ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICA DE

Schinus terebinthifolius CONTRA Burkholderia cenocepacia

Adriana de Araujo Sacramento

Rio de Janeiro

2012

ADRIANA DE ARAUJO SACRAMENTO

Aluna do Curso de Ciências Biológicas Matricula 0823800162

ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTERISTÁTICA DE

Schinus terebinthifolius CONTRA Burkholderia cenocepacia

Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,

apresentado ao Curso de Graduação em

Ciências Biológicas do Centro Universitário

Estadual da Zona Oeste, UEZO, como parte

dos requisitos para obtenção do grau de

Biológo, sob orientação da Profª Drª Maria

Cristina de Assis.

Rio de Janeiro

2012

Sacramento, Adriana A, 2012

Atividade Bactericida de Shinus terebinthifolius contra Burkholderia cenocepacia /

Adriana de Araujo Sacramento,2012.

viii, 26 p.il;

Trabalho de conclusão de curso- Centro Universitário Estadual da Zona

Oeste- UEZO, 2012.

Orientador: Maria Cristina de Assis

Co-Orientador: Alaíde de Sá Barreto

1 Atividade Bactericida, 2 Burkholderia cenocepacia, 3 Crescimento

planctônico e séssil, 4 Schinus terebinthifolius

__Trabalho de Conclusão de Curso. I. Barreto, Alaíde de Sá, II.Assis, Maria

Cristina. II. Centro Universitário Estadual da Zona Oeste.III. Atividade Bactericida

de Shinus terebinthifolius contra Burkholderia cenocepacia.

ii

ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTEROSTÁTICA DE

Schinus terebinthifolius CONTRA Burkholderia cenocepacia

Elaborado por Adriana de Araujo Sacramento Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau......................................

Rio de Janeiro, 16 de julho de 2012.

Maria Cristina de Assis, Dra (Presidente da Banca e Orientadora)

Alaíde de Sá Barreto, Dra (Co- Orientadora)

Cristiane Pimentel Victório, Dra (examinador 01)

João Bosco de Salles, Dro (examinador 02)

RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL

iii

DEDICATÓRIA

A Deus, por estar comigo, conduzindo meus passos, me

dando força e sabedoria. Aos meus pais e ao meu irmão que

me deram condições de estar aqui e acreditaram sempre nas

minhas conquistas, ao meu noivo pela compreensão e

dedicação e a minha orientadora Maria Cristina pelo carinho e

exemplo de profissionalismo.

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus que me deu força e sabedoria para trilhar mais um caminho

em minha vida.

Aos meus pais pelo apoio e a confiança que depositaram em mim.

Ao meu irmão Adriano que esteve comigo em todos os momentos, me aconselhando,

dando força, e acreditando em mim.

Ao meu noivo Marlon pelo incentivo e compreensão em todos os momentos.

À minha orientadora, Doutora Maria Cristina, pela sua enorme disponibilidade,

atenção, conselhos e carinho. Obrigada!

A professora Cristiane Pereira (UFRJ) pela disponibilidade, grande ajuda e atenção!

A professora Alaíde pelo trabalho e alegria.

Agradeço as minhas amigas Karina Costa e Ana Paula Nogueira por estarem comigo

nos momentos em que pensei em desistir!

Agradeço as minhas irmãs científicas Juliana Chal e Ezaine Torquato pela alegria,

companheirismo, apoio e amizade.

Agradeço aos meus amigos de Laboratório Adriano Pereira, Verônica Torres e

Thiago Alves pela ajuda nos momentos necessários, pela alegria e amizade.

A todos os colegas de laboratório pelo amadurecimento e crescimento profissional.

A todos os professores pelos ensinamentos na vida acadêmica e profissional.

v

SUMÁRIO

Página

Resumo............................................................................................................................................ viii

Abstract...................................................................................................................... ..................... ix

1. Introdução.................................................................................................................................... 1

1.1 O complexo Burkholderia cepacia.............................................................................................. 1

1.2 Fatores de Virulência................................................................................................................... 3

1.2.1 Mecanismos de resistência de B. Cepacia.................................................................... 7

1.3 Fibrose Cística....................................................................................................................... 8

1.3.1 Fibrose Cística e B. cepacia....................................................................................... 11

1.4 Schinus terebinthifolius......................................................................................................... 12

2. Justificativa.............................................................................................................. .................... 14

3. Objetivos.................................................................................................................. .................... 15

3.1 Objetivo Geral..................................................................................................................... 15

3.2 Objetivos Específicos.................................................................................................................. 15

4. Materiais e Métodos.................................................................................................................... 15

4.1 Schinus terebinthifolius......................................................................................................... 15

4.2 Preparação dos Extratos....................................................................................................... 16

4.3 Caracterização Organoléptica............................................................................... .................... 16

vi

4.4 Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius.......................................................... 16

4.5 Amostras Bacterianas......................................................................................... ............................ 17

4.6 Determinação da atividade antibacteriana in vitro do extrato aquoso Schinus terebinthifolius

contra B cenocepacia............................................................................................................................

17

4.7 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra B. Cenocepacia em Crescimento Planctônico.................................................

18

4.8 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. Cenocepacia em Crescimento Séssil..........

19

4.9 Avaliação do perfil químico de Schinus terebinthifolius por cromatografia em camada

delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).....................................................

20

4.10 Análise Estatística...................................................................................................................... 21

5. Resultados...................................................................................................................................... 21

5.1 Características organolépticas da espécie Schinus terebinthifolius................................................ 21

5.2 Atividade bactericida do extrato Schinus terebinthifolius contra a cepa ET-12 em crescimento

planctônico........................................................................................................................................

21

5.3 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 B. Cenocepacia em Crescimento

Planctônico...........................................................................................................................................

22

5.4 Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius.......................................................... 23

5.5 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra isolados clínicos B. Cenocepacia em Crescimento Planctônico...................

24

5.6 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. Cenocepacia em Crescimento Séssil..........

25

5.7 Comparação da atividade bactericida de S. terebinthifolius contra B. cenocepacia em

crescimento planctônico e séssil..........................................................................................................

27

vii

5.8 Avaliação do perfil químico de S. terebinthifolius por cromatografia em camada delgada

(CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)...............................................................

27

6. Discussão........................................................................................................................................ 29

7. Conclusões..................................................................................................................................... 32

8. Perspectivas................................................................................................................................... 32

9. Referências Bibliográficas............................................................................................................. 33

viii

RESUMO

Burkholderia cenocepacia é um patógeno oportunista que está frequentemente associada a

pacientes com fibrose cística (FC), estando relacionada a infecções graves em pacientes

fibrocísticos, quadros estes caracterizados por pneumonia necrosante com deterioração

pulmonar aguda levando à sepse, quadro clínico chamado de síndrome cepacia. A cepa

epidêmica ET-12 é virulenta em pacientes com FC, com alta resistência a antibióticos,

principalmente associada à formação em biofilme. Portanto, o objetivo deste trabalho é

determinar a atividade bactericida in vitro do extrato aquoso de Schinus terethinfolius

frente à cepa ET-12 em crescimento planctônico e séssil. A atividade bactericida em

crescimento planctônico do extrato foi determinada por ensaio quantitativo que consistiu

na microdiluição em meio Luria Bertani do extrato em placas de 96 poços em

concentrações variadas. A determinação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL)

foi realizada por diluição e semeadura em meio Azul de Bromotimol (CLED). A inibição

do crescimento em estado séssil, foi realizado a partir de uma suspensão bacteriana com

DO680nm=0.2, que foi inoculada em placas de 96 poços e cobertas com tampas contendo

espículas. As espículas após 24 horas foram transferidas para nova placa contendo

diferentes concentrações do extrato e a determinação das UFC/mL foi realizada por

diluição e semeadura em CLED. Em crescimento planctônico podemos observar que houve

atividade bactericida nas concentrações de 20mg/mL e 10mg/mL e bacteriostática nas

concentrações de 5 mg/mL. Em crescimento séssil há um menor efeito da atividade

bactericida do extrato, mesmo na concentração de 20mg/mL, confirmando a alta

resistência bacteriana em biofilme. O perfil químico do extrato determinado por

cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência sugere como

componentes majoritários flavonóides e taninos. O extrato de S.terebinthifolius pode ser

uma alternativa no tratamento contra B. cenocepacia podendo contribuir com a qualidade

de vida dos indivíduos com fibrose cística.

Palavras Chaves: atividade bactericida, Burkholderia cenocepacia, crescimento

planctônico e séssil, Schinus terethinfolius.

ix

ABSTRACT

Burkholderia cenocepacia is an opportunistic pathogen that is often associated with

patients with cystic fibrosis (CF), being related to severe infections in CF patients, these

frames are characterized by necrotizing pneumonia with acute lung damage leading to

sepsis, the clinical syndrome called cepacia. The ET-12 epidemic strain is virulent in CF

patients, with high resistance to antibiotics, mainly associated with the formation of

biofilm. Therefore, the objective of this study is to determine the in vitro bactericidal

activity of aqueous extract of Schinus terethinfolius front of the ET-12 strain growing

planktonic and sessile. The bactericidal activity of the extract planktonic growth was

determined by quantitative assay which consisted of Luria Bertani broth microdilution in

the extract in 96 well plates at varying concentrations. Determination of Colony Forming

Units (CFU/mL) was performed by dilution and inoculation in Blue Bromothymol

(CLED). Growth inhibition state sessile was performed from a bacterial suspension

DO680nm = 0.2, was inoculated into 96 well plates and covered with lids containing

spikes. Spikes after 24 hours were transferred to new plate containing different

concentrations of the extract and the determination of CFU/mL was performed by dilution

and seeding on CLED. Planktonic growth can be observed that there was bactericidal

activity at concentrations of 20mg/ml and 10mg/mL and bacteriostatic at concentrations of

5 mg/mL. In sessile growth is less of an effect of the bactericidal activity of the extract,

even at a concentration of 20mg/ml, confirming the high resistance in bacterial biofilms.

The chemical profile of the extract determined by thin layer chromatography and high

performance liquid chromatography suggested as major components of flavonoids and

tannins. The extract of S. terebinthifolius can be an alternative treatment against B.

cenocepacia may contribute to the quality of life of individuals with cystic fibrosis.

Keywords: bactericidal activity, Burkholderia cenocepacia, planktonic and sessile growth,

Schinus terethinfolius

1

1- Introdução

1.1 Complexo Burkholderia cepacia

Burkholderia cepacia (Figura 1), denominada inicialmente de Pseudomonas

cepacia, foi descrita em 1950 por Willian Burkholder como um patógeno de plantas

capaz de causar apodrecimento dos bulbos de cebolas (Burkholder, 1950), e capaz de

uma variedade de interações complexas, tais como a degradação de poluentes

aromáticos complexos (O’Sullivan &Mahenthiralingam, 2005), a proteção e promoção

de crescimento de plantas (Parke & Gurian-Sherman, 2001) e a infecção de seres

humanos e animais, além de causar doenças de plantas (Mahenthiralingam et al., 2005).

A taxonomia do gênero Burkholderia vem passando por várias revisões significativas ao

longo do tempo. Muitas espécies do gênero Burkholderia foram por muitos anos

incluídas dentro do gênero Pseudomonas por causa da extensa e indeterminada

descrição fenotípica. Análises de hibridização RNAr-DNA apresentaram diversidade

genética entre os membros desses dois gêneros (Yabuuchi et al., 1992). Em meados dos

anos de 1990, foi demonstrado pertencer ao conjunto, pelo menos cinco espécies

distintas, que foram classificadas como Complexo Burkholderia cepacia (CBC).

Figura1: Burkholderia cepacia

Fonte: eol.org

Análises taxonômicas revelaram que estes microganismos são genotipicamente

diferentes e fenotipicamente semelhantes. O CBC foi composto incialmente por nove

espécies distinguidas por técnicas moleculares em B. cepacia, B. multivorans, B.

cenocepacia, B. stabilis, B. vietnamiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina e B.

Pyrrocinia. Atualmente a posição taxônomica de clusters gênicos recA de isolados do

2

CBC foi determinada através de taxonomia polifásica propondo mais oito novas

espécies: B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B.

contaminans e B. lata (Vanlaere et al.,2009). Sendo assim, pertencem ao Complexo

Burkholderia cepacia, até o momento 17 espécies. Todas essas espécias foram isoladas

de escarro de pacientes com Fibrose Cística (FC), com exceção da Burkholderia

ubonensis, sendo predominante as espécies Burkholderia cenocepacia e Burkholderia

multivorans (Vanlaere et al., 2009).

Estas espécies são caracterizadas como bactérias Gram-negativas, aeróbias, não

formadoras de esporos, móveis, catalase e oxidase positiva, além da produção de

pigmentos fluorescentes e polihidroxialcanoatos como reserva de materiais, sendo sua

temperatura ótima de crescimento em torno de 30 °C e 35 °C (Palleroni & Genus,

1984).

Bactérias do Complexo B. cepacia são comumente encontradas no solo, água e

plantas. São fitopatógenos, podendo estar associadas à rizosfera de várias culturas,

como ervilha, milho, arroz e trigo. Podem ser usadas como agentes de biorremediação

por possuir a capacidade de metabolizar hidrocarbonetos clorados, que são encontrados

em pesticidas e herbicidas comerciais, incluindo o ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético

(2,4,5-T), havendo a possibilidade de serem adicionadas em ambientes contaminados

por estas toxinas (Willians & Wilkins, 1989). Ainda podem ser usadas em controle

biológico, porque podem produzir antibióticos contra fungos patogênicos em plantas.

Contrastando com os fortes interesses econômicos, as bactérias do CBC

emergiram nas últimas duas décadas como patógenos oportunistas principalmente em

portadores de fibrose cística. No entanto, a sua patogenicidade não se limita à

população com FC, sendo um agente etiológico importante na granulomatose crônica,

imunossuprimidos, infecções em feridas, peritonites, artrites sépticas, afetando,

também, pessoas saudáveis. Portanto, são preocupantes os riscos de sua utilização como

um agente de controle biológico (Butler et al., 1995).

A espécie B. cenocepacia é a mais frequentemente isolada nos pacientes com

FC, e está associada a infecções graves nos mesmos, caracterizadas por pneumonia

necrosante com deterioração pulmonar aguda associada à sepse, quadro clínico este

chamado de síndrome cepacia (Isles, Maclusky & Corey,1984).

3

1.2 Fatores de Virulência de B. cepacia

As bactérias do Complexo B. cepacia possuem um DNA muito extenso, que é

dividido em dois ou mais replicons, oferecendo flexibilidade na aquisição, na perda e

expressão de genes (Mahenthiralingam; Baldwin & Dowson, 2008).

Os microrganismos que formam este complexo exibem vários fatores de

virulência, os quais incluem: pili (Sajjan et al., 1995), flagelo (Tomich et al., 2002),

produção de proteases, lipases, lipopolissacarídeo (LPS), formação de biofilme

(Courtney et al., 2004), sistema “quorum sensing” (Lewenza et al., 1999; Huber et al.,

2001) e sistema de secreção do tipo III (SSTT) (Tomich et al., 2003).

Existem alguns fatores que são determinantes para causar a infecção, como por

exemplo, a motilidade, a aderência, o dano tecidual e a formação de biofilme (Cunha et

al., 2004).

A adesão ao trato respiratório é um importante fator na colonização deste

patógeno. A expressão da adesina “cable pili”, tem sido demonstrado na linhagem

altamente transmissível ET-12 (eletrophoretic type 12) de B. cenocepacia, que carrega

um gene, denominado cblA, que é a adesina responsável pela aderência da bactéria na

célula epitelial (Davies & Rubin, 2007). O fato deste gene não estar presente em todos

os clones epidêmicos sugerem que outros fatores bacterianos podem estar envolvidos.

Outros fatores de virulência importantes são os sistemas de secreção de

proteínas bacterianas, que podem ser definidos como mecanismos capazes de exportar

produtos produzidos intracelularmente para o meio extracelular. Em bactérias Gram-

negativas, existem seis destes mecanismos de secreção (Winans et al.,1996).

O sistema tipo II de secreção tem sido identificado em B. cepacia e parece ser

responsável pela secreção de lipase, uma enzima importante na invasão de células

epiteliais pulmonares (Gotschlich et al., 2001). Além disso, parece ser importante na

secreção de metaloproteases de zinco, ZmpA e ZmpB, que são proteoliticamente ativas

contra proteínas da matriz extracelular, compreendendo o colágeno tipo IV e a

fibronectina (Kooi et al., 2006).

Outro fator de virulência que tem se demonstrado importante na invasão

intracelular, é a liberação da serina protease, HtrA (Pedersen et al, 2001;Wilson et al.,

2006). Esta serina protease também tem a capacidade de utilizar a ferritina como fonte

4

de ferro, e isso gera uma vantagem significativa para o CBC já que o pulmão de um

fibrocístico apresenta níveis mais elevados de ferritina (Whitby et al., 2006).

O sistema de secreção tipo III (SSTIII) é especializado em permitir que proteínas

efetoras transportem produtos bacterianos diretamente para o citoplasma da célula

hospedeira, sendo, portanto chamado de sistema secretor contato dependente (Cornelis

& Van Gijsegem, 2000). As proteínas translocadas para a célula hospedeira alteram as

funções celulares estabelecendo diversas relações como a patogênese para benefício

próprio (Mota et al., 2005). Tomich et al (2003) demonstraram que o SSTIII é

importante na sobrevivência de B. cenocepacia em infecções em murinos.

O sistema de secreção tipo IV recentemente descrito em B. cenocepacia, é

necessário para causar doença em cebolas e para a sobrevivência intracelular em células

epiteliais e macrófagos (Valvano & Loutet, 2010). O tipo VI (T6SS) também

identificado em B. cenocepacia, na qual sua expressão é regulada negativamente pelo

sensor do regulador de quinase-resposta ATSR . Experimentos in vitro demonstraram

que o T6SS também é necessário para proteção contra a predação pela ameba

Dictyostelium discoideum. Além disso, demonstraram que macrófagos infectados com

B. cenocepacia que superexpressam T6SS induziram a projeções celulares em

macrófagos favorecendo sua internalização em vacúolos (Valvano & Loutet, 2010).

A primeira vez que o termo lipopolissacarídeo foi utilizado, foi para descrever

uma endotoxina, obtida através do método de extração fenólica da parede celular de

diversas cepas de bactérias Gram-negativas. Devido a sua função biológica, sua

estrutura é essencial para relação bactéria-hospedeiro (Westphal & Jann, 1965).

O CBC possui LPS diferente de outros microrganismos Gram-negativos, isso

por causa da diferença no núcleo de oligossacarídeos e também na porção do lípidio A

(Silipo et al., 2007). O LPS coopera para resistência à peptídeos antimicrobianos e

induz a uma resposta pró-inflamatória considerável (Bamford et al., 2007), além disso o

LPS de B. cenocepacia induziu a secreção de IL-8 em células epiteliais de vias aéreas,

mostrando ser mais potente que o LPS de outras espécies bacterianas (Reddi et al.,

2003).

Tem sido descrito que cepas do CBC crescem como biomassa nas secreções

pulmonares, possuindo a habilidade de formar biofilmes in vitro (Caraher et al., 2006).

Os biofilmes, definidos como complexos ecossistemas microbianos, podem ser

5

formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies,

podendo ser encontrados em uma variedade de superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta

maneira, muitos autores definem biofilmes como associações de microrganismos e de

seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou

abióticas (Rickard et al.,2002). Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme

ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos organismos denominados colonizadores

primários, que aderem a uma superfície. A sua composição pode conter proteínas ou

outros compostos orgânicos onde suas células aderidas passam a desenvolver-se,

originando microcolônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS). Essas

matrizes EPS passam a atuar como substratos para a aderência de microrganismos

denominados colonizadores secundários, que podem se aderir diretamente aos primários

(Figura 2).

Figura 2- Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonização primária de um

substrato; (b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com

o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células

coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas

espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro. (Adaptado

de Rickard et al.,2002)

A natureza da estrutura do biofilme e os atributos fisiológicos dos organismos

6

promovem a persistência das infecções e uma resistência inerente aos antibióticos. Os

mecanismos responsáveis pela resistência podem ser: (i) retardo da penetração do

agente antimicrobiano através da matriz do biofilme, (ii) diminuição da taxa de

crescimento do biofilme (iii) mudanças ambientais que regulam o crescimento e a

composição do biofilme. O primeiro caso, a substância da matriz que são polímeros

extracelulares apresenta uma barreira para difusão das moléculas do antibiótico, assim

influenciando a taxa do transporte das moléculas para o interior do biofilme,

configurando assim uma barreira física. O segundo é a ineficiência da droga em

decorrência de taxas de crescimento muito lentas no interior do biofilme. Estudos que

determinaram a taxa de crescimento planctônico e da formação de biofilme, por

bactérias de Escherichia coli, observaram um crescimento mais lento do biofilme em

relação à formação planctônica, proporcionando maior resistência ao antibiótico

cetrimida (Evan, 1999). O terceiro caso é quando ocorre a participação de fatores

ambientais como pressão osmótica, deficiência de nutrientes, calor, danos oxidativos no

DNA, etc, na regulação do crescimento e a composição do biofilme. Em relação à fase

de maturação, trabalhos anteriores demonstraram que o “quorum sensing”, definido

como um mecanismo de comunicação através do qual bactérias regulam a expressão de

conjuntos de genes especializados em resposta à densidade celular e desempenham um

papel importante na maturação de biofilme (Huber et al., 2001).

Bactérias infecciosas que utilizam o sistema de “quorum sensing” são mais

virulentas por secretarem peptídeos que sinalizam a expressão de fatores de virulência

quando em alta densidade celular, evitando assim o reconhecimento precoce pelo

sistema imune. Burkholderia cepacia sintetiza N-acil homoserina lactona (AHL). As

AHL não controlam somente a expressão dos genes de virulência bacteriana, mas estão

também envolvidas em estimular a maturação de biofilmes resistentes a antibióticos

(Ward et al., 2003).

Importante consequência da formação de biofilme com profundas implicações

clínicas incluem o aumento da resistência a antibióticos, a desinfetantes e proteção

contra as defesas do hospedeiro (Caraher et al., 2006).

1.2.1 Mecanismos de Resistência a Antibióticos de Burkholderia cepacia

7

As bactérias do CBC possuem uma resistência intrínseca decorrente de vários

mecanismos: i) permeabilidade seletiva na parede celular, causada pela mudança no

envelope da célula bacteriana; ii) alterações na estrutura do lipopolissacarídeo; iii)

presença de várias bombas de efluxo multidroga, que expulsam o antibiótico da célula;

iv) além da formação de biofilme, que provoca a dificuldade de contato do antibiótico

com a superfície da célula bacteriana (Lacy et al, 1993).

O Complexo Burkholderia cepacia possui alta resistência à maioria dos

antibióticos. Este problema é agravado pelo desenvolvimento de resistência durante a

terapia (Wigfield et al., 2002). A terapia para pacientes com fibrose cística pode ser

destinada apenas a diminuir a carga bacteriana pulmonar e reduzir a resposta

inflamatória do hospedeiro, mas não à erradicação de B. cepacia (Davies & Rubin,

2007).

A resistência de Burkholderia cepacia à antibioticoterapia pode ser em

decorrência de um DNA muito extenso, medindo de 4,0 a 9,0 Mb, sendo capaz de sofrer

diversas mutações, adaptando-se a vários ambientes. É resistente aos aminoglicosídeos,

quinolonas, polimixinas, devido ao incomum componente LPS de suas membranas

celulares, e a β-lactâmicos devido à produção de betalactamases. O tratamento de

indivíduos com infecções por bactérias do CBC geralmente incluem a combinação com

dois ou três antibióticos com atividade sinérgica como o β-lactâmico (meropenem ou

ceftazidina), a ciprofloxacilina, a tobramicina, o cloranfenicol, a minociclina ou a

rifampicina. Contudo, estas combinações não levam a erradicação total do

microrganismo (Lacy et al., 1993)

Um estudo realizado por Peeters et al. (2009) para determinar a atividade in

vitro da ceftazidima, da ciprofloxacina, do meropenem, da minociclina, da tobramicina

e do trimetoprim contra as formas planctônicas e sésseis de Burkholderia cepacia

confirmou a resistência inata do B. cepacia a esses antibióticos usados em pacientes

fibrocísticos infectados por esses patógenos. Todos os antibióticos mostraram

semelhantes atividades bacteriostáticas contra B. cepacia em células planctônicas e

sésseis. Meropenem, minociclina e ceftazidima apresentaram a melhor Concentração

Mínima Inibitória (CIM) em concentrações clinicamente relevantes. Embora esses

microrganismos sejam tipicamente resistentes a aminoglicosídeos, altas doses de

8

tobramicina inibiu a maioria das cepas testadas. No entanto, o uso terapêutico de

concentrações mais elevadas de antibióticos não é recomendado por sua citotoxicidade.

Rodley et al.(1995) propuseram que em B. cepacia, a baixa permeabilidade da

membrana não parece ser suficiente para explicar os elevados níveis de resistência

exibidos. Segundo Rodley e colaboradores, foram identificados em B. cepacia genes

homólogos aos que constituem o operon mexA-mexB-oprM de P. aeruginosa, sendo que

neste microrganismo codificam três proteínas transportadoras MexA, MexB e OprM,

envolvidas na expulsão ativa de drogas. Este operon está envolvido na resistência a uma

ampla gama de antibióticos, incluindo a tetraciclina, o cloranfenicol, as

fluoroquinolonas, e alguns β-lactâmicos. No caso de P. aeruginosa, a proteína MexB

parece ser responsável pelo efluxo de substâncias através da membrana interna

enquanto que à proteína OprM é atribuído o efluxo através da membrana externa. A

proteína MexA, por sua vez, é considerada uma proteína de fusão membranar. A

presença simultânea das três parece ser necessária à multirresistência. Com base na

sequência de nucleotídeos publicada do gene opcM de B. cepacia (homólogo do gene

oprM de P. aeruginosa) e através da técnica de PCR, foi possível inferir sobre a

presença deste gene em alguns dos isolados, que eram exatamente os mais resistentes a

antibióticos, através da amplificação de um fragmento de aproximadamente 540 bp.

1.3- Fibrose Cística

A fibrose cística é comumente diagnosticada em descendentes europeus, com

uma frequência de um (1) doente para cada 3.200 nascidos vivos (Quinton, 2007). Em

negros essa doença é mais rara, acometendo (1) doente para cada 15.000 nascidos vivos,

para hispânicos essa incidência é de (1) doente para 9.200, e para asiáticos é de (1) para

10.000 (Boyle,2007). No mundo inteiro, mais de 50.000 indivíduos são afetados e muito

mais pessoas carregam o gene defeituoso que causa a fibrose cística (Govan & Deretic,

1996).

A Fibrose Cística ainda é uma doença incurável, porém conhecimentos novos

sobre a etiologia e a fisiopatologia da doença, adquiridos nas últimas décadas, sugerem

novas formas de tratamento, auxiliando no aumento da sobrevida e gerando

possibilidades de cura da doença. Quando os primeiros diagnósticos de Fibrose Cística

foram identificados, quase todos os acometidos por essa doença morriam ainda no

9

primeiro ano de vida. Atualmente com o diagnóstico precoce e acesso ao tratamento

adequado, quase metade dos pacientes sobrevivem por mais tempo, e há ainda muitas

perspectivas de um futuro promissor (Ribeiro et al., 2002).

Essa doença é caracterizada por uma falha das glândulas de secreção exócrina do

organismo, como glândulas sudoríparas, bronquiais, do intestino, do pâncreas exócrino,

salivares e hepáticas. As mucosidades produzidas por essas glândulas são muito

espessas e dificultam a produção de enzimas do pâncreas e a expulsão das secreções

mucosas dos brônquios. Essas obstruções causam deficiências no aparelho digestivo e

nas vias respiratórias, gerando nos pulmões, o início da colonização por diversos

microrganismos de difícil erradicação (Kroll&Terra, 1999).

A Fibrose Cística, antigamente conhecida como mucoviscidose, é uma doença

autossômica recessiva, sistêmica e hereditária causada por um defeito no gene regulador

do canal de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR – cystic fibrosis

transmembrane regulator), localizado no braço longo do cromossomo 7, no lócus q31,

formado por 250kb de ácido desoxirribonucléico (DNA). Com 27 éxons, esse gene

origina um mRNA de 6,5kb, que transcreve a proteína CFTR, de aproximadamente

1480 aminoácidos (Rommens et al., 1989).

A CFTR (Figura 3) também denominada de “canal de cloro” sofre maturação em

organelas citoplasmáticas, sendo assim ela é encontrada na membrana apical das

células. Essa proteína define a formação de canais de cloreto em células epiteliais de

glândulas exócrinas, sendo de extrema importância para o transporte iônico através da

membrana celular, pois é responsável pela regulação do fluxo de cloro, sódio e água

(Boucher, 2004; Vankeerberghen et al., 2002).

Figura 3 – Estrutura da CFTR (canal de cloro)

Fonte: Tratado de Clinica Médica (2009)

10

Muitas mutações naturais já foram estabelecidas no gene da Fibrose Cística, mas

a que ocorre com maior frequência é a deleção de três pares de bases, a qual gera a

perda do aminoácido fenilalanina na posição 508 da proteína CFTR, acarretando danos

na função da mesma. As mutações causadas pela presença de dois alelos provocam

danos como a ausência da atividade ou funcionamento parcial da CFTR, gerando

diminuição na excreção do cloro e aumentando a eletronegatividade intracelular. Esse

aumento resulta em um maior fluxo de sódio para preservar o equilíbrio eletroquímico,

e posteriormente o fluxo de água para dentro da célula por osmose. Mutações do tipo I,

II e III apresentam manifestações clínicas mais graves, enquanto as mutações do tipo IV

e V apresentam manifestações clínicas mais leves (Knowles,1986).

A Fibrose Cística é uma doença multissistêmica, quando acomete o trato

respiratório geram alterações no líquido de superfície com desidratação das secreções

mucosas, aumentando a viscosidade, propiciando a obstrução ductular, levando a reação

inflamatória e posteriormente ao processo de fibrose (Knowles,1986). As alterações no

líquido de superfície e alterações no clearance mucociliar fazem com que substâncias

quimiotáticas do hospedeiro como interleucina-8 (IL-8) favorecem a migração de

neutrófilos aos pulmões. A presença de neutrófilos em números elevados nas vias aéreas

geram liberação de elastase e grande quantidade de DNA no muco, favorecendo o

aparecimento de substâncias pró-inflamatórias como citocinas, fator de necrose tumoral

IL-1, IL-6 e IL-8. Na FC a inflamação ocorre precocemente e precede a infecção,

levando a colonização bacteriana e a infecção das vias aéreas, causando dano pulmonar

irreversível.

A colonização das vias aéreas por bactérias oportunistas causam dano tecidual, e

dentre esses microrganismos podemos citar: Staphylococcus aureus, Haemophilus

influenzae, Pseudomonas aeruginosa, e Burkholderia cepacia. Outros patógenos como

as micobactérias não tuberculosas, vírus e fungos, especialmente Aspergillus spp,

também têm sido isolados em doenças pulmonares de pacientes com fibrose cística

(Gilligan,1991; Saiman & Siegel, 2004).

11

1.3.1- Fibrose Cística e B. cepacia

B. cepacia é um dos microrganismos mais importantes na colonização bacteriana

em pacientes fibrocísticos. A primeira colonização pulmonar por B. cepacia foi

confirmada nos anos 70. Muitos pacientes acometidos pela Síndrome de B. cepacia, que

se caracteriza por pneumonia necrosante com deterioração pulmonar, febre, bacteremia,

elevação da média de sedimentação de eritrócitos e leucocitose, passam a uma rápida

evolução clínica geralmente fatal no período de um ano após a colonização por este

microrganismo (Govan & Deretic,1996).

As infecções por B. cepacia apresentam três características importantes:

Manifestações clínicas, de rápido e fatal declínio pulmonar;

Disseminação de cepas epidêmicas que podem acometer pacientes fibrocísticos

ou não;

A multirresistência a antibióticos de isolados de B. cepacia. (Govan et al., 1993)

Estudos epidemiológicos demonstraram que a transmissão do CBC ocorre por

contato social (Mahenthiralingam, Baldwin & Vandamme, 2002).

Foi demonstrado também que cepas virulentas de B. cenocepacia podem

substituir outras variantes genômicas durante a infecção, como a B. multivorans,

sugerindo a importância do isolamento dos pacientes infectados (Courtney et al., 2004).

Além disso, existe um risco de infecção cruzada nos centros de tratamento de fibrose

cística e um cuidado com a higiene deve ser priorizado para reduzir a contaminação

(Campana et al., 2005). Essas cepas podem também gerar uma epidemia de impacto

internacional, como o ocorrido com a cepa epidêmica ET-12, que se disseminou para

muitas pessoas com FC do Canadá, Reino Unido e outros países europeus, causando

uma alta taxa de mortalidade associado à sua capacidade de causar a síndrome cepacia

(Govan et al., 1996).

A predominância de espécies CBC varia geograficamente, sendo B. cenocepacia

a espécie predominante nos centros de FC na América do Norte, enquanto B.

multivorans é a espécie mais comum em pacientes FC dos países europeus. Contudo,

contaminações causadas por outras espécies podem ter ocorrido em todo o mundo, pois

B. cepacia é raramente erradicada do trato respiratório de pacientes de FC, mesmo com

terapia antimicrobiana, por possuírem elevada resistência intrínseca a múltiplos

antibióticos. O tratamento para erradicar esses microrganismos é praticamente

12

impossível, sendo realizada uma antibioticoterapia muito agressiva, com combinações

de duas ou mais drogas para o controle da infecção (Mahenthiralingam et al., 2008 ).O

que leva a diferentes centros de pesquisa a investir em drogas alternativas para o

controle destas infecções.

1.4- Schinus terebinthifolius

Desde o início das civilizações os vegetais têm sido utilizados, não só como

fonte de alimento, mas também como medicamento. O ramo da medicina alternativa

que utiliza plantas no tratamento de doenças é a fitoterapia, que oferece soluções

eficazes e de baixo custo. As plantas medicinais têm grande importância na manutenção

das condições de saúde da população, visto que, a fitoterapia representa a cultura de um

povo, como um saber difundido ao longo de gerações, além de suas ações terapêuticas

(Tomazzoni et al., 2006).

Desde as mais antigas civilizações que o uso de plantas tem sido utilizado como

recursos terapêuticos. Muitas experiências com ervas obtiveram sucesso através da cura,

porém outras fracassaram ocasionando mortes ou graves efeitos colaterais (Tomazzoni

et al., 2006).

Os fitofármacos são considerados de baixa toxicidade no que diz respeito aos

seus efeitos colaterais, sendo comprovado por vários estudos clínicos. Contudo, existem

comprovações de efeitos adversos, relevantes para o tratamento. Como por exemplo, o

extrato de Hypericum perforatum, que causa virada maníaca e fotossensibilidade

(Andreatini, 2000).

Anacardiaceae é uma família botânica representada por 70 gêneros e cerca de

600 espécies de árvores ou arbustos, conhecidas por serem frutíferas e apresentarem

madeira de boa qualidade. Pertencem a esta família a Schinus terebinthifolius raddi,

popularmente conhecida como aroeira, corneíba ou cambuí. Esta planta é originária do

Peru e encontrada também na Europa, Ásia e outras regiões da América. No Brasil está

distribuída na vegetação litorânea, desde o Nordeste até o Sul do país. A árvore possui

porte grande, com casca fina e escamosa, suas folhas são compostas por folíolos

lanceolados e pontiagudos, possuem cutícula estriada, tricomas tectores unicelulares e

glandulares pluricelulares, drusas e prismas de oxalato de cálcio (Oliveira & Grotta,

1965), contém numerosas flores pequenas de cor branca ou amarelo esverdeado,

13

estando dispostas em pedículos. O fruto possui cor vermelha, é lustroso e contém um

odor característico semelhante à pimenta. A planta é catalogada em oito espécies

diferentes, sendo mais comum na América do Sul e do Norte (Coutinho et al., 2006; El-

Massry et al., 2009).

O uso medicinal da casca de Schinus terebinthifolius (Figura 4) foi descrito na

primeira edição da Farmacopéia Brasileira, em 1926 (Lucena et al., 2006).

Figura 4: Schinus terebinthifolius

Fonte: altervista.org

Alguns estudos têm demonstrado diferentes ações farmacológicas para S.

terebinthifolius como: atividade antiinflamatória (Gazzaneo et al., 2005),

antimicrobiana (Martínez et al., 1996; Melo-júnior et al., 2002; Schmourlo et al., 2005;

Lima et al., 2006), antioxidante (Velásquez et al., 2003) e antitumoral (Queires et al.,

2006).

Estudos fitoquímicos identificaram nesta espécie: fenóis, flavonóides, esteróides,

triterpenos, antraquinonas e saponinas (Lima et al., 2006). O schinol e o ácido

masticadienóico são responsáveis pela inibição competitiva específica da fosfolipase

A2. Os biflavonóides (amentoflavona, 2,3-dihidroamentoflavona e 2,3,2”,3”-

tetrahidroamentoflavona) são os principais metabólitos isolados de S. terebinthifolius, e

estão relacionados com sua ação antiinflamatória. O ácido hidroximasticadienóico, o

ácido terebinthifólico e o ácido ursólico, por sua vez, estão envolvidos na atividade

antimicrobiana, com demonstrações in vitro em algumas bactérias como Klebsiella

pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e espécies de fungos, em especial

14

do gênero Aspergillus (Jain et al., 1995; Amorim & Santos, 2003; Varela-barca et al.,

2007).

As principais partes de S. terebinthifolius relatadas em estudos científicos são: a

casca, entrecasca e as folhas (El-Massry et al., 2009).

A atividade antimicrobiana in vitro da aroeira foi testada sobre microrganismos

da cavidade oral, observando que o extrato hidroalcoólico desta planta apresentou

atividade bactericida e bacteriostática sobre Streptococcus mitis, Streptococcus

sobrinus, e Streptococcus sanguis como também ação antifúngica sobre Cândida

albicans, Cândida tropicalis e Cândida Krusei (Alves, 2005). Além disso, foi

comprovado que os extratos alcoólicos e aquosos de S. terebinthifolius introduzidos em

géis apresentaram atividade antimicrobiana contra as cepas padrões de S. aureus

ATCC6538 e ATCC9144 (Leal et al., 1996).

Em estudo realizado por Guerra e colaboradores foi observado que o extrato

etanólico a 30% da aroeira apresentou atividade antibacteriana sobre as cepas de

Escherichia coli, Pseudomonas auruginosa, Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis

(Guerra et al, 2000) demonstraram significativa atividade antibacteriana do extrato

etanólico a 80% desta planta sobre Candida albicans, comprovando a eficácia desta

planta como potente antimicrobiano (Martinez et al.,1996).

2- Justificativa

Burkholderia cenocepacia é um patógeno oportunista que frequentemente está

associado a infecções graves em pacientes com Fibrose Cística. Alguns estudos têm

demonstrado que B. cenocepacia é potencialmente virulenta, com alta resistência a

antibióticos, principalmente associada à formação de biofilme, o que dificulta o

tratamento de pacientes infectados por esta bactéria, mesmo com a combinação de dois

ou três antibióticos com atividade sinérgica e o uso de elevadas concentrações de

antibióticos (Peeters et al., 2009). Além disso, diversos estudos têm demonstrado os

diversos efeitos biológicos de Schinus terebinthifolius que poderiam contribuir para a

melhoria do quadro pulmonar, tais como: antioxidantes, antitumorais, cicatrizantes,

antiinflamatórios, antimicrobianos, febrífugos e analgésicos (Alves, 2005).

O que nos sugeriu investigar a atividade bactericida do extrato aquoso das folhas

15

de Schinus terebinthifolius contra Burkholderia cenocepacia.

3- Objetivos

3.1- Objetivo Geral

Avaliar a atividade bactericida e bacteriostática in vitro do extrato aquoso de S.

terebinthifolius frente a diferentes cepas de B. cenocepacia.

3.2- Objetivos Específicos

1- Avaliar a atividade bactericida in vitro do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius frente ao clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia em

crescimento planctônico e séssil;

2- Avaliar a atividade bactericida in vitro do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius frente a isolados clínicos de B. cenocepacia em crescimento

planctônico e séssil;

3- Verificar o perfil químico do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia em camada

delgada (CCD).

4- Materiais e Métodos

4.1- Material Vegetal

As folhas frescas de Schinus terebinthifolius foram coletadas na fazenda da

Secretaria do Meio Ambiente Agricultura e Pesca do Município de Itaguaí (SEMAAP -

Itaguaí / RJ), em um total de pelo menos 2832,69g. As folhas posteriormente foram

armazenadas no Laboratório de Tecnologia em Fármacos no Centro Universitário

Estadual da Zona Oeste - UEZO, após serem limpas e secas. Como etapa precedente à

preparação do extrato, as folhas foram congeladas por aproximadamente 16 horas a -

28ºC e trituradas em um moedor elétrico.

O registro da excicata do Schinus terebinthifolius é: RB 210.885.

4.2- Preparação dos Extratos

16

O extrato aquaso foi realizado a partir de folhas frescas de Schinus

terebinthifolius, sendo preparado por meio de infusão de acordo com a descrição da 1°

edição da Farmacopéia Brasileira, com algumas modificações. Para cada 800 g das

folhas de aroeira foram utilizados 2000 mL de água mineral. A água foi adicionada a

um béquer e fervida até 100ºC, entrando assim em processo de ebulição, com posterior

adição no béquer contendo as folhas frescas previamente trituradas. A solução foi

homogeneizada, havendo ajuste de temperatura até alcançar o ponto de 70ºC,

permanecendo em repouso durante 30 minutos com o recipiente fechado. Após esse

período, o infuso foi resfriado até atingir a temperatura ambiente e filtrado em funil de

porcelana contendo papel de filtro, com auxílio de uma bomba a vácuo e depositado em

kitazato. Finalmente, o extrato aquoso foi transferido para frascos âmbares,

devidamente identificados e mantidos congelados até o momento da liofilização. A

liofilização do extrato aquoso de aroeira foi realizado no Centro Universitário Estadual

da Zona Oeste no Liofilizador Liotop. Modelo: L202 – Liobras, com armazenamento do

material obtido a -20ºC.

4.3- Caracterização Organoléptica

Foram observadas características relacionadas à cor, sabor, textura e pH dos

extratos aquosos de folhas de Schinus terebinthifolius (Farmacopéia Brasileira, 1988).

4.4- Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius

Para avaliar o espectro de absorção do extrato aquoso preparado com as folhas

frescas da aroeira, realizamos uma varredura em espectrofotômetro para obter uma

curva absortiva. Utilizamos o extrato aquoso de S. terebinthifolius com pH 4,6 e com

pH próximo ao fisiológico (6,5 e 7,0) ajustando a solução aquosa do extrato com

bicarbonato de sódio 1.0 M. Para realizarmos a curva absortiva fizemos uma diluição

do extrato com os diferentes valores de pH (4,6; 6,5 e 7,0) de 1: 10 (200 µL do extrato +

1800 µL de PBS, pH= 7,2) e 1:20 (100 µL do extrato + 1900 µL de PBS, pH= 7,2),

sendo as amostras colocadas em cubetas de vidro e analisadas por varredura na faixa

de comprimento de onda de 200 a 500 nm, em espectrofotômetro UV-visível (Biothec,

modelo SP-2000 UV – Bel Photonics).

17

4.5- Amostras bacterianas

Em nossos experimentos foi utilizada a cepa ET-12 de B. cenocepacia (amostra

J2315, pertencente à genovariante IIIa), gentilmente cedida pelo Dr. Mustapha Si-Tahar

(Unité de Defense Inée et Inflamation, Instituto Pasteur, Paris - França) além de quatro

isolados clínicos de B. cenocepacia procedentes de pacientes com FC, atendidos no

Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e no Instituto Fernandes Figueira (IFF-

Fiocruz) com evolução clínica benigna diferente da síndrome cepacia, gentilmente

fornecidos pela Dr. Elizabeth de Andrade Marques (Departamento de Microbiologia,

Imunologia e Parasitologia da UERJ).

4.6- Determinação da atividade antibacteriana in vitro do extrato aquoso

Schinus terebinthifolius contra B. cenocepacia.

Inicialmente realizamos um ensaio qualitativo para determinar as concentrações

do extrato de S. terebinthifolius com atividade bactericida contra a cepa ET-12 de B.

cenocepacia. Para tal, foram utilizadas três alíquotas de 40 mg/mL do extrato de aroeira,

e em cada alíquota foram adicionados 10 mL de PBS estéril (pH 7,2), em seguida o pH

das amostras foi verificado. Visto que a solução aquosa do extrato possui um pH ácido

(pH 4,6), optamos por trabalhar com mais duas soluções, com pH próximo ao

fisiológico (pH 6,5 e 7,0). Portanto o pH de duas soluções foi ajustado com uma solução

de bicarbonato de sódio 1,0 M. Após esta etapa as soluções foram filtradas em uma

capela de fluxo laminar e 9 alíquotas de 1,0 mL de cada foram preparados de maneira

estéril e estocadas a -20ºC até a utilização.

Suspensões bacterianas foram preparadas em colorímetro (Biochrom, modelo

Libra S2) a partir de culturas de 18 horas da cepa ET-12 a 30ºC em meio Luria Bertanni

(LB) cultivadas em shaker orbital (Shaker orbital-Nova Ética) a 150rpm.

As culturas foram centrifugadas (centrífuga: Eppendorf, modelo - 5810R) a 2608

x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” formado foi

homogeneizado. Diluições em meio LB, a partir do “pellet” bacteriano foram realizadas

em colorímetro (Biochrom, modelo Libra S2) a 680nm, a fim de obter suspensões

bacterianas com DO680nm=0,2.

18

Em uma placa de 96 poços foram adicionados diluições seriadas de S.

terebinthifolius (20mg, 10mg, 5mg, 2,5mg, 1,25mg, 0,625mg) de forma a obtermos 100

µL como volume final, para os diferentes valores de pH. A cada poço foram

adicionados 100 µL da suspensão bacteriana com DO680nm = 0,2, que passou a DO680nm

=0,1 e as concentrações finais do extrato passaram a 20mg, 10mg, 5mg, 2,5mg, 1,25mg,

0,625mg, 0,325mg, respectivamente, para os diferentes valores de pH (4,6, 6,5 e 7,0).

Posteriormente a placa foi homogeneizada e incubada por 24horas a 37ºC. Após este

período, 10µL de cada diluição foram semeadas em “spots” em placas de Petri contendo

ágar azul de bromotimol (C.L.E.D). As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e

procedeu-se observação dos “spots” para selecionar as concentrações de S.

terebinthifolius a serem submetidas ao teste quantitativo.

4.7- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato

aquoso de Schinus terebinthifolius contra B. cenocepacia em Crescimento

Planctônico.

Foi determinada pela metodologia da microdiluição em caldo, segundo normas

da Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006). Para o ensaio quantitativo

foram utilizadas as concentrações de 20mg/mL, 10mg/mL e 5mg/ mL selecionadas a

partir dos resultados obtidos no item 4.6. Para tal, foram utilizadas três alíquotas de 40

mg/mL do extrato de aroeira, e em cada alíquota foram adicionados 10 mL de PBS

estéril (pH 7,2) e duas alíquotas de solução aquosa de extrato foram ajustadas para pH

6,5 e 7,0, com uma solução de bicarbonato de sódio 1,0 M.

Suspensões bacterianas foram preparadas a partir de culturas de 18 horas da cepa

ET-12 e quatro isolados clínicos a 30 ºC em meio Luria Bertanni (LB) cultivadas em

shaker orbital (Shaker orbital-Nova Ética) a 150rpm.

As culturas foram centrifugadas a 2608 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi

descartado, e o “pellet” formado homogeneizado. Diluições em meio LB, a partir do

“pellet” bacteriano foram realizadas em colorímetro (Biochrom, modelo Libra S2) a

680nm, a fim de obter suspensões bacterianas com DO680nm=0,2.

Em uma placa de 96 poços foram adicionadas diluições seriadas em base 2 a

partir de uma solução S. terebinthifolius a 40mg/mL. A cada poço foram adicionados

19

100 µL da suspensão bacteriana com DO680nm = 0,2 onde a concentração final do extrato

passou a 20mg/mL, 10mg/mL e 5mg/mL para os diferentes valores de pH (4,6, 6,5 e

7,0) e a suspensão bacteriana passou a DO680nm= 0,1. Posteriormente a placa foi

incubada por 24hs à 37ºC. Em uma nova microplaca de 96 poços foram adicionados

180 µL de PBS estéril e 20 µL das culturas contendo diferentes concentrações do

extrato, que foram diluídas de 10-1

a 10-6

para a determinação das unidades formadoras

de colônias por mililitro (UFC/mL). De cada diluição, alíquotas de 10 µL foram

semeadas em triplicata em “spots” em placas de Petri contendo meio CLED. As placas

foram incubadas a 37ºC por 24 horas, quando foram realizadas as contagens das

colônias. Os resultados foram expressos em UFC/mL.

4.8- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato

aquoso de Schinus terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B.

cenocepacia em Crescimento Séssil.

A cepa ET-12 foi cultivada em caldo Luria Bertani (LB-Gibco) a 30 °C sob

agitação de 150 rpm (Shaker orbital-Nova Ética), por 16 a 18 horas. Após este período

as culturas foram diluídas até a obtenção de suspensões bacterianas com DO680nm=0.2.

Quando 200 µL desta suspensão foram inoculadas em microplacas de 96 poços, sendo

cobertas com uma tampa contendo espículas (Nunc-Immuno TSP) e incubadas a 37 °C

por 24 horas para a formação do biofilme. Após este período, as bactérias não aderidas

às espículas foram removidas após serem lavadas 3x com água destilada estéril. Em

seguida, a tampa contendo as espículas foi colocada em uma nova microplaca de 96

poços contendo as diluições seriadas do extrato aquoso do S. terebinthifolius (20mg/mL,

10mg/mL e 5mg/mL). Em seguida a placa foi incubada por 24 horas a 37 °C.

Posteriormente, as espículas foram lavadas 3x com água destilada estéril. Após esta

etapa, a tampa contendo as espículas lavadas foi colocada em contato com uma nova

placa de 96 poços que continham 200 µL de meio LB e incubada por 1 hora a 37 °C

para avaliar a atividade bactericida do extrato. Após este período, as espículas foram

retiradas, e a placa incubada por mais 6 horas a 37 °C. Em uma nova microplaca de 96

poços foram adicionados 180 µL de PBS estéril e alíquotas de 20 µL das culturas após

6h de incubação, posteriormente foram realizadas diluições de 10-1

a 10-4

. De cada

diluição, 10 µL foram semeados em triplicata em spots em placas de Petri, contendo

20

meio CLED. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas, quando foram realizadas

as contagens das colônias. Os resultados foram expressos em UFC/mL.

4.9-Avaliação do perfil químico de Schinus terebinthifolius por

cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE).

Para a avaliação do perfil químico de S. terebinthifolius foram utilizados

solventes em padrão analítico (P.A), para cromatografia em camada delgada, e em grau

espectroscópico, para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As

misturas de solventes foram feitas sempre volume a volume (v/v).

Foram utilizadas placas de gel de sílica 60 G (para CCD) MERCK® e estas

foram reveladas com os seguintes reagentes cromogênicos: NP (2-

aminoetildifenilborato em etanol a 1,0 mg/mL) SPECTRUM® e PEG 4000

(polietilenoglicol a 5% em etanol) FLUKA® . A visualização das placas foi feita com a

utilização de câmara de UV contendo lâmpadas “Mineral light” nos comprimentos de

254 e 365nm. O sistema de solventes ideal para a corrida cromatográfica era composto

de acetato de etila: metanol: água: ácido acético (8: 1: 0.5: 0.1/ v/v).

A análise por CLAE acoplada ao detector de feixe de fotodiodos foi realizada

em aparelho SHIMADZU® CBM-10 A, equipado com bomba LC-10AD e detector

ultravioleta de feixe de fotodiodos SPD-M10A. A coluna utilizada foi a Lichrosorb-RP-

18 (25 cm de comprimento, 5 mm de diâmetro). Os solventes utilizados para a obtenção

do perfil em CLAE do extrato aquoso de Schinus terebentifolius foram: Solução A

(H2O: H3PO4 0.01%) e solução B (MeOH: H3PO4 0.01%). A eluição foi feita em modo

gradiente de 0% até 100% de B em 85 min, 1mL/ min. A detecção de UV foi

realizada com detector DAD e os canais observados foram de 254 e 365nm.

4.10- Análise Estatística

Os resultados foram expressos em médias ± erros padrões (SEM) dos valores

obtidos, além da análise de variância (ANOVA) seguida pelos testes de comparação de

Dunnett e o teste de significância de Bonferroni .

21

5-Resultados

5.1- Características organolépticas da espécie Schinus terebinthifolius.

O extrato aquoso das folhas de Schinus terebinthifolius, preparado por infusão

das folhas frescas da planta apresentou cor amarela, sabor amargo e adstringente e pH

ácido, na faixa de 4,6.

5.2- Atividade bactericida do extrato Schinus terebinthifolius contra a

cepa ET-12 em crescimento planctônico.

Inicialmente determinamos as concentrações do extrato de S. terebinthifolius a

serem utilizadas nos ensaios para determinação da concentração inibitória mínima do

crescimento da cepa ET-12 de B. cenocepacia. A tabela 1 apresenta as seis

concentrações utilizadas do extrato no pH 4,6, 6,5 e 7,0, e os resultados qualitativos da

inibição bacteriana. A tabela demonstra uma atividade de inibição do crescimento

bacteriano nas concentrações de 20mg/mL e uma redução de unidades formadoras de

colônias nos “spots” de 10µl quando utilizamos 10mg/mL de extrato. Nos “spots” das

demais concentrações utilizadas não foi possível contar as unidades formadoras de

colônias.

Tabela 1: Análise qualitativa da atividade bactericida do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius

Concentração do extrato aquoso Schinus terebinthifolius

pH 20mg/mL 10mg/mL 5mg/mL 2,5mg/mL 1,25mg/Ml 0,625mg/mL

4,6 NC RC IC IC IC IC

6,5 NC RC IC IC IC IC

7,0 NC RC IC IC IC IC

NC = não houve formação de Unidades Formadoras de Colônias

RC = redução do número de Unidades Formadoras de Colônias

IC = incontáveis números de Unidades Formadoras de Colônias

5.3- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato

aquoso de S. terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 B. cenocepacia em

Crescimento Planctônico.

Na figura 1A podemos observar uma significativa atividade bactericida do

extrato nas concentrações 20mg/mL e 10mg/mL (p<0.001) quando o número de

22

unidades formadoras de colônias das culturas tratadas com o extrato foram comparadas

com culturas que não foram tratadas (controle) para os diferentes valores de pH.

Quando foi utilizada a concentração de 5 mg/mL, observamos uma atividade

bacteriostática (Figura 1B) para pH 4,6 e 6,5. O extrato a 5 mg/mL com pH 7,0 não

apresentou diferenças significativas no número UFC/mL quando comparado ao

controle. Estes resultados podem ser melhor evidenciados na figura 1B que apresenta o

percentual de inibição do crescimento bacteriano quando as Unidades Formadoras de

Colônias obtidas em culturas da cepa ET-12 de B. cenocepacia não tratadas com S.

terebinthifolius foram tomadas com 100%. A concentração de 20mg/mL do extrato nos

diferentes valores de pH inibiu o crescimento bacteriano em culturas planctônicas em

100%, enquanto que em 10 mg/mL o extrato reduziu em 94,36%, 94,8% e 96,63% nos

pH 4,6, 6,5 e 7,0, respectivamente. Enquanto que na concentração de 5 mg/mL reduziu

em 57,74%, 44,74% e 45,85%, nas soluções de pH 4,6, 6,5 e 7,0 respectivamente,

demonstrando ser apenas bacteriostática ou seja reduz apenas taxa de crescimento.

Fig.1A- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia em Crescimento Planctônico: Os

resultados representam médias erros padrões de 5 experimentos realizados em triplicata, onde * p<

0.05, **p<0.01 e ***p<0.001. Fig. 1B- Percentual de inibição do crescimento bacteriano do clone

epidêmico ET-12 de B.cenocepacia, em diferentes valores de pH ( 4,6, 6,5 e 7,0) do extrato aquoso

de Schinus terebinthifolius: Os resultados representam médias + erros padrões de 5 experimentos

realizados em triplicata

1A 1B

23

5.4-Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius.

O fato de observarmos uma precipitação nos extratos de pH 6,5 e 7,0, e uma

menor significância na atividade bactericida quando foi utilizada a concentração de

5mg/mL nestes valores de pH, nos levou a fazer curva absortiva para verificarmos se

estava ocorrendo perda de constituintes. A Figura 2 mostra a sobreposição das curvas

de absorção de 200nm a 500nm do extrato aquoso S. terebinthifolius nos valores de pH

4,6, 6,5 e 7,0. As três amostras apresentaram um pico entre 200 e 300nm e outro em

300nm e 400nm. No entanto, foi observado que os extratos no pH 6,5 e 7,0

apresentaram uma diminuição das densidades óticas. O que nos levou a continuar os

experimentos com os extratos aquosos sem ajuste do pH, ou seja pH 4,6.

Fig. 2. Curva absortiva do extrato aquoso de S. terebinthifolius em diferentes valores de pH nos

intervalos de 200nm a 500nm

5.5- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de

Schinus terebinthifolius contra isolados clínicos B. cenocepacia em Crescimento

Planctônico.

Nesta etapa verificamos se o efeito bactericida do extrato aquoso observado com

a cepa ET-12 pode ser observado com outras cepas da mesma espécie (genovariante

IIIA), visto que existe uma grande variabilidade de resposta a substâncias

antimicrobianas dentro de uma mesma espécie. A Figura 3A representa o CIM do

extrato aquoso sobre quatro isolados clínicos de B. cenocepacia. Podemos observar

que, as concentrações de 20mg/mL, 10mg/mL e 5mg/mL inibiram significativamente o

crescimento bacteriano quando comparadas com as UFC/mL obtidas a partir de culturas

não tratadas com o extrato (controle) para as diferentes cepas testadas, exceto quando

24

foi utilizado 5mg/mL para a cepa 2627. Esses dados podem ser melhores

compreendidos na Figura 3B, que representa o percentual de inibição do crescimento

bacteriano do extrato quando as UFC/mL das culturas das diferentes cepas tratadas com

extrato foram comparadas com as UFC/mL obtidas em culturas controle, tomadas como

100%. Observamos uma atividade bactericida com percentual médio de 98% quando foi

utilizado 20 mg/mL para todas as cepas testadas. E quando foram utilizadas 10mg/mL e

5mg/mL houve uma inibição do crescimento bacteriano com um percentual médio de

88% e 48%, respectivamente, quando culturas das cepas 1664, 1634 e 1652 foram

tratadas com S. terebinthifolius. O tratamento das culturas da cepa 2627 com 5mg/mL

do extrato levou a uma inibição média em torno de 20%.

Fig. 3A- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra isolados clínicos B. cenocepacia em Crescimento Planctônico: Os resultados

expressos em UFC/mL representam médias + erros padrões de 3 experimentos realizados em triplicata, onde * p< 0.05, **p<0.01 e ***p<0.001; Fig. 3B- Percentual de Inibição do Crescimento Bacteriano:

Os resultados representam médias + erros padrões de 3 experimentos realizados em triplicata

3A 3B

25

5.6- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de

Schinus terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia em

Crescimento Séssil.

O crescimento em biofilme melhor representa as características de crescimento

bacteriano de B. cenocepacia in vivo. Resultados anteriores de nosso grupo

demonstraram a formação de biofilme pela cepa ET-12 de B. cenocepacia em cultura de

24 horas (Carvalho et al., 2011). Estes fatos nos levaram a determinar o CIM do extrato

aquoso frente ao crescimento séssil. A Figura 4A representa espículas com a formação

de biofilme após 24 horas de contato com culturas da cepa ET-12. A Figura 4B mostra

o crescimento bacteriano após 6 horas de cultivo em contato com os biofilmes de 24

horas tratados com as diferentes concentrações do extrato aquoso de S. terebinthifolius.

Observamos um menor efeito bactericida do extrato em crescimento bacteriano séssil,

mesmo quando utilizada a concentração de 20mg/mL. Estes resultados são melhores

observados na Figura 4C que representa o percentual de inibição do crescimento

bacteriano das concentrações de S. terebinthifolius frente aos biofilmes formados por

ET-12 quando comparamos as UFC/mL obtidas em culturas tratadas com o extrato e os

valores obtidos em culturas não tratadas, tomadas como 100%. O percentual de inibição

de 20 mg/mL é de 82% 8,805, e em 10 mg/mL e 5mg /mL houve uma redução de

51% 13,58 e 35% 11,64, respectivamente.

4A 4B

26

Fig.4A-- Espícula com formação de biofilme após 24 horas de contato com as culturas da cepa ET-

12 de B. cenocepacia. Fig. 4B- A concentração mínima inibitória do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra a cepa ET-12 de B. cenocepacia em crescimento séssil: Os resultados

representam médias + erros padrões de 2 experimentos realizados em quadruplicata, onde * p< 0.05,

**p<0.01 e ***p<0.001. Fig.4C- Percentual de inibição do crescimento séssil do clone epidêmico ET-

12 de B. cenocepacia, pelo extrato aquoso de Schinus terebinthifolius: Os resultados representam

médias + erros padrões de 2 experimentos realizados em quadruplicata

5.7- Comparação da atividade bactericida de S. terebinthifolius contra B.

cenocepacia em crescimento planctônico e séssil.

A figura 5 mostra uma melhor atividade inibitória do crescimento bacteriano

pelo extrato de S. terebinthifolius em culturas planctônicas, embora ao compararmos as

UFC/mL das culturas planctônicas e sésseis os resultados não apresentaram diferenças

significativas.

Fig. 5- Comparação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de Schinus

terebinthifolius contra a cepa ET-12 B. cenocepacia em Crescimento Planctônico e Séssil: Os resultados expressos em UFC/mL representam médias + erros padrões de 2 experimentos realizados em

quadriplicata

4C

27

5.8-Avaliação do perfil químico de S. terebinthifolius por cromatografia em

camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

Inicialmente realizamos a detecção dos derivados fenólicos de S.

terebinthifolius por CCD (Figura 6A) com utilização do reagente NP/PEG. As placas

foram observadas sob luz UV a 254 nm antes da revelação e a 365 nm após a revelação.

A presença de flavonóides foi evidenciada pela coloração alaranjada observada na placa

de CCD após a utilização do NP/PEG. Quando o extrato foi submetido a análise por

CLAE, o perfil cromatográfico (Figura 6B) nos sugeriu a presença de flavonóides e

taninos. Eestes resultados podem ser melhores evidenciados nas Figuras 6C e 6D,

respectivamente (Simões et al. 1999).

Fig. 6A- Sistema Cromatográfico do extrato aquoso de S. terebinthifolius: Gel de sílica GF 254,

acetato de etila: metanol: água: ácido acético (8: 1: 0.5: 0.1/ v/v). Corante NP/PEG

Fig. 6B- Cromatograma do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius em 365 nm, corrido em 85

minutos

6A

6B

BB

28

Fig. 6C- Espectro de absorção característico de flavonóide no tempo 64.23 minutos. Fig. 6D-

Espectro de absorção característico de tanino no tempo 55.05 minutos

6-Discussão

As bactérias do Complexo B. cepacia emergiram nas últimas duas décadas como

agentes de infecções oportunistas principalmente associadas a infecções respiratórias

em pacientes com fibrose cística (FC). A colonização pulmonar com Burkholderia

cenocepacia está associada com acelerado declínio clínico e morbidade da infecção.

Há evidências de que cepas de B.cepacia crescem como biomassa no muco

pulmonar (Burns et al., 1999) e formam biofilme (Schwab et al., 2002). A formação

de biofilme leva a severas implicações clínicas como aumento da resistência a

antibióticos e desinfetantes, além de proteção contra a resposta imune do hospedeiro.

Estudos realizados por Garcia & Hickey (2002) mostraram que biofilmes geram

uma maior resistência a antibióticos, sendo necessário utilizar altas concentrações de

antibióticos, o que pode ser tóxico para o organismo. Outro estudo realizado por Peeters

e colaboradores (2009) confirma a alta resistência das cepas do CBC a uma ampla gama

de antibióticos. O estudo mostra também que altas doses de tobramicina foram

necessárias para inibir a maioria das cepas testadas, tanto para culturas planctônicas,

como para biofilmes.

Tobramicina é utilizada como uma solução inalatória como coadjuvante no

tratamento das infecções broncopulmonares. A inalação de 300mg leva a uma

concentração média de 1.237µg/g (variando de 0,35 a 7.414 µg/g) no escarro. A

toxicidade deste antibiótico pode levar perda de audição, danos aos rins, ao feto, entre

outros.

6D

BB

6C

BB

29

Por existir essa resistência intrínseca e uma grande dificuldade no tratamento de

infecções respiratórias causadas por bactérias do CBC, é que atualmente muitos

pesquisadores buscam alternativas de tratamento para inibir estas infecções

(Mahenthiralingam et al., 2008). E o presente trabalho teve como objetivo buscar uma

nova alternativa de tratamento através do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius. A

maioria dos casos de síndrome cepacia foi relacionada com infecção por cepas de B.

cenocepacia, particularmente pela cepa ET-12 (Govan & Deretic, 1996;

Mahenthralingam et al., 2005). Em nosso estudo utilizamos o clone epidêmico ET-12

de B. cenocepacia, cepa amplamente estudada e que apresenta resistência a múltiplos

antibióticos. No complexo Burkholderia cepacia existe uma grande variabilidade nos

fatores de virulência de diferentes cepas em uma mesma espécie, resolvemos testar a

atividade bactericida do extrato aquoso sobre quatro cepas clínicas, isoladas de

pacientes fibrocísticos.

Nossos estudos foram realizados de modo a comparar a atividade bactericida do

extrato aquoso de Schinus terebinthifolius em crescimento séssil e planctônico, visto

que diversos estudos demonstram que a formação em biofilme confere maior resistência

aos antimicrobianos do que o crescimento planctônico.

Estudos realizados por Peeters et al. (2009) indicam que as concentrações

inibitórias utilizadas para crescimento planctônico e crescimento séssil são semelhantes.

Para a maioria das cepas testadas, o tratamento com ceftazidima, ciprofloxacina,

meropenem, minociclina ou trimetoprim / sulfametoxazol gerou reduções similares no

número de células planctônicas e sésseis.

Já em nossos resultados encontramos uma atividade bactericida significativa do

extrato aquoso de Schinus terebinthifolius em concentrações de 20mg/mL e 10mg/mL

em crescimento planctônico, enquanto que houve uma menor atividade bactericida

contra crescimento séssil. Na concentração de 5mg/mL observamos uma atividade

bacteriostática tanto em crescimento planctônico como séssil. Estes resultados estão em

acordo com os encontrado por Callaghan et al (2006) que avaliou a suscetibilidade de

diferentes antimicrobianos em crescimento planctônico e séssil, e observaram que em

biofilme as cepas eram mais resistentes.

A avaliação química preliminar do extrato aquoso de S. terebenthifolius nos

permite sugerir a presença de flavonóides e taninos. Os flavonóides mais conhecidos

30

desta espécie correspondem às biflavonas (amenthoflavona e dihidroamentoflavona)

(Jain et al., 1995), provavelmente devido a extração realizada, com solventes de maior

polaridade, não foi possível observar a presença destes metabólitos. O flavonóide

observado no extrato aquoso foi do tipo flavonol, pois apresentava máximos de

absorção no UV nas regiões de 355nm para banda I e 268nm para a banda II (Simões et

al, 1999). A presença de taninos nesta espécie já foi descrita por Queiroz et al. (2002).

Os taninos hidrolisáveis e condensados são responsáveis pela propriedade adstringente

em plantas (Monteiro et al, 2005), característica organoléptica esta que foi observada no

extrato da aroeira utilizado, além disso, esta classe de metabólitos é bastante conhecida

também em função da sua atividade antibacteriana (Machado et al, 2002).

Nossos resultados são estimulantes e nos permitem sugerir que o extrato aquoso de

S. terebenthifolius pode ser uma alternativa na inibição da infecção por B. cenocepacia

podendo contribuir com a qualidade de vida dos indivíduos com fibrose cística. Pois,

além da atividade antimicrobiana, possui segundo a literatura, atividades

antiinflamatórias e antioxidativas, que desempenham papel importante na regeneração

do tecido pulmonar do fibrocístico.

7-Conclusões

As concentrações de extrato de Schinus terebinthifolius a 20 mg/mL e 10 mg/mL

tiveram efeito bactericida enquanto que as concentrações de 5 mg/mL tiveram

efeito bacteriostático contra o clone epidêmico ET-12 em crescimento

planctônico.

O extrato mostrou ter atividade bactericida quando utilizado contra as quatro

cepas clínicas em crescimento planctônico na concentração de 20 mg/mL.

Quando foram utilizadas as concentrações de 10mg/mL e 5mg/mL houve uma

inibição do crescimento bacteriano, mostrando ser apenas bacteriostático.

Em crescimento séssil o extrato possui menor atividade bactericida, mesmo

quando utilizada a concentração de 20 mg/ mL, visto que em crescimento

plactônico teve melhor efeito bactericida, confirmando estudos realizados por

diversos autores, que demonstraram que em biofilme há uma resistência

intrínseca.

31

O perfil cromatográfico sugere como componentes majoritários a presença de

taninos e flavonóides no extrato aquoso de S. terebinthifolius.

8-Perspectivas

Isolar os metabólitos de aroeira por meio de técnicas cromatográficas (CLAE

semi-preparativo ou cromatografia em coluna aberta).

Identificar os metabólitos puros por meio de técnicas espectroscópicas (RMN H1

e C13

) e espectrométricas (espectrometria de massas).

Avaliar a resposta inflamatória do Schinus terebinthifolius, visto que na fibrose

cística, a inflamação ocorre precocemente e precede a infecção, mesmo em

condições clínicas estáveis;

Verificar a citotoxicidade de culturas de células epiteliais alveolares (A549)

frente às concentrações do extrato aquoso determinadas pelos ensaios

bactericidas.

9-Referências Bibliográficas

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