Universidade de Aveiro

2011

Departamento de Biologia

Carina Teixeira

Moita

Caracterização da Atividade Bactericida da Água

Termal do Cró

Universidade de Aveiro

2011

Departamento de Biologia

Carina Teixeira

Moita

Caracterização da Atividade Bactericida da Água

Termal do Cró

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos

requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Microbiologia, realiza-

da sob a orientação científica da Prof. Doutora Cândida Ascensão Teixeira

Tomaz, Professora Associada no Departamento de Química da Universidade

da Beira Interior e coorientação da Prof. Doutora Adelaide Almeida, Professora

Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.

o júri

presidente Prof. Doutora Sónia Alexandra Leite Velho Mendo Barroso Professora auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Fani Pereira de Sousa Professora Auxiliar do Departamento de Ciências Médicas da Universidade da Beira Interior (Arguente)

Prof. Doutora Cândida Ascensão Teixeira Tomaz Professora Associada no Departamento de Química da Universidade da Beira Interior (Orientado-ra)

Prof. Doutora Adelaide Almeida

Professora Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro (Coorientadora)

agradecimentos Gostaria de expressar a minha gratidão a todos aqueles que de alguma forma

contribuíram para a realização do presente trabalho.

À Prof. Doutora Cândida Tomaz, orientadora desta dissertação, gostaria de manifestar o meu reconhecimento e o meu muito obrigado por toda a ajuda que me prestou tornando possível a realização deste trabalho. Ao Dr. Paulo Tavares, Diretor do Serviço de Patologia Clínica do Hospital Sou-sa Martins da Guarda, verdadeiro símbolo de dinamismo, responsabilidade e eficiência, um muito obrigado pela ajuda na viabilização da realização deste estudo, e principalmente pelos valiosos conhecimentos transmitidos na orien-tação deste trabalho. À Prof. Doutora Adelaide Pinho, coorientadora, pela disponibilidade e dedica-ção que sempre demonstrou. À Dr.ª Fátima Vale, por todos os conhecimentos que partilhou comigo, pela sua atenção e disponibilidade. À Maria de Jesus, pela sua incansável ajuda, simpatia e companheirismo. A toda a equipa do Complexo Termal do Cró, especialmente ao Eng.º Tavares, ao Sr. Ferreira e ao Sr. Rui, pela colaboração e disponibilidade que sempre mostraram aquando das minhas deslocações à estância termal. Gostaria ainda de manifestar o meu agradecimento aos colegas do Laboratório e toda a equipa de auxiliares de ação médica, pelo apoio e ajuda sempre manifestados. A toda a equipa da Sub-Região de Saúde da Guarda, por me terem recebido no seu laboratório. Aos meus Amigos, em quem tantas vezes pensei, que sempre me apoiaram e entusiasmaram, compreendendo sempre a minha indisponibilidade. À minha família e ao Jorge pelo apoio, compreensão e paciência que me têm sempre dedicado.

A todos, o meu Bem-haja!

palavras-chave

água termal, doentes hospitalares, meios de cultura, crescimento bacteriano, atividade bactericida, Staphylococcus aureus

resumo

As águas minerais em Portugal têm uma longa tradição, fazendo parte da cultura e herança do nosso país. A riqueza hidromineral de apreciável valor, não só pela quantidade de nascentes como também pela qualidade das águas, tem permitido a sua utilização no termalismo, tanto na vertente medicinal como turística. Atualmente, a eficácia terapêutica das águas termais é, na generalidade, reconhecida. No entanto, os mecanismos da sua ação permanecem em grande parte desconhecidos, assim como a sua capacidade bactericida, in vitro. Deste modo, o presente estudo teve como principal objetivo analisar a atividade bactericida da água termal. Pretendeu-se ainda inferir quanto à suscetibilidade das bactérias no que concerne à água termal. Para o efeito, foram preparados meios Tripto Caseína Soja (TCS) com diferentes percentagens de água termal, sendo posteriormente usados para cultivar isolados bacterianos, selecionados de utentes da comunidade local e hospitalar. A recolha da amostra decorreu no período de dezembro de 2010 a fevereiro de 2011, perfazendo um total de 60 isolados bacterianos. A análise dos resultados mostrou que o crescimento bacteriano foi menor no meio TCS com 100% de água termal. No entanto, apenas foram observadas

diferenças estatisticamente significativas para a bactéria S. aureus. O teor

desta bactéria aumentou à medida que diminuiu a percentagem de água termal do meio. Verificou-se ainda que as estirpes A. baumannii e P. aeruginosa cresceram em meio Pastagar B com água desionizada e com água termal, apesar de não serem observadas diferenças estatisticamente significativas. O presente estudo permitiu evidenciar que a água termal diminuiu o crescimento de S. aureus, sugerindo a sua potencial aplicação como coadjuvante no tratamento local de infeções por esta bactéria. No entanto, sugerem-se novos estudos, no sentido de perceber de que forma a água termal interfere no crescimento de S. aureus e se é específica para esta estirpe ou se também se observa com outras bactérias Gram-positivo.

keywords

thermal water, hospital patients, culture medium, bacterial growth, bactericidal activity, Staphylococcus aureus

abstract

In Portugal the mineral waters have a long tradition, being part of the culture and heritage of our country. The hydromineral resources of appreciable value, not only due to the amount of springs but also the quality of water, have al-lowed its use in hydrotherapy, both in the medical and touristic aspects. Currently, the therapeutic efficacy of thermal waters is generally recognized. However, the mechanisms of their action remain largely unknown, as well as their in vitro bactericidal capacity. Thus, the main objetive of this study was to analyze the bactericidal activity of the thermal water. It was also intended to infer the susceptibility of bacterium in relation to the thermal water. For this purpose, culture Trypto-Casein-Soy (TCS) mediums with different per-centages of thermal water were prepared, which were subsequently used to cultivate bacterial isolates, chosen from the local community and hospital pa-tients. The sample collection took place from December 2010 to February 2011, ending up with a total of 60 bacterial isolates. The analysis of the results showed that the bacterial growth was lower in the TCS medium with 100% of thermal water. However, statistically significant dif-ferences were only observed on the bacteria S. aureus. The content of this bacteria increased as the percentage of thermal water in the medium de-creased. It was also evidenced that the strains A. baumannii and P. aeruginosa grew in Pastagar B medium with deionized water and with thermal water, de-spite the fact that statistically significant differences were not observed. Through this study it became evident that the thermal water decreased the growth of S. aureus, suggesting its potential use as an adjuvant to local treat-ment of infections by this bacterium. Nevertheless, new studies have to be performed in order to understand how the thermal water interferes with the growth of S. aureus and if it is specific to this strain or if it extends to other Gram-positive bacteria.

“Aquilo que aparenta ser benéfico para a saúde merece ser estudado com o necessário espírito

crítico e científico e devidamente ensinado”

Patrice Queneau

Índice Geral

i

Índice

Capítulo 1 1 - Introdução......................................................................................................................... 2

1.1 - Águas Minerais Naturais ............................................................................................... 4

1.1.2 – Origem ....................................................................................................................... 5

1.1.3 – Caracterização ........................................................................................................... 6

1.1.3.1 – Características Físico-Químicas ................................................................... 7

1.1.3.2 – Classificação de Acordo Com a Composição Química ............................. 10

1.1.4 – Aplicações Terapêuticas .......................................................................................... 11

1.1.5 – Ação Bactericida da Água Termal .......................................................................... 12

1.2– Termas do Cró ............................................................................................................. 13

1.2.3 – Enquadramento Hidrogeográfico ............................................................................ 13

1.2.4 - Programa de Controlo de Qualidade ........................................................................ 14

1.2.5 – Caracterização da Água Termal e Indicações Terapêuticas .................................... 15

1.3 – Crescimento Bacteriano .............................................................................................. 16

1.4 – Meios de Cultura ........................................................................................................ 20

1.5 - Controlo do Crescimento Bacteriano .......................................................................... 21

1.5.1 – Mecanismos de Ação dos Agentes Antibacterianos ................................................ 21

1.5.2 – Quantificação da Atividade Antibacteriana ............................................................. 22

1.6 – Bactérias Patogénicas – Caracterização Geral............................................................ 24

1.6.1– Escherichia coli ........................................................................................................ 26

1.6.2 - Pseudomonas aeruginosa ........................................................................................ 27

1.6.3 - Acinetobacter spp ..................................................................................................... 29

1.6.4 - Staphylococcus aureus ............................................................................................. 30

Objetivos .............................................................................................................................. 32

Índice Geral

ii

Capítulo 2

2 - Material e Métodos......................................................................................................... 34

2.1 – Local do estudo ........................................................................................................... 34

2.2 - Isolados Bacterianos .................................................................................................... 34

2.2.1– Processamento e Critérios de Inclusão ..................................................................... 35

2.3 - Identificação dos Isolados Bacterianos ....................................................................... 35

2.3.1 – Análise Macroscópica ............................................................................................. 35

2.3.2 – Análise Microscópica .............................................................................................. 35

2.3.3 - Identificação Bioquímica ......................................................................................... 36

2.3.4 – Identificação Automatizada (Sistema VITEK® 2 Compact) .................................... 37

2.4 – Conservação ............................................................................................................... 38

2.5 - Recolha da Água Termal ............................................................................................. 38

2.5.1 – Processamento da Recolha da Água Termal ........................................................... 39

2.5.2 – Determinação de Parâmetros Físico – Químicos ..................................................... 39

2.5.3 – Transporte da Água Termal ..................................................................................... 39

2.6 - Meios de Cultura do Estudo ........................................................................................ 39

2.6.1 - Água Termal com Agar ............................................................................................ 40

2.6.2 - Água Desionizada com Agar ................................................................................... 40

2.6.3 – Gelose Tripto Caseína Soja ..................................................................................... 40

2.6.4 – Processo de Esterilização ........................................................................................ 41

2.6.5 – Controlo de Qualidade Interno ................................................................................ 41

2.7 – Sementeira em Meios de Cultura................................................................................ 41

2.7.1 - Preparação do Inóculo por Diluições Sucessivas ..................................................... 41

2.7.2 – Técnica de Sementeira ............................................................................................. 42

2.7.3 – Interpretação dos Resultados ................................................................................... 42

2.7.4 – Controlo de Qualidade ............................................................................................. 43

2.8 - Avaliação da Suscetibilidade das Bactérias à Água Termal ....................................... 43

Índice Geral

iii

2.8.1 – Preparação dos Discos com Água Termal ............................................................... 43

2.8.2 – Preparação dos Discos com Água Destilada Estéril ................................................ 44

2.8.3 - Adaptação da Técnica de Kirby – Bauer .................................................................. 44

2.8.3.1 – Preparação do Inóculo ................................................................................ 44

2.8.3.2 - Inoculação do Meio de Cultura ................................................................... 44

2.8.3.3 – Aplicação dos Discos Impregnados ........................................................... 44

2.8.3.4 – Incubação e Leitura dos Halos de Inibição ................................................ 45

2.8.4 – Controlo de Qualidade ................................................................................. 45

2.9 – Tratamento Estatístico ................................................................................................ 45

Capítulo 3

3 – Resultados e Discussão .................................................................................................. 47

3.1 – Caracterização da População em Estudo e Espécime Biológico ................................ 48

3.2 – Caracterização Geral das Águas Termal e Desionizada - pH, Condutividade e

Temperatura ............................................................................................................... 52

3.3 – Caracterização dos Meios de Cultura - pH ................................................................. 54

3.4 – Avaliação do Crescimento Bacteriano ....................................................................... 57

Capítulo 4

4 – Conclusão e Perspetivas Futuras ................................................................................... 68

Capítulo 5

5 – Bibliografia .................................................................................................................... 71

Anexos ................................................................................................................................. 87

Índice de Figuras

iv

Índice de Figuras

Figura 1.1 – Esquema de um sistema de águas termais .................................................................... 6

Figura 1.2 – Representação das grandes unidades geológicas estruturais e das águas termais

(incluindo respetivo quimismo) de Portugal Continental ......................................... 10

Figura 2.1- Esquema das provas de identificação bioquímicas efetuadas de acordo com as

características culturais das bactérias e com a coloração de Gram ........................... 36

Figura 3.1- Distribuição da faixa etária (anos) dos indivíduos do presente estudo ......................... 48

Figura 3.2- Distribuição das estirpes por serviço de proveniência .................................................. 49

Figura 3.3- Distribuição das bactérias por espécime biológico....................................................... 50

Figura 3.4 – Distribuição dos valores médios do pH dos meios Pastagar B com água desionizada e

com água termal ........................................................................................................ 55

Figura 3.5 – Distribuição dos valores médios do pH nos diferentes meios de TCS ....................... 55

Figura 3.6 - Teor de bactérias no meio Pastagar B ......................................................................... 57

Figura 3.7 – Colónias isoladas nos diferentes meios de cultura com diferentes diluições .............. 59

Figura 3.8 – Teor de E. coli nos diferentes meios de TCS .............................................................. 61

Figura 3.9 – Teor de A. baumannii nos diferentes meios de TCS ................................................... 61

Figura 3.10 – Teor de P. aeruginosa nos diferentes meios de TCS ................................................ 62

Figura 3.11 – Teor de S. aureus nos diferentes meios de TCS ....................................................... 63

Figura 3.12- Distribuição do Teor médio de S. aureus nos diferentes meios de TCS .................... 63

Índice Tabelas

v

Índice de Tabelas

Tabela 1.1 – Classificação das águas minerais de acordo com a temperatura .................................. 8

Tabela 1.2 – Classificação das águas minerais em relação à mineralização total ............................. 8

Tabela 1.3 – Classificação das águas minerais em relação ao resíduo seco ...................................... 9

Tabela 1.4 – Classificação das águas minerais segundo a dureza total ............................................. 9

Tabela 1.5 – Classificação das águas minerais Portuguesas e sua principal característica ............. 10

Tabela 1.6 – Macronutrientes na natureza e nos meios de cultura, sua função celular ................... 18

Tabela 1.7 – Micronutrientes microbianos, forma química usada pelas bactérias e sua função

celular. ....................................................................................................................... 19

Tabela 2.1- Percentagem de água termal e de água desionizada utilizada na preparação dos diferen-

tes meios de TCS ....................................................................................................... 40

Lista de Abreviaturas

vi

Lista de Abreviaturas

ATCC – American Type Culture Collection

ATP – Adenosina Trifosfato

CLED – Cystine Lactose Electrolyte Deficient

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

CMI – Concentração Mínima Inibitória

DPOC – Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica

FDA – Food e Drug Administration

GC – Gelose Columbia

I – Intermédio

IACS – Infeções Associadas aos Cuidados de Saúde

ITU – Infeção do trato urinário

IUPAC – International Union of Pure e Applied Chemistry

LED – Light Emitting Diodes

LPS – Lipopolissacárideos

LSD – Least Significant Difference

MCK – MacConkey

MH – Müller-Hinton

MSA – Manitol Salt Agar

NaCl – Cloreto de sódio

NE – SW – Nordeste – Sudoeste

Índice de Figuras

vii

NNIS – National Nosocomial Infection Surveillance System

NP – Norma Portuguesa

NW – SE – Noroeste – Sudeste

OMS – Organização Mundial de Saúde

PNCI – Programa Nacional de Controlo de Infeção

R – Resistente

S – Sensível

SPSS – Statistical Package for the Social Science

TCS – Tripto Caseína Soja

UCI – Unidade de Cuidados Intensivos

UFC/mL – Unidades formadoras de colónias por mililitro

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Introdução

2

1 - Introdução

O tratamento termal é a terapêutica mais antiga presente na história da medicina (Messina,

et al., 1999; Olina, et al., 2008). Atualmente, a terapia termal não reúne um consenso unâ-

nime: a heterogeneidade das águas termais, tanto do ponto de vista físico como químico, a

diversidade das metodologias nas aplicações terapêuticas e as suas sequências temporais,

tornam difícil de avaliar e sobretudo valorizar os resultados obtidos (Olina, et al., 2008).

Contudo, a fidelização dos aquistas por longos períodos é uma evidência que testemunha a

eficácia da terapia termal, não só na reabilitação e na prevenção de diversas patologias,

mas também na promoção do bem-estar (Olina, et al., 2008).

Portugal é um dos países mais ricos em estâncias termais (Picoto, 1996). Do ponto de vista

químico, o nosso país possui toda a gama de águas minerais naturais, contudo as águas

sulfúreas são as que apresentam maior prevalência (Almeida e Calado, 1993; Lourenço e

Cruz, 2006; Cruz, 2007). A principal característica destas águas é a presença de formas

reduzidas de enxofre, nomeadamente hidrogenosulfureto (HS-) e sulfato (SO4

2-) (Carvalho,

et al., 1990).Quanto à composição química, caracterizam-se por valores de pH entre 7,4 e

9,5. O sódio é o catião dominante, o anião mais representativo é o bicarbonato, seguindo-

se-lhe o cloreto, ou mesmo o fluoreto. (Carvalho, et al., 1990; Almeida e Calado, 1993;

Calado, 1995; Lourenço e Cruz, 2006).

Pelas suas propriedades, estas águas são usadas principalmente no tratamento de problemas

respiratórios, doenças reumatológicas, dermatológicas e afeções do aparelho músculo-

esquelético (Faílde e Mosqueira, 2006; Eyzaquirre, 2008; Bellometti, 2009).

No que concerne às águas sulfúreas, vários estudos têm realçado a ação mucolítica

(Passali, et al., 2007; Staffieri e Abramo 2007; Olina, et al., 2008) e cicatrizante das águas

termais a nível das mucosas (Staffieri, et al., 2008; Ottaviano, et al., 2010). Outros há, que

fazem referência ao seu efeito antioxidante (Tamás, et al., 2007; Costantino, et al., 2009) e

propriedades anti-inflamatórias (Messina, et al., 1999; Salami, et al., 2010). Alguns autores

Introdução

3

referem também a sua atividade anti-histamínica (Ottaviano, et al., 2010) e bactericida

(Passali, et al., 2007; Olina, et al., 2008; Salami, et al., 2010).

Atualmente, a eficácia terapêutica das águas termais é, na generalidade, reconhecida. No

entanto, os mecanismos da sua ação permanecem em grande parte desconhecidos, assim

como a sua ação bactericida in vitro, facto que motivou o interesse do presente estudo.

Uma motivação adicional é o facto da ação bactericida destas águas poder vir a revelar-se

importante no meio hospitalar, podendo ser usadas para lavar feridas, ajudando assim no

processo de cicatrização. Desta forma poderão ser um incremento importante no controlo

das infeções associadas aos cuidados de saúde (IACS).

Segundo o Programa Nacional de Controlo de Infeção (PNCI), as IACS são contraídas

quando são prestados cuidados de saúde e/ou durante uma estadia num estabelecimento de

saúde (por exemplo, quando o doente recebe cuidados ambulatórios, cuidados hospitalares

ou cuidados prolongados). Quando ocorrem num hospital, estas infeções são denominadas

"infeções hospitalares" ou "infeções nosocomiais". A mesma fonte revela no relatório de

inquérito de prevalência de infeção em 2010, que 14.3% das IACS têm origem em feridas

cirúrgicas e 10.1% localizam-se na pele e tecidos moles (PNCI, 2010).

O uso da terapêutica termal, nestes e noutros casos, poderá revelar-se menos agressiva e

menos dispendiosa, por comparação aos métodos de terapêutica química (Messina, et al.,

1999).

Introdução

4

1.1 - Águas Minerais Naturais

1.1.1 – Evolução Histórica

A atividade termal, desde há algum tempo reconhecida pela Organização Mundial de Saú-

de (OMS), constitui um importante procedimento terapêutico, que tem sido aplicado desde

a antiguidade (Gonzalez e Mosqueira, 2009). O seu poder curativo foi inicialmente atribuí-

do a causas mágicas ou milagrosas (Via, 1997).

Egípcios, Caldeus e Índios já utilizavam as águas termais muitos séculos antes de Cristo

para fins terapêuticos e rituais religiosos (Gonzalez e Mosqueira, 2009).

As primeiras termas apareceram na Grécia. Hipócrates (460-377 a.C.) utilizava a água

como bebida para baixar a febre e considerava-a como remédio equilibrador e restaurador

nos distúrbios humorais. Foi sob o domínio Romano que as termas atingiram o seu auge. O

seu interesse pelo desenvolvimento do termalismo residia sobretudo na preparação física

antes das campanhas militares e posteriormente na reabilitação e recuperação das lesões

sofridas nos combates. As estâncias termais eram também locais de convívio (Via, 1997).

Com a queda do Império Romano e a expansão do Cristianismo a prática termal sofreu um

decréscimo, acabando mesmo por se extinguir na Idade Média. A Igreja desaprovava a

utilização da água, tal como os Romanos a entendiam, e passou mesmo a considerar a sua

utilização como um conjunto de práticas imorais de alguma luxúria (Via, 1997).

Em Portugal, durante o período Romano, foram construídos grandes edifícios, de que são

exemplo as ruínas de Conímbriga, Troia e Ossonoba-Milreus no Algarve (Calado, 1995;

Picoto, 1996; Rodrigues, et al., 2010).

Durante o século XV, período do Renascimento, consolida-se entre as elites o hábito de

frequentar as estâncias termais mais notáveis, a fim de comparar os diferentes tratamentos,

de conhecer os hábitos e admirar outras culturas (Barata e Filipe, 1999).

Introdução

5

É no século XIX que se dá o grande ressurgimento das termas, tornando-se famosas as

estâncias de Vichy, Wiesbaden e Bath. Nesta altura surgem os Palace Hotel, unidades hote-

leiras muito complexas, com quartos para os senhores no edifício central e para os seus

criados à volta da unidade hoteleira. Em Portugal destacam-se as estâncias de Vidago,

Cúria e Pedras Salgadas (Barata e Filipe, 1999).

Atualmente, as estâncias termais voltam a ser o centro de atenção no cuidado do corpo,

devido ao contexto de mudança social e uma nova mentalidade favorável à medicina natu-

ral, verificada sobretudo a partir dos anos 90. As novas tendências são complexos hotelei-

ros designados por Resort Spa, cuja procura assenta não só na reabilitação de alguma pato-

logia, bem como em beneficiar dos efeitos da água, desfrutar da natureza ou simplesmente

descansar (Barata e Filipe, 1999).

1.1.2 – Origem

A maioria das águas termais tem a sua origem na precipitação atmosférica que, infiltrando-

se em profundidade, vão ganhando características físico-químicas particulares, em função

da composição mineralógica das formações geológicas por onde circula (A.P.R.H.).

Quando a água precipitada alcança a superfície terrestre, uma parte infiltra-se nos solos e

nas rochas, através dos seus poros, fissuras e fraturas – escoamento subterrâneo, tal como

evidencia a Figura 1.1. Pode atingir uma circulação profunda, armazenando-se nos interstí-

cios das formações geológicas. Para ser considerada água subterrânea, a camada de solo ou

rocha deve estar saturada (Arango, 2001; Midães e Fernandes, 2001). No interior da crosta

terrestre, devido aos elevados valores de temperatura e pressão, a água pode emergir à

superfície através das fraturas e fissuras das rochas.

A água subterrânea designa-se por água meteórica quando tem origem no processo de infil-

tração. O seu caudal é variável com as estações do ano e a pluviosidade, a sua concentra-

ção é inversamente proporcional ao caudal e a temperatura, normalmente inferior a 30 ºC

(Arango, 2001). Podem ainda ser classificadas em águas endógenas ou juvenis. Estas águas

não fazem parte do ciclo hidrológico. São águas de origem magmática relacionadas com

Introdução

6

fenómenos vulcânicos, provenientes do interior da crosta terrestre. Caracterizam-se por

apresentarem um caudal, composição química e temperatura constantes, esta última de

valores elevados (Arango, 2001).

A maioria das águas minerais tem uma origem mista, embora com caráter meteórico mais

elevado (Arango, 2001).

Figura 1.1 – Esquema de um sistema de águas termais (Adaptado de (A.P.R.H.).

1.1.3 – Caracterização

O termalismo é uma atividade com longa tradição em Portugal (Picoto, 1996). Esta deve-se

fundamentalmente à grande diversidade do quimismo das águas minerais naturais portu-

guesas. Tal quimismo é resultante das características geológicas e estruturais do território

Português, quer do ponto de vista litológico, quer do ponto de vista tectónico (Cruz, et al.,

1996; Lourenço e Cruz, 2006; Rodrigues, et al., 2010).

Portugal está dividido em quatro grandes unidades hidrogeológicas: o Maciço Antigo ou

Maciço Hespérico, a Orla Meso-Cenosóicas Ocidental, a Orla Meso-Cenosóicas Meridio-

nal e a Bacia Terciária do Tejo – Sado (Calado, 1995).

Introdução

7

Tendo em conta esta divisão geológica, verifica-se que as nascentes termais se localizam

principalmente na zona norte e centro do Maciço Hespérico, designadamente na Zona Cen-

tro – Ibérica, estando a sua distribuição intimamente relacionada com grandes acidentes

tectónicos, como é o caso do acidente Penacova – Régua – Verin (Cruz et al., 1996).

As nascentes localizadas nas Orlas Meso-Cenosóicas Ocidental e Meridional estão estrei-

tamente relacionadas com falhas ativas ou diapiros salinos, verificando-se na maioria dos

casos, a concorrência de ambos (Almeida e Calado, 1993; Cruz, et al., 1996; Rodrigues, et

al., 2010).

A grande variabilidade geológica de Portugal continental permite que as suas águas termais

apresentem uma elevada diversidade em termos de composição físico-química (Midães e

Fernandes, 2001). A sua composição química e temperatura de emergência dependem do

percurso das partículas de água até chegarem à superfície, sendo uma consequência em

especial do tipo de rocha por onde passam, da profundidade e temperatura atingida no inte-

rior dos maciços rochosos (ERTCP, 2011).

As águas termais raramente têm apenas um elemento característico, na maioria dos casos

têm um conjunto de aniões e catiões que as caracterizam. Quando existe predominância de

um anião e de um catião é natural que se unam e constituam as características químicas

principais dessa água (Simões, 1993).

1.1.3.1 – Características Físico-Químicas

1.1.3.1.1 - Temperatura

A temperatura é um parâmetro físico que pode dar indicações muito importantes sobre a

origem da água subterrânea. Desempenha também um papel marcante no desenvolvimento

de fenómenos como a solubilidade de gases e sais (A.P.R.H.; Gonzalez e Mosqueira,

2009). Na Tabela 1.1 pode observar-se a classificação das águas minerais de acordo com

este parâmetro.

Introdução

8

Tabela 1.1 – Classificação das águas minerais de acordo com a temperatura (Adaptado de Diegues e Martins

2010).

Designação Temperatura de Emergência /° C

Hipotermal ou água fria < 25

Mesotermal 25 a 35

Termal 35 a 40

Hipertermal > 40

1.1.3.1.2 - pH

Este parâmetro é de extrema importância nos processos de interação água - rocha e nos

equilíbrios químicos das soluções (Diegues e Martins, 2010). No que concerne ao pH, as

águas termais são consideradas ácidas quando o pH é inferior a 7, neutras quando o pH é

igual a 7 e alcalinas se o pH for superior a 7.

1.1.3.1.3 - Mineralização Total

A mineralização total é a quantidade de sais dissolvidos numa água (Diegues e Martins,

2010). A Tabela 1.2 mostra a classificação das águas minerais em relação a este parâmetro.

Tabela 1.2 – Classificação das águas minerais em relação à mineralização total (Adaptado de Diegues e

Martins 2010).

Designação Mineralização Total /mg L-1

Hipossalina < 200

Fracamente mineralizada 200 a 1000

Mesossalina 1000 a 2000

Hipersalina > 2000

1.1.3.1.4 - Resíduo Seco

A Tabela 1.3 mostra a classificação da água mineral segundo o resíduo seco, isto é, o total

de sais resultante da evaporação de 1L de água a 180ºC.

Introdução

9

Tabela 1.3 – Classificação das águas minerais em relação ao resíduo seco (Adaptado de Antunes 2008).

Designação Resíduo Seco/mg L-1

Água Doce < 2000

Água Salobra 2000 a 5000

Água Salgada 5000 a 40000

Salmoura > 40000

1.1.3.1.5 - Dureza Total

A dureza total corresponde à quantidade de carbonato de cálcio equivalente ao teor em

cálcio, magnésio e, caso exista, ferro e alumínio (Antunes, 2008). Na Tabela 1.4 pode ser

observada a classificação das águas minerais de acordo com este parâmetro.

Tabela 1.4 – Classificação das águas minerais segundo a dureza total (Adaptado de Antunes 2008).

Designação Dureza/ppm CaCO3

Branda < 50

Ligeiramente Dura 50 a 100

Dura 100 a 200

Muito Dura > 200

1.1-3.1.6 - Potencial Redox

A pH 7 consideram-se redutoras as águas com potencial redox inferior a 0.4v e oxidantes

as que têm potencial redox superior a 0.4v. Para outros valores de pH deve-se ter em conta

as correções correspondentes, sendo preferível usar o valor de rH2 que é definido pela

equação:

rH2 = 2 (E/0.059) + pH a 25ºC, em que E é o potencial correspondente à equação:

H+ + e

- ↔ ½ H2

Valores de rH2 inferiores a 27.6 correspondem a águas redutoras e valores superiores a

26.7 a águas oxidantes (Diegues e Martins, 2010).

Introdução

10

1.1.3.2 – Classificação de Acordo Com a Composição Química

Baseada na composição química da classificação do Instituto de Hidrologia de Lisboa,

Simões, propõe uma classificação das águas minerais Portuguesas (Tabela 1.5) (Simões,

1993; Carvalho, et al., 2007).

Tabela 1.5 – Classificação das águas minerais Portuguesas e sua principal característica (Adaptado de

Simões 1993)

Classificação da Água Principal Característica

Hipossalina Mineralização total é inferior a 200 mg/l

Sulfúrea Contém formas reduzidas de enxofre

Gasocarbónica CO2 livre é superior a 500 mg/l

Bicarbonatada O ião dominante é o HCO3-

Cloretada O ião dominante é o cloreto

Sulfatada O ião dominante é o sulfato

Figura 1.2 – Representação das grandes unidades geológicas estruturais e das águas termais (incluindo res-

petivo quimismo) de Portugal Continental. Fonte: (Lourenço e Cruz, 1998).

Introdução

11

No que se refere à distribuição geográfica das águas termais verifica-se, tal como mostra a

Figura 1.2, que no Maciço Hespérico predominam as águas sulfúreas. Estas águas possuem

geralmente valores de pH superiores a 8 e podem ser bicarbonatadas ou cloretadas. Na

Orla Meso - Cenozóica Ocidental, de um modo geral, as águas termais são essencialmente

cloretadas ou bicarbonatadas sódicas, podendo também apresentar águas sulfatadas cálci-

cas. O pH destas águas já se encontra próximo da neutralidade. As emergências termais

que se localizam na Orla Meso – Cenozóica Meridional apresentam geralmente águas

bicarbonatadas, sódicas ou cálcicas (Calado, 1995; Lourenço e Cruz, 2005).

1.1.4 – Aplicações Terapêuticas

Uma das principais características das águas termais é o facto de apresentarem proprieda-

des terapêuticas. O termalismo, isto é, o uso da água mineral natural e outros meios com-

plementares para fins de prevenção, terapêutica, reabilitação ou bem-estar (Decreto Lei

136/2004), pode classificar-se em ―clássico‖ ou de ―bem-estar‖. O termalismo ―clássico‖

engloba a realização de terapias específicas para determinadas patologias. Requer, em

geral, uma estadia de duas a três semanas na estância termal. O termalismo de ―bem-estar‖

consiste em programas mais curtos, de lazer, relaxamento, repouso ou de cuidados estéti-

cos (Rodríguez, et al., 2000).

Os diferentes tipos de águas minerais naturais associadas às técnicas de hidrologia médica

disponíveis em cada balneário condicionam o conjunto de indicações terapêuticas, ou seja,

os tipos de patologia para cuja terapia são mais indicadas. Além disso, a limpeza do orga-

nismo através das águas minerais naturais leva por sua vez a uma limpeza dos poros e das

mucosas, bem como a libertação de toxinas, deixando a pele limpa e mais firme (ERTCP,

2011).

Um pouco por todo o país existem águas termais benéficas para a saúde, que são utilizadas

no tratamento de problemas respiratórios, doenças reumáticas e afeções do aparelho mús-

culo - esquelético, problemas digestivos, afeções do aparelho circulatório, doenças da pele,

doenças endócrinas, entre outras. A forma como atuam depende dos sais existentes nas

águas (Faílde e Mosqueira, 2006; Eyzaquirre, 2008).

Introdução

12

1.1.5 – Ação Bactericida da Água Termal

Atualmente, a eficácia terapêutica das águas termais é, na generalidade, reconhecida. No

entanto, os mecanismos da sua ação permanecem em grande parte desconhecidos, assim

como a sua capacidade bactericida, in vitro.

Ghersetich et al. (2001), Matz et al. (2003) e Faílde e Mosqueira (2006) referem, em estu-

dos dermatológicos, que a água termal de natureza sulfúrea apresenta propriedades bacteri-

cidas. Estes efeitos têm sido atribuídos ao ácido pentatiónico (H2S5O6) produzido na pele

através da interação do enxofre com os radicais de oxigénio presentes nas camadas profun-

das da epiderme.

Ottaviano et al. (2010) revelaram o sucesso da terapêutica termal em processos infeciosos

protagonizados por estirpes de S. aureus, justificando a ação bactericida destas águas (sul-

fúreas) devido à presença de formas reduzidas de enxofre.

Outros autores citam a ação bactericida das águas sulfúreas devido à toxicidade das formas

reduzidas de enxofre nas bactérias (Albertini, et al., 2007; Passali, et al., 2007; Olina, et

al., 2008; Staffieri, et al., 2008; Salami, et al., 2010). Contudo, nenhum estudo refere de

que forma estes componentes afetam as bactérias.

Inoue et al. (1999) e Akiyama et al. (2000) descreveram a atividade bactericida do ião

manganésio em águas termais com pH ácido.

Lemire et al. (2010) evidenciaram a ação bactericida do alumínio e Dankovich e Gray

(2011) estudaram a ação bactericida da prata.

Introdução

13

1.2– Termas do Cró

As termas do Cró estão localizadas nas Freguesias da Rapoula do Coa e do Seixo do Coa,

Concelho do Sabugal, Distrito da Guarda. Situam-se na estrada nacional n.º 324 que liga

Cerdeira do Coa ao Sabugal, a 15 km da sede do concelho. São atravessadas pelo ribeiro

do Cró também conhecido por ribeira do Boi (sendo este um dos afluentes da margem

esquerda do rio Coa) que efetua a separação entre as duas freguesias (Alexandre, 2003;

Manso e Manso, 2008).

1.2.3 – Enquadramento Hidrogeográfico

As termas do Cró situam-se numa área topograficamente bem marcada, em região de natu-

reza essencialmente granítica, com afloramentos dispersos e ocasionais de xistos alterados.

Na zona das emergências não ocorrem afloramentos de xisto, sendo de salientar que os

granitos do Cró são porfiróides, de grão médio a grosseiro, calco-alcalinos, leucocratas e

com grandes cristais de feldspato. As emergências ocorrem em zonas em que a percolação

está intimamente relacionada com a fracturação superficial e com o grau de alteração das

formações graníticas, nomeadamente com a sua colmatação com materiais resultantes da

meteorização (INETI).

A percolação das águas das emergências do Cró está associada a fenómenos tectónicos de

grande envergadura. A área de infiltração de águas provenientes de escorrência superficial

que servem de alimentação ao aquífero corresponde à grande faixa fraturada de direção

NW-SE que passa junto à cidade da Guarda e a cerca de 8 km para oeste do Cró, bem

como às zonas de estruturas circulares envolventes ao abatimento onde se localizam as

emergências (INETI).

Geograficamente o local situa-se na vertente norte da cordilheira Luso-Castelhana formada

pelas serras de Guadarrama, Gredos e Gata que entra em Portugal no sentido NE-SW,

pelas serras da Estrela e da Lousã. Geologicamente está localizada no Maciço Hespérico,

na zona Centro - Ibérica (INETI).

Introdução

14

1.2.4 - Programa de Controlo de Qualidade

Atualmente é inquestionável a necessidade de monitorizar a qualidade das águas minerais

naturais na captação. Mesmo as águas que possuem um longo historial analítico não estão

imunes à variabilidade dos novos fatores ambientais que podem interferir no processo

hidrogeológico (Calado, 2005).

No complexo termal do Cró, anualmente, a Direção Geral de Geologia e Energia (orga-

nismo tutelar) envia o programa de controlo de qualidade da água mineral natural a ser

efetuado na captação (Anexo 1 e 2). Este boletim de análise química contempla análises

físico-químicas e bacteriológicas.

As análises físico-químicas são realizadas três vezes ao longo do ano (janeiro, julho e

outubro), fazendo a cobertura de todo o ano Hidrológico e do regime de funcionamento do

furo. Os parâmetros físico-químicos devem ser verificados para avaliar a evolução da qua-

lidade da água através da comparação com uma análise de referência, a presença de vestí-

gios de produtos indesejáveis, tais como produtos de limpeza ou desinfeção (Nascimento,

1999).

As análises bacteriológicas são efetuadas semanalmente durante a época termal (maio a

novembro), e uma vez por mês, fora da época termal. Regem-se pela Portaria 1220/2000

de 29 de dezembro, que define as condições a que as águas minerais naturais (e águas de

nascente) devem obedecer para poderem ser consideradas bacteriologicamente próprias. Os

parâmetros analisados nas águas termais incluem E. coli e outros coliformes, Enterococ-

cus, clostrídios sulfito redutores, P. aeruginosa e Legionella pneumophila (Portaria nº

1220/00). A pesquisa de Legionella pneumophila é feita duas vezes por ano, uma no início

da época termal e a outra no meio da referida época.

Introdução

15

1.2.5 – Caracterização da Água Termal e Indicações Terapêuticas

A água termal do Cró foi alvo de estudos físico-químicos pela primeira vez em 1891

(Alexandre, 2003). Atualmente insere-se no grupo das águas minerais sulfúreas alcalinas e

caracteriza-se por ser uma água bicarbonatada sódica, carbonatada, fluoretada e sulfidrata-

da (INETI).

A nível organolético, tem uma aparência límpida, é incolor e com cheiro a sulfídrico

(―ovos podres‖) (Anexo 1).

Sob o ponto de vista iónico, o hidrogenocarbonato (HCO3-) é o anião dominante, embora o

cloreto (Cl-) e fluoreto (F

-) também se encontrem presentes em quantidades consideráveis.

No que concerne ao catião, o sódio (Na+) é o que predomina (Anexo 1).

Quanto às suas características físico-químicas, de referir a presença de formas reduzidas de

enxofre, nomeadamente hidrogenosulfureto (HS-) e sulfato (SO4

2-) (Anexo 1).

É uma água fracamente mineralizada, já que possui uma mineralização total de cerca de

379 mg/l. No que concerne à temperatura, é uma água hipotermal, já que a temperatura de

emergência aproxima-se dos 20.9 ºC. Apresenta uma condutividade de aproximadamente

426 μS/cm-1

e um pH, de cerca de 8.21 (Anexo 1).

Pelas suas propriedades, estas águas reconhecidas ao abrigo do Despacho nº 8047/2008, de

18 de março, são indicadas para o tratamento de infeções respiratórias (rinite, sinusite,

bronquite, faringite, asma brônquica, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC)), de

problemas reumáticos e músculo-esqueléticos (osteoartrose, reumatismos inflamatórios e

abarticulares, artropatias traumáticas e pós-operatório ortopédico). Muitos aquistas procu-

ram-nas também para doenças de pele e patologias dermatológicas (psoríase, eczema, úlce-

ras varicosas e acne) (INETI; Mata, 1963).

Introdução

16

1.3 – Crescimento Bacteriano

O crescimento bacteriano é definido como o aumento coordenado de todos os constituintes

celulares, podendo estar associado ao aumento do tamanho de uma célula ou do número de

células, em consequência da multiplicação celular, ou a ambos (Côrte-Real, et al., 2010).

Este crescimento é condicionado por vários fatores físicos e químicos (Hogg, 2005;

Tortora, et al., 2010).

Quanto aos fatores físicos, a temperatura é um fator que influência o crescimento micro-

biano. Cada bactéria apresenta uma temperatura ótima de crescimento, em torno dessa

temperatura observa-se um intervalo dentro do qual o desenvolvimento também ocorre,

sem, no entanto, atingir o seu máximo. Quando o limite superior é excedido, ocorre a des-

naturação das enzimas, dos transportadores de membrana e outras proteínas. Temperaturas

muito elevadas provocam a rotura das membranas celulares uma vez que há a alteração da

dupla camada lipídica por ação do calor. As temperaturas inferiores à ótima levam a uma

desaceleração das reações metabólicas, com diminuição da velocidade da multiplicação

celular, inviabilizando a sobrevivência celular (Hogg, 2005; Tortora, et al., 2010).

Atendendo à temperatura de crescimento, é possível distinguir três grupos fisiológicos de

bactérias: as psicrófilas que têm uma temperatura ótima de crescimento entre os 12 e 17º

C; as mesófilas em que a temperatura ótima de crescimento varia entre os 28 e 37ºC e as

termófilas com uma temperatura ótima de crescimento que varia entre os 57 e 87ºC

(Tortora, et al., 2010).

Embora existam bactérias que necessitam de altas temperaturas para o seu crescimento, a

maioria encontra-se no grupo das mesófilas, principalmente as de maior interesse clínico

(Tortora, et al., 2010) .

O pH constitui outro dos fatores físicos que influencia o crescimento microbiano. Cada

espécie cresce numa gama definida de pH e tem um pH ótimo para o seu desenvolvimento.

Os microrganismos acidófilos têm o seu pH ótimo de crescimento entre 0.1 e 5.4. Os neu-

trófilos entre 5.4 a 8.5 e os alcalófilos entre 8.5 e 11.5 (Hogg, 2005; Tortora, et al., 2010).

Introdução

17

Devido à impermeabilidade da membrana citoplasmática a protões, a maioria das espécies

bacterianas cresce em meios cujo valor de pH se encontra próximo da neutralidade, entre

6.5 e 7.5. Variações drásticas no pH podem causar o rompimento da membrana celular,

inibir a atividade enzimática ou os transportadores membranares de proteínas (Leboffe e

Pierce, 2008).

O oxigénio é também um fator físico que influencia o crescimento bacteriano. Pode ser

indispensável, letal ou inócuo para as bactérias, o que permite classificá-las em aeróbias

estritas (crescem apenas na presença de oxigénio), microaerófilas (requerem oxigénio livre

para o seu crescimento mas numa concentração muito baixa), facultativas (apresentam

mecanismos que as capacitam a utilizar o oxigénio, quando disponível, mas podem desen-

volver-se também na sua ausência) e anaeróbias estritas (não necessitam de oxigénio para

o seu crescimento, sendo tóxico para este tipo de microrganismos) (Hogg, 2005; Tortora, et

al., 2010).

A água é um componente importante e sempre presente em altas quantidades. É essencial a

qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. Todas as células reque-

rem água no meio para que os nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a

membrana celular (Zimbro, et al., 2009; Tortora, et al., 2010).

Os nutrientes podem ser divididos em duas classes: macronutrientes e micronutrientes

(Tabela 1.6 e 1.7). Ambos os tipos são imprescindíveis, mas os primeiros são requeridos

em grandes quantidades por serem os principais constituintes dos compostos orgânicos

celulares (Kim e Gadd, 2008; Zimbro, et al., 2009; Singh e Kapoor, 2010).

Introdução

18

Tabela 1.6 – Macronutrientes na natureza e nos meios de cultura, sua função celular (Adaptado de(Kim e

Gadd, 2008; Madigan, et al., 2009).

Macronutrientes Forma do

nutriente presen-

te na natureza

Forma química exis-

tente nos meios de

cultura

Função Celular

Carbono

Componentes

orgânicos, CO,

CO2

Glicose, malato, aceta-

to, piruvato, misturas

complexas contendo

estes e outros compos-

tos (ex. Extrato de leve-

dura, peptonas, extratos

de carne).

Principal elemento no crescimen-

to bacteriano. Essencial na síntese

de açúcares, lípidos, proteínas e

ácidos nucléicos.

Azoto

Componentes

orgânicos azota-

dos, NH4+, NO3

-,

N2

Inorgânico: NH4Cl,

(NH4)2SO4, KNO3,

N2.Orgânico: ex. ami-

noácidos, bases azota-

das dos nucleótidos.

As bactérias usam o azoto princi-

palmente para formar o grupo

amina dos aminoácidos.

Hidrogénio

Componentes

orgânicos, H2O,

H2

H2O, compostos orgâ-

nicos.

Elemento presente em açúcares,

lípidos, proteínas e ácidos nucléi-

cos

Enxofre

HS-, SO4

2-, S0,

S2O32-

compostos

orgânicos sulfu-

rados

Na2SO4, Na2S2O3,

Na2S, cisteína, ou

outros compostos orgâ-

nicos sulfurados.

Faz parte de aminoácidos (cisteí-

na e metionina), de vitaminas e

grupos prostéticos de várias pro-

teínas importantes em reações de

oxidação-redução.

Fósforo HPO42-

KH2PO4, Na2HPO4 Necessário para a síntese de áci-

dos nucléicos e fosfolipídeos.

Os elementos manganésio, zinco, cobre, cobalto, molibdénio, selénio e outros são também

necessários ao desenvolvimento microbiano, mas em quantidades variáveis, dependendo

do elemento e do microrganismo considerado (Kim e Gadd, 2008; Murray, et al., 2009;

Zimbro, et al., 2009). A Tabela 1.7 mostra os principais micronutrientes microbianos e a

sua função celular.

Uma vez que a quantidade necessária destes nutrientes é muito reduzida, a sua adição aos

meios de cultura torna-se frequentemente desnecessária, dado que estes micronutrientes

estão associados à água e a outros componentes utilizados na sua preparação (Madigan, et

al., 2009).

Introdução

19

Tabela 1.7 – Micronutrientes microbianos, forma química usada pelas bactérias e sua função celular (Adap-

tado de (Murray, et al., 2009).

Micronutriente Forma química usada

pelas bactérias

Função Celular

Cobalto (Co) Co2+

Necessário na formação de Vitamina B12;

Cobre (Cu) Cu2+

Importante nas enzimas respiratórias

(citocromo c oxidase); presente em algu-

mas superóxido dismutases

Manganésio (Mn) Mn2+

Ativador de muitas enzimas; presente em

certas superóxido dismutases

Molibdénio (Mo) MoO42-

Presente em várias enzimas que contêm

flavina; presente no nitrato redutase, sulfi-

to oxidases e desidrogenases fórmicas

Níquel (Ni) Ni+ Presente na maior parte das hidrogenases;

presente na urease

Selénio (Se) SeO32-

Presente no aminoácido selenocisteina;

presente nalgumas hidrogenases

Tungsténio (W) WO42-

Presente em algumas desidrogenases fór-

micas e oxotransferases de hipertermófilas

Zinco (Zn) Zn2+

Tem um papel estrutural em várias enzi-

mas (DNA e RNA polimerases) e outras

proteínas de ligação ao DNA

Entre as bactérias heterotróficas há uma imensa variedade de exigências nutritivas. Algu-

mas são capazes de crescer em meio muito simples, sintetizando todos os componentes do

citoplasma: proteínas, polissacarídeos, ácidos nucléicos e coenzimas. Outras são incapazes

de sintetizar determinados compostos orgânicos que entram na composição das células ou

dos precursores dos constituintes celulares. Essas substâncias designam-se por fatores de

crescimento, e incluem as vitaminas, os aminoácidos, as purinas e as pirimidinas (Brooks,

et al., 2010; Côrte-Real, et al., 2010).

Introdução

20

1.4 – Meios de Cultura

O estudo dos microrganismos está muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar,

isolar e manter microrganismos viáveis no laboratório, sob a forma de culturas puras,

segundo os procedimentos internos do laboratório e sujeitos às normas da Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI) (Krisher, et al., 2004).

Os meios de cultura possibilitam a multiplicação de microrganismos em laboratório sob

condições controladas, o que permite o seu isolamento e caracterização morfológica, fisio-

lógica e bioquímica. As exigências metabólicas das bactérias são muito diversificadas, pelo

que os meios de cultura utilizados devem corresponder às exigências específicas do tipo de

microrganismo que se quer cultivar.

Em relação à composição química os meios podem ser sintéticos ou complexos. Nos meios

sintéticos, a composição química é conhecida. Contêm, em geral, sais inorgânicos que

incluem fontes de carbono e de azoto (Zimbro, et al., 2009). Os meios complexos contêm

todos os ingredientes necessários ao crescimento do microrganismo, são compostos por

misturas de proteínas e outros extratos de origem biológica, em que as quantidades precisas

de cada aminoácido ou glícido, por exemplo, não são conhecidas. Peptonas e triptonas,

hidrolisados enzimáticos de proteína animal e de levedura, respetivamente, são dois fre-

quentes constituintes dos meios complexos. Os meios de cultura quimicamente complexos

permitem a multiplicação da maioria dos microrganismos heterotróficos (Zimbro, et al.,

2009).

No que diz respeito ao seu estado físico, os meios de cultura podem ser líquidos, quando

são uma solução aquosa de nutrientes, ou sólidos, quando à solução aquosa é adicionado

um polissacarídeo extraído das algas, o agar. Os meios sólidos permitem não só a multipli-

cação, mas também o isolamento de bactérias de forma a obter culturas puras (Willey, et

al., 2008; Pelczar, et al., 2010).

Quanto ao tipo de meios de cultura, estes podem ser seletivos se contêm na sua composi-

ção substâncias que inibem o crescimento de um determinado grupo de bactérias, mas

Introdução

21

permitem o desenvolvimento de outras. São denominados por diferenciais, os meios de

cultura adicionados de substâncias e indicadores, que permitem distinguir entre as bacté-

rias, nele semeadas, as que utilizam ou não essas substâncias, ajudando na identificação

das mesmas. Os meios de enriquecimento são aqueles que possuem suplementos adicio-

nais, com o objetivo de satisfazer os requisitos nutritivos das bactérias mais exigentes

(Hogg, 2005; Zimbro, et al., 2009; Singh e Kapoor, 2010).

1.5 - Controlo do Crescimento Bacteriano

O controlo do crescimento bacteriano pode ser efetuado quer através da inibição do cres-

cimento, quer da indução da morte das bactérias viáveis. Os agentes antibacterianos que

destroem ou tornam as bactérias inviáveis são designados bactericidas. Por outro lado, os

agentes que inibem o crescimento bacteriano são bacteriostáticos (Pelczar, et al., 2010).

O controlo do crescimento bacteriano pode ser feito por descontaminação, desinfeção e

esterilização, podendo ser usados métodos físicos ou químicos. Nos métodos físicos, de

referir o calor (húmido e seco), a filtração e as radiações; nos químicos incluem-se sobre-

tudo os antissépticos, os desinfetantes, os antibióticos e os aditivos (Madigan, et al., 2009;

Brooks, et al., 2010). Estes métodos são essenciais no tratamento e prevenção de infeções,

na prevenção da contaminação de culturas bacterianas puras e nos processos de produção

das Indústrias Farmacêutica e Alimentar (Côrte-Real, et al., 2010).

1.5.1 – Mecanismos de Ação dos Agentes Antibacterianos

Os principais alvos de ação dos agentes antibacterianos são a parede celular, a membrana

citoplasmática e os processos de biossíntese das proteínas e dos ácidos nucleicos.

1.5.1.1. - Alteração da Permeabilidade da Membrana

A membrana plasmática da bactéria, localizada internamente à parede celular, é o alvo de

muitos agentes antibacterianos. Esta membrana regula ativamente a passagem de nutrientes

para as células e a eliminação de resíduos provenientes da célula. A alteração dos lípidos

Introdução

22

ou proteínas da membrana plasmática por agentes antibacterianos tem como consequência

a passagem do conteúdo celular para dentro do meio circundante e interfere com o cresci-

mento da célula (Madigan, et al., 2009; Tortora, et al., 2010).

1.5.1.2. - Alteração das Proteínas e Ácidos Nucleicos

As bactérias são muitas vezes vistas como "pequenos sacos de enzimas." As enzimas são

proteínas vitais nas atividades celulares. A forma tridimensional das proteínas é mantida

por ligações químicas. Algumas dessas ligações são ligações de hidrogénio que por ação

do calor ou de agentes químicos podem ser quebradas, resultando na desnaturação da pro-

teína.

Os ácidos nucleicos, DNA e RNA, são os portadores da informação genética da célula. A

alteração nos ácidos nucleicos pelo calor, radiação ou produtos químicos é frequentemente

letal para as células: deixa de haver replicação celular e funções metabólicas normais,

como a síntese de enzimas (Madigan, et al., 2009; Tortora, et al., 2010).

1.5.2 – Quantificação da Atividade Antibacteriana

A atividade antibacteriana de um composto pode ser quantificada com base na determina-

ção da concentração mínima do composto capaz de inibir o crescimento de uma dada bac-

téria, um valor denominado CMI (Concentração Mínima Inibitória) (Hindler e Jorgensen,

2007). Este valor pode ser determinado através do método das diluições sucessivas, do

método da difusão em agar ou ainda através do método de E-test® (bioMérieux

®)

(Vandepitte, et al., 2003).

No método das diluições, a avaliação do crescimento bacteriano é feita através da turvação

da cultura. A turvação indica que o crescimento bacteriano não foi inibido pela concentra-

ção do antibacteriano existente naquele meio.

O método da difusão em agar foi desenvolvido por William Kirby e A. W. Bauer (1966), e

mais tarde deu lugar ao método de Kirby-Bauer. Este método é atualmente recomendado

Introdução

23

pela Food e Drug Administration (FDA) e estandardizado pela CLSI (Barry e Thornsberry,

1991). Este método baseia-se no princípio de que se um disco impregnado com um anti-

bacteriano for colocado numa placa de agar previamente inoculada com a bactéria em

estudo, ocorre um fenómeno de difusão centrífuga/radial do antibacteriano através do agar,

produzindo-se um gradiente de concentração do mesmo. Desta forma, o antibacteriano está

presente em grandes concentrações perto do disco, e à medida que a distância ao centro do

disco aumenta a concentração do antibacteriano diminui. Este fenómeno é traduzido por

um halo claro, transparente à volta do disco quando há inibição do crescimento bacteriano

pelo antibacteriano, o que significa que quanto maior for o halo de inibição maior é a sen-

sibilidade da bactéria ao antibacteriano (Barry e Thornsberry, 1991; Vandepitte, et al.,

2003).

Após a medição dos halos, é feita a sua interpretação, de acordo com os critérios estabele-

cidos pelo CLSI, específicos para a bactéria testada. Desta forma, as amostras bacterianas

são categorizadas em resistente (R), intermédio (I) e sensível (S). De acordo com as nor-

mas do CLSI uma bactéria in vitro é (S) a determinado antibacteriano quando o diâmetro

do halo de inibição é igual ou superior ao valor estipulado pelo CLSI, é (R) quando o diâ-

metro do halo de inibição é igual ou inferior ao valor padronizado. Se o diâmetro do halo

de inibição for inferior ao valor estipulado para (S) e superior ao valor estipulado para (R),

o resultado é (I) (NCCLS, 2003; Vandepitte, et al., 2003; Hindler e Jorgensen, 2007).

O método de E-test ®

(bioMérieux) permite quantificar, através do uso de tiras contendo

um gradiente de concentração de antibacteriano, a atividade bacteriana perante um deter-

minado antibacteriano, determinando a CMI pela técnica de difusão no meio de Müller-

Hinton (MH) (Hindler e Jorgensen, 2007).

Introdução

24

1.6 – Bactérias Patogénicas – Caracterização Geral

As bactérias são microrganismos procariotas, unicelulares e reproduzem-se assexuadamen-

te. Caracterizam-se pela sua capacidade de adaptação rápida a alterações no meio ambien-

te, crescendo e dividindo-se rapidamente. Estes procariotas podem distinguir-se entre si

atendendo às suas características morfologias (tamanho, forma e coloração), propriedades

metabólicas, antigénicas e genéticas (Murray, et al., 2009).

A coloração de Gram tem um grande significado taxonómico já que permite distinguir os

microrganismos Gram-positivo de Gram-negativo, através do diferente teor lipídico e da

camada de peptidoglicano da sua parede bacteriana. As bactérias Gram-positivo apresen-

tam uma coloração púrpura conferida pelo violeta de cristal e as Gram-negativo coram de

vermelho pelo corante secundário, a fucsina (Ferreira e Sousa, 2010) .

As bactérias Gram-positivo possuem uma parede celular espessa que é composta por várias

camadas, as quais são compostas maioritariamente pelo peptidoglicano (50 a 90% do total

da parede celular). O peptidoglicano, na maioria dos casos, é permeável a macromoléculas

e, de um modo geral, não oferece resistência à difusão dos antimicrobianos (Ferreira e

Sousa, 2010). Pode ser destruído perante a lisozima, levando à lise celular. A célula Gram-

positivo possui outros componentes na membrana externa, como é o caso dos ácidos tei-

cóicos e lipoteicóicos (Silhavy, et al., 2010).

A parede celular das bactérias Gram-negativo é mais complexa, contém duas camadas

externas em relação à membrana citoplasmática e imediatamente a seguir à membrana

encontra-se uma camada fina de peptidoglicano (5 a 10% do total da parede celular). A

camada mais externa denomina-se membrana externa e é exclusiva das bactérias Gram-

negativo. O espaço compreendido entre esta e a membrana plasmática designa-se espaço

periplasmático (Silhavy, et al., 2010). Este espaço possui enzimas hidrolíticas que degra-

dam as macromoléculas necessárias para a célula; por outro lado a membrana externa

constitui uma barreira na difusão de antimicrobianos, moléculas de grande peso molecular

e hidrófobas, e uma defesa para as condições adversas de alguns ambientes (Nikaido,

2001). Os lipopolissacárideos (LPS) são moléculas anfipáticas localizadas no folheto

Introdução

25

externo da membrana externa e são a principal endotoxina das bactérias Gram-negativo.

Presentes na superfície da célula bacteriana provocam uma resposta imune exacerbada que

atua contra o hospedeiro, sendo responsáveis pelas manifestações clínicas que ocorrem

durante a infeção bacteriana. Estas moléculas encontram-se ancoradas à membrana através

da sua região hidrófoba (lípido A) projetando a sua região hidrófila (região polissacarídica)

para o exterior da célula conferindo-lhe uma carga negativa. As ligações não covalentes

estabelecidas entre os LPS adjacentes conferem estabilidade à membrana externa e são

responsáveis pela impermeabilidade da última a antimicrobianos, corantes hidrofóbicos,

detergentes e sais biliares (Ferreira e Sousa, 2010).

Os fosfolípidos são moléculas lipídicas anfipáticas que integram a membrana externa, são

constituídos por um grupo fosfato (polar) e uma cadeia de ácidos gordos (apolar). A cama-

da fosfolipídica é responsável pela permeabilidade da membrana a substâncias lipossolú-

veis que, para além da água (molécula polar), efetuam um transporte por difusão simples

(Ferreira e Sousa, 2010).

Na parede celular bacteriana, nomeadamente na membrana externa, existe um elevado teor

de proteínas, lipoproteínas e porinas, que participam na difusão específica de compostos

através da membrana externa. As porinas são proteínas transmembranares que atuam como

canais hidrófilos e permitem a difusão através da membrana de moléculas com baixo peso

molecular. Estas proteínas transmembranares atravessam a espessura da membrana exter-

na, por aminoácidos hidrofóbicos (porção externa das porinas) e aminoácidos hidrofílicos

(porção interna das porinas), o que proporciona o transporte de substâncias solúveis em

água para o interior da célula. Pelas suas características, as porinas são consideradas como

os principais veículos para a difusão de antimicrobianos (Delcour, 2009; Ferreira e Sousa,

2010).

A membrana externa une-se à membrana citoplasmática por meio de zona de adesão e ao

peptidoglicano por interação com uma lipoproteína (Silhavy, et al., 2010).

Na relação das bactérias com o homem, elas estão presentes em grande número, sem que

sejam elementos de patogenicidade ou doença. Podem, no entanto, tornar-se patogénicos,

Introdução

26

em determinadas situações, nas quais se rompem o equilíbrio biológico. Outras bactérias,

porém, são altamente patogénicas, estando a sua presença no organismo quase sempre

associada a doença (Ferreira e Sousa, 2010).

1.3.1– Escherichia coli

O microrganismo E. coli pertence a um dos maiores e bem definidos grupos de bactérias

Gram-negativo, a família Enterobacteriaceae (Goldman e Adam, 2006; Tenaillon, et al.,

2010). Foi descoberta em 1885 por um bacteriologista alemão, Theodor Escherich, num

estudo a um conjunto de bebés com inflamação do intestino (Shulman, et al., 2007).

1.3.1.1 - Características Fisiológicas

Como microrganismo procariota, E. coli é relativamente pequeno e simples. A sua dimen-

são típica é de 0.5 μm de diâmetro e 1.5 μm de comprimento, apresenta uma forma de bas-

tonete e divide-se por fissão binária. Também pode apresentar uma forma esférica, quando

as suas células perdem parcialmente a parede celular (Shimeld e Rodgers, 1999). É uma

bactéria não-esporulada, anaeróbia facultativa, que pode crescer a temperaturas entre os 8 e

os 48 ºC (Goldman e Adam, 2006), contudo, a sua temperatura ótima de crescimento é de

36 ºC. Cresce em ambientes próximos da neutralidade, isto é, pH entre 6 e 8, podendo ain-

da desenvolver-se, embora mais lentamente, em condições onde o pH é ácido ou alcalino

(Stancik, et al., 2002; Schaechter, 2009).

1.3.1.2 - Epidemiologia

A bactéria E. coli pode sobreviver em diferentes ambientes, pode ser isolada a partir do

solo, da água e de organismos vivos, tais como plantas, humanos e animais (Manning,

2005). Como membro integrante da flora comensal do intestino grosso no homem e ani-

mais, a maioria das estirpes são inofensivas. Contudo, algumas podem atuar como agentes

patogénicos provocando infeções do aparelho urinário, doenças respiratórias e pneumonia,

septicemia, meningite neo-natal e gastroenterites (Schaechter, 2009).

Introdução

27

É responsável por 70 a 85% das infeções urinárias adquiridas na comunidade e por 50 a

60% das infeções urinárias adquiridas por doentes hospitalizados (Silva, et al., 2008).

A bactéria E. coli é utilizada como indicador de contaminação fecal das águas, uma vez

que se encontra no intestino grosso, e quando presente na água indica polui-

ção/contaminação de origem fecal, sendo, por isso, considerada um coliforme fecal

(Shulman, et al., 2007).

1.3.1.3 - Isolamento e Identificação

O microrganismo E. coli pode desenvolver-se em condições de aerobiose ou anaerobiose,

numa variedade de meios de cultura não seletivos (Gelose Columbia) (GC) e seleti-

vos/diferenciais, como por exemplo o meio Cystine Lactose Electrolyte Deficient (CLED)

e MacConkey (MCK). Esta bactéria possui exigências nutricionais simples e como caracte-

rísticas bioquímicas gerais, fermenta a lactose, produz indol, reduz nitratos a nitritos, pro-

duz catalase e é oxidase negativa (Walker, et al., 2007). As células de E. coli não requerem

fatores específicos de crescimento, podendo sintetizar todos os seus componentes macro-

moleculares a partir da glicose. Em condições ótimas, estas células possuem um ciclo de

vida bastante curto, aproximadamente de 30 minutos (Schaechter, 2009).

1.3.2 - Pseudomonas aeruginosa

A bactéria P. aeruginosa pertence à família Pseudomonadaceae (Solh e Alhajhusain,

2009). O primeiro relato deste organismo foi em 1850, quando Sédillot, um cirurgião mili-

tar francês, observou a presença de pus azul esverdeado em algumas feridas (Lyczak, et al.,

2000; Zago e Chugani, 2009).

1.3.2.1 - Características Fisiológicas

A bactéria P. aeruginosa é um bacilo Gram-negativo, não-esporulado, aeróbio estrito.

Mede cerca de 0.5 a 0.8 μm de largura e 1.5 a 3.0 μm de comprimento. Tipicamente tem

flagelos polares simples ou múltiplos (Sadikot, et al., 2005; Ferreira e Lala, 2010).

Introdução

28

A temperatura ideal de crescimento de P. aeruginosa varia entre os 37 e 42ºC. O seu cres-

cimento é condicionado pela temperatura acima dos 42ºC (o que ajuda a diferenciá-la das

outras espécies de Pseudomonas do grupo fluorescente); por uma pressão osmótica eleva-

da, já que necessitam de muita água; e pela variação de pH, pois são intolerantes a um pH

ácido (Brooks, et al., 2010; Pier e Ramphal, 2010).

1.3.2.2 - Epidemiologia

A bactéria P. aeruginosa pode ser isolada na água, plantas, solo e tecidos animais (Lister,

et al., 2009). A capacidade de sobreviver em condições físicas adversas e a sua resistência

intrínseca e adquirida a diversas classes de agentes antimicrobianos, em diferentes ambien-

tes, torna-a num agente patogénico para o homem (Mena e Gerba, 2009; Moore e Flaws,

2011).

É uma bactéria patogénica importante, particularmente como causa de infeções em doentes

hospitalizados, em doentes imunocomprometidos e pacientes com fibrose quística

(Driscoll, et al., 2007; Williams, et al., 2010). No que diz respeito às IACS, de destacar,

infeções respiratórias, infeções do aparelho urinário, peritonite e septicemia (Driscoll, et

al., 2007; Brooks, et al., 2010). As infeções adquiridas na comunidade são raras, por vezes

estão associadas à água contaminada, resultando em foliculites e otites (Kiska e Gilligan,

2003). Pode também causar pneumonia, em DPOC e pacientes que tiveram recentemente

alta hospitalar (Ferreira e Lala, 2010).

1.3.2.3 - Isolamento e Identificação

O crescimento de P. aeruginosa pode ser realizado em meios de cultura comuns, como a

GC ou o MCK. Cresce também em meios seletivos e diferenciais, como é o caso do meio

Cetrimide agar (Tramper-Stranders, et al., 2005). As colónias são geralmente lisas, de

coloração esverdeada fluorescente e difusas, possuem contornos serrilhados com um brilho

metálico, podem também ser ou não mucoides (Hall, 2007; Ferreira e Lala, 2010) .

Introdução

29

As exigências nutricionais são muito simples e não necessitam de fatores de crescimento

(Solh e Alhajhusain, 2009; Moore e Flaws, 2011), podendo, inclusive, sobreviver em água

destilada (Legnani, et al., 1999; Silva, et al., 2008). Esta espécie bacteriana é capaz de uti-

lizar uma grande variedade de substratos orgânicos como fonte de carbono, uma vez que

tem uma versatilidade metabólica muito elevada. Não fermenta a glicose, é oxidase e cata-

lase positiva (Kiska e Gilligan, 2003).

1.3.3 - Acinetobacter spp

As bactérias classificadas como membros do género Acinetobacter sofreram algumas

mudanças taxonómicas ao longo do tempo. O género Acinetobacter spp pertence à família

Moraxellaceae que inclui ainda os géneros Moraxella e Psychrobacter (Peleg, et al.,

2008). Entre as diferentes espécies, A. baumannii é considerada a espécie de maior impor-

tância clínica (Peleg, et al., 2007).

1.3.3.1 - Características Fisiológicas

O microrganismo Acinetobacter é um cocobacilo Gram-negativo, aeróbio estrito, mede

cerca de 1.0 a 1.5µm de largura e 1.5 a 2.5µm de cumprimento, não forma esporos e é

imóvel (Bayuga, et al., 2002; Vegasa e Nieves, 2005; Allen e Hartman, 2010). A impor-

tância de A. baumannii tem aumentado nos últimos anos devido à sua capacidade em

adquirir mecanismos de resistência às diferentes classes de antibióticos e à sua aptidão em

sobreviver e se adaptar a condições adversas, como a dessecação, a desinfetantes, a varia-

ções de temperatura e pH (Simor, et al., 2002), o que contribui para o seu potencial de

transmissibilidade através de objetos (Montefour, et al., 2008; Rezende, et al., 2010). A

temperatura ideal de crescimento varia entre os 30 e 35ºC, sendo o pH entre os 5.5 e 6

(Vegasa e Nieves, 2005; Hall, 2007).

1.3.3.2 - Epidemiologia

As diferentes espécies de Acinetobacter apresentam diversos habitats naturais, tendo sido

isoladas no solo, na água, em vegetais e em hospedeiros animais e humanos (Houang, et

Introdução

30

al., 2001; Montefour, et al., 2008). Outras espécies fazem parte da flora comensal da pele e

das mucosas humanas (Montefour, et al., 2008). Esta bactéria é causadora tanto de infe-

ções comunitárias como de IACS, destacando-se a pneumonia, a bacteriemia, a meningite,

as infeções da pele e dos tecidos moles (Gaynes, et al., 2005; Maragakis e Perl, 2008).

1.3.3.3 - Isolamento e Identificação

A bactéria Acinetobacter é cultivada in vitro em meios de cultura comuns, como a GC ou o

MCK. Na GC, formam colónias planas, branco – acinzentadas, no meio MCK, as colónias

são levemente rosadas, normalmente cremosas, e, por vezes, podem ter aspeto mucoide.

Com um diâmetro de cerca de 1.5 a 3.0 mm, crescem em aerobiose a 37ºC.

Esta bactéria não necessita de fatores de crescimento, uma vez que é nutricionalmente pou-

co exigente. Como características bioquímicas gerais, Acinetobacter é não fermentador da

glicose, produz catalase, é oxidase negativa e raramente reduz o nitrato. (Peleg, et al.,

2007; Peleg, et al., 2008).

1.3.4 - Staphylococcus aureus

A bactéria S. aureus pertence ao género Staphylococcus, família Micrococcaceae (Lowy,

1998). O género Staphylococcus foi descrito pela primeira vez em 1880, num pus de

abcesso cirúrgico, pelo cirurgião escocês, Ogston (Lowy, 1998). A espécie S. aureus é a de

maior interesse clínico, uma vez que atualmente, é um dos microrganismos mais comuns

nas IACS, em todo o mundo (Santos, et al., 2007; Grundmann, et al., 2010).

1.3.4.1 – Características Fisiológicas

Morfologicamente, apresenta-se como um coco Gram-positivo, as células têm entre 0.5 a

1.5 μm de diâmetro (Kanafani e Fowler, 2006; Peacock, 2006; Moreillon, et al., 2010;

Tang e Stratton, 2010). O nome tem origem grega (staphylé) e significa cocos em cacho,

sendo assim observado ao microscópio ótico quando retirados da superfície de meios de

cultura sólidos (agar), se forem observados de espécimes clínicos aparecem como cocos

Introdução

31

isolados, em pares ou em pequenas cadeias (Lowy, 1998; Gillaspy e Iandolo, 2009;

Somerville e Proctor, 2009). São bactérias imóveis, não esporuladas, anaeróbios facultati-

vos, no entanto, crescem melhor em aerobiose. São capazes de crescer a temperaturas entre

os 18 a 40ºC, sendo a temperatura ótima a 37ºC, e em pH neutro (Bannerman, 2003;

Santos, et al., 2007).

1.3.4.2 - Epidemiologia

O microrganismo S. aureus pode colonizar o Homem de forma assintomática. As mucosas

são o local de colonização mais frequente, mas a orofaringe, as axilas, o períneo, a vagina,

o aparelho digestivo e a pele também são colonizadas com frequência (Wertheim, et al.,

2005; Somerville e Proctor, 2009). Este facto torna-se importante para a sua disseminação

dentro do ambiente hospitalar (Lowy, 1998). Esta bactéria, frequentemente resistente aos

antimicrobianos, é responsável por infeções ligeiras como abcessos cutâneos, e por doen-

ças mais graves, nomeadamente bacteriemia, endocardite, pericardite, pneumonia, artrite

séptica ou miosite. Quando se fala de IACS, S. aureus, é reconhecidamente o mais impor-

tante. (Kanafani e Fowler, 2006; Tang e Stratton, 2010).

1.3.4.3 - Isolamento e Identificação

A bactéria S. aureus cresce em meios comuns, caldo ou agar simples. Em GC formam

colónias redondas, convexas, brilhantes, opacas, com 1.0 a 3.0 mm de diâmetro (Kanafani

e Fowler, 2006). Neste meio é, em geral, observada uma zona de – hemólise a envolver a

colónia (Bannerman, 2003). A produção de pigmento é variável, exibindo usualmente um

pigmento amarelo ou dourado, devido à produção de carotenoides (Harrisson, 2007; Tang

e Stratton, 2010).

Outro meio de cultura importante para a identificação de S. aureus é o Manitol Salt Agar

(MSA), seletivo para esta espécie, uma vez que S. aureus consegue fermentar o manitol,

produzindo ácido láctico. Esta espécie desenvolve-se também em meios com elevado teor

de cloreto de sódio (NaCl) (10 %), que estimula a produção de coagulase, enzima que é

apenas produzida por S. aureus, entre as espécies patogénicas para o Homem. Para além da

coagulase produzem também catalase (Santos, et al., 2007; Gillaspy e Iandolo, 2009).

Introdução

32

Objetivos

Portugal é um dos países mais ricos em águas minerais naturais, tanto pela quantidade de

nascentes como pela qualidade das águas, tendo em vista a variedade e tipos de tratamento

que é possível realizar nas estâncias termais.

O fenómeno termal permanece na atualidade, e numa época em que o termalismo se está a

revitalizar, tanto na vertente medicinal como turística, esta investigação visa poder dar um

contributo aos estudos relativos às águas termais.

Deste modo, o presente estudo apresenta como principal objetivo, evidenciar a atividade

bactericida da água termal. Pretende-se ainda inferir quanto à suscetibilidade das bactérias

no que concerne à água termal.

33

CAPÍTULO 2

Material e Métodos

Material e Métodos

34

2 - Material e Métodos

Neste estudo foram usadas as estirpes E. coli, P. aeruginosa, A. baumannii e S. aureus uma

vez que, algumas destas bactérias fazem parte dos parâmetros microbiológicos analisados

nas águas termais e todas elas podem ser agentes patogénicos para o homem, quer na

comunidade, quer a nível hospitalar.

Para avaliar o efeito bactericida da água termal, as bactérias foram incubadas em água ter-

mal adicionada ao agar de forma a poder quantificar o seu teor. O agar é um polissacarídeo

com propriedades solidificantes, pouco nutritivo e não é biodegradado pela maior parte dos

microrganismos. Como controlo foi usada água desionizada adicionada de agar.

Foi também utilizado um meio de cultura mais nutritivo (TCS) que permite o crescimento

da maioria das bactérias. Este meio de cultura foi preparado com diferentes percentagens

de água termal (0%, 25%, 75% e 100%).

2.1 – Local do estudo

A recolha da água termal de natureza sulfúrea foi realizada no Complexo Termal do Cró,

localizado nas Freguesias da Rapoula do Coa e do Seixo do Coa, Concelho do Sabugal,

Distrito da Guarda. A preparação dos meios de cultura foi realizada no laboratório da Sub-

Região de Saúde, da Unidade Local de Saúde da Guarda, E.P.E e o estudo foi efetuado no

laboratório de Microbiologia do Serviço de Patologia Clínica do Hospital Sousa Martins,

Unidade Local de Saúde da Guarda, E.P.E.

2.2 - Isolados Bacterianos

Para o presente estudo foram recolhidos 60 isolados, E. coli (n=15), P. aeruginosa (n=15),

A. baumannii (n=15) e S. aureus (n=15) no período de dezembro de 2010 a fevereiro de

2011. Os isolados foram selecionados de utentes pertencentes aos serviços de Internamen-

Material e Métodos

35

to, Consulta Externa e Urgência do Hospital Sousa Martins, Unidade Local de Saúde da

Guarda, E.P.E.

2.2.1– Processamento e Critérios de Inclusão

O processamento laboratorial dos espécimes biológicos, bem como o isolamento das bacté-

rias, foram realizados de acordo com os procedimentos vigentes no laboratório de Micro-

biologia do Serviço de Patologia Clínica do referido Hospital e sujeitos às normas do

CLSI.

Como critérios de inclusão para o presente estudo foram selecionadas estirpes não duplica-

das. Por outro lado, foram apenas consideradas as estirpes: E. coli, P. aeruginosa, A. bau-

mannii e S. aureus.

2.3 - Identificação dos Isolados Bacterianos

Na identificação fenotípica das bactérias é indispensável a avaliação da análise macro e

microscópica das colónias, bem como o uso de provas bioquímicas.

2.3.1 – Análise Macroscópica

A análise macroscópica das colónias em meio de cultura sólido foi efetuada tendo em con-

ta o meio de cultura, proporcionando uma caracterização presuntiva das estirpes. Dos iso-

lados bacterianos teve-se especial atenção à sua forma, tamanho, cor e brilho, consistência,

odor, produção de pigmento e presença/ausência de hemólise.

2.3.2 – Análise Microscópica

Posteriormente, procedeu-se à coloração de Gram (Salubris, Inc; Lote: MB11-0094) e o

aspeto morfológico das bactérias foi analisado por microscopia ótica de fundo claro, com

uma ampliação de 1000X (Leica DM 2000). A coloração de Gram é uma técnica de colo-

Material e Métodos

36

ração diferencial que permite distinguir os dois principais grupos de bactérias por micros-

copia ótica: bactérias Gram-positivo e Gram-negativo (Madigan, et al., 2009).

Na técnica de Gram utilizou-se inicialmente o violeta de cristal, seguido de um mordente, o

lugol, que aumenta a afinidade da célula para o corante primário. Posteriormente, aplica-se

um agente descolorante, o álcool-acetona, seguido de um corante secundário, a fucsina.

2.3.3 - Identificação Bioquímica

De acordo com o resultado obtido da observação das características em cultura das bacté-

rias e da coloração de Gram, foram efetuadas provas de identificação bioquímicas às estir-

pes em estudo (Figura 2.1). Estas provas permitiram uma identificação presuntiva dos

microrganismos, que foi posteriormente confirmada pela técnica automatizada Vitek ®

2

Compact (bioMeriéux

®).

Figura 2.1 – Esquema das provas de identificação bioquímicas efetuadas de acordo com as características da

cultura das bactérias e com a coloração de Gram.

Figura 1- Esquema das provas de identificação bioquímicas efetuadas de acordo com as características cul-

turais das bactérias e com a coloração de Gram

Material e Métodos

37

2.3.3.1 - Teste da Catalase

O teste da catalase permite fazer a distinção entre Staphylococcus spp, catalase positiva, e

Streptococcus spp, catalase negativa, e assim orientar a identificação definitiva. A forma-

ção de gás, quando se coloca uma gota de peróxido de hidrogénio a 3% numa lâmina e se

adiciona uma colónia do microrganismo, corresponde a uma reação positiva (Procedimento

operativo vigente no Laboratório de Microbiologia).

2.3.3.2 - Teste da Coagulase

Na presença de S. aureus ocorre uma reação positiva, ou seja, observa-se uma aglutinação

visível a olho nu, quando se coloca uma gota de reagente látex no card de aglutinação e se

adiciona 1 a 3 colónias do microrganismo (PastorexTM Staph - Plus® Bio-rad

®; Lote:

1C2504).

2.2.3.3 - Teste da Oxidase

O teste da oxidase permite diferenciar as bactérias Gram-negativo em duas famílias: as não

Enterobacteriaceae, oxidase positiva e as Enterobacteriaceae, oxidase negativa (PNCI,

2004). Ao adicionar duas gotas do reagente teste da oxidase a uma tira de papel de filtro

(Whatman n.º 1) e ao colocar 1 a 3 colónias do microrganismo em estudo ocorre uma rea-

ção positiva quando as bactérias passam de violeta a púrpura de imediato ou no prazo de

30 s. As reações negativas permanecem incolores ou mudam para cor-de-rosa claro/ púrpu-

ra claro após 30 s (BD Oxidase®; Lote: 1130053).

2.3.4 – Identificação Automatizada (Sistema VITEK® 2 Compact)

Para a identificação das estirpes em estudo foi utilizado o sistema automático VITEK®

2

Compact (bioMeriéux®

). Este sistema permite identificar diferentes microrganismos, atra-

vés da monitorização contínua do crescimento e da atividade dos microrganismos no inte-

rior dos poços das cartas. O sistema ótico de transmissão utiliza luz visível para medir dire-

tamente o crescimento de microrganismos. Este sistema baseia-se numa leitura de luz ini-

Material e Métodos

38

cial do poço, antes do início do crescimento microbiano. Amostragens de transmissão de

luz do mesmo poço, com intervalos de 15 minutos, medem o crescimento de microrganis-

mos através da quantidade de luz que é impedida de atravessar o poço. O sistema ótico

utiliza Light Emitting Diodes (LED) que produzem luz nos comprimentos de onda apro-

priados e fotodetectores de silicone para capturar a luz transmitida (bioMérieux® 2007).

Para a identificação automática dos bacilos Gram-negativo fermentadores e não-

fermentadores foi usada a carta de Identificação de Gram-negativo VITEK®

2 (GN; Lote:

241210840). Esta carta baseia-se em métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos

recentemente desenvolvidos, que medem a utilização da fonte de carbono, atividade enzi-

mática e resistência. Existem 47 testes bioquímicos e um poço de controlo negativo. O

poço de controlo negativo para a descarboxilase é usado como referência do valor de base

para os poços de teste descarboxilase (bioMérieux®, 2009).

Para a identificação automática dos microrganismos Gram-positivo foi usada a carta de

Identificação de Gram-positivo VITEK®

2 (GP; Lote: 242220140). Esta carta baseia-se em

métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos recentemente desenvolvidos. Existem

43 testes bioquímicos que medem a utilização da fonte de carbono, a resistência e a ativi-

dade enzimática (bioMérieux®, 2009).

2.4 – Conservação

Após a identificação, todas os isolados bacterianos foram conservados, a partir de uma

cultura de GC (bioMeriéux®; Lote: 1000758490) com 24 h de crescimento, em criotubos

com 1 mL de caldo Tripticase-Soja (Bio-rad®; Lote: 0H2248) com glicerol (Baker; Lote:

0619202023) a 15%, devidamente identificados e congelados a – 70º C (ISO, 2009,

Zimbro, et al., 2009).

2.5 - Recolha da Água Termal

A recolha da amostra de água termal foi efetuada no mês de agosto de 2011 no Complexo

Termal do Cró.

Material e Métodos

39

2.5.1 – Processamento da Recolha da Água Termal

A água termal foi colhida através de um furo com 30 metros de profundidade, situado no

pólo das termas e que permite o acesso direto ao aquífero.

Na recolha da amostra da água termal utilizou-se um frasco de polietileno esterilizado.

Depois de bem enxaguado com água termal, inclinou-se ligeiramente o frasco, encheu-se

evitando a formação de bolhas e colocou-se de imediato a rolha (NP, 1966, ISO, 2006,

ERSAR, 2010). De referir que a água do furo estava em corrente contínua.

2.5.2 – Determinação de Parâmetros Físico – Químicos

Após identificação do frasco e colheita da água termal, procedeu-se ao registo dos valores

de pH, condutividade e temperatura presentes na sonda do sistema de monitorização da

captação (WTW).

Os valores dos referidos parâmetros no que concerne à água desionizada (destilador Enk-

rott) foram determinados no laboratório da Sub-Região de Saúde, da Unidade Local de

Saúde da Guarda, E.P.E mediante um potenciómetro (Mettler Toledo).

2.5.3 – Transporte da Água Termal

O frasco com água termal foi transportado para o laboratório numa mala térmica a 4ºC, e

foi usada, nesse mesmo dia, na preparação dos meios de cultura (ERSAR, 2010).

2.6 - Meios de Cultura do Estudo

Os meios de cultura desidratados são produzidos por laboratórios comerciais. A sua apre-

sentação é feita em pó ou em grânulos e a sua preparação é feita de acordo com as indica-

ções do fabricante, descritas no rótulo da embalagem.

Material e Métodos

40

2.6.1 - Água Termal com Agar

Na preparação do meio à base de agar pesou-se o Pastagar B (Bio-rad; Lote: 0M0147)

segundo as indicações do fabricante e reconstitui-se com água termal. Procedeu-se

posteriormente à medição do pH do meio. O Pastagar B é o nome comercial do agar (Bio-

rad) que foi adicionado à água termal e água desionizada com o intuito de obter um meio

sólido.

2.6.2 - Água Desionizada com Agar

Realizou-se o procedimento descrito anteriormente, mas utilizou-se água desionizada em

vez de água termal na reconstituição do Pastagar B (Bio-Rad®).

2.6.3 – Gelose Tripto Caseína Soja

Na preparação do meio TCS (Bio-rad®; Lote: 7B2144) seguiram-se as indicações do

fabricante. De referir, no entanto, que para a reconstituição do meio foram utilizados

diferentes volumes de água termal e de água desionizada (Tabela 2.1).

Tabela 2.1 – Percentagem de água termal e de água desionizada utilizada na preparação dos diferentes meios

de TCS.

Meios de Cultura

Água

TCS1 TCS2 TCS3 TCS4 TCS5

Agua Termal (%)

100 75 50 25 0

Água Desionizada Estéril (%)

0 25 50 75 100

À temperatura do meio de cultura a 25ºC, procedeu-se à medição do pH do meio. Para a

determinação do pH foi usado um medidor de pH de bancada (Mettler Toledo).

Material e Métodos

41

2.6.4 – Processo de Esterilização

Todos os meios foram esterilizados na autoclave (JSM, Mod. 075-L) a 121ºC durante 15

minutos. Depois de autoclavados, arrefeceram até cerca de 45ºC e, em condições de assep-

sia, foram distribuídos por placas de Petri de 90 mm, fazendo uma espessura de, pelo

menos, 3 mm (18 a 20 mL de agar). Quando os meios solidificaram, as placas foram inver-

tidas e armazenadas a 4ºC até serem usadas (ISO, 2009; Zimbro, et al., 2009) .

2.6.5 – Controlo de Qualidade Interno

Como controlo dos procedimentos efetuados na preparação dos diferentes meios de cultura

do mesmo lote, escolheram-se aleatoriamente, 5% dos diferentes meios, para serem incu-

bados 24 horas a 37ºC, e mais 24h à temperatura ambiente (para excluir a contaminação

com bactérias psicrófilas) (PNCI, 2004).

2.7 – Sementeira em Meios de Cultura

Os diferentes meios de cultura foram semeados com um inóculo de diferentes concentra-

ções. De referir, que foi feito um estudo prévio, de forma a selecionar as diluições e quan-

tidade de inóculo mais adequados, para se proceder à contagem macroscópica das colónias

através da observação visual das placas de Petri.

2.7.1 - Preparação do Inóculo por Diluições Sucessivas

A partir de uma cultura pura do microrganismo em estudo, com 24 h de crescimento em

meio de GC (bioMérieux®; Lote: 1000758490), foi preparada, com solução NaCl 0,85%

(bioMérieux®; Lote: 1000477950), uma suspensão homogénea com uma densidade equiva-

lente a um padrão McFarland de 0.50 a 0.63 do microrganismo em estudo, usando o densi-

tómetro DensiCHEK™ VITEK® (bioMérieux

®) (bioMérieux

®, 2009).

A suspensão foi homogeneizada e posteriormente procedeu-se ao método das diluições

decimais sucessivas. Para efetuar as diluições, adicionou-se 900 µl de solução NaCl 0,85%

(bioMérieux®; Lote: 1000477950) para tubos de ensaio esterilizados. De seguida, transfe-

Material e Métodos

42

riu-se 100 µl da suspensão 0.5 McFarland para o primeiro tubo de ensaio. Desta primeira

diluição, depois de homogeneizada, transferiu-se mais 100 µl para o segundo tubo de

ensaio (10-2

). Repetiu-se este procedimento até à última diluição (10-5

) (NP, 1998; Leboffe

e Pierce, 2008).

2.7.2 – Técnica de Sementeira

Todos os meios de cultura foram inoculados com 10 µl de cada uma das diluições referidas

anteriormente, seguindo a ordem decrescente das diluições e semeados pela técnica de

espalhamento (NP, 1998). Foram efetuadas 2 réplicas para cada meio.

2.7.3 – Interpretação dos Resultados

Após incubação a 37ºC durante 24 h, procedeu-se à contagem macroscópica das colónias

através da observação visual das placas de Petri e determinou-se a concentração em

unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/mL).

Por questões de fiabilidade e precisão foram consideradas apenas as placas que continham

entre 30 e 300 colónias (NP, 1998) .

O resultado da contagem das colónias, em UFC/mL, foi determinado aplicando a seguinte

equação (NP, 1998):

CS = N VS

( n1V1F1) + (n2V2F2)

Onde:

CS – Número de unidades formadoras de colónia no volume de referência VS de amostra;

N – Soma de todas as colónias contadas nas placas de Petri provenientes das diluições F1 e

F2;

n1, n2 – Número de placas de Petri contadas para as diluições F1 e F2 ;

V1, V2 – Volumes por ensaio das diluições F1, F2;

Material e Métodos

43

F1, F2 – Diluições utilizadas para as tomas para ensaio V1, V2 (F = 1 para uma amostra não

diluída, F = 0,1 para uma diluição decimal, etc.);

VS – Volume de referência escolhido para exprimir a concentração de microrganismos na

amostra.

2.7.4 – Controlo de Qualidade

Com o intuito de controlar os resultados obtidos, em cada ensaio de cinco isolados bacte-

rianos, os diferentes meios de cultura foram inoculados com água termal e água desioniza-

da. De referir, que não se observou crescimento bacteriano nos diferentes meios de cultura

(Controlo Negativo).

Com o mesmo intuito e com a mesma frequência foram semeadas as estirpes da American

Type Culture Collection (ATCC®

): 25922™ (E. coli), 29213™ (P. aeruginosa), 17978™ (A.

baumannii) e 27853™ (S. aureus), nos diferentes meios de cultura. De referir que o cresci-

mento obtido foi similar aos resultados obtidos nas bactérias do estudo (Controlo Positivo).

Os procedimentos efetuados foram os mesmos que os realizados para os diferentes isolados

bacterianos.

2.8 - Avaliação da Suscetibilidade das Bactérias à Água Termal

A avaliação da sensibilidade dos isolados bacterianos à água termal foi determinada pelo

método de difusão em meio sólido, utilizando uma adaptação da Técnica de Kirby – Bauer.

2.8.1 – Preparação dos Discos com Água Termal

Os discos de filtro estéreis (Bio-rad®; Lote: 1C0047) foram impregnados com 20 µl de

água termal. Posteriormente, deixaram-se secar à temperatura ambiente durante 10 minutos

(Abujheisha, 2005; Fernandes, 2009).

Material e Métodos

44

2.8.2 – Preparação dos Discos com Água Destilada Estéril

Realizou-se o procedimento descrito anteriormente, mas utilizou-se água destilada estéril

(Braun®; Lote: 0087B06) em vez de água termal.

2.8.3 - Adaptação da Técnica de Kirby – Bauer

2.8.3.1 – Preparação do Inóculo

Para a preparação do inóculo escolheram-se algumas colónias bacterianas, isoladas a partir

de uma cultura de GC (bioMérieux®

; Lote: 1000758490) com 24 h de crescimento, inocu-

laram-se numa suspensão salina de NaCl 0,85% (bioMérieux; Lote: 1000477950), de modo

a obter uma turvação da suspensão equivalente a 0,5 da escala McFarland, usando o Den-

siCHEK™ VITEK® (bioMérieux

®) (NCCLS, 2003).

2.8.3.2 - Inoculação do Meio de Cultura

A inoculação no meio MH (bioMérieux®; Lote: 15935), foi feita com o auxílio de uma

zaragatoa previamente mergulhada na suspensão bacteriana, tendo o cuidado de a apertar e

rodar três vezes contra as paredes do tubo e de seguida o mesmo número de vezes acima

do nível do líquido, com a finalidade de eliminar o líquido em excesso. Posteriormente,

com a mesma zaragatoa semearam-se por estrias apertadas, em três direções, perpendicula-

res entre si, por toda a superfície do meio. Por fim, rodou-se a zaragatoa na periferia da

placa (NCCLS, 2003).

2.8.3.3 – Aplicação dos Discos Impregnados

Os discos de filtro impregnados foram aplicados sobre a superfície do meio, com a ajuda

de uma pinça esterilizada, de modo a evitar a sobreposição dos halos de inibição e tendo o

cuidado de exercer sobre cada um deles uma ligeira pressão para assegurar um perfeito

contacto com o meio (NCCLS, 2003).

Material e Métodos

45

Foram efetuadas 2 réplicas para cada meio.

O disco impregnado com água destilada estéril foi utilizado como controlo negativo.

2.8.3.4 – Incubação e Leitura dos Halos de Inibição

Após 24 h de incubação a 37ºC, em aerobiose, mediram-se os halos de inibição em milíme-

tros, com a ajuda de uma régua (NCCLS, 2003).

2.8.4 – Controlo de Qualidade

De forma a controlar os resultados obtidos, foram incluídas em cada ensaio de cinco isola-

dos bacterianos, as estirpes de ATCC®: 25922

™, 29213

™, 17978™ e 27853

™. Os procedi-

mentos efetuados foram os mesmos que os realizados para os diferentes isolados bacteria-

nos.

2.9 – Tratamento Estatístico

Para sistematizar e realçar a informação fornecida pelos dados aplicaram-se técnicas da

estatística descritiva e da estatística inferencial. Os dados foram tratados informaticamente,

recorrendo ao programa de tratamento estatístico SPSS (Statistical Package for the Social

Science), na versão 19.0 de 2011. As técnicas estatística utilizadas foram:

Frequências: absolutas (n) e relativas (%); Medidas de Tendência Central: média aritmética

e mediana; Medidas de dispersão ou variabilidade: desvios padrão, valor mínimo e valor

máximo. Testes de Hipóteses: teste Kruskal-Wallis, teste Wilcoxon, teste Friedman, teste

Least Significant Difference (LSD) e testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk (como

testes de normalidade – Anexo 3).

46

CAPÍTULO 3

Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

47

3– Resultados e Discussão

A recolha das amostras foi realizada entre dezembro de 2010 e fevereiro de 2011. Nesse

período foram estudadas 1307 urinas, 811 hemoculturas, 513 exsudatos de feridas não

cirúrgicas, 245 expetorações, 115 aspirados traqueobrônquicos, entre outros espécimes

biológicos provenientes dos utentes dos vários serviços do Hospital Sousa Martins, Unida-

de Local de Saúde da Guarda, E.P.E, nomeadamente: internamento, urgência e consulta

externa. No conjunto destes foram isolados vários microrganismos dos quais foram sele-

cionadas aleatoriamente 15 estirpes de E. coli, 15 estirpes de P. aeruginosa, 15 estirpes de

A. baumannii e 15 estirpes de S. aureus, que foram usadas neste estudo.

Os resultados da aplicação dos testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk evidenciaram

que a maioria das variáveis quantitativas envolvidas no estudo não apresentava distribui-

ções normais (p <0.050). Atendendo a que esta é uma das condições necessárias para apli-

cação de técnicas paramétricas e dado que não se verifica, utilizaram-se testes não paramé-

tricos. Em todos os testes fixou-se o valor 0.050 como valor máximo da probabilidade do

erro tipo I (p), ou seja, como valor abaixo do qual se considerou que as relações ou dife-

renças em estudo eram estatisticamente significativas.

Resultados e Discussão

48

3.1 - Caracterização da População em Estudo e Espécimes Biológicos

Na análise dos dados demográficos dos indivíduos em estudo (n=60) verificou-se que a

idade dos mesmos se situou entre 7 e 103 anos, sendo a idade média 69 anos, com desvio

padrão de 21 anos, sendo que metade dos elementos da amostra tinha, pelo menos, 77 anos

(idade mediana).

Ao nível das estirpes verificou-se que as idades médias dos indivíduos foram de 74 anos

para P. aeruginosa, 71 anos para A. baumannii, 67 anos para E. coli e 67 anos para S.

aureus (Figura 3.1).

Figura 3.1. - Distribuição da faixa etária (anos) dos indivíduos do presente estudo

A análise dos dados demográficos revelou que a população em estudo é uma população

envelhecida. O Instituto Nacional de Estatística, no período de referência dos dados de

2010 e para a população da Região da Beira Interior Norte, revelou que 52.7% da popula-

ção residente apresenta idades compreendidas entre os 25 e os 64 anos, e que 25.5% apre-

senta uma idade superior a 65 anos (INE).

Estes dados não corroboram com a média de idades dos resultados obtidos ( =69,4), con-

tudo, de referir, que as bactérias do estudo foram na sua grande maioria provenientes dos

serviços de internamento de um Hospital distrital, onde há um predomínio de uma popula-

ção idosa.

E. Coli P. aeruginosa A. baumannii S. aureus Total

Estirpe

Resultados e Discussão

49

Figura 3.2 – Distribuição das estirpes por serviço de proveniência

Quanto à origem dos espécimes biológicos constatou-se (Figura 3.2) que, no global, a

maioria teve origem em meio hospitalar (indivíduos internados), 76.7% (46/60). De salien-

tar que estes resultados encontram-se enquadrados com o número de requisitos de análises

realizadas no laboratório de Microbiologia do serviço de Patologia Clínica do referido

Hospital, já que 61.9% (4047/6533) dos mesmos tiveram origem nos serviços de interna-

mento.

Este facto também se verificou para cada uma das estirpes, variando as percentagens entre

53.3% (8/15), para E. coli, e 100.0% (15/15), para A. baumannii. Constatou-se ainda que as

bactérias P. aeruginosa e S. aureus tiveram origem em meio hospitalar em 93.3% (14/15) e

60.0% (9/15) das situações, respetivamente.

No que concerne aos espécimes biológicos a partir dos quais foram isoladas as estirpes em

estudo (Figura 3.3) verificou-se que, em termos globais, 31.7% (19/60) foram obtidas a

partir de culturas de produtos respiratórios (expetoração e aspirado traqueobrônquico) e

30.0% (18/60) foram isoladas a partir de culturas de urina dos doentes do estudo.

E. Coli P. aeruginosa A. baumannii S. aureus Total

Estirpe

Resultados e Discussão

50

Figura 3.3 – Distribuição das bactérias por espécime biológico

Marston et al. (1997) revelaram que as infeções respiratórias são a principal causa de mor-

te no mundo e a principal causa de morte devido a doenças infeciosas.

Relativamente às infeções do trato urinário (ITU), Martins et al. (2010) referem que são

uma das causas mais frequentes da consulta médica e uma das infeções comunitárias mais

frequentes (Martins, et al., 2010).

De acordo com Chen et al. (2008) as ITU, as infeções respiratórias e da pele são as que

apresentam uma maior prevalência nas IACS.

A análise da Figura 3.3 mostra também, relativamente às bactérias, E. coli foi isolada prin-

cipalmente na urina, 66.7% (10/15). Num estudo de Martins et al. (2010), E. coli foi res-

ponsável por 53 a 72% das infeções urinárias adquiridas na comunidade e por 17.5% a

56.7% das infeções urinárias, em pacientes idosos institucionalizados.

Da análise da distribuição dos resultados da bactéria A. baumannii (Figura 3.3) verificou-se

uma predominância de 46.7% (7/15) isolada na urina e 26.7% (4/15) provenientes de pro-

dutos respiratórios. De referir também que todos os espécimes biológicos, 100.0% (15/15)

tiveram origem hospitalar.

E. Coli P. aeruginosa A. baumannii S. aureus Total

Estirpe

Resultados e Discussão

51

Cirino et al. (2008) citaram os espécimes do trato respiratório, hemoculturas, urina e,

menos comummente, exsudatos e líquido cefalorraquídiano como sendo os espécimes bio-

lógicos mais comuns no isolamento de A. baumannii.

Lahiri et al. (2004) e Silva et al. (2011) afirmaram que esta bactéria tem sido associada a

uma grande variedade de infeções, principalmente, em IACS e, mais raramente, em infe-

ções adquiridas na comunidade. Embora, as infeções da comunidade por este agente sejam

raramente relatadas, a espécie Acinetobacter é cada vez mais reconhecida como um agente

patogénico de elevada morbilidade e mortalidade no contexto comunitário (Lahiri, et al.,

2004; Silva, et al., 2011).

No que concerne às ITU vários estudos apresentam uma baixa prevalência de A. baumannii

isolados na urina. A análise dos resultados do presente estudo, tal como foi referido ante-

riormente, revelou que as bactérias A. baumannii foram predominantemente isoladas na

urina, 46.7% (7/15). Estes resultados devem-se, provavelmente, ao elevado número de

requisitos de cultura de urina recebidos, cerca de 20.0% (1307/6533). Por outro lado,

vários autores citam o uso da cateterização vesical prolongada como causa de ITU causa-

das por bactérias Gram-negativo multirresistentes, incluindo A. baumannii (Peleg, et al.,

2008; Peleg e Hooper, 2010). Outros evidenciam a idade avançada dos indivíduos para a

infeção por este microrganismo (Cirino, et al., 2008; Caljouw, et al., 2011).

Da análise da distribuição dos resultados da bactéria P. aeruginosa (Figura 3.3) verificou-

se uma ocorrência de 40.0% (6/15) isolada em produtos respiratórios e 26.7% (4/15) em

exsudados e em outros produtos biológicos.

Vários autores referem que P. aeruginosa é um dos microrganismos patogénicos com uma

elevada prevalência em infeções do trato respiratório (Giamarellou, 2002; Bellido, 2008).

Em relação aos espécimes biológicos onde o microrganismo S. aureus foi isolado (Figura

3.3), 46.7% (7/15) correspondiam a produtos respiratórios, 33.3% (5/15) a exsudados e

13.3% (2/15) a hemoculturas.

Resultados e Discussão

52

Barnnerman (2003) citou que as infeções respiratórias nosocomiais produzidas por S.

aureus ocorrem em casos de DPOC, entubação e aspiração. O mesmo autor refere também

que as doenças malignas subjacentes são reconhecidas como fatores de risco para o desen-

volvimento de bacteriemia por S. aureus (Barnnerman, 2003).

Santos et al. (2007) afirmaram que as infeções da pele e tecidos moles são comuns, tanto

em pacientes da comunidade, como em doentes hospitalizados. Estas infeções podem atin-

gir regiões superficiais ou até mesmo os tecidos mais profundos, sendo S. aureus o agente

mais comum. Os mesmos autores revelaram ainda que S. aureus é frequentemente isolado

em feridas cirúrgicas, podendo representar focos para o desenvolvimento de infeções sis-

témicas (Santos, et al., 2007).

3.2 – Caracterização Geral das Águas Termal e Desionizada - pH, Con-

dutividade e Temperatura

Da análise dos dados obtidos para o pH da água termal e da água desionizada verificou-se

que o pH da água termal variou entre 8.17 e 8.22, com um valor médio de 8.20.

Quanto ao valor de pH da água desionizada, variou entre 5.44 e 5.48, com um valor médio

de 5.46. Através dos resultados obtidos constatou-se que os valores observados para a água

termal são mais elevados que os da água desionizada, sendo as diferenças estaticamente

significativas. De referir, que no presente estudo a água termal foi, significativamente,

mais alcalina que a água desionizada.

Calado (1995) e Lourenço (2005) afirmaram que as águas sulfúreas possuem, geralmente,

valores de pH superiores a 8.00. O boletim de análise química das águas sulfúreas do com-

plexo termal do Cró, de julho de 2011, apresentou um valor de pH de 8.21 (Anexo1).

Riché et al. (2006) afirmaram que a água desionizada é levemente ácida (pH aproximada-

mente 5.8), isto porque a água desionizada dissolve dióxido de carbono (CO2) da atmosfe-

ra. O CO2 dissolvido reage com a água e forma o ácido carbónico (H2CO3), o qual se dis-

Resultados e Discussão

53

socia em hidrogenocarbonato (HCO3-) que está em equilíbrio com o carbonato (CO3

2-)

(Riché, et al., 2006), tal como evidenciam as seguintes equações:

H2O + CO2 ↔ H2CO3

H2CO3 + H2O ↔ H3O+ + HCO3

-

HCO3- + H2O ↔ H3O

+ + CO3

2-

Para além do pH foi também determinada a condutividade da água termal e da água desio-

nizada. A condutividade de uma solução eletrolítica é a capacidade dos iões em solução

conduzirem corrente elétrica, sendo afetada pela temperatura numa relação de proporciona-

lidade direta (Clesceri, et al., 1998).

Da análise dos dados obtidos para a condutividade da água termal e da água desionizada

verificou-se que a condutividade da água termal variou entre 340 e 447 µS/cm, com um

valor médio de 407.65 µS/cm. Quanto ao valor da condutividade da água desionizada,

variou entre 4.01 e 4,11 µS/cm, com um valor médio de 4.05 µS/cm.

A aplicação do teste Wilcoxon revelou que as diferenças observadas eram estatisticamente

significativas. De salientar então, que a água termal apresentou uma elevada condutividade

por comparação com a da água desionizada. O boletim de análise química das águas do

complexo termal do Cró apresentou um valor de condutividade de 426.00 µS/cm (Ane-

xo1).

A água termal é rica em sais e a sua mineralização é a que predomina nos terrenos que

atravessa (Arango, 2001). O boletim de análise química das águas do complexo termal do

Cró apresentou um valor de mineralização total de 379 mg/L (Anexo1). De acordo com

Diegues e Martins (2010) esta água termal classifica-se como uma água francamente mine-

ralizada, razão pela qual apresentou uma maior condutividade, comparativamente, com a

água desionizada (isenta de iões). A condutividade é um bom indicador da concentração

mineral da água (Clesceri, et al., 1998).

Resultados e Discussão

54

No que concerne à temperatura da água é importante conhecer o seu valor, dado que con-

diciona a solubilidade dos sais (Clesceri, et al., 1998).

Da análise dos dados obtidos para a temperatura da água termal e da água desionizada veri-

ficou-se que a temperatura da água termal variou entre 23.20 e 24.30 ºC, com um valor

médio de 23.81 ºC. Quanto ao valor da temperatura da água desionizada, variou entre

24.00 e 24.20 ºC, com um valor médio de 24.10 ºC.

De acordo com Calado em 1995 é usual designar por ―termal‖ toda a água cuja temperatu-

ra de emergência seja superior a 20 ºC. No entanto, muitos geólogos preferem indexar o

limite à temperatura média anual do ar da região da nascente, considerando termal quando

é excedida (Calado, 1995). Na Europa foi adotada a definição de considerar ―termais‖, as

águas de temperatura superior a 20ºC, retomando a sistematização do Simpósio de Águas

Minerais de Praga de 1968 (Calado, 1995).

Segundo Diegues e Martins (2010) no que concerne à temperatura, esta água termal define-

se como uma água hipotermal.

3.3 – Caracterização dos Meios de Cultura - pH

A medição do pH foi efetuada nos meios de cultura depois de autoclavados à temperatura

de aproximadamente 25ºC, temperatura de referência definida pela International Union of

Pure and Applied Chemistry (IUPAC).

Em relação aos valores de pH nos meios Pastagar B com água desionizada e Pastagar B

com água termal, representados na Figura 3.4, revelaram que o meio Pastagar B termal

evidenciou um pH mais elevado que o meio Pastagar B com água desionizada, mas em

nenhuma das situações as diferenças foram estatisticamente significativas (p> 0.050), ou

seja, o meio Pastagar B com água desionizada apresentou um valor de pH semelhante ao

meio Pastagar B termal.

Resultados e Discussão

55

Figura 3.4 – Distribuição dos valores médios do pH dos meios Pastagar B com água desionizada e com água

termal

Em relação à média dos valores de pH nos diferentes meios de TCS verificou-se no total

um valor médio de pH de 7.43 para os meios 100% e 75% de água termal, 7.39, 7.32 e

7.25 para os meios 50%, 25% e 0 % de água termal, respetivamente. Os valores de pH

foram mais elevados nos meios 100% e 75% termal e mais baixos no meio 0% termal, ou

seja, no meio com 100% de água desionizada (Figura 3.5).

Figura 3.5 – Distribuição dos valores médios do pH nos diferentes meios de TCS

Resultados e Discussão

56

Da análise estatística dos valores médios do pH nos diferentes meios de TCS verificou-se

que existem diferenças significativas (p < 0.001). A aplicação do teste Least Significant

Difference (LSD) para comparações múltiplas revelou que, apenas, entre os meios 100% e

75% termal as diferenças não foram estatisticamente significativas.

Os valores de pH para os meios TCS 0% termal, ou seja, 100% desionizada e Pastagar B

com água desionizada obtidos no presente estudo corroboram os apontados pela casa

comercial (Bio-rad®). De acordo com este fabricante, os valores de pH para os referidos

meios, depois de autoclavados, são de 7.3 ± 0.2 e 7 ± 0.6, respetivamente. Para os restantes

meios com diferentes concentrações de água termal desconhecem-se os valores de referên-

cia.

Na preparação dos meios de cultura a determinação do pH é importante uma vez que este

constitui um dos fatores que influencia o crescimento bacteriano (Tortora, et al., 2010). De

acordo com Barros e Pasqual et al. (1992), o pH do meio de cultura é influenciado pela

ebulição e pela autoclavagem do mesmo (Barros e Pasqual, 1992; Pasqual, et al., 1992). O

meio de cultura com um pH inicial ácido, após ebulição, tem tendência a ficar com um pH

alcalino. Por sua vez, um pH inicial alcalino tem tendência a ficar ácido. O pH do meio de

cultura cujo valor inicial se encontra próximo da neutralidade é pouco influenciado pela

ebulição (Barros e Pasqual, 1992). Vários autores evidenciaram que a autoclavagem pro-

voca uma diminuição do pH do meio de cultura (Barros e Pasqual, 1992; Pasqual, et al.,

1992). Skirvin et al. (1986) verificaram uma diminuição do pH do meio, em média, de 0.3

a 0.5 unidades. Em 1992, Barros e Pasqual consideraram que as variações de pH do meio

de cultura após autoclavagem são devidas às reações químicas ocorridas durante o proces-

so de esterilização do mesmo. Estas variações dependem não só do pH inicial do meio,

como também da temperatura de autoclavagem (Barros e Pasqual, 1992). Os mesmos auto-

res revelaram ainda que quanto mais alcalino for o pH inicial do meio mais ácido se torna,

após autoclavagem.

No que concerne ao agar, Skirvin et al. (1986), consideraram que este exerce um efeito

tampão sobre o pH do meio. No mesmo estudo constataram ainda que na presença do agar

Resultados e Discussão

57

Figura 3.6 – Teor de bactérias no meio Pastagar B

o pH do meio ficou menos ácido. Estes resultados verificaram-se, similarmente, no proces-

so de ebulição e na autoclavagem do meio de cultura.

Por outro lado, Msogoya et al. (2008) revelaram que o agar para além de ser um agente

solidificante contém ácidos que sofrem hidrólise durante a autoclavagem, resultando na

redução substancial do pH do meio.

Relativamente ao pH dos meios de cultura com uma maior concentração de água termal

(75% e 100% termal) verificou-se um aumento de acidez comparativamente aos de maior

concentração de água desionizada (0% e 25% termal). Deste modo, estes resultados con-

firmam os dos estudos referenciados anteriormente.

Devido à impermeabilidade da membrana citoplasmática a protões, a maioria das espécies

bacterianas cresce em meios cujo valor de pH se encontra próximo da neutralidade, entre

6.5 e 7.5 (Leboffe e Pierce, 2008). É de salientar que os resultados do pH observados nos

diferentes meios de cultura encontram-se enquadrados com os valores de pH ótimo para o

crescimento das bactérias do presente estudo.

3.4 - Avaliação do Crescimento Bacteriano

Relativamente ao crescimento bacteriano nos meios Pastagar B com água desionizada e

com água termal, este só se verificou para as bactérias P. aeruginosa e A. baumannii (Figu-

ra 3.6).

Resultados e Discussão

58

Da análise dos resultados apresentados na Figura 3.6, verificou-se que não existem dife-

renças estatisticamente significativas em qualquer das situações estudadas. Desta forma, a

água termal não interferiu no crescimento das bactérias no meio Pastagar B.

Vários autores catalogam como simples as exigências nutricionais de P. aeruginosa (Solh

e Alhajhusain, 2009; Moore e Flaws, 2011) destacando a sua sobrevivência em água desti-

lada (Legnani, et al., 1999; Silva, et al., 2008) e na água das piscinas (Rusin, et al., 1997;

Grobe, et al., 2001). Por outro lado, em relação à bactéria A. baumannii, Rezende et al.

(2010) e Peleg et al. (2008) afirmaram que é nutricionalmente pouco exigente, sobrevive

em condições ambientais adversas como a dessecação, a soluções desinfetantes, a varia-

ções de temperatura e pH, o que contribui para o seu potencial de transmissibilidade atra-

vés de objetos. Rusin et al. (1997) revelaram que Acinetobacter foi isolado em 97% de

amostras de água natural, numa concentração de 0.1-100 células/mL; 42% em fontes de

água termais e em 38% de águas subterrâneas, numa proporção de 8 UFC/l00 mL. Os

resultados apresentados no presente estudo corroboram os apontados pelos autores referen-

ciados anteriormente.

Quanto às estirpes E. coli e S. aureus são bactérias que possuem necessidades nutricionais

mais exigentes, (Madigan, et al., 2009) comparativamente com as bactérias A. baumannii e

P. aeruginosa, razão pela qual não apresentaram crescimento no meio Pastagar B.

De salientar, relativamente à análise macroscópica das referidas bactérias, o seu reduzido

tamanho (Figura 3.7), observado similarmente no meio Pastagar B com água desionizada e

termal. Estes resultados podem ter por base as características pouco nutricionais do meio

onde foram semeadas. O agar é um polissacarídeo complexo, extraído usualmente de algas

vermelhas marinhas (Rhodophyceae), composto principalmente por fibras e também sais

minerais (fósforo, ferro, potássio e cloro), celulose, anidrogalactose e uma pequena

quantidade de proteínas (Zimbro, et al., 2009). A água desionizada é isenta de iões e a

termal apresenta alguns sais minerais.

Resultados e Discussão

59

Figura 3.7 – Colónias isoladas nos diferentes meios de cultura com diferentes diluições.

A - Isolado bacteriano de E.coli em meio TCS 0% termal (diluição de 10-4

); B - Isolado bacteriano de P.

aeruginosa em meio Pastagar B termal (diluição de 10-3

); C - Isolado bacteriano de A. baumannii em meio

Pastagar B com água desionizada (diluição de 10 -4

); D - Isolado bacteriano de A. baumannii em meio TCS

100% (placas superiores) e 0% termal (placas inferiores) (diluições de 10 -4

e 10-5

); E - Isolado bacteriano de

S. aureus em meio TCS 100% termal (diluição de 10 -3

); F - Isolado bacteriano de S. aureus em meio TCS

0% termal (diluição de 10 -3

).

A

C

B

D

E

C

F

C

Resultados e Discussão

60

De forma a colmatar as características nutricionais do meio Pastagar B foi utilizado um

meio de cultura nutritivo, o TCS (Bio-rad®). A presença de peptona pancreática de caseína,

peptona papaínica de soja e glucose na constituição do meio, permite o crescimento da

maioria das bactérias.

Na preparação do meio TCS foram utilizados diferentes volumes de águas termal e

desionizada (0%, 25%, 50%, 75% e 100%), de forma a avaliar a concentração de água

termal a partir da qual se verificava ação bactericida. De salientar, que em todos os meios

de TCS preparados com diferentes concentrações de água termal observou-se, sempre, a

presença de crescimento das várias estirpes. Contudo, da análise dos resultados verifica-

ram-se diferenças no que concerne ao seu crescimento nos diferentes meios de TCS. Tal

facto pode ter origem nas diferentes características de crescimento e nutricionais das várias

bactérias em estudo. A estirpe S. aureus, bactéria Gram-positivo, apresenta necessidades

nutricionais mais exigentes relativamente às restantes (Madigan, et al., 2009).

Os gráficos que se seguem evidenciam o teor dos 60 isolados, E. coli (n=15), A. baumannii

(n=15), P. aeruginosa (n=15) e S. aureus (n=15). De referir, que cada linha do gráfico cor-

responde ao crescimento (UFC/mL X 105) de um isolado bacteriano em cada meio de TCS.

Assim, cada gráfico apresenta 15 linhas que correspondem ao crescimento dos 15 isolados

bacterianos de cada estirpe em cada meio de TCS. A média (X) do crescimento de cada

estirpe corresponde à linha a negrito.

A figura 3.8 ilustra o crescimento dos isolados de E. coli nos diferentes meios de TCS.

Resultados e Discussão

61

Figura 3.9 – Teor de A. baumannii nos diferentes meios de TCS

Figura 3.8 – Teor de E. coli nos diferentes meios de TCS

A análise dos resultados apresentados na Figura 3.8 mostrou que não existiram diferenças

estatisticamente significativas (p = 0.514) no crescimento dos isolados de E. coli nos dife-

rentes meios de TCS.

Similarmente, para a estirpe A. baumannii, a análise dos resultados (Figura 3.9) revelou

que não existiu significância estatística (p = 0.617) no crescimento desta nos vários meios

de TCS.

Meio TCS

Meios TCS

Resultados e Discussão

62

De igual modo, para o crescimento dos isolados de P. aeruginosa, a análise dos resultados

(Figura 3.10) evidenciou que não houve diferenças estatisticamente significativas (p =

0.622) entre os diferentes meios de TCS.

Figura 3.10 – Teor de P. aeruginosa nos diferentes meios de TCS

No presente estudo evidenciou-se o crescimento de três bactérias Gram-negativo em meios

de cultura preparados com diferentes concentrações de água termal, sem variações signifi-

cativas no teor de bactérias entre os mesmos. A água termal não interferiu no crescimento

das referidas bactérias, ou seja, não se verificou ação bactericida.

À luz da bibliografia atual não se conhecem estudos relativos à ação bactericida da água

termal e quais os mecanismos da sua ação para estas bactérias Gram-negativo.

Relativamente ao crescimento dos isolados de S. aureus nos diferentes meios de TCS, a

análise dos resultados ilustrados na Figura 3.11 revelou a existência de diferenças estatisti-

camente significativas (p < 0.001).

Meios TCS

Resultados e Discussão

63

Figura 3.11 – Teor de S. aureus nos diferentes meios de TCS

Comparando os valores das medidas de tendência central (média e mediana) constatou-se

que o teor de S. aureus aumentou à medida que diminuiu a percentagem de água termal do

meio. O teste LSD revelou que as diferenças observadas só não são estatisticamente signi-

ficativas entre os meios com 100% e 75% de água termal e entre 25% e 0% de água termal

(Figura

3.12).

Meios TCS

Figura 3.12 – Distribuição do Teor médio de S. aureus nos diferentes meios de TCS

Resultados e Discussão

64

A diminuição do crescimento de S. aureus à medida que aumentou a percentagem de água

termal do meio enquadra-se com os resultados preliminares do estudo realizado no âmbito

do Programa Operacional Regional do Centro 2007-2013 QREN cujo tema è a ―Avaliação

do Efeito Terapêutico do Termalismo em Indivíduos com Rinite Alérgica e em Indivíduos

com Artrite Reumatoide‖, a decorrer no laboratório de Microbiologia do Serviço de Pato-

logia Clínica do Hospital Sousa Martins, Unidade Local de Saúde da Guarda, E.P.E.

Vários autores referem, em estudos dermatológicos, que a água termal de natureza sulfúrea

apresenta propriedades bactericidas. Estes efeitos têm sido atribuídos ao ácido pentatiónico

(H2S5O6) produzido na pele através da interação do enxofre com os radicais de oxigénio

presentes nas camadas profundas da epiderme (Ghersetich, et al., 2001; Matz, et al., 2003;

Faílde e Mosqueira, 2006).

Ottaviano et al. (2010) descreveram o sucesso da terapêutica termal em processos infecio-

sos protagonizados por estirpes de S. aureus, justificando a ação bactericida destas águas

com a presença de formas reduzidas de enxofre. Outros autores citam a ação bactericida

das águas sulfúreas devido à toxicidade das formas reduzidas de enxofre nas bactérias (HS-

e SO42-

) (Albertini, et al., 2007; Passali, et al., 2007; Olina, et al., 2008; Staffieri e Abramo

2007; Salami, et al., 2010). Contudo, nenhum estudo refere de que forma estes componen-

tes influem na bactéria.

A estirpe S. aureus, microrganismo Gram-positivo contemplado no presente estudo, foi a

única bactéria que apresentou diminuição de crescimento nos meios TCS 100% e 75%

termal. Estes resultados podem ser devidos às diferenças estruturais da parede bacteriana e

às características de permeabilidade da membrana dos diferentes microrganismos: Gram-

positivo e Gram-negativo.

É conhecido que o peptidoglicano, na maioria dos casos das bactérias Gram-positivo, é

permeável a macromoléculas e, de um modo geral, não oferece resistência à difusão dos

antibacterianos (Ferreira e Sousa, 2010; Silhavy, et al., 2010). Por outro lado, e no que

concerne às bactérias Gram-negativo, estas apresentam uma maior resistência à passagem

de substâncias para o meio intracelular. A membrana externa, que tem como função a defe-

Resultados e Discussão

65

sa para as condições adversas de alguns ambientes constitui uma barreira para as moléculas

de grande peso molecular e hidrófobas (Nikaido, 2001). Na referida membrana existem

ainda algumas proteínas, como é o caso das porinas que são proteínas transmembranares

que atuam como canais hidrófilos e permitem a difusão, através da membrana, de molécu-

las com baixo peso molecular para o espaço periplasmático e, em seguida, para o interior

da célula. Outras moléculas responsáveis pela impermeabilidade da membrana externa a

antibacterianos, corantes hidrofóbicos, detergentes e sais são os LPS. Estas moléculas anfi-

páticas contribuem para a carga negativa da superfície bacteriana. (Delcour, 2009; Ferreira

e Sousa, 2010).

A passagem dos aniões (HS- e SO4

2-) para o interior da célula através da membrana pode

ser dificultada nas bactérias Gram-negativo pela possível existência da repulsão de cargas.

Nas bactérias Gram-positivo há uma maior permeabilidade da membrana, a sua passagem

para o interior da célula ou a sua ligação com algum componente intracelular talvez possa

revelar-se tóxica para a célula bacteriana.

De salientar, que se desconhece a existência de literatura relativa ao processo pelo qual a

água termal interfere no crescimento de S. aureus ou de outras bactérias, havendo por isso,

a necessidade de realizar estudos neste âmbito.

No que concerne aos restantes iões presentes na água termal do Cró e a sua possível ação

bactericida, Inoue et al. (1999) e Akiyama et al. (2000) descreveram a atividade bacterici-

da do ião manganésio em águas termais com pH ácido.

Lemire et al. (2010) evidenciaram num estudo a ação bactericida do alumínio e Dankovich

e Gray (2011) estudaram a ação bactericida da prata. De salientar também, que estes iões

se encontram presentes na água termal do Cró como componentes vestígiais (Anexo 1).

A partir de estudos estatísticos comparativos analisou-se também o crescimento das dife-

rentes bactérias do presente estudo quanto à sua origem (hospitalar e comunidade). Contu-

do, não foram encontradas quaisquer diferenças estatisticamente significativas. Assim sen-

Resultados e Discussão

66

do, a origem dos isolados bacterianos não parece ter influenciado o crescimento das bacté-

rias do presente estudo.

Quanto aos discos impregnados com água termal e água desionizada, observou-se a ausên-

cia dos halos de inibição em todos os isolados bacterianos. Estes resultados relativamente

às bactérias E. coli, A. baumannii e P. aeruginosa encontram-se concordantes com os obti-

dos entre os diferentes meios de cultura. No que concerne ao S. aureus, a ausência de halo

de inibição pode ter sido verificada pela reduzida quantidade de água termal com que os

discos foram impregnados. De salientar, que esta estirpe só apresentou diminuição de cres-

cimento nos meios de cultura com maior concentração de água termal (TCS 100% e 75%

termal).

Para as estirpes de ATCC®

: 25922™

, 29213™

, 17978™

e 27853™

também se verificou, em

todas elas, ausência de halo de inibição.

67

CAPÍTULO 4

Conclusão e Perspetivas Futuras

Conclusão e Perspetivas Futuras

68

4 – Conclusão e Perspetivas Futuras

Atualmente, a terapia termal não reúne um consenso unânime. Embora a sua eficácia tera-

pêutica seja, na generalidade, reconhecida, os mecanismos da sua ação permanecem em

grande parte desconhecidos.

No presente estudo observou-se o crescimento de três bactérias Gram-negativo (E. coli, A.

baumannii e P. aeruginosa) em meios de cultura TCS preparados com diferentes concen-

trações de água termal, demonstrando-se que esta não interferiu no crescimento das referi-

das bactérias, ou seja, não se verificou ação bactericida por parte da água termal.

Por outro lado, registou-se uma diminuição do crescimento dos isolados da bactéria Gram-

positivo S. aureus nos diferentes meios de TCS, à medida que aumentou a percentagem de

água termal do meio, indicando uma possível ação bactericida sobre esta estirpe bacteriana.

No entanto, este efeito terá de ser validado com um número de amostras mais alargado e

um maior número de ensaios.

Sugere-se assim a realização de futuros trabalhos, de forma a colmatar as limitações do

presente estudo, no sentido de perceber de que forma a água termal interfere no

crescimento de S. aureus e se é específica para esta estirpe ou se extende a outras bactérias

Gram-positivo, nomeadamente Enterococcus e Streptococus pneumoniae.

De forma a identificar o componente presente na água termal do Complexo do Cró, que

interfere com o crescimento de S. aureus será necessário realizar outros testes laboratoriais.

Com este intuito, poderia adicionar-se, isoladamente, aos meios de cultura preparados com

água desionizada os iões presentes na água termal do Complexo do Cró, sendo

posteriormente inoculados com a estirpe em estudo.

A visualização da parede celular das bactérias, por microscopia eletrónica, antes e após

inoculação em meios preparados com água termal também poderá ajudar a avaliar o efeito

da água termal sobre as bactérias.

Conclusão e Perspetivas Futuras

69

A aplicação destas águas termais pode vir a revelar-se importante sobretudo no ambiente

hospitalar, podendo ser utilizadas para lavar feridas, ajudando simultaneamente no proces-

so de cicatrização. A ação bactericida destas águas pode também ser de grande utilidade,

no que concerne aos indivíduos portadores de S. aureus.

O uso da terapêutica termal, nestes e noutros casos, poderá revelar-se menos agressiva e

menos dispendiosa, por comparação aos métodos de terapêutica química (Messina, et al.,

1999). De forma similar poderão ser um incremento importante no controlo das IACS.

70

CAPÍTULO 5

Bibliografia

Bibliografia

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87

Anexos

Anexo 1

88

Anexo 1

89

Anexo 2

90

Anexo 2

91

Anexo 3

92

Resultados dos testes de normalidade

Estirpe

Variável

E. coli

(n = 15)

P. aeru-

ginosa

(n = 15)

A. bau-

mannii

(n = 15)

S. aureus

(n = 15)

Total

(n = 60)

Idade 0.001 0.246 0.001 0.780 <0.001

pH da água desionizada 0.008 0.014 0.004 0.008 <0.001

pH da água termal 0.002 0.002 0.001 0.002 <0.001

Condutividade da água desionizada 0.028 0.021 0.040 0.028 <0.001

Condutividade da água termal <0.001 0.001 <0.001 <0.001 <0.001

Temperatura da água desionizada 0.006 0.006 0.004 0.006 <0.001

Temperatura da água termal 0.001 0.001 0.001 0.001 <0.001

pH do meio 100% termal 0.083 0.098 0.130 0.083 <0.001

pH do meio 75% termal <0.001 0.001 <0.001 <0.001 <0.001

pH do meio 50% termal 0.125 0.142 0.191 0.125 <0.001

pH do meio 25% termal 0.001 0.002 0.001 0.001 <0.001

pH do meio 0% termal 0.001 0.001 0.001 0.001 <0.001

pH do Pastagar B com água desionizada <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

pH do Pastagar B com água termal <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

UFC/mL no meio 100% termal 0.834 0.001 0.728 0.136 <0.001

UFC/mL no meio 75% termal 0.682 0.002 0.912 0.508 <0.001

UFC/mL no meio 50% termal 0.142 0.105 0.909 0.460 <0.001

UFC/mL no meio 25% termal 0.635 0.010 0.997 0.237 <0.001

UFC/mL no meio 0% termal 0.417 0.074 0.426 0.274 <0.001

UFC/mL no Pastagar B com água desionizada --- <0.001 0.290 --- <0.001

UFC/mL no Pastagar B com água termal --- 0.002 0.351 --- <0.001