curvas de calibracão

8/9/2019 Curvas de Calibraco

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ESPECTROFOTOMETRIAESPECTROFOTOMETRIA

Parte 1Parte 1 espectro de absoroespectro de absoro

Parte 2Parte 2 -- Curva de calibraoCurva de calibrao

Dosagem de amostraDosagem de amostra


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Aplicaes da fotometria (Exemplo prtico)Dosagem de Proteina

A principal finalidade de uma medida espectrofotomtrica, nas regies doultravioleta e visvel, avaliar quantidades.

Assim, extremamente importante efetuar uma rigorosa calibrao visandoobter resultados exatos.

Para obter-se uma curva de calibrao alguns aspectos devem serconsiderados como:

1. A escolha de uma soluo padro ( Ex:proteina-Albumina)2. O estabelecimento de um branco adequado3. A seleo da rea espectral.(realizado em aula anterior)


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AP = P c l

Absorbncia(P fixo)

Absortividade(constante para um P

fixo)

Concentrao da soluoque absorve a luz

Distncia percorrida pelaluz atravs da amostra

Lei de

Lambert

e

Beer


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Soluo padroConstitui parte integrante da anlise quantitativa no laboratrio e usada na

dosagem de amostra desconhecida.

Uma soluo padro apresenta concentrao exata de uma substnciaconhecida, que servir como referncia na determinao fotomtrica deconcentraes desconhecidas desta mesma substncia.

Uma soluo padro tem grande importncia no preparo da curva decalibrao.

Exemplo: uma soluo padro de albumina 10 mg/ml

Isto significa que foram pesados 10 mg de albumina que a seguir foramdissolvidas em 1 ml de gua ou outro solvente.

Evidentemente, a pessoa responsvel ( aqui o Armando! ) preparou uma

quantidade maior de soluo padro...


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Preparo de uma curva padro (ou calibrao)

O preparo da curva de calibrao de grande importncia e deve ser bementendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas prprias curvasde calibrao e interpretar os resultados obtidos.

Para se obter o valor da concentrao de substncias cuja concentrao sedesconhece, necessrio estabelecer uma relao entre a absorbnciadesta soluo em diferentes concentraes com as suas concentraes.

Isto se chama curva de calibrao (curva padro).


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BR 2 4 6 8 10mg/ml

1. Preparar uma srie de padres exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ouindicada. Usar o padro recomendado para o mtodo a ser calibrado.

2. Dosar todos os padres de acordo com a tcnica recomendada. Efetuar asleituras colorimtricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A,alm do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pelacurva de absoro espectral previamente realizada.

3. Obter os valores de Absorbncia.

4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbncia (ordenada)com as concentraes dos padres (abcissa).

Examinar bem os pontos e decidir se eles sero cobertos por uma linha reta. Se ospontos aparentemente seguirem uma linha reta, traar uma curva de modo quemais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada deponto a ponto, mas interpolando atravs dos pontos.

5. Examinar a curva traada, avaliando se ela tem sensibilidade correta


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A curva padro ideal deve ter ngulo aproximado de 45

Uma boa curva padro

2 4 6 8 10 mg/ml00

0.1

0.2

0.30.4

0.5A

C


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Curva padro de Albumina

Na prtica, como ser a performance de vocs?

TuboTubo Conc.Conc.(mg/ml)(mg/ml)

AlbuminaAlbumina10 mg/ml10 mg/ml

(ml)(ml)

guagua(ml)(ml)

BiuretoBiureto(ml)(ml)

AA

11 2,02,0 4,04,0

22 4,04,0 4,04,0

33 6,06,0 4,04,0

44 8,08,0 4,04,0

55 10,010,0 4,04,0

BRBR ---------- ---------- 1,01,0 4,04,0 ----------


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Temos que preparar as diluies do padro 10 mg/ml tendo comovolume final 1,0 ml.

Recorremos a regra geral da diluio:Ci Vi = Cf Vf

onde:Ci = concentrao inicial (10 mg/ml)Vi = volume a ser retirado do padro (?)C

f= concentrao final (2mg/ml)

Vf = volume final (1,0 ml)

Albumina10 mg/ml

Albumina2 mg/mlExemplo: Tubo 1 ( 2,0 mg/ml )

Ci Vi = Cf Vf

10 mg/ml Vi (?) = 2 mg/ml 1,0 mg/ml

Vi = 0,2 ml

Vi = 0,2 ml do padro+ 0,8 ml de gua

1,0 ml (2 mg/ml)


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Preenchendo a tabela para obter a curva...

TuboTubo Conc.Conc.(mg/ml)(mg/ml)

AlbuminaAlbumina10 mg/ml10 mg/ml

(ml)(ml)

guagua(ml)(ml)

BiuretoBiureto(ml)(ml)

AA

11 2,02,0 4,04,0

22 4,04,0 4,04,0

33 6,06,0 4,04,044 8,08,0 4,04,0

55 10,010,0 4,04,0

BRBR ---------- ---------- 1,01,0 4,04,0 ----------

0,2 0,8

0,4 0,6

0,6 0,40,8 0,2

1,0 ---

Deixar os tubos em repouso por 10 minutos.Ler as absorbncias de todos os tubos contra o Branco no P

adequado.Traar o grfico e analisar.


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Dosagem de protenas totais de uma amostra

1,0 ml da amostra

4,0 ml do reagente de biuretoEsperar 10 minutosLer contra o Branco

AmostraConc. ?

Determinar a concentrao de protenas totais na amostra recorrendo curva padro

2 4 6 8 10 mg/ml0

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5A

C


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O uso de Fator de Calibrao (FC)

um artifcio usado rotineiramente e seu clculo feito como:

concentrao padroFC =

absorbncia padro


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2. Obtendo o Fator de Calibrao pela prpria curva padro

0.5 FC = cotag E

2 4 6 8 10 mg/ml0

00.1

0.2

0.3

0.4

A

C

Y2

Y1

X1 X2

E

cateto oposto(sen E)

cateto adjacente(cos E)

Portanto:FC = 1 / tg E

Como:tg E = sen E / cos E

Ento:FC = cos E / sen E

De onde se conclui que:

cateto adjacente X2 - X1FC = = cateto oposto Y2 - Y1

Finalmente, para calcular a concentrao da amostra:

[amostra] = Absorbncia da amostra FC


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