CRESCIMENTO BACTERIANO

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Prof. Gildemar CrispimMicrobiologia Médica

Requerimento nutricional

• As bactérias necessitam de uma FONTE DE CARBONO E NITROGENIO, FONTE DE ENERGIA, ÁGUA e vários ions para seu crescimento

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CULTURA = ISOLAMENTO DE GERMES

DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS INFECCIOSAS

Fontes de Nutrientes

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Carbono: CO2, carboidratos, aminoácidos, etc.

Nitrogênio: N2, NH3 (amonia), NO3(Nitrato), aminoácidos, etc.

Enxofre: SO4(sulfato), cisteína(proteína), vitaminas, etc.

Fontes de Nutrientes

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FÓSFORO: PO4 e nucleotídeos.

Minerais: Fe, Ca, Mg, Mn, Zn, K, Na, Cl, etc.

Fatores de crescimento: vitaminas, aminoácidos, nucleosídeos. (citosina, adenina, guanina, timina ou uracila)

CONDIÇÕES DE CULTIVO

• TEMPERATURA• D.B.O (Demanda Bioquímica de

Oxigênio)• TEMPO DE INCUBAÇÃO• PRESSÃO OSMÓTICA• UMIDADE• pH

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TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO

•Psicrófilos = 12 a 17ºC•Mesófilos = 30 a 40 ºC•Termófilos = 57 a 87ºC

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Arqueobacter = 250 – 350ºCArqueobacter = 250 – 350ºCPsicrotrófico = deteriorização Psicrotrófico = deteriorização dos alimentosdos alimentos

D.B.O – Demanda Bioquímica de O2

• FACULTATIVAS: Staphylococcus sp.

• ANAERÓBIOS: Clostridium tetani

• AERÓBIOS: M. tuberculose

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CAMPINOFÍLICOS = Cresce em CO2

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D.B.O – Demanda Bioquímica de O2

• MICROAERÓFILAS: Campylobacter jejuni, Neisseria meningitide

• AEROTOLERANTES: Enterococcus, faecalis

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CAMPNOFÍLICOS = Cresce em CO2

PRESSÃO OSMÓTICA

MEIO• ISOTÔNICO• HIPOTÔNICO• HIPERTÔNICO

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Bactérias halofílicas obrigatórias ( 30 % )Bactérias halofílicas obrigatórias ( 30 % )Bactérias halofílicas facultativas ( 2% )Bactérias halofílicas facultativas ( 2% )

Ágar Chapman-Stone para S. aureus

Ambientes com alta concentração de sais

TEMPO DE INCUBAÇÃO

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Tempo de Geração= Tempo de Geração= Tempo necessário para Tempo necessário para uma célula se dividir (dobro)]uma célula se dividir (dobro)]

Geralmente 1 a 3 Geralmente 1 a 3 HH(( E. coli E. coli 20 min.)20 min.)

Representação Representação logarítma ( Yx)logarítma ( Yx)TG

CRESCIMENTO E REPRODUÇÃO

• Crescimento Microbiano: É o aumento do número de indivíduo e não o aumento de tamanho de uma determinada célula.

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REPRODUÇÃOREPRODUÇÃO : É : É a perpetuação das a perpetuação das espécies de espécies de bactérias pelo bactérias pelo processo de divisão processo de divisão binária, Cisciparidadebinária, Cisciparidade

Divisão Bacteriana

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No de bactérias/ml

Tempo

Fase de latênciaFase de crescimentoExponencial (fase log)

CURVA TÍPICA CRESCIMENTO BACTERIANOCURVA TÍPICA CRESCIMENTO BACTERIANO

Fase estacionária

Fase de decréscimo do número de bactérias (fase lag)

Número de Bactérias Totais

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MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NA ROTINA

BACTERIOLÓGICAS

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MEIOS DE CULTURA

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São misturas de nutrientes São misturas de nutrientes necessários ao crescimento necessários ao crescimento microbiano que deve conter a microbiano que deve conter a fonte de energia e de todos os fonte de energia e de todos os elementos imprescindíveis à elementos imprescindíveis à vida das células. vida das células.

MEIOS DE CULTURA

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A formulação deve levar em A formulação deve levar em conta o t ipo nutri t ivo ao qual conta o t ipo nutri t ivo ao qual o microorganismo pertence, o microorganismo pertence, considerando – se a fonte de considerando – se a fonte de energia, o substrato doador energia, o substrato doador de elétrons e a fonte de de elétrons e a fonte de carbono.carbono.

FATORES DE CRESCIMENTO

• Também é imprescindível acrescentar ao meio vitaminas, cofatores e aminoácidos quando estes compostos não são sintetizados pelo microorganismo que se deseja cultivar.

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Tipos de Meios de Cultura

Meio Quimicamente Definido Meio AR-103

Meio Complexo. Ex. ágar sangue

Meio Seletivo Ex. ágar Chapman Stone, ágar EMB

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Tipos de Meios de Cultura

Meio Diferencial. Ex. ágar SSMeio de Enriquecimento. Caldo Verde BrilhanteMeio de Transporte. Ex. Meio de Stuart

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MEIOS DE TRANSPORTE

• MEIO DE STUART• CARY BLAIN = Transporte para fezes• ROSA DUDET = Transporte para

Micoplasma• MEIO DE LIGNIER

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COPROCULTURA

• ÁGAR E.M.B (Eosina Blue Metioleno)• ÁGAR MAC CONKEY• ÁGAR SS ( Salmonella-Shigella)• CALDO TETRATIONATO• SKIRROW = CAMPYLOBACTER

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UROCULTURA

• ÁGAR CLED (Contagem de colônias)• ÁGAR MAC CONKEY• BROLACIN• ÁGAR SANGUE

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CULTURA DE SECREÇÕES

• ÁGAR SANGUE• ÁGAR CHOCOLATE• ÁGAR THAYER MARTIN (GONOCOCOS)• CALDO BHI• CALDO TIOGLICOLATO (anaeróbios)

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CULTURA PARA ANAEROBIOS

• CALDO TIOGLICOLATO• Agar Sangue para Anaeróbios (ASA)• ASA + álcool feniletila, • ASA + kanamicina + vancomicina• Agar cicloserina-cefoxitina—frutose,

Caldo tioglicolato enriquecido

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CULTURA PARA TUBERCULOSE

• Descontaminação prévia (Petrof, Lauril sulfato de sódio)• Meio de Lowenstein-Jensen: ovo

coagulado• Middlebrook 7H10 - Meio à base de

ágar27

MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS

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BACTÉRIAS NÃO CULTIVÁVEIS:

• MYCOBACTERIUM LEPRAE• TREPONEMA PALIDUM• RIQUÉTSIAS

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CULTURA PARA FUNGOS

• ÁGAR SABOURAND• MICOSEL• ÁGAR B.D.A (ÁGAR DEXTROSE-

BATATA)

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MEIOS PARA TRICHOMONAS

• MEIO DE KUPFERBERG• MEIO DE ROISON• MEIO DE DIAMOND

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S.Aureus em ÁGAR SANGUE

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ÁGAR SANGUE

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ÁGAR SANGUE

• O sangue é adicionado a temperatura de 40ºC no ágar base ou ágar Mueller-Hinton. As hemácias são preservadas íntegras

Meio de enriquecimento

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ÁGAR CHOCOLATE

• O SANGUE QUANDO AQUECIDO A 56ºC LIBERA DIVERSAS SUBSTÂNCIAS QUE FUNCIONAM COMO FATORES DE CRESCIMENTO

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Cultura para Neisserias

ÁGAR SS (Salmonella & Shigella)

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AS COLÔNIAS NEGRAS INDICAM A PRODUÇÃO DE H2S PELAS SALMONELLAS

TCBS CHOLERA MEDIUM

1-V. Cholerae

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Incubação: 24hs em 35ºC

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1- Morfologia das colônias;

2-Forma, Coloração de Gram,

Arranjo, Motilidade, Catalase;

3-Modo de fermentação da glicose

(carboidratos) e perfil bioquímico;

4-Fatores de crescimento;

5-Disponibilidade de oxigênio;

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS

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6-Testes de produção de gás;

7-Tolerância ao sal, pH e bile;

8-Crescimento em determinadas

temperaturas (máxima e mínima);

9-Condições do ácido láctico

produzido;

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10-Tipos de bacteriófagos;

11-Hidrólise da Arginina;

12-Formação de Acetoina

(Acetilmetilcarbinol);

13-Fermentação butilenoglicólica;

14-Tipo de hemólise;

15-Produção de polissacarídeos

extracelulares;

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16-Tipagem sorológica;

17-Presença de enzimas e

antígenos na superfície celular;

18-Perfil eletroforético de

proteínas;

19-Atividade antimicrobiana;

20-Lipídeos e constituintes da

parede celular

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Car

acte

ríst

icas

cul

tura

is d

as

bact

éria

s

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Car

acte

ríst

icas

cul

tura

is d

as

bact

éria

s

Características das Colonias

• 1.Qto ao BRILHO: TRANSPARENTE, TRANSLUCIDA OU OPACA• 2.Qto a COR: INCOLOR OU PIGMENTADA• 3.Qto ao ASPECTO:VISCOSA, ÚMIDA,

FILAMENTOSA, ETC,

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Crescimento em tubo de agar inclinado

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Meios para Provas Bioquímicas

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Fermentação da carboidratos

Bifidobacterium

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Fermentação da carboidratos

Tube 1:Culture en WW (rose) Tube 2:Lait Tube 3:Type respiratoire anaerobi (WW profond) Tube 4:Glucose Tube 5:Saccharose

Tube 6:Lactose Tube 7:Glycerol Tube 8:Mannitol Tube 9:Amidon Tube 10:Indole Tube 11:Nitrate

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ÁGAR MUELLER-HINTON

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CRESCIMENTO CONFLUENTE UTILIZADO NO ANTIBIOGRAMA

PROVA DA OPTOQUINA

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PREPARAÇÃO DO MEIO

• 1-PESAGEM• 2-DISSOLUÇÃO• 3-ESTERILIZAÇÃO• 4-DISTRIBUIÇÃO• 5-TESTE DE ESTERILIDADE

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DISSOLUÇÃO

• A FRIO = MEIO LIQUIDO (CALDO, INFUSO)

• A QUENTE = MEIO SÓLIDO (ÁGAR-ÁGAR)

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Tubos

Placas

ESTERILIZAÇÃO

• AUTOCLAVE = 121ºC por 15 a 20min

(Substância termoestável)

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ESTERILIZAÇÃO

• FILTRAÇÃO = Membrana milipore

(Substâncias termolábil: Soro, vitaminas, antibióticos, açucares, etc)

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SEMEADURA

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SEMEADURA

• Princípio: Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los.

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Técnicas de Semeadura

• ESGOTAMENTO• ESPALHAMENTO “POUR PLATE” • ESPALHAMENTO POS PLATE

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Técnica de Esgotamento

• A mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue, ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente flambada e esfriada

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Técnica de Esgotamento

• Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra.• Passar a alça sobre o meio de cultura

em movimento de zigue-zague sem sobrepor as linha e sem recarregar a Alça.• Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48

horas66

Técnica de Esgotamento

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Incubar na estufa

68

Col

ônia

s is

olad

as

• COLÔNIAS QUE SURGEM FORA DOS RISCOS DA ALÇA

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SUGEREM POSSÍVEIS CONTAMINANTE

Espalhamento “Pour Plate”

• Consiste em fazer uma prévia diluição da amostra e colocar em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogenizar a amostra diluída com o meio de cultura.

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Cultura de urina = Contagem de colônias (UFC/ml)

Espalhamento “Pour Plate” Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10,

1/100 e 1/1000. Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de

Petri estéril Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC Derramar sobre a amostra na placa e aplicar

movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;

Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 hora

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Espalhamento Pos Plate

• Consiste em colocar a amostra (diluida ou não) sobre o meio com auxilio da alça de platina calibrada e espalhar por toda placa.• Pode-se também colocar um volume

conhecido (10ul) com pipeta automática e espalhar com alça de Drigalsky.

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Contagem de Bactérias Viáveis

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Recomendações Para Semeadura• Todo processo deve ser feito em ambiente limpo

e desinfectado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;

• Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;

• As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa

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