COLORAÇÃO DE GRAM

Texto 1. A Coloracao de Gram e as Variacoes na sua Execucao

RESUMO

A coloracao de Gram e um importante teste realizado nos laboratorios de

microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnostico de doencas bacterianas. A

partir de um determinado perfil tintorial as bacterias coram-se de roxo ou de rosa e

consequentemente sao classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas,

respectivamente.

A coloracao de Gram envolve uma serie de procedimentos antes de chegar a

etapa final de leitura da lamina preparada: envolve a confeccao do esfregaco, sua

fixacao e passa pela coloracao pro- priamente. Nesta, o corante Cristal Violeta

adsorve-se nas celulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apos a etapa

diferencial, com alcool-acetona, as celulas sao contra-coradas com Fucsina de

Gram. Neste estudo avaliou-se a influencia de variacoes na referida coloracao

considerando os tempos de exposicao aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de

Gram e o emprego ou nao de lavagens com agua entre as etapas.

Os resultados obtidos mostraram que as diferencas nos procedimentos

aplicados em cada tecnica testada nao alteraram o resultado quando comparados a

laminas padrao.

INTRODUÇÃO

Em geral, sao necessarias coloracoes biologicas para a visualizacao de

bacterias de modo adequado e demonstracao dos detalhes finos das suas

estruturas.

O advento da coloracao representa, em grande parte, o fundamento dos

principais avancos produzidos em microbiologia clínica e em outros campos da

microscopia diagnostica durante os últimos 100 anos.

A maioria das coloracoes utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o

diagnostico presuntivo rapido do processo infeccioso e tambem a previa avaliacao

da qualidade da amostra.

A coloracao de Gram e o metodo bacterioscopico mais importante e mais

utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade e a classificacao de

microrganismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e

arranjo celular.

As bacterias sao classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-

positivas e Gram-negativas. No que diz respeito as características tintoriais, as

bacterias Gram-positivas coram-se de roxo e as bacterias Gram-negativas coram-se

de rosa.

A deteccao de microrganismos na amostra e de suma importancia, uma vez

que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de

patogenos e, tambem, a necessidade da realizacao de cultura com finalidade

diagnostica e/ou epidemiologica.

A tecnica de coloracao de Gram geralmente respeita um protocolo de acoes

que a padroniza. Contudo, ha variantes nesse procedimento relacionadas aos

tempos de execucao da coloracao e a utilizacao de lavagem com agua em dadas

etapas que podem ou nao interferir na visualizacao das estruturas coradas. Nesse

sentido, este trabalho se propos a verificar se estas pequenas variacoes de tempo e

lavagens a partir de protocolos específicos refletem em alguma alteracao na

interpretacao dos resultados da coloracao de Gram.

FREITAS, Valdonir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A coloracao de Gram e as

variacoes na sua execucao. Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.

Texto 2. Técnica de Coloracao de GRAM

INTRODUÇÃO

O metodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia e o metodo de

Gram. A bacterioscopia, apos coloracao pelo metodo de Gram com diagnostico

presuntivo, de triagem, ou ate mesmo confirmatorio em alguns casos, constitui peca

importante e fundamental na erradicacao e no controle das Doencas Sexualmente

Transmissíveis (DST). Essa tecnica e simples, rapida e tem capacidade de

resolucao, permitindo o correto diagnostico em cerca de 80% dos pacientes em

carater de pronto atendimento em nível local.

Os custos com investimento e manutencao sao consideravelmente baixos

diante da eficacia alcancada com os resultados imediatos dos testes. Essa tecnica

requer instalacao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com

disponibilidade de agua e gas, onde devera ser instalado um balcao com pia e um

bico de Busen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira.

Sao ainda necessarios: microscopio com objetiva de imersao e bateria para a

coloracao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo proprio laboratorio ou

por um laboratorio habitado que assegure a qualidade do produto.

Finalmente, e mais importante, sao necessarios tecnicos de laboratorio

treinados, responsaveis e conscientes do valor do seu trabalho.

A coloracao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor,

o medico dinamarques Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que

as bacterias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.

Isso permitiu classifica-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram

chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-

negativas.

Apos descricao do metodo, inúmeras propostas de modificacao foram feitas.

Neste manual, voce vai conhecer a tecnica, os corantes e os procedimentos para a

correta realizacao da coloracao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de

Doencas Sexualmente Transmissíveis e Aids do Ministerio da Saúde.

Como funciona a coloracao de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, varios pesquisadores tentaram, com

pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no metodo de coloracao.

Conceitos diversos tem sido apresentados, tais como:

1. A existencia de um substrato Gram-positivo e específico;

2.As bacterias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam

diferentes afinidades com o corante primario cristal de violeta; e

3.A existencia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos

Gram-positivos e Gram-negativos.

Este último e o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de

celular, quanto as dimensoes dos espacos intersticiais, por exemplo, “diametro do

poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloracao de Gram.

Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares sao cobertas pela

violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adicao do lugol, tambem chamado

de mordente, ocorre a formacao do completo iodo-pararosanilina. Esta reacao tem a

propriedade de fixar o corante primario nas estruturas coradas. Algumas estruturas

perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como

alcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou nao perdem a

cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

As bacterias que tem a parede celular composta por mureína

(peptídeoglicano - peptídeo de acido n-acetil muramico), durante o proces- so de

descoloracao com alcool etílico, retem o corante. Ja as bacterias com parede celular

composta predominantemente por acidos graxos (lipopolissacarídeos e

lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante

de fundo.

Brasilia: Ministerio da Saúde, Tecnica de Coloracao de Gram. Programa

Nacional de Doencas Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Serie

TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doencas Sexualmente Transmissíveis

e AIDS, (Brasil). II. Serie TELELAB. Disponível em:

http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf. Acesso em: 15 out

2014.

TEXTO 3. Coloracao de Gram (Tortora)

A coloracao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologis- ta dinamarques

Hans Christian Gram. Ela e um dos procedimentos de coloracao mais úteis, pois

classifica as bacterias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.

Neste procedimento (Figura 3.12a),

1. Um esfregaco fixado pelo calor e recoberto com um corante basico púrpura,

geralmente o cristal violeta. Uma vez que a co- loracao púrpura impregna

todas as celulas, ela e denominada coloracao primária.

2. Apos um curto período de tempo, o corante púrpura e lavado, e o esfregaco e

recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo e lavado, ambas as

bacterias gram-positivas e gram-nega- tivas aparecem em cor violeta escuro

ou púrpura.

3. A seguir, a lamina e lavada com alcool ou uma solucao de alcool-acetona.

Essa solucao e um agente descolorante, que remove o púrpura das celulas

de algumas especies, mas nao de outras.

4. O alcool e lavado, e a lamina e entao corada com safranina, um corante

basico vermelho. O esfregaco e lavado novamente, seco com papel e

examinado microscopicamente.

O corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bacteria,

corando-a de violeta escuro ou púrpura. As bacte- rias que retem essa cor apos a

tentativa de descolori-las com alcool sao classificadas como gram-positivas; as

bacterias que perdem a cor violeta escuro ou púrpura apos a descoloracao sao

classificadas como gram-negativas (Figura 3.12b). Como as bacterias gram- -

negativas sao incolores apos a lavagem com alcool, elas nao sao mais visíveis. É

por isso que o corante basico safranina e aplica- do; ele cora a bacterias gram-

negativas de rosa.

Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a

coloracao primaria, sao denominados contracorantes. Como as bacterias gram-

positivas retem a cor púrpura original, nao sao afetadas pelo contracorante

safranina.

Como voce vera no Capítulo 4, os diferentes tipos de bacterias reagem de

modo distinto a coloracao de Gram, pois diferencas es- truturais em suas paredes

celulares afetam a retencao ou a liberacao de uma combinacao de cristal violeta e

iodo, denominada comple- xo cristal violeta-iodo (CV-I).

Entre outras diferencas, as bacterias gram-positivas possuem uma parede

celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e aminoacidos) que as

bacterias gram- -negativas. Alem disso, as bacterias gram-negativas contem uma

camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua parede

celular (veja a Figura 4.13, pagina 86).

Quando aplicados a celulas gram-positivas e gram-negativas, o cristal vio-

leta e o iodo penetram facilmente nas celulas. Dentro das mesmas, o cristal violeta e

o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo e maior que a molecula de

cristal violeta que penetrou na celula e, devido a seu tamanho, nao pode ser

removido da camada intacta de peptideoglicano das celulas gram-positivas pelo

alcool. Consequentemente, as celulas gram-positivas retem a cor do co- rante cristal

violeta.

Nas celulas gram-negativas, contudo, a lava- gem com alcool rompe a

camada externa de lipopolissacarídeo, e o complexo CV-I e removido atraves da

camada delgada de peptide- oglicano. Como resultado, as celulas gram-negativas

permanecem incolores ate serem contracoradas com a safranina, quando adqui-

rem a cor rosa.

Em resumo, as celulas gram-positivas retem o corante e per- manecem com a

cor púrpura. As celulas gram-negativas nao retem o corante; elas ficam incolores ate

serem contracoradas com um corante vermelho.

O metodo de Gram e uma das mais importantes tecnicas de coloracao na

microbiologia medica. Porem, os resultados da co- loracao de Gram nao sao

universalmente aplicaveis, pois algumas celulas bacterianas coram-se fracamente

ou nao adquirem cor. A reacao de Gram e mais consistente quando utilizada em

bacterias jovens, em crescimento.

Figura 1. Procedimento para a realização da coloração de Gram.

Figura 2. Micrografia de bactérias coradas pelo Gram. Os bastonetes e os cocos (roxo) são gram-positivos, e os vibriões (rosa) são gram-negativos.

Microbiologia [recurso eletrônico] / Gerard J. Tortora,

Berdell R. Funke, Christine L. Case ; tradução: Aristóbolo Mendes da Silva ... [et al.] ; revisão técnica: Flávio Guimarães da Fonseca. – 10. ed. – Dados eletrônicos. – Porto Alegre : Artmed, 2012.