10 (pois os valores de pKa são baseados em logaritmos de base 10).

Variando a temperatura 50 ºC consegue-se deslocar o ponto isoeléctrico até uma

unidade na direcção de pH’s mais baixos. Assim o pH ao afectar a enzima vai também

afectar o valor de Vmax e KM (ao afectar as constantes de equilíbrio). O efeito do pH na

actividade de uma enzima pode (na generalidade dos casos) ser descrito por56:

221 aa

óptimopKpKpH +

=

Eq. 16

Assim, apesar de a Eq. 16 ser bastante simplificada e ignorar os efeito da ionização

tanto do substrato como do(s) produto(s) e co-substrato, produz uma variação de Vmax

com o pH, tipicamente, com a forma de uma curva sinusoidal sendo um modelo para

enzimas em que se assume que só um dos estados carregados apresenta actividade

(neste caso EH-).

-Capítulo 1-

26

Figura 8: Esquema geral (normalmente aplicável) da variação de Vmax de uma reacção catalisada

por uma enzima com o pH da solução56.

O centro (pH óptimo) e largura desta curva dependem fortemente das constantes de

dissociação dos grupos principais da enzima. Variações de pH de duas a três

unidades em qualquer uma das direcções a partir do ponto isoeléctrico são,

essencialmente, reversíveis, mais do que isso verifica-se a desnaturação da enzima.

A força iónica é outro parâmetro bastante importante ao lidar com enzimas. O que é

particularmente notório porque a catálise depende do movimento de moléculas

carregadas. Tanto a ligação de substratos carregados às enzimas como o movimento

de grupos carregados no centro activo vão ser influenciados pela composição iónica

do meio. No caso de reacções em que a constante reaccional depende da

aproximação de cargas pode-se aplicar a seguinte relação entre a força iónica e a

constante da reacção57:

Eq. 17

Em que K é a constante efectiva, K0 é a constante da reacção para uma força iónica

de zero, za e zb são as cargas electroestáticas das espécies em causa, e I a força

iónica da solução. Quando as cargas za e zb são de sinal idêntico verifica-se um

aumento na constante efectiva, no caso contrário verifica-se uma diminuição. Mesmo

-Capítulo 1-

27

no caso de relações mais complexas entre as constantes e a força iónica é claramente

importante controlar a força iónica das soluções em paralelo com o pH.

A temperatura além dos efeitos já referidos influi nas constantes reaccionais de

todas as reacções, incluindo as de catálise enzimática. Em geral verifica-se um

aumento com a temperatura de acordo com a equação de Ahrrenius: RTGAek /*∆−=

Eq. 18

Em que k é a constante de velocidade da reacção, A a constante de Ahrrenius, ∆G*

é a energia de activação padrão (KJ.mol-1), R a constante dos gases e T a temperatura

absoluta. Para energias de activação típicas (15 - 70 kJ.mol-1) observam-se aumentos

na constante cinética da ordem de 1,2 a 2,5x por cada 10ºC de aumento de

temperatura. Em geral seria óptimo poder usar as enzimas a temperaturas elevadas

mas, nesse caso, surge o problema da desnaturação (alteração conformacional que

resulta na perda de actividade biológica). O processo de desnaturação tem energias

de activação da ordem dos 200 - 300 kJ.mol-1 o que corresponde a factores de

aumento na constante reaccional de 6 a 36x por cada 10ºC o que torna a perda de

actividade muito rápida limitando assim os incrementos de temperatura possíveis.

Figura 9 : Diagrama esquemático mostrando o efeito da temperatura na actividade de uma enzima catalisadora de uma reacção.

De um modo geral a desnaturação das enzimas deve-se principalmente às suas

interacções proteicas com o ambiente aquoso. Como regra, as enzimas são mais

-Capítulo 1-

28

estáveis em solução concentrada e no estado desidratado, podendo manter a

actividade por longos períodos de tempo mesmo a temperaturas superiores a 100ºC57.

1.2.7 Processos de imobilização de moléculas

As enzimas em solução são normalmente utilizadas uma única vez. A utilização

repetida, imposta pelos biossensores, conduziu à procura de metodologias que

favoreçam uma reutilização da enzima. Factores como a natureza da reacção

enzimática, das espécies a determinar, do tipo de transdutor utilizado, ou das

condições de funcionamento do biossensor, conduzem à diversificação das técnicas

de imobilização. A Figura 10 apresenta um organograma que faz uma síntese das

metodologias mais utilizadas58.

Figura 10: Organograma das técnicas de imobilização de enzimas mais utilizadas

De uma forma esquemática, as diferentes formas de imobilização de enzimas,

encontram-se representadas na Figura 11:

Enzimas

Imobilizadas Livres

Ligação Aprisionadas “Crosslinking”

Covalente Adsorção Matriz Encapsuladas

-Capítulo 1-

29

Figura 11: esquema representativo dos quatro principais métodos de imobilização enzimática. (a)

adsorção, (b) ligação covalente, (c) Matriz (aprisionamento) (d) encapsulação57 .

O objectivo de qualquer metodologia de imobilização é reter a máxima actividade da

biomolécula na superfície do transdutor. Contudo, existem três parâmetros que

condicionam ou melhoram a imobilização: a cinética da reacção, o pH e temperatura.

Normalmente os processos de imobilização conduzem a uma diminuição da

velocidade da reacção, o que conduz à necessidade de maiores concentrações de

substrato para atingir o mesmo nível de resposta. A mesma situação é verificada

quando se utilizam agentes funcionais, reflectindo-se na diminuição ou aumento da

KMapp, consoante a afinidade do substrato para com a matriz. A influência do pH

traduz-se no deslocamento do pH óptimo da enzima para a região alcalina em grupos

carregados negativamente, enquanto que grupos carregados positivamente induzem

valores de pH mais baixos. Quanto à temperatura, enzimas aprisionadas e ligadas a

grupos funcionais são, normalmente, termicamente mais estáveis.

-Capítulo 1-

30

Analisando os factores que influenciam as biomoléculas, como as condições do meio

ou o procedimento de imobilização, é possível definir a técnica que possui as

condições mais adequadas ao sistema em estudo. As técnicas de imobilização de

maior utilização são as de ligação covalente e adsorção. A adsorção física da

biomolécula baseia-se na formação de forças atractivas de Van der Waals entre as

biomoléculas e o eléctrodo. Este método, não exige qualquer modificação química e

possui a vantagem da simplicidade, requerendo apenas uma solução contendo a

enzima a utilizar. Todavia, facilmente poderá ocorrer uma perda da enzima adsorvida

se ocorrem alterações do meio durante as medições como, por exemplo, variações de

pH, força iónica ou temperatura59. Relativamente à ligação covalente, esta técnica

baseia-se na reacção entre grupos funcionais terminais da enzima, não essenciais à

actividade catalítica, e grupos reactivos da superfície. Embora esta técnica possua a

vantagem de dificilmente a enzima se desprender da matriz de suporte, durante a

utilização, a eficiência relativa da ligação de uma quantidade de enzima no estado

imobilizado deve ser sempre comparada com a actividade de uma quantidade idêntica

de enzima em solução. Vários métodos são apontados para a formação da ligação

covalente, por exemplo a formação de ligações via grupos acilo, diazónio e tióis60.

A técnica de aprisionamento é mais utilizada em enzimas de elevada massa

molecular, sendo estas são aprisionadas, por exemplo em géis em contacto directo

com a superfície de um eléctrodo selectivo de iões (ESI). Usualmente esta camada é

separada da solução teste por uma membrana semipermeável, de forma a retardar a

lixiviação da enzima. Todavia, para enzimas de baixo peso molecular o

comportamento não se encontra próximo do desejado. Ogawa e colaboradores

descrevem, por exemplo, no seu trabalho o aprisionamento da urease em um novo

sistema de microgéis61 e a co-imobilização de duas enzimas (gluconolactonase e

glucose oxidase) para a melhoria da cinética do processo enzimático de géis de

polielectrólitos62.

Assim esta técnica é também apropriada para processos que envolvam substratos e

produtos de baixo peso molecular apresentando problemas óbvios para substratos e

produtos de maiores pesos moleculares. Quantidades até 1g de enzima por grama de

gel ou fibra podem ser aprisionadas. Este processo pode ser puramente físico ou

envolver ligações covalentes.

A técnica de “crosslinking” baseia-se na imobilização como resultado da reacção da

enzima com um agente bifuncional em que se forma uma ligação covalente63. Os

-Capítulo 1-

31

reagentes que permitem o uso desta técnica contêm grupos reactivos terminais

específicos para os grupos funcionais (por exemplo aminas) que se encontram nas

outras moléculas a imobilizar. A escolha do agente de “crosslinking” é feita, assim, de

acordo com os grupos funcionais presentes na enzima sendo, no entanto, a escolha

final feita de uma maneira empírica. Para a maioria das aplicações é necessário

manter a estrutura original da proteína, por isso o “crosslinking” é feito em condições

pouco agressivas tanto de pH como de tampões. É também importante obter um grau

de conjugação entre o agente de “crosslinking” e a proteína pois nalguns casos

(incluindo enzimas em particular) é conveniente que não seja muito elevado de modo

a permitir a manutenção da actividade biológica do fixado. A metodologia mais

utilizada na aplicação é o mergulhar da superfície de suporte (por exemplo um

eléctrodo) numa solução activa contendo a enzima e o agente bifuncional (p. ex.

glutaraldeído, carbodiimida, etc.) de forma a cobrir toda a superfície, esperar que se

forme uma película (períodos que variam entre poucos minutos e várias horas

dependendo do agente) seguindo-se períodos de lavagem e secagem da superfície

tratada. Tabela 4: Tabela comparativa das diferentes técnicas de imobilização de enzimas57.

Enzimas

Características de alguns métodos de imobilização de enzimas

Características Adsorção Ligação covalente

Aprisionamento Encapsulação

Preparação Simples Difícil Difícil Simples Custo Baixo Alto Moderado Alto Estabilidade da ligação

Variável Forte Fraco Forte

Perdas de enzima

Sim Não Sim Não

Aplicabilidade Elevada Selectiva Elevada Muito Elevada Problemas de Operação

Altos Poucos Altos Poucos

Efeito de Matriz

Sim Sim Sim Não

Barreiras de difusão

Não Não Sim Sim

Protecção microbiana

Não Não Sim Sim

-Capítulo 1-

32

1.3 ITIES – Interfaces Entre Duas Soluções Electrolíticas Imiscíveis

Uma interface entre duas soluções de electrólitos imiscíveis (ITIES - Interface

between Two Immiscible Electrolyte Solutions) é formada entre dois solventes com

uma solubilidade mútua baixa, contendo cada um deles um electrólito. Um desses

solventes é, normalmente a água, e o outro um solvente orgânico pouco polar com

uma permitividade dieléctrica moderada ou alta tal como o nitrobenzeno ou o 1,2-

dicloroetano (DCE), o que permite, pelo menos, a dissociação parcial do electrólito em

iões. A electroquímica das ITIES é uma temática que tem suscitado elevado interesse

devido ao seu elevado número de aplicações incluindo as suas aplicações

biomiméticas. Apesar de serem estudadas há já algum tempo, só num passado

recente o estudo electroquímico das duplas camadas nas interfaces líquido-líquido e

líquido-gel se traduziram em algumas aplicações64,65,66,67,68, em grande parte devido às

dificuldades experimentais no manuseamento destas interfaces. A investigação

desenvolvida actualmente nesta temática visa a compreensão dos mecanismos de

transferência de carga nas microinterfaces líquido-líquido e líquido-gel, juntamente

com a procura de aplicações práticas das ITIES, temática esta subjacente a este

trabalho.

1.3.1 Evolução

A primeira referência ao estudo electroquímico das interfaces líquido-líquido reporta

a 1902, no trabalho desenvolvido por Nernst e Riesenfeld69, em que são descritos os

fenómenos de difusão e de migração na passagem de uma intensidade de corrente

constante através de uma interface líquido-líquido. Surge, posteriormente, em 1939 o

primeiro modelo para a estrutura na interface formada entre dois líquidos imiscíveis,

através do estudo realizado a diferentes sistemas por Verwey e Niessen70. Estes

sugeriram que a dupla camada era constituída por duas camadas de difusão paralelas,

mas só uns anos mais tarde, em 1968, com o trabalho desenvolvido por Gavach e

colaboradores71, em interfaces polarizáveis, é que se clarificaram alguns aspectos dos

fenómenos de transporte de massa nas interfaces líquido-líquido.

Mas a grande revolução, em termos electroquímicos, surge em 1976 com o trabalho

realizado por Koryta e colaboradores72 em que estes demonstraram a possibilidade de

-Capítulo 1-

33

utilização das ITIES como modelos simplificados de membranas biológicas, abrindo

assim a porta para inúmeras aplicações. Esta possibilidade já tinha sido abordada em

1848 por Du Bois-Reymond73, em que este sugere que as superfícies de sistemas

biológicos teriam propriedades semelhantes às de um eléctrodo de uma célula

galvânica. Recentemente, Volkov74 no seu livro refere a utilização da transferência

iónica nas ITIES como base ou modelo de vários sistemas importantes como as

biomembranas, os industriais e os analíticos.

1.3.2 Aplicações analíticas das ITIES

Samec et al75, em 1977 introduziram a utilização do potenciostato de quatro

eléctrodos com compensação óhmica no estudo das ITIES. Este trabalho conduziu à

aplicação de várias técnicas electroquímicas, entre as quais, a voltametria

cíclica76,77,78, a cronoamperometria79, a espectroscopia de impedância electroquímica80

e a voltametria diferencial de impulsos, sendo esta utilizada na determinação do catião

acetilcolínio, no primeiro artigo de utilização das ITIES com fins analíticos, publicado

em 1981 por Mareček et al64,81.

O primeiro trabalho que descreve uma aplicação das ITIES em biossensores foi

relatado por Osakai et al82 e mostra o desenvolvimento de um biossensor baseado na

detecção do catião amónio proveniente da decomposição da ureia. A transferência

assistida deste catião através das ITIES origina um sinal amperométrico, proporcional

à concentração de ureia (1 a 2000 µM).

A utilização das ITIES em estudos analíticos encerra ainda alguns problemas,

essencialmente devido à dificuldade experimental no manuseamento da interface

líquido-líquido e a outras limitações, como:

Natureza tóxica dos solventes orgânicos;

Queda óhmica elevada;

Instabilidade da interface;

Estas dificuldades experimentais na preparação das células electroquímicas

traduzem-se, sobretudo, na falta de reprodutibilidade das áreas interfaciais e com a

elevada resistência observada no sistema electroquímico.

-Capítulo 1-

34

Uma das formas de minimizar alguns destes problemas é o da utilização de

microeléctrodos83,84

1.3.3 Polarizabilidade das ITIES

Quando uma diferença de potencial é aplicada através de uma interface líquido-

líquido, é possível distinguir dois comportamentos distintos das interfaces

electrificadas: as interfaces idealmente polarizáveis e as interfaces idealmente não

polarizáveis. A diferença reside na aplicação de uma grande diferença de potencial

gerar uma pequena corrente através da interface, nas interfaces polarizáveis,

enquanto que nas idealmente não polarizáveis, uma corrente elevada pode ser obtida

pela aplicação de uma pequena diferença de potencial. Esta polarizabilidade das

ITIES está directamente relacionada com a energia de Gibbs de transferência dos sais

electrolíticos85.

Para o caso em que um sal hidrofílico é dissolvido na fase aquosa e um sal

hidrofóbico na fase orgânica (casos em que se verifica que a concentração dos

respectivos sais nas fases opostas é negligenciável comparativamente à concentração

do sal da respectiva fase), considera-se a interface como idealmente polarizável.

Nesta situação é possível polarizar a interface através de uma fonte de potencial

exterior, sem modificar quimicamente a composição química das fases adjacentes.

Assim, é possível estabelecer a denominada “janela de potencial”, possibilitando a

polarização da interface para um ponto em que a diferença de potencial galvânica

aplicada é suficiente para a transferência do ião através da interface.

. A amplitude da janela de potencial é então determinada pela natureza dos iões dos

electrólitos de suporte. A Figura 12 representa um voltamograma cíclico típico de um

interface líquido/líquido, onde se esquematizam os vários processos que podem

ocorrer nessa interface por aplicação de uma diferença de potencial, nomeadamente

os processos de transferência iónica que ocorrem nos limites da janela de potencial.

-Capítulo 1-

35

Figura 12:Esquema do processo interfacial dentro da janela de potencial 85

1.4 Tensão superficial e ângulos de contacto

A caracterização das propriedades de superfície é muito importante particularmente

em termos industriais. A medição de ângulos de contacto e a tensão superficial

fornece uma melhor compreensão das interacções entre sólidos e líquidos ou entre

líquidos. Estes parâmetros proporcionam informações necessárias para o

desenvolvimento e modificação de materiais com os fins mais variados.

As moléculas no interior de um sólido ou líquido são afectadas em todas as

direcções por forças de atracção iguais, pelo contrário as moléculas que se encontram

na superfície dos mesmos não estão numa situação de equilíbrio de forças se

considerarmos apenas o sólido ou líquido em questão. Estas não possuindo moléculas

na vizinhança excepto as da fase gasosa, são por isso sujeitas a maiores forças

atractivas na direcção do sólido ou líquido do que do ar. A Figura 13 apresenta um

esquema que ilustra as forças às quais as moléculas de um sólido ou líquido estão

sujeitas. Nesta figura é possível observar a “ausência” de forças de atracção externa

-Capítulo 1-

36

sofrida pelas moléculas exteriores bem como as forças superiores que têm com o

resto do sólido ou líquido.

Figura 13: Esquema do equilíbrio de forças numa interface líquido /gasoso86

Devido ao desequilíbrio das forças na interface a estrutura e composição desta não

será a mesma do interior do sólido ou líquido em questão. As interacções em

superfícies e interfaces resultam, deste modo, numa orientação particular das

moléculas podendo-se verificar a acumulação de alguns tipos de moléculas na

interface e separação de cargas positivas e negativas. Isto leva a que,

frequentemente, as características internas sejam completamente diferentes das da

interface. Assim a análise de tensão superficial combinada com a de ângulos de

contacto fornece informação acerca da camada externa de uma superfície de um

modo relativamente simples. Existe uma gama variada de instrumentos dedicados à

caracterização de superfícies, entre eles a espectroscopia de raios X, a espectrometria

de massa secundária, difracção de raios X, espectroscopia Raman e espectroscopia

de infra vermelho. No entanto, todas estas técnicas penetram em alguma extensão na

superfície enquanto que a tensiometria e a goniometria proporcionam acesso apenas

à camada mais externa de uma superfície. Em termos de custo as primeiras têm

custos na ordem das centenas de milhares de euros enquanto que as últimas podem

ser obtidas por “apenas” algumas dezenas de milhar. Claro que a informação obtida

por estas técnicas não é tão completa nem exacta como a proporcionada pelas

-Capítulo 1-

37

técnicas mais dispendiosas, mas são técnicas rápidas, simples e razoavelmente

precisas úteis para verificações rápidas.

O ângulo de contacto, θ; é uma medida quantitativa da “molhagem” de um sólido por

um líquido. É definido geometricamente como o ângulo formado por um líquido na

zona em que sólido, líquido e gás coexistem como se vê abaixo:

Figura 14: Esquema ilustrativo das diferentes formas de gotas87

Para valores de θ baixos os líquidos espalham-se pela superfície, valores mais

elevados indicam que o líquido não se espalha, formando gotas. Se θ for menor que

90º diz-se que o líquido molha o sólido, se for maior diz-se que o líquido não molha.

Um ângulo de contacto de 0º significa que o líquido molha o sólido totalmente. Para a

obtenção deste valor θ não se devem considerar apenas ângulos estáticos (ângulos

obtidos com a gota estática não permitindo evaporação). Para cada interacção

sólido/líquido existe uma gama de diferentes ângulos dependentes da história recente

dessa interface87. Quando uma gota se expandiu recentemente o ângulo diz-se

avançado, quando pelo contrário sofreu uma contracção o ângulo diz-se recuado.

Estes ângulos definem a gama de ângulos para cada interacção sendo o ângulo

avançado próximo do valor mínimo e, o ângulo recuado próximo do valor máximo. É

também possível medir esses ângulos com o ponto de fronteira (sólido/líquido/gás) em

movimento sendo nesse caso designados por ângulos em avanço ou em recuo

podendo ser obtidos a várias velocidades87.

Estes ângulos podem também ser considerados de um ponto de vista

termodinâmico. Assim esta análise envolve as energias livres das interfaces entre as

três fases dado pela equação de Young88:

-Capítulo 1-

38

slsvlv γγθγ −=cos

Eq. 19

onde γlv , γsv e γsl se referem as energias interfaciais dos interfaces líquido/vapor,

sólido/vapor e sólido/líquido.

Existem dois métodos comummente usados para medir ângulos de contacto em

sólidos não porosos, a goniometria e a tensiometria. A primeira envolve a observação

de uma gota séssil de um líquido de teste num substrato sólido, a segunda envolve a

medição de forças de interacção quando o sólido é posto em contacto com o líquido.

Visto que apenas a primeira técnica foi utilizada será a única a ser descrita.

1.4.1 A goniometria

A análise da forma de uma gota de um líquido de teste sobre um sólido é, como já

foi referido, a base da goniometria ( do grego gonio metron - medição de ângulos)87,89.

Os elementos básicos de um goniómetro para medições de gota séssil incluem a fonte

luminosa, o suporte da amostra, a lente e um aparelho de aquisição de imagem. O

ângulo de contacto é medido directamente medindo o ângulo formado entre o sólido e

a tangente à superfície da gota.

A produção de gotas com ângulos avançados e recuados envolve uma de duas

estratégias: os ângulos recuados podem ser produzidos simplesmente permitindo a

evaporação do líquido ou retirando uma porção do líquido, os ângulos avançados

podem ser medidos ao acrescentar líquido ou, alternativamente, os ângulos, tanto

recuados como avançados, podem ser obtidos inclinando o suporte da amostra até

produzir movimento no líquido e utilizando velocidades de captura de imagem

elevadas87,90.

A goniometria pode ser usada em situações bastante variadas. É possível usar uma

grande variedade de substratos sólidos desde que estes tenham uma zona

relativamente plana que permita o teste e possa ser colocada no suporte. Permite

analisar substratos com curvatura regular (tais como lentes de contacto). O teste pode

ser feito usando quantidades muito pequenas de líquido, permitindo também testar

líquidos a alta temperatura (como plástico fundido)

-Capítulo 1-

39

Atribuir uma linha tangente à gota de modo a definir o ângulo de contacto é um

factor que limita a reprodutibilidade dos ângulos. A goniometria convencional baseia-

se na consistência do operador nessa atribuição o que pode levar a erros

significativos, especialmente entre diferentes utilizadores (a análise por computador

pode ser uma forma de diminuir este factor). As condições utilizadas na obtenção de

ângulos recuados e avançados são, por vezes, difícil de reproduzir. Embora gotas em

movimento possam fornecer os ângulos de contacto dinâmicos, a velocidade não pode

ser controlada. A superfície analisada em cada ensaio é limitada e pode obrigar à

realização de grande número de ensaios (como se verificou no nosso caso).

1.4.2 Medição dos ângulos de contacto

Verifica-se que o ângulo θ teórico nem sempre corresponde aos valores obtidos

experimentalmente, sendo que este e a tensão superficial da interface líquido vapor,

γlv, são as únicas quantidades mensuráveis. De modo a determinar γsv e γsl, torna-se

necessário procurar outras relações entre estas quantidades88.

No entanto, no presente caso, o ângulo de contacto foi utilizado como um parâmetro

característico de cada superfície. É de notar que, para que o ângulo de contacto

observado possa ser considerado, é necessário que a superfície seja absolutamente

lisa, pois qualquer superfície rugosa automaticamente invalida o seu uso. No entanto

não existe nenhum critério que defina quando é que o ângulo experimental deixa de

ser uma boa aproximação.

1.5 Constantes dieléctricas e de relaxação dieléctrica

Os dieléctricos (ou isoladores) são materiais em que não existem cargas livres que

se possam movimentar com facilidade. Na presença de um campo eléctrico externo,

este é atenuado pelo dieléctrico. Surge então um parâmetro denominado de constante

dieléctrica relativa, ε que indica quantas vezes mais fraco é o campo eléctrico de um

material, comparativamente ao vácuo, determinado pela relação91:

-Capítulo 1-

40

material

vácuor E

E∆∆

=ε

Eq. 20

Esta atenuação do campo eléctrico deve-se à polarização induzida no material. Em

sólidos ou líquidos pouco polares, as moléculas têm uma orientação aleatória,

designada por movimento estocástico ou browniano. A ordem obtida com a aplicação

de um campo eléctrico nunca é perfeita, mas mesmo assim a matéria fica polarizada.

Num condensador com um dieléctrico, o campo eléctrico no seu interior fica ε vezes

mais fraco, sendo a diferença de potencial entre as placas ε vezes menor. Portanto

quanto maior ε, maior será a capacidade do condensador. Assim é possível obter uma

relação entre a capacidade de um condensador plano e a constante dieléctrica

relativa:

vrCC ε=

Eq. 21

em que Cv é a capacidade utilizando o vazio como dieléctrico e εr a constante

dieléctrica relativa do meio em estudo.

Contudo, esta relação linear é válida apenas quando estamos na presença de um

dieléctrico ideal. Normalmente existem perdas dieléctricas por condução e assim a

constante dieléctrica relativa é um número complexo dado por:

( ) ( ) ( )ωεωεωε ''' j−=

Eq. 22

em que a parte imaginária (ε’’) representa as perdas relativas do meio. Calculando a

corrente total no circuito (I=Icond+I0), em que Icond representa a corrente de condução e

I0 a corrente do dieléctrico ideal, obtém-se:

-Capítulo 1-

41

vCC

='ε

Eq. 23

vcCRωε 1'' =

Eq. 24

em que ω é a frequência e Rc a resistência de condução. Este resultado mostra que

estas perdas são muito mais significativas a baixas frequências92.

Na Figura 15 encontram-se representados os circuitos equivalentes de um

dieléctrico e as respectivas correntes, definidas anteriormente e Ir a corrente associada

ao processo de relaxação dieléctrica.

a) b) c)

Figura 15: Circuitos eléctricos equivalentes de dieléctricos: a) ideal; b) com perdas por condução; c) com relaxação dieléctrica.

Contudo, os dipolos eléctricos do dieléctrico apresentam uma relaxação dieléctrica

que advém da variação da polarização induzida pela aplicação do campo eléctrico. A

variação destes parâmetros com a frequência encontra-se representada de forma

genérica na Figura 1693:

-Capítulo 1-

42

Figura 16: Variação dos parâmetros ε’ e ε’’ com o logaritmo da frequência.

Analisando a curva da figura é possível verificar que a variação de ε’ com o

logaritmo da frequência dá origem a uma curva de dispersão sigmoidal, enquanto que

a representação de ε’’=f(ln f) origina uma curva de absorção parabólica. No entanto, a

projecção de ε’’=f(ε’), conhecida por diagrama de Cole-Cole94, dá origem a uma

representação em semicírculo, prevista para os processos de relaxação simples,

descritos pela teoria de Debye. É característico dos dieléctricos, para estes processos

de relaxação simples, prever uma mudança da velocidade de polarização,

proporcional à diferença de polarização do valor de equilíbrio. Nestes casos a

constante dieléctrica pode ser expressa pela conhecida equação de Debye:

rjωτεεε

+∆

+= ∞ 1

Eq. 25

em que ∆ε=ε0-ε∞ sendo designada como amplitude dieléctrica e τr é o tempo de

relaxação dieléctrica.

É então possível escrever a equação para a constante dieléctrica, associando as

contribuições das equações Eq. 24, Eq. 25 e Eq. 26:

cr jj ωτωτεεε 1

1+

+∆

+= ∞

Eq. 26

em que τc=CvR é o tempo de condução dieléctrica. A contribuição para a constante

dieléctrica para baixas frequências está associada à condução dieléctrica enquanto

-Capítulo 1-

43

que a contribuição para altas-frequências é devida predominantemente ao processo

de relaxação dieléctrica.

No entanto, os processos de relaxação dieléctrica podem apresentar uma dispersão

do tempo de relaxação, contrariamente ao previsto pela teoria de Debye. É então

possível observar, à mesma temperatura, vários modos de relaxação que contribuem

para a constante dieléctrica. Considerando que estes modos são independentes, a

equaçãoEq. 26 pode ser reescrita como:

( ) ( ) ( )∑=

∞ ++

∆+=

n

i cr

i

jj i

i1

11 λβ ωτωτ

εεωε

Eq. 27

Em que n é o número de modos de relaxação independentes, βi o parâmetro

polidispersivo do sistema e λ um parâmetro que mede a dispersão dos tempos τc.

Samec et al80 descrevem teoricamente no seu trabalho a relação que existe entre a

capacidade da interface e a constante dieléctrica. Pelo estudo das propriedades

dieléctricas é então possível obter uma melhor compreensão dos fenómenos inter e

intramoleculares, permitindo uma análise mais profunda dos processos físico-químicos

que decorrem e que dependem dos solventes orgânicos utilizados.

Como se pode observar na Figura 16 a representação de ε’’=f(ε’), designada por

representação de Cole-Cole, tem a forma de um semicírculo para uma relaxação do

tipo de Debye (modo de relaxação monodispersivo), que pode ser descrito

matematicamente por92:

( ) 222 ''' ca =+− εε Eq. 28

Em que a e c são constantes. Todavia, é frequente encontrarem-se modos de

relaxação com alguma dispersão na frequência de relaxação, designados por modos

polidispersivos. Para estes, o diagrama de Cole-Cole é parte de um semicírculo, em

que o centro não se encontra sobre o eixo ε’, mas abaixo dele; a expressão

matemática que representa esta situação é:

-Capítulo 1-

44

( ) ( ) 222 ''' cba =−+− εε Eq. 29

Em que a, b e c são constantes. O ajuste dos valores experimentais da

representação de Cole-Cole a esta equação permite calcular os valores de ∆ε, os

termos ε(0), ε(∞) e o parâmetro βa, através das seguintes expressões:

( ) 220 bca −+=ε Eq. 30

( ) 22 bca −−=∞ε Eq. 31

( ) ( ) 2220 bc −=∞−=∆ εεε Eq. 32

−=

cbarcsen

πβ 21

Eq. 33

Na prática é mais fácil obter estes parâmetros ajustando uma função teórica aos

valores experimentais de ε’(ω) e de ε’’(ω). Para isso, considerando que existem um ou

mais modos de relaxação independentes, as expressões da contribuição dieléctrica

ε’(ω) e ε’’(ω) têm a seguinte forma:

( ) λββ

β

ωω

λπ

ωωπβ

ωω

πβωω

εεωε

+

+

+

+

∆+= ∑=

∞

c

n

i

r

i

r

i

ri i

i

i

i

i

ig 2cos

2cos21

2cos1

'1

2

Eq. 34

a Parâmetro que mede o carácter polidispersivo do modo. Se:

β = 1 o modo é monodispersivo; 0 < β < 1 o modo é polidispersivo;

-Capítulo 1-

45

( ) λββ

β

ωω

λπ

ωωπβ

ωω

πβωω

εωε

+

+

+

∆= ∑=

c

n

i

r

i

r

i

ri

sensen

gi

i

i

i

i

i 2

2cos21

2''

12

Eq. 35

Em que βi e λ são factores adimensionais (entre 0 e 1) que definem,

respectivamente, o carácter polidispersivo do sistema e a existência de defeitos na

malha, gi é o factor adimensional característico do modo de relaxação i, sendo que

, e são as frequências de relaxação e condução92.

1.6 Desenho factorial

As técnicas analíticas, frequentemente, têm de detectar quantidades vestigiais de

analitos, é importante que os níveis dos parâmetros experimentais dos quais a

resposta depende sejam escolhidos de modo a maximizar a resposta obtida. O

processo que permite encontrar os níveis desses factores é a optimização e, o

primeiro passo nesse processo é a determinação de quais os factores e interacções

entre factores são relevantes para a resposta obtida. Isto pode ser feito usando a

técnica denominada por desenho factorial. Este método tem vantagens relativamente

à tradicional optimização feita à medida que se vão fazendo experiências, sendo as

maiores:

• O desenho factorial detecta e estima todas as interacções ao invés da

optimização tradicional;

• Nos casos em que os efeitos são aditivos, o desenho factorial precisa de

menos medições que a aproximação clássica oferecendo a mesma ordem de

precisão.

O objectivo principal da elaboração de um desenho factorial é o de conduzir a

pesquisa laboratorial no sentido de obter o máximo de informação com um mínimo de

∑=

=n

iig

1

1i

ir

r τω 1

=c

c τω 1

=

-Capítulo 1-

46

trabalho95. Um dos problemas essenciais do planeamento reside na escolha do tipo de

desenho que melhor permite caracterizar a superfície de resposta a explorar. Ora este

é um problema de lógica circular pois, para poder escolher os melhores pontos a

analisar seria necessário conhecer a superfície de resposta, o que constitui o objectivo

da investigação.

Outro problema particular, característico dos sistemas químicos, são as variações de

resposta relativamente suaves, que não apresentam variações bruscas ou

descontinuidades (ou então são já previamente conhecidas).

Para efectuar um planeamento experimental completo seria necessário conhecer

previamente os seguintes parâmetros:

• Quais são os parâmetros importantes;

• Em que domínio devem ser estudados;

• Como se relacionam os parâmetros com a função de resposta.

Ainda assim pode não ser simples escolher os pontos mais adequados para realizar

o planeamento experimental. É evidente que o experimentalista tem muito mais

facilidade em responder a estes problemas no final dum planeamento experimental do

que no seu início. Isto justifica que seja desejável adoptar uma sequência de desenhos

experimentais moderados, orientando os passos futuros da pesquisa à medida que os

resultados de cada experiência vão sendo conhecidos.

Um desenho factorial é um conjunto sistematizado de experiências realizadas de

acordo com um esquema simples, que cobre uma parte do espaço de variação de

cada parâmetro considerado. Para levar a cabo um desenho factorial escolhem-se os

níveis a testar para cada parâmetro, realizando depois as experiências

correspondentes a todas as combinações possíveis dos diferentes níveis para todos

os parâmetros. Assim: se existirem n1 níveis para o factor 1, n2 níveis para o factor

2,..., e nk níveis para o último, será necessário realizar n1 x n2 x ... x nk experiências para

se obter o desenho factorial n1xn2x...xnk. (por exemplo para um desenho factorial 3x4x2

são necessárias 3x4x2=24 experiências.

Deste modo uma escolha adequada dos pontos a estudar permite frequentemente

extrair relações e avaliar o efeito dos diferentes parâmetros e formular modelos para

compreensão dos sistemas em estudo.

-Capítulo 1-

47

1.6.1 Desenhos factoriais a dois níveis

Entre os desenhos factoriais os que utilizam dois níveis para cada factor são

particularmente úteis e importantes porque:

• Requerem poucas experiências para o parâmetro em estudo (apesar de

permitir explorar uma vasta região da superfície de resposta, podem,

geralmente, identificar tendências e portanto sugerir as futuras linhas de

investigação);

• Podem ser aumentados (desenhos compostos), para permitir uma

exploração local mais profunda, ou contraídos (desenhos factoriais

fraccionários) para realizar as explorações iniciais sem um grande esforço

experimental;

• A interpretação dos resultados é simples, bastando senso comum e

aritmética elementar.

A tabela onde se representam as experiências realizadas e os seus resultados

designa-se geralmente por matriz de desenho factorial e pode ser usada tanto com os

sinais + e – para os níveis superior e inferior como 1 e 0 (tendo-se optado pela

primeira no nosso caso). Assim para um desenho factorial de 2x2x2 (ou 23)

envolvendo os parâmetros A, B e C vem:

Tabela 5: matriz genérica de um desenho factorial 23 95,96

Exp A B C

1 - - - 1 2 + - - a 3 - + - b 4 + + - ab 5 - - + c 6 + - + ac 7 - + + bc 8 + + + abc

Neste caso por exemplo, teríamos que na experiência 1 os factores A, B e C teriam

todos o nível negativo ( por exemplo falta do elemento) , e na experiência 2 os factores

Be C mantêm-se mas o factor A terá o seu nível superior.

-Capítulo 1-

48

O efeito de um parâmetro reflecte a variação na resposta do sistema quando,

mantendo os valores dos outros parâmetros, se altera de – para + o valor do

parâmetro em causa. Tendo que Y1, Y 2..., Y n são as respostas às experiências 1 a n e

sendo α1, α2..., αn os componentes do efeito A (neste caso). As respostas

)( 8642 YYYY +++ têm assim um peso positivo pois o factor A tem um peso positivo e,

contrariamente, )( 7531 YYYY +++ têm um peso negativo pois o factor em causa tem

um peso negativo (como se pode notar nas tabelas anteriores Tabela 5 e Tabela 6).

Assim para se calcular o efeito do parâmetro A devemos elaborar a Tabela 6:

Tabela 6: Efeito de um factor individual num desenho factorial 23

Diferença Nível de B Nível de C Nível de A

Y2-Y1=α1 -

Y4-Y3=α2 + -

Y6-Y5=α3 -

Y8-Y7=α4 + +

+ -

Efeito A = α

Ou então

4/)(4/)( 75318642 YYYYYYYYAEfeito +++−+++=

Eq. 36 (Assim teremos a diferença entre todos os resultados em que o factor tem um nível

superior e o nível inferior normalizado)

Note-se que todas as observações são utilizadas no cálculo de cada efeito principal.

Também é importante saber que, caso os factores não se comportem de maneira

puramente aditiva (o efeito de A e o efeito de B separadamente são iguais aos seus

efeitos quando juntos) o desenho factorial permite estimar as suas interacções.

Acontece que ao separar o efeito de um parâmetro para os dois níveis de um outro

estes sejam muito diferentes podendo-se calcular a diferença, esses dois parâmetros

são ditos não aditivos.

Considerando os efeitos A e B, caso não haja interacção entre eles a mudança de

resposta entre dois níveis de A deve ser independente do nível de B. Por convenção o

efeito de interacção entre dois factores A e B representa-se por AxB. Na tabela

anterior (Tabela 6) o primeiro e terceiros valores da primeira coluna ( 1Y e 3Y )

-Capítulo 1-

49

correspondem às mudanças de B de nível alto para o nível baixo enquanto A está no

nível baixo tal como o quinto e sétimo ( 5Y e 7Y ). Do mesmo modo os quatro valores

restantes ( 468 ,, YYY e 2Y ) correspondem à mesma mudança quando A está no nível

elevado. Caso não haja nem interacção nem erros as estimativas do efeito A devem

ser iguais. Caso não se dê um caso de igualdade, metade da diferença é considerado

o valor da interacção, obtendo-se (neste caso) por:

2/2

)()(2

)()( 13572468

−+−

−−+−

=×YYYYYYYYBAEfeito

Eq. 37

ou:

4/)(4/)( 76328541 YYYYYYYYBAEfeito +++−+++=×

Eq. 38

O cálculo para as restantes interacções entre dois factores é feito de modo

semelhante. (Note-se que na equaçãoEq. 38 para calcular o peso negativo ou positivo

a dar a cada resposta se multiplicam os níveis + ou -. Por exemplo para Y1 temos A –

e B – obtendo-se, por isso, uma contribuição positiva para a equação anterior).

Considerando cada interacção de 2º grau verifica-se ainda que podem haver duas

medidas para o feito com o terceiro factor. Metade da diferença entre elas define a

interacção entre os três factores. Podendo-se, como nos casos anteriores calcular da

seguinte forma:

4/)(4/)( 76418532 YYYYYYYYCBAEfeito +++−+++=××

Eq. 39

-Capítulo 1-

50

1.6.2 O algoritmo de Yates

O cálculo do efeito de cada parâmetro pode ser simplificado usando uma tabela de

sinais ou um algoritmo de Yates96. A tabela de coeficientes é obtida a partir da matriz

do desenho factorial (Tabela 5).

Tabela 7:Formas simplificadas de calcular os efeitos – Tabelas de coeficientes

Exp Média A B C AB AC BC ABC Resposta 1 + - - - + + + - Y1 2 + + - - - - + + Y2 3 + - + - - + - + Y3 4 + + + - + - - - Y4 5 + - - + + - - + Y5 6 + + - + - + - - Y6 7 + - + + - - + - Y7 8 + + + + + + + + Y8

As colunas referentes aos efeitos principais obtêm-se directamente a partir da coluna

de matriz referente a cada parâmetro e as interacções obtêm-se a partir destas por

multiplicação directa de cada parâmetro. Todos os efeitos podem então ser obtidos

calculando o valor médio do produto do sinal de cada coluna pelo valor da resposta

correspondente (sendo a divisão por 8 no cálculo e por 4 nos restantes)97.

Para utilizar o algoritmo de Yates é necessário começar por colocar as colunas dos

tratamentos por uma ordem padrão: os factores são inseridos numa tabela

verticalmente, um de cada vez e vão sendo combinados com todos os factores

anteriores pela ordem determinada:

• 22:I, a,b,ab

• 23:I, a,b,ab,c,ac,bc,abc

• 24:I ,a,b,ab,c,ac,bc,abc,d,ad,bd,abd,cd,acd,bcd,abcd

Seguidamente introduz-se uma coluna (1) onde:

• Os primeiros 2n-1 elementos são calculados através da soma dos pares de

respostas adjacentes (o primeiro elemento é calculado pela soma das duas

primeiras, o segundo pelas soma da terceira e quartas, etc..)

• Os restantes 2n-1 elementos são calculados de forma análoga através da

diferença de pares de respostas adjacentes.

-Capítulo 1-

51

• As colunas (2) e (3) calculam-se de forma análoga à usada para a coluna (1)

mas usando os valores da coluna (1) e (2) respectivamente. O número de

colunas é igual ao expoente do desenho factorial (n)

• Na coluna final a divisão é feita do mesmo modo que na tabela de

coeficientes.

• O resultado final é o mesmo que o obtido não usando o algoritmo.

O grande problema dos desenhos factoriais completos reside na multiplicação

exponencial no número de medições a fazer com o número de factores a testar. Assim

se tivermos k factores teremos 2k experiências. Quando o número de factores

ultrapassa os 3 tornam-se possíveis economias de tempo se se desprezar a

possibilidade de existirem interacções de nível superior a três sendo essa a técnica

desenho factorial fraccionário.

-Capítulo 2-

52

2 Procedimento Experimental

2.1 Material e reagentes utilizados ao longo do trabalho

De seguida apresenta-se uma tabela com o resumo de todos os materiais e

reagentes utilizados na realização das diferentes determinações experimentais.

Tabela 8: Tabela de materiais e reagentes utilizados Material

- Filme poliéster Millinex

- Gobelés

- Agitador magnético Magnestir, Lab-line Instrum. Inc.

- Placa aquecimento MR3001 Heidolph

- Fonte de tensão ±15V, CFUP

- Balança AG245, Mettler Toledo

- Saco de luvas

- Tubo teflon

- Tubo de vidro

- Microespátula

- Secador ar quente

- Potenciostato SI 1287 – Solartron Instrum.

- Potenciostato EG&G Model 273

- pH Meter Crison-MicropH 2000

- Banho termostatizado type SU5 – Grant Instrum.

- Célula de vidro de 4 eléctrodos

- Eléctrodos de Ag/AgCl

- Eléctrodos de platina

- Fios de prata, Aldrich

- Parafilme M®

- Silicone Bricobi

- Analisador da Resposta de Frequência (ARF) SI 1250 – Solartron Instrum.

-Capítulo 2-

53

Reagentes

- 1,2-dicloroetano (1,2-DCE), 99%, Aldrich - 1,3:2,4-dibenzilideno sorbitol (DBS), Milliken

- 1,4-Dibromobutane (1,4-DBB), >=98.00%,bdh

- 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazina (PDT), Sigma

- 5,6-Difenil-3-(2-piridil)-1,2,4-triazina (DPT), >=99.00%, Aldrich - Acetato de Sódio (CH3COONa), 99.00%, Merck

- Acetona Pronalab - Àcido Clorídrico (HCl) , puro. pronalab/panreac - Agár Bacto, DIFCO Lab.

- Água ultra pura Millipore - Amoníaco (NH3), puro. Pronalab - Bis(trifenil phosphoranilideno) Amónio Tetraquis(4-Clorofenil)-Borato(BTPPATPBCl),

- Borohidreto de Sódio(NaBH4) , >96.00%, for synthesis. Merck-schuchardt

- Cloreto de Bis(trifenil fosphoranilideno) Amónio (BTPPACl), 97.00%, Aldrich - Cloreto de sódio (NaCl), 99,5%, Merck

- Decametilferroceno (C20H30Fe), >95.00%, for synthesis. Fluka

- Diidrogenofosfato de Sódio (NaH2PO4),p.a. Aldrich - Etanol, 99.8%, Merck

- Éter o-nitrofeniloctílico (o-NPOE), Fluka - Fenosafranina (C18H15ClN4),for microscopy. Fluka - Glucose oxidase, 23 U de aspergillus níger, Fluka - Hidrogenofosfato de Sódio (Na2HPO4),p.a. Merck - Hidróxido de lítio (LiOH), 98%, Merck - Hidróxido de Sódio (NaOH), 99.00%,Puro. Merck - Metilviologénio Dicloro Hidrato, 98.00%,aldrich-chemie - Nitrato de Potássio(KNO3) , 99.00%, M&B - Nitrato redutase (NaR), 97.00%, Aldrich - Policloreto de Vinil(PVC) de elevada massa molecular, Sigma - Sal de Fenosafranina e Tetraquis(4-Clorofenil)-Borato (Ps-TPB), - Sal de Fenosafranina e Bis(trifenil fosphoranilideno) Amónio (BTPPA-Ps)

- Solução tampão, pH=4,01

- Solução tampão, pH=7,02 - ß-Nicotinamida Adenina Dinucleótido,forma reduzida sal dissódico (NADH), 97.00%,Sigma - Tetrafenilborato de sódio (NaTPB), 99,5%, Merck - Tetraoctilamónio Tetra Fenil Borato (TOATPB)

-Capítulo 2-

54

- Tetraquis-(4-Clorofenil)-Borato de Potássio , >=98.00%, Fluka - Tetraquis(4-Clorofenil)-Borato de Potássio(KTPBCl c24h16BCl4K), 9.00%, Merck - α-Nicotinamida adenina núcleótido(C21H27N7O14P2), 95.00%,Sigma

2.2 Métodos utilizados ao longo do trabalho

2.2.1 Preparação dos eléctrodos de Ag/AgCl

Após soldar um fio de prata a um fio de cobre, une-se o último pela extremidade a

uma resistência de 85 kΩ que se encontra ligada ao pólo positivo da fonte. Mergulha-

se o fio de prata num gobelé contendo uma solução 3M de cloreto de sódio à qual se

adicionam umas gotas de ácido clorídrico concentrado, para evitar a formação de

hidróxidos. A solução é colocada sob agitação contínua, e coloca-se um outro fio de

prata ligado ao pólo negativo da fonte. Aplica-se então uma diferença de potencial de

10 V durante algumas horas. Quando o fio de prata se encontrar revestido por uma

camada cinzenta, considera-se que o eléctrodo de Ag/AgCl está pronto a ser utilizado.

2.2.2 Síntese do tetrafenilborato de tetraoctilamónio (TOATPB)

O TOATPB utilizado nas diferentes experiências electroquímicas foi sintetizado de

acordo com o procedimento utilizado neste grupo de investigação, relatado por Pereira

et al98, e que a seguir se descreve:

- Prepara-se uma solução de NaTPB em água/etanol 50% (v/v), sendo que a

quantidade de NaTPB depende apenas da quantidade de TOATPB que se pretende

prepara.

- Prepara-se uma outra solução de TOABr em água/etanol 50% (v/v).

- Misturam-se bem estas duas soluções, observando-se a precipitação do TOATPB.

- Deixa-se a solução repousar durante 4 horas e filtra-se o precipitado usando vácuo.

- Purifica-se o TOATPB por re-cristalização com acetona. Solubiliza-se o composto e

remove-se a acetona por evaporação à temperatura ambiente com arejamento,

formando-se os cristais de TOATPB.

-Capítulo 2-

55

2.2.3 Preparação dos géis

Gel orgânico

Transfere-se uma dada quantidade (≅ 10 ml) de o-NPOE para um gobelé, em

atmosfera de azoto, pela utilização de um saco de luvas. Pesa-se a quantidade de o-

NPOE. Após pesagem coloca-se o gobelé sobre uma placa de aquecimento a 150 ºC.

Agita-se a solução até que todos os compostos se dissolvam completamente e deixa-

se arrefecer, formando-se o respectivo gel.

Gel aquoso de referência

Pesam-se 0.2 g de agár Bacto para um gobelé e adicionam-se 10 ml de solução

aquosa de referência 10 mM NaCl e 10 mM NaTPB. Coloca-se o gobelé sobre uma

placa de aquecimento a uma temperatura de 90 ºC e agita-se até que o agár se

encontre completamente dissolvido e deixa-se arrefecer.

2.2.4 Preparação da célula electroquímica de 4 eléctrodos

A utilização de células de vidro no estudo das ITIES prende-se com a facilidade da

montagem experimental, maior rapidez na sua preparação, pela reprodutibilidade do

valor da área da interface e pelos pequenos volumes de solventes presentes nas

diferentes fases. Todavia, a utilização de um solvente orgânico introduz uma elevada

queda óhmica na interface entre as duas fases imiscíveis. A utilização de quatro

eléctrodos vem corrigir esse efeito facilitando o estudo electroquímico da interface

formada. Na Figura 17 descreve-se em pormenor os constituintes da célula de vidro

usada para as medições electroquímicas de interfaces líquido-líquido.

-Capítulo 2-

56

Figura 17: Representação esquemática da célula de vidro de 4 eléctrodos utilizada nas

determinações de impedância. 1. Interface de área interna igual a 0.28 cm2; 2. Eléctrodo de platina; 3. Capilares de Luggin; 4. Fase aquosa; 5. Fase orgânica; 6. Fase orgânica de referência; 7.

Eléctrodos de Ag/AgCl; 8. Eléctrodo de platina.

Célula electroquímica

Figura 18: Diagrama esquemático da célula usada nas medições electroquímicas

Para a preparação da célula representada utilizou-se o seguinte procedimento:

- Lava-se a célula muito bem utilizando, alternadamente etanol, água e acetona após

o que se seca a célula com a ajuda de um secador de ar quente durante cerca de 5

minutos e deixa-se arrefecer;

- Prende-se a célula num suporte no interior da hotte e com a ajuda de uma pipeta

de Pasteur coloca-se um volume de solvente orgânico suficiente para atingir a

interface.

- Adiciona-se fase orgânica de referência até a fase orgânica ultrapassar

ligeiramente a interface e adiciona-se fase aquosa até a fase orgânica se separar, mas

sem que a fase aquosa atravesse o limite inferior da interface.

- Adiciona-se, alternadamente, fase orgânica de referência e fase aquosa até

perfazer os volumes pretendidos e mergulham-se os eléctrodos.

1. 2. 3.

3.

7. 7.8.

4.

5.

6.

5.

4.

100mM LiClx µM NaR

(aq.) 10mM TOATPB

(1,2-DCE)

10 mM NaTPB10 mM NaCl

(aq.) AgCl/Ag’

AgCl/Ag 10 mM NaTPB10 mM NaCl

(aq.)

-Capítulo 2-

57

- Deixa-se a célula em repouso durante cerca de 30 minutos antes de se dar inicio

às determinações de impedância, de modo a permitir que se estabeleça uma situação

de equilíbrio.

2.2.5 Técnica: Voltametria cíclica

A voltametria cíclica é uma técnica voltamétrica que pode ser considerada como

uma variação, mais elaborada, da voltametria linear. Embora possa ser aplicada com

fins quantitativos, é mais utilizada como técnica qualitativa. Nesta técnica aplica-se

uma rampa de potencial a um eléctrodo de trabalho, variando entre de um valor

máximo e mínimo de potencial que correspondem ao início e término do varrimento,

em cada um dos sentidos no potencial. Esta rampa apresenta a forma descrita na

Figura 19:

Figura 19: Relação potencial-tempo em voltametria cíclica99.

Durante o varrimento do potencial, o potenciostato, para além de controlar o

potencial do eléctrodo de trabalho (relativamente ao do eléctrodo de referência), mede

a intensidade de corrente resultante dos fenómenos que ocorrem através da interface.

A Figura 20 apresenta um voltamograma típico de transferência iónica em interfaces

líquido-líquido. A partir deste obtém-se os parâmetros mais importantes, como os

valores da intensidade de corrente para a transferência iónica (Ip+ e Ip-) e o potencial de

pico (Ep+ e Ep-). Esta intensidade de corrente sob a forma de pico surge quando os

processos de difusão são predominantemente lineares.

-Capítulo 2-

58

Figura 20: Voltamograma cíclico teórico para uma transferência iónica. (A) a espécie não se encontra transferida; (B) Transferência de um catião Aq-Org ou anião Org-Aq; (C) inversão do sentido do potencial; (D) Transferência de um anião Aq-Org ou catião Org-Aq;

É possível relacionar a intensidade de corrente de pico para reacções de

transferência iónica directa de iões, reversíveis e controladas por difusão linear,

através da equação de Randles-Sevčik:

21

212

1

4463,0 vDRT

FzFAczI iib

iip

=

Eq. 40

Em que Ip corresponde à intensidade de corrente de pico em amperes, A a área

interfacial em cm2, v é a velocidade de varrimento em V.s-1, bic é a concentração do ião

na solução em mol.cm-3 e Di é o coeficiente de difusão do ião em cm2.s-1.

No entanto para que esta relação seja válida é necessário que se satisfaçam as

seguintes condições:

Os potenciais de transferência sejam independentes da velocidade de

varrimento;

A diferença entre os potenciais de pico seja igual a 59/z mV, a 25 ºC, em que z

representa a carga da espécie iónica que se transfere através da interface;

-Capítulo 2-

59

2.2.6 Técnica: Espectroscopia de Impedância Electroquímica

A Espectroscopia de Impedância Electroquímica (EIE) é uma técnica importante na

caracterização de sistemas electroquímicos, bastante utilizada na investigação de

reacções de transferência de espécies através de membranas lipídicas100, de

transferência iónica em interfaces água|1,2-DCE101, nos estudos de semicondutores102,

na caracterização da natureza e propriedades de filmes óxido103 ou em biossensores

para a determinação de glucose baseados em células eucarióticas104. Um artigo de

revisão recente105, descreve os avanços que continuam a surgir nas aplicações da

espectroscopia de impedância, não só na caracterização da estrutura e funcionalidade

de vários tipos de biossensores, tais como, imunossensores, sensores de ADN e

biossensores biocatalíticos baseados em enzimas, mas também no acompanhamento

da construção de estruturas biológicas em suportes condutores multicamadas, na

observação da afinidade das interacções de biomoléculas e na monitorização de

reacções biocatalíticas.

O princípio da EIE, ou impedância electroquímica como é por vezes conhecida,

baseia-se na aplicação de uma perturbação sinusoidal de pequena amplitude e na

determinação da resposta do sistema a essa perturbação, quando este se encontra

em estado estacionário. Se for sobreposta uma onda sinusoidal de baixa amplitude

( )tEsen ω∆ , a uma dada frequência angular ω , ao potencial de polarização dc E0,

deverá ocorrer como resposta uma onda sinusoidal ( )φω +∆ tIsen , que pode ser

relacionada com o potencial aplicado, em φ que representa o ângulo de fase. A

resposta à perturbação pode sofrer efeitos na sua amplitude e no ângulo da fase,

dependendo das características e dos processos que ocorrem no sistema em estudo.

Na figura seguinte (Figura 21) representa-se esquematicamente a curva de resposta

típica de um sistema electroquímico.

-Capítulo 2-

60

Figura 21: Representação esquemática da resposta de um sistema electroquímico a uma

perturbação sinusoidal102.

Esta relação difere de acordo com o potencial aplicado: ac ou dc. Na teoria dc, caso

especial da teoria ac em que a frequência é igual a 0 Hz, é possível utilizar a lei de

Ohm para se obter relação entre o potencial (V) e a corrente (I).

IVR =

Eq. 41 Na teoria ac, na qual a frequência difere de 0 Hz, esta relação é definida por:

ac

ac

IVZ =

Eq. 42

em que Z é definido como sendo a impedância, o equivalente ac da resistência (R).

Existem, no entanto, duas formas de representar a impedância:

Através da utilização de números complexos, em que a impedância é

definida por:

-Capítulo 2-

61

''' iZZZ −= Eq. 43

em que Z’ e Z’’ são, respectivamente, as componentes real e imaginária da

impedância;

Através de uma representação vectorial, utilizando coordenadas

Cartesianas:

Figura 22 : Representação vectorial da impedância de um sistema.

Neste sistema de eixos a projecção da impedância sobre o eixo das coordenadas dá

origem à componente imaginária ( ''Z ), enquanto que a projecção sobre o eixo das

abcissas corresponde à componente real ( 'Z ) da impedância.

A impedância total de um sistema é assim resultado da adição vectorial da impedância

de cada um dos componentes que compõe o sistema. A Tabela 9 sistematiza as

impedâncias associadas aos elementos mais frequentes que compõem os circuitos

equivalentes usados para caracterizar sistemas electroquímicos:

-Capítulo 2-

62

Tabela 9: Resumo dos elementos presentes em circuitos eléctricos equivalentes106,107.

Componentes Impedância º/φ

R, Resistência R 0

C, Capacidade

Cjω1

90

L, Indutância Ljω 90

Q, Elemento de Fase Constante

( )njQ ω1

45 a 90

n = 0.5 a n = 1

W, Warburg

(Camada de difusão infinita) ωσj

j)1( − 45

A caracterização de um sistema electroquímico através da EIE pressupõe, portanto,

a interpretação dos resultados por meios de modelos adequados. O modelo descrito

por um circuito equivalente é então ajustado aos resultados experimentais para se que

possa prever o comportamento do sistema em várias condições. Não sendo mais que

um circuito constituído por vários componentes eléctricos, nomeadamente,

resistências, condensadores, indutores e por outros elementos como o elemento de

fase constante (Q) e a impedância de Warburg (Tabela 9) que simulam o

comportamento da interface. A combinação destes elementos em série ou em paralelo

entre si dá origem aos referidos circuitos equivalentes aos quais se atribui um

determinado significado físico. Teoricamente, é possível representar qualquer sistema

em que apenas ocorram processos químicos utilizando resistências e capacidades.

A aplicação da EIE no estudo dos diversos sistemas electroquímicos só é possível

fazendo uso de modelos que são designados por circuitos eléctricos equivalentes. O

comportamento das ITIES submetido a uma perturbação sinusoidal poder ser descrita

pelo circuito eléctrico equivalente que se encontra representado na Figura 23, e que é

normalmente utilizado no ajuste dos resultados experimentais de reacções de

transferência de carga, o circuito de Randles, em que Cd é a capacidade da interface,

Zf a impedância faradaica e Rs a resistência da solução entre as pontas dos capilares

de Luggin.

-Capítulo 2-

63

Figura 23: Circuito equivalente representativo das ITIES, denominado de circuito de Randles.

Os elementos Zf e Cd são introduzidos em paralelo porque a corrente total através da

interface é a soma de uma parcela faradaica, If, devida à transferência de iões e de

uma parcela capacitiva, relativa ao processo de carga da dupla camada. Para

sistemas em que as reacções de transferência podem ser consideradas relativamente

rápidas, a impedância faradaica transforma-se na impedância de Warburg Zw,

particularmente para baixos valores de frequência.

Experimentalmente, as determinações são efectuadas a vários potenciais d.c. e a

frequência da perturbação sinusoidal é variada num intervalo definido, por isso é que a

impedância electroquímica é denominada normalmente de espectroscopia de

impedância electroquímica.

Contudo, a impedância que se obtém é a impedância global da interface, devida às

contribuições dos vários componentes presentes, cuja relação com a respectiva

impedância é conhecida (ver Tabela 9). É então possível pela análise da forma como

a impedância total, Z, varia com a frequência angular (obter os valores dos

componentes presentes no circuito equivalente. Esta análise é determinada pela

representação no plano complexo de -Z’’ vs. Z’ para diferentes frequências angulares

(e é denominada de diagrama de Nyquist).

2.2.7 Caracterização da interface

Nas experiências de impedância electroquímica é necessária a utilização de um

potenciostato e de um analisador de resposta da frequência (ARF). Numa primeira

fase aplica-se uma rampa de potencial ao sistema electroquímico com o objectivo de

se obter o intervalo de potencial no qual a interface apresenta o comportamento

Ic

If

(Ic+If)

Cd

Zf

Rs

-Capítulo 2-

64

apropriado para as determinações da capacidade (Cdc) por Espectroscopia de

Impedância Electroquímica, isto é, no intervalo onde a interface se comporta como

idealmente polarizável, a chamada “janela de potencial”.

Após a obtenção do voltamograma cíclico para, acciona-se o ARF e aplica-se um

varrimento de frequência entre 1 e 300 Hz, a vários potenciais d.c. cujos limites são

determinados pela rampa de potencial aplicada anteriormente, no intervalo

correspondente à “janela de potencial”.

A interpretação dos resultados da EIE é realizada pela representação do diagrama

de Nyquist, à qual se ajustam os circuitos equivalentes possíveis de descrever o

comportamento da curva experimental, utilizando o programa Equivalent Circuit

desenvolvido por B.A. Boukamp, (versão 3.97 de 1989). A Figura 24: Circuito

equivalente utilizado no ajuste da célula electroquímica : R(C(RW)).esquematiza o

circuito equivalente utilizado no ajuste da maioria das curvas experimentais da célula

electroquímica, e como podemos ver é um caso especial do circuito representado na

Figura 23: Circuito equivalente representativo das ITIES, denominado de circuito de

Randles. quando a impedância faradaica se encontra associada a uma resistência de

transferência de carga e à impedância de Warburg representando o processo de

difusão.

Figura 24: Circuito equivalente utilizado no ajuste da célula electroquímica : R(C(RW)).

-Capítulo 2-

65

2.2.8 Técnica: Goniometria, medição de ângulos de contacto

Um dos problemas ao preparar sensores baseados em microinterfaces

líquido/líquido é o da possibilidade de a enzima adsorver no poliéster usado para

suportar as interfaces. A goniometria poderá ser uma forma de avaliar a existência ou

não de adsorção da enzima à superfície da membrana.

Para a determinação dos ângulos de contacto começou-se por alinhar o sistema de

medição.

Figura 25: imagem do goniómetro

Seguidamente procedeu-se à preparação dos filmes de PET ou lâminas de gel

orgânico, conforme o caso fazendo-se uma simples limpeza com etanol e acetona

quando se usam os filmes de PET e, quando se usam géis orgânicos, obtendo-se por

corte fresco uma superfície de teste o mais lisa possível, podendo-se em ambos os

casos depositar outras substâncias.

-Capítulo 2-

66

Seguidos estes passos, realiza-se a aquisição da imagem após cada nova gota

depositada na superfície em teste. A imagem obtida é tratada pelo software. Primeiro a

imagem da gota é digitalizada e convertida num conjunto de pontos correspondentes à

interface líquido-gasosa aparecendo como uma função em forma de U invertido,

seguidamente é feito um ajuste linear aos 50 pontos de cada extremidade, sendo

esses os pontos mais próximos do ponto triplo, (sendo este o 2º método de

interpretação usado). Inicialmente de modo a obter o ângulo de contacto tentou-se

ajustar um polinómio do terceiro grau e encontrar as derivadas nos pontos triplos, mas,

devido aos erros mais elevados, optou-se por, paralelamente, obter o ângulo de

contacto correspondente a cada ponto triplo a partir do declive de cada uma das

rectas). É feita a média dos dois valores de cada gota para se compensar quaisquer

possíveis desvios à horizontalidade do eixo da câmara. Seguidamente são removidos

os “outlyers” (são removidos os ajustes com um R menor que 0,9 e os conjuntos de

ângulos com mais de 10º de diferença por indicarem irregularidades na superfície) e

finalmente é feita uma média dos ângulos de contacto corrigidos, sendo assim

possível eliminar a parte dos desvios devidos ao analista.

Figura 26: imagem do perfil de uma gota em repouso num filme de PET

Base

-Capítulo 3-

67

3 Resultados

3.1 Optimização da concentração de Enzima

Sendo que um dos principais factores que contribui para a versatilidade e

aplicabilidade de um biossensor amperométrico, bem como para o seu custo de

fabrico, é a quantidade de enzima, procurou-se fazer um estudo de forma a optimizá-

la.

Assim, e visto que o pH das soluções a usar era próximo do pretendido optou-se por

estudar soluções apenas de enzima e electrólito de modo a eliminar quaisquer

complicações. Começou-se por aplicar voltametria cíclica numa célula de quatro

eléctrodos com a seguinte composição:

Célula electroquímica

Figura 27: Diagrama esquemático da célula usada nas medições electroquímicas

Na tentativa caracterizar o comportamento da enzima que se pretendia utilizar

(aspectos como a adsorção na interface e a eventual acumulação de carga à

superfície), determinaram-se as curvas de capacidade da dupla camada para

diferentes concentrações de NaR numa macrointerface líquido-líquido. Para tal

utilizou-se uma célula de vidro de 4 eléctrodos (esquematizada na Figura 17) com uma

macrointerface água|1,2-DCE de 0.28 cm2 de diâmetro.

Assim, na Figura 28 representam-se os voltamogramas cíclicos obtidos usando a

célula electroquímica representada na Figura 27:

100mM LiClx µM NaR

(aq.)

10mM TOATPB (1,2-DCE)

10 mM NaTPB10 mM NaCl

(aq.)

AgCl/Ag’

AgCl/Ag

-Capítulo 3-

68

Figura 28: Voltamogramas cíclicos prévios feitos na ausência e na presença de NaR

A resposta obtida nos ensaios prévios de voltametria permite determinar a janela de

potencial que será usada nas medições de impedância para determinar o

comportamento da enzima num interface H20/DCE (1,2-dicloroetano).

-Capítulo 3-

69

Figura 29: Espectro de impedância típico e (em cima) circuito equivalente usado na análise.

Tendo-se obtido uma série de medições de impedância, e, usando um dos circuitos

equivalente representados nas figuras Figura 23 e Figura 24, calcula-se a capacidade

do circuito para aquele potencial, tornando-se possível construir uma curva de

capacidade/potencial para cada concentração.

Para o cálculo dos valores de capacidade, o ajuste de um circuito equivalente do tipo

R(C(RW)), como representado na Figura 24, foi o mais adequado à maioria dos pontos

da curva experimental. De acordo com este resultado é possível atribuir a este sistema

electroquímico um significado físico para os vários elementos. Verifica-se a existência

uma resistência Rsol devida à resistência da solução entre as pontas dos capilares de

Luggin, da capacidade da interface Cdc pela acumulação de carga na dupla camada

interfacial e devido à transferência de iões através da interface a presença de uma

impedância de Warburg e de uma resistência à transferência de carga Rtc. A

representação de Cdc=f(E) dá-nos as curvas de capacidade, como representadas na

Figura 30 para diferentes concentrações de NaR.

-Capítulo 3-

70

Curvas de capacdade obtidas numa interface água/1,2-dichloroetano. Efeito da concentração de NaR usando EIS

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 100 200 300 400 500 600

potencial de medida / mV

Cap

acid

ade

/ µF

1000nM NaR

100nM NaR

10nM NaR

1nM NaR

0nM NaR

Figura 30: Curvas de capacidade obtidas numa interface água/1,2-dicloroetano. Efeito da concentração de NaR. (é de notar que este conjunto de ensaios foi realizado num aparelho diferente sendo a escala de potencial aplicado diferente)

Analisando a Figura 30 é possível verificar que o comportamento das várias curvas

se sobrepõem até certo ponto em parte do intervalo de polarização, no entanto essa

sobreposição não se verifica numa região significativa do intervalo de polarização

indicando a existência de fenómenos de adsorção de NaR na interface para valores

menos positivos de potencial.

O aumento de concentração de NaR resulta no decréscimo de capacidade a

potenciais menos positivos em particular até 300mV. Isto é geralmente atribuído à

adsorção de moléculas na interface líquido/líquido. Para concentrações de NaR acima

de 100nM aparecem efeitos de saturação (notando-se a diminuição da capacidade da

dupla camada). Isto permite optimizar o sensor pois mostra que a enzima é

suficientemente lipofílica para ser adsorvida, não havendo tendência para que a

reacção se dê no seio da solução. De notar que após montagem da célula,

aguardaram-se 30 minutos antes de realizar as determinações para permitir a

adsorção da enzima na interface.

-Capítulo 3-

71

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

[NaR] / nM

Cd /

µF.

cm-2

E = 200mV E = 250mV E = 300mV

Figura 31: Comparação dos valores de capacidade obtidos na interface água/1,2-dicloroetano a vários potenciais e para diferentes concentrações de enzima.

A realização dos voltamogramas cíclicos antes do início das determinações de

impedância electroquímica comprova também que não há transferência de NaR

protonada através da interface.

A partir das curvas de capacidade é possível calcular o grau de cobertura da

interface pela enzima. Considerando que para concentrações de NaR acima de 100nM

1=θ temos que nM

lbenz

CCC

100

−=θ (em que θ é o grau de cobertura interfacial, enzC é a

capacidade obtida para determinada concentração da enzima, lbC é a capacidade

obtida para a linha de base e nMC100 é a capacidade obtida para uma situação

estacionária). Considerando que a adsorção de uma enzima pode ser representada

pela isotérmica de Langmuir108 é possível obter-se a seguinte relação:

βθθθ ln2)1.(ln +=

− a

CNaR

Eq. 44

-Capítulo 3-

72

A representação da Eq. 44 permite avaliar a energia de Gibbs do processo de

adsorção.

Onde a representa o parâmetro interacção entre as moléculas e β pode ser

relacionado com o parâmetro AdsG∆ da seguinte forma

RTG∆−

=βln

Eq. 45

Representando

− )1.(ln θθ

NaRCem função de θ vem que:

Título do gráfico

y = 5.4429x + 16.259R2 = 0.4916

10

12

14

16

18

20

22

24

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

θ

ln(θ

/CN

aR(1

-θ))

Figura 32: Avaliação de parâmetros de adsorção na interface água/1,2-dicloroetano obtidos a vários potenciais entre -500 e -150 mV ( -500; -400; -350; -300; -250; -200; e -150mV).

Obtendo β por regressão linear e aplicando a equaçãoEq. 45 obtêm-se os resultados

representados na Figura 33:

-Capítulo 3-

73

-50

-49

-48

-47

-400 -350 -300 -250 -200 -150 -100

Potencial / mV

∆G /

kJ.m

ol-1

Figura 33: Variação da energia de Gibbs com o potencial.

Neste caso obteve-se uma energia de Gibbs que varia entre -47kJ/mol e -55 kJ/mol

(-49.8±2.3 kJ/mol) no intervalo em que se verifica fenómenos de adsorção que é da

ordem de magnitude dos valores de ∆G encontrados para a adsorção de lípidos em

interfaces líquido/ líquido.

100

120

140

160

180

200

220

240

0 20 40 60 80 100 120

[NaR] / nM

∆Фca

p.pi

co/ M

V

Figura 34: Variação do mínimo de capacidade com a concentração de NaR até saturação da interface

-Capítulo 3-

74

355

360

365

370

375

380

385

390

0 200 400 600 800 1000

[NaR] / nM

∆Фm

in.c

ap./

MV

Figura 35 Variação do mínimo de capacidade com a concentração de NaR até formação de bi-camada

O potencial mínimo mantém-se constante entre 15 e 100 nM da enzima em solução,

todavia para concentrações muito maiores aumenta a capacidade, o que pode a

formação de uma bicamada. Não houve no entanto tempo para aprofundar a

investigação.

A presença do anião Nitrato poderia também ter efeitos, tanto na capacidade da

dupla camada como na janela de potencial utilizável. Assim procurou-se observar o

seu efeito numa solução de NaR 50nM. De modo a poder fazer a comparação e tendo

em conta que qualquer adição altera a posição da interface realizaram-se ensaios em

branco numa célula idêntica mas em que a adição era apenas de electrólito.

-Capítulo 3-

75

Figura 36: Efeitos da presença de Nitrato numa solução de 3mL sol com 10mM de LiCl + 50 nM NaR + 50mM MV em que (a) e (ak) são as linhas de base com uma composição semelhante mas em que o interface está em posições diferentes, (bk) contém 10 µM KNO3, (ck) contém 50 µM KNO3 tendo em (c) sido adicionado um volume semelhante de solução 10mM LiCl, (dk) contém 500 µM KNO3 tendo em (d) sido adicionado um volume semelhante de solução 10mM LiCl, (ek) contém 1000 µM KNO3 tendo em (e) sido adicionado um volume semelhante de solução 10mM LiCl,

Apesar de existirem diferenças entre as linhas de base que dificultam a comparação,

analisando o gráfico (Figura 36) verifica-se que a presença de nitrato provoca o

aumento do pico de transferência e uma ligeira diminuição do intervalo de potencial a

ser usado não impossibilitando no entanto a continuação do estudo.

3.2 Dadores Enzimáticos A presença de dadores electrónicos na proximidade da enzima permite que esta

passe da sua forma oxidada de novo para a sua forma reduzida que apresenta

actividade catalítica (estes dadores electrónicos serão eles próprio oxidados, podendo,

posteriormente ser reduzidos por acção electroquímica). Assim, de modo a manter a

concentração da forma activa da enzima o mais constante possível ao longo do tempo

é necessário que no biossensor exista uma grande quantidade de dador. Isto leva-nos

a tentar encontrar o dador mais eficiente e estudar o seu efeito no comportamento

global do biossensor.

Testaram-se três dadores: o NAD(H), o Metil viologénio (MV) e a fenosafranina (PS).

Devido ao longo tempo de espera de cada ensaio (até 13h) optou-se por elaborar um

-Capítulo 3-

76

planeamento experimental que permitisse avaliar os efeitos e interacções dos três

elementos participantes na reacção: a concentração de nitrato redutase e a presença

de anião nitrato (KNO3) e do dador minimizando o tempo gasto e maximizando a

informação obtida.

Para tal usou-se a seguinte célula electroquímica:

Figura 37: Célula electroquímica usada para a caracterização do comportamento de adsorção da NaR.

Tabela 10: Planeamento experimental utilizado para testar o efeito dos dadores

68.8 µM LiNO3

6.88 µM LiNO3

Bloco a

Bloco b

Bloco c

Bloco d

2.10nM NaR a-x b-x

0.5 mM NAD(H) Sem dador 0.5 mM

MV 0.5 mM

PS 10.00 nM NaR c-x d-x


MV 0.5 mM

PS 100.0 nM NaR e-x f-x


MV 0.5 mM

PS 0.00 nM NaR h-x g-x


MV 0.5 mM

PS

Em que o x em a-x por exemplo vai corresponder a a, b, c ou d conforme o dador

que está ou não presente. Este género de planeamento experimental permite verificar

a existência de efeitos entre os vários parâmetros experimentais. É ainda possível a

identificação de factores com efeitos sinérgicos (neste caso até 3ª ordem)

encontrando-se na Tabela 10 descrito o planeamento utilizado no nosso caso. Assim,

aplicando EIS nas diferentes condições de partida foram obtidos os seguintes

resultados para os vários blocos:

10 mM NaTPB 10 mM NaCl

(Aq.)

10 mM TOATPBDBS 1.8 %

(1,2-DCE)

Ag/AgCl AgCl/Ag’

10 mM NaCl x nM NaR

x mM KNO3 0.5 mM Dador

(Aq.)

-Capítulo 3-

77

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0


Capa

cida

de /

µF

aa

ba

ca

db

ea

fa

ga

hb

Figura 38: Capacidades da interface obtidas para o bloco A em que se varia os níveis de NAD(H), NaR e anião nitrato e usando EIS.

Nas figuras 28 a 41 mostram-se os resultados experimentais obtidos para os

diferentes blocos experimentais. Nestas figuras encontra-se representada a

capacidade da interface da célula electroquímica mencionada na Figura 37.

-Capítulo 3-

78

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0


Cap

acid

ade

/ µF

ab

bb

cb

da

eb

fb

gb

ha

Figura 39: Capacidades da interface obtidas para o bloco B em que não se faz uso de dadores e em que se varia os níveis de NaR e anião nitrato e usando EIS.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0


Capa

cida

de /

µF

ac

bc

cc

dc

ec

fc

gc

hc

Figura 40: Capacidades obtidas para o bloco C em que se faz uso do metil viologénio (Versão não ajustada aparece centrada nos picos)

-Capítulo 3-

79

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0


Capa

cida

de /

µF

ac

bc

cc

dc

ec

fc

gc

hc

Figura 41: Capacidades obtidas para o bloco C em que se faz uso do metil viologénio (com acerto semelhante aos outros blocos, pelo lado menos negativo)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0


Capa

cida

de /

µF

ad

bd

cd

dd

ed

fd

gd

hd

Figura 42: Capacidades obtidas para o bloco D em que se faz uso da fenosafranina

De modo a permitir uma analise numérica dos resultados, a partir dos espectros de

impedância obtidos para cada bloco (Figura 38 a Figura 42, respectivamente NAD(H),

ausência de dador (branco), MV e PS), de modo a compensar as variações diárias nas

-Capítulo 3-

80

condições e facilitar comparações foram obtidos pontos por amostragem a potenciais

fixos em todos eles. Estes pontos encontram-se expostos na Tabela 16 ( ver anexo)

Apesar de na prática serem blocos de experiências 2x2x4 (sempre usando os dados

de um bloco com dador e os do bloco B ou linha de base), é possível interpreta-los

apenas como vários blocos 2x2x2. Assim, de modo a permitir a interpretação, cada

bloco foi dividido em três, um para cada concentração de NaR. Usando o algoritmo de

Yates para este planeamento obtêm-se os seguintes efeitos (valores na Tabela 17, ver

anexos):

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (2,1 nM)

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-525 -425 -325 -225 -125

Potencial de medida / mV

efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF

médiaNAD(H)NaRNAD(H)+NaRNitratoNAD(H)+NitratoNaR+NitratoNAD(H)+NaR+Nitrato

Figura 43: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (2,1 nM)

-Capítulo 3-

81

-500

-350

-250

-150

NAD(H)

NAD(H)xNaR

NAD(H)xNitrato

NAD(H)xNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0

normalização do efeito em

relação á média / % capacidade

Potencial de medição / mV

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (2,1 nM)

normalizadosNAD(H)

NaR

NAD(H)xNaR

Nitrato

NAD(H)xNitratoNaRxNitrato

NAD(H)xNaRxNitrato

Figura 44: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (2,1 nM) normalizados em relação à média.

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (10 nM)

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-525 -475 -425 -375 -325 -275 -225 -175 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF

médiaNAD(H)NaRNAD(H)+NaRNitratoNAD(H)+NitratoNaR+NitratoNAD(H)+NaR+Nitrato

Figura 45: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (10 nM)

-Capítulo 3-

82

-500

-350

-250

-150

NAD(H)

NAD(H)xNaR

NAD(H)xNitrato

NAD(H)xNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0





normalizados

NAD(H)

NaR

NAD(H)xNaR

Nitrato


NAD(H)xNaRxNitrato

Figura 46: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (10 nM) normalizados em relação à média.


-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-525 -425 -325 -225 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF média

NAD(H)NaRNAD(H)+NaRNitratoNAD(H)+NitratoNaR+NitratoNAD(H)+NaR+Nitrato

Figura 47: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (100 nM)

-Capítulo 3-

83

-500

-350

-250

-150

NAD(H)

NAD(H)xNaR

NAD(H)xNitrato

NAD(H)xNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0





normalizados

NAD(H)

NaR

NAD(H)xNaR

Nitrato


NAD(H)xNaRxNitrato

Figura 48: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, NAD(H) e de NaR (100 nM) normalizados em relação à média.

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

0

5

10

15

20

Capacidade / µF


[NaR] / nM

média

2,1nM10nM100nM

Figura 49: Evolução da capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-400

-350

-300

-250

-200

-150

2,1nM

100nM

-15

-10

-5

0

5

Efeito na capacidade / µF


[NaR] / nM

NAD(H)

2,1nM10nM100nM

Figura 50: Evolução do efeito do dador na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-Capítulo 3-

84

-500

-400

-350

-300

-250

-200

-150

2,1nM

100nM

-10

-5

0

5

10



[NaR] / nM

NaR

2,1nM10nM100nM

Figura 51: Evolução do efeito da enzima na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração desta.

-500

-400

-350

-300

-250

-200

-150

2,1nM

100nM

-10

-5

0

5



[NaR] / nM

Nitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 52: Evolução do efeito do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

Usando como dador o NAD(H) e analisando as tendências do efeito tanto dele

próprio como dos outros elementos, torna-se evidente que para os potenciais de

fronteira (nos quais o interface começa a não se comportar idealmente e , visto a

capacidade ser maior, se perder resolução) se consegue maiores valores de

capacidade e efeitos. A falta de um pico claro e de uma variação linear da capacidade

com a concentração de nitrato dificultam a possibilidade de aplicação efectiva no

biossensor. Os efeitos de primeiro grau são, exceptuando nos potenciais fronteira,

pouco significativos o que demonstra a pouca sensibilidade no intervalo de potencial

usado. As zonas de potencial de fronteira, em que se tem um grau de incerteza

bastante superior ( devido aos acertos necessários para realizar ao ajuste), implicam

fortes possibilidades de erro humano ou de ajuste devendo por isso ser evitadas se

possível.

Analisando o efeito do factor nitrato o uso de NAD(H) deveria ser feito para uma

concentração de NaR máxima de pois no intervalo de potenciais intermédios é o que

apresenta maiores efeitos ( comparando com as outras concentrações de enzima).

Os gráficos correspondentes aos efeitos de grau superior encontram-se em anexo

(Figura 90Figura 91Figura 92 Figura 93).

Pretendia-se testar ainda outros dadores tendo-se optado por recorrer ao metil

viologénio, aliás recomendado na literatura referente ao uso de NaR1,109,110. Deste

modo procedeu-se a testes recorrendo ao já referido, metil viologénio, tendo-se usado

concentrações semelhantes às de NAD(H) e seguindo um planeamento semelhante (

ver Tabela 10) e obtendo-se os seguintes resultados (valores na Tabela 18, ver

anexos):

-Capítulo 3-

85

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (2,1 nM)

-30

-10

10

30

50

70

90

-525 -475 -425 -375 -325 -275 -225 -175 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF

MédiaNAD(H)NaRNAD(H)+NaRNitratoNAD(H)+NitratoNaR+NitratoNitrato

Figura 53: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (2,1 nM)

-500

-350

-250

-150

MV

MVxNaR

MVxNitrato

MVxNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0




Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (2,1

nM) normalizados MV

NaR

MVxNaR

Nitrato

MVxNitrato

NaRxNitrato

MVxNaRxNitrato

Figura 54: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (2,1 nM) normalizados em relação à média.

-Capítulo 3-

86

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (10 nM)

-30

-10

10

30

50

70

90

-525 -475 -425 -375 -325 -275 -225 -175 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF

MédiaNAD(H)NaRNAD(H)+NaRNitratoNAD(H)+NitratoNaR+NitratoNitrato

Figura 55: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (10 nM)

-500

-350

-250

-150

MV

MVxNaR

MVxNitrato

MVxNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0




Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (10

nM) normalizados MV

NaR

MVxNaR

Nitrato

MVxNitrato

NaRxNitrato

MVxNaRxNitrato

Figura 56: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (10 nM) normalizados em relação à média.

-Capítulo 3-

87

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR

(100 nM)

-30

-10

10

30

50

70

90

-525 -475 -425 -375 -325 -275 -225 -175 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF

média

NAD(H)

NaR

NAD(H)+NaR

Nitrato

NAD(H)+Nitrato

NaR+Nitrato

NAD(H)+NaR+Nitrato

Figura 57 Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (100 nM)

-500

-350

-250

-150

MV

MVxNaR

MVxNitrato

MVxNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0




Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR

(100nM) normalizados MV

NaR

MVxNaR

Nitrato

MVxNitrato

NaRxNitrato

MVxNaRxNitrato

Figura 58: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, MV e de NaR (100 nM) normalizados em relação à média.

-Capítulo 3-

88

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

0

20

40

60

Capacidade / µF


[NaR] / nM

média

2,1nM10nM100nM


-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-200

20406080

100

Capacidade / µF


[NaR] / nM

Metil Viologénio (MV)

2,1nM10nM100nM

Figura 60 Evolução do efeito do dador na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-40

-20

0

20

40

Capacidade / µF


[NaR] / nM

Nitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 61 Evolução do efeito do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-200

20406080

100

Capacidade / µF


[NaR] / nM

NaR

2,1nM10nM100nM

Figura 62: Evolução do efeito do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

Usando como dador o MV, ao analisar as tendências dos efeitos tanto dele próprio

como dos outros elementos, contrariamente ao caso da NAD(H) em que em ambos os

potenciais de fronteira se obtiveram maiores valores de capacidade e efeitos na

generalidade, apenas para os potenciais superiores se observa um efeito pronunciado

do dador. Apesar de apresentar um pico claro mesmo sem se realizar as experiências

em atmosfera inerte, visto que este não se encontra a um potencial constante, ao

amostrar a capacidade a potenciais fixos não se observam efeitos a potenciais

intermédios. A variação do efeito do nitrato na capacidade , neste caso, é muito

pequena impossibilitando aplicações efectivas em biossensores. Os efeitos de

primeiro grau são, exceptuando para potenciais mais elevados, pouco significativos o

que demonstra (de modo semelhante ao que se obteve usando a NAD(H) ) a pouca

sensibilidade no intervalo de potencial de uso possível. As zonas de potencial elevado,

em que, como já se referiu, se tem um grau de incerteza bastante superior, são, no

entanto, as únicas em que se tem efeitos nas capacidades elevados.

-Capítulo 3-

89

Analisando o efeito do factor nitrato o uso de MV deveria ser feito para uma

concentração de NaR baixa de pois é aquela à qual se observam maiores efeitos na

capacidade (particularmente, comparando com as outras concentrações de enzima).


(Figura 94,Figura 95Figura 96 Figura 97).

Procedeu-se ainda a testes com outros dadores tendo-se optado por recorrer ao

Fenosafranina, cujo uso se encontra também documentado na literatura referente ao

uso de NaR111. Deste modo procedeu-se a testes usando o já referido dador tendo-se

usado, igualmente, concentrações semelhantes às de NAD(H) e seguindo um

planeamento semelhante ( ver Tabela 10) e obtendo-se os seguintes resultados

(valores na Tabela 19, ver anexos):

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (2,1 nM)

-10

-5

0

5

10

15

20

25

-525 -425 -325 -225 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF Média

PSNaRPS+NaRNitratoPS+NitratoNaR+NitratoPS+NaR+Nitrato

Figura 63: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (2,1 nM)

-Capítulo 3-

90

-500

-350

-250

-150

PS

PSxNaRPSxNitrato

PSxNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0




Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (2,1

nM) normalizados PS

NaR

PSxNaR

Nitrato

PSxNitrato

NaRxNitrato

PSxNaRxNitrato

Figura 64: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (2,1 nM) normalizados em relação à média.

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos núiveis de anião nitrato, PS e NaR (10nM)

-10

-5

0

5

10

15

20

25

-525 -475 -425 -375 -325 -275 -225 -175 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF Série1

PS

NaR

PSxNaR

Nitrato

PSxNitrato

NaR+Nitrato

PS x NaR x Nitrato

Figura 65: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (10 nM)

-Capítulo 3-

91

-500

-350

-250

-150

PS

PSxNaRPSxNitrato

PSxNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0




Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (10 nM)

normalizados PS

NaR

PSxNaR

Nitrato

PSxNitrato

NaRxNitrato

PSxNaRxNitrato

Figura 66: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (10 nM) normalizados em relação à média.

Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (100 nM)

-10

-5

0

5

10

15

20

25

-525 -425 -325 -225 -125


efei

to n

a ca

paci

dade

/ µF Média

PSNaRPS+NaRNitratoPS+NitratoNaR+NitratoPS+NaR+Nitrato

Figura 67: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (100 nM)

-Capítulo 3-

92

-500

-350

-250

-150

PS

PSxNaRPSxNitrato

PSxNaRxNitrato

-50.0

0.0

50.0

100.0




Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (100

nM) normalizados PS

NaR

PSxNaR

Nitrato

PSxNitrato

NaRxNitrato

PSxNaRxNitrato

Figura 68: Efeitos na capacidade da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato, PS e de NaR (100 nM) normalizados em relação à média.

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

0

10

20

30

Capacidade / µF


[NaR] / nM

média

2,1nM10nM100nM


-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

0

10

20

Capacidade / µF


[NaR] / nM

Fenosafranina (PS)

2,1nM10nM100nM

Figura 70: Evolução do efeito do dador na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-10

0

10

Capacidade / µF


[NaR] / nM

NaR

2,1nM10nM100nM

Figura 71: Evolução do efeito da enzima na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de Na

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-10

0

10

Capacidade / µF


[NaR] / nM

Nitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 72: Evolução do efeito do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-Capítulo 3-

93

Usando como dador a fenosafranina, ao analisar as tendências dos efeitos tanto

dele próprio como dos outros elementos, contrariamente aos casos anteriores

(NAD(H) e MV) em que apenas nos potenciais de fronteira se obtinham maiores

valores de capacidade e efeitos, pode-se verificar o efeito desta mesmo a potenciais

intermédios. No entanto continua-se, como aliás seria de esperar, a obter efeitos

relativos as outros factores apenas para os potenciais de fronteira. Apesar de na

literatura a fenosafranina apresentar um pico claro, o facto de, por indisponibilidade de

equipamento, não se realizarem as experiências em atmosfera inerte este não está

presente (foram feitas tentativas em ambiente inerte usando sais de fenosafranina

tanto na fase orgânica como na fase aquosa mas não se obtiveram resultados que

justificassem a realização de um bloco adicional de experiências). A variação do efeito

do nitrato na capacidade , neste caso, é pequena mas mais elevada em potenciais

intermédios abrindo lugar a aplicações efectivas em biossensores devido a uma maior

reprodutibilidade. Os efeitos de primeiro grau são, excepto para o nitrato, elevados em

potenciais mais elevados e intermédios (para a NaR apenas em concentrações

baixas) o que demonstra a sensibilidade no intervalo de potencial de uso possível. As

zonas de potencial elevado, em que, como já se referiu, se tem um grau de incerteza

bastante superior, devem ser evitadas podendo-se neste caso recorrer aos potenciais

intermédios que têm também efeitos nas capacidades elevados.

Analisando o efeito do factor nitrato o uso de MV deveria ser feito para uma

concentração de NaR baixa de pois é aquela à qual s em que se observa efeitos na

capacidade (comparando com as outras concentrações de enzima).


(Figura 98Figura 99Figura 100Figura 101).

No caso do metil viologénio é também possível fazer a transdução da reacção

seguindo a redução do pico presente112, assim, aplicando o mesmo desenho factorial

obtiveram-se os seguintes resultados (valores na Tabela 20, ver anexos):

-Capítulo 3-

94

Em que as siglas correspondem a: Tabela 11: Desenho factorial para o Metil viologénio (ver Tabela 10) [NO3

-] / mM [NaR] / nM 68.8 6.88

1 ac bc 10 cc dc

100 ec fc 0 hc gc

0.5mM MV

Visto que não se pode comparar o pico que aparece no bloco C com a linha de base

(bloco B) o passamos a ter um planeamento de apenas 2x2. Assim aplicando o

algoritmo de Yates vem que (valores na Tabela 11 e Tabela 23 ver anexos):

Efeitos na capacidade de pico da interface produzidos pela variação dos níveis de anião

nitrato e de NaR ( pico positivo)

-300.00-200.00-100.00

0.00100.00200.00300.00400.00500.00

0 20 40 60 80 100 120

Concentração de enzima NaR / nM

Ca

paci

dade

/ (µ

F)

NaRNitratoNaRxNitrato

Figura 73: Efeitos na capacidade de pico (pico positivo) da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato e de NaR na presença de MV

-Capítulo 3-

95

Efeitos na capacidade de pico da interface produzidos pela variação dos níveis de anião

nitrato e de NaR ( pico negativo)

-300.00-200.00-100.00

0.00100.00200.00300.00400.00500.00

0 20 40 60 80 100 120


C

apac

idad

e / (

µF)


Figura 74: Efeitos na capacidade de pico (pico negativo) da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato e de NaR (2.1 nM) na presença de MV

Efeitos na capacidade de pico da interface normalizados em relação á média (Pico positivo)

-100.00

-50.00

0.00

50.00

100.00

150.00

0 20 40 60 80 100 120


% d

o va

lor

méd

io


Figura 75: Efeitos na capacidade de pico (pico positivo) da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato e de NaR na presença de MV

-Capítulo 3-

96

Efeitos capacidade de pico da interface normalizados em relação á média (Pico negativo)

-200.00-150.00-100.00-50.00

0.0050.00

100.00150.00200.00

0 20 40 60 80 100 120


% d

o va

lor m

édio


Figura 76: Efeitos na capacidade de pico (pico negativo) da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato e de NaR na presença de MV

Ao analisar as tendências deste caso particular os efeitos tanto da enzima como do

próprio nitrato pode notar-se a obtenção de efeitos na capacidade mais marcados para

concentrações de enzima maiores o que é contrário ao obtido nos efeitos gerais do

MV. No entanto continuam-se a obter valores de efeito do nitrato elevados para

concentrações baixas de Enzima.

Apesar de, como já foi referido, não se ter usado uma atmosfera inerte, apresenta-se

um pico claro, o que permite obter resultados mesmo que com valor limitado. O facto

de o pico se manifestar a potenciais intermédios torna-se conveniente mesmo que

obrigue à interpretação individual de cada pico de modo a obter valores de ∆C.

-Capítulo 3-

97

Figura 77: Efeitos na intensidade de corrente de pico ( pico positivo) da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato e de NaR na presença de MV

Figura 78: Efeitos na intensidade de corrente de pico (pico negativo) da interface produzidos pela variação dos níveis de anião nitrato e de NaR na presença de MV

-Capítulo 3-

98

Efeitos na intensidade de corrende de pico da interface normalizados em relação á média (Pico

positivo)

-25.00

-20.00

-15.00

-10.00

-5.00

0.00

5.00

10.00

0 20 40 60 80 100 120


% d

o va

lor m

édio


Figura 79: Efeitos na intensidade de corrente do pico positivo que se apresenta ao aplicar voltametria cíclica ao interface H2O/DCE normalizados

Pico negativo

-25.00

-20.00

-15.00

-10.00

-5.00

0.00

5.00

10.00

15.00

0 50 100 150


In

tens

idad

e de

cor

rent

e /

(A)


Figura 80: Efeitos na intensidade de corrente do pico negativo que se apresenta ao aplicar voltametria cíclica ao interface H2O/DCE normalizados

De modo a complementar a análise do pico por EIS realizou-se um estudo por

voltametria cíclica no qual se encontrou também um pico. Ao analisar as tendências

desse pico os efeitos diferem nos dois picos (sentido negativo e positivo) tanto a

enzima como o nitrato, causam comportamentos diferentes. Podendo notar-se no pico

positivo uma variação do efeito do nitrato em forma de ∆ sendo o efeito negativo para

-Capítulo 3-

99

concentrações altas e baixas e positivo a intermédias. Os efeitos para o pico negativo

são todos semelhantes sendo no entanto de maior valor absoluto a valores de enzima

baixos.

No geral apesar de estes valores serem mais simples e rápidos de obteros efeitos

dos factores são também menores dificultando o estudo mas não impossibilitando a

sua utilização mais tarde, particularmente devido à apresentação de comportamentos

que indicam o seu uso possível nas concentrações enzimáticas em que se aplica o

método anterior sendo usado talvez como método de rastreio prévio qualitativo ou

menos exacto.

3.3 Caracterização dos suportes enzimáticos

Depois de se ter procedido à calibração inicial do goniómetro (como visto no ponto

2.2.8) determinaram-se os ângulos de contacto de um filme de PET, e de um gel

orgânico usado depois de mergulhados numa solução de GOx (devido à falta de NaR

no momento de realização da experiência ao tempo) por diferentes períodos de tempo.

Assim obtiveram-se os seguintes resultados para gotas de 10 microlitros em gel

imerso em GOx por diferentes tempos: Tabela 12: resultados obtidos por goniometria para cortes de gel mergulhados previamente em soluções de GOx.

Nº do ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x s s rel

% 2h 76,14 77,33 59,33 77,80 70,94 74,30 66,22 46,87 80,21 77,67 70,68 10,50 14,86 17h 70,74 68,85 73,89 78,63 62,64 64,52 69,71 61,19 73,01 69,24 5,67 8,19

Sendo estes resultados para um ajuste à curva completa determinando-se a

derivada nos pontos de contacto (método inicial ver ponto 2.2.8).

Tabela 13: resultados obtidos por goniometria para cortes de gel mergulhados previamente em soluções de GOx Nº do ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x s s rel

% 2h 73.5 71.7 74.1 72.5 71.3 73.6 72.7 1.1 1.5 17h 62.3 65.5 71.5 68.7 65.6 62.3 61.3 70.1 69.3 69.2 67.1 3.6 5.3

Os resultados representados na Tabela 13 foram obtidos para dois ajustes lineares

aos 50 pontos terminais da curva completa considerando-os uma recta e

-Capítulo 3-

100

determinando-se o declive (método final, ver ponto 2.2.8). Os pontos que foram

retirado foram-no por um de três motivos, por a fotografia não ser de qualidade (desvio

dos ângulos ser maior ou igual a 15º), por serem estatisticamente diferentes ou por,

usando critérios visuais serem outlyers.

Assim comparando estes valores (Tabela 12 e Tabela 13) verifica-se que as duas

técnicas apresentam valores de variância diferentes entre elas para uma certeza de

95% apenas para os ensaios com duas horas decorridas e sendo que os valores das

médias para a mesma experiência não são estatisticamente diferentes o seu uso seria

indiferente, no entanto apenas a técnica 2 permite distinguir (para o mesmo grau de

confiança) as duas médias. Visto que a primeira técnica apresenta também desvios

padrão mais elevados e a tendência é igual em ambas serão os resultados da

segunda a serem levados em conta.

Assim pode-se concluir que a primeira técnica usada apresenta uma dispersão de

resultados maior. Pode-se todavia concluir que o tempo de contacto com a enzima

altera o ângulo de contacto, reflexo das diferenças na superfície parecendo indicar a

adsorção da GOx à superfície com o passar do tempo.

Seguidamente passou-se a estudar as diferenças de ângulos avançados e recuados

de modo a ser possível avaliar a relevância e necessidade de obter ambos para cada

medição. Para tal, usando um filme de PET e vários volumes obtiveram-se algumas

séries de resultados que se traduzem nas Figura 81 Figura 82:

-Capítulo 3-

101

Figura 81: Comparação dos valores obtidos por goniometria para placas de PET com GOx sendo os ângulos de contacto observados recuados ou avançados usando o método inicial.

45

50

55

60

65

70

75

80

0 20 40 60 80 100

Volume da gota (microlitros)

Âng

ulo

(gra

us)

PET e GOx ADV PET e GOx REC

Figura 82: comparação dos valores obtidos por goniometria para placas de PET com GOx sendo os ângulos de contacto observados recuados ou avançados usando o método final.

Mais uma vez os valores foram obtidos pelos dois métodos, apresentando diferenças

tanto a nível de erro como mesmo dos valores obtidos.

-Capítulo 3-

102

Os resultados para os ângulos de contacto avançados, de ambos os métodos, estão

próximos dos valores de 72º 113 e 73,44º ± 0.12º 114 (para um volume de 0,1234 cm3

neste último caso) encontrados na literatura, particularmente se tivermos em conta as

diferentes condições de temperatura e características das superfícies.

Este estudo permitiu verificar as diferenças de valor esperadas entre os ângulos

avançados e recuados. Devido ao maior erro nos ângulos recuados, e ao facto de a

literatura valorizar sobretudo o uso de ângulos avançados além de considerações de

simplicidade experimental, decidiu-se medir apenas estes últimos.

Depois deste processo passou-se a utilizar um filme de PET modificado com tiofeno

para avaliar o comportamento dos ângulos de contacto do PET quando é modificado

com um material cuja cobertura do filme é possível verificar visualmente. Para além

deste aspecto algumas experiências efectuadas em tinas de langmuir mostraram a

incorporação de GOx em filmes de tiofeno o que sugere a possibilidade de

incorporação de enzimas numa camada deste composto no filme de PET. Para tal

prepararam-se três filmes distintos com diferentes exposições a soluções de tiofeno,

tendo-se obtido os seguintes resultados:

Tabela 14: resultados obtidos por goniometria para slides de PET com diferentes tratamentos.

Volume da gota /µL x s s rel %

Polietileno limpo 10 59,1 2,0 3,3 20 62,5 1,3 2,1 40 62,8 2,9 4,7 80 66,5 1,5 2,3

Polietileno com monocamada tiofeno 10 57,8 1,8 3,1 20 60,5 1,5 2,4 40 61,5 0,9 1,4 80 63,6 0,7 1,0

Polietileno com gota de tiofeno seca 10 44,8 3,0 6,8 20 46,9 5,4 11,5 40 58,0 1,9 3,2 80 53,1 3,2 6,1

-Capítulo 3-

103

40455055606570

0 50 100Volume da gota (microlitro)

Âng

ulo

de c

onta

cto

(gra

u)

polietileno polietileno+tiofeno polietileno+tiofeno seco

Figura 83: resultados obtidos por goniometria para slides de PET limpos e tratados previamente com tiofeno (ver Tabela 14) usando o método inicial (Polinomialização e derivação).

Assim na Tabela 14 e Figura 83 encontram-se os resultados obtidos para placas de

polietileno limpo que sofreram apenas um processo de limpeza e secagem prévio, as placas

com monocamada de tiofeno que foram tratadas na tina de langmuir sendo-lhe aplicada uma

monocamada deste composto, e por fim as ultimas placas foram preparadas colocando uma

gota de solução de tiofeno e deixando evaporar até à secura.

Os resultados para a regressão linear das porções finais são muito semelhantes aos

apresentados na Figura 83, inclusive em termos de erro, não sendo, por isso,

apresentados. O que parece indicar de forma clara que o tiofeno se mantém no filme

quando deixado a secar a temperatura ambiente. Restava mostrar que a camada de

tiofeno não se degrada e mantém as propriedades de incorporação da GOx.

De modo a testar a reprodutibilidade dos resultados foi testado para uma placa de

PET limpo possíveis modificações nos valores determinados em dois dias diferentes

estudando a placa e depois de esta ficar guardada ao abrigo da luz e poeiras até ao

dia seguinte até ser estudada de novo, tendo-se obtido os seguintes resultados:

-Capítulo 3-

104

55

57

59

61

63

65

67

69

71

73

0 20 40 60 80 100

volume das gotas em microlitros

ângu

lo d

e co

ntac

to e

m g

raus

petdia1 petdia2 petplaca1 petplaca2

Figura 84: Resultados obtidos por goniometria para um slide de PET limpo com um dia de intervalo (petdia 1 e petdia 2) e resultados para duas placas distintas observadas no mesmo dia (petplaca1 e petplaca2).

Comparando os resultados obtidos para as placas estudadas com um dia de

intervalo estatisticamente demonstra-se que, visto que o teste F para 95% e 90%

consideram os pontos diferentes (contrariamente às placas estudadas no mesmo dia

que se encontram representadas apenas para permitir comparar as diferenças entre

placas diferentes com as entre placas iguais mas dias diferentes), não é válido

continuar com experiências com uma duração superior a um dia mesmo considerando

um erro médio de %92.1± e demonstrando-se assim que há modificação da

superfície com o tempo.

Para efeitos de comparação verificou-se também se as diferenças entre dois slides

de PET seriam significativas tendo-se também feito uma experiência com uma placa

de vidro como se pode observar pela análise da Figura 85 praticamente não há

diferenças entre os ensaios feitos com PET (para um grau de confiança de 90% não

existem diferenças estatísticas entre os dois resultados).

No caso da comparação com os resultados obtidos para o vidro, existe uma

diferença significativa entre a hidrofobicidade destes dois materiais.

-Capítulo 3-

105

40

45

50

55

60

65

70

75

0 20 40 60 80 100

volume das gotas em microlitros

ângu

lo d

e co

ntac

to e

m g

raus

petplaca1 petplaca2 vidro

Figura 85: resultados obtidos por goniometria para slides de PET limpos e uma placa de vidro para comparação.

Estes resultados mostram ainda que o uso de um sistema de digitalização de

imagem pode ser usado facilmente para a medição de ângulos de contacto que por

sua vez podem ser usados para a caracterização da superfície e para a avaliação das

modificações introduzidas na superfície.

3.4 Determinação dos parâmetros associados às propriedades dieléctricas

Para a determinação dos valores das propriedades dieléctricas utilizou-se uma

célula de vidro constituída por duas placas de vidro separadas por uma distância de 25

µm, contendo no seu seio uma superfície quadrada de óxido de índio e estanho (ITO)

de 4 mm2 de área, no interior da qual se insere a amostra por capilaridade. Coloca-se

esta célula no forno (ver Figura 86) e realizam-se as ligações entre a célula e o forno

através de tiras de alumínio, fixas nas extremidades com laca de prata.

Prepara-se a restante montagem, como se mostra na Figura 86, e realiza-se a

determinação de ε para uma gama de frequências entre 20 Hz e 1 MHz, sendo que a

capacidade é lida no LCR METER e as temperaturas calculadas a partir da diferença

de potencial de um termopar de cromel-alumel.

-Capítulo 3-

106

Figura 86: Montagem utilizada para a determinação dos parâmetros associados às propriedades

dieléctricas.

Utiliza-se uma diferença de potencial de 0,25 V de forma a se obter um campo

eléctrico o mais baixo possível, neste caso 0,01 V.µm-1.

O valor dos parâmetros foi obtido através do ajuste das curvas experimentais às

expressões Eq. 34 eEq. 35, utilizando a função Solver do Microsoft Excel; o

procedimento informático pode ser consultado no artigo de Walsh e Diamond115. Neste

caso, o ajuste dos valores experimentais foi realizado utilizando a programação

desenvolvida pelo Grupo Ferroeléctricos do Departamento de Física.

Na parte superior direita da Figura 87 encontra-se a representação da parte

imaginária da constante dieléctrica (ε’’) em função da parte real (ε’), conhecida por

diagrama de Cole-Cole. O ajuste dos valores experimentais de ε’(ω) e de ε’’(ω) às

expressões anteriores, permite determinar os parâmetros experimentais associados às

propriedades dieléctricas λωβωε eg ciri i,,,,∆ .

-Capítulo 3-

107

10 100 1000 10000 100000 1000000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1,4-DBB 1,6-DCH 1,6-DBH 1,2-DCE

ε'' /

F

ω / Hz

0 1000 2000 3000 40000

500

1000

1500

2000

2500

3000

1,4-DBB 1,6-DCH 1,6-DBH 1,2-DCE

ε''

ε'

Figura 87: Representação dos valores das partes real e imaginária da constante dieléctrica para

diferentes solventes orgânicos.

Os valores para a parte imaginária da constante dieléctrica, representados

graficamente na Figura 87, indiciam o deslocamento dos modos de relaxação para

menores frequências (inferiores a 20 Hz) para os solventes de maior cadeia alifática e

maior massa molecular do halogéneo. Este efeito pode ser explicado pelo aumento

dos tempos de relaxação devido a um aumento do volume das moléculas dos

solventes, que condiciona o reajuste das moléculas perante a aplicação de um

pequeno campo eléctrico alternado.

Embora estes modos de relaxação sejam apenas claramente visíveis nos géis de

1,2-DCE e 1,4-DBB, o facto de o diagrama de Cole-Cole apresentar a forma de um

semicírculo, bem como os ajustes efectuados, sugerem precisamente a existência de

tais fenómenos de relaxação. É então possível, a partir do ajuste e extrapolação dos

valores experimentais do diagrama de Cole-Cole às equações Eq. 34 e Eq. 35,

quantificar os valores dos parâmetros dieléctricos para os vários solventes utilizados,

sendo que apenas aqueles que apresentam maior significado físico se encontram

esquematizados na Tabela 15.

-Capítulo 3-

108

Tabela 15: Valores dos parâmetros dieléctricos de solventes orgânicos puros.

Solvente

Orgânico

Temperatura

/ ºC λ ∆ε β ωr / Hz

1,2-DCE 25.6 0.98

3080.1

2342.9

6.4

0.99

0.96

1.00

26

62

600 000

1,4 - DBB 25.0 0.98 3294.4

2259.5

1.00

0.98

18

39

1,6 - DCH 22.3 0.32 2129.9

329.9

1.00

0.98

10

38

1,6 - DBH 22.6 0.97 2640.1

9.0

0.99

1.00

11

599 999

Embora não se tenham determinado os valores de ε para os diferentes solventes à

mesma temperatura, devido a algumas limitações experimentais, considera-se que

estes desvios de temperatura não introduzem contribuições significativas. Assim, pela

comparação dos valores de γ verifica-se que apenas o 1,6-DCH apresenta um

resultado dissonante, apresentado um valor bastante baixo para este parâmetro. Este

resultado, de algum modo imprevisível, surge na sequência do comportamento obtido

para o diagrama de Cole-Cole no qual o semicírculo obtido para o 1,6-DCH apresenta

uma curvatura diferente da dos restantes solventes, contudo não é possível com os

dados disponíveis retirar qualquer conclusão relativamente a este aspecto.

Relativamente aos modos de relaxação, a Tabela 15 apresenta para todos os

solventes um modo de relaxação de baixa frequência próximo dos 20 Hz, constituindo

uma extrapolação aos dados em análise. Estes modos de relaxação têm uma grande

contribuição para a constante dieléctrica relativa dado que apresentam os valores mais

elevados para a amplitude dieléctrica sendo que, no caso dos halohexanos, a sua

contribuição é quase plena. No caso do diclorohexano o valor da amplitude dieléctrica

do segundo modo de relaxação é bastante menor enquanto que para o

dibromohexano o segundo modo de relaxação é conhecido e deve-se aos eléctrodos

de ITO da célula.

-Capítulo 3-

109

O valor da amplitude dieléctrica, ε∆ , para cada solvente é obtido pela contribuição

ponderada (pelo factor gi) das amplitudes dieléctricas de cada modo de relaxação.

Verifica-se que à medida que diminuem a cadeia alifática e a massa molecular de

halogéneo presente na molécula o valor de ε∆ vai aumentando de modo que os

solventes apresentam uma maior polarizabilidade como descreve Vanýsek 116,117.

Na Figura 88 encontram-se representadas as curvas da parte imaginária de ε em

função da frequência, para várias fases orgânicas preparadas a partir do solvente 1,4-

DBB. Verifica-se que a introdução de PVC provoca um deslocamento da curva para

frequências mais elevadas. Este desvio para frequências mais elevadas deve-se aos

menores tempos de relaxação da estrutura molecular, que pode ser relacionado com

as interacções intermoleculares. É possível relacionar este resultado com uma

interacção das moléculas de solvente com a malha tridimensional formada pelo PVC.

Devido a essa interacção as moléculas reagem mais rapidamente à aplicação do

campo eléctrico, diminuindo os tempos de relaxação e deslocando o modo de

relaxação para frequências mais elevadas.

10 100 1000 10000 100000 1000000

0

2000

4000

6000

8000

10000

1,4-DBB 1,4-DBB + 3% PVC 1,4-DBB + 3% PVC + 10 mM BTPPATPBCl 1,4-DBB + 3% PVC + 10 mM BTPPATPBCl + 5mM PDT 1,4-DBB + 10 mM BTPPATPBCl

ε'

ω / Hz

(a)

10 100 1000 10000 100000 1000000-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

1,4-DBB 1,4-DBB + 3% PVC 1,4-DBB + 3% PVC + 10 mM BTPPATPBCl 1,4-DBB + 3% PVC + 10 mM BTPPATPBCl + 5mM PDT 1,4-DBB + 10 mM BTPPATPBCl

ε''

ω / Hz

(b)

Figura 88: Representação das curvas das de constante dieléctrica para diferentes fases orgânicas em 1,4-DBB. a) Componente real; b) Componente imaginária.

Relativamente à introdução do sal de BTPPATPBCl, este não só altera os tempos de

relaxação, pelos mesmos motivos, como também introduz um forte aumento dos

-Capítulo 3-

110

valores de ε’’, relacionados com o aumento da condução da solução, e dos valores de

ε’, que se relacionam com a capacidade da solução, devido ao carácter iónico desta

solução, introduzido pela dissociação do sal. O mesmo efeito é obtido pela introdução

do BTPPATPBCl no gel orgânico para as curvas de ε’’, considerando que as

contribuições do PVC e do sal são aditivas, enquanto que para as curvas de ε’ a

contribuição deve-se exclusivamente ao carácter iónico introduzido pela adição do sal.

Relativamente à introdução do ligando, este também contribui para uma maior

interacção das moléculas do solvente, contudo esta sua contribuição é pouco

significativa e deve-se somente a um ligeiro aumento da capacidade do sistema, como

o demonstra a curva de ε’.

Na Figura 89 encontram-se representadas as curvas para as componentes real e

imaginária da constante dieléctrica para diferentes concentrações de BTPPATPBCl

numa solução de 1,4-dibromobutano. Observa-se que o aumento da concentração do

sal não altera significativamente o comportamento das curvas. Torna-se possível

concluir, de acordo com o descrito na interpretação da figura anterior, que apenas tem

significado a contribuição introduzida pelo carácter iónico da solução com a

dissociação do sal na condução da solução, não sendo no entanto as alterações

verificadas ao alterar a concentração deste particularmente significativas. É por isso

possível que para maiores variações de concentração apareçam contribuições

relevantes.

10 100 1000 10000 100000

0

2000

4000

6000

8000

10000

1,4-DBB + 10 mM BTPPATPBCl 1,4-DBB + 5 mM BTPPATPBCl

ε'

ω / Hz

a)

10 100 1000 10000 100000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

1,4-DBB + 10 mM BTPPATPBCl 1,4-DBB + 5 mM BTPPATPBCl

ε''

ω / Hz

b)

Figura 89: Representação das curvas das componentes da constante dieléctrica para diferentes concentrações de BTPPATPBCl em 1,4-DBB. a) Componente real; b) Componente imaginária.

-Capítulo 4-

111

4 Conclusões e sugestões de trabalho futuro

Antes de começar qualquer investigação duas questões importantes a colocar são: a

da informação disponível e a da gestão do tempo. Neste trabalho, conhecia-se desde

início a necessidade de passar pelas mais diversas fases, a saber: pesquisa, teste e

optimização antes de poder considerar o recurso estudado optimizado e pronto a ser

utilizado. Assim a duração prevista para a realização desta dissertação, revelou-se

insuficiente para ambicionar a realização de todos estes passos e ainda concretizar a

construção de uma forma funcional do biossensor que use a enzima e a interface

estudado.

Para além da construção do protótipo de acordo com os resultados da

pesquisa preliminar e da verificação de pontos em que o seu desempenho pode ser

melhorado, outros propósitos para o futuro, de carácter mais global apresentam-se

com o fim desta dissertação.

Projectam-se, desde já, fases de teste do protótipo construído, intervindo

directamente no mercado com o intuito de melhorar cada vez mais este recurso,

adaptando-o à realidade da indústria Química.

Prevê-se ainda, a médio prazo, divulgar os resultados do estudo científico

realizado. Tal como a realização de um artigo proposto pelo agrupamento dieléctricos

de Física da FCUP. Assim a hipótese de vir a aproveitar os dados de todo este estudo

para efectuar um artigo é real.

Para finalizar, completando um processo de simbiose entre esta dissertação e a

nossa experiência profissional, não poderíamos deixar de ter o propósito final de

utilizar este recurso cujas potencialidades se começou a explorar no futuro enquanto

químicos.

-Capítulo 4-

112

Reflexão final

No início do trabalho referiu-se que este seria um projecto de desafios. É com

agrado, que chegando ao fim desta etapa, se verifica que alguns dos desafios foram

concretizados com sucesso. Contudo, fica ainda por realizar uma pesquisa mais

aprofundada que dá a possibilidade de continuar a desenvolver o trabalho

Muito se aprendeu com a realização deste trabalho, quer a nível de competências

técnicas na área de caracterização de superfícies e electroquímica, quer no âmbito da

ciência Química. No campo experimental, salienta-se a evolução pessoal enquanto

investigador, estando actualmente mais atento e preparado para os desafios futuros

da profissão.

-Anexos -

113

Anexos

Tabela 16: Resultados obtidos usando EIE num interface H2O/DCE de modo a estudar os efeitos da enzima (NaR), do substrato (nitrato) e dos vários dadores (NAD(H), MV e PS). Note-se que as experiências Da, Db, Ha e Hb foram trocadas por lapso durante a execução estando por isso colocadas no local correcto mas mantendo as designações originalmente erradas. Note-se também que os pontos Cb500, Hb 150 foram obtidos por extrapolação e não interpolação e os pontos marcados com (a) não foram obtidos. NaR Potencial de medição / mV Exp -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

aa 5.9 6.1 5.1 2.6 3.6 14.6 5.9 ba 7.5 6.3 5.4 3.7 3.2 3.3 7.5 ca 10.6 8.0 6.6 4.0 4.5 22.1 10.6 db 9.3 7.1 6.3 4.0 5.1 24.5 9.3 ea 24.0 15.0 12.2 8.6 7.5 7.9 24.0 fa 7.9 5.9 4.7 3.6 3.8 10.6 7.9 ga 7.4 5.9 4.8 2.8 3.6 4.6 7.4 hb 6.2 3.6 3.4 3.5 4.5 13.8 6.2

Capacidade / µF

Linha de Base Potencial de medição / mV Exp -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

ab 9.6 7.8 6.0 3.9 2.4 21.8 9.6 bb 9.6 6.5 5.1 3.6 3.9 5.4 9.6 cb 9.0 6.3 5.1 2.5 1.3 17.4 9.0 da 8.4 7.1 5.7 3.5 4.7 15.0 8.4 eb 9.1 6.5 5.8 4.3 4.3 18.2 9.1 fb 9.0 7.1 5.0 3.9 4.3 17.5 9.0 gb 5.9 8.9 7.3 4.5 3.1 18.5 5.9 ha 9.4 7.5 6.3 3.9 4.4 29.9 9.4

Capacidade / µF

MV Potencial de medição / mV Exp -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

ac 10.0 144.3 6.7 5.3 4.3 13.7 10.0 bc 105.9 6.9 5.4 3.6 5.2 24.1 105.9 cc 10.4 34.4 7.9 4.2 3.7 5.1 10.4 dc 13.8 114.9 35.8 a a a 13.8 ec 32.9 481.5 16.7 5.2 4.5 10.3 32.9 fc 192.3 4.3 4.6 4.0 4.1 8.9 192.3 gc 12.5 13.9 10.8 6.6 6.3 8.0 12.5 hc 13.8 6.2 5.6 6.8 3.8 24.0 13.8

Capacidade / µF

-Anexos -

114

PS Potencial de medição / mV Exp -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

ad 11.6 7.3 7.4 6.1 8.7 11.3 11.6 bd 9.1 8.5 7.9 5.6 8.1 19.8 9.1 cd 11.2 8.1 8.4 11.2 19.3 27.4 11.2 dd 8.7 8.6 9.1 14.8 19.9 26.3 8.7 ed 26.7 9.1 9.9 11.8 15.7 34.6 26.7 fd 11.7 11.9 11.6 18.9 25.5 36.6 11.7 gd 13.4 12.3 13.0 17.4 20.8 22.4 13.4 hd 8.5 8.8 8.6 7.9 11.1 24.0 8.5

C

apacidade / µF

Tabela 17: Efeitos na capacidade da interface para diferentes concentrações da enzima (NaR) e usando como dador o sal dissódico de NAD(H) (ß-Nicotinamida adenina dinucleótido, forma reduzida) obtidos a diferentes potenciais NaR 0 e 2.1 nM Potencial de medição / mV Efeito -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

Média 9.8 7.5 6.2 4.4 4.4 15.1 9.8NAD(H) 3.0 0.1 0.2 0.5 0.8 -11.8 3.0NaR 5.3 2.2 1.5 1.4 1.1 -3.1 5.3NAD(H) x NaR 3.9 3.5 2.9 1.5 0.5 3.2 3.9NO3 3.5 3.0 2.7 1.3 0.4 -5.7 3.5NAD(H) x NO3 5.2 2.6 1.8 0.8 1.0 -0.3 5.2NaR x NO3 4.6 1.2 1.5 1.4 1.5 4.7 4.6NAD(H) x NaR x NO3 2.8 2.2 1.6 1.5 0.8 -1.4 2.8

NaR 0 e 10 nM Potencial de medição / mV Efeito -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

Média 8.3 6.8 5.7 3.6 3.9 18.2 8.3NAD(H) 0.2 -1.3 -0.8 0.0 1.1 -3.9 0.2NaR 2.1 0.7 0.5 -0.2 0.0 3.1 2.1NAD(H) x NaR 1.0 2.1 1.9 1.0 0.8 11.1 1.0NO3 -0.1 0.9 0.5 -0.3 -1.6 -5.1 -0.1NAD(H) x NO3 1.4 0.6 0.3 -0.1 0.8 -0.7 1.4NaR x NO3 1.1 -0.9 -0.7 -0.2 -0.4 5.2 1.1NAD(H) x NaR x NO3 -1.0 0.2 0.2 0.6 0.6 -1.7 -1.0

-Anexos -

115


Média 9.8 7.5 6.2 4.4 4.4 15.1 9.8NAD(H) 3.0 0.1 0.2 0.5 0.8 -11.8 3.0NaR 5.3 2.2 1.5 1.4 1.1 -3.1 5.3NAD(H) x NaR 3.9 3.5 2.9 1.5 0.5 3.2 3.9NO3 3.5 3.0 2.7 1.3 0.4 -5.7 3.5NAD(H) x NO3 5.2 2.6 1.8 0.8 1.0 -0.3 5.2NaR x NO3 4.6 1.2 1.5 1.4 1.5 4.7 4.6NAD(H) x NaR x NO3 2.8 2.2 1.6 1.5 0.8 -1.4 2.8

-500

-400

-350

-300

-250

-200

-150

2,1nM

100nM

-5

0

5

10

15



[NaR] / nM

NAD(H)xNaR

2,1nM10nM100nM

Figura 90: Evolução do efeito conjunto do dador e da enzima na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500-400

-350-300

-250-200

-150

2,1nM10nM

100nM

-5

0

5

10


Potencial de medição / mV[NaR] /

nM

NAD(H)xNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 91: Evolução do efeito conjunto do dador e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500-400

-350-300

-250-200

-150

2,1nM10nM

100nM

-5

0

5

10

15



nM

NaRxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 92: Evolução do efeito conjunto da enzima e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR.

-500-400

-350-300

-250-200

-150

2,1nM10nM

100nM

-5

0

5



nM

NAD(H)xNaRxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 93:Evolução do efeito conjunto do dador, da enzima e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-Anexos -

116

Tabela 18: Efeitos na capacidade da interface para diferentes concentrações da enzima (NaR) e usando como dador o Metil Viologénio (MV) obtidos a diferentes potenciais. (a) Devido a um resultado incompleto não foi possível separar a contribuição dos vários efeitos neste caso. NaR 0 e 2.1 nM Potencial de medição / mV Efeito -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

Média 22.1 25.2 6.6 4.8 4.2 18.2 22.1Média 26.9 35.2 1.0 1.6 1.4 -1.5 26.9MV 23.3 32.2 -1.7 -1.3 -0.4 -3.8 23.3NaR 21.4 33.3 -0.4 -0.9 0.1 6.8 21.4MV x NaR -25.2 36.9 2.1 0.6 -0.3 -5.4 -25.2NO3 -23.4 35.6 1.1 0.1 1.1 -7.9 -23.4MV x NO3 -22.7 32.4 -1.0 0.4 -0.9 8.3 -22.7NaR x NO3 -24.5 32.5 -1.0 0.6 -0.8 -5.6 -24.5


Média 10.4 24.9 10.6 a a a 10.4MV 4.4 34.9 8.9 a a a 4.4NaR 0.0 31.6 6.1 a a a 0.0MV x NaR -1.1 33.0 7.5 a a a -1.1NO3 -1.9 -18.1 -5.6 a a a -1.9MV x NO3 -0.4 -18.4 -5.8 a a a -0.4NaR x NO3 0.5 -22.6 -8.7 a a a 0.5MV x NaR x NO3 -1.6 -21.5 -7.9 a a a -1.6


Média 55.5 7.4 6.3 4.7 4.3 16.7 55.5MV 94.4 -0.3 0.3 1.2 0.6 -8.6 94.4NaR 90.3 -3.5 -2.5 -1.4 -0.2 -6.7 90.3MV x NaR 88.9 -2.2 -1.1 -1.3 -0.7 -0.4 88.9NO3 -1.2 2.1 1.7 0.2 0.3 -6.7 -1.2MV x NO3 0.5 1.7 0.8 -0.3 1.0 -1.3 0.5NaR x NO3 1.3 -2.4 -1.3 0.0 -0.3 7.0 1.3MV x NaR x NO3 -0.6 -1.4 -1.2 0.1 -1.0 1.0 -0.6

-Anexos -

117

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-40

-20

0

20

40

Capacidade / µF


[NaR] / nM

MVxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 94 Evolução do efeito conjunto do dador e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-200

20406080

100

Capacidade / µF


[NaR] / nM

MVxNaR

2,1nM10nM100nM

Figura 95: Evolução do efeito conjunto do dador e da enzima na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-40

-20

0

20

40

Capacidade / µF


[NaR] / nM

NaRxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 96: Evolução do efeito conjunto do nitrato e da enzima na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-40

-20

0

20

40

Capacidade / µF


[NaR] / nM

MVxNaRxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 97: Evolução do efeito conjunto do dador, da enzima e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de Na

Tabela 19: Efeitos na capacidade da interface usando Fenosafranina (PS) como dador, diferentes concentrações da enzima NaR obtidas a diferentes potenciais. NaR 0 e 2.1 nM Potencial de medição / mV Efeito -500 -400 -350 -300 -250 -200 -150

Média 9.6 8.2 7.4 6.5 7.3 18.9 9.6PS 2.1 1.1 2.5 5.0 7.8 0.1 2.1NaR 0.7 -2.3 -2.7 -3.9 -5.0 -9.5 0.7PS x NaR -1.2 -1.3 -1.5 -3.5 -4.4 1.1 -1.2NO3 1.0 1.7 2.0 3.1 2.8 -0.9 1.0PS x NO3 2.8 0.4 1.0 2.6 4.3 -3.4 2.8NaR x NO3 0.3 -0.7 -0.7 -2.0 -1.4 5.6 0.3PS x NaR x NO3 -1.5 -0.6 -0.7 -1.9 -1.3 -8.3 -1.5

-Anexos -

118


Média 9.3 8.5 7.9 8.2 10.5 22.6 9.3PS 2.3 2.0 3.7 9.2 14.4 4.8 2.3NaR 0.0 -1.9 -1.7 -0.5 1.4 -2.2 0.0PS x NaR -1.0 -0.4 -0.3 0.8 2.2 5.8 -1.0NO3 1.1 0.9 1.0 1.4 1.1 -2.4 1.1PS x NO3 2.6 0.6 0.8 1.6 3.5 2.1 2.6NaR x NO3 0.4 -1.6 -1.7 -3.7 -3.1 4.1 0.4PS x NaR x NO3 -1.7 -0.5 -0.9 -2.9 -2.1 -2.8 -1.7


Média 11.7 9.0 8.4 9.1 11.1 25.2 11.7PS 6.7 3.1 4.7 9.8 14.3 8.4 6.7NaR 4.8 -0.7 -0.7 1.3 2.6 3.0 4.8PS x NaR 3.4 0.7 0.7 1.4 2.0 9.3 3.4NO3 4.1 0.4 1.1 0.9 -0.4 -3.6 4.1PS x NO3 5.8 0.0 0.2 0.4 0.3 1.8 5.8NaR x NO3 3.4 -2.1 -1.6 -4.2 -4.6 2.9 3.4PS x NaR x NO3 1.6 -1.1 -1.5 -4.1 -5.2 -3.1 1.6

Tabela 20: Capacidades no pico verificado ao usar MV como dador pico sentido

positivo base sentido

positivo pico sentido

negativo base sentido

negativo

Potencial /mV

Capacidade /µF

Potencial /mV

Capacidade /µF ∆ C1

Potencial /mV

Capacidade /µF

Potencial /mV

Capacidade /µF ∆ C2

ac -450 197.2 -476 6.4 190.9 -475 47.9 -496 9.7 38.3bc -500 141.7 -481 8.2 133.5 -475 76.7 -479 10.3 66.4cc -500 113.0 -489 9.7 103.3 -550 20.8 -489 7.6 13.2dc -450 226.5 -467 8.9 217.6 -475 71.5 -467 8.9 62.6ec -475 539.3 -514 8.3 530.9 -500 58.0 -513 7.3 50.7fc -475 587.0 -515 6.7 580.3 -500 478.9 -517 5.8 473.1gc -500 251.9 -503 9.2 242.6 -525 24.8 -525 9.8 14.9hc -500 122.7 -501 6.5 116.2 -475 28.8 -478 13.3 15.5

-Anexos -

119

Em que as siglas correspondem a: Tabela 21: Desenho factorial para o Metil viologénio (ver Tabela 10) [NO3

-] / mM [NaR] / nM 68.8 6.88

1 ac bc 10 cc dc

100 ec fc 0 hc gc

0.5mM MV

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-10

0

10

Capacidade / µF


[NaR] / nM

PSxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 98: Evolução do efeito conjunto do dador e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-10

0

10

Capacidade / µF


[NaR] / nM

NaRxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 99: Evolução do efeito conjunto da enzima e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-10

0

10

Capacidade / µF


[NaR] / nM

PSxNaRxNitrato

2,1nM10nM100nM

Figura 100: Evolução do efeito conjunto do dador, da enzima e do nitrato na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-500

-350

-250

-150

2,1nM100nM

-10

0

10

Capacidade / µF


[NaR] / nM

PSxNaR

2,1nM10nM100nM

Figura 101: Evolução do efeito conjunto do dador, da enzima na capacidade de acordo com os potenciais para os diferentes blocos de concentração de NaR

-Anexos-

120

Tabela 22: Efeitos na capacidade da interface para o pico verificado aquando do uso de Metil viologénio como dador com diferentes concentrações de KNO3 da enzima NaR.

∆ C1 / µF ∆ C2 / µF Efeito divisor Efeito1 Efeito2 116.20 15.45 média 4 170.81 33.76 133.54 66.42 NaR 2 -17.21 37.16 242.64 14.92 NO3 2 91.89 -14.35 190.88 38.26 NaR x NO3 2 -34.55 -13.82

[NaR] varia

entre 0 e 2,1nM

∆ C1 / µF ∆ C2 / µF Efeito divisor Efeito1 Efeito2 116.20 15.45 média 4 169.92 26.56 217.56 62.61 NaR 2 -18.99 22.74 242.64 14.92 NO3 2 6.09 -24.95 103.30 13.25 NaR x NO3 2 -120.35 -24.42

[NaR] varia

entre 0 e 10nM

∆ C1 / µF ∆ C2 / µF Efeito divisor Efeito1 Efeito2 116.20 15.45 média 4 367.52 138.56 580.33 473.13 NaR 2 376.21 246.75 242.64 14.92 NO3 2 38.52 -211.47 530.92 50.73 NaR x NO3 2 -87.93 -210.94

[NaR] varia

entre 0 e 100nM

Tabela 23: Efeitos na intensidade de corrente do pico voltamétrico da interface para o pico verificado aquando do uso de Metil viologénio como dador com diferentes concentrações de NO3 da enzima NaR.

∆ I1 / A ∆ I2 / A Efeito divisor Efeito1 Efeito2 2.26E-05 -1.96E-05 média 4 2.19E-05 -1.77E-05 2.31E-05 -1.96E-05 NaR 2 -2.66E-06 3.16E-06 2.40E-05 -1.89E-05 NO3 2 -1.81E-06 3.91E-06

1.81E-05 -1.25E-05 NaR x NO3 2 -3.22E-06 3.17E-06

[NaR] varia

entre 0 e

2,1nM ∆ I1 / A ∆ I2 / A Efeito divisor Efeito1 Efeito2

2.26E-05 -1.96E-05 média 4 2.17E-05 -1.91E-05 1.92E-05 -1.90E-05 NaR 2 -3.22E-06 3.18E-07 2.40E-05 -1.89E-05 NO3 2 1.54E-06 4.67E-07 2.09E-05 -1.88E-05 NaR x NO3 2 1.33E-07 -2.77E-07

[NaR] varia

entre 0 e 10nM

∆ I1 / A ∆ I2 / A Efeito divisor Efeito1 Efeito2 2.26E-05 -1.96E-05 média 4 2.12E-05 -1.82E-05 2.12E-05 -1.94E-05 NaR 2 -4.15E-06 2.15E-06 2.40E-05 -1.89E-05 NO3 2 -1.41E-06 2.70E-06

1.70E-05 -1.48E-05 NaR x NO3 2 -2.82E-06 1.95E-06

[NaR] varia

entre 0 e

100nM

-Bibliografia-

121

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desenvolvimento, caracterização e optimização de um ... · tabela 1: ... a o ph ao qual...

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