Controle Microbiolgico de Produtos no estreis

Produtos no estreis so aqueles nos quais se admite conceitualmente a presena de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as caractersticas de sua utilizao.Cosmticos, produtos farmacuticos tpicos e oraisContato com reas portadoras de flora microbiana natural!!!Ateno no CQ destes produtos deve assegurar que a carga microbiana presente (quali e quantitativo) no comprometa a sua qualidade final ou mesmo a segurana do paciente.

Altas cargas microbianas presentes no produto farmacutico no estril podem comprometer:

A segurana do paciente e/ou usurio que no esteja saudvel, dependendo ainda das caractersticas de utilizao de cada produto.

A estabilidade do mesmo, interferindo diretamente na sua qualidade intrnseca.

A qualidade microbiolgica de um produto no estril proporcionada pela adoo e respeito s Boas Prticas de Fabricao, sendo necessrio e complementar s BPF a adio de conservantes.

Segundo RDC 162/01, apresentada a definio de conservantes :

So substncias adicionadas aos Produtos de Higiene Pessoal, Cosmticos e Perfumes com a finalidade primria de preserv-los de danos e/ou deterioraes causados por microorganismos durante sua fabricao e estocagem, bem como proteger o consumidor de contaminao inadvertida durante o uso do produto. permitida a associao de substncias conservantes obedecidos seus limites individuais.Em casos especiais, quando houver necessidade de utilizar-se uma concentrao que ultrapasse os valores individuais estipulados na lista, a empresa dever apresentar documentao tcnico-cientfica justificando o seu uso.

RDC 162 de 2001, estabelece a lista de substncias de ao conservantes para produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfumes.

Sistemas conservantes devem apresentar algumas caractersticas para suas substncias:

Possuir amplo espectro de ao microbiana; No mudar as caractersticas organolpticas do produto; No interagir com componentes da formulao; Ser estvel em ampla faixa de pH; Devem includas nas formulaes sob concentrao mnima de eficcia e mxima descrita em legislao.

CQ tem como objetivo imediato comprovar a ausncia de microorganismos patognicos e determinar o nmero de microorganismos viveis, em funo dos tipos de utilizao do produto.Risco ao consumidor:

Saprfitas agentes infectantes oportunistas (deteriorao de produtos) TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!! Patognicos (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) risco de quadro clnico infeccioso PROIBITIVO A PRESENA!!!Ex. consumidor ser debilitado ou imunodeprimido; Cosmticos em pele sensvel beb.Cuidados quanto ao limite microbiano!!!

Estabilidade do produto:

Perda da eficcia teraputica por degradao do PA:ou por alterao de parmetro fsico fundamental para sua atividade ex. pH, ou alterao de propriedades fsico-qumicas entre elas: produo de gases odor desagradvel, ao enzimtica levando a degradao de tensoativos quebra da emulso ou alterao na viscosidade.

PREOCUPAO COM AS POSSVEIS FONTES DE CONTAMINAO:

DIRETAS: Fluidos gasosos, gua e demais matrias-primas (principalmente origem natural).

INDIRETAS: procedimentos de limpezas, instalaes inadequadas, pessoal no paramentado, processos no validados...

Lembrar que a carga microbiana (CM) pode ser alterada durante o processo de fabricao ou mesmo durante o tempo de prateleira do produto, por diversos fatores:

Frmula: presena de protenas e carboidratos (cosmticos) se a concentrao no for hiperosmtica favorece a elevao de CM. em contrapartida, presena de etanol, sorbitol, sacarose, propilenoglicol tendem a favorecer CM mais baixas, nas concentraes normalmente utilizadas em lquidos. Conservantes: usados com critrio podem interagir com componentes da frmula e ter sua atividade reduzida.

pH: microorganismos crescem em pH neutro, com efeitos inibitrios em faixas extremas (cidas ou alcalinas).

Atividade da gua: fundamental para sobrevivncia de microorganismos. Portanto os produtos em gua dependem de incorporao de conservantes. Recorrer quando possvel s frmulas extemporneas!!!

Processo: altas temperaturas reduzem CM, j temperaturas prximas a 40C tem efeito oposto. gua de condensao nas paredes de reatores, ou mesmo vapor de gua na tampa de frascos durante o resfriamento podem ocasionar a proliferao de microorganismos

PADRES PRIMRIOSApesar do reconhecimento, h muitos anos, da importncia do controle microbiano de produtos no estreis, a implantao dos padres sanitrios tem ocorrido lentamente. Este fato pode ser observado nas farmacopias em que os padres esto sendo includos gradativamente.

As monografias farmacopeicas nas quais consta especificaes para qualidade microbiolgica, de forma geral, referem-se ausncia de uma ou mais espcies especficas. Apesar de a carga microbiana total tambm ser parmetro de avaliao da qualidade sanitria do produto, o limite para o nmero de microorganismos viveis exigncia apenas em algumas especificaes.

A Portaria n 600, de 28 de novembro de 1997, da Secretaria da Vigilncia Sanitria, divide os cosmticos em dois grupos, tipo I e II, dependendo do local de aplicao. O tipo I refere-se a produtos para uso infantil, para rea dos olhos e para aqueles que entra em contato com a mucosa. O tipo II, para demais produtos suceptveis contaminao.- Tipo I: menos que 102/g de microrganismos totais aerbicos. Ausncia de Pseudomonas aeruginoas, Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g; no caso do talco, ausncia de Clostrdeos sulfito redutores, tambm em 1g.- Tipo II difere em relao ao primeiro apenas no limite de aerbios totais que de, menos que 103/g.

Mtodos de anlises:

Amostragem (coleta, transporte e preparao da amostra).

Determinao numrica ou contagem de formas viveis.

Isolamento e identificao dos microorganismos indesejveis para serem pesquisados.Medicamentos no estreis e cosmticos!!!

AmostragemA amostragem a ser efetuada para investigao quanto aos atendimentos aos padres microbianos deve ser representativa.

Barricas ou sacos de matria-prima (p) no estril: coletar amostras na regio inferior, mediana e superior na quantidade de n + 1. Efetuar assepsia na rea prxima coleta de amostras, vedar em recipiente hermtico a amostra.

Em processos contnuos, a segmentao do processo deve estar contemplada na amostragem.

Produto acabado duplicata de amostra representando incio, meio e fim do processo de enchimento e que aps fechado a embalagem no existir a introduo de contaminantes.

Coleta e Transporte das amostras Fazer as amostragens em local limpo;

Operador treinado;

Recipientes, dispositivos auxiliares (esptulas, pipetas) estreis;

Temperatura adequada para trasnporte.

Quantidade a ser analisada

- Quantidade depende das anlises e re-teste.

Recomendao das principais farmacopias:

- Para enriquecimento na pesquisa de patognicos: 10 g(mL) do produto em 90 mL da soluo tampo pH 7 com inativante do conservante ou em soluo salina com inativante do conservante. Obs. No caso de amostra total ser 10 g (mL) ou inferior, estetotal deve ser analisado.

- A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(mL) emamostras com alto valor agregado.

Preparao da amostra

- Verificar a presena de conservantes na frmula.

Os conservantes devem ser inativados substncias adequadas de acordo com natureza qumica.Ex. Sais de amnio quaternrio 3% de polissorbato + 0,3% de lecitina.

Ajuste do pH do produto diludo para a faixa de neutralidade.

Homogeneizao.

- Tratamento da amostra para permitir contato ntimo daamostra com o meio diluente.

- Produtos oleosos adio de agente tensoativo.

Durante o preparo de amostras de produtos no estreis para a contagem de microrganismos viveis no patognicos, necessrio o contato dessas amostras com diluentes biocompatveis com as clulas microbianas.

Alguns possveis diluentes:

- soluo de NaCl 0,9% estril.- soluo de NaCl 0,9% e peptonada a 0,1% estril.- soluo tampo pH 7,0 estril.- caldo lactosado estril.

Exemplo de preparo de amostra para anlise microbiolgico de um cosmtico em diluio decimal seriada:

A diluio 1:10 de uma amostra de cosmtico pode ser obtida homogeneizando:

1 g de cosmtico + 9 mL de diluente, ou10 g de cosmtico + 90 mL de diluente, ou20 g de cosmtico + 180 mL de diluente, ou25 g de cosmtico + 225 mL de diluente, e assim por diante.

Em todos os exemplos acima, a amostra resultante diluda a 1:10 (10-1), e consequentemente, em cada mL da diluio teremos uma quantidade de amostra correspondente a um dcimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.

Mtodos de Contagem de MicrorganismosSemeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)

Anlise quantitativa.

Alquota de 1 a 2 mL da diluio da amostra para rplicas (triplicata) de placas de Petri estreis.

- Meio de cultura no seletivo lquido, estril, fundido e resfriado a temperatura (45-48C), cerca de 20 mL vertido sobre a placa contendo a amostra e homogeneizao com movimento em 8 ou S.

- Incubao na posio invertida aps solidificao.

8Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)

- Anlise quantitativa.

- Meio de cultura no seletivo ou seletivo slido, lquido ou semi-slido preparado e distribudo previamente em placas de Petri ou tubos.

- As diluies so distribudas por pipetas estreis, com volumes de 0,1 a 0,5 mL na superfcie do gel j solidificado, e espalha com movimentos cuidadosos com basto de vidro em L ou ala de Drigalski.

Incubar as placas invertidas.

- Esta metodologia no se aplica a amostras com cargamicrobiana inferior a 2 UFC/g (mL).

Semeadura da amostra em superfcie

Semeadura da amostra em superfcieMeio lquidoMeio semi-slidoMeio slido inclinadoMeio slido placa de Petri

Membrana Filtrante Anlise quantitativa.

- Alquotas do produto ou suas diluies filtradas em membranas apropriadas. - Membranas de 0,45m ou 0,20 m de poro e 47 mm de dimetro.

- Coloca-se a membrana sobre placa contendo meio de cultura solidificado.

- Permite amostragem de volumes elevados.

Membrana FiltranteStericup Unidade filtrante STERICUP com membrana express 0,22mm e PVDF 0,45 um, funil e frasco coletor.Sterifil aseptic Suporte de filtrao a vcuo Sterifil em polissulfona, composto de funil, base e copo coletor. Trasnferir a membrana para placa de Petri e incubar

INCUBAO DAS AMOSTRAS

- Colocar placas em estufa a 30-35 C por 2 a 5 dias na posio invertida, ou estante com tubos, paraverificar a presena de bactrias.

- Colocar placas em estufa a 20-25 C por 5 a 7 dias na posio invertida, ou estante com tubos, paraverificar a presena de fungos e leveduras.

Contagem: vista desarmada ou com auxlio de contadores.Transcorrido o tempo de incubao, considerar a contagem, somente das placas da mesma diluio que apresentarem de 30-300 colnias. Multiplica-se a mdia das mesmas pelorespectivo fator de diluio e se expressa o resultado em UFC/g de amostra.

Nmero Mais Provvel (NMP)

Anlise estimativa fundamentada em probabilidade.

- Indica o valor dentro de uma faixa que reflete o nmero de organismos presentes.

Embora apresentando impreciso maior oficilamente recomendado.

- Melhor revitalizao de microrganismos estressados perfeito contato com o meio de cultura.

Recomendado para amostras pouco solveis e translcidas.

- Permite amostras com nveis elevados de concentrao, mas indicado para quando se espera valores baixos de contagem- caldo de dupla concentrao

Nmero Mais Provvel (NMP)

- Emprega meios lquidos diluies seriadas das amostras inoculadas nos mesmos.

- Uso de tabelas estatsticas.

- Nmero de rplicas de cada diluio pode variar - o mais comum : 3 ou 5 rplicas.

As tabelas oferecem o nmero mais provvel de microrganismos por mL ou g e os limites inferior e superior (limite de confiana de 95%)

Leitura e obteno dos resultados se d por comparao com padro de turvao de meios de cultura no seletivos.

Para a escolha da tabela na qual se verificar o NMP correspondente combinao de tubos positivos, atentar para a quantidade (g ou mL) de amostra que foi realmente inoculada em cada tubo das diferentes sries e no o volume inoculado. Inoculao de

1,0 mL da diluio 10-1 na 1 srie 0,1 g ou mL1,0 mL da diluio 10-2 na 2 srie 0,01 g ou mL1,0 mL da diluio 10-3 na 3 srie 0,001 g ou mLQuantidade de amostra inoculada em cada srieQuando inoculamos mais de 3 diluies seriadas, selecionar a maior diluio na qual todos os tubos inoculados so positivos e considerar as 2 diluies seguintes maiores que a selecionada.

Exemplo 1: Amostra de medicamento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo e apresentaram os seguintes resultados:

10-2 3 tubos positivos10-3 2 tubos positivos10-4 0 tubos positivos

O valor de NMP a ser lido na tabela correspondente seria 3/2/0, que corresponde ao valor 93 NMP/g ou mL. Como, neste caso a amostra estava diluda a 10-2, o resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obteno do valor do NMP real por grama ou mL do alimento em anlise. Assim, o resultado final ser: 9300 NMP/g ou mL.

EXERCCIO.

Uma amostra de fitoterpico (cavalinha em p) foi submetido contagem microbiana pela tcnica de semeadura em superfcie, onde uma alquota de 10 g foi pesada e homogeneizada com 90 ml qsp de diluente biocompatvel contendo polissorbato. A seguir, foram feitas diluies seriadas na razo de 1:10 at a diluio 10-3 (alquotas de 1mL em 9mL de diluente). A seguir, cada diluio foi plaqueada em meio de cultura TSA fundido (em triplicata), seguindo-se a incubao das placas inoculadas. Baseado no exposto acima, pergunta-se: Qual foi a quantidade de amostra dispensada na triplicata de placas correspondente diluio 10-2 ?