1$*$%5,(/$785$12 avaliaÇÃo da atividade bactericida da

HELENA GABRIELA TURANO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BACTERICIDA DA

PIOCINA S8 CONTRA CEPAS DE Pseudomonas

aeruginosa MULTIRRESISTENTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia do Instituto

de Ciências Biomédicas da Universidade

de São Paulo, para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

São Paulo

2017

HELENA GABRIELA TURANO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BACTERICIDA DA

PIOCINA S8 CONTRA CEPAS DE Pseudomonas

aeruginosa MULTIRRESISTENTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia do Instituto

de Ciências Biomédicas da Universidade

de São Paulo, para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

Área de Concentração: Microbiologia

Orientador: Prof. Dr. Nilton Ebert

Lincopan Huenuman

Versão corrigida. A versão original

eletrônica encontra‐se disponível tanto na Biblioteca do ICB quanto na Biblioteca

Digital de Teses e Dissertações da USP

(BDTD).

São Paulo

2017

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

_____________________________________________________________________________________________________

Candidata: Helena Gabriela Turano

Título da Tese: “Avaliação da atividade bactericida da piocina S8 contra cepas de

Pseudomonas aeruginosa multirresistentes”.

Orientador: Prof Dr Nilton Erbet Lincopan Huenuman

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão

pública realizada a 20/06/2017, considerou

( X ) Aprovada ( ) Reprovado(a)

Examinadora: Assinatura: ....................................................................................

Nome: Ana Cristina Gales

Instituição: Departamento de Medicina da Escola Paulista de

Medicina da Universidade Federal de São Paulo


Nome: Anna Sara Shafferman Levin

Instituição: Departamento de Doenças Infecciosas da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo

Examinador: Assinatura: ....................................................................................

Nome: Luis Eduardo Soares Netto

Instituição: Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da

Universidade de São Paulo


Nome: Kelly Ishida

Instituição: Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo

Presidente: Assinatura: ....................................................................................

Nome: Nilton Erbet Lincopan Huenuman

Instituição: Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo

Dedico este trabalho à minha família amada. Aos meus pais,

Nestor e Lúcia, exemplos de trabalho, que sempre me

apoiaram e batalharam junto comigo para realização de mais

esta etapa. Ao meu irmão, Nestor Júnior, que sempre esteve do

meu lado, me incentivando incondicionalmente. Ao meu filho,

Enzo, motivo inicial e principal dessa longa e árdua

caminhada. Ao meu esposo, amigo e companheiro, Fernando,

que sempre fez tudo o que estava ao seu alcance para me

ajudar, sacrificando-se muitas vezes, para que assim

pudéssemos alcançar nossos sonhos juntos. Amo vocês!

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus pelo cumprimento dessa promessa em minha vida.

Aos meus pais, Nestor e Lúcia, pois sem eles nada disso seria possível. Agradeço

imensamente por toda ajuda, especialmente por todo cuidado dado ao meu filho, por todo

carinho, amor e apoio em todos os momentos da minha vida.

Ao meu irmão, Nestor Júnior, exemplo de batalha e perseverança, por todo carinho e atenção

dedicados a mim e ao meu filho.

Ao meu filho, Enzo, por todo amor, carinho, compreensão, paciência e companheirismo em

todos os momentos da minha vida.

Ao meu esposo, Fernando, meu companheiro de casa e do trabalho. Agradeço imensamente

por todo seu tempo dedicado a mim, por suas orientações, sem as quais esta Tese não se

realizaria e por sua ajuda em todas as etapas de execução deste trabalho.

À minha avó Marina, por seu exemplo de fé, de vida, por toda sua bondade, conselhos e

conversas. Aos meus avós que já não estão neste mundo, mas que continuam em meus

pensamentos. À toda minha família, meus tios e primos queridos, que sempre me

incentivaram a continuar e compreenderam minha ausência em tantos momentos.

A família de meu esposo, seus avós, seus pais, Maria (in memoriam) e Válter, seus irmãos,

Camila e Vinícius, que sempre nos apoiaram e compreenderam nossos momentos de ausência.

Ao meu orientador Prof. Dr. Nilton Lincopan, por toda liberdade de trabalho oferecida, por

acreditar na minha competência e por confiar na minha pesquisa.

Ao Prof. Dr Luís Netto, por aceitar fazer colaboração com meu trabalho, oferecendo toda a

estrutura de seu laboratório. Agradeço por permitir que eu convivesse diariamente entre seus

alunos, entre eles meu esposo e, por toda liberdade que me foi dada. Essa colaboração foi

fundamental para este trabalho.

Ao meu amigo Juan, por me incentivar na realização desta Tese e por toda a sua amizade.

Aos amigos e colegas dos laboratórios: IB: Renato, Flávio, Renata, Thiago, Carlos, Rogério,

Andressa, Júlia, Eduardo, Diogo, César, Anita, Simone, Cristina, Janaína, Amanda e Valesca.

ICB: Lucianne, Tatiane, Quézia, Lívia, Enyd, Lúcia, Ralf, Luana, Rodrigo, Louise, Miriam,

Luciana, Maria, Fernanda e Caetano.

Ao órgão financiador deste trabalho CNPq:

Edital/chamada: Cotas do Programa de Pós Graduação;

Processo: 140045/2013-9;

Modalidade-Categoria: Doutorado-GD;

Vigência: De 01/01/2013 a 31/12/2016.

“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas,

mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de

espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem

numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem

derrota.”

Theodore Roosevelt

“Todo aquele que se dedica ao estudo da ciência chega a

convencer-se de que nas leis do Universo se manifesta um Espírito

sumamente superior ao do homem, e perante o qual nós, com os

nossos poderes limitados, devemos humilhar-nos.”

Albert Einstein

RESUMO

Turano HG. Avaliação da atividade bactericida da piocina S8 contra cepas de Pseudomonas

aeruginosa multirresistentes. [tese (Doutorado em Microbiologia)]. São Paulo: Instituto de

Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2017.

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista que ocasiona diferentes infecções em

humanos. O surgimento de linhagens multirresistentes (MRs), contra os antibióticos

comercialmente disponíveis, tem causado elevados níveis de morbidade e mortalidade. O

objetivo deste estudo foi identificar uma molécula de piocina que apresente potente atividade

bactericida contra cepas de P. aeruginosa MRs. Uma piocina de baixo peso molecular,

produzida por uma cepa de P. aeruginosa (ET02) isolada da microbiota intestinal humana,

apresentou potente atividade bactericida contra treze linhagens de P. aeruginosa produtoras

de β-lactamases clinicamente importantes (SPM-1, GIM-1, VIM-1, IMP-1, KPC-2 e GES-5).

Essa piocina foi purificada e identificada como S8 através de espectrometria de massas e

sequenciamento de DNA. Os genes codificadores da piocina S8 estão presentes no interior de

um novo transposon (Tn6350), localizado no cromossomo bacteriano da cepa ET02. Estes

resultados demonstraram que S8 possui potente atividade bactericida contra linhagens de P.

aeruginosa MRs, podendo vir a ser utilizada como um composto antimicrobiano no

tratamento de infecções associadas.

Palavras chave: Pseudomonas aeruginosa. Piocina S8. Multirresistente. Bacteriocina.

ABSTRACT

Turano HG. Evaluation of the bactericidal activity of the pyocin S8 against multiresistant

Pseudomonas aeruginosa strains. [Ph. D. thesis (Microbiology)]. São Paulo: Instituto de

Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2017.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunist pathogen that causes human infections. The

emergence of multidrug resistant strains (MRs) against antibiotics commercially available has

been causing elevated mortality and morbidity levels. The purpose of this study was to

identify a molecule of pyocin with a potent bactericidal activity against P. aeruginosa MRs

strains. A low molecular weight pyocin, produced by ET02 strain, isolated from human

microbiota, has presented wide bactericidal activity against thirteen lineages of P. aeruginosa,

producers of β-lactamases (SPM-1, GIM-1, VIM-1, IMP-1, KPC-2 e GES-5). This pyocin

was purified and identified as S8 through mass spectrometry and DNA sequencing. The

pyocin S8 encoding genes are present in the interior of a transposon located in the bacterial

chromosome of the ET02 strain. These results demonstrate that S8 have potent bactericidal

activity against P. aeruginosa MRs lineages, and may well be used as an antimicrobial

compound on treatment of hospital infections.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa. Pyocin S8. Multiresistant. Bacteriocin.

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Piocinas do tipo S de P. aeruginosa descritas até o momento ................ 36

Quadro 2 - Linhagens de Pseudomonas aeruginosa utilizados neste trabalho ......... 61

Quadro 3 - Composição dos géis de separação e de empilhamento utilizados nas

análises por SDS-PAGE .............................................................................................. 65

Quadro 4 - Linhagens de E. coli utilizadas neste trabalho ......................................... 68

Quadro 5 - Meio de cultura para o crescimento das células de E. coli ...................... 68

Quadro 6 - Oligonucleotídeos utilizados na identificação das piocinas do tipo S .... 76

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Organização gênica dos diferentes tipos de piocinas do tipo S.................. 35

Figura 2 - Estrutura cristalográfica do domínio IV da piocina AP41 em associação

com a proteína imunitária ............................................................................................ 40

Figura 3 - Modelo de ligação e translocação da piocina SD2 através da membrana

externa da célula alvo .................................................................................................. 44

Figura 4 - Modelo de translocação da molécula de colicina através da membrana

externa da célula alvo .................................................................................................. 45

Figura 5 - Representação esquemática da piocina do tipo R ...................................... 47

Figura 6 - Organização gênica das piocinas do tipo S ............................................... 49

Figura 7 - Representação esquemática do conjunto de genes (cluster) codificadores

da piocina R2 de P. aeruginosa PAO1 ........................................................................ 49

Figura 8 - Representação esquemática da regulação da síntese de piocinas em P.

aeruginosa ................................................................................................................... 51

Figura 9 - Halos de inibição de crescimento gerados pelas moléculas de piocinas

frente às cepas multirresistentes .................................................................................. 80

Figura 10 - Purificação das moléculas de piocinas .................................................... 81

Figura 11 - Atividade bactericida das piocinas presentes na fração S contra as

linhagens multirresistentes .......................................................................................... 82

Figura 12 - Purificação da piocina de ~90 KDa através de cromatografia de

exclusão molecular ...................................................................................................... 84

Figura 13 - Identificação da piocina de ~90 KDa da cepa ET02 através de

espectrometria de massas ............................................................................................ 85

Figura 14 - Amplificação da região codificadora da piocina AP41 da linhagem

ET02 ............................................................................................................................ 86

Figura 15 - Alinhamento da piocina AP41 com a piocina de ET02 ........................... 87

Figura 16 - Organização genética da estrutura portadora da piocina S8 da linhagem

ET02 ............................................................................................................................ 89

Figura 17 - Região regulatória da piocina S8 ............................................................. 89

Figura 18 - Purificação das piocinas recombinantes ................................................. 91

Figura 19 - Atividade bactericida das piocinas recombinantes contra as linhagens

MRs ............................................................................................................................. 92

Figura 20 - Purificação da piocina S8 da linhagem ET02 .......................................... 93

Figura 21 - Atividade bactericida das piocinas R5 e S8 contra as linhagens MRs .... 94

Figura 22- Atividade bactericida da piocina S8 ......................................................... 96

Figura 23 - Atividade bactericida da piocina R5 ........................................................ 97

Figura 24 - Alinhamento das sequências de aminoácidos do domínio catalítico e

das proteínas imunitárias das bacteriocinas que possuem o motivo HNH .................. 99

Figura 25 - Estrutura cristalográfica do domínio DNase da piocina S8 em

associação com a proteína imunitária .......................................................................... 101

Figura 26 - Sobreposição do sítio ativo da piocina S8DNase-ImS8 com

AP41DNase ................................................................................................................. 102

Figura 27 - Representação esquemática dos hipotéticos mecanismos de resistência

das linhagens MRs contra a piocina S8 purificada de ET02 ....................................... 108

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Perfil de suscetibilidade antibacteriana das cepas de P. aeruginosa ...... 77

Tabela 2 - Triagem inicial da atividade bactericida das piocinas contra as cepas

multirresistentes ........................................................................................................ 79

Tabela 3 - Presença das piocinas do tipo S nas cepas multirresistentes .................. 98

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µg Micrograma

µL Microlitro

µm Micrômetro

AMI Amicacina

AMR Antimicrobial Resistance

ATM Aztreonam

BHI Brain heart infusion

BSA Albumina sérica bovina

CAZ Ceftazidima

CCIH Comissão de controle de infecção hospitalar

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CI Cepas indicadoras

CIM Concentração inibitória mínima

CIP Ciprofloxacina

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CPA Antígeno polissacarídeo comum

CPM Cefepima

CT Colistina

CV Volume de coluna

CVC Cateter Venoso Central

DNA ácido desoxirribonucleico

EDTA Ácido etilenodiamino tetracético

ESKAPE Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,

Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp

ESCAPE

Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile,

Enterobacter, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e

Enterobacteriaceae

EUCAST The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

FC Fibrose cística

FDA Food and Drug Administration

GEN Gentamicina

GES Guiana de espectro estendido

GIM German Imipenemase

h Hora

I Intermediário

IB Instituto de Biociências

ICB Instituto de Ciências Biomédicas

IDSA Infectious Diseases Society of America

IGP Isotonic glucose phosphate

IMP Imipenemase

IPCSL Infecções Primárias de Corrente Sanguínea Laboratorial

IPE Immunity protein exosite

IPM Imipinem

IRAS Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde

IROMP Iron-regulated outer membrane proteins

Kb Kilobase

KDa Quilodalton

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

L Litro

Lab Laboratório

LPS Lipopolissacarídeo

LVX Levofloxacina

MER Meropenem

mg Miligrama

MH Mueller-Hinton

min Minuto

mL Mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

MR Microrganismo multirresistente

MDR Multidrug Resistant

MPA 2-mercaptopropiônico

MβL Metalo-β-lactamase

N Número

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NDM New Delhi metalo-β-lactamase

nm Nanômetro

OMS Organização mundial da saúde

ONU Organização das Nações Unidas

ORF Open reading frame

OXA Oxacilinase

Pa Pseudomonas aeruginosa

pb Pares de bases

PBP Penicillin binding protein

PCR Polymerase chain reaction

PDR Pandrug Resistant

PMF Peptide mass fingerprinting

POL Polimixina B

PPT Piperacilina/Tazobactam

R Resistente

ROS Espécies reativas de oxigênio

rpm Rotações por minuto

S Sensível

SD Shine-Dalgarno

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

SEC Size-exclusion chromatography

SIM Seoul imipenemase

SPM São Paulo metalo-β-lactamase

STEC Escherichia coli produtora de toxina Shiga

UFC Unidade formadora de colônia

UPEC Escherichia coli uropatogênica

UN United Nations

UTI Unidade de terapia intensiva

UV Luz ultravioleta

VIM Verona Imipenemase

WHO World Health Organization

XDR Extremely Drug Resistant

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 21

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 23

2.1 Pseudomonas aeruginosa .................................................................................................... 23

2.1.1 Descrição geral .................................................................................................................. 23

2.1.2 Importância clínica ........................................................................................................... 25

2.2 Bacteriocinas: compostos antimicrobianos ...................................................................... 31

2.3 Piocinas: bacteriocinas produzidas por Pseudomonas aeruginosa ................................. 33

2.4 Piocinas de baixo peso molecular do tipo S ...................................................................... 34

2.4.1 Propriedades biológicas e organização estrutural ........................................................... 35

2.4.2 Domínio catalítico e proteína imunitária ......................................................................... 38

2.4.3 Liberação extracelular e interação com o receptor ......................................................... 40

2.5 Piocinas de alto peso molecular do tipo R e F .................................................................. 44

2.6 Regulação da síntese das piocinas ..................................................................................... 47

2.7 Funções biológicas das piocinas ......................................................................................... 52

2.8 Resistência bacteriana frente às piocinas ......................................................................... 53

2.9 O envolvimento das piocinas no processo infeccioso ....................................................... 54

2.10 Potenciais aplicações das piocinas ................................................................................... 57

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 59

3.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 59

3.2 Objetivos específicos ........................................................................................................... 59

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................. 60

4.1 Condições de cultivo e estocagem das cepas de Pseudomonas aeruginosa ..................... 60

4.2 Testes de sensibilidade de antimicrobianos pelo método de disco-difusão .................... 60

4.3 Cepas de Pseudomonas aeruginosa .................................................................................... 60

4.4 Seleção de cepas de P. aeruginosa produtoras de piocinas com ampla atividade

bactericida (piocinotipagem) ................................................................................................... 61

4.5 Purificação das piocinas das células de P. aeruginosa ..................................................... 62

4.6 Atividade bactericida das piocinas purificadas de P. aeruginosa (ensaio de

monocamada) ............................................................................................................................ 63

4.7 Cromatografia de filtração a gel ou SEC (Size-exclusion chromatography) .................. 64

4.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante (SDS-PAGE) .......... 64

4.9 Identificação da piocina através de espectrometria de massas ....................................... 65

4.10 Clonagem da região codificadora da piocina de ~90 KDa da cepa ET02 .................... 66

4.11 Sequenciamento do genoma da linhagem produtora da piocina .................................. 67

4.12 Metodologias utilizadas para a construção da piocina recombinante ......................... 67

4.12.1 Extração do DNA genômico de P. aeruginosa .............................................................. 67

4.12.2 Linhagens de Escherichia coli e meios de cultura ........................................................ 68

4.12.3 Condições de cultivo das células de E. coli .................................................................... 68

4.12.4 Métodos gerais para manipulação de DNA ................................................................... 68

4.12.5 Transformação Bacteriana ............................................................................................. 70

4.12.6 Clonagem da piocina recombinante ............................................................................... 70

4.12.7 Expressão e purificação da piocina recombinante ........................................................ 71

4.12.8 Cristalização do domínio catalítico da piocina em associação com a subunidade

imunitária ................................................................................................................................... 72

4.12.9 Quantificação de proteínas ............................................................................................. 75

4.13 Determinação da atividade bactericida (Concentração Bactericida Mínima - CBM) 75

4.14 Screening molecular das piocinas do tipo S nas linhagens multirresistentes .............. 76

5 RESULTADOS ...................................................................................................................... 77

5.1 Seleção de cepas de P. aeruginosa com fenótipo de multirresistência ............................ 77


bactericida ................................................................................................................................. 78

5.3 Purificação das moléculas de piocinas e avaliação da sua atividade bactericida .......... 80

5.4 Identificação molecular da piocina de ~90 KDa da linhagem ET02 .............................. 83

5.5 Construção da piocina S8 recombinante .......................................................................... 90

5.6 Purificação da piocina S8 diretamente da linhagem ET02 ............................................. 90

5.7 Estrutura cristalográfica da piocina S8 ............................................................................ 98

6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 103

6.1 Análises estruturais ............................................................................................................. 112

6.2 Considerações finais ........................................................................................................... 116

7 CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 120

REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 121

APÊNDICES ............................................................................................................................. 144

A - Presence of high-risk clones of OXA-23-producing Acinetobacter baumannii (ST79) and SPM-1-

producing Pseudomonas aeruginosa (ST277) in environmental water samples in Brazil…................... 144 B - Tn6350, a Novel Transposon Carrying Pyocin S8 Genes Encoding a Bacteriocin with Activity

against Carbapenemase-Producing Pseudomonas aeruginosa …............................................................ 145

21

INTRODUÇÃO

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa que possui um caráter

oportunista, podendo colonizar uma ampla variedade de hospedeiros (Aujoulat et al., 2012).

Em humanos, esse patógeno é comumente encontrado em feridas causadas por queimaduras

(Church et al., 2006), infecções do trato urinário (Sievert et al., 2013) e doenças pulmonares

obstrutivas, sendo esta última, muito comum em pacientes com fibrose cística (Driscoll et al.,

2007).

Atualmente, há uma crescente prevalência de cepas de P. aeruginosa resistentes a

praticamente todas as classes de antibióticos disponíveis (Oliver et al., 2015). Esse fenótipo

de multirresistência, associado à capacidade de P. aeruginosa de formar biofilmes durante as

infecções crônicas, tem colocado este patógeno em uma categoria de organismos praticamente

intratáveis (McCaughey et al., 2016b). Dessa forma, urge a necessidade de desenvolvimento

de novas estratégias terapêuticas que possam ser utilizadas no tratamento de infecções

causadas por P. aeruginosa multirresistentes.

Uma estratégia alternativa frente aos antibióticos atualmente disponíveis é a utilização

das piocinas produzidas pelas próprias células de P. aeruginosa (Smith et al., 2012;

McCaughey et al., 2016b). Piocinas são antibióticos proteicos produzidos por P. aeruginosa

que possuem atividade bactericida contra outras linhagens da mesma espécie, atuando, assim,

na competição intraespecífica (Michel-Briand, Baysse, 2002). As atividades bactericidas

descritas até o momento incluem DNase, tRNase, rRNase , formação de poros na membrana

plasmática e inibição da síntese de peptideoglicano (Ghequire, De Mot, 2014). Durante sua

ação sobre as células alvos, as moléculas de piocinas reconhecem receptores específicos

presentes na superfície celular, desencadeando a morte seletiva de competidores. Tal

especificidade reduz o seu espectro de ação, porém facilita seu direcionamento para linhagens

específicas, como bactérias multirresistentes ou altamente virulentas (McCaughey et al.,

2016).

Após a primeira descrição das piocinas no inicio da década de 1950, numerosos

estudos foram desenvolvidos, culminando em avanços no entendimento do mecanismo de

ação dessas moléculas. A potência e a especificidade das piocinas levantou a possibilidade de

que essas moléculas poderiam ser utilizadas como antibióticos clinicamente úteis no

tratamento de infeções causadas por P. aeruginosa. De fato, a atividade bactericida das

moléculas de piocinas tem sido eficientemente testada em modelos de animais infectados com

22

P. aeruginosa (Merrikin, Terry, 1972; Williams, 1976; Scholl, Martin, 2008; Williams et al.,

2008; Scholl et al., 2009; Ritchie et al., 2011; Smith et al., 2012; McCaughey et al., 2016a,b).

No entanto, não há estudos que reportem a utilização dessas moléculas contra linhagens de P.

aeruginosa multirresistentes.

A disponibilização de sequências genômicas de linhagens de P. aeruginosa tem

possibilitado a identificação de um grande número de novas piocinas (Ghequire, De Mot,

2014), revelando a complexa evolução dessas moléculas. Visando aprofundar o conhecimento

sobre a possível utilização das piocinas como antibióticos proteicos, este trabalho teve como

principal objetivo a identificação de uma nova molécula de piocina com potente atividade

bactericida contra linhagens de P. aeruginosa multirresistentes.

23

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Pseudomonas aeruginosa

2.1.1 Descrição geral

O gênero Pseudomonas pertence à família Pseudomonadaceae, foi proposto pela

primeira vez por Migula em 1894, baseado em características morfológicas e metabolismo

celular e, desde então, muitas revisões taxonômicas para este gênero foram realizadas (Moore

et al., 2006; Peix et al., 2009; Molina et al., 2013).

Pseudomonas compreende mais de cem espécies (Özen, Ussery, 2012), classificadas

de acordo com um refinamento nos critérios de definição, que incluem: morfologia e estrutura

celular, composição da parede celular, tipos de pigmentos, características nutricionais e

metabólicas, susceptibilidade a diferentes compostos, produção de antibióticos etc.

Estudos de hibridação de DNA-rRNA postularam cinco subdivisões de RNA no

gênero Pseudomonas (I a V), no qual o grupo rRNA I recebeu o nome de Pseudomonas

(stricto sensu), dentro da classe Gammaproteobacteria e inclui espécies relacionadas a P.

aeruginosa. Os demais grupos (II a V) foram posteriormente classificados em diferentes

gêneros (Burkholderia, Stenotrophomonas, Comamonas, Ralstonia, Acidovorax, entre

outros), reduzindo assim o número de espécies dentro deste gênero (Palleroni et al., 1973;

Palleroni, 2003; Tindall et al., 2006; Peix et al., 2009; Özen, Ussery, 2012).

Pseudomonas (stricto sensu) ainda poderia ser subdividido com base na

patogenicidade ou na produção de pigmentos (Özen, Ussery, 2012). Com relação à produção

de pigmentos, existem dois grupos distintos: o que compõe as espécies com capacidade de

produzir pigmento fluorescente solúvel em água (sob a luz UV), pioverdina (principal

sideróforo de Pseudomonas de coloração amarelo esverdeado); e o grupo com as espécies que

produz pigmento não fluorescente. Em P. aeruginosa a pioverdina se combina com a

piocianina (pigmento fenazina de coloração azul) ocasionando sua cor característica verde

brilhante. Algumas linhagens podem produzir um pigmento avermelhado (piorrubina) ou

preto amarronzado (piomelanina) (Kiska, Gilligan, 2003).

Pseudomonas spp. são bacilos Gram-negativos retos ou ligeiramente curvados

(variando entre 1,5 a 5 µm de comprimento e 0,5 a 1,0 µm de largura), encontrados isolados

ou aos pares, aeróbicos, não formadores de esporos, móveis (devido à presença de um ou mais

24

flagelos polares), catalase positiva, oxidase positiva e não fermentadores de lactose. Algumas

espécies podem se multiplicar a 4 ºC, porém a maioria é mesofílica, apresentando o

crescimento ótimo entre 30 a 37 ºC (P. aeruginosa consegue crescer a 42 ºC) (Kiska, Gilligan,

2003; Moore et al., 2006). Adicionalmente, P. aeruginosa possui um odor doce característico

semelhante ao de uvas, devido à presença do 2-aminoacetofenona (Cox, Parker, 1979).

Algumas espécies de Pseudomonas são reconhecidas por serem patogênicas para

plantas e cogumelos, tais como P. pseudoalcaligenes, P. mediterrânea, P. syringae, P.

costantinii, P. marginalis, P. corrugata, P. palleroniana etc. Outras são patógenos de animais

e humanos, como P. alcaligenes, P. fluorescens, P. mendocina, P. putida, P. stutzeri, P.

luteola entre outras, porém o patógeno mais importante do gênero para os seres humanos é P.

aeruginosa (Kiska, Gilligan, 2003; Peix et al., 2009).

As espécies de Pseudomonas são genética, metabólica e fisiologicamente muito

versáteis, com capacidade de utilizar mais de cem diferentes fontes de carbono. Em

decorrência de sua diversidade metabólica, cepas de P. aeruginosa podem ser encontradas em

todo ambiente hospitalar, desde equipamentos respiratórios, banheiras, pias e até em soluções

antissépticas fracas, contribuindo para sua natureza oportunista (Timmis, 2002; Yahr, Parsek,

2006; Amoureux et al., 2017).

P. aeruginosa também é versátil a respeito de quimiotaxia (com uma grande variedade

de receptores quimiotáticos) e motilidade. Em ambientes aquosos, o movimento se dá através

do mecanismo de natação (swimming), já em superfícies sólidas, é utilizado o mecanismo de

enxame, também conhecido como pulular (swarming) ou o mecanismo de extensão e retração

(twitching) (Yahr, Parsek, 2006).

Cepas de P. aeruginosa podem ser encontradas em formas planctônicas ou em

biofilmes, apresentando, neste caso, uma cápsula polissacarídica (alginato). O alginato é um

fator de virulência, que confere um aspecto mucoide às cepas as quais são frequentemente

encontradas em pacientes com fibrose cística (FC). Sua produção é consequência de uma

mutação no gene muc que, em condições normais, inibe a expressão do gene alg (Yahr,

Parsek, 2006; Pulcrano at al., 2012).

O biofilme se forma à medida que organizações de células bacterianas, envoltas por

uma matriz exopolissacarídea, vão crescendo aderidas a uma superfície. O biofilme confere

proteção contra o sistema imune do hospedeiro, facilita a comunicação celular (“inter” e

“intra” espécies), dificulta a difusão de antimicrobianos e facilita a troca de material genético

entre as células (Lincopan, Trabulsi, 2008). Esse fenótipo mucoide está relacionado a uma

25

maior dificuldade de eliminação do patógeno, resultando em uma piora do prognóstico dos

pacientes (Silva Filho et al., 2013).

P. aeruginosa possui múltiplos fatores de virulência, os quais são regulados por

diferentes fatores externos, tais como, concentração de ferro, osmolaridade e quorum-sensing

(mecanismo pelo qual as bactérias monitoram a densidade populacional). Quando a densidade

populacional torna-se suficientemente elevada, o quorum-sensing desencadeia a expressão de

um grande número de genes não relacionados, que auxiliam na transição de células

planctônicas para um crescimento em biofilme (Kiska, Gilligan, 2003; Yahr, Parsek, 2006;

Blondel-Hill et al., 2007; Lincopan, Trabulsi, 2008).

Os principais fatores de virulência encontrados nesta espécie são: adesinas (ex.

flagelo, pílis, lipopolissacarídeo, cápsula de alginato), toxinas e enzimas secretadas (ex.

exotoxina A, piocianina, pioverdina, elastases, hemolisinas, proteases e o sistema de secreção

(ex. tipo III) (Crousilles et al., 2015; Lincopan, Trabulsi, 2008; Yahr, Parsek, 2006).

2.1.2 Importância clínica

Pseudomonas aeruginosa é considerada um patógeno oportunista de plantas, animais e

humanos, embora possa ser encontrada naturalmente em uma ampla variedade de nichos,

incluindo ambientes da água e do solo (Hancock, Speert, 2000; Kiska, Gilligan, 2003; Moore

et al., 2006; Yahr, Parsek, 2006).

P. aeruginosa também pode ser achada, ainda que raramente, fazendo parte da

microbiota de indivíduos saudáveis e, nestes casos, os locais de colonização são: garganta,

mucosa nasal, superfícies úmidas da pele (axilas e períneo) (Kiska, Gilligan, 2003).

Devido à sua grande diversidade metabólica, P. aeruginosa é facilmente encontrada e

disseminada em todo ambiente hospitalar, podendo utilizar como reservatório qualquer

superfície molhada [alimentos; flores (trazidas pelas visitas dos pacientes); sanitários;

equipamentos de diálise, respiratórios indevidamente limpos etc.], ou até mesmo através das

mãos dos profissionais de saúde (Kiska, Gilligan, 2003; Moura, 2007; Souli et al., 2008).

Apesar de possuir uma ampla variedade de fatores de virulência, dificilmente P.

aeruginosa infectará um indivíduo imunocompetente, ou sem lesões teciduais. Porém, uma

vez que P. aeruginosa obtenha êxito em entrar no corpo humano, as infecções podem

progredir rapidamente, caracterizando sua natureza de patógeno oportunista (Kiska, Gilligan,

2003; Moore et al., 2006; Yahr, Parsek, 2006; Blondel-Hill et al., 2007).

26

Por ser um patógeno oportunista, Pseudomonas aeruginosa pode ocasionar infecções

em pacientes hospitalizados e/ou com o sistema imunitário comprometido (i.e., câncer, HIV,

queimaduras, fibrose cística etc.) (Goldberg, 2010; Diene, Rolain, 2013; Morita et al., 2014;

Ruhnke et al., 2014; López-Causapé et al., 2015; Trecarichi et al., 2015).

Pessoas saudáveis e fora do ambiente hospitalar também podem ocasionalmente ser

acometidas por P. aeruginosa, principalmente após situações de exposição à água,

originando: infecções do ouvido (especialmente em crianças e praticantes de esportes

aquáticos), erupções cutâneas (uso de banheiras de hidromassagem ou de piscinas cloradas

inadequadamente) e infecções oculares (devido ao uso de lentes de contato) (Blondel-Hill et

al., 2007; Kiska, Gilligan, 2003).

Em ambientes hospitalares, as infecções relacionadas à P. aeruginosa podem ocorrer

em praticamente todas as regiões anatômicas, porém as principais são: oftalmológicas,

otológicas, respiratórias, do trato urinário, sanguíneas, de peles e tecidos moles (Bodey et al.,

1983; Stover et al., 2000; Yahr, Parsek, 2006; Hauser, Ozer, 2011; Ramírez-Estrada et al.,

2016).

Na América Latina, Pseudomonas spp. tem sido responsável por 7,5% das infecções

de corrente sanguínea; por 13,8 % das infecções da pele e dos tecidos moles; e por 31,2 % dos

casos de pneumonia (Gales et al., 2012).

Um estudo de Sader et al. (2014) mostrou que nos Estados Unidos, Europa e região do

mediterrâneo, Pseudomonas aeruginosa tem sido o Gram-negativo mais frequentemente

isolado, com uma frequência de isolamento de 20,9%, nos casos de pneumonia. E, para os

casos de pneumonia associada à ventilação mecânica (VAP), em hospitais norte-americanos,

P. aeruginosa representa 29,2 % dos isolamentos (Sader et al., 2015).

De acordo com os dados do CDC (2013) (Centers for Disease Control and

Prevention) estima-se que 51.000 infecções por ano, nos Estados Unidos, são causadas por P.

aeruginosa, sendo que 13% são ocasionadas por cepas multirresistentes. Estima-se que a cada

ano mais de 400 pessoas morrem devido a essas infecções.

No Brasil, dados de 2012-2015, da avaliação dos indicadores nacionais das Infecções

Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) mostraram que P. aeruginosa corresponde ao

quinto agente etiológico (e terceiro Gram-negativo) mais isolado de IPCSL (Infecções

Primárias de Corrente Sanguínea Laboratorial) associada à CVC (Cateter Venoso Central) em

pacientes adultos em UTI (Unidade de Terapia Intensiva), correspondendo a 10% dos

isolamentos. Adicionalmente, a resistência desse patógeno aos carbapenêmicos foi de 39,1%.

27

Já para IPCSL, associada à CVC em pacientes pediátricos em UTI, P. aeruginosa apesar de

também corresponder ao quinto patógeno mais frequentemente isolado, é o segundo na lista

dos Gram-negativos, correspondendo a 9,9% dos isolamentos e, a resistência reportada aos

carbapenêmicos foi de 29,5% (ANVISA, 2016).

Sua importância clínica é decorrente da expressão de múltiplos mecanismos de

virulência e resistência que dificultam a ação de antibacterianos e ocasionam elevados índices

de morbidade e mortalidade (Sader et al., 2001; Pellegrino et al., 2002; Gales et al., 2004;

Souli et al., 2008; Zavascki et al., 2010; Lambert et al., 2011; Poole, 2011; Diene, Rolain,

2013; Hauser, 2014; McCarthy, 2015).

Dentre os principais mecanismos de resistência de P. aeruginosa, ressaltam-se:

enzimas capazes de inativar os antimicrobianos (diferentes β-lactamases e enzimas

modificadoras de aminoglicosídeos), superexpressão de bombas de efluxo, perda de porina e

alterações no sítio alvo dos antimicrobianos (Diene, Rolain, 2013; Kanj, Kanafani, 2011;

McCarthy, 2015; Muller et al., 2011; Oliver et al., 2015; Poole, 2011; Souli et al., 2008;

Strateva, Yordanov, 2009; Rizek et al., 2014; Zavascki et al., 2010).

P. aeruginosa pode apresentar resistência natural ou adquirida a diferentes

antimicrobianos utilizados rotineiramente na clínica, como cefalosporinas de primeira e

segunda geração, tetraciclinas, cloranfenicol e macrolídeos (Kiska, Gilligan, 2003; Strateva,

Yordanov, 2009). Adicionalmente, mesmo drogas com boa atividade contra P. aeruginosa

não são sempre 100% eficientes contra ela (Bouza, Muñoz, 2000).

Atualmente são escassas as alternativas terapêuticas disponíveis para o tratamento de

infecções causadas por cepas de P. aeruginosa multirresistentes. Estima-se que entre 18 a

25% dos isolados clínicos de P. aeruginosa sejam multirresistentes (McCaughey et al.,

2016b). Além disso, a capacidade de formar biofilmes durante as infecções crônicas e o

surgimento de variantes fenotípicas resistentes aos antibióticos, durante tratamentos

prolongados, fazem de P. aeruginosa um patógeno praticamente intratável (Drenkard,

Ausubel, 2002; Livermore, 2002; Mah et al., 2003). Como resultado, há um aumento de

trabalhos reportando infecções por P. aeruginosa pan-resistentes em hospitais ao redor do

mundo (Souli et al., 2008; Farrell et al., 2013; Oliver et al., 2015).

Um microrganismo pode ser denominado multirresistente [MR (ou Multidrug

Resistant – MDR)] quando ele apresenta resistência a no mínimo três antibióticos de classes

diferentes, ou extremamente resistente [XDR (ou Extremely Drug Resistant)] quando é

resistente a um ou mais antimicrobiano em quase todas as categorias (exceto uma ou duas) e,

28

pan-resistente [PDR (ou Pandrug Resistant)] quando ele apresenta resistência a todos os

agentes de todas as categorias antimicrobianas. Deve-se testar todos os antimicrobianos, ou o

mais próximo disso, contra esse microrganismo, para garantir a correta aplicação destas

definições (Magiorakos et al., 2012).

Considerando a presença dos múltiplos mecanismos de resistência, anteriormente

citados, a Sociedade de Doenças Infecciosas Norte-Americana (Infectious Diseases Society of

America: IDSA) incluiu Pseudomonas aeruginosa na lista dos patógenos que representam

maior ameaça à saúde pública: “ESKAPE” (devido a sua “habilidade de driblar/escapar” os

principais tratamentos antibacterianos atualmente existentes). Este acrônimo é formado pela

inicial de diferentes patógenos (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella

pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp). Outra

versão seria o uso do termo “ESCAPE”, o qual se inclui Clostridium difficile e substitui

Enterobacter por Enterobacteriaceae (Boucher et al., 2009; Peterson, 2009; Santajit,

Indrawattana, 2016).

Dando continuidade aos principais mecanismos de resistência de P. aeruginosa, temos

a produção de enzimas capazes de inativar os antimicrobianos, como as β-lactamases.

Existem diferentes tipos de enzimas β-lactamases, entre elas as carbapenemases. Essas

enzimas têm capacidade de hidrolisar diferentes classes de antibióticos, como cefalosporinas,

monobactâmicos, penicilinas e carbapenêmicos. Carbapenemases pertencem às classes

moleculares A, B e D. As enzimas das classes A e D possuem um aminoácido de serina

altamente conservado no sítio ativo e as da classe B, também conhecidas como metalo-β-

lactamases, contêm um metal (normalmente zinco) no sítio ativo. Existem várias enzimas

representantes das carbapenemases da classe A, entre elas encontramos GES e KPC, da classe

D temos principalmente as enzimas do tipo OXA, e as da classe B encontramos IMP, VIM,

SPM, GIM, NDM e SIM (Ambler, 1980; Watanabe et al., 1991; Lauretti et al., 1999;

Toleman et al., 2002; Lee et al., 2005; Walsh et al., 2005; Zhanel et al., 2007; Yong et al.,

2009; Bush, 2013).

Os carbapenêmicos são antibióticos de amplo espectro e estão sendo muito utilizados

no tratamento de pacientes com infecção hospitalar. Esta classe de antibiótico é a droga de

escolha para esses pacientes, pois apresenta boa estabilidade frente a muitas β-lactamases.

Porém, quando utilizada inadvertidamente, ou em concentrações subinibitórias, essa escolha

acaba exercendo maior pressão seletiva sobre a microbiota hospitalar, ocasionando uma

seleção natural de bactérias resistentes e a disseminação desses clones. Sendo assim, seu uso

29

racional se torna essencial para diminuir essa pressão seletiva (Davies, Davies, 2010; Kanj,

Kanafani, 2011; Lucena et al., 2014; Morita et al., 2014; Karam et al., 2016; Campana et al.,

2017).

O contínuo aumento de infecções ocasionadas por bactérias MR (em paralelo com a

falta de alternativas terapêuticas, devido à resistência a maioria dos antimicrobianos

comercialmente disponíveis) é um problema de importância mundial. Diante desse panorama

desfavorável, diferentes pesquisas têm previsto um retorno à era pré-antibiótica, e postulando

a volta de antibióticos abdicados no passado (em consequência de toxicidade, entre outros

motivos reportados), tais como as Polimixinas B e E (colistina) (Livermore, 2002,2009;

Timurkaynak et al., 2006; Paterson, Lipman, 2007; Levin, Oliveira, 2008; Tillotson, 2008;

Schurek et al., 2009; Piddock, 2012; Theuretzbacher, 2012; Balsalobre et al., 2014;

Karaiskos, Giamarellou, 2014; Rizek et al., 2015; Kaye, et al., 2017).

Em 2009, o IDSA anunciou a iniciativa "Bad Bugs no Drugs-10 by 20" para apoiar o

desenvolvimento de 10 novos antibióticos até 2020, tendo como principais alvos os chamados

patógenos ESKAPE (Boucher et al., 2009; IDSA, 2010).

Atualmente o assunto “resistência antimicrobiana” tem se tornado um tema de grande

importância e repercussão mundial. Em maio de 2016 foi publicado um relatório, intitulado

“Review on Antimicrobial Resistance” (Revisão sobre a resistência antimicrobiana, em

tradução livre), encomendado em julho de 2014 pelo Primeiro-Ministro britânico, para o

economista Jim O’Neill (O’Neill, 2016). A ele foi solicitado uma análise do problema global

sobre o aumento da resistência aos medicamentos e a recomendação de soluções para

enfrentá-lo internacionalmente. Esse documento apresenta uma visão geral das possíveis

ações a serem implementadas para reduzir o uso desnecessário dos atuais antimicrobianos e

aumentar a produção de novas drogas.

O’Neill (2016) também avalia a necessidade de se melhorar o saneamento básico e

medidas de higiene, melhorar as práticas clínicas e laboratoriais, reduzir a poluição do meio

ambiente, reduzir o uso de antibióticos na agricultura, melhorar a vigilância global, introduzir

diagnósticos rápidos e vacinas, valorizar e aumentar o número de pessoas trabalhando nesta

área e ainda faz uma análise de como estas soluções podem ser financiadas.

Neste documento, O’Neill projeta um expressivo aumento na mortalidade no mundo

inteiro devido à resistência antimicrobiana, chegando a 10 milhões de mortes por ano,

simultaneamente a uma perda na produtividade econômica global de US$ 100 trilhões até o

ano de 2050, se nenhuma medida for tomada imediatamente (O’Neill, 2016). Adicionalmente,

30

devido ao impacto alcançado por este relatório, foram publicados dois artigos, no formato de

comentário, discutindo os dados e as propostas apresentadas por O’Neill (Brogan, Mossialos,

2016; Piddock, 2016).

Ainda em 2016, na última assembleia geral da ONU (Organização das Nações

Unidas), realizada em Nova York (Estados Unidos), líderes mundiais se reuniram e dedicaram

um dia inteiro para discutir sobre a resistência antimicrobiana (AMR – Antimicrobial

Resistance) regional, nacional e internacional. Nessa reunião se comprometeram pela primeira

vez a tomar medidas globais para enfrentar a resistência aos antimicrobianos, de forma

abrangente e multissetorial (medicina humana e veterinária, agricultura, finanças, meio

ambiente e os consumidores), enfatizando as responsabilidades dos governos e de

organizações intergovernamentais, como a OMS [Organização Mundial da Saúde (ou WHO –

World Health Organization)] para aumentar a conscientização sobre o assunto a fim de se

encontrar uma solução eficiente (ONU, 2016).

Nessa reunião da ONU foi lembrada a resolução WHA 68.7, da assembleia mundial de

saúde, intitulada “Plano de ação global sobre a resistência antimicrobiana”, ressaltando a

importância primordial de se alcançar os cinco objetivos estratégicos divulgados nesse plano.

Os cinco objetivos são: melhorar o conhecimento e a compreensão da resistência

antimicrobiana através de comunicação eficaz, educação e formação; reforçar conhecimentos

de evidências básicas através da vigilância e pesquisa; reduzir a incidência da infecção através

de medidas eficazes de saneamento, medidas de higiene e prevenção de infecções; otimizar o

uso de medicamentos antimicrobianos na saúde humana e animal; desenvolver pacote

econômico para o investimento sustentável, considerando as necessidades de todos os países e

aumentar o investimento realizado em ferramentas de diagnóstico, vacinas, novos

medicamentos e outras intervenções (WHO, 2015).

Recentemente a OMS (WHO) divulgou pela primeira vez uma lista de agentes

patogênicos priotários resistentes aos antibióticos. Esta lista contém doze famílias de bactérias

que representam a maior ameaça para a saúde humana, e tem como finalidade orientar e

promover a pesquisa e desenvolvimento de novos antibióticos para enfrentar a crescente

resistência mundial aos medicamentos. Nesta lista é destacada a ameaça das bactérias gram-

negativas resistentes a múltiplos antibióticos. Para a criação desta lista alguns critérios foram

levados em consideração: nível de letalidade das infecções que provocam; se o tratamento

requer longas internações hospitalares; com qual frequência apresentam resistência aos

antibióticos existentes quando infectam as pessoas na comunidade; a facilidade de se

31

disseminar entre os animais, dos animais para os seres humanos e de pessoa para pessoa; se as

infecções que provocam podem ser prevenidas (por boas práticas de higiene, vacinação etc);

quantas opções de tratamento ainda permanecem; e se novos antibióticos para tratar as

infecções que causam já estão sendo pesquisados e desenvolvidos. Nesta lista as doze famílias

de bactérias foram classificadas de acordo com o grau de prioridade para os quais a pesquisa e

desenvolvimento de novos antibióticos se faz necessário: crítico, alto e médio. No nível mais

elevado (crítico) encontram-se os seguintes grupos de bactérias: Acinetobacter baumannii

resistente aos carbapenêmicos, Pseudomonas aeruginosa resistente aos carbapenêmicos e

Enterobacteriaceae resistente aos carbapenêmicos e produtoras de ESBL (WHO, 2017).

Alguns novos agentes antimicrobianos vêm sendo aprovados (ou estão em fase de

desenvolvimento) para uso clínico, especialmente para patógenos Gram-positivos (Coates et

al., 2011; Bassetti et al., 2013; Bassetti, Righi, 2015).

Diante das dificuldades apresentadas, urge a necessidade de implementação de

medidas de controle que visem à diminuição e a contenção da disseminação de clones MR.

Adicionalmente, é imprescindível o desenvolvimento e aprovações regulatórias, de novas

estratégias de combate e de novos agentes antimicrobianos capazes de serem usados

clinicamente, em substituição ou em paralelo aos antibióticos convencionais (Tillotson, 2008;

Saeidi et al., 2011; Piddock, 2012; Theuretzbacher, 2012; Bassetti et al., 2013; Talbot, 2013;

Ghequire, De Mot, 2014; Rossolini et al., 2014; McCarthy, 2015; Pires et al., 2015; Potron et

al., 2015; Karam et al., 2016; Khan, Khan, 2016; Medina-Presentado et al., 2016; O’Neill,

2016; Ramírez-Estrada et al., 2016).

Nesse sentido, alguns trabalhos têm apontado que um grupo específico de moléculas

conhecidas como bacteriocinas poderiam desempenhar um papel significativo no tratamento

antimicrobiano, representando uma via alternativa e/ou complementar aos antibióticos

atualmente disponíveis (Baba, Schneewind, 1998; Bakkal et al., 2010; Wolska et al., 2012;

Cotter et al., 2013; Arthur et al., 2014; Garsa et al., 2014; Nigam et al., 2014).

Adicionalmente, há uma grande procura dessas moléculas nas indústrias de alimentos,

para os processos de conservação, nos quais se procuram eliminar dos alimentos os

microrganismos indesejáveis e/ou prejudiciais à saúde (Cotter et al., 2005; Settanni, Corsetti,

2008).

Bacteriocinas são compostos antimicrobianos produzidos por muitas espécies

bacterianas que possuem um espectro de ação reduzido, quando comparado aos antibióticos

tradicionais. Elas apresentam atividade bactericida apenas contra membros filogeneticamente

32

relacionadas à bactéria produtora e, dessa forma, desempenham um importante papel na

competição bacteriana intraespecífica (competição entre membros da mesma espécie)

(Ghequire, De Mot, 2014). A bactéria produtora da bacteriocina possui componentes que a

torna imune a bacteriocina por ela produzida, impedindo a sua autodestruição (Cotter et al.,

2005, 2013).

As bacteriocinas produzidas por P. aeruginosa são coletivamente denominadas como

piocinas (Nakayama et al., 2000).

2.2 Bacteriocinas: compostos antimicrobianos

Bacteriocinas são compostos antimicrobianos produzidos por praticamente todas as

principais bactérias estudadas até o momento (Riley, Wertz, 2002a,b). Há indícios de que

99% das linhagens bacterianas produzem no mínimo um tipo específico de bacteriocina

(Klaenhammer, 1988).

Uma característica-chave na definição das bacteriocinas é a sua composição

estritamente proteica. Sendo assim, essas moléculas são sintetizadas unicamente pela

maquinaria ribossomal (Cotter et al., 2013; Ghequire, De Mot, 2014). Atualmente, há diversas

maneiras de classificar as bacteriocinas, porém uma forma simplificada de classificação é a

distinção entre as bacteriocinas produzidas por bactérias Gram-positivas das Gram-negativas.

Em geral, as bacteriocinas produzidas por bactérias Gram-positivas são moléculas

relativamente pequenas, geralmente pequenos peptídeos proteicos (Cotter et al., 2013).

Contrário do que ocorre nas bactérias Gram-negativas, a produção dessas bacteriocinas não

representa um evento tóxico para a célula bacteriana. Isso é decorrente de um eficiente

sistema de transporte que promove a liberação dessas moléculas imediatamente após a sua

síntese (Riley, Wertz, 2002b). Uma das classes mais bem estudadas de bacteriocinas

produzidas por bactérias Gram-positivas são os lantibióticos produzidos pelas bactérias do

ácido láctico. A nisina, produzida pela bactéria Lactococcus lactis subsp. lactis, tem sido

amplamente utilizada na indústria alimentícia como conservante de alimentos, devido a suas

propriedades antimicrobianas (Cleveland et al., 2001; Settanni, Corsetti, 2008; Garsa et al.,

2014).

Por outro lado, as bacteriocinas das bactérias Gram-negativas na maioria dos casos são

verdadeiras proteínas apresentando atividade citotóxica. Constituem um grupo diverso,

variando no seu tamanho, modo de ação e mecanismo de imunidade (Riley, Wertz, 2002b). O

33

exemplo mais bem estudado são as colicinas, as bacteriocinas produzidas por Escherichia coli

(Jakes, Cramer, 2012; Papadakos et al., 2012).

O espectro de ação das bacteriocinas geralmente se restringe às espécies bacterianas

filogeneticamente relacionadas à linhagem produtora da bacteriocina (Cotter et al., 2013). No

entanto, há casos onde uma determinada bacteriocina se mostra ativa contra uma ampla

variedade de organismos. Este é o caso da nisina, demonstrada ser ativa contra diversos

gêneros Gram-positivos e até mesmo Gram-negativos (Mota-Meira, 2000; Piper et al., 2009).

Estudos demonstram que o espectro de ação das bacteriocinas das bactérias Gram-negativas é

menor em relação ao das bactérias Gram-positivas (Riley, Wertz, 2002b).

2.3 Piocinas: bacteriocinas produzidas por Pseudomonas aeruginosa

Piocinas são bacteriocinas produzidas por Pseudomonas aeruginosa que apresentam

atividade bactericida contra células da mesma espécie (Ghequire, De Mot, 2014).

A primeira descrição das piocinas foi feita na década de 1950, pelo pesquisador

francês, François Jacob. O pesquisador demonstrou que a irradiação de uma determinada

linhagem de P. aeruginosa com luz ultravioleta (agente mutagênico), desencadeava a

produção de um composto que, após liberado pela célula produtora, ligava-se na superfície da

célula alvo provocando a sua morte (Michel-Briand, Baysse, 2002). A identidade do

composto responsável pela morte da célula alvo foi posteriormente caracterizada como sendo

uma piocina de alto peso molecular, com estrutura semelhante à cauda de um bacteriófago,

conhecida como piocina do tipo R (Kageyama et al., 1962).

Posteriormente, pesquisadores japoneses descreveram um segundo tipo de piocina de

alto peso molecular, denominado piocina do tipo F (Takeya et al., 1967). Finalmente, no

início da década de 1970, ocorreu a descrição de um terceiro tipo de piocina denominado de

piocina do tipo S (Ito et al., 1970). Nos anos seguintes, diversos estudos identificaram a

atividade piocinogênica de linhagens de P. aeruginosa isoladas de ambientes naturais e

clínicos (Govan, Gillies, 1969; Jones et al., 1973, 1974; Mushin, Ziv, 1973; Gierløff, 1980;

Jurado Chacon et al., 1987; Komiyama et al., 1987). Dentre estes, destacam-se os estudos que

utilizavam as moléculas de piocinas como uma maneira de classificar fenotipicamente as

linhagens de P. aeruginosa, método conhecido como piocinotipagem (Fyfe et al., 1984).

Estudos subsequentes concentraram-se na caracterização molecular das piocinas,

incluindo suas propriedades físicas, químicas e biológicas (Kageyama, 1964; Kageyama et al.,

34

1964; Kageyama et al., 1979; Sano, Kageyama, 1981, Sano, Kageyama, 1984; Sano et al.,

1993b; Duport et al., 1995; Nakayama et al., 2000).

As piocinas produzidas por P. aeruginosa são classificadas em três tipos: R, F e S

(Riley, 1998; Michel-Briand, Baysse, 2002; Ghequire, De Mot, 2014). Esta classificação

baseia-se principalmente na estrutura molecular das piocinas. Nesse sentido, as piocinas dos

tipos R e F, que possuem similaridade estrutural com a cauda de bacteriófagos, são

denominadas de piocinas de alto peso molecular. Por outro lado, as piocinas do tipo S são

conhecidas como piocinas de baixo peso molecular, pois são constituídas por apenas duas

subunidades proteicas.

Mais de 90% das linhagens de P. aeruginosa produzem piocinas (Govan, Deretic,

1996), sendo que uma mesma linhagem pode produzir diferentes tipos (Ghequire, De Mot,

2014; Sun et al., 2014).

2.4 Piocinas de baixo peso molecular do tipo S

As piocinas do tipo S são proteínas solúveis, sensíveis à protease e ao calor. Possuem

uma estrutura binária composta por duas subunidades proteicas codificadas por dois genes

organizados em um operon (Figura 1): o componente proteico maior, que possui a função

bactericida ou citotóxica e o componente proteico menor ou imunitário, que confere

imunidade à célula produtora da piocina ao se ligar ao componente maior, inibindo sua

atividade (Riley, 1998; Michel-Briand, Baysse, 2002; Joshi et al., 2015).

35

Figura 1 - Organização gênica dos diferentes tipos de piocinas do tipo S

Nota: As setas ilustram os dois genes codificadores das piocinas do tipo S. O gene codificador da subunidade

maior, ou citotóxica, é composto por quatro domínios (apenas os domínios I e IV estão sendo demonstrados) que

podem ser vistos como módulos. O gene codificador da subunidade imunitária confere imunidade à bactéria

produtora da piocina.

Fonte: Adaptado de Ghequire e De Mot (2014).

As piocinas S possuem similaridades estruturais e funcionais com as colicinas, as

bacteriocinas produzidas por Escherichia coli (Duport et al., 1995; Riley, 1998; Michel-

Briand, Baysse, 2002; Parret, De Mot, 2002; Klein et al., 2016). Estudos demonstram que as

piocinas S e as colicinas possam ter evoluído a partir de um ancestral comum. Grande parte

do conhecimento sobre a função e o mecanismo de ação das piocinas deriva de estudos com

as colicinas (Ghequire, De Mot, 2014).

2.4.1 Propriedades biológicas e organização estrutural

Atualmente, já foram descritos dezessete subtipos de piocinas do tipo S, porém apenas

nove deles foram caracterizados bioquimicamente: S1, S2, S3, S4, S5, S6, M1 (PaeM), AP41

36

e S11 (Quadro 1). A linhagem amplamente utilizada em laboratório PAO1 (Stover et al.,

2000) produz as piocinas S2, S4 e S5.

Quadro 1 - Piocinas do tipo S de P. aeruginosa descritas até o momento

Subtipo Mecanismo de Ação Número de aminoácidos

Fonte citotóxica imunitária

S1 DNase 618 87 Ito et al. (1970)

S2 DNase 689 87 Ohkawa et al. (1973)

S3 DNase 766 153 Duport et al. (1995)

S4 tRNase 764 112 Elfarash et al. (2012)

S5 Formação de poro 498 108 Ling et al. (2010)

AP41 DNase 777 90 Sano e Kageyama (1981)

S6 rRNase 571 77 Dingemans et al. (2016)

S7 rRNase 642 77 Ghequire e De Mot (2014)

S8 DNase 772 85 Ghequire e De Mot (2014)



S11 (SD2) tRNase 662 90 McCaughey et al. (2016a)

S12 (SD3) tRNase 740 90 McCaughey et al. (2016a)

SD1 tRNase 591 90 McCaughey et al. (2016a)

M1 (PaeM) Degradação de lipídeos 289 – Barreteau et al. (2009)

M4 Degradação de lipídeos 342 – Ghequire e De Mot (2014)

L1 Desconhecido 256 – McCaughey et al. (2014)

As piocinas S possuem diversos mecanismos de ação (Quadro 1), porém, a atividade

citotóxica é sempre dependente do componente proteico maior (Ghequire, De Mot, 2014).

Este é composto por quatro diferentes domínios, denominados I, II, III e IV (Figura 1). Tais

domínios podem ser vistos como módulos independentes que atuam sequencialmente durante

o mecanismo de ação das moléculas de piocinas (Sano et al., 1993a; Riley, 1998; Michel-

Briand, Baysse, 2002; Parret, De Mot, 2002; Ghequire, De Mot, 2014).

Para a maioria das piocinas do tipo S, o domínio I, ou amino-terminal, é responsável

pela ligação da piocina ao receptor da célula alvo, enquanto o domínio IV, ou carboxi-

terminal, possui a atividade bactericida (Sano et al., 1993b; Parret, De Mot, 2002). A

translocação da molécula de piocina através da membrana externa da célula alvo é

impulsionada pelo domínio III. Até o momento, a função do domínio II permanece

desconhecida (Ghequire, De Mot, 2014). A organização modular dos domínios das piocinas

permite que bacteriocinas funcionais possam ser construídas a partir da união de domínios

oriundos de diferentes piocinas, aumentando o espectro de ação das mesmas (Sano et al.,

1993a; Elfarash et al., 2014). Tal ideia foi expandida até mesmo para a criação de

37

bacteriocinas híbridas construídas a partir da fusão de piocinas e colicinas (Kageyama et al.,

1996; Gupta et al., 2013).

Para as piocinas S5, M1 (PaeM) e possivelmente M4, cuja ação bactericida ocorre no

espaço periplasmático, a organização de seus domínios é ligeiramente diferente das demais

piocinas. Nestas, o domínio de translocação III precede o domínio de ligação ao receptor I

(Barreteau et al., 2009; Elfarash et al., 2014). A piocina L1, descrita em McCaughey et al.

(2014), possui uma organização estrutural completamente diferente das demais piocinas do

tipo S. Esta piocina possui similaridade estrutural com um grupo de proteínas com

propriedades de ligação a carboidratos conhecidas como lectinas. Seu mecanismo de ação

permanece desconhecido.

As ações bactericidas (citotóxicas) das piocinas descritas até o momento incluem:

atividades de DNase, tRNase, rRNase, formação de poros e degradação de lipídeos (Quadro

1).

O domínio DNase (domínio IV do componente proteico maior) presente nas piocinas

S1, S2 e AP41 possui o motivo altamente conservado das nucleases conhecido como HNH

(Parret, De Mot, 2002). Este motivo é encontrado nos três domínios da vida, atuando em uma

variedade de funções, incluindo recombinação homóloga, reparo de DNA e apoptose

(Stoddard, 2005).

No contexto das piocinas S1, S2 e AP41, o motivo HNH, o qual coordena um íon

metálico, se liga no sulco menor do DNA genômico da célula alvo catalisando clivagens

randômicas (Seo, Golloway, 1990; Sano, 1993; Sano et al., 1993b; Sano, Kageyama, 1993).

Tais clivagens sobrecarregam a maquinaria de reparo de DNA da célula alvo, resultando na

morte celular minutos após a entrada da piocina (Pommer et al., 1998, 2001). Apesar da

piocina S3 possuir atividade de DNase, ela não possui o motivo HNH presente no domínio IV

das piocinas S1, S2 e AP41 (Duport et al., 1995; Parret, De Mot, 2002).

Nenhuma atividade enzimática foi demonstrada para a piocina S5. Esta piocina é

conhecida por matar a célula alvo por meio da formação de poros na membrana celular,

danificando a mesma e causando o escape dos componentes intracelulares (Ling et al., 2010).

Por meio de análises in silico, os autores Parret e De Mot (2000) descreveram um

novo tipo de piocina denominada S4 codificada pelo genoma da linhagem PAO1. Foi predito

que essa piocina possua atividade do tipo tRNase, visto que seu domínio IV do componente

proteico maior possui elevada similaridade de sequência com a colicina E5 (Parret, De Mot,

38

2000; Elfarash et al., 2012), ao qual catalisa a degradação de moléculas de tRNAs (Ogawa et

al., 2006; Cascales et al., 2007).

A piocina S6 possui atividade do tipo rRNase (Dingemans et al., 2016). O domínio IV

do componente maior dessa piocina possui similaridade estrutural com a colicina E3 de

Eschericha coli, ao qual catalisa a clivagem de uma única ligação ribonucleotídica no sitio A

do RNA ribossomal 16S (Soelaiman et al., 2001; Walker et al., 2004). Tal clivagem inativa a

maquinaria de biossíntese de proteínas da célula alvo. Este modo de ação resulta em um efeito

bacteriostático, contrário a atividade bactericida exercida pelas piocinas com atividade de

DNase (Dingemans et al., 2016).

Recentemente, McCaughey et al. (2016a) realizaram a clonagem e a caracterização

bioquímica de três novas piocinas, denominadas SD1, SD2 e SD3. O domínio IV dessas

piocinas possui similaridade de sequência com a colicina D de Escherichia coli (McCaughey

et al., 2016a). A colicina D apresenta atividade do tipo tRNase (Graille et al., 2004) e resíduos

importantes para a atividade catalítica dessa colicina estão conservados nas piocinas SD1,

SD2 e SD3.

Através de estudos in silico, Ghequire e De Mot (2014) identificaram novos genes

codificadores de piocinas nos genomas de P. aeruginosa depositados nos bancos de dados

(GenBanK e Pseudomonas Genome Database). Com essa abordagem, os pesquisadores

descreveram as piocinas S7, S8, S9, S10, S11, S12 e M4. Essa descrição baseou-se

unicamente em similaridade de sequência, não havendo nenhuma caracterização funcional

dessas novas piocinas. Curiosamente, as piocinas S11 e S12 são as mesmas SD2 e SD3

descritas por McCaughey et al. (2016a) e, portanto, possuem atividade do tipo tRNase

(Quadro 1).

As piocinas S8 e S9 foram descritas com atividade do tipo DNase, apresentando o

motivo HNH presente nas piocinas S1, S2 e AP41. A piocina S10 possui certa similaridade de

sequência com a piocina S3. Ambas apresentam atividade do tipo DNase, porém não possuem

o motivo HNH encontrado nas piocinas S1, S2 e AP41. Finalmente, para a piocina S7, assim

como a piocina S6, foi postulado possuírem atividade do tipo rRNase (Ghequire, De Mot,

2014) (Quadro 1).

39

2.4.2 Domínio catalítico e proteína imunitária

As piocinas do tipo S são sintetizadas na forma de complexos proteicos binários

(subunidade citotóxica, ou componente maior / subunidade imunitária, ou componente

menor), em uma taxa equimolar 1:1. O tamanho da proteína imunitária varia entre 77 a 157

aminoácidos, muito menor do que a proteína citotóxica que varia entre 256 (L1) a 777 (AP41)

aminoácidos (Ghequire, De Mot, 2014) (Quadro 1).

A expressão da proteína imunitária é crucial para a sobrevivência da célula produtora

da piocina. Após ser sintetizada, a proteína imunitária se liga na subunidade citotóxica,

inativando a atividade bactericida da piocina, até que ela seja liberada para o ambiente (Sano,

Kageyama, 1981; Seo, Galloway, 1990; Sano et al., 1993b; Duport et al., 1995; Ling et al.,

2010; Elfarash et al., 2012; Rasouliha et al., 2013; Joshi et al., 2015; Dingemans et al., 2016).

Recentemente, Joshi et al. (2015) determinaram as estruturas cristalográficas do

domínio IV da subunidade citotóxica das piocinas S2 e AP41 de P. aeruginosa em associação

com suas respectivas proteínas imunitárias (Figura 2). Este estudo permitiu identificar as

bases moleculares e estruturais através do qual a proteína imunitária se liga na proteína

citotóxica, alcançando elevado grau de especificidade e afinidade.

O domínio IV da subunidade citotóxica, também conhecido como domínio DNase,

possui uma composição mista de α-hélices e fitas-β, contendo o motivo HNH, característico

das piocinas S1, S2 e AP41 (Joshi et al., 2015). O motivo HNH também está presente nas

colicinas com atividade de DNase ColE2, ColE7, ColE8 e ColE9 (Kleanthous et al., 1999;

Walker et al., 2002; Maté, Kleanthous, 2004; Doudeva et al., 2006). Ele é composto por 33

resíduos de aminoácidos localizados na extremidade C-terminal do domínio IV. Esses

aminoácidos adotam uma conformação de duas fitas-β antiparalelas rodeadas por uma α-

hélice. O motivo também possui quatro resíduos de histidinas altamente conservados

envolvidos na coordenação de um íon metálico divalente que catalisa a hidrolise da ligação

fosfodiéster do DNA (Kleanthous et al., 1999; Walker et al., 2002; Maté, Kleanthous, 2004;

Doudeva et al., 2006; Joshi et al., 2015; Klein et al., 2016). Essa região constitui o sítio ativo

da enzima (Figura 2).

A subunidade imunitária é composta por uma estrutura globular formada por quatro α-

hélices (Figura 2). O atual modelo pelo qual a subunidade imunitária inibe a atividade de

DNase é derivado de estudos estruturais das colicinas. De acordo com tal modelo, a proteína

imunitária se associa ao domínio DNase em uma região adjacente ao centro ativo da enzima

40

conhecida como IPE (immunity protein exosite). O conjunto de cargas negativas presentes na

proteína imunitária causa uma repulsão eletrostática ou um impedimento estérico que

bloqueia a interação do domínio DNase com o DNA da célula produtora da colicina (Walker

et al., 2002).

Figura 2 – Estrutura cristalográfica do domínio IV da piocina AP41 em associação com a

proteína imunitária

Nota: O domínio IV (DNase) da subunidade citotóxica está colorido em marrom enquanto que a subunidade

imunitária em azul. Para simplificação, os resíduos de histidinas que coordenam o íon metálico não estão

representados. Esta estrutura encontra-se depositada no PDB (protein data bank) com o seguinte código de

acesso: 4HUP.

Fonte: Adaptado de Joshi et al. (2015).

A ligação da subunidade imunitária na região IPE permite que os resíduos catalíticos

do centro ativo permaneçam inalterados. Por outro lado, ocorre uma grande diversificação de

resíduos de aminoácidos na interface de ligação entre ambas às subunidades. Isto garante

elevado grau de especificidade entre as diferentes moléculas de piocinas e suas respectivas

proteínas imunitárias (Kleanthous et al., 1999; Ko et al., 1999; Kleanthous, Walker, 2001;

Maté, Kleanthous, 2004; Joshi et al., 2015).

41

Os conhecimentos estruturais das moléculas de piocinas são fundamentais para o

entendimento do seu mecanismo de ação. Tais informações também podem ser utilizadas na

criação de modificações estruturais nas piocinas visando potencializar sua atividade

bactericida.

2.4.3 Liberação extracelular e interação com o receptor

Sob determinadas condições (ver seção 2.7) as piocinas são produzidas e liberadas

para o meio extracelular. O mecanismo pelo qual isso ocorre permanece desconhecido e o

conhecimento que se tem deriva de estudos com as colicinas.

Para evitar a morte da célula produtora, as colicinas são sintetizadas e mantidas em

associação com suas proteínas imunitárias. Portanto, as colicinas, e muito provavelmente as

piocinas, são liberadas para o ambiente na forma de complexos heterodiméricos compostos

pelas proteínas citotóxica e imunitária (Papadakos et al., 2012; Vankemmelbeke et al., 2013).

Durante o processo de liberação para o meio extracelular, as colicinas utilizam uma

proteína de lise codificada pelo operon das colicinas (van der WAL et al., 1995). No entanto,

análises dos genomas de P. aeruginosa revelaram a ausência de tal proteína, levantando

dúvidas sobre o mecanismo pelo qual as piocinas são liberadas (Ghequire, De Mot, 2014).

Nakayama et al. (2000) sugeriram que as piocinas do tipo S poderiam utilizar o

sistema de lise codificado pelo operon das piocinas do tipo R e F (ver seção 2.5). Tal hipótese

parece incompleta, visto que nem todas as linhagens produtoras de piocinas do tipo S

possuem as piocinas R e F.

Após liberadas, as piocinas S interagem com receptores específicos presentes na

superfície da célula alvo. Observações de que as piocinas S apresentam atividades

bactericidas aumentadas sob condições de carência de ferro, conduziram a descoberta de que

estas moléculas reconhecem receptores envolvidos na captação de ferro durante sua

translocação para o interior da célula alvo (Ohkawa et al.,1980; Sano et al., 1993b; Duport et

al., 1995; Elfarash et al., 2012, 2014; Inglis et al., 2016).

Sob condições de carência de ferro, P. aeruginosa sintetiza sideróforos de baixo peso

molecular com elevada afinidade por Fe3+

, conhecidos como pioverdinas e pioquelinas. Após

serem secretados, os sideróforos interagem com Fe3+

do ambiente, sendo em seguida captados

pela célula bacteriana através de proteínas de membrana externa reguladas por ferro

(IROMPs) (Cornelis, Dingemans, 2013).

42

Estudos mutagênicos forneceram evidências inequívocas de que as piocinas do tipo S

utilizam os IROMPs como receptores. Atualmente, sabe-se que as piocinas S2 e S4 utilizam o

receptor de ferropioverdina I (FpvAI) durante sua translocação para o interior da célula alvo

(Ohkawa et al., 1980; Smith et al., 1992; Denayer et al., 2007; Elfarash et al., 2012). Por outro

lado, a piocina S3 utiliza o receptor de ferropioverdina II (FpvAII) (Baysse et al., 1999)

enquanto a piocina S5 o receptor de ferropioquelina (FptA) (Elfarash et al., 2014).

A piocina L1, recentemente descrita, se liga em um tipo diferente de receptor. Essa

piocina utiliza o lipopolissacarídeo LPS como receptor, ligando-se especificamente no

antígeno polissacarídeo comum (CPA), um homopolímero de moléculas de D-ramnose

(McCaughey et al., 2014). CPA é o principal antígeno de superfície produzido por linhagens

de P. aeruginosa que crescem em pulmões de pacientes com fibrose cística (Lam et al., 1989;

Weisner et al., 2007; McCaughey et al., 2016b). A natureza dos receptores para as demais

piocinas permanece desconhecida.

Após interagir com o receptor, a molécula de piocina é translocada através da

membrana externa da célula alvo. O processo pelo qual isso ocorre permanece desconhecido,

porém, o fato de essas piocinas utilizarem os receptores de pioverdina e pioquelina sugere que

as mesmas sejam translocadas de maneira semelhante aos sideróforos (Cornelis, Dingemans,

2013).

Em P. aeruginosa, as moléculas de sideróforos são translocadas para o interior da

célula por intermédio do sistema TonB. TonB é uma proteína integral da membrana interna,

que utiliza a energia do gradiente de prótons da membrana interna para impulsionar o

transporte de substância através da membrana externa. TonB possui domínios que se projetam

em direção ao periplasma e interagem com receptores presentes na membrana externa. Após

se ligar ao seu receptor, a molécula de sideróforo é translocada para o interior da célula por

meio da proteína TonB (Jakes, Cramer, 2012).

Apesar dos receptores de algumas piocinas terem sido identificados, os eventos

moleculares envolvidos na translocação dessas moléculas através da membrana externa da

célula alvo permanecem desconhecidos. Recentemente, McCaughey et al. (2016a)

propuseram um mecanismo de direcionamento e translocação da piocina SD2 através da

membrana externa de P. aeruginosa (Figura 3). A piocina SD2 possui atividade do tipo

tRNase, porém sua região N-terminal, responsável pela ligação ao receptor, é semelhante à

piocina S2, ao qual possui atividade de DNase. Dessa forma, SD2 se liga no mesmo receptor

da piocina S2, especificamente o receptor de ferropioverdina I (FpvAI) (McCaughey et al.,

43

2016a). Por meio de análises in silico, Ghequire e De Mot (2014) identificaram o gene

codificador da piocina SD2 em genomas de P. aeruginosa e denominaram essa piocina como

S11 (Quadro 1). McCaughey et al. (2016a), porém, optaram por defini-la como SD2, devido à

sua semelhança com a piocina S2.

Além de se ligar ao receptor FpvAI, a piocina SD2 também interage com o antígeno

polissacarídeo comum (CPA) do lipopolissacarídeo LPS. De acordo com este modelo, a

ligação de SD2 ao antígeno CPA orienta a região N-terminal da molécula de piocina em

direção ao receptor FpvAI, localizado na membrana externa da célula alvo. Em seguida, uma

região intrinsicamente desestruturada, composta pelos cinquenta aminoácidos iniciais da

piocina, é inserida no interior do poro do receptor FpvAI, passando assim a interagir com a

maquinaria de translocação dependente de TonB. A interação do receptor FpvAI com a

proteína TonB, através de seu domínio TonB box, é essencial para a translocação da piocina

através da membrana externa (McCaughey et al., 2016a) (Figura 3).

Os eventos moleculares descritos acima são ligeiramente distintos daqueles que

ocorrem na translocação das colicinas. Inicialmente, as moléculas de colicinas se ligam a

receptores específicos envolvidos na captação de moléculas de alimento, como o receptor

BtuB, envolvido no transporte de cobalamina (Kleanthous, 2010). Ao contrário da piocina

SD2, a molécula de colicina não utiliza o poro do receptor durante sua translocação através da

membrana externa. Ela recruta uma proteína adicional de membrana externa, conhecida como

proteína translocadora (Jakes, Cramer, 2012; Papadakos et al., 2012) (Figura 4).

A porina OmpF atua como proteína translocadora de algumas colicinas do grupo A

(colicinas que utilizam a maquinaria Tol durante sua translocação para o interior da célula

alvo) (Cavard, Lazdunski, 1981; Housden et al., 2005). Durante sua interação com OmpF,

uma região de aminoácidos intrinsicamente desestruturada da porção N-terminal da colicina

se insere no interior do poro da molécula de porina (Zakharov et al., 2004; Yamashita et al.,

2008; Housden et al., 2010). Em seguida, a região de aminoácidos desestruturada estabelece

contatos com componentes da maquinaria Tol, especificamente a proteína TolB. A associação

com a maquinaria Tol impulsiona a translocação da colicina para o interior do periplasma

(Figura 4).

44

Figura 3 – Modelo de ligação e translocação da piocina SD2 através da membrana externa da

célula alvo

Nota: A piocina SD2 se liga ao antígeno polissacarídeo comum (CPA) na superfície da célula alvo através do

domínio de ligação ao CPA. A interação com CPA orienta a região N-terminal da molécula de piocina em

direção ao receptor FpvAI localizado na membrana externa da célula alvo. Em seguida, uma região

intrinsicamente desestruturada (desprovida de estrutura secudária), se insere no interior do poro do receptor

FpvAI, passando assim a interagir com a maquinaria de translocação dependente de TonB. O receptor FpvAI

interage com a proteína TonB através de seu domínio TonB box. A interação de FpvAI com TonB é essencial

para a translocação da piocina através da membrana externa.

Adaptado de: McCaughey et al. (2016a).

Para que a colicina exerça sua atividade bactericida no citoplasma da célula alvo, a

proteína imunitária deve se dissociar da subunidade citotóxica. Foi postulado que essa

dissociação ocorre durante a translocação da molécula de colicina através da membrana

externa (Duché et al., 2006). A dissociação da proteína imunitária requer a energia do

gradiente de prótons armazenada na membrana interna (Vankemmelbeke et al., 2009).

45

Figura 4 – Modelo de translocação da molécula de colicina através da membrana externa da

célula alvo

Nota: A molécula de colicina inicialmente interage com o receptor BtuB na superfície da célula alvo. Após

estabelecer contato com a porina OmpF, uma região de aminoácidos intrinsicamente desestruturada da colicina

se insere no interior do poro da molécula de porina. Durante sua translocação através do poro de OmpF, a

colicina interage com a maquinaria de transporte Tol ao qual impulsiona a translocação da colicina para o

interior do periplasma.

Nota: Adaptado de Jakes e Cramer (2012).

O mecanismo pelo qual as moléculas de piocinas se dissociam de suas subunidades

imunitárias permanece desconhecido. Há também uma carência de informações sobre o

mecanismo de translocação através da membrana interna da célula alvo.

2.5 Piocinas de alto peso molecular do tipo R e F

P. aeruginosa produz uma segunda classe de bacteriocinas conhecidas como piocinas

de alto peso molecular, do tipo R e F. Ao contrário das piocinas do tipo S, as piocinas R e F

são estruturas de alto peso molecular, que possuem elevada similaridade estrutural com a

cauda dos bacteriófagos P2 e lambda, respectivamente (Nakayama et al., 2000; Michel-

Briand, Baysse, 2002; Williams et al., 2008; Ghequire et al., 2015). Devido à sua semelhança

com a cauda de bacteriófagos alguns autores tem postulado a utilização do termo “tailocins”

(Ghequire, De Mot, 2014).

As piocinas R são estruturas cilíndricas e ocas com formato de bastão. Sua estrutura

básica é composta por um tubo (ou núcleo) inserido no interior de uma bainha (Figura 5A e

B). O núcleo e a bainha são formados por unidades repetitivas semelhantes a discos

46

empilhados. Cada disco possui seis subunidades proteicas organizadas com uma simetria

helicoidal (Figura 5C). A bainha é sustentada por uma base a partir da qual se projetam seis

fibras (ou caudas) responsáveis pelo ancoramento da piocina na superfície da célula alvo

(Ishii et al., 1965; Higerd et al., 1969; Takeda, Kageyama, 1975). Na extremidade do tubo

encontra-se uma estrutura com formato de agulha ancorada neste por uma segunda base.

Recentemente Ge et al. (2015) elucidaram a estrutura molecular da piocina R2 de P.

aeruginosa. Através de estudos de crio-microscopia eletrônica, os autores geraram modelos

atômicos da bainha nas formas contraída e relaxada (Figura 5A e B). Dessa forma, foi

possível criar um modelo que demonstra o mecanismo pelo qual a bainha se contrai e,

consequentemente, empurram o tubo para fora.

A unidade básica das piocinas R, composta por um tubo inserido dentro de uma

bainha, é estruturalmente semelhante à cauda dos bacteriófagos e à maquinaria de secreção do

tipo VI de P. aeruginosa (Ge et al., 2015; Ghequire, De Mot, 2015; Orlova, 2015).

Consequentemente, as piocinas R atuam de maneira semelhante a estas estruturas. Após a

interação da piocina com a superfície da célula alvo, a bainha se contrai empurrando o tubo

para o exterior (Figura 5A). Desta forma, a estrutura em formato de agulha presente na

extremidade do tubo perfura a superfície da célula alvo (Higerd et al., 1969; Govan, 1974a,b;

Shinomiya et al., 1975; Uratani, 1982; Uratani, Hoshino, 1984; Ge et al., 2015; Ghequire, De

Mot, 2015; Orlova, 2015). No entanto, ao contrário dos bacteriófagos e do sistema de

secreção do tipo VI, as piocinas R não injetam nenhum material genético ou moléculas

efetoras no interior da célula.

Durante a contração da bainha, a estrutura em formato de agulha forma canais na

membrana plasmática interna da célula alvo. Como consequência, ocorre a despolarização da

membrana seguida da morte da célula bacteriana devido ao bloqueio da síntese de proteínas e

ácidos nucleicos (Kaziro, Tanaka, 1965; Ohsumi et al., 1980; Uratani, Hoshino, 1984; ;

Michel-Briand, Baysse, 2002). Este sistema é altamente eficiente, visto que a ligação de uma

única molécula de piocina pode desencadear a morte da célula bacteriana (Kageyama et al.,

1964).

47

Figura 5 - Representação esquemática da piocina do tipo R

Nota: Piocina do tipo R com a bainha em sua forma contraída (A) e relaxada (B). Em (C), demonstra-se uma

representação de superfície da arquitetura das proteínas que compõe o tubo e a bainha. Uma sessão transversal

da piocina em sua forma relaxada (retângulo na figura B) é vista do topo. Dois monômeros componentes da

bainha destacam-se em azul-claro e escuro, ao passo que dois monômeros do tubo estão destacados em amarelo

e laranja. As outras subunidades (seis subunidades por volta) estão destacadas em cinza.

Fonte: Adaptado de Ghequire e De Mot (2015).

Até o momento não foi reportado nenhuma estrutura da piocina do tipo F. Estudos de

microscopia eletrônica demonstraram que estas piocinas são estruturas flexíveis, porém não

contráteis. Cada molécula é composta por 23 discos a partir dos quais se projetam fibras de

uma das suas extremidades. Existem poucas informações sobre seu mecanismo de ação, no

entanto, acredita-se que elas atuem de maneira semelhante às piocinas do tipo R, causando a

despolarização da membrana plasmática da célula alvo (Nakayama et al., 2000).

48

Atualmente já foram descritos cinco subtipos da piocina R (R1 a R5), baseados nos

diferentes receptores que elas reconhecem. A interação da molécula de piocina com o receptor

é mediada pela proteína Prf15 presente na fibra (cauda) da molécula (Ohsumi et al., 1980;

Kumazaki, Ishii, 1982; Michel-Briand, Baysse, 2002). Diferentes isoformas de Prf15

reconhecem receptores distintos presentes na superfície da célula alvo (Williams et al., 2008;

Ghequire, De Mot, 2014; 2015). Especificamente, Prf15 interage com a porção de carboidrato

das moléculas de lipopolissacarídeo (LPS) presentes na membrana externa bacteriana (Ikeda,

Egami, 1969; Govan, 1974a,b; Meadow, Wells, 1978; Kumazaki et al., 1982). Usando

linhagens mutantes para componentes específicos do lipopolissacarídeo, Köhler et al. (2010)

demonstraram que a piocina R1 reconhece um resíduo de L-ramnose, enquanto as piocinas R2

e R5 reconhecem resíduos distintos de D-glicose.

As piocinas do tipo F reportadas até o momento são: piocina 28 (Takeya et al., 1967),

430f (Govan, 1974a,b), F1, F2 (Kuroda, Kageyama, 1979) e F3 (Kuroda, Kageyama, 1981).

Assim como para as piocinas R, essa categorização é feita com base nas proteínas que

formam a cauda da piocina. Os receptores das piocinas do tipo F permanecem desconhecidos.

2.6 Regulação da síntese das piocinas

Em P. aeruginosa, os genes codificadores das piocinas estão localizados no

cromossomo bacteriano, contrário à maioria das outras bacteriocinas, como as colicinas de

Escherichia coli, cujos genes estão presentes em plasmídeos (Papadakos et al., 2012).

Os genes das piocinas do tipo S estão organizados na forma de um operon composto

de duas ORFs: A primeira ORF codifica a proteína citotóxica e a segunda a proteína

imunitária (Figura 6). Na maioria dos casos, o códon de parada do gene citotóxico está

separado por poucas bases do códon de inicio da transcrição (ATG) do gene imunitário (Sano

et al., 1993b). Além disso, a sequência de ligação do ribossomo (Shine Dalgarno - SD2) do

gene imunitário está presente no interior do gene citotóxico (Sano et al., 1993b) (Figura 6).

Tal organização gênica permite que o ribossomo sintetize as duas proteínas simultaneamente,

garantindo assim, que a subunidade imunitária se ligue rapidamente à subunidade citotóxica,

inativando-a e garantindo a imunidade da célula produtora da piocina (Michel-Briand, Baysse,

2002).

49

Figura 6 - Organização gênica das piocinas do tipo S

Nota: As piocinas do tipo S são codificadas por dois genes (ORFs – Open Reading Frame) organizados em um

operon. A sequência regulatória P-box atua como sítio de ligação da proteína ativadora da transcrição PrtN. As

sequências de nucleotídeos são referentes aos genes codificadores da piocina S2 da P. aeruginosa PAO1

(GenBank: D12708). Fonte: Adaptado de Michel-Briand e Baysse (2002).

Os genes codificadores das piocinas de alto peso molecular dos tipos R e F estão

organizados conjuntamente, constituindo um cluster gênico. Na linhagem PAO1, produtora

das piocinas R2 e F2, os genes dessas piocinas estão localizados no interior do operon do

triptofano, especificamente entre os genes trpE e trpG (Kageyama, 1974; Matsui et al., 1993;

Shinomiya et al., 1983a,b) (Figura 7).

Figura 7 - Representação esquemática do conjunto de genes (cluster) codificadores da

piocina R2 de P. aeruginosa PAO1

Nota: As informações descritas na figura indicam funções gênicas conhecidas. Os números de 3 a 27 indicam a

denominação prf dos genes. Os genes envolvidos na regulação da síntese das piocinas prtR e prtN são transcritos

da direita para a esquerda. A seta indica a direção da transcrição.

Fonte: Adaptado de Williams et al. (2008).

Dezesseis ORFs localizadas a jusante do gene trpE (prf10 a prf23, sendo que as orfs

prf11 e prf19 são nomeadas duas vezes) participam da síntese da piocina R2. Dentre essas,

doze ORFs apresentam elevada similaridade de sequência com os genes de fagos da família

50

P2, tais como P2, 186, e ΦCTX (Portelli et al., 1998; Nakayama et al., 2000). De fato, a

ordem dos genes do fago P2 é altamente semelhante aos genes da piocina R2 (Nakayama et

al., 2000). O conjunto de genes (cluster) envolvidos na síntese da piocina F2 se localiza

exatamente a jusante da piocina R2 (Shinomiya et al., 1983b; Matsui et al., 1993).

Além dos genes responsáveis pela produção das piocinas R2 e F2, o cluster gênico

situado no interior do operon do triptofano também codifica um sistema de lise composto por

cinco proteínas (Figura 7 – genes com coloração amarela). Nakayama et al. (2000)

propuseram que esse sistema de lise seja responsável pela liberação das moléculas de piocinas

para o meio extracelular. Dessa forma, a síntese das piocinas pode ser considerada um evento

suicida, visto que a célula bacteriana morre durante esse processo (como será discutido

posteriormente).

A indução da transcrição dos genes das piocinas R, F e S ocorre de maneira

semelhante à ativação da resposta SOS em Escherichia coli. A resposta SOS é ativada quando

o cromossomo bacteriano sofre inúmeras lesões resultando no bloqueio da forquilha de

replicação do DNA. Como consequência, regiões de DNA simples fita (ssDNA) são geradas,

as quais atuam como substrato de ligação da proteína RecA, originando um filamento

nucleoproteico ssDNA-RecA. O filamento de RecA ligado a ssDNA induz a autoclivagem de

uma proteína repressora conhecida como LexA. Em condições de não indução, LexA liga-se a

regiões promotoras dos genes da resposta SOS inibindo a transcrição dos mesmos. Quando o

filamento de RecA é formado, LexA sofre autoclivagem liberando a transcrição dos genes da

resposta SOS (Ghequire, De Mot, 2014; Penterman et al., 2014).

A proteína RecA também atua na regulação da síntese das piocinas, porém, o repressor

LexA não possui nenhum envolvimento nesse processo, sendo sua função substituída pelas

proteínas PrtN e PrtR. PrtN é um ativador transcricional responsável pela indução da

transcrição dos genes codificadores dos três tipos de piocinas (Nakayama et al., 2000; Sun et

al., 2014). Na sua forma ativa, PrtN se liga nas regiões promotoras dos genes das piocinas em

uma sequência de DNA denominada P-box (Matsui et al., 1993). A ligação de PrtN nas

sequências P-box induz a transcrição dos genes das piocinas (Shinomiya et al., 1983a; Sano,

Kageyama, 1987; Matsui et al., 1993) (Figura 8).

51

Figura 8 - Representação esquemática da regulação da síntese de piocinas em P. aeruginosa

Nota: (A) Sob condições normais de crescimento, PrtR se liga na região promotora do ativador transcricional

PrtN, inibindo a sua síntese. (B) A exposição das células a agentes mutagênicos, como luz ultravioleta (UV) ou

mitomicina C, causa um aumento nos níveis de danos ao DNA, promovendo a ativação da proteína RecA. RecA

na sua forma ativa induz a autoclivagem de PrtR. Desta forma, ocorre a transcrição de PrtN, que por sua vez

ativa a transcrição dos genes codificadores das piocinas.

Fonte: Adaptado de Michel-Briand e Baysse (2002).

Sob condições de não indução, no qual não haja o acúmulo de danos no DNA

cromossômico, a transcrição de PrtN é inibida pelo repressor PrtR. No entanto, durante o

acúmulo de lesões no DNA, PrtR é inativado pelo filamento de ssDNA-RecA de maneira

semelhante à inativação de LexA (Matsui et al., 1993). A inativação de PrtR libera a

transcrição de PrtN e, como consequência, inúmeras moléculas de piocinas, são produzidas.

(Sano, Kageyama, 1993; Sano et al., 1993b) (Figura 8).

Conforme citado acima, a proteína RecA desempenha um papel central na regulação

da síntese das piocinas e também na indução da resposta SOS. RecA regula esses dois

processos através da indução da autoclivagem das proteínas repressoras PrtR e LexA,

respectivamente.

Estudos demonstraram que os genes da resposta SOS aumentam a sobrevivência

celular enquanto que os genes regulados por PrtR possuem um efeito contrário, induzindo a

52

morte da célula bacteriana (como será discutido a seguir). Os efeitos opostos dessas duas vias

de sinalização levantou a questão de como a célula de P. aeruginosa regula tais processos.

Penterman et al. (2014) propuseram que a proteína RecA interage de maneira diferente com as

proteínas repressoras LexA e PrtR. Nesse modelo, RecA possui uma afinidade muito maior

pelo repressor LexA em relação a PrtR. Sendo assim, somente a resposta SOS poderá ser

induzida durante a fase inicial do período de estresse. Por outro lado, se a fonte causadora do

estresse for mantida, PrtR sofrerá autoclivagem e a síntese das piocinas será ativada.

Conforme já salientado, a produção das piocinas ocorre em decorrência da

autoclivagem de PrtR e consequente expressão de PrtN. Além dos genes das piocinas, PrtN

também ativa a expressão de um conjunto de enzimas líticas codificadas pelo cluster gênico

das piocinas R2 e F2 (Nakayama et al., 2000). Após a síntese das piocinas, as enzimas líticas

promovem a lise da célula bacteriana, liberando as piocinas para o meio extracelular.

Devido o ativador PrtN induzir a transcrição de enzimas líticas, a produção das

moléculas de piocinas representa um evento suicida para a célula bacteriana. Nesse sentido, a

síntese das piocinas pode ser vista como o resultado final de inúmeras tentativas da célula

bacteriana em lidar com a situação de estresse. Conforme citado acima, RecA em seu estado

ativo, possui uma afinidade muito maior pelo repressor LexA em comparação com PrtR. Essa

diferença de afinidade permite que a célula induza a resposta SOS sem ativar a síntese das

piocinas.

Existe também outro mecanismo pelo qual a célula bacterina reprime a transcrição dos

genes das piocinas, durante a ativação da resposta SOS. Sun et al. (2014) demonstraram que

PrtR exerce um efeito autorrepressor ligando-se diretamente em sua própria região promotora.

Curiosamente, PrtR possui uma afinidade maior pela região promotora de PrtN do que pelo

seu próprio promotor. Dessa forma, durante a indução da resposta SOS, a autoclivagem de

PrtR induz a transcrição de novas moléculas de PrtR, porém a síntese de PrtN permanece

bloqueada. Dessa forma, a bactéria pode manter um nível estável de PrtR necessário para

reprimir PrtN e dessa forma bloquear, ou no mínimo atrasar, a produção de piocinas até que o

suicídio bacteriano torne-se absolutamente necessário.

A ativação da transcrição dos genes das piocinas pode não ser apenas dependente da

autoclivagem do repressor PrtR. Llamas et al. (2008) demonstraram que a superexpressão do

fator sigma extra citoplasmático PA4896 na linhagem de P. aeruginosa PAO1 induziu a

expressão das piocinas R2, F2 e S5. Curiosamente, a expressão da piocina S2 não sofreu

indução, indicando um mecanismo de sinalização específico para as piocinas R2, F2 e S5. O

53

fator sigma extracitoplasmatico PA4896 faz parte de um sistema de sinalização envolvido na

captação de sideróforos. Dessa forma, foi especulado que enquanto a bactéria captura a

molécula de sideróforo de outras linhagens bacterinas ela ao mesmo tempo induz a morte das

mesmas através da produção de piocinas (Llamas et al., 2008).

O fato de RecA regular a síntese das piocinas indica que essas moléculas são

sintetizadas em condições onde haja o acúmulo de danos ao DNA. Agentes genotóxicos que

causam extensivas lesões no DNA tais como luz UV e mitomicina C, têm sido reportados

induzirem fortemente a síntese das piocinas (Morse et al., 1976; Michel-Briand, Baysse,

2002).

Outros agentes externos têm sido demonstrados induzirem a expressão das piocinas.

Antibióticos do grupo das fluoroquinolonas (ciprofloxacina) que inibem a DNA girase ou a

topoisomerase IV, foram demonstrados ativarem a transcrição das piocinas (Brazas, Hancock,

2005; Penterman et al., 2014; Sun et al., 2014). Chang et al. (2005) reportaram que o estresse

oxidativo causado pelo tratamento das células bacterianas com peróxido de hidrogênio

induziu a transcrição da piocina S5.

2.7 Funções biológicas das piocinas

A exata função biológica das piocinas é uma questão de debate, porém há um

consenso na literatura de que essas moléculas desempenham um papel na competição entre

organismos de uma mesma espécie (competição intraespecífica) em ambientes onde a

disponibilidade de nutrientes é limitada (Michel-Briand, Baysse, 2002; Riley, Wertz, 2002a;

Bakkal et al., 2010). Nesse sentido, a atividade das piocinas poderia assegurar a

predominância de uma linhagem produtora de piocina contra outras linhagens sensíveis a essa

piocina (Riley, Gordon, 1999; Michel-Briand, Baysse, 2002; Parret, De Mot, 2002; Riley,

Wertz, 2002a,b; Denayer, et al., 2007; Ghoul et al., 2015; Lee et al., 2016).

Heo et al. (2007) investigaram a função das piocinas na competição bacteriana através

do cocultivo das linhagens PAO1, PA14 e PAK. Foi observado que as linhagens PAO1 e

PA14 eliminaram completamente a linhagem PAK quando cultivadas em conjunto. A

eliminação da linhagem PAK se deveu à atividade citotóxica da piocina do tipo R (Heo et al.,

2007). Em estudo subsequente, Waite e Curtis (2009) cocultivaram uma linhagem produtora

de piocina com uma linhagem sensível em um modelo de biofilme. O estudo revelou que altos

54

níveis de piocinas são produzidos, resultando na predominância da linhagem produtora da

piocina (Waite, Curtis, 2009).

Um importante fator para a manutenção evolutiva da produção de piocinas é o fato de

que essas moléculas atacam especificamente indivíduos não relacionados, não possuindo

nenhum efeito sobre a linhagem produtora devido a fatores de imunidade relacionados com a

piocina. O termo “não relacionados”, utilizado nesse contexto, refere-se à similaridade do

locus gênico codificador da piocina entre os indivíduos e não à similaridade média do restante

de seus genomas (Inglis et al., 2009). Dessa forma, duas linhagens com genomas muito

parecidos podem produzir piocinas diferentes.

A produção das piocinas tem sido considerada um evento “vingativo” (spiteful), pois

os custos biológicos da produção dessas moléculas (morte da célula bacteriana) supera os

benefícios obtidos com a morte das linhagens competidoras (Inglis et al., 2013). Há indícios

de que a ação “vingativa” das piocinas poderia ser favorável em situações em que a linhagem

produtora apresente frequências intermediárias em relação à linhagem sensível em uma

determinada população (Gardner et al., 2004; Inglis et al., 2009). Nessa condição, o

comportamento “vingativo” das piocinas torna-se vantajoso, pois ele causa prejuízos aos

indivíduos competidores, permitindo a exploração dos recursos não utilizados pela linhagem

produtora da piocina. Em contrapartida, havendo elevadas frequências da linhagem produtora

da piocina, haverá também uma redução nos benefícios do comportamento “vingativo” das

piocinas, pois existirão poucos competidores para se combater e, portanto, poucos recursos a

serem obtidos.

2.8 Resistência bacteriana frente às piocinas

Alguns estudos demonstraram o surgimento da resistência bacteriana frente às

piocinas. A resistência de P. aeruginosa a uma determinada piocina ocorre por diferentes

fatores. Normalmente uma determinada linhagem é imune à ação de sua própria piocina, em

decorrência da proteína imunitária que se liga à subunidade citotóxica, inibindo sua atividade.

A proteína imunitária é sintetizada conjuntamente à subunidade citotóxica, assegurando uma

produção balanceada das duas proteínas.

Em princípio, células produtoras de piocinas necessitam neutralizar as piocinas

produzidas por seus clones (clonemates) (Inglis et al., 2013). De qualquer forma, a linhagem

que possuir o gene da subunidade imunitária será imune à piocina que essa proteína

55

imunitária reconhece. Curiosamente, existem genes imunitários ditos “órfãos”, pois não são

precedidos por genes citotóxicos. Linhagens possuidoras de tais genes se tornam protegidas

das piocinas cognatas as quais essas proteínas imunitárias interagem (Denayer et al., 2007;

Elfarash et al., 2012, 2014; Rasouliha et al., 2013).

P. aeruginosa utiliza o sideróforo pioverdina para captar Fe3+

do ambiente. A molécula

de pioverdina é composta por um cromóforo que se liga ao Fe3+

com alta afinidade e uma

cadeia peptídica que interage com o receptor da membrana externa. Cada linhagem de P.

aeruginosa sintetiza um de três possíveis tipos de pioverdina, as quais interagem com

receptores específicos. Durante sua translocação para o interior da célula alvo, as piocinas do

tipo S2, S3 e S4 interagem com diferentes receptores de pioverdina. Se uma célula expressar

um receptor diferente ao qual uma determinada piocina se liga, ela será resistente contra essa

piocina.

O surgimento de linhagens resistentes às piocinas S2, S3 ou S4 poderia ser devido à

perda da função do receptor ao qual elas interagem ou uma diminuição na sua expressão.

Inglis et al. (2016) demonstraram que o surgimento de células resistentes à piocina S2 ocorre

com maior frequência em condições em que o ferro é facilmente disponível. Nessa condição,

na qual o receptor FpvAI e a pioverdina não são necessários, mutações que inativam o

receptor não restringem o crescimento bacteriano. Por outro lado, quando o ferro estiver

escasso e, o receptor FpvAI e a pioverdina forem necessários, qualquer mutação no receptor

irá restringir o crescimento bacteriano.

2.9 O envolvimento das piocinas no processo infeccioso

P. aeruginosa não é um patógeno “profissional”, pois apesar de sua versatilidade

metabólica e seu enorme repertório de fatores de virulência, ela é considerada um patógeno

oportunista que precisa se adaptar ao ambiente do hospedeiro a fim de sobreviver (Crousilles

et al., 2015). Dessa forma, um dos principais desafios no combate desse patógeno é a

identificação de quais fatores microbianos são importantes para o sucesso da manutenção da

infecção.

As infecções por P. aeruginosa podem ser classificadas em aguda e crônica. Infecções

agudas frequentemente se originam localmente, mas podem rapidamente se tornar sistêmicas,

levando à morte em questão de dias (Parrillo et al., 1990; Crouch Brewer et al., 1996; Yahr,

Parsek, 2006; Crousilles et al., 2015). Por outro lado, infecções respiratórias crônicas, comuns

56

em pacientes com fibrose cística, são minimamente invasivas, não citotóxicas e raramente

progridem para infecções sistêmicas (Høiby et al., 2001; Rajan, Saiman, 2002).

A produção das piocinas ocorre durante a resposta SOS, quando a autoclivagem de

PrtR induz a expressão do ativador transcricional PrtN (Matsui et al., 1993; Michel-Briand,

Baysse, 2002). Há indícios de que PrtR possa desempenhar uma função nas infecções de P.

aeruginosa (Sun et al., 2014). Durante a infecção do hospedeiro, P. aeruginosa é exposta às

espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pelos neutrófilos (Hector et al., 2014) e às

fluoroquinolonas (Brazas, Hancok, 2005). Tais condições induzem fortemente a resposta SOS

e, em princípio, poderiam induzir a produção de piocinas (Chang et al., 2005; Barreteau et al.,

2012; Wei et al., 2012).

A regulação da síntese das piocinas durante a colonização do hospedeiro parece ser

um processo complexo. A deleção de PrtN não afetou a colonização de P. aeruginosa em um

modelo de pneumonia aguda de camundongo. Por outro lado, a dupla mutação de prtN e prtR

reduziu significativamente a carga bacteriana (Sun et al., 2014).

Foi demonstrado que durante a entrada do patógeno no hospedeiro as espécies reativas

de oxigênio, liberadas pelos neutrófilos, ativam a resposta SOS, o que ocaziona a

autoclivagem de PrtR e induz a transcrição de novas moléculas de PrtR, uma vez que esta

proteína exerce um efeito repressor sobre o seu próprio promotor. O resultado final é a

manutenção de níveis relativamente estáveis da proteína PrtR ao qual possui dupla função: 1)

ativar a expressão dos componentes do sistema de secreção do tipo III (T3SS) e 2) inibir a

síntese das moléculas de piocinas (Sun et al., 2014).

Foi demonstrado que PrtR é necessário para a ativação de T3SS através da repressão

da expressão de PrtB, um inibidor específico de T3SS (Wu, Jin, 2005). T3SS desempenha

uma importante função na indução da morte dos neutrófilos, permitindo a sobrevivência e a

replicação da bactéria dentro do hospedeiro (Diaz et al., 2008; Diaz, Hauser, 2010; Howell et

al., 2013). Enquanto ativa a expressão dos componentes de T3SS, PrtR simultaneamente inibe

a síntese das piocinas. Visto que a produção de piocinas é considerada um evento suicida, a

manutenção de níveis estáveis de PrtR bloqueia, ou no mínimo, atrasa a produção dessas

moléculas, até que o suicídio bacteriano torne-se absolutamente necessário (Sun et al., 2014).

A inibição da produção de piocinas aumenta a resistência da bactéria a alguns antibióticos

possibilitando sua sobrevivência frente a agentes genotóxicos (Brazas, Hancock, 2005;

Penterman et al., 2014).

57

A transição da infecção aguda para crônica envolve uma série de mudanças

transcricionais que culminam na produção de biofilme (Jimenez et al., 2012). P. aeruginosa

comumente forma biofilmes em pacientes que sofreram queimaduras severas, estão

imunocomprometidos ou possuem fibrose cística (Chatzinikolaou et al., 2000; Gang et al.,

1999; Jones et al., 2010; Winstanley et al., 2016).

A produção de piocinas desempenha um importante papel na competição bacteriana

pela disputa por nutrientes (Riley, Wertz, 2002b). Há indícios de que durante as infecções

crônicas, a produção de piocinas poderia atuar na competição bacteriana garantindo a

manutenção de P. aeruginosa no interior do hospedeiro (Bakkal et al., 2010).

O pulmão de um paciente com fibrose cística é uma ambiente heterogêneo, hostil e

estressante para a bactéria invasora. As condições estressantes incluem: estresse osmótico,

devido à produção de muco (Brocker et al., 2012); estresse oxidativo (Hector et al., 2014) e

nitrosativo (Wood et al., 2007), devido a respostas do hospedeiro; concentrações subletais de

antibióticos (Andersson, Hughes, 2014); e a presença de outros microrganismos (Fodor et al.,

2012; Lopes et al., 2015). Portanto, as populações de P. aeruginosa precisam superar estes

desafios para persistir e sobreviver no hospedeiro (Winstanley et al., 2016).

Foi demonstrado que a expressão dos genes das piocinas é induzida quando P.

aeruginosa é cultivada na forma de biofilme sob condições aeróbicas e ou anaeróbicas, porém

a atividade matadora das piocinas foi significativamente maior sob condições de cultivo

anaeróbicas. O cocultivo de linhagens produtoras de piocinas com linhagens sensíveis, no

modelo de biofilme, revelou que a produção de piocinas causou uma redução de quase 100%

no número de bactérias sensíveis à ação das piocinas (Waite, Curtis, 2009).

P. aeruginosa é a espécie prevalente nos pulmões de pacientes com fibrose cística,

causando infeções crônicas persistentes (Winstanley et al., 2016). Por outro lado, espécies de

Burkholderia cepacia também colonizam estes pacientes, indicando que ambas as espécies

competem no interior do pulmão (Govan, Deretic, 1996). Outro trabalho demonstrou que as

piocinas dos tipos R e F causaram a morte de B. cepacia, indicando seu envolvimento nas

interações de competição no interior do pulmão (Bakkal et al., 2010)

2.10 Potenciais aplicações das piocinas

Diante da problemática ausência de antimicrobianos eficientes contra Pseudomonas

aeruginosa multirresistentes, as piocinas poderão se tornar valiosas ferramentas em futuras

58

aplicações terapêuticas. Todavia, estudos da atividade bactericida das piocinas contra

linhagens multirresistentes, associadas com infecções hospitalares, ainda têm sido pouco

explorados.

Dois trabalhos independentes reportaram a potente atividade bactericida das piocinas

do tipo S contra isolados clínicos de P. aeruginosa. O primeiro deles utilizou a piocina S5

contra sete linhagens (DWW3, InA, InB, In3, In4, In7 e In8) (Ling et al., 2010), enquanto o

segundo empregou a piocina S2 frente a três isolados crescendo na forma de biofilme

(YHP14, YHP15, e YHP7) (Smith et al., 2012). Ambos os trabalhos utilizaram versões

recombinantes das piocinas clonadas a partir do genoma da linhagem PAO1. Porém não

houve descrição do perfil de resistência antimicrobiana das linhagens testadas.

Recentemente, McCaughey et al. (2016b) reportaram a eficácia das piocinas do tipo S

na proteção de animais infectados com P. aeruginosa. Neste trabalho, as piocinas do tipo S2,

S5, AP41 e L1 foram altamente efetivas em reduzir a carga bacteriana em modelos de animais

de pneumonia aguda infectados com P. aeruginosa.

As piocinas R também vêm sendo utilizadas como possíveis compostos

antimicrobianos. Sua atividade bactericida tem sido avaliada in vivo em modelos de

camundongos infectados com P. aeruginosa (Merrikin, Terry, 1972; Haas et al., 1974; Scholl,

Martin, 2008; Ritchie et al., 2011). Visando aumentar o espectro de ação da piocina R2,

Williams et al. (2008), construíram piocinas hibridas através de fusões gênicas envolvendo a

proteína da cauda da piocina R2 com a proteína da cauda do fago P2. Com tal abordagem, foi

possível aumentar o espectro bactericida da piocina R2 para bactérias de Escherichia coli

uropatogênicas (UPEC). De maneira semelhante, Scholl et al. (2009) redirecionaram a piocina

R2 para a linhagem de E. coli produtora da toxina Shiga (STEC), uma das principais

causadoras de colite (podendo progredir para hemorrágica e a síndrome hemolítica urêmica).

Nos estudos descritos acima, a maioria das piocinas utilizadas são derivadas da

linhagem modelo PAO1, amplamente utilizada em laboratórios de pesquisa (exceto AP41 e

L1) (Scholl, Martin, 2008; Williams et al., 2008; Scholl et al., 2009; Ling et al., 2010; Ritchie

et al., 2011; Smith et al., 2012). Por outro lado, a redução nos custos de sequenciamento de

DNA tem elevado exponencialmente o número de sequências genômicas de P. aeruginosa

disponibilizadas nos bancos de dados, possibilitando a identificação de inúmeras piocinas

novas, além de revelar grande diversidade e distribuição na natureza (Ghequire, De Mot,

2014). Nesse sentido, este trabalho teve por objetivo identificar novas moléculas de piocinas

que apresentem potente atividade bactericida contra cepas de P. aeruginosa multirresistentes.

59

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Identificar uma(s) molécula(s) de piocina(s) que apresente(m) ampla atividade bactericida

contra cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes.

3.2 Objetivos específicos

Selecionar cepas de P. aeruginosa que produzam piocinas com ampla atividade bactericida

contra as linhagens de P. aeruginosa multirresistentes (MRs).

Purificar as piocinas das cepas selecionadas e avaliar sua atividade bactericida contra as

linhagens de P. aeruginosa MRs.

Identificar a molécula de piocina responsável pela morte das linhagens multirresistentes.

Sequenciar o genoma da cepa produtora das piocinas com ampla atividade bactericida.

Identificar o contexto genético de piocinas com ampla atividade bactericida, utilizando WGS

(Whole Genome Sequencing).

Realizar a clonagem, superexpressão e purificação da piocina identificada.

Avaliar a atividade bactericida da piocina recombinante contra as linhagens de P. aeruginosa

multirresistentes.

60

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Condições de cultivo e estocagem das cepas de Pseudomonas aeruginosa

As cepas de Pseudomonas aeruginosa foram semeadas em meio ágar MacConkey

(Oxoid, Hampshire, England) e incubadas por 24 h a 37 °C. As colônias foram então

semeadas em 2 mL de meio caldo BHI (infusão cérebro-coração) e incubadas a 37 °C por 24

horas a 150 rpm. O resultado dessa semeadura foi acrescido de 20% de glicerol e congelado

para preservação.

4.2 Testes de sensibilidade de antimicrobianos pelo método de disco-difusão

Foram realizados antibiogramas para a determinação do perfil de resistência das cepas

de Pseudomonas aeruginosa produtoras de β-lactamases através do método de disco-difusão,

seguindo as normas padronizadas do CLSI (2015). O critério de interpretação foi de acordo

com o estabelecido pelo CLSI (2016), a fim de se obter o perfil de resistência para os

antibióticos Imipenem (10 μg), Meropenem (10 μg), Ceftazidima (30 μg), Amicacina (30 μg),

Ciprofloxacina (5 μg), Aztreonam (30 μg), Piperacilina/Tazobactam (100/10 μg), Cefepima

(30 μg), Gentamicina (10 μg) e Levofloxacina (5 μg) (Sensifar-Cefar, Diagnóstica, São Paulo,

Brasil).

4.3 Cepas de Pseudomonas aeruginosa

As cepas de Pseudomonas aeruginosa clonalmente não relacionadas e previamente

caracterizadas por estudos anteriores, foram selecionadas conforme descrito abaixo, no

Quadro 2.

61

Quadro 2 – Linhagens de Pseudomonas aeruginosa utilizados neste trabalho

Nota: * No quadro foram incluídas Cepas Indicadoras (CI), utilizadas para a piocinotipagem (Gillies, Govan,

1966; Govan, Gillies, 1969) para triar possíveis piocinas; a apresenta superexpressão de bomba de efluxo. Não

Determinado (ND).


bactericida (piocinotipagem)

A triagem de cepas de P. aeruginosa produtoras de piocinas com elevado potencial

bactericida foi feito de acordo com a metodologia de piocinotipagem descrita anteriormente

(Gillies, Govan, 1966; Govan, Gillies, 1969; Fyfe et al., 1984).

As cepas testadas foram cultivadas em placas de ágar Mueller-Hinton para obtenção

de colônias isoladas. As células foram suspensas em 1 mL de água destilada estéril, a fim de

Isolados Origem Genótipo de

resistência Referência ou Fonte

48-1997A Clínica SPM-1 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

247-B Clínica VIM-1 Neves (2010)

PaGIM Clínica GIM-1 Castanheira et al. (2004)

Pa BH6 Clínica KPC-2 Profa. Ana Lúcia da Costa Darini (FCF-USP-RP)

Pa PHB64 Clínica GES-5 Profa. Mara C. Nogueira (FM-FAMERP-SJRP)

PaIMP Clínica IMP-1 Dra. Doroti O. Garcia (Instituto Adolfo Lutz)

298 Clínica OXA-18 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

395 Clínica IMP-18 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

179 Clínica VIM-1 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

1088 Clínica SPM-1 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

392 Clínica OXA-10 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

225 Clínica GES-1 Dra. Ana Gales (Laboratório ALERTA, UNIFESP/EPM)

24 Clínica RmtD Neves (2010)

C916a Clínica negativo Neves (2010)

44 Clínica SPM-1 Neves (2010)

19 Ambiental SPM-1 Fontes et al. (2011)

141 Ambiental SPM-1 Turano et al. (2016)

151 Ambiental SPM-1 Turano et al. (2016)

ET02 Clínica OXA-50 Este trabalho

CI1 * Clínica ND Gillies e Govan (1966)







CSIA * Clínica ND Lincopan (1999)

CIB * Clínica ND Lincopan (1999)

CIC * Clínica ND Lincopan (1999)

CID * Clínica ND Lincopan (1999)

PAO1 Clínica OXA-50 Dra. Sílvia F. Costa (Lab. de Bacteriologia, HC, FMUSP)

62

se obter uma suspensão de 108 bactérias/mL. A partir dessa suspensão, volumes de 1,2 µL

foram adicionados em placas de ágar Mueller-Hinton, formando pequenas gotas de células.

As placas foram incubadas a 30 ºC, por 6 horas para permitir o crescimento bacteriano. Após

este período, as placas foram expostas diretamente ao vapor de clorofórmio por 20 minutos.

Esse vapor foi gerado por um papel filtro de 3 cm2 embebido com 300 µL de clorofórmio e

depositado no interior das tampas das placas previamente invertidas. Em seguida adicionou-se

sobre as placas uma monocamada de células das linhagens multirresistentes a qual se deseja

matar.

A monocamada das linhagens multirresistentes é preparada da seguinte maneira:

células bacterianas, previamente crescidas em placas de Mueller-Hinton foram utilizadas para

gerar uma suspensão contendo 108 bactérias/mL em meio líquido Mueller-Hinton. Após 4 h

de incubação, 100 µL dessa suspensão foram misturados com 3,5 mL de ágar semissólido (0,5

g de ágar e 1 g de protease peptona Himedia em 100 mL de água destilada). A mistura foi

vertida sobre a superfície das placas contendo as cepas produtoras de piocinas mortas pelo

clorofórmio. As placas foram incubadas a 37 ºC overnight. As leituras foram realizadas

observando se houve a formação de halos inibitórios de crescimento.

Com tal metodologia é possível testar um grande número de linhagens produtoras de

piocinas em uma única placa contendo a monocamada de uma determinada cepa

multirresistente.

Cepas produtoras de piocinas que formaram grandes halos inibitórios foram

posteriormente avaliadas contra as linhagens multirresistentes através de uma pequena

modificação da metodologia de piocinotipagem. Para melhor visualização dos halos,

aumentou-se o volume das células produtoras de piocinas adicionadas nas placas expostas ao

clorofórmio (o volume inicial de 1,2 µL foi aumentado para 20 µL).

4.5 Purificação das piocinas das células de P. aeruginosa

A purificação das piocinas foi feita conforme descrito previamente (Williams et al.,

2008; Scholl et al., 2009; Ge et al., 2015). Uma cultura saturada de células de P. aeruginosa

foi obtida através do inóculo de 3 colônias bacterianas em 10 mL de meio G (20 g de

glutamato de sódio, 5 g de glicose, 2.23 g de Na2HPO4, 100 mg de MgSO4 - 7H2O, 250 mg de

KH2PO4, 500 mg de extrato de levedura, completar com água ultrapura para um litro) seguido

de incubação overnight a 37 ºC, 250 rpm. No dia seguinte, a cultura foi diluída 1:100 em 50

63

mL de meio G fresco e incubada a 37 ºC, 250 rpm, até atingir uma OD600 final de 0,250. A

indução da síntese de piocinas foi feita através da adição de mitomicina C (a partir de

Streptomyces caespitosus – Sigma M4287) para uma concentração final de 3 µg/mL seguida

de incubação por 3 h. Nesse período, ocorre a lise das células devido a produção e liberação

das piocinas de alto peso molecular R e F. Em seguida, adicionou-se DNase I (Boehringer

Mannheim, Mannheim, Germany) para uma concentração final de 2 U/mL seguido de

posterior incubação por 30 min. O lisado bacteriano foi centrifugado a 17,000 x g, 4 ºC, em

centrifuga Hitachi Himac CR20B2 com o rotor RPR20-2-4601, por 1 h e o sobrenadante foi

coletado. Uma solução saturada de sulfato de amônio (4 M) foi adicionada ao sobrenadante

em uma taxa de fluxo de 1 mL/min para uma concentração final de 1.6 M. Durante a adição

de sulfato de amônio, a solução foi mantida sob agitação no gelo. A suspensão foi estocada a

4 ºC overnight. No dia seguinte, centrifugou-se a mistura a 17,000 x g, 4 ºC, em centrifuga

Hitachi Himac CR20B2 com o rotor RPR20-2-4601, por 2 h. O pellet obtido foi ressuspenso

com 5 mL de tampão Tn50 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5]). As piocinas do tipo R

e F foram coletadas através de ultracentrifugação a 61,000 x g, 4ºC, em centrifuga Sorvall

Ultra Pro80 com o rotor AH-629, por 1 h e ressuspensas em 1 mL de tampão Tn50.

Alternativamente, o período da ultracentrifugação foi aumentado para 2 h permitindo que as

piocinas de alto peso molecular fossem eficientemente sedimentadas. O sobrenadante dessa

ultracentrifugação, contendo as piocinas do tipo S, também foi coletado. As amostras foram

mantidas a 4 ºC até posterior análise.

4.6 Atividade bactericida das piocinas purificadas de P. aeruginosa (ensaio de

monocamada)

A atividade bactericida das piocinas frente às cepas multirresistentes foi avaliada da

seguinte maneira: inicialmente, foi feito uma monocamada de células das cepas

multirresistentes sobre placas de ágar Mueller-Hinton, através da adição de uma pequena

quantidade de células em suspensão (~ 1,5 x 108 bactérias/mL) sobre a superfície da placa

com auxílio de um swab bacteriológico. Em seguida, um volume de 10 µL (gota equivalente a

~8 mm) das frações contendo as piocinas, foi adicionado sobre a monocamada. As placas

foram incubadas a 37 ºC overnight. A atividade bactericida das piocinas foi confirmada

através da observação do halo inibitório do crescimento bacteriano, conforme descrito em

Fyfe et al. (1984). Nesse sentido, halos equivalentes a ~8 mm de diâmetro foram considerados

64

resultantes da ação bactericida das piocinas de alto peso molecular e halos com diâmetro

superiores a este valor sendo resultantes da ação das piocinas do tipo S.

4.7 Cromatografia de filtração a gel ou SEC (Size-exclusion chromatography)

Esta etapa cromatográfica foi feita com o objetivo de purificar as piocinas obtidas das

células de P. aeruginosa (item 4.5). As corridas de cromatografia de filtração a gel foram

feitas na coluna Superose TM 6, 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences) utilizando o

sistema de purificação ÄKTA FPLC com coletor do tipo Frac-900. Antes de iniciar a

purificação, a coluna foi preparada através da lavagem com 2 CV (volume de coluna) de água

ultrapura. A coluna foi equilibrada em um fluxo isocrático de 0,5 mL/min, em tampão fosfato

de sódio 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mm. As amostras proteicas contendo as piocinas foram

filtradas em filtro 0,22 µM e em seguida injetadas na coluna em volumes de 500 µL. A

eluição dos componentes proteicos foi monitorada por luz ultravioleta (UV) (280 nm).

4.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante (SDS-PAGE)

A eletroforese de proteínas em condição desnaturante foi feita conforme descrito em

Laemmli (1970), utilizando o sistema de minigéis da BioRad. A percentagem de

poliacrilamida no gel de separação dependeu da massa molecular das proteínas que foram

analisadas. O Quadro 3 descreve a composição dos géis utilizados nesse trabalho:

Antes de serem aplicadas no gel, as proteínas foram misturadas com tampão de

amostra Laemmli 5x acrescido de 1 µL de 1M DTT. A mistura foi fervida por 5 min a 95 ºC.

Posteriormente realizou-se a corrida eletroforética a 200 V em tampão de corrida Tris-Glicina

(25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS). Após a eletroforese, os géis foram corados com

solução de Azul de Coomassie e descorados com solução descorante.

65

Quadro 3 – Composição dos géis de separação e de empilhamento utilizados nas análises por

SDS-PAGE

Soluções Gel de Separação

Gel de

Empilhamento

12% 14% 15% 4.6%

1,5 M Tris-HCl pH 8.8 2,8 mL 2,8 mL 2,8 mL -

0,5 M Tris-HCl pH 6.8 - - - 0,4 mL

Acrilamida:bis-acrilamida

30:0.8

2,12 mL 2,5 mL 2,65 mL 0,5 mL

Persulfato de Amônio 10%

(p/v)

50 µL 50 µL 50 µL 15 µL

TEMED 100% 10 µL 10 µL 10 µL 5 µL

Água 0,38 mL - 0,15 mL 2,3 mL

Volume Final 5,3 mL 5,3 mL 5,3 mL 3,2 mL

4.9 Identificação da piocina através de espectrometria de massas

A identificação da molécula de piocina foi feita através da abordagem conhecida como

PMF ou impressão digital da massa dos peptídeos (do inglês: Peptide Mass Fingerprinting).

Esta é uma técnica analítica de identificação proteica na qual a proteína desconhecida de

interesse é primeiramente clivada em pequenos peptídeos, a fim de que a massa absoluta

possa ser medida com um espectrômetro de massa. A massa dos peptídeos é então comparada

com bancos de dados de sequências proteicas conhecidas e, dessa forma, a proteína

desconhecida pode ser identificada através de análise comparativa.

Uma etapa crítica na identificação de proteínas utilizando a metodologia PMF é

garantir que a proteína a ser identificada esteja com elevado grau de pureza. Desta forma,

cerca de 40 µg da proteína, que foi previamente purificada através da cromatografia de

exclusão molecular, foi aplicada em um gel de SDS-PAGE e, após coloração com Azul de

Coomassie, a banda proteica foi excisada da malha do gel.

A proteína foi então digerida com tripsina (tripsinização) para gerar os peptídeos que

posteriormente seriam identificados através de espectrometria de massas. O protocolo de

tripsinização foi feito no laboratório de Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan,

coordenado pela professora Dra. Marilene Demasi. Brevemente, o fragmento do gel contendo

a banda proteica foi transferido para um tubo de microcentrífuga e posteriormente descorado

com uma solução de 100 mM de bicarbonato de amônio pH, 7,8 contendo 50% de

66

acetronitrila, por um período de 45 min, a 37 ºC. A amostra foi então desidratada através da

adição de 100 µL de solução de acetonitrila 100% seguido de incubação a temperatura

ambiente por 5 min. Após a remoção da solução de acetonitrila, a amostra foi reidratada com

uma solução de 40 mM de bicarbonato de amônio e 10% de acetonitrila, contendo a enzima

tripsina (Trypsin Gold – Promega) na concentração de 20 mg/mL, por 1 h a 4 ºC. A amostra

foi posteriormente incubada por 18 h a 37 ºC.

Os peptídeos oriundos da tripsinização foram secos e em seguida analisados através da

cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas, utilizando um sistema UFLC

binário (20A Prominence, Shimadzu Co., Japan) acoplado ao espectrômetro de massas do tipo

Electrospray - Ion Trap - Time of Flight (ESI-IT-TOF) (LCMS-8030, Shimadzu Co., Japão).

Os peptídeos foram ressuspensos em água contendo 0,1% Ácido Acético e analisados em uma

coluna C18 (Discovery C18, 5 μm, 50 mm x 2.1 mm), tendo como solventes (A) Ácido

Acético, água (1:999) e (B) Ácido Acético, ACN, água (1:900:99). Por meio de um fluxo

constante de 0,2 mL/min, o gradiente variou de 5 a 70% de solvente B, durante 35 min, a 37

°C, e monitorado a 214 nm por um detector Shimadzu SPD-M20A PDA.

Logo após a etapa cromatográfica, os peptídeos foram analisados por espectrometria

de massas, de acordo com os seguintes parâmetros: a voltagem utilizada da interface foi de

4,5 KV e a voltagem do detector, 1,76 KV, com temperatura de 200 °C; a fragmentação foi

causada por gás de colisão argônio, com 50% de energia; e os espectros foram obtidos na

faixa de 50 a 2000 m/z.

O padrão de fragmentação dos peptídeos foi processado pelo programa Peaks Studio

V7 (Ma et al., 2003) para sequenciamento ‘de novo’ e análises proteômicas e de comparação

de sequências.

A identificação dos peptídeos por espectrometria de massas foi realizada no

Laboratório Multiusuário do Instituto Butantan, com o auxílio do aluno de Doutorado

Douglas Oscar Ceolin Mariano sob a supervisão do Dr. Daniel Carvalho Pimenta, do

Programa de Toxicologia, Instituto Butantan.

4.10 Clonagem da região codificadora da piocina de ~90 KDa da cepa ET02

A região codificadora da piocina de ~90 KDa da cepa ET02 foi amplificada a partir do

DNA genômico da cepa ET02 utilizando os oligonucleotídeos AP41–F15b 5’

GGAATTCCATATGAGCGACGTTTTTGACCTTGGA 3’ (NdeI) e AP41–R15b 5’

67

CGGGATCCTTAGCCAGCCTTGAAGCCAGGGAG 3’ (BamHI). ). O produto de

amplificação foi digerido com as enzimas de restrição NdeI e BamHI e posteriormente ligado

no vetor pET15b previamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo recombinante

foi transformado na linhagem de E. coli DH5α a qual produziu grandes quantidades de cópias

do plasmídeo. Após extração do plasmídeo a partir das células de E. coli DH5α, realizou-se o

sequenciamento deste a fim de confirmar a integridade das sequências codificadoras. Devido

ao fato de o fragmento de DNA clonado possuir aproximadamente 2.500 pb, dois

oligonucleotídeos adicionais foram sintetizados com o intuito de sequenciar a região interna

do fragmento. As sequências desses oligonucleotídeos são: AP41ET02seq F 5’

GCTTGATCGAAGCGGAAATCA 3’ e AP41ET02seq R 5’

AATCGGCACTCCGTCACCTT 3’

4.11 Sequenciamento do genoma da linhagem produtora da piocina

O DNA genômico total da linhagem produtora da piocina foi extraído e utilizado para

a construção de uma biblioteca mate-paired, ao qual foi sequenciada através da plataforma

MiSeq platform (Illumina, Inc.). As sequências de leitura foram montadas de novo usando o

programa A5-Miseq pipeline (Coil et al., 2015). Após a anotação automática utilizando o

programa Prokka (www.github.com/tseemann/prokka), a sequência foi manualmente curada

usando o banco de dados GenBank e InterPro (www.ebi.ac.uk/interpro) . Etapas de montagem

foram feitas com auxílio da aluna de Doutorado Louise Cerdeira, orientada pelo Prof. Dr.

Nilton Lincopan do Departamento de Microbiologia – ICB; USP.

4.12 Metodologias utilizadas para a construção da piocina recombinante

4.12.1 Extração do DNA genômico de P. aeruginosa

O DNA genômico das cepas de Pseudomonas aeruginosa foi extraído pelo método de

lise por fervura, conforme descrito em Chapman et al. (2001).

68

4.12.2 Linhagens de Escherichia coli e meios de cultura

Quadro 4 - Linhagens de E. coli utilizadas neste trabalho

Linhagem Escherichia coli

Referência Genótipo

DH5α [endA1, hsdR17 (rk- mk+), supE44, thi-1, recA1,

gyrA (Na 1r), relA1, ∆ (lacZYA-argF)U169

(m80lacZ∆M15)].

Novagen

BL21(DE3)pLysS F–, ompT, hsdSB (rB–, mB–), dcm, gal, λ(DE3),

pLysS, Cmr.

Novagen

Quadro 5 - Meio de cultura para o crescimento das células de E. coli

Tipo de meio Composição

LB 0,5% extrato de levedura, 1% triptona e 1% NaCl

Nota: * Meio sólido foi preparado através da adição de 2% de ágar bacteriológico.

4.12.3 Condições de cultivo das células de E. coli

As células de E. coli foram crescidas a 37 ºC em incubadora operando sob constante

agitação orbital a 200 rpm. Quando necessário, as células foram armazenadas em meio LB

líquido contendo 8% glicerol e estocadas a -80 ºC.

4.12.4 Métodos gerais para manipulação de DNA

As digestões enzimáticas das moléculas de DNA foram feitas com as enzimas de

restrição obtidas do fornecedor New England Biolabs, conforme recomendações do

fabricante.

A eletroforese de DNA foi realizada em gel de agarose 1% com tampão TAE 1x. A

purificação das moléculas de DNA do gel de agarose e/ou das reações de restrição foi feita

utilizando-se o Kit Wizard®

SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), conforme

recomendações do fabricante.

A reação de ligação das moléculas de DNA foi feita a 4 ºC por 16 horas em um

volume final de reação de 20 µL, contendo uma razão de 3:1 de fragmento/vetor, tampão da

enzima 1 x e 1 U da enzima T4 ligase obtida do fornecedor Promega.

69

O isolamento dos plasmídeos das culturas bacterianas foi feito utilizando o Kit

QIAprep®

Spin Miniprep (Qiagen), conforme recomendações do fabricante. A concentração

do DNA foi determinada pela absorbância em 260 nm em aparelho NanoDrop ND-1000

Spectrophotometer.

As reações de amplificação de DNA (polymerse chain reaction - PCR) foram feitas

em um volume final de 50 µL, consistindo em: tampão 1 x da Taq polimerase de alta

fidelidade, 2 mM de MgSO4, 0,2 mM de dNTP mix, 0,2 µM de cada oligonucleotídeo

iniciador, cerca de 20 ng de DNA molde, 1 U da Taq polimerase de alta fidelidade

(ThermoFicher Scientific) e H2O ultrapura autoclavada para o volume final de 50 µL. O

programa de amplificação consistiu em um ciclo inicial de desnaturação de 2 min a 94 ºC,

seguido de 30 ciclos de desnaturação (30 seg a 94 ºC), anelamento (30 seg a 55 ºC) e extensão

(68 ºC com 1 min para cada 1 Kb do DNA amplificado). Para garantir a completa extensão do

DNA sintetizado foi acrescentada uma etapa de extensão de 10 min a 68 ºC ao final do

programa.

As reações de sequenciamento de DNA foram feitas através do método de terminador

marcado (dye terminator) utilizando ddNTPs marcados com fluoróforos e a DNA polimerase

termoestável. A reação de sequenciamento foi feita em um volume final de reação de 10 µL

consistindo de: 200 ng do DNA plasmidial, 0,5 µM do oligonucleotídeo iniciador, 1 µL do

BigDye Terminator v3.1 5x Sequencing Buffer (Applied Biosystems), 2 µL do BigDye®

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (Applied Biosystems) e água

ultrapura autoclavada para o volume final de 10 µL. A reação de sequenciamento consistiu de

um ciclo inicial de 96 ºC por 1 min, seguido de 25 ciclos de 96 ºC por 10 seg, 50 ºC por 5 seg

e 60 ºC por 4 min. O produto de sequenciamento foi purificado em resina SephadexTM

G-50

Fine (GE Healthcare), utilizando microplacas de purificação MultiScreen®

-HV (Millipore).

Após a purificação, o material foi secado por 15 min a 95 ºC e analisado no sequenciador ABI

3730 DNA Analyser (Applied Biosystems) localizado no Centro de Pesquisa sobre o Genoma

Humano e Células Tronco (Instituto de Biociências IB – USP). As sequências de DNA foram

salvas no formato ab1. e, analisadas e editadas, por inspeção visual no módulo Seqman do

programa LaserGene v.7.1.0 (DNAStar, Inc.; EUA). Após a edição, as sequências foram

salvas no formato Fasta e alinhadas com as sequências depositadas no banco de dados

Pseudomonas aeruginosa DataBase (http://www.pseudomonas.com/), utilizando o programa

Clustal W (Larkin et al., 2007).

70

4.12.5 Transformação Bacteriana

A transformação bacteriana foi feita através do método do choque elétrico

(eletroporação) de células bacterianas previamente tornadas eletrocompetentes.

A eletroporação procedeu da seguinte maneira: Alíquotas de 50 μL de células

eletrocompetentes armazenadas a -80 ºC foram descongeladas em banho de gelo seguido da

adição do DNA plasmidial e/ou a reação de ligação. Após a leve homogeneização da mistura,

esta foi transferida para uma cubeta de eletroporação e submetida a um pulso elétrico de 2,5V

em aparelho Gene Pulser II Electroporation System (Bio-Rad). Após a pulso de voltagem, as

células foram imediatamente ressuspensas em 1 mL de meio LB e incubadas a 37 ºC por 1 h.

Alíquotas de 100-200 μL de células foram plaqueadas em meio sólido contendo os

antibióticos apropriados para a seleção das células transformantes. As placas foram incubadas

a 37 ºC durante 16-24 horas.

4.12.6 Clonagem da piocina recombinante

A estratégia utilizada para a obtenção da piocina recombinante foi à cromatografia de

afinidade a metais. Nessa metodologia, a proteína recombinante é sintetizada em fusão com

uma cauda de 6 resíduos de histidinas o que possibilita sua purificação em coluna de

cromatografia de afinidade a níquel.

Foram construídas duas versões da piocina recombinante: uma com cauda de histidina

inserida na região N-terminal e a outra com a cauda inserida na região C-terminal.

A construção do plasmídeo recombinante que expressa a piocina com a cauda de

histidina inserida na região N-terminal foi feita da seguinte maneira: a região codificadora da

piocina (sem a subunidade imunitária) foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico da

linhagem de P. aeruginosa ET02, utilizando os oligonucleotídeos AP41-F15b 5’

GGAATTCCATATGAGCGACGTTTTTGACCTTGGA 3’ (NdeI) e S8 pET15b-R 5’

CGGGATCCTTTTCCTTTGTTCGAATGAACTTG 3’ (BamHI). O produto de amplificação

foi digerido com as enzimas de restrição NdeI e BamHI e posteriormente ligado no vetor de

expressão pET15b previamente digerido com as mesmas enzimas.

A construção do plasmídeo recombinante que expressa a piocina com a cauda de

histidina inserida na região C-terminal foi feita da seguinte maneira: a região codificadora da

piocina S8 (sem a subunidade imunitária) foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico

71

da linhagem de P. aeruginosa ET02, utilizando os oligonucleotídeos AP41-F15b 5’

GGAATTCCATATGAGCGACGTTTTTGACCTTGGA 3’ (NdeI) e AP41 pET29b R2

5’ATGGATCCTGTTTTCCTTTGTTCGAATGAACTTG 3’ (BamHI). O produto de

amplificação foi digerido com as enzimas de restrição NdeI e BamHI e posteriormente ligado

no vetor de expressão pET29b previamente digerido com as mesmas enzimas.

Os plasmídeos recombinantes foram transformados na linhagem de E. coli DH5α a

qual produziu grandes quantidades de cópias do plasmídeo. Após extração do plasmídeo a

partir das células de E. coli DH5α, realizou-se o sequenciamento deste a fim de confirmar a

integridade das sequências codificadoras. Devido ao fato de o fragmento de DNA clonado

possuir aproximadamente 2.500 pb, dois oligonucleotídeos adicionais foram sintetizados com

o intuito de sequenciar a região interna do fragmento. As sequências desses oligonucleotídeos

são: AP41ET02seq F 5’ GCTTGATCGAAGCGGAAATCA 3’ e AP41ET02seq R 5’

AATCGGCACTCCGTCACCTT 3’

4.12.7 Expressão e purificação da piocina recombinante

Os plasmídeos recombinantes foram transformados na linhagem de E. coli de

expressão BL21(DE3)pLysS, a qual foi utilizada para produzir grandes quantidades das

proteínas recombinantes.

A indução da expressão das proteínas recombinantes foi feita da seguinte maneira:

células de E. coli BL21(DE3)pLysS contendo o plasmídeo de interesse foram pré-cultivadas em

50 mL de meio LB contendo o antibiótico adequado por 16 horas a 37 ºC. A cultura foi então

diluída para uma OD600 = 0,2 em 1 L de meio LB fresco e, após atingir OD600 = 0,6,

adicionou-se 1 mM de IPTG seguido de posterior crescimento a 37 ºC por 3 horas. Durante

este período, a molécula de IPTG ativa o promotor T7 presente no vetor de expressão,

induzindo a transcrição e a tradução da proteína recombinante. Após este período, as células

foram coletadas por meio de centrifugação (10 min, 4 ºC, 5000 rpm) e posteriormente

estocadas a -20 ºC.

A purificação da proteína recombinante foi iniciada através da lise das células por

meio da sonicação do pellet celular na presença do tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7.4,

NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) e do inibidor de protease PMSF (1 mM). Em seguida, o

extrato celular foi tratado com 1 % de sulfato de estreptomicina (com agitação) por 20 min no

72

gelo. Após centrifugação por 45 min, a 4 ºC, a 15000 RPM, o sobrenadante foi filtrado em

membrana de 0,45 µm (Millipore).

A proteína recombinante foi purificada em coluna de afinidade a níquel com volume

de 5 mL (Ni-NTA Superflow Cartridges - Qiagen), seguindo o protocolo descrito a seguir:

1) 50 mL água ultrapura;

2) 10 mL NiSO4 0,1M;

3) 50 mL água ultrapura;

4) 50 mL Fosfato de Sódio 20 mM pH 7.4/ NaCl 500 mM/ imidazol 20 mM;

5) Extrato celular (preparado como descrito anteriormente




9) 50 mL Fosfato de Sódio 20 mM pH 7.4/ NaCl 300 mM/ EDTA 100 mM;

10) 50 mL água ultrapura.

A proteína de interesse foi eluída com 500 mM de imidazol (etapa 8) e coletada em

tubos de microcentrífuga. O grau de pureza das proteínas purificadas foi verificado através da

aplicação das amostras coletadas na etapa 8 em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-

PAGE) conforme descrito em Laemmli (1970).

Algumas proteínas contaminantes foram co-purificadas juntamente com a proteína

recombinante. Tais proteínas contaminantes foram removidas através de cromatografia de

filtração a gel utilizando uma coluna do tipo Superdex S200 26/60 (GE Healthcare Life

Sciences).

Após a purificação, as proteínas foram dialisadas em tampão fosfato de sódio 50 mM e

NaCl 50 mM, utilizando colunas PD-10 Desalting (GE Healthcare) conforme recomendações

do fabricante. Esta etapa permite a retirada do imidazol utilizado nas etapas de purificação e a

adição do tampão que a proteína irá ser armazenada.

4.12.8 Cristalização do domínio catalítico da piocina em associação com a subunidade

imunitária

A construção do plasmídeo recombinante que expressa o domínio DNase da piocina

em associação com a subunidade imunitária foi feita da seguinte maneira: a região

codificadora do domínio catalítico da piocina juntamente com a subunidade imunitária foi

amplificada por PCR a partir do DNA genômico da linhagem de P. aeruginosa ET02,

73

utilizando os oligonucleotídeos AP41pET29b-F 5’

ATTATATCATATGGATGAGCCGGGTGTTGCTACC 3’ (NdeI) e AP41pET29bIMU-R 5’

AAGGTACCGCCAGCCTTGAAGCCAGGGAG 3’ (KpnI). O produto de amplificação foi

digerido com as enzimas de restrição NdeI e KpnI e posteriormente ligado no vetor de

expressão pET29b previamente digerido com as mesmas enzimas. A sequência do plasmídeo

recombinante foi checada através de sequenciamento.

A etapa de expressão e purificação do domínio DNase da piocina em associação com a

subunidade imunitária foi feita conforme descrito no item 4.12.7. No entanto, algumas etapas

da purificação foram otimizadas, a fim de obter a proteína a mais homogênea possível, para a

realização dos ensaios de cristalização.

Após a preparação do extrato proteico total, a proteína recombinante foi purificada em

equipamento de cromatografia do tipo AKTA (GE Healthcare) utilizando colunas de

afinidade a níquel de volume de 5 mL (Ni-NTA Superflow Cartridges - Qiagen).

O programa utilizado no AKTA foi:

a) calibração da coluna com 5 CV (volumes de coluna) de tampão fosfato de sódio 20

mM pH 7.4, NaCl 500 mM, (fluxo 5 mL/ min);

b) injeção do extrato proteico total (fluxo 0,5 mL/ min);

c) lavagem da coluna com 5 CV de tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7.4, NaCl 500

mM, imidazol 50 mM (fluxo 1 mL/ min). Nesta etapa, as proteínas contaminantes que

interagiram com a coluna são eluídas e descartadas;

d) aplicação de um gradiente linear de imidazol (de 0 a 100%) em 20 CV (fluxo 1 mL/

min) utilizando o tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7.4, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM.

Durante a aplicação do gradiente de imidazol, a proteína de interesse é eluída da coluna de

níquel e coletada em frações de 2 mL em tubos de microcentrífuga.

O grau de pureza da proteína recombinante foi avaliado através de SDS-PAGE.

A proteína foi quantificada e submetida a um “screen” de cristalização para

determinar a condição formadora de cristais. Esta etapa foi realizada no Laboratório Robolab

situado no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio) e ao Centro Nacional de Pesquisa

em Energia e Materiais (CNPEM), Campinas – SP. Após o “screen”, a condição de

cristalização que produziu cristais de melhor qualidade foi acetato de sódio 0,2M,

polietilenoglicol (PEG) 4000 30% (w/v) e Tris-HCl 0,1M pH 8.5. As reações de cristalização

foram feitas através do método de gota pendurada.

74

Na cristalografia de raios X, os cristais de proteínas são incialmente submetidos a um

feixe de raios X de um determinado comprimento de onda. Ao se chorarem com o cristal, os

feixes de raios X são difratados pelos elétrons dos átomos presentes no cristal. Os raios

difratados são coletados em um filme fotográfico gerando um conjunto de pontos de difração.

O perfil de pontos no filme fotográfico é então utilizado para determinar o espaçamento dos

átomos presentes no cristal.

As diferentes etapas da cristalografia de raios X podem poder ser resumidas da

seguinte maneira:

a) Um cristal de proteína é colocado entre um feixe de raios X e um detector;

b) Ao se chocarem com o cristal, os raios X são difratados, gerando um conjunto de

pontos ou reflexões no detector.

c) Cada átomo na molécula do cristal faz uma contribuição para cada ponto.

d) O padrão total de difração é utilizado para construir o mapa de densidade eletrônica

da proteína presente no cristal, por uma técnica matemática chamada de transformada de

Fourier.

e) Devido sua enorme complexidade, a criação do mapa de densidade eletrônica é feita

através de programas computacionais.

f) O modelo da estrutura da proteína é então construído de acordo com o mapa da

densidade eletrônica.

Os ensaios de difração de raios X foram realizados na linha MX2 do Laboratório

Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). Todas as medidas foram feitas em temperatura

criogênica (110 K) através de fluxo de nitrogênio líquido sobre as amostras.

Os dados de difração de raios X coletados foram processados utilizando o XDS

(Kabsch, 2010) e iMolsflm da plataforma CCP4 (Winn et al., 2011).

O refinamento das estruturas proteicas foi executado usando os softwares Coot

(Emsley, Cowtan, 2004) Refmac (Vagin et al., 2004), ambos presentes na plataforma CCP4 e

ainda o Phenix (Adams et al., 2010).

As etapas de purificação, cristalização, difração de raios X e resolução da estrutura

foram feitas com auxílio dos alunos de Doutorado Fernando Gomes e Renato Domingos

(Laboratório de Proteínas e Biologia Redox, coordenado pelo Prof. Dr. Luís Netto, do

Programa de Genética e Biologia Evolutiva – IB, USP).

75

4.12.9 Quantificação de proteínas

A quantificação de proteínas foi feita pelo método colorimétrico de Bradford.

(Hammond, Kruger, 1988). O conteúdo proteico é avaliado através da absorbância a 595 nm,

utilizando BSA (proteína do soro fetal bovino) como padrão externo e o reagente Protein

Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

As proteínas recombinantes com elevado grau de pureza foram quantificadas em

espectrofotômetro no comprimento de onda de 280 nm. Os resíduos aromáticos de triptofano,

presentes nas proteínas, possuem a propriedade de absorverem energia no comprimento de

onda de 280 nm. Os valores de absorbância obtidos foram utilizados para calcular a

concentração das proteínas utilizando o coeficiente de extinção molar obtido através do

software Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam).

4.13 Determinação da atividade bactericida (Concentração Bactericida Mínima - CBM)

Para determinação da concentração bactericida mínima (CBM) foi primeiramente

necessário realizar o método de microdiluição em caldo (concentração inibitória mínima –

CIM), fazendo adaptações das normas padronizadas do CLSI (2015). A colônia foi inoculada

em um caldo de crescimento, incubado a 37 ºC até alcançar a turbidez padrão de 0,5 de

McFarland (~1 x 108 UFC/mL). Foram realizadas diluições seriadas das piocinas em caldo

Mueller-Hinton (Difco, Le Pont de Claix, France) e plaqueado 100 µL de cada concentração

em poços de placa de ELISA estéril. Foi acrescentado 5 µL do inóculo diluído 1:10 que foi

previamente preparado na escala 0,5 de McFarland. As placas foram incubadas a 37 ºC

overnight. Após a incubação foi verificado o crescimento bacteriano, através da turvação do

meio. Feita a verificação, a determinação da atividade bactericida foi realizada, para isto, foi

utilizado um indicador fluorescente/calorimétrico com propriedade redox, Alamar Blue®

(também denominado resazurin) (Sigma Chemical Co, St Louis, USA). O Alamar Blue foi

preparado segundo Nateche et al. (2006) e 30 µL da solução foi adicionado em cada poço da

microplaca, sendo posteriormente incubada overnight. A leitura foi interpretada como a

mínima concentração da piocina em diluição produzindo inibição do crescimento

macroscopicamente visível, sendo a forma oxidada azul (célula não viável/não fluorescente) e

a forma reduzida rosa (célula viável/fluorescente).

76

4.14 Screening molecular das piocinas do tipo S nas linhagens multirresistentes

O DNA genômico das linhagens MRs foi isolado conforme descrito no item 4.12.1.

Um protocolo de PCR padrão foi utilizado para identificar os genes das piocinas do tipo S

presentes nas linhagens MRs. Vários conjuntos de primers foram sintetizados utilizando as

sequencias das piocinas do tipo S depositadas no NCBI (GenBank) (Quadro 6). O programa

de amplificação consistiu em um ciclo inicial de desnaturação de 10 min a 95 ºC, seguido de

30 ciclos de desnaturação (30 seg a 94 ºC), anelamento (30 seg a 55 ºC) e extensão (72 ºC

com 1 min para cada 1 Kb do DNA amplificado). Para garantir a completa extensão do DNA

sintetizado foi acrescentada uma etapa de extensão de 10 min a 72 ºC ao final do programa.

Os produtos de PCR foram analisados em géis de agarose 1%. A amplificação do gene TRPE

foi utilizada como controle positivo das reações de PCR para avaliar a integridade do DNA

genômico.

Quadro 6 – Oligonucleotídeos utilizados na identificação das piocinas do tipo S.

Piocina Primer forward 5’-3’ Primer reverse 5’-3’ Tamanho do

amplicon (pb) Referências

S1 AGAATTCATGGCTGGCAA

GAGTTTGAAAGT

TCAAAGCTTCTAACCGGCCT

TAAAGCCAGGAA 2138

Sano et al. (1993b)

S2 AGAATTCATGGCTGTCAAT

GATTACGAACCTGG

TCAAAGCTTCTAACCGGCCT

TAAAGCCAGGAA 2351

Sano et al. (1993b)

S3 TGGATCCATGGCTGATGCA

CCACCGCCACT

AGTAAGCTTTCAGTACCACC

CCTGTTCTTT 2317 Duport et al. (1995)

S4 AGAATTCATGACAAATAAT

AGTGCGCCACCAC

AGTAAGCTTTTACTTATTTCT

CCAGATGAT 2311

Elfarash et al.

(2012)

S5 GGAATTCCATATGTCCAAT

GACAACGAAGTACCTGG

CGGGATCCTTAAATGGATAT

TACAAGATTGTT 1515 Ling et al. (2010)

S6 GGAATTCCATATGGCACGA

CCCATTGCTGACCTTA

CGGGATCCCTAGGCGTAAAC

CCCAATAAAATAC 1964

Dingemans et al.

(2016)

S8 GGAATTCCATATGAGCGAC

GTTTTTGACCTTGGA

AAGGTACCTTTTCCTTTGTTC

GAATGAACTTG 2337 Este estudo

AP41 GGAATTCCATATGAGCGAC

GTTTTTGACCTTGGA

CGGGATCCTTATTATTTCTC

CTTACGTTTAAG 2355

Sano e Kageyama

(1993)

TRPE GCTGGAGCCGGTCAAGCG

TGG

TTATTCGACGCTCTGCTCGG

CCA 236

Nakayama et al.

(2000)

77

5 RESULTADOS

5.1 Seleção de cepas de P. aeruginosa com fenótipo de multirresistência

Neste trabalho foram selecionadas dezoito cepas, previamente caracterizadas com

fenótipo de multirresistência (Magiorakos et al., 2012), para testarmos a atividade bactericida

das piocinas. O perfil de suscetibilidade antibacteriana de todas as dezoito cepas (incluindo

quinze cepas hospitalares e três ambientais) foi confirmado através do método de disco-

difusão e interpretados de acordo com CLSI (2016) (Tabela 1).

Tabela 1 - Perfil de suscetibilidade antibacteriana das cepas de P. aeruginosa

Cepas

Genótipo

de

resistência

Perfil de suscetibilidade antimicrobiano

A B C D E F

LVX CIP GEN AMI MER IPM PPT CAZ CPM ATM

48-1997ª SPM-1 R R R R R R R

R

R

R

I

S

S

I

R

I

I

I

S

I

R

S

I

R

R R S

247-B VIM-1 R R R S R R R I S

PaGIM GIM-1 R R R I R R R R S

Pa BH6 KPC-2 R R I R R R R R R

Pa PHB64 GES-5 R R R R R R R R I

PaIMP IMP-1 R I R R R R R R S

298 OXA-18 S S I S R I R R R

395 IMP-18 R R R R R R R R I

179 VIM-1 R R R R R R R R S

1088 SPM-1 R R I S R R R R S

392 OXA-10 R R R S R R I R I

225 GES-1 R R R R R R R R R

24 RmtD R R R R R R R S S

C916 – R R R S R R S S S

44 SPM-1 R R R R R R R R S

19 SPM-1 R R R R R R R R S

141 SPM-1 R R R R R R R R I

151 SPM-1 R R R R R R R R R

Nota: Categoria antimicrobiana – A, quinolonas; B, aminoglicosídeos; C, carbapenêmicos; D, penicilina; E,

cefalosporinas de terceira geração e de quarta geração; F, monobactâmico. Antimicrobianos – LVX,

levofloxacina; CIP, ciprofloxacina; GEN, gentamicina; AMI, amicacina; MER, meropenem; IPM, imipenem;

PPT, piperacilina/tazobactam; CAZ, ceftazidima; CPM, cefepima; ATM, Aztreonam. R, resistente; S,

susceptível; I, intermediário; –, ausente. Maiores informações sobre os isolados no Quadro 2.

Fonte: CLSI (2016).

As cepas de origem clínica e ambiental, portadoras de enzimas β-lactamases (e enzima

modificadora de aminoglicosídeos, cepa 24), apresentaram resistência aos antimicrobianos

normalmente usados em esquemas terapêuticos para infecções ocasionadas por Pseudomonas

aeruginosa (Tabela 1), resultando no perfil de multirresistência descrito por Magiorakos et al.

(2012). Adicionalmente, as cepas C916 e 24 apresentam superexpressão de bombas de efluxo

78

e ausência de porina, respectivamente, caracterizadas em estudo prévio, contribuindo para a

multirresistência (Neves, 2010).


bactericida

Após a seleção das cepas multirresistentes, foi feita uma triagem de cepas de P.

aeruginosa produtoras de piocinas com potencial atividade bactericida. A metodologia

utilizada foi adaptada dos trabalhos de Gillies e Govan (1966) e Fyfe et al. (1984).

Inicialmente, a atividade bactericida das piocinas foi testada apenas contra seis cepas com

fenótipo de multirresistência (1/3 do total), devido à enorme quantidade de cepas produtoras

de piocinas a serem testadas. Dessa forma, foi possível obter um perfil geral de quais cepas

produzem piocinas com ampla atividade bactericida.

Dentre as cepas produtoras de piocinas testadas (Tabela 2) encontram-se exemplares

de uma coleção de cepas indicadoras, comumente utilizadas no passado, para tipagem de

cepas, através do método de piocinotipagem (CI1, CI2, CI3, CI4, CI5, CI6, CI8, CSIA, CIB,

CIC e CID) (Fyfe et al., 1984). Cepas com fenótipo de multirresistência também foram

testadas quanto à sua capacidade de produzir piocinas (48-1997A, 44CIB, 247-B, PaGIM, Pa

BH6, Pa PHB64, PaIMP, 19, 141 e 151).

A cepa ET02 foi isolada em março de 2013, da microbiota intestinal, de um

funcionário pertencente à Casa de Apoio à Saúde do Índio (CASAI), na cidade de São Gabriel

da Cachoeira (AM - Brasil), através de um swab de vigilância (retal), por Marco Vianello, no

laboratório do Hospital de Guarnição e encaminhada para este laboratório.

Finalmente, a cepa PAO1 foi utilizada como um controle positivo para a produção de

piocinas, pois, suas piocinas têm sido amplamente caracterizadas (S2, S4, S5, R2 e F2).

Através da metodologia de piocinotipagem foi verificado que as cepas CI3, CIB e

ET02 produziram piocinas com potente atividade bactericida contra as seis linhagens

multirresistentes testadas (Tabela 2).

79

Tabela 2 – Triagem inicial da atividade bactericida das piocinas contra as cepas

multirresistentes

Cepas

Testadas

Cepas das Monocamadas (Cepa/Genótipo β-lactamase)

48-1997A/

SPM-1

PaGIM/

GIM-1

247-B/

VIM-1

PaIMP/

IMP-1

Pa BH6/

KPC-2

Pa PHB64/

GES-5

CI1 - - - + - -

CI2 - - - - - +

CI3 + + - + + +

CI4 - - - - - -

CI5 - - - + - -

CI6 + - - - - -

CI8 - - - - - -

CSIA - - + - - -

CIB + + + + + +

CIC - - - + - -

CID - + - - - -

PAO1 - - - - - -

48-1997A - - - - - -

44CIB - - - - - -

247-B - - - - - -

PaGIM - - - - - -

Pa BH6 - - + + - -

Pa PHB64 - - + - - -

PaIMP - - + - - -

ET02 + + + + + +

PA19 - - - - - -

PA141 - - - - - -

PA151 - - - - - -

Nota: Inibição da cepa da monocamada (+); ausência de inibição da cepa da monocamada (-). Teste realizado

conforme seção 4.4 (Materiais e Métodos). Maiores informações sobre as cepas no Quadro 2.

Para comprovar a potente atividade bactericida das piocinas produzidas por essas três

cepas, uma pequena modificação da metodologia de piocinotipagem foi feita. Com essa

modificação (seção 4.4), foi possível corroborar que as cepas CI3, CIB e ET02 produzem

piocinas com potente atividade bactericida contra as cepas multirresistentes. Além disso, a

cepa ET02 apresentou a mais potente atividade bactericida, matando todas as seis linhagens

testadas (Figura 9).

80

Figura 9 - Halos de inibição de crescimento gerados pelas moléculas de piocinas frente às

cepas multirresistentes

Nota: 1- Figura ilustrativa, representando os halos de inibição formados no teste de piocinotipagem, para auxiliar

na leitura das placas numeradas de 2 a 7. Letras: A, Cepa Indicadora B (CIB); B, Cepa Indicadora 3 (CI3); C,

PAO1 ; D, ET02. Para a monocamada, as cepas de P. aeruginosa multirresistentes utilizadas foram: 2, PaGIM;

3, PaIMP; 4, 247-B; 5, 48-1997A; 6, Pa BH6; 7, Pa PHB64. No Quadro 2 encontram-se maiores detalhes das

cepas.

5.3 Purificação das moléculas de piocinas e avaliação da sua atividade bactericida

Uma vez confirmado que as cepas CI3, CIB e ET02 produzem piocinas com ampla

atividade bactericida, foi feita a purificação das moléculas de piocinas dessas cepas. A

linhagem PAO1 foi utilizada como um controle negativo, pois ela apresentou uma baixa

eficiência bactericida contra as cepas multirresistentes.

A síntese das moléculas de piocinas foi induzida através da adição de mitomicina C

em meio de cultivo líquido das linhagens CI3, CIB, ET02 e PAO1. Após a indução, as

piocinas presentes nos extratos celulares totais foram precipitadas com sulfato de amônio e

coletadas através de centrifugação a 17.000 x g. O pellet resultante dessa centrifugação foi

denominado de fração T e contém as piocinas totais produzidas pelas células bacterianas. A

separação das piocinas de alto peso molecular do tipo R e F a partir das piocinas de baixo

81

peso molecular do tipo S foi feita através de centrifugação a 61.000 x g. O pellet derivado

dessa ultracentrifugação foi denominado fração P, enquanto que o sobrenadante fração S. A

composição proteica das diferentes frações foi analisada através de SDS-PAGE (Figura 10).

Houve um enriquecimento de duas bandas proteicas nas frações P das linhagens

PAO1, ET02 e CIB comparadas com as frações T e S (retângulos verdes da figura 10). Essas

bandas provavelmente representam proteínas das piocinas do tipo R de alto peso molecular,

que foram sedimentadas através da ultracentrifugação a 61.000 x g, conforme verificado por

Scholl et al. (2009).

Figura 10 - Purificação das moléculas de piocinas

Nota: Gel de SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie da purificação das piocinas. T – fração proteica total

obtida através da precipitação com sulfato de amônio. S – Fração solúvel (sobrenadante) obtida após

ultracentrifugação a 61000 x g. P – Fração que foi sedimentada (pellet) após ultracentrifugação a 61000 x g. Os

retângulos verdes possivelmente correspondem às proteínas das piocinas do tipo R de alto peso molecular. O

retângulo vermelho indica uma banda superexpressa presente apenas na linhagem ET02. Padrão de peso

molecular (MW).

Curiosamente, as frações T e S da linhagem ET02 apresentaram uma banda altamente

expressa de ~90 KDa (retângulos vermelhos na Figura 10). Visto que essa banda não esteve

presente na fração P da cepa ET02, infere-se que se trata de uma piocina de baixo peso

molecular do tipo S, que permaneceu no sobrenadante após a etapa de ultracentrifugação.

Devido à cepa ET02 ter previamente apresentado a mais potente atividade bactericida contra

as linhagens multirresistentes, esforços foram direcionados na identificação de uma possível

82

piocina do tipo S representada pela banda altamente expressa presente na fração S da cepa

ET02. Dessa forma, alíquotas da fração S das cepas ET02, CIB, CI3 e PAO1 foram

inicialmente testadas contra as 18 linhagens multirresistentes (Figura 11).

Figura 11 - Atividade bactericida das piocinas presentes na fração S contra as linhagens

multirresistentes

Nota: Alíquotas das piocinas presentes na fração S (sobrenadante) das cepas CIB, CI3, ET02 e PAO1 foram

adicionadas sobre as monocamadas das linhagens multirresistentes (Seção 4.6). As placas foram incubadas a 37

ºC overnight para permitir o crescimento das linhagens multirresistentes. A atividade bactericida das piocinas é

confirmada através da presença de halos de inibição do crescimento das linhagens multirresistentes. No Quadro

2 encontram-se maiores detalhes das cepas.

As piocinas da fração S da cepa ET02 apresentou a mais potente atividade bactericida,

produzindo um halo de inibição em 17 cepas multirresistentes (Figura 11). Apenas a linhagem

395 não foi morta. A análise do perfil proteico das piocinas da fração S das cepas CI3, CIB,

ET02 e PAO1, sugere que a banda proteica de ~90 KDa presente apenas na linhagem ET02,

83

seja, de fato, a piocina responsável pela morte das cepas MRs. Dessa forma, a próxima etapa

foi a identificação molecular dessa possível piocina do tipo S produzida pela cepa ET02,

através de espectrometria de massas.

5.4 Identificação molecular da piocina de ~90 KDa da linhagem ET02

Previamente às análises de espectrometria de massas, as piocinas presentes na fração S

da cepa ET02 foram repurificadas através de cromatografia de exclusão molecular (Figura

12A). O conteúdo proteico das diferentes frações obtidas na cromatografia de exclusão

molecular foi analisado através de SDS-PAGE e comparado com a fração S da cepa ET02,

previamente aplicado na coluna cromatográfica. A partir de tal abordagem foi possível

verificar a eficiente purificação da proteína de ~90 KDa da cepa ET02 (retângulo vermelho da

Figura 12B). Conforme esperado, frações da cromatografia contendo a proteína de ~90 KDa

apresentaram atividade antibacteriana contra a cepa multirresistente PaGIM (escolhida

aleatoriamente, devido à pouca quantidade resultante da purificação), confirmando a presença

de uma possível piocina (Figura 12C).

A banda proteica de ~90 KDa (retângulo vermelho da figura 12B) foi excisada do gel

de poliacrilamida e digerida com a protease tripsina. Os peptídeos gerados foram então

submetidos à análise em espectrometria de massas.

Um conjunto de 14 peptídeos apresentaram 90% de identidade com a piocina do tipo S

de baixo peso molecular AP41 (GenBank Accession number Q51502), previamente

identificada na cepa de P. aeruginosa PAF (Holloway et al., 1973; Sano, Kageyama, 1993)

(Figura 13). Os 14 peptídeos identificados compreendem uma cobertura de 19% da sequência

da piocina AP41.

84

Figura 12 - Purificação da piocina de ~90 KDa através de cromatografia de exclusão

molecular A

B C

Nota: A – Cromatograma obtido após a cromatografia de exclusão molecular das piocinas presentes na fração S

da cepa ET02. A linha azul, a qual varia de intensidade de acordo com a escala do eixo Y, representa a presença

de proteínas detectadas no aparelho ÄKTA AFPLC. Os números indicados no eixo X indicam as frações obtidas

e coletadas em tubos durante a cromatografia. B – Alíquotas das frações representativas dos diferentes picos

proteicos do cromatograma foram aplicadas em um gel de SDS-PAGE e coradas com comassie blue. S: conteúdo

da fração S da cepa ET02 antes da cromatografia. MW: padrão de peso molecular. O retângulo vermelho denota

a piocina de ~90 KDa presente na fração 24 da cromatografia. C – atividade bactericida das piocinas presentes

nas diferentes frações da cromatografia de exclusão molecular contra a cepa PaGIM.

85

Figura 13 - Identificação da piocina de ~90 KDa da cepa ET02 através de espectrometria de

massas

Nota: Um total de 14 peptídeos apresentou identidade com a piocina AP41 da linhagem PAF. A sequência de

aminoácidos da piocina AP41(GenBank: Q51502) está realçada em cinza. Os peptídeos identificados na

espectrometria de massas estão realçados em vermelho.

Baseado na sequência de DNA da piocina AP41 da cepa PAF (GenBank Accession

number D12705.1) foram construídos oligonucleotídeos para amplificar os genes da piocina

86

da linhagem ET02. Houve amplificação de um segmento de DNA de aproximadamente 2.500

pares de bases (Figura 14), condizente com o tamanho da sequência codificadora da piocina

AP41 da linhagem PAF (Sano, Kageyama, 1993).

O produto de amplificação foi clonado no vetor pET15b e o plasmídeo recombinante

foi sequenciado. Após o sequenciamento foi possível deduzir a sequência de aminoácidos da

piocina produzida pela cepa ET02, permitindo assim realizar o alinhamento com a sequência

de aminoácidos da piocina AP41 da linhagem PAF (Figura 15).

Figura 14 - Amplificação da região codificadora da piocina AP41 da linhagem ET02

Nota: Gel de eletroforese de DNA do produto de amplificação dos genes codificadores da piocina AP41 da

linhagem ET02. (1) – Linhagem PAO1 utilizada como controle negativo, visto que ela não possui a piocina

AP41. (2) – Linhagem ET02. (P) – Padrão de peso molecular 1kb DNA Ladder (Invitrogen).

A análise do alinhamento demonstrou uma elevada similaridade de sequência de

aminoácidos entre os domínios I, II e III da subunidade citotóxica das piocinas das linhagens

PAF e ET02 (Figura 15). Por outro lado, houve diferenças significativas na região C-terminal

do domínio IV. As subunidades imunitárias também foram significativamente diferentes.

Curiosamente, as diferenças entre as duas piocinas ocorreram principalmente na região de

interação da subunidade imunitária com o domínio IV da subunidade citotóxica (região

destacada por retângulos vermelhos na Figura 15). Isto levantou a hipótese de que a

subunidade imunitária de ambas as piocinas sejam diferentes e que possivelmente a piocina da

cepa ET02 seria uma variante da piocina AP41 encontrada na linhagem PAF.

87

Figura 15 - Alinhamento da piocina AP41 com a piocina de ET02

Nota: O alinhamento foi feito utilizando o programa clustaw ômega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Os diferentes domínios das piocinas estão destacados em cores diferentes. * aminoácidos idênticos.

88

Um trabalho de Ghequire e De Mot (2014) realizou predições de novos genes

codificadores de piocinas utilizando os genomas de P. aeruginosa disponíveis nos bancos de

dados (GenBank e Pseudomonas Genome Database). Em suas análises, os autores descrevem

novas moléculas de piocinas, entre elas, uma foi denominada S8, a qual possui similaridade

de sequência com a piocina AP41. Curiosamente, o alinhamento de sequência demostrou que

a piocina S8 possui 100% de identidade com a piocina produzida pela cepa ET02. Portanto, a

piocina da cepa ET02 é de fato a piocina S8, incialmente predita por Ghequire e De Mot

(2014).

Atualmente não há estudos funcionais sobre a piocina S8, visto que sua sequência de

aminoácidos foi deduzida somente através de estudos in silico (Ghequire, De Mot, 2014).

Pelo fato de S8 ainda não ter sido caracterizada, a sequência genômica da cepa ET02 foi

determinada a fim de se caracterizar o contexto genético no qual essa piocina está localizada.

O genoma da cepa ET02 encontra-se na fase scaffold de montagem e está depositado no

banco de dados GenBank (Accession number: LYLY01000036.1).

O sequenciamento genômico possibilitou determinar o ST (sequencing typing) da

linhagem ET02. Curiosamente, não houve identidade com nenhum ST atualmente disponível

no banco de dados de P. aeruginosa (https://pubmlst.org/paeruginosa/). Dessa forma, um

novo ST foi denominado para a linhagem ET02 (ST2343).

O contexto genético no qual a piocina S8 está presente foi investigado (Turano et al.,

2017). Curiosamente, verificou-se que essa piocina está inserida em uma unidade genética de

7367 pb que apresenta elevada similaridade de sequência com elementos de transposição da

família Tn3 (Figura 16).

A estrutura genética é composta de oito ORFs: uma ATPase, uma transposase, uma

resolvase, as subunidades citotóxica e imunitária da piocina S8 e três proteínas hipotéticas. As

proteínas ATPase, transposase, resolvase e duas hipotéticas são codificadas pela fita negativa

(3’-5’). As subunidades da piocina S8 e uma proteína hipotética são codificadas pela fita

positiva (5’-3’). Todas as proteínas estão intactas e são flanqueadas por duas sequências

repetidas invertidas (IRs) de 48 pares de bases com 100% de identidade entre elas (Figura 16).

Estruturas genéticas portadoras de uma transposase e genes passageiros, flanqueadas

por sequências repetidas invertidas (IRs), são características de elementos de transposição.

Dessa forma, assume-se que a piocina S8 está localizada no interior de um transposon. A

sequência do transposon foi submetida para um banco de dados de transposon

(http://www.ucl.ac.uk/eastman/research/departments/microbial-diseases/tn), ao qual passou a

89

ser denominado Tn6350. O transposon também foi depositado no GenBank com o número de

acesso KY347015.

Figura 16 - Organização genética do transposon Tn6350 contendo a piocina S8 da linhagem

ET02

Nota: Representação esquemática dos genes presentes no interior do transposon Tn6350. Sequências repetidas

invertidas estão localizadas nas extremidades do transposon e são representadas por triângulos negros. Os genes

são representados por setas coloridas indicando a direção da transcrição.

Através de análises in silico, foi possível caracterizar a região promotora do gene da

piocina S8. O promotor da piocina S8 contém uma sequência regulatória denominada P-box

(Figura 17). A região P-box é reconhecida pelo ativador transcricional PrtN (Matsui et al.,

1993), responsável pela ativação da transcrição dos genes das piocinas. A região P-box da

piocina S8 é semelhante ao das outras piocinas do tipo S, consistindo de quatro repetições da

sequência (ATTGnn(n)GT-nn(n)). Além da piocina S8, a análise do genoma da cepa ET02

identificou a presença de duas piocinas adicionais: a piocina de baixo peso molecular do tipo

S2 e a piocina de alto peso molecular do tipo R5.

Figura 17 - Região regulatória da piocina S8

Nota: Análises in silico da sequência de nucleotídeos da região regulatória da piocina S8 da cepa ET02. A região

P-box consiste em quatro repetições da sequência (ATTGnn(n)GT-nn(n)) (destacadas em cinza). O ativador

transcricional PrtN se liga na região P-box ativando a transcrição gênica das piocinas. A sequência RBS de

ligação ao ribossomo está destacada em negrito e sublinhada. O sítio de inicio da tradução está indicado por uma

seta.

90

5.5 Construção da piocina S8 recombinante

A purificação da piocina S8 diretamente da linhagem ET02 é um processo altamente

laborioso e gera uma quantidade muito pequena de proteína, o que inviabiliza a realização de

um grande número de experimentos. Nesse sentido, a piocina S8 foi clonada em vetores de

expressão o que possibilitou realizar a superexpressão e a purificação da piocina

recombinante através de cromatografia de afinidade a metais. Isso é possível pelo fato de que

as proteínas recombinantes são sintetizadas em fusão com uma cauda de seis resíduos de

histidinas o que permite sua purificação em colunas de afinidade a níquel.

Foram construídas duas versões da piocina S8 recombinante: S8-N e S8-C. S8-N

possui a cauda de histidina inserida na porção N-terminal da piocina enquanto que S8-C na

porção C-terminal. A purificação das piocinas recombinantes gerou grandes quantidades de

proteínas, porém houve pequenas contaminações com outras proteínas bacterianas (Figura 18,

canaleta 3). Dessa forma, as amostras proteicas foram submetidas a uma segunda etapa de

purificação, utilizando a cromatografia de exclusão molecular. Com esta etapa adicional, foi

possível obter amostras com elevado grau de pureza (Figura 18, canaleta 4).

A atividade bactericida das piocinas recombinantes foi testada contra as linhagens

multirresistentes. Surpreendentemente, ambas as piocinas recombinantes não inibiram o

crescimento de nenhuma linhagem multirresistente (Figura 19).

5.6 Purificação da piocina S8 diretamente da linhagem ET02

Devido às piocinas S8 recombinantes não terem matado as linhagens MRs, optou-se

por uma padronização da purificação de S8 diretamente da linhagem de P. aeruginosa ET02.

Dessa forma, o principal desafio foi isolar a piocina S8 das demais produzidas pela cepa ET02

(S2 e R5). A indução da síntese das piocinas foi feita através da adição de mitomicina C ao

meio de cultivo da linhagem ET02 (Figura 20, canaleta 2). As piocinas totais foram

precipitadas com sulfato de amônio e coletadas através de centrifugação a 17.000 x g (Figura

20, canaleta 3).

A piocina R5, de alto peso molecular, foi separada das de baixo peso molecular, S2 e

S8, através de centrifugação a 61.000 x g (Figura 20, canaleta 5). Nessa purificação, o período

de ultracentrifugação utilizado foi maior em comparação com o protocolo utilizado na figura

91

10. Isto permitiu que a piocina R5 ficasse restrita apenas na fração P (comparar as proteínas

correspondentes aos retângulos verdes da canaleta 3 com as das canaletas 4 e 5).

Figura 18 – Purificação das piocinas recombinantes

Nota: Canaleta 1: extrato proteico das células BL21(DE3)pLysS antes da adição de IPTG, 2: extrato proteico das

células BL21(DE3)pLysS após a adição de IPTG, 3: proteínas recombinantes após cromatografia de afinidade a

níquel, 4: proteínas recombinantes após cromatografia de exclusão molecular, MW: padrão de peso molecular.

A piocina S2 possui um tamanho molecular de 73,8 KDa enquanto que S8 um

tamanho molecular de 83,4 KDa (peso molecular teórico calculado com base na sequência de

aminoácidos das proteínas). Portanto, a proteína altamente expressa presente na canaleta 4 da

figura 20 (retângulo vermelho), provavelmente corresponde à piocina S8 da cepa ET02. Tal

hipótese também é suportada pelas análises de espectrometria de massas (Figura 13). A

presença de apenas uma banda altamente expressa (canaleta 4 da figura 20, retângulo

vermelho) no sobrenadante da ultracentrifugação a 61.000 x g indica que a piocina S2 da

cepa ET02 é produzida em menor quantidade do que a piocina S8 nas condições

experimentais utilizadas nesse estudo. Dessa forma, assumiu-se que o sobrenadante da

ultracentrifugação (Figura 20, canaleta 4) continha apenas a piocina S8 e o pellet (Figura 20,

canaleta 5) a piocina R5.

92

Figura 19 - Atividade bactericida das piocinas recombinantes contra as linhagens MRs

Nota: Alíquotas das piocinas recombinantes foram adicionadas sobre as monocamadas das linhagens

multirresistentes. As placas foram incubadas a 37 ºC overnight para permitir o crescimento das linhagens

multirresistentes. No Quadro 2 encontram-se maiores detalhes das cepas multirresistentes.

93

Figura 20 - Purificação da piocina S8 da linhagem ET02

Nota: A purificação das moléculas de piocinas da cepa ET02 foi feita conforme descrito na seção 4.5. Canaleta

1: extrato proteico total antes da adição de mitomicina C, canaleta 2: extrato proteico total após a adição de

mitomicina C, canaleta 3: piocinas totais precipitadas com sulfato de amônio e coletadas através de

centrifugação a 17.000 x g, canaleta 4: piocina S8 (retângulo vermelho) presente no sobrenadante da

ultracentrifugação a 61.000 x g, canaleta 5: piocina R5 de alto peso molecular. Os retângulos verdes indicam as

proteínas da piocinas R5 que foram completamente sedimentadas após a ultracentrifugação.

As atividades bactericidas das piocinas S8 e R5 foram testadas contra as linhagens

MRs (Figura 21).

A piocina S8 apresentou atividade bactericida contra 13 linhagens MRs (Figura 21).

Por outro lado, as linhagens 141, C916, 225, 395 e 392 não foram mortas pela piocina S8.

Curiosamente, a piocina R5 matou 16 linhagens MRs com apenas as linhagens Pa BH6 e 225

sendo resistentes.

No entanto, analisando as bordas dos halos de inibição, ficou evidente que a piocina

R5 continha pequena contaminação com a piocina S8. Essa hipótese baseia-se no fato de que

as piocinas de baixo peso molecular do tipo S se difundem para o meio de cultura após serem

adicionadas sobre a monocamada de células bacterianas. O mesmo não ocorre para as

piocinas de alto peso molecular dos tipos R e F, as quais ficam restritas apenas no local onde

foram adicionadas sobre a monocamada, correspondendo apenas ao tamanho da gota (Fyfe et

al., 1984).

94

Figura 21 - Atividade bactericida das piocinas R5 e S8 contra as linhagens MRs

Nota: Alíquotas das piocinas R5 e S8 foram adicionadas sobre as monocamadas das linhagens multirresistentes

(seção 4.6). As placas foram incubadas a 37 ºC overnight para permitir o crescimento das linhagens

multirresistentes. No Quadro 2 encontram-se maiores detalhes das cepas multirresistentes.

A hipótese citada anteriormente é suportada através da análise da atividade bactericida

da piocina R5 contra a cepa PAO1 (Figura 21). Para esta cepa, houve uma nítida região de

ausência total de crescimento bacteriano presente apenas no local onde a piocina foi

adicionada (correspondendo ao local da gota pingada). Ao redor dessa região observa-se a

presença de um segundo halo inibitório onde a linhagem PAO1 apresentou dificuldade de

95

crescimento. Isto é decorrente da difusão das moléculas de piocina S8 que estavam presentes

em menor quantidade juntamente com a piocina R5. Portanto, para as 16 cepas mortas pela

piocina R5, a piocina S8 possivelmente pode ter contribuído para a atividade citotóxica.

Com base nessa observação, pode-se afirmar que apenas as cepas que apresentaram

um halo com tamanho de ~8 mm (seção 4.6) foram mortas unicamente pela piocina R5. Nesse

critério encaixaram-se as cepas 392, 395, C916 e 141.

As piocinas S8 e R5 foram quantificadas através do método de Bradford (Hammond,

Kruger, 1988) e, em seguida, testadas em diferentes concentrações para determinar a

concentração bactericida mínima (CBM) necessária para matar as linhagens multirresistentes

(Figura 22).

O teste da CBM para a piocina S8 foi realizado para todas as linhagens MRs que

apresentaram halo de inibição no teste da Figura 21. Sendo assim, nitidamente ficaram de fora

deste teste as cepas 392, C916, 141, 225 e 395.

Foi possível determinar a CBM da piocina S8 para um total de 6 linhagens MRs: 179:

4,6 µg/mL, PaIMP: 2,3 µg/mL, PaGIM: 0,5 µg/mL, 19: 1,1 µg/mL, 1088: 1,1 µg/mL, Pa

PHB64: 0,5 µg/mL. A linhagem 151 morreu com todas as concentrações testadas. Para as

demais linhagens MRs, nem mesmo a concentração de 300 µg/mL foi suficiente para causar a

morte bacteriana (Figura 22).

O teste da CBM para a piocina R5 foi testado para as cepas 392, 395, C916 e 141. Foi

possível determinar a CBM para 3 linhagens MRs: 392: 7,8 µg/mL, C916: 62,5 µg/mL e 141:

500 µg/mL (Figura 23).

96

Figura 22- Atividade bactericida da piocina S8

Nota: A piocina S8 purificada diretamente da linhagem ET02 foi quantificada e diluída gradativamente em meio

Mueller-Hinton. Um volume de 100 µL das diferentes diluições foi adicionado nos diferentes poços da

microplaca. Em paralelo, as diferentes linhagens multirresistentes foram crescidas em meio Mueller-Hinton e

ajustadas para escala 0,5 de McFarland (~ 1 x 108 UFC/mL). As bactérias foram diluídas 1:10 em meio fresco e

um volume de 5 µL foi adicionado nos diferentes poços da microplaca contendo diferentes concentrações da

piocina S8. As placas foram incubadas a 37 ºC overnight para permitir o crescimento bacteriano. A atividade

bactericida foi verificada através da adição de Alamar Blue, a qual reage com células contidas nos poços,

adquirindo uma coloração azul (célula não viável/não fluorescente) e rosa (célula viável/fluorescente).

97

Figura 23 - Atividade bactericida da piocina R5

Nota: A piocina R5, purificada diretamente da linhagem ET02, foi quantificada e diluída em série, em meio

Mueller-Hinton. A determinação da concentração bactericida mínima foi feita conforme descrito na seção 4.13 e

na legenda da Figura 22.

Para avaliar quais as piocinas que as linhagens multirresistentes produzem, um

screening molecular foi realizado utilizando primers específicos para os genes das piocinas do

tipo S.

A linhagem PAO1 foi utilizada como controle das reações de amplificação, pois já

está documentado que ela produz as piocinas S2, S4, S5, R2 e F2. Dentre as linhagens que

não foram mortas pela piocina S8, apenas C916 possui o gene codificador dessa piocina

(Tabela 3). Foi verificado que treze cepas MRs possuem os genes das piocinas S1 ou S2. Para

as quatro cepas que não foram mortas pela piocina S8 (141, 225, 395 e 392) (Figura 21), o

mecanismo de resistência frente a essa piocina possivelmente envolve outros mecanismos.

98

Tabela 3 – Presença das piocinas do tipo S nas cepas multirresistentes

Cepas

Genótipo

de

resistência S1

S2

S3

S4

S5

S6

S8

AP

41

Atividade da

piocina S8*

ET02 OXA-50 -

PAO1 OXA-50 +

PaIMP IMP-1 +

48-1997A SPM-1 +

PaGIM GIM-1 +

247-B VIM-1 +

Pa BH6 KPC-2 +

Pa PHB64 GES-5 +

19 SPM-1 +

151 SPM-1 +

141 SPM-1 -

24 RmtD +

44 SPM-1 +

C916 negativo -

298 OXA-18 +

225 GES-1 -

179 VIM-1 +

1088 SPM-1 +

395 IMP-18 -

392 OXA-10 -

Nota: Retângulos pretos, PCR positivo para a piocina; retângulos brancos, PCR negativo para a piocina; -,

piocina S8 sem atividade contra a cepa; +, piocina S8 com atividade contra a cepa.

* Atividade referente à figura 21. Detalhes dos primers utilizados descritos no Quadro 6.

5.7 Estrutura cristalográfica da piocina S8

Através de análises in silico, Ghequire e De Mot (2014) propuseram que S8 possui

similaridade de sequência com a piocina AP41. Portanto, S8, pertence ao grupo de

bacteriocinas que possuem atividade de DNase baseada no motivo HNH endonuclease. Além

de S8 e AP41, o motivo HNH também está presente nas piocinas S1, S2 e S9 e nas colicinas

E2, E7, E8 e E9 (Parret, De Mot, 2002). O alinhamento da sequência de aminoácidos do

domínio DNase (domínio IV) das bacteriocinas que possuem o motivo HNH demonstrou que

S8 compartilha considerável identidade de sequência com as demais bacteriocinas (Figura

24A).

99

Figura 24 - Alinhamento das sequências de aminoácidos do domínio catalítico e das

proteínas imunitárias das bacteriocinas que possuem o motivo HNH

Nota: (A) Alinhamento das sequências de aminoácidos do domínio catalítico (IV) e das proteínas imunitárias das

bacteriocinas que possuem o motivo endonuclease HNH (piocinas S1, S2, AP41, S9 e as colicinas E2, E7, E8 e

E9). As sequências estão coloridas de acordo com o nível de conservação dos aminoácidos, sendo os

aminoácidos idênticos coloridos de azul escuro. As setas e os cilindros representam fitas e hélices,

respectivamente. As regiões de interação entre o domínio catalítico e a proteína imunitária estão sublinhadas

com uma linha vermelha. (B) Alinhamento dos aminoácidos que compõem o motivo HNH. Os resíduos de

histidinas altamente conservados envolvidos na coordenação do íon metálico divalente estão destacados por

retângulos vermelhos.

100

S8 possui o motivo HNH formado por uma sequência de 33 aminoácidos localizados

na porção C-terminal do domínio IV. O alinhamento do motivo HNH de S8 com as demais

bacteriocinas demonstrou elevado nível de conservação dos aminoácidos essenciais para a

atividade de DNase da piocina (Figura 24 B). Dentre estes, destacam-se quatro resíduos de

histidinas (Figura 24 B, retângulos vermelhos) que participam na coordenação de um íon

metálico divalente essencial para a clivagem da ligação fosfodiéster da molécula de DNA.

A piocina S8 apresentou uma potente atividade bactericida contra as linhagens MRs.

Para investigar o mecanismo de catálise da piocina S8, a estrutura cristalográfica dessa

piocina foi determinada através da difração de raios X.

Apenas o domínio DNase (domínio IV) em associação com a proteína imunitária (S8

DNase-ImS8) foi cristalizado. Os cristais obtidos difrataram com alta resolução (1.39 Å) e

pertencem ao grupo espacial P212121. A estrutura foi resolvida através de substituição

molecular utilizando a estrutura da piocina AP41 (AP41DNase-ImAP41) determinada

recentemente (Joshi et al., 2015). A estrutura final foi refinada para um Rfree/Rwork =

0.2758/0.2804.

O domínio S8DNase (domínio IV) é composto por quatro fitas-beta (β1- β2- β3- β4) e

seis alfa-hélices (α1- α2- α3- α4- α5- α6) (Figura 25 A). O motivo HNH (região destacada em

verde na figura 25 A) é formado por duas fitas-beta (β3 e β4) com orientação anti-paralela

rodeadas por uma alfa-hélice (α6). Essa região constitui o sítio ativo da enzima. Ela se liga no

sulco menor da molécula de DNA e catalisa a clivagem da ligação fosfodiéster.

A proteína imunitária é um feixe composto por quatro α-hélices (αI, αII, αIII e αIV)

(Figura 25 A). Ela interage com o domínio DNase de S8 em uma região adjacente do sítio

catalítico da enzima.

Recentemente, a estrutura cristalográfica do domínio DNase (domínio IV) das

piocinas S2 e AP41 em associação com suas respectivas proteínas imunitárias (S2DNase-

ImS2 e AP41DNase-ImAP41) foram determinadas (Joshi et al., 2015). A sobreposição da

estrutura de S8DNase-ImS8 com AP41DNase-ImAP41 demonstrou que S8 possui um

enovelamento muito semelhante ao da piocina AP41 com valores de RMSD de 1.30 Å para os

átomos de carbono α. No entanto, S8 não possui uma extensão de aminoácidos carregados

positivamente (FKRKEK) na região C-terminal do domínio DNase como observado para

AP41.

101

Figura 25 - Estrutura cristalográfica do domínio DNase da piocina S8 em associação com a

proteína imunitária

Nota: (A) O domínio DNase está representado em azul escuro enquanto que a proteína imunitária em azul claro.

O motivo HNH do domínio DNase está destacado em verde. As fitas beta do domínio DNase estão destacadas

como β1, β2, β3 e β4. Já as alfa-hélices estão demonstradas como α1, α2, α3, α4, α5 e α6. A subunidade

imunitária é formada apenas por alfa-hélices (α-1, α-II, α-III e α-IV). Três resíduos de histidinas do sítio ativo

estão demonstrados no formato de bastão. (B) Sobreposição estrutural de S8DNase-ImS8 (laranja) com

AP41DNase-ImAP41 (azul).

102

Não foi possível detectar a nuvem eletrônica de nenhum íon metálico divalente no

sítio ativo da piocina S8. Curiosamente, apenas três resíduos de histidinas (His102, His103 e

His127) puderam ser identificados no sítio ativo da enzima. A ausência da His131 se deve à

sua elevada mobilidade na estrutura no cristal impossibilitando a detecção da sua nuvem

eletrônica (Figura 26).

Figura 26 – Sobreposição do sítio ativo da piocina S8DNase-ImS8 com AP41DNase

Nota: A estrutura da piocina S8DNase-ImS8 está demonstrada em laranja enquanto que a estrutura de

AP41DNase (sem a subunidade imunitária) está demonstrada em azul. Os resíduos de histidinas estão

representados na forma de bastão. Na estrutura de AP41DNase um íon metálico divalente de Ni2+

está

representado por uma esfera azul. O íon de Ni2+

é coordenado pelas histidinas His102, His127 e His131 e por

uma molécula de citrato que foi cocristalizada com a proteína. Não foi possível determinar a nuvem eletrônica da

histidina 131 na estrutura de S8DNase-ImS8.

103

6 DISCUSSÃO

Por muitas décadas, os antibióticos foram uma arma poderosa na luta contra as

infecções bacterianas. Porém, nos últimos anos, o aumento da resistência aos antibióticos tem

sido amplamente documentado e, agora, representa uma ameaça global à humanidade (Levy,

Marshall, 2004; Eggleston et al., 2010; O’Neill, 2016).

São variados os fatores que contribuem para a seleção de organismos resistentes às

diversas classes de antibióticos disponíveis. Porém, o desenvolvimento de um novo

antibiótico é um processo altamente custoso e demorado, enquanto que a resistência

bacteriana pode surgir em um curto espaço de tempo (Coates et al., 2011; Schmieder,

Edwards, 2012). Algumas novas drogas antimicrobianas estão sendo aprovadas, ou estão em

fase de desenvolvimento, principalmente para Gram-positivos (Coates et al., 2011; Bassetti et

al., 2013; Bassetti, Righi, 2015).

Projeções alertam que, devido à resistência antimicrobiana, até 2050 haverá uma perda

na produtividade econômica global de US$ 100 trilhões, aliada a um aumento expressivo na

mortalidade mundial, chegando a 10 milhões de mortes por ano (O’Neill, 2016; Piddock,

2016).

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista Gram-negativo que acomete

principalmente pacientes imunocomprometidos, sob ventilação mecânica, com queimaduras,

portadores de fibrose cística e os que estão em unidades de terapia intensiva. Isolados clínicos

resistentes a diferentes classes de antibióticos têm sido associados a elevados níveis de

morbidade e mortalidade (Lambert et al., 2011; Diene, Rolain, 2013; McCarthy, 2015).

Os elevados níveis de morbidade/mortalidade se deve ao fato de P. aeruginosa

expressar múltiplos mecanismos de resistência, tais como: enzimas capazes de inativar os

antimicrobianos, superexpressão de bombas de efluxo, perda de porina e alterações no sítio-

alvo dos antimicrobianos, o que acaba por dificultar a ação dos antibacterianos atualmente

disponíveis (Pellegrino et al., 2002; Lambert et al., 2011; Poole, 2011; Diene, Rolain, 2013;

Morita et al., 2014).

Considerando sua importância clínica, a Sociedade de Doenças Infecciosas Norte-

Americana (IDSA) incluiu Pseudomonas aeruginosa na lista dos patógenos de maior ameaça

à saúde pública (ESKAPE) (Boucher et al., 2009).

Como consequência da falta de opções de antimicrobianos eficientes contra

microrganismos multirresistentes, diferentes trabalhos têm previsto um retorno à era pré-

104

antibiótica, postulando o uso de antibióticos abdicados no passado, devido toxicidade etc.

(Livermore, 2002, 2009; Theuretzbacher, 2012; Kaye et al., 2017)

Diante desse panorama desfavorável, urge a necessidade para o desenvolvimento e

aprovação de novos agentes antimicrobianos, especialmente contra os patógenos Gram-

negativos MRs (Boucher et al., 2009; Bassetti et al., 2013; Piddock, 2016). O relatório de Jim

O’Neil (intitulado “Review on Antimicrobial Resistance”) ressaltou a importância de se buscar

novas alternativas ao uso de antibióticos, dentre elas destacam-se anticorpos, probióticos,

lisinas, bacteriófagos de tipo selvagem e manipulados e estimulação do sistema imune do

hospedeiro (O’Neill, 2016). Adicionalmente, a OMS divulgou uma lista, na qual P.

aeruginosa resistente aos carbapenêmicos encontra-se no nível crítico de prioridade para

pesquisas e desenvolvimento de novos antibióticos (WHO, 2017). Com base nesse relatório

de O’Neil e nessa lista da OMS, nos quais a busca por novas alternativas são sugeridas,

bacteriocinas poderiam representar uma nova opção.

De fato, as piocinas têm sido apontadas como uma possível alternativa terapêutica

para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa (Scholl, Martin, 2008; Scholl et

al., 2009; Ritchie et al., 2011; Brown et al., 2012; Smith et al., 2012; Ghequire, De Mot, 2014;

Bakkal, 2016; McCaughey et al., 2016a,b).

Ao contrário dos antibióticos tradicionais de amplo espectro, as piocinas possuem um

espectro de ação relativamente restrito, possuindo atividade contra linhagens

filogeneticamente relacionadas à da célula produtora (Michel-Briand, Baysse, 2002; Riley,

Wertz, 2002a,b). Nesse sentido, a utilização das piocinas teria como principal vantagem a sua

especificidade apenas contra células de P. aeuruginosa, o que preservaria a microbiota do

hospedeiro (Ritchie et al., 2011).

Apesar do seu potencial valor terapêutico, há poucos estudos reportando a utilização

das piocinas contra linhagens de P. aeruginosa multirresistentes. Além disso, a maioria dos

trabalhos restringiu-se em utilizar apenas as piocinas produzidas pela cepa PAO1, a qual

possui o mapeamento genômico melhor caracterizado (Stover et al., 2000).

Com os avanços da tecnologia de sequenciamento de DNA o número de sequências

genômicas de P. aeruginosa cresceu vertiginosamente. Através de análises in silico, Ghequire

e De Mot (2014) fizeram predições de diversas sequências gênicas codificadoras de novas

moléculas piocinas.

105

Diante da grande diversidade de piocinas presentes na natureza este trabalho teve

como principal objetivo identificar uma nova molécula de piocina que apresente potente

atividade bactericida contra cepas de P. aeruginosa multirresistentes.

Os resultados aqui obtidos demonstram que a linhagem ET02 produz piocinas que

apresentam ampla atividade bactericida contra a maioria das cepas MRs testadas. Tais

resultados se basearam no teste de piocinotipagem, (Gillies, Govan, 1966; Govan, Gillies,

1969; Fyfe et al., 1984), uma metodologia que não permite identificar o tipo específico de

piocina que uma determinada cepa produz (ex. S1, S2 etc.). Portanto, esforços foram

direcionados na tentativa de identificar a(s) molécula(s) de piocina(s) responsável(eis) pela

morte das linhagens MRs.

A purificação das moléculas de piocinas, a partir das células bacterianas de ET02,

resultou na geração de duas frações proteicas. A fração S (sobrenadante da ultracentrifugação

feita a 61000 x g) contém piocinas de baixo peso molecular, denominadas piocinas do tipo S.

Por outro lado, a fração P (pellet da ultracentrifugação feita a 61000 x g) contém piocinas de

alto peso molecular, denominadas R e F (Williams et al., 2008; Scholl et al., 2009; Ge et al.,

2015).

A análise da composição proteica das frações S e P demonstrou a superexpressão de

uma proteína de ~90 KDa presente apenas na fração S da cepa ET02. Essa proteína foi

posteriormente repurificada através de cromatografia de exclusão molecular e apresentou

potente atividade bactericida contra a linhagem multirresistente PaGIM (escolhida

aleatoriamente devido ao pouco conteúdo de piocina). Esses dados incialmente suportavam a

hipótese de uma possível piocina do tipo S, uma vez que a proteína não foi sedimentada após

ultracentrifugação a 61000 x g.

A natureza química da proteína foi avaliada através de espectrometria de massas. Os

peptídeos que foram identificados apresentaram identidade com a piocina do tipo S AP41, a

qual foi caracterizada anteriormente (Holloway et al., 1973; Sano, Kageyama, 1981; Sano,

Kageyama, 1993; Joshi et al., 2015).

Com base na sequência de DNA da piocina AP41, depositada no banco de dados

(Sano, Kageyama, 1993), foi possível realizar a clonagem da piocina da cepa ET02,

inicialmente identificada como AP41 na espectrometria de massas.

A comparação da sequência de aminoácidos da piocina AP41 com a piocina da cepa

ET02 revelou que os domínios I, II e III são praticamente idênticos. Curiosamente, o domínio

IV, o qual possui a função de DNase na piocina AP41, se mostrou parcialmente diferente. As

106

subunidades imunitárias também apresentaram diferenças significativas entre si. Portanto,

apesar de algumas semelhanças entre as duas piocinas, foi possível afirmar que a cepa ET02

produz um novo tipo de piocina.

Através de análises in silico, Ghequire e De Mot (2014) fizeram a predição de uma

nova piocina presente nas cepas BL09, BL13, BL20 e VRFPA07, que possui grande

semelhança com a piocina AP41. Essa possível piocina foi denominada pelos autores como

S8. Curiosamente, a comparação da sequência de aminoácidos da piocina que foi clonada, da

cepa ET02, com a piocina S8 revelou que a piocina produzida pela cepa ET02 trata-se de fato

da piocina S8.

O sequenciamento do genoma da cepa ET02 revelou que a piocina S8 está inserida em

uma unidade genética composta por 7367 pb flanqueada por duas sequências repetidas

invertidas (IRs) de 48 pares de bases com 100% de identidade entre elas. A unidade genética é

composta de 8 ORFs: uma ATPase, uma transposase, uma resolvase, as subunidades

citotóxica e imunitária da piocina S8 e três proteínas hipotéticas (Turano et al., 2017).

Estruturas genéticas contendo uma transposase, flanqueada por IRs e uma curta região

de DNA duplicada, são características de elementos de transposição (Szuplewska et al.,

2014). Dessa forma, a piocina S8 está localizada no interior de um transposon. Curiosamente,

a piocina AP41 também foi reportada estar inserida em um transposon, denominado TnAP41

(Sano, Kageyama, 1993). No entanto, a estrutura de TnAP41 possui apenas os genes da

piocina flanqueados por sequências repetidas invertidas de 36 pares de bases. A ausência de

uma transposase em TnAP41 indica que a transposição desse elemento é dependente de uma

transposase codificada por outro elemento genético (Sano, Kageyama, 1993).

Elementos de transposição são capazes de se mover entre genomas desempenhando

uma importante função na evolução bacteriana. Em muitos casos, eles podem conferir

vantagens adaptativas para a bactéria em um determinado nicho biológico (Casacuberta,

González, 2013). É provável que ET02 tenha adquirido a capacidade de produzir a piocina S8

através da integração de um transposon no seu cromossomo. A mobilização desse elemento

entre as linhagens de P. aeruginosa poderia desempenhar um importante papel na

disseminação da piocina S8, no entanto, estudos deverão ser realizados para verificar a

capacidade deste transposon se mobilizar entre genomas.

O sequenciamento do genoma da cepa ET02 revelou que essa bactéria também produz

as piocinas S2 e R5. Dessa forma, o principal desafio foi purificar a piocina S8 diretamente de

ET02 sem que houvesse contaminações com S2 e R5. No início deste trabalho foram

107

realizadas sucessivas purificações das piocinas da cepa ET02 e constantemente verificado que

a fração S (piocinas de baixo peso molecular) continha contaminações com a piocina R5

(retângulos verdes na figura 10). Por outro lado, em posteriores purificações, nas quais se

duplicou o período da ultracentrifugação, foi possível reduzir a presença da piocina R5 da

fração S (comparar as proteínas correspondentes aos retângulos verdes da figura 20 nas

canaletas 3, 4 e 5).

Apesar de ET02 codificar as piocinas S2 e S8, houve apenas uma proteína

superexpressa na fração S, a qual foi identificada como S8 através de espectrometria de

massas e sequenciamento de DNA. Dessa forma, assumiu-se que a piocina S2 foi produzida

em pequenas quantidades e que a fração S continha predominantemente S8.

A atividade bactericida das piocinas S8 e R5 foi avaliada através da adição do

conteúdo das frações S e P sobre monocamadas das linhagens MRs, posteriormente foi

realizado a CBM para as cepas que foram mortas pelo teste anterior.

A interpretação dos resultados foi baseada nos mecanismos descritos na Figura 27.

No teste da monocamada, a piocina S8 matou 13 linhagens MRs (48-1997A, 247-B,

PaGIM, Pa PHB64, Pa BH6, PaIMP, 298, 179, 1088, 24, 44, 19 e 151) dentre as 18 linhagens

testadas. Surpreendentemente, a piocina R5 matou 16 (48-1997A, 247-B, PaGIM, Pa PHB64,

PaIMP, 298, 179, 1088, 24, 44, 19, 151, 392, C916, 141 e 395) das 18 linhagens testadas.

Para a piocina S8 foi possível determinar a CBM para um total de 6 linhagens MRs

(179, PaIMP, PaGIM, 19, 1088 e Pa PHB64). A cepa 151 morreu até mesmo com a menor

concentração testada. Por outro lado, a CBM da piocina R5 foi determinada apenas para 3

linhagens (392, C916 e 141). Em comparação com o ensaio de monocamada, houve uma

redução no número de cepas MRs que foram mortas pelas piocinas no ensaio da CBM. Isso

pode ser devido ao aparecimento de colônias resistentes à ação das piocinas conforme

evidenciado pela presença de colônias no interior do halo de inibição de crescimento. Tais

colônias impossibilitaram a determinação da CBM, pois elas cresceram durante o ensaio em

decorrência da sua resistência frente às piocinas.

108

Figura 27 - Representação esquemática dos hipotéticos mecanismos de resistência das

linhagens MRs contra a piocina S8 purificada de ET02

Nota: Fluxograma utilizado para interpretação dos resultados do ensaio de monocamada.

A atividade enzimática das piocinas é neutralizada através da ação da proteína

imunitária. Esta proteína se liga na subunidade citotóxica e inibe sua atividade catalítica.

Dessa forma, se as linhagens multirresistentes possuírem os genes das piocinas, elas serão

resistentes contra a ação dessas moléculas.

Nesse sentido, para explicar esses resultados foi realizado PCR para os genes das

piocinas do tipo S (Quadro 6 e Tabela 3).

As linhagens 48-1997A, 247-B, PaGIM, Pa PHB64, Pa BH6, 1088, 24, 44, 19 e 151

foram mortas unicamente pela piocina S8, uma vez que, o PCR para elas demonstrou a

presença das piocinas S1 e S2, excluindo assim a possibilidade de serem mortas por estas

109

piocinas. Ambas, S1 e S2, são inativadas pela mesma subunidade imunitária (Sano et al.,

1993b).

Não é possível identificar qual piocina (S2 ou S8) é responsável pela morte das

linhagens PaIMP, 298 e 179, pois elas não possuem os genes das piocinas S1, S2 e S8. Apesar

de não ser possível confirmar que a S8 seja a responsável pelas mortes destas cepas, o gel da

Figura 20 indica que somente esta piocina foi superexpressa, estando, portanto, em maior

quantidade na fração S.

A análise do tamanho dos halos de inibição de crescimento (Figura 21) demonstrou

que a fração P continha contaminações com a piocina S8 e/ou S2. Isso ficou evidente pelo

fato de que alguns halos inibitórios, formados pela piocina R5, tinham diâmetros maiores do

que 8 mm (que corresponde ao tamanho inicial do halo formado pela adição do líquido

contendo as piocinas sobre a placa).

As piocinas do tipo S possuem a capacidade de se difundir no meio de cultura, o

mesmo não ocorre para as piocinas de alto peso molecular, dos tipos R e F (Fyfe et al., 1984).

Nesse sentido, é possível afirmar que as linhagens C916, 392, 395 e 141 foram mortas

unicamente pela piocina R5, pois o halo apresentou um diâmetro de ~8 mm.

Para as linhagens 48-1997A, 247-B, PaGIM, Pa PHB64, Pa BH6, 1088, 24, 44, 19 e

151, cujos halos são maiores do que ~8 mm, a piocina S8 foi responsável pela atividade

bactericida. Já para as linhagens PaIMP, 298 e 179 as piocina S8 e/ou S2 podem ter atuado

em conjunto para a formação dos halos.

Para a linhagem 225 houve pequenas variações nos resultados entre os ensaios da

Figura 11 e Figura 21. Isso pode ter ocorrido devido ao aparecimento da resistência de

algumas células durante o segundo experimento, como pode ser observado na Figura 21.

O mecanismo de resistência, contra a piocina S8, nas linhagens 141, 395, 392 e 225

poderia envolver ausência e/ou alterações no receptor no qual esta piocina se liga.

A resistência bacteriana frente às piocinas vem sendo recentemente documentada.

Inglis et al. (2016) reportaram o surgimento da resistência frente a piocina S2 em linhagens de

P. aeruginosa cultivadas em meio contendo níveis normais de ferro. Por outro lado, não foi

observado o surgimento da resistência quando as linhagens foram cultivadas em condições de

carência de ferro. Isso se deve ao fato de que a piocina utiliza o mesmo receptor envolvido

para a captação do ferro.

Durante a translocação através da membrana externa a piocina S2 interage com o

receptor FpvAI (Ohkawa et al., 1980; Smith et al., 1992; Denayer et al., 2007). Por outro lado,

110

esse receptor também desempenha um importante papel na aquisição de ferro pela célula

bacteriana. Em condições de carência desse metal, células de P. aeruginosa produzem e

secretam sideróforos, que possuem elevada afinidade por ferro, conhecidos como pioverdinas

(Visca et al., 2007).

Após se ligarem ao átomo de ferro, as pioverdinas são translocadas para o interior da

célula bacteriana através dos receptores da classe FpvA (Cornelis, 2010; Cornelis,

Dingemans, 2013). Dessa forma, quando as concentrações de ferro estiverem baixas, as

alterações no receptor FpvAI, que causam resistência à piocina S2, ocorrerão com menor

frequência, pois o ferro é um componente essencial do metabolismo bacteriano e precisa ser

captado pelo receptor (Inglis et al., 2016).

A resistência das linhagens (141, 225, 395 e 392) frente à piocina S8 poderia ser

devido a uma diminuição da expressão do receptor dessa piocina, pois os meios de cultivo

utilizados nesse estudo continham níveis normais de ferro, o que poderia favorecer o

surgimento da resistência conforme verificado por Inglis et al. (2016). Alternativamente, tais

linhagens poderiam simplesmente não possuir o receptor que a piocina S8 interage.

Há evidências de que a piocina AP41 seja translocada para o interior da célula-alvo

através de um conjunto de proteínas cuja expressão é regulada pela disponibilidade de ferro

(Duan et al., 2000; Ghequire, De Mot, 2014). Células de P. aeruginosa produzem três tipos de

pioverdina, as quais variam entre as diferentes linhagens (Visca et al., 2007). Cada subtipo de

pioverdina interage com um receptor específico. Devido o domínio de ligação ao receptor das

piocinas AP41 e S8 ser o mesmo é possível que essas piocinas interajam com apenas um

desses subtipos de receptor.

A purificação das piocinas diretamente das cepas de P. aeruginosa foi um processo

altamente laborioso, o qual demandou excessiva quantidade de tempo, gerando uma

quantidade muito pequena de proteínas. Isto acabou dificultando a realização de ensaios

quantitativos devido à baixa concentração das piocinas obtidas após a purificação. Dessa

forma, a produção de piocinas em larga escala se torna fundamental para a realização de

experimentos que tenham como objetivo testes quantitativos/in vivo. Nesse sentido, foi feita a

construção de piocinas recombinantes, permitindo a obtenção de grandes quantidades dessas

moléculas.

A purificação das piocinas recombinantes foi feita através de cromatografia de

afinidade a níquel, em virtude da inserção de uma cauda de histidina na molécula de piocina.

Foram construídas duas versões recombinantes da piocina S8. Em uma delas, a cauda de

111

histidina foi inserida na região N-terminal da piocina enquanto que na outra a cauda foi

inserida na região C-terminal.

As piocinas recombinantes foram testadas contra as linhagens MRs e,

surpreendentemente, nenhuma foi morta. A ausência de atividade poderia ser devido a

alterações conformacionais na molécula de piocina, causadas pela cauda de histidina. Isto

parece pouco provável visto que uma grande quantidade de trabalhos tem utilizado piocinas

do tipo S recombinantes produzidas em fusão com cauda de histidina (Barreteau et al., 2009;

Ling et al., 2010; Elfarash et al., 2012, 2014; Smith et al., 2012; Ghequire et al., 2014;

McCaughey et al., 2014; Dingemans et al., 2016; McCaughey et al., 2016a,b). Na maioria

deses trabalhos, as piocinas se mostraram ativas contra linhagens de P. aeruginosa sensíveis

aos diferentes tipos de piocinas.

Foi reportada uma potente atividade bactericida da piocina AP41 purificada

diretamente das células de P. aeruginosa (Sano, Kageyama, 1981). Uma única molécula da

piocina foi suficiente para desencadear a morte da célula-alvo, mecanismo este conhecido

como single-hit killing. Por outro lado, a atividade de DNase observada in vitro, através da

clivagem de moléculas de DNA, não foi potente o suficiente para explicar o mecanismo de

single-hit killing (Sano, 1993).

Devido essa discrepância, especulou-se que a piocina AP41 poderia requerer algum

cofator para sua ótima atividade ou ainda que ela fosse processada in vivo para exibir uma

potente atividade de DNase (Sano, 1993). É possível que a piocina S8 recombinante não seja

suficientemente ativa devido a esses requerimentos. O processo de aquisição do íon metálico

divalente, essencial para atividade catalítica da enzima, poderia estar sendo dificultado nas

células de Escherichia coli.

Outra possibilidade seria que a cauda de histidina possa interferir com a translocação

da molécula de piocina para o interior da célula-alvo. Com base nos estudos das colicinas, há

evidências de que apenas o domínio DNase seja translocado (Jakes, Cramer, 2012). Dessa

forma, durante o processo de translocação, as moléculas de colicinas são clivadas por uma

protease localizada na membrana interna (Chauleau et al., 2011; Walker et al., 2007). Apesar

de não haver estudos sobre o mecanismo de translocação das piocinas, há evidências de que o

processo seja semelhante ao das colicinas.

Comprovando esta hipótese, um estudo demonstrou que a piocina AP41, mantida por

um período de dois meses a 4 ºC, sofreu um processo de clivagem liberando um fragmento de

112

aproximadamente 16.000 Da. Tal fragmento apresentou potente atividade de DNase contra

moléculas de DNA in vitro (Sano, 1993).

6.1 Análises estruturais

A comparação das sequências de aminoácidos das piocinas S8 e AP41 demonstrou que

essas piocinas possuem diferenças significativas no domínio DNase (domínio IV) da

subunidade citotóxica. Curiosamente, as principais diferenças estão localizadas na região de

ligação da proteína imunitária, conhecida como IPE (immunity protein exosite).

A região IPE compreende uma sequência de aminoácidos contínua formada pela alfa-

hélice V e pelo loop 4 do domínio DNase (Kleanthous, Walker, 2001; Joshi et al., 2015).

Visto que os aminoácidos da região IPE determinam a especificidade de interação com a

proteína imunitária, é provável que a imunitária de S8 seja incapaz de interagir com o

domínio DNase da piocina AP41.

O fato da região IPE se localizar adjacente ao sítio ativo da enzima possibilita que haja

extensivas variações de sequência nessa região sem que haja alterações nos aminoácidos

conservados do sítio ativo (Kleanthous, Walker, 2001).

O surgimento de mutações na região IPE poderia trazer vantagens adaptativas para a

linhagem produtora da piocina durante a competição contra outros organismos. Mutações

nessa região, bem como na própria proteína imunitária, tornaria a bactéria capaz de produzir

uma nova molécula piocina.

As informações acima citadas indicam que uma seleção positiva poderia atuar na

geração de novos padrões de interação entre a proteína imunitária e a região IPE. De fato, há

evidências de que existam maiores taxas de polimorfismos nas regiões codificadoras dos

domínios DNases e das proteínas imunitárias das colicinas, em comparação com os domínios

de ligação ao receptor e de translocação (Riley, 1998; Tan, Riley, 1997).

Kleanthous e Walker (2001) propuseram a hipótese de seleção diversificadora para o

surgimento de novos padrões de interação entre a proteína imunitária e o domínio DNase das

colicinas. De acordo com essa hipótese, inicialmente ocorreria uma mutação no gene

codificador da proteína imunitária conferindo-lhe uma maior flexibilidade de interação com o

domínio DNase. Em seguida, ocorreria uma mutação compensatória na região IPE. Isso

poderia gerar uma nova molécula de colicina, na qual a célula produtora ancestral seria

incapaz de neutralizar a atividade dessa nova colicina.

113

Com base na hipótese da seleção diversificadora proposta para as colicinas, é possível

especular que as piocinas S8 e AP41 tenham evoluído a partir de um ancestral comum. O

acúmulo de mutações na região IPE e na proteína imunitária poderia ter permitido a

diferenciação dessas duas piocinas ao longo da evolução. Devido à piocina S8 ter apresentado

potente atividade bactericida, é provável que essa piocina tenha surgido recentemente na

natureza e, portanto, poucas linhagens bacterianas possuam esse novo tipo de piocina

(Ghequire; De Mot, 2014).

Na região C-terminal do domínio DNase encontra-se o sítio ativo da piocina,

responsável pela clivagem do DNA da célula-alvo (Joshi et al., 2015). O sítio ativo contém o

motivo altamente conservado HNH encontrado em diversas endonucleases de procariotos e

eucariotos (Kleanthous et al., 1999; Kühlmann et al., 1999). Tal motivo é composto por 33

resíduos de aminoácidos localizados na extremidade C-terminal do domínio DNase. Ele

possui duas fitas beta antiparalelas (fitas β3 e β4 na piocina S8) rodeadas por uma alfa-hélice

(α-hélice VI na piocina S8) e um íon metálico divalente ligado ao centro.

O mecanismo de clivagem do DNA das piocinas que possuem o motivo HNH (S1, S2,

AP41, S8 e S9) permanece desconhecido. Não há nenhuma estrutura cristalográfica das

piocinas em complexo com o DNA. Por outro lado, o mecanismo de clivagem de colicinas

tem sido extensivamente caracterizado com base nas estruturas das colicinas ColE7 (Hsia et

al., 2004; Doudeva et al., 2006) e ColE9 (Maté, Kleanthous, 2004) complexadas com o DNA.

Aminoácidos altamente conservados do motivo HNH possuem funções críticas na

clivagem da molécula de DNA. Quatro resíduos de histidinas, (His102, His103, His127 e

His131), participam na coordenação de um íon metálico divalente, que catalisa a hidrólise da

ligação fosfodiéster da molécula de DNA (Kleanthous et al., 1999; Kühlmann et al., 2000;

Pommer et al., 2001; Hsia et al., 2004; Maté, Kleanthous, 2004; Doudeva et al., 2006). O

alinhamento do motivo HNH da piocina S8 com outras bacteriocinas, que também possuem

este motivo, demonstrou que S8 contém os aminoácidos essenciais para a catálise enzimática.

Além dos quatro resíduos de histidinas, os resíduos de Glu100 e Asn118 são essenciais para a

atividade da enzima (Walker et al., 2002).

Para obter informações sobre o mecanismo de catálise da piocina S8 estudos de

cristalografia de raios X foram realizados. Isto permitiu uma análise detalhada da estrutura

molecular dessa piocina. Apenas o domínio catalítico da piocina S8 em associação com a

subunidade imunitária (S8 DNase-ImS8) foram cristalizados. A estrutura do complexo S8

DNase-ImS8 foi obtida com resolução de 1.39 Å.

114

Joshi et al. (2015) determinaram a estrutura do domínio DNase, da piocina AP41,

isoladamente (AP41 DNase) ou em associação com a proteína imunitária (AP41 DNase-

ImAP41).

O domínio DNase de S8 adquire o típico enovelamento HNH presente nas estruturas

das piocinas AP41 e S2 (Joshi et al., 2015) e nas colicinas ColE7 (Ko et al., 1999) e ColE9

(Kleanthous et al., 1999; Kühlmann et al., 2000). A sobreposição das estruturas S8 DNase-

ImS8 e AP41 DNase-ImAP41, revelou que elas são muito semelhantes.

Não foi possível detectar a nuvem eletrônica de nenhum íon metálico na estrutura de

S8 DNase-ImS8.

Na estrutura do domínio DNase de AP41 foi possível detectar a presença do íon

metálico Ni2+

no sítio ativo da enzima. Por outro lado, na estrutura com a proteína imunitária,

(Ap41DNase-ImAP41) o íon metálico esteve ausente. Especulou-se que a proteína imunitária

desencadeou uma mudança no ângulo da hélice C-terminal (α-hélice VI) reposicionando os

resíduos de histidinas do sítio ativo tornando-os incapazes de coordenar o íon metálico (Joshi

et al., 2015).

Apenas três resíduos de histidinas do centro ativo puderam ser detectados na estrutura

de S8 DNase-ImS8 (His102, His103 e His127). Não foi possível detectar a nuvem eletrônica

da His131, provavelmente devido à elevada mobilidade desse resíduo na estrutura do cristal.

Portanto, em ambas as estruturas de S8 DNase-ImS8 e AP41 DNase-ImAP41 a presença da

proteína imunitária causa uma desorientação dos resíduos de histidinas do sítio ativo.

Com base nessas informações é possível especular o mecanismo pelo qual a proteína

imunitária inibe a atividade das piocinas. A ligação da subunidade imunitária poderia

desorientar os resíduos de histidinas impossibilitando a coordenação do íon metálico. Sem o

íon metálico, a piocina seria incapaz de catalisar a clivagem da molécula de DNA.

A hipótese descrita acima é ligeiramente diferente do modelo proposto para as

moléculas de colicinas. De acordo tal modelo, a ligação da proteína imunitária na molécula de

colicina impede que a mesma se ligue no DNA. Isso é baseado na rede de cargas negativas

presente na superfície da proteína imunitária. Devido ao fato de o DNA também ser negativo,

a ligação da proteína imunitária causa uma repulsão eletrostática da ligação da colicina no

DNA substrato (Kleanthous et al., 1999; Kleanthous, Walker, 2001).

A obtenção da estrutura da piocina S8 em complexo com o DNA substrato será

fundamental para entender o mecanismo pelo qual a proteína imunitária inibe a atividade da

115

piocina. Tais informações possibilitarão que as piocinas sejam estruturalmente modificadas

desenvolvendo diferentes subtipos de piocinas.

A determinação da estrutura cristalográfica de todos os domínios de S8 irá contribuir

para o entendimento de como essa molécula é translocada para o interior da célula-alvo. Além

disso, os dados de cristalografia de raio X poderão permitir que as moléculas de piocinas

sejam modificadas potencializando sua atividade bactericida.

O mecanismo de translocação da piocina S8 permanece desconhecido. Porém, devido

a essa piocina possuir um domínio de ligação ao receptor idêntico ao de AP41 é provável que

elas reconheçam o mesmo tipo de receptor. Apesar de a natureza do receptor permanecer

desconhecida, há evidências de que envolva genes envolvidos na captação de ferro (Holloway

et al., 1973; Duan et al., 2000).

Holloway et al. (1973) isolaram mutantes de P. aeruginosa resistentes à ação da

piocina AP41. Esses mutantes foram posteriormente caracterizados, revelando o

envolvimento de um conjunto de sete genes organizados em três operons (orf1-tolQRA, tolB e

oprL-orf2) (Dennis et al., 1996; Duan et al., 2000). Em condições de baixa concentração de

ferro, esses genes são fortemente induzidos de maneira dependente do regulador RegA (Duan

et al., 2000; Lafontaine, Sokol, 1998). Tais resultados indicam que a translocação das piocinas

AP41 e S8 seriam facilitadas em situações de carência de ferro. Nessas condições, a ação das

moléculas de piocinas teria um importante papel nas competições bacterianas pela aquisição

do ferro.

As sete proteínas, envolvidas na translocação de AP41, fazem parte de um complexo

proteico conhecido como Tol (Kleanthous, 2010). Esse complexo auxilia o transporte de

substâncias através da membrana externa utilizando a energia armazenada na membrana

interna (Jakes, Cramer, 2012). Os mecanismos moleculares pelo qual o complexo Tol atua

permanecem totalmente desconhecidos. O pouco conhecimento que se tem foi obtido através

da caracterização desse complexo em Escherichia coli. Nesse organismo, as colicinas do

grupo A, tais como ColE2, ColE7, ColE8 e ColE9, se ligam no receptor da vitamina B12

(BtuB) e, após atravessarem a membrana externa, interagem com a complexo Tol

(Kleanthous, 2010; Jakes, Cramer, 2012). Curiosamente, o transporte da vitamina B12,

mediado pelo receptor BtuB, é dependente de outro complexo proteico conhecido como

complexo TonB (Noinaj et al., 2010).

Em P. aeruginosa, os receptores envolvidos na captação de ferro (receptores de

ferropioverdina) utilizam a maquinaria Ton durante o transporte do ferro para o interior da

116

célula (Visca et al., 2007). Com base no mecanismo de translocação das colicinas é possível

especular que as piocinas S8 e AP41 se liguem em receptores envolvidos na captação de ferro

e utilizem a maquinaria Tol para atingirem o citoplasma da célula-alvo.

Recentemente, McCaughey et al. (2016a) propuseram um modelo de translocação da

piocina SD2. De acordo com esse modelo, a piocina SD2 é concentrada na superfície celular

através da ligação ao antígeno polissacarídeo comum (CPA). A interação com CPA facilita a

ligação ao receptor FpvAI localizado na membrana externa. Após a ligação ao receptor

FpvAI, a molécula é translocada para o periplasma com o auxílio dos componentes da

maquinaria Ton. Curiosamente, McCaughey et al. (2016a) verificaram que a piocina AP41

não se liga ao antígeno CPA, indicando que essa piocina é translocada por outro mecanismo.

O conhecimento do receptor da piocina S8 será fundamental para sua utilização

clínica, uma vez que, é necessário saber se a P. aeruginosa, causadora da infecção, expressa

esse receptor. Adicionalmente, esse conhecimento poderá permitir o desenvolvimento de

novas moléculas de piocinas, que reconheçam diferentes tipos de receptores, através da

substituição dos seus domínios de ligação ao receptor.

6.2 Considerações finais

Estudos apontam que as piocinas podem vir a se tornar úteis no tratamento de

infecções ocasionadas por P. aeruginosa (Scholl, Martin, 2008; Williams et al., 2008; Scholl

et al., 2009; Ling, et al., 2010; Ritchie et al., 2011; Smith et al., 2012; McCaughey et al.,

2016b). Apesar do seu potencial valor terapêutico, não há estudos reportando a utilização

dessas moléculas contra linhagens MRs. Nesse sentido, este trabalho teve como principal

objetivo identificar uma nova molécula de piocina que apresentasse potente atividade

bactericida contra dezoito linhagens de P. aeruginosa MRs.

A piocina S8 apresentou potente atividade bactericida contra treze das dezoito

linhagens MRs testadas. Para a realização desses ensaios, a piocina S8 foi purificada

diretamente da cepa ET02. Devido ao fato de o protocolo de purificação ser extremamente

demorado e produzir uma pequena quantidade da piocina, optou-se pela produção de S8

recombinante em células de Escherichia coli. No entanto, esta se mostrou inativa contra todas

as linhagens MRs testadas. Estudos adicionais deverão ser conduzidos para compreender os

motivos pelos quais a piocina S8 recombinante não apresentou atividade.

117

As piocinas do tipo S são ativas apenas contra as linhagens de P. aeruginosa. Dessa

forma, a piocina S8 poderá ser utilizada na pratica clínica sem afetar a microbiota do paciente,

como ocorre com os antibióticos tradicionais. Complicações associadas à utilização de

antibióticos de amplo espectro incluem diarreia e infecções causadas por Clostridium difficile

(Gorkiewicz, 2009; Carroll, Bartlett, 2011).

Estudos recentes indicam que o desequilíbrio da comunidade microbiana desempenha

uma importante função em uma variedade de patologias tais como a doença de Crohn,

diabetes, obesidade e artrite reumatoide (Scher, Abramson, 2011; Henao-Mejia et al., 2012;

Manichanh et al., 2012; Qin et al., 2012). A capacidade de tratar infecções sem interferir com

a microbiota do hospedeiro poderia melhorar a saúde do paciente, aumentando a eficácia do

tratamento (McCaughey et al., 2016b).

Para que a piocina S8 seja ativa no tratamento de uma determinada infecção, o

profissional da saúde deverá seguir dois critérios: 1) verificar se a bactéria causadora da

infecção expressa o receptor ao qual esta piocina interage; 2) avaliar se a bactéria não possui o

gene da subunidade imunitária responsável pela inibição da atividade da piocina. As cinco

linhagens MRs que se mostraram resistentes à ação da piocina S8 provavelmente possuem um

desses dois critérios. Nesse caso, uma outra piocina poderia ser utilizada como alternativa.

A piocina R5 poderia ser eficientemente utilizada contra as linhagens MRs que se

mostrarem resistentes à ação da piocina S8. De fato, R5 matou quatro linhagens MRs que não

foram mortas pela piocina S8. No entanto, ao contrário das piocinas do tipo S, que são

facilmente clonadas em vetores de expressão, a obtenção da piocina R5 recombinante poderia

ser dificultada em decorrência de ela possuir várias proteínas.

Foi construída uma versão “recombinante” da piocina R2 através da substituição da

proteína da cauda Pfr15 por uma proteína do fago PS17. Esta piocina teve seu espectro

bactericida aumentado, passando a reconhecer bactérias diferentes de Pseudomonas

aeruginosa, que foram infectadas pelo fago (Williams et al., 2008). Baseado nessa

metodologia, uma versão “recombinante” da piocina R5 poderia ser construída, na qual uma

de suas subunidades seja expressa em fusão com uma cauda de histidina. Isso facilitaria sua

purificação em colunas de cromatografia de afinidade à níquel.

A atividade bactericida das piocinas foi caracterizada em modelos de animais

infectados com P. aeruginosa (Merrikin, Terry, 1972; Williams, 1976; Scholl, Martin, 2008;

Williams et al., 2008; Scholl et al., 2009; Ritchie et al., 2011). Em todos esses estudos, não

houve nenhuma citotoxicidade in vivo.

118

Recentemente a atividade bactericida das piocinas S2, S5, L1 e AP41 foi avaliada em

camundongos com infecções pulmonares agudas de P. aeruginosa. A piocina S5 apresentou

potente atividade em uma concentração cem vezes menor do que o antibiótico tobramicina

comumente usado no tratamento das infecções. Adicionalmente, as piocinas se mantiveram

estáveis no pulmão e foram pouco imunogênicas (McCaughey et al., 2016b).

A atividade bactericida das piocinas S8 e/ou R5 deverá ser testada em modelos de

animais infectados com as linhagens MRs.

A atividade bactericida da piocina R2 foi avaliada em camundongos com infecções

peritoneais causadas por P. aeruginosa (Scholl, Martin, 2008). Neste estudo, a piocina R2 foi

administrada de duas maneiras: intravenosa e intraperitonealmente. A administração

intraperitoneal foi mais eficaz em reduzir o número de bactérias causadoras da infecção. Os

autores especularam que, na administração intravenosa, houve uma limitada difusão das

piocinas do sangue para o espaço peritoneal. A escolha de administração da piocina S8 irá

depender do tipo de infecção que o paciente possuir. Nesse sentido, infecções respiratórias

poderiam ser tratadas com um produto para inalação e, infecções em queimaduras, com um

produto de uso tópico.

O surgimento da resistência bacteriana contra a ação das piocinas poderia dificultar o

sucesso do tratamento. Conforme descrito anteriormente, a especificidade das piocinas do tipo

S é determinada por receptores específicos presentes na superfície da célula bacteriana.

Alterações no receptor, ou diminuição nos níveis de expressão, são os principais fatores

envolvidos na resistência bacteriana contra a ação das piocinas (Inglis et al., 2016). Por outro

lado, devido ao fato de as piocinas possuírem uma estrutura modular, seu espectro de ação

poderia ser ampliado simplesmente substituindo o domínio de ligação ao receptor. Essa ideia

foi explorada através da construção de piocinas híbridas entre S1 e AP41 (Sano et al., 1993a)

e S5 com S2 (Elfarash et al., 2014).

Por S8 ter apresentado potente atividade bactericida, os domínios II, III e IV dessa

piocina poderiam ser fusionados com diferentes domínios de ligação ao receptor. Em teoria, a

piocina S8 poderia ser modificada para reconhecer receptores de outras bactérias causadoras

de infecção, como por exemplo, linhagens de Escherichia coli patogênicas.

Em resumo, o cenário atual indica que as infecções de P. aeruginosa MRs possuem

poucas opções de tratamento (Pinheiro et al., 2008; McCaughey et al., 2016). A resistência

aos antibióticos, fatores de patogenicidade e a formação do biofilme estão entre os principais

desafios enfrentados pelos profissionais de saúde. A utilização da piocina S8 como um

119

antibiótico proteico pode vir a se tornar uma alternativa eficaz no combate de infecções

causadas por P. aeruginosa MRs. Nesse sentido, estudos adicionais deverão ser realizados

para se obter um melhor entendimento do mecanismo de ação da piocina S8.

120

7 CONCLUSÕES

1. As cepas CIB, CI3 e ET02 produzem piocinas com ampla atividade bactericida contra

as cepas MRs. Dentre essas, a cepa ET02 produziu os maiores halos de inibição do

crescimento das linhagens multirresistentes.

2. A cepa ET02 produz três tipos de piocinas: S2, S8 e R5.

3. No teste da monocamada a piocina S8 matou treze de dezoito cepas MRs. Dentre

essas, pode-se afirmar que dez cepas (48-1997A, 247-B, PaGIM, Pa PHB64, Pa BH6,

1088, 24, 44, 19 e 151) foram mortas unicamente pela S8. A CBM foi determinada

para um total de seis cepas (179, PaIMP, PaGIM, 19, 1088 e Pa PHB64).

4. No teste da monocamada, a piocina R5 matou quatro de dezoito cepas MRs (C916,

392, 395 e 141). A CBM foi determinada para três cepas (392, C916 e 141).

5. Os genes codificadores da piocina S8 estão inseridos no interior de um novo

transposon da família Tn3. O transposon é composto por oito ORFs: uma tranposase,

uma resolvase, uma ATPase, três proteínas hipotéticas e os dois genes da piocina S8.

6. Há uma baixa frequência da piocina S8 nas linhagens MRs (somente a linhagem C916

produz essa piocina), explicando sua ampla atividade bactericida.

7. Há uma elevada frequência das piocinas S1 e S2 nas linhagens MRs (treze cepas

produzem S1 e/ou S2). Dessa forma, essas linhagens são resistentes frente a ação

dessas piocinas.

8. A piocina S8 possui 90% de identidade de aminoácidos com a piocina AP41. Os

domínios I, II e III da subunidade citotóxica são praticamente idênticos entre ambas as

piocinas.

9. A piocina S8 possui o motivo HNH endonuclease presente nas piocinas S1, S2, AP41

e S9 e também nas colicinas ColE2, ColE7, ColE8 e ColE9.

10. As piocinas S8 e AP41 possuem diferenças significativas no domínio IV da

subunidade citotóxica. As principais diferenças estão localizadas na região de

interação entre a subunidade citotóxica e a proteína imunitária.

11. A ligação da proteína imunitária causa um rearranjo dos resíduos de histidinas do

centro ativo da enzima impossibilitando a ligação do íon metálico divalente.

121

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APÊNDICES

Artigo 1

Aceito pela revista Diagnostic Microbiology and Infectious Disease em 4 de junho de

2016.

Article title: Presence of high-risk clones of OXA-23-producing Acinetobacter

baumannii (ST79) and SPM-1-producing Pseudomonas aeruginosa (ST277) in environmental

water samples in Brazil.

Authors: Helena Turano, Fernando Gomes, Micheli Medeiros, Silvane Oliveira, Lívia

Fontes, Maria I.Z. Sato and Nilton Lincopan

Journal: Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (Diagn Microbiol Infect Dis)

http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2016.06.005

145

Artigo 2

Aceito pela revista Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC) em 27 de

fevereiro de 2017.

Article title: Tn6350, a Novel Transposon Carrying Pyocin S8 Genes Encoding a

Bacteriocin with Activity against Carbapenemase-Producing Pseudomonas aeruginosa.

Authors: Helena Turano, Fernando Gomes, Gesiele A. Barros-Carvalho, Ralf Lopes,

Louise Cerdeira, Luis E. S. Netto, Ana C. Gales and Nilton Lincopan

Journal: Antimicrobial Agents and Chemotherapy

http://dx.doi.org/10.1128/AAC.00100-17

Presence of high-risk clones of OXA-23-producingAcinetobacter baumannii (ST79) and SPM-1-producingPseudomonas aeruginosa (ST277) in environmental water samples in Brazil

Helena Turano a, Fernando Gomes b, Micheli Medeiros c, Silvane Oliveira a, Lívia C. Fontes a,Maria I.Z. Sato d, Nilton Lincopan a,c,⁎a Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazilb Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazilc Department of Clinical Analysis, School of Pharmacy, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazild Environmental Company of São Paulo State (CETESB), São Paulo, Brazil

a b s t r a c ta r t i c l e i n f o

Article history:Received 5 April 2016Received in revised form 2 June 2016Accepted 4 June 2016Available online 7 June 2016

Keywords:Non-fermentativeMultidrug-resistantMβLOXAMLSTUrban rivers

This study reports thepresence of hospital-associated high-risk lineages ofOXA-23-producing ST79Acinetobacterbaumannii and SPM-1-producing ST277 Pseudomonas aeruginosa in urban rivers in Brazil. These findings indicatethat urban rivers can act as reservoirs of clinically important multidrug-resistant bacteria, which constitutea potential risk to human and animal health.

© 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.

The dissemination of hospital-associated bacteria in the environ-ment is a serious clinical and public health concern worldwide (Rocaet al., 2015). In this regard, the extensive use of antimicrobials in agricul-ture, livestock and human and veterinary medicine has lead to the in-crease in antimicrobial resistance among clinically important bacteria,which can find its way into aquatic environments (Marshall and Levy,2011). Therefore, in urbanized areas, rivers can act as reservoirs ofmultidrug-resistant (MDR) bacteria, facilitating their transmission tohumans and animals exposed through drinking water and/or recrea-tional water (Montezzi et al., 2015). In the last years, reports of theoccurrence of clinically relevant bacteria, belonging to hospital-associated high-risk clonal lineages, in sewage and polluted rivershave been increasingly frequent, mainly in Brazil, the biggest countryin Latin America (Dropa et al., 2016; Oliveira et al., 2014; Picão et al.,2013; Sacramento et al., 2016). In this study, we report additional infor-mation on the environmental dissemination of OXA-23-producingAcinetobacter baumannii and SPM-1-producing Pseudomonas aeruginosabelonging to hospital-associated clones ST79 and ST277, respectively.

During a local surveillance study conducted to monitor the occur-rence of carbapenemase-producing Gram-negative bacteria fromurban areas in Southeastern Brazil, 39 surface water samples were col-lected from ten different locations along the Tietê (TIET) and Pinheiros(PINH) Rivers, in the city of São Paulo (Fig. 1), the largest andmost pop-ulous metropolitan area in Brazil. Both rivers cut through this metropo-lis and, while the Tietê stretches through São Paulo state from east towest for about 1100 km, the Pinheiros River is a tributary of the TietêRiver that runs 25 km across the city.

According to standard methods for the examination of water andwastewater, 500 mL of surface water was collected in sterile bottles(http://www.standardmethods.org). From each water sample, 100 mLwas concentrated by filtration through sterile membrane filters with apore size of 0.45 μm. The filters were placed on MacConkey agar platesand incubated for 24 h at 37 °C. Next, the membrane filters wereaseptically removed and placed separately into sterile tubes that hadpreviously been filled with 10 mL of sterile Mueller–Hinton broth.After vortex treatment, an aliquot (100 μL) of each culturewas streakedonto MacConckey agar plates supplemented with imipenem (1 μg/mL).Isolates were identified by flightmass spectrometry (MALDI-TOF) anal-ysis, the antibiotic resistance pattern was determined by Kirby-Bauermethod (CLSI, 2015), and carbapenemase-encoding genes were

Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 86 (2016) 80–82

⁎ Corresponding author. Tel.: +55-11-30917296; fax: +55-11-30917354.E-mail address: [email protected] (N. Lincopan).

Contents lists available at ScienceDirect

Diagnostic Microbiology and Infectious Disease

j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /d iagmicrob io

http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2016.06.0050732-8893/© 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.

screened by PCR amplification and sequencing (Gales et al., 2003;Higgins et al., 2010). Additionally, the clonal relatedness was evaluatedby multilocus sequence typing (MLST) (http://pubmlst.org/paeruginosa/;http://pubmlst.org/abaumannii/).

In this study, six carbapenem-resistant non-fermentative bacteriawere isolated from six different surface water samples collected fromthe rivers Tietê and Pinheiros in São Paulo (Southeastern Brazil). Theisolates were identified as P. aeruginosa (n = 3) or A. baumannii (n =3), and PCR and sequencing analysis showed that these isolates carriedblaSPM-1 and blaOXA-23 genes, respectively (Table 1). In this regard, posi-tive water samples were collected from three different sites located inthemetropolitan region of São Paulo. The first (TIET-04180) and secondsite (TIET-04900)were located along of the Tietê River (S 23° 31′ 18″, W46° 37′ 52″ and S 23° 27′ 16″, W 46° 54′ 36″, respectively), and the thirdsite (PINH-04900) was located downstream of the Pinheiros River(S 23° 31′ 52″, W 46° 44′ 54″) (Fig. 1). SPM-1-producing P. aeruginosaisolates were clonally related belonging to sequence type ST277 on

MLST analysis. Likewise, OXA-23 positive A. baumannii strains werealso closely related belonging to the clonal complex CC79 (Table 1).

These results confirm the environmental dissemination of hospital-associated lineages of carbapenemase-producing non-fermentingbacteria in Brazil. In this regard, SPM-1-producing P. aeruginosa was de-scribed for the first time in 1997 and since then, it has become endemicin Brazilian hospitals, being associated with nosocomial outbreaks linkedto the spread of the pandemic clone ST277 (Fonseca et al., 2015; Galeset al., 2003). On the other hand, the production of OXA-23 has been themain mechanism responsible for carbapenem resistance amongA. baumannii isolates and previous studies have showed that ST79/CC79is the main clone/clonal complex responsible for the spread ofA. baumannii carrying blaOXA-23 in Brazil and other South American coun-tries (Camargo et al., 2016; Provasi Cardoso et al., 2016; Stietz et al., 2013;Vasconcelos et al., 2015). In fact, carbapenem-resistant Pseudomonasaeruginosa and Acinetobacter baumannii strains have become highlyprevalent in nosocomial settings in Latin America (Labarca et al., 2016)

Fig. 1.Map showing sampling locations (1 to 10) in the Tietê and Pinheiros Rivers (Suares Rocha et al., 2010). OXA-23-producing ST79 A. baumannii strains were isolated at TIET-04180(location 5, S 23°31′18″ W 46°37′52″), TIET-04900 (location 3, S 23°27′16″ W 46°54′36″), and PINH-04900 (location 8, S 23°31′52″ W 46°44′54″), whereas SPM-1-producing ST277P. aeruginosa strains were isolated at TIET-04900 (location 3) and PINH-04900 (location 8), in the metropolitan area of São Paulo, southeastern Brazil.

Table 1Characteristics of environmental OXA-23-producing A. baumannii and SPM-1-producing P. aeruginosa strains.

Straina Environmental location(latitude/longitude)

Antimicrobial resistance profileb β-lactamase gene MLST allelic profilec ST/CC

AbP cpn60 fusA gltA pyrG recA rplB rpoB

AbB gltA gyrB gdhB recA cpn60 gpI rpoD

PaC acsA aroE guaA mutL nuoD ppsA trpE

Ab 105,TIET-04180

S 23° 31′ 18″W 46° 37′ 52″

CAZ, CTX, FEP, IPM, CIP, AMK, SXT blaOXA-51, blaOXA-23 AbP 26 2 2 2 29 4 5 79/79AbB 1 15 8 10 28 195 32 783

Ab 120,TIET-04900

S 23° 27′ 16″W 46° 54′ 36″

CAZ, CTX, FEP, IPM, CIP, SXT blaOXA-51, blaOXA-23 AbP 26 2 2 2 29 4 5 79/79AbB 1 15 8 10 28 195 32 783

Ab 150,PINH-04900

S 23° 31′ 52″W 46° 44′ 54″

CAZ, CTX, FEP, IPM, CIP, GEN, SXT blaOXA-51, blaOXA-23 AbP 26 2 2 2 29 4 5 79/79AbB 1 15 8 10 28 195 32 783

Pa 19,TIET-04900

S 23° 27′ 16″W 46° 54′ 36″

CAZ, FEP, IPM, MEM, CIP, AMK, GEN, SXT blaSPM-1 2/8/10 PaC 39 5 9 11 27 5 2 277

Pa 141,PINH-04900

S 23° 31′ 52″W 46° 44′ 54″


Pa 151,PINH-04900

S 23° 31′ 52″W 46° 44′ 54″


a Ab, Acinetobacter baumannii; Pa, Pseudomonas aeruginosa; TIET, Tietê river; PINH, Pinheiros river.b CAZ, ceftazidime; FEP, cefepime; IPM, imipenem; MEM, meropenem; CIP, ciproflaxacin; AMK, amikacin; GEN, gentamicin; SXT, trimethoprim-sulfamethoxazole; CTX, cefotaxime.c AbP,Acinetobacter baumannii allelic profile Pasteur, ST andCCweredeterminedusing theAcinetobacter baumanniiMLSTdatabases of Institut Pasteur, France (http://pubmlst.org/abaumannii/);

AbB, Acinetobacter baumannii allelic profile Bartual, ST was determined using the A. baumanniiMLST databases of University of Oxford, UK (http://pubmlst.org/abaumannii/); PaC, Pseudomonasaeruginosa allelic profile Curran, ST was determined using the P. aeruginosaMLST databases of University of Oxford, UK (http://pubmlst.org/paeruginosa/).

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Other reports have documented the detection of OXA-23- andNDM-1-producingA. baumannii strains recovered fromurban river and hospi-tal sewage samples in France and China, respectively (Girlich et al.,2010; Zhang et al., 2013); as well as, the identification of P. aeruginosaVIM-2 from anurban river sample and sewage downstream from aHos-pital discharge site in Portugal (Quinteira and Peixe, 2006), and IMP-29-producing P. aeruginosa in water treated by wastewater treatmentplants in France (Slekovec et al., 2012), revealing that the environmen-tal spread of carbapenemase-producing A. baumannii and P. aeruginosacan be occurring in different countries around the world.

High-risk MDR bacteria have found several routes of entry into theenvironment, such as sewage from the community or hospitals (Rocaet al., 2015). Specifically, in Brazil wastewater from treatment plantsand hospitals have become a hot spot for horizontal transfer of antibiot-ic resistance genes (Dropa et al., 2016; Ferreira et al., 2011). Further-more, recent studies have report the occurrence of clinically relevantESBL and/or carbapenemase producers and vanA-containing Enterococ-cus species in sewage and polluted rivers (Fontes et al., 2011; Oliveiraet al., 2014; Picão et al., 2013; Sacramento et al., 2016). Of particular in-terest is the fact that the detection of KPC-2-producing K. pneumoniae(belonging to the widely disseminated CC258) and vanA-containingE. faecium has also been reported in the Tietê and Pinheiros Rivers, aswell as in contaminated coastal waters, in Brazil (Montezzi et al.,2015; Oliveira et al., 2014; Sacramento et al., 2016), demostrating thathigh-risk clinically important bacteria are not limited to nosocomial set-tings, which should exacerbate the public health concerns.

In summary, these results highlight the importance of environmen-tal monitoring of pathogenic bacteria that can potentially serve as asource of resistance genes against clinical important antimicrobialagents, emphasizing the urgent need to adopt drastic measures of con-trol and surveillance of discharge of domestic sewage and hospitalwastewater. Finally, new strategies should be developed to inhibit theextra-hospital spread of clinically important high-risk bacterial clones.

Funding

This work was funded by research Grant from Fundação de Amparoà Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) and Conselho Nacional deDesenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Competing interests

None declared.

Acknowledgements

FAPESP and CNPq research grants are gratefully acknowledged. N. L. isa research fellow of CNPq. We thank Cefar Diagnóstica Ltda (São Paulo,Brazil) for kindly supplying antibiotic discs for susceptibility testing.

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Tn6350, a Novel Transposon CarryingPyocin S8 Genes Encoding a Bacteriocinwith Activity against Carbapenemase-Producing Pseudomonas aeruginosa

Helena Turano,a Fernando Gomes,b Gesiele A. Barros-Carvalho,c Ralf Lopes,a

Louise Cerdeira,d Luis E. S. Netto,b Ana C. Gales,e Nilton Lincopana,d

Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazila;Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, University of São Paulo, São Paulo,Brazilb; Department of Botany, Institute of Biosciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazilc; Departmentof Clinical Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazild; LaboratoryAlerta, Federal University of São Paulo, São Paulo, Brazile

ABSTRACT A novel transposon belonging to the Tn3-like family was identified onthe chromosome of a commensal strain of Pseudomonas aeruginosa sequence type2343 (ET02). Tn6350 is 7,367 bp long and harbors eight open reading frames (ORFs),an ATPase (IS481 family), a transposase (DDE catalytic type), a Tn3 resolvase, threehypothetical proteins, and genes encoding the new pyocin S8 with its immunityprotein. We show that pyocin S8 displays activity against carbapenemase-producingP. aeruginosa, including IMP-1, SPM-1, VIM-1, GES-5, and KPC-2 producers.

KEYWORDS transposon, S-type pyocins, bacteriocin, Pseudomonas aeruginosa,metallo-�-lactamases

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen and a leading cause ofnosocomial infections, which are very difficult to treat because hospital-associated

lineages are usually multidrug resistant (MDR). Carbapenems have been considered themost effective drugs against MDR isolates. However, the emergence and disseminationof carbapenemase-producing P. aeruginosa strains have become a major health careproblem (1, 2). Therefore, since therapeutic options are limited, the research of newtherapeutic compounds is essential. In this regard, one alternative strategy has beenthe investigation of natural antibiotics (i.e., bacteriocins) produced by many bacteria forintraspecies competition (3–9). Specifically, bacteriocins produced by P. aeruginosa arecalled “pyocins.” Based on their structure, pyocins can be divided into three types,named R, F, and S. While R- and F-type pyocins are high-molecular-weight proteincomplexes that resemble phage tails, S-type pyocins are binary protein complexesconsisting of a large protein that harbors the killing function and a smaller immunityprotein that confers protection against the cognate bacteriocin (9, 10). Most S-typepyocins bind to specific receptors in the bacterial outer membrane and are translocatedthrough it before killing their target. In P. aeruginosa, several S-type pyocins exhibitingdifferent killing activities, such as DNase (S1, S2, S3, and AP41), tRNase (S4, S11, andS12), pore-forming (S5), rRNase (S6), and lipid II degradation activity (M1 and M4), havebeen described and functionally characterized. Currently, genes encoding S-type pyo-cins S7 through S10 have been identified in silico by analysis and comparison of draftand complete genome sequences of P. aeruginosa strains (9).

In this study, we performed a screening for strains producing pyocins with activityagainst MDR P. aeruginosa strains. In this regard, pyocins extracted from a commensalstrain (ET02), belonging to sequence type ST2343, which was isolated from a healthy

Received 17 January 2017 Returned formodification 8 February 2017 Accepted 21February 2017

Accepted manuscript posted online 27February 2017

Citation Turano H, Gomes F, Barros-CarvalhoGA, Lopes R, Cerdeira L, Netto LES, Gales AC,Lincopan N. 2017. Tn6350, a novel transposoncarrying pyocin S8 genes encoding abacteriocin with activity againstcarbapenemase-producing Pseudomonasaeruginosa. Antimicrob Agents Chemother61:e00100-17. https://doi.org/10.1128/AAC.00100-17.

Copyright © 2017 American Society forMicrobiology. All Rights Reserved.

Address correspondence to Helena Turano,[email protected], or NiltonLincopan, [email protected].

SUSCEPTIBILITY

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patient in Brazil, exhibited the highest antibacterial activity against MDR P. aeruginosaisolates, including carbapenemase-producing nosocomial lineages (Table 1).

The antimicrobial activity of pyocins from the ET02 strain was evaluated using apreviously described pyocin assay method (5). In brief, the pyocin production in ET02was induced by adding a 3 �g/ml final concentration of mitomycin C in culturemedium. Pyocin molecules were then precipitated by ammonium sulfate. The high-molecular-weight R- and F-type pyocins were sedimented by ultracentrifugation,whereas S-type pyocins were recovered from the supernatant (11). Both high- andlow-molecular-weight pyocins were screened against carbapenemase-producing P.aeruginosa isolates, where the fraction containing the S-type pyocins from the ET02strain displayed the highest antibacterial activity against clinically significant�-lactamase (SPM-1, GIM-1, VIM-1, IMP-1, KPC-2, OXA-18, GES-1, and GES-5)-producingP. aeruginosa strains (12–17) (Table 1). In contrast, S-type pyocins produced by P.aeruginosa PAO1 (i.e., S2, S4, S5) (9), which were used as a control, showed no activityagainst the strain panel (Table 1). S-type pyocins from the ET02 strain were submittedto proteomic analysis by mass spectrometry, and data were searched against theSwiss-Prot database, resulting in 19% coverage of the pyocin AP41 sequence (GenBankaccession number Q51502).

Total genomic DNA of P. aeruginosa ET02 was extracted to construct a mate-pairedlibrary, which was sequenced using the MiSeq platform (Illumina, Inc.). The sequencereads were de novo assembled using an A5-miseq pipeline (18), and after automaticannotation using Prokka (www.github.com/tseemann/prokka), the sequence wasmanually curated using the GenBank database and InterPro (www.ebi.ac.uk/interpro).Curiously, during whole-genome sequencing (WGS) analysis, we noted that a DNAregion of 7,367 bp containing the S-type pyocin nucleotide sequence from strain ET02displayed 100% identity with a region analyzed from the complete genome sequenceof P. aeruginosa strain BAMCPA07-48, recently submitted to the NCBI GenBank data-base (accession number CP015377.1). This region contained a transposon DNA-invertase, hypothetical proteins, and an uncharacterized S-type pyocin. Additionally, atranslated search of GenBank (blastx) revealed that the S-type pyocin from ET02displayed 90% identity to AP41 pyocin (GenBank accession number Q51502).

TABLE 1 Bacterial activity of pyocin S8 against MDR Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinical and environmental samples

P. aeruginosa strain Source

Resistance profile fora:

�-Lactamaseb

Bacterial activityof pyocinsc:

IPM MEM CAZ FEP AK GEN LVX CIP S8 S2, S4, S5d

48-1997A Human R R R R R R R R SPM-1 � –247-B Human R R R I S R R R VIM-1 � –GIM Human R R R R I R R R GIM-1 � –BH6 Human R R R R R I R R KPC-2 � –PHB64 Human R R R R R R R R GES-5 � –IMP Human R R R R R R R I IMP-1 � –298 Human I R R R S I S S OXA-18 � –395 Human R R R R R R R R IMP-18 – –179 Human R R R R R R R R VIM-1 � –1088 Human R R R R S I R R SPM-1 � –392 Human R R I R S R R R OXA-10 – –225 Human R R R R R R R R GES-1 � –44 Human R R R R R R R R SPM-1 � –19 Environmental R R R R R R R R SPM-1 � –141 Environmental R R R R R R R R SPM-1 – –151 Environmental R R R R R R R R SPM-1 � –ET02 Human S S S R S I I S OXA-50 – �PAO1 Control S S S S S S S S OXA-50 � –aIPM, imipenem; MEM, meropenem; CAZ, ceftazidime; FEP, cefepime; AK, amikacin; GEN, gentamicin; LVX, levofloxacin; CIP, ciprofloxacin (21); R, resistant isolates; I,intermediate isolates; S, susceptible isolates.

bGenes encoding �-lactamases were confirmed by PCR and sequencing.cBacterial activity of pyocins was evaluated by the presence (�) or absence (–) of inhibition zones measuring �10 mm, using a pyocin assay (5).dPyocins produced by P. aeruginosa strain PAO1 (9).

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Primers were designed to confirm the nucleotide sequence of ET02 pyocin bySanger sequencing, and then the translated sequence was deduced and analyzed; 772amino acids were obtained. Although attempts to perform a comparative proteinanalysis using different databases were unsuccessful, we found a recent review ofantibacterial proteins and peptides of Pseudomonas (9), in which new S-type pyocinsfrom P. aeruginosa were identified based on an in silico analysis, where a pyocin namedS8 was identical to the pyocin produced by P. aeruginosa ET02.

The genetic environment of S8 pyocin from ET02 was submitted to the TnNumber Registry database (http://www.ucl.ac.uk/eastman/research/departments/microbi-al-diseases/tn), confirming a new transposon, which was designed Tn6350. In thisregard, Tn6350 is a 7,367-bp transposon (GenBank accession number KY347015) be-longing to the Tn3-like family, which was located on the chromosome of ET02. Thistransposon carries genes encoding eight ORFs, an ATPase (IS481 family), a transposase(DDE catalytic type), a resolvase (Tn3 family), an S-type pyocin, an immunity protein,and three hypothetical proteins (Fig. 1).

S-Type pyocins carried by transposon elements have been previously described(19). Transposons are genetic elements able to move within and among genomes.These elements are important modulators of bacterial genomes, in many casesimproving the environmental adaptation (20). In recent years, WGS approacheshave allowed the in silico comparative analysis of bacterial genomes. In this context,novel transposable elements have been identified. So, although Tn6350 has notbeen previously described and characterized, it might be present in other P.aeruginosa strains.

Interestingly, pyocin S8 (harbored by Tn6350) exhibited a wide bactericidal activityagainst clinically significant carbapenemase-producing P. aeruginosa strains. For thehost strain, this bacteriocin production can confer a fitness advantage, whereas thepotency and targeted action of this pyocin could be developed into a clinically usefulantibiotic against MDR pathogens for which there are few therapeutic options (4).

In summary, we hereby describe a new transposon carrying S8 pyocin genesencoding a bacteriocin presenting activity against carbapenemase-producing P.aeruginosa strains. The clinical therapeutic potential of this new pyocin is worthy offurther investigation.

Accession number(s). This whole-genome shotgun project has been deposited atDDBJ/ENA/GenBank under the accession number LYLY00000000.

ACKNOWLEDGMENTSThis work was supported by research grants from Coordenação de Aperfeiçoa-

mento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa doEstado de São Paulo (FAPESP) (grant 2016/08593-9), and Conselho Nacional deDesenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (grant 462042/2014-6). N.L. is aresearch grant fellow of CNPq.

FIG 1 Genetic organization of Tn6350 (GenBank accession number KY347015), which harbors genes encoding pyocin S8. Predicted coding regions arerepresented by thick arrows indicating the direction of transcription. This element contains eight ORFs, including an ATPase (orf1), a transposase (int), a resolvase(tnpR), a cytotoxic subunit of pyocin S8 (pys8), an immunity subunit of pyocin S8 (imm), and three more hypothetical proteins (ofr4, orf7, and orf8). The invertedrepeat (IR) sequences flanking the element are marked by black triangles (IRL, inverted repeat left; IRR, inverted repeat right). They have 48 bp and 100%identity. The element is flanked by short direct repeats (DRs) rich in CG dinucleotide.

Tn6350 Carrying S8 Pyocin Genes in P. aeruginosa Antimicrobial Agents and Chemotherapy



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We thank A. L. Darini and M. C. Nogueira for kindly providing P. aeruginosa strainsBH6 and PHB64, respectively.

We have no conflicts of interest to declare.

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