caracterizaÇÃo fitoquÍmica de Óleos essenciais de

CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE EUCALIPTO E SEU

EFEITO SOBRE O PROTOZOÁRIO TRIPANOSOMATÍDEO

Herpetomonas samuelpessoai

NILMAR EDUARDO ARBEX DE CASTRO

2006


CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE EUCALIPTO E SEU EFEITO SOBRE O PROTOZOÁRIO

TRIPANOSOMATÍDEO Herpetomonas samuelpessoai

Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Agronomia, área de concentração Fitotecnia, para obtenção do título de “Doutor”.

Orientador Prof. Dr. Gabriel José de Carvalho

LAVRAS MINAS GERAIS – BRASIL

2006

Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da UFLA

Castro, Nilmar Eduardo Arbex de Caracterização fitoquímica de óleos essenciais de eucalipto e seu

efeito sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai / Nilmar Eduardo Arbex de Castro. -- Lavras: UFLA, 2006.

82 p. : il.

Orientador: Gabriel José de Carvalho. Tese (Doutorado) – UFLA. Bibliografia.

1. Eucalipto. 2. Cineol. 3. Citronelal. 4. Óleo essencial. 5. Tripanosoma. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.

CDD – 665.3




Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Agronomia, área de concentração Fitotecnia, para obtenção do título de “Doutor”.

APROVADA em 21 de março de 2006

Prof. Dr. Luiz Antônio Augusto Gomes - UFLA/DAG

Pesq. Drª Márcia Ortiz Mayo Marques - IAC

Profª Drª Maria das Graças Cardoso - UFLA/DQI

Prof. Dr. Renato Innecco - UFC

Prof. Dr. Gabriel José de Carvalho UFLA

(Orientador)

LAVRAS MINAS GERAIS – BRASIL

Aos meus pais,

Nilza e Nilson Aos meus irmãos,

Inês, Marilza, Cristina, Nilson e Marcos (in memorian) Às minhas filhas,

Ágata e Jade Aos meus amigos, Aos meus mestres, A Deus, por presentear-me com a vida e nela colocar essas pessoas.

Dedico e ofereço

AGRADECIMENTOS

Ao professor Gabriel José de Carvalho, pela confiança, apoio e

oportunidade de trabalhos nesta Universidade, desde a criação do Núcleo de

Estudos em Agricultura Orgânica (NEAGRO), até esta orientação.

À professora Drª Maria das Graças Cardoso, pela co-orientação desde o

mestrado, meus sinceros agradecimentos por todos os ensinamentos, e pelo

grande apoio.

Ao professor Luiz Antônio Augusto Gomes, pelas contribuições e

companheirismo durante esta jornada, além da bandeira da agricultura orgânica.

À Drª Márcia Ortiz Mayo Marques (IAC), pelas contribuições na banca

avaliadora e relevantes trabalhos prestados no setor de óleos essenciais no

Brasil, como o Simpósio Brasileiro de Óleos Essenciais e do apoio para a

criação da Associação Brasileira de Produtores de Óleos Essenciais

(ABRAPOE), da qual também participo como membro fundador.

Ao prof. Dr. Renato Innecco (UFC), amigo e companheiro de ESAL,

que honrou-me com sua presença e pelas valiosas contribuições na banca

avaliadora, além do relevante trabalho que vem realizando com as Farmácias

Vivas.

Aos professores Élberis Pereira Botrel, Nilton Nagib Chalfun, Carlos

Ramirez de Rezende e Silva e Pedro Milanez, pela amizade e apoio desde a

minha graduação na ESAL.

Aos professores Moacir Pasqual e Samuel Pereira, coordenadores da

pós-graduação DAG, meus sinceros agradecimentos.

À Nelzi e Marli, secretárias da pós-graduação DAG, e Hebe e Gisele,

secretárias da Pró-Reitoria de Graduação, por todo apoio e presteza.

Aos professores e funcionários do Setor de Sementes DAG.

À amiga, Regina Pinheiro, pela parceria no trabalho com as Plantas

Medicinais.

Ao amigo Eduardo Alves, companheiro de coletas e pela amizade.

À Gerdau Florestal, pela cessão das áreas para as colheitas dos materiais

utilizados para o estudo, na pessoa do engenheiro agrônomo e irmão Nilson E.

Arbex de Castro.

Ao Serviço Nacional de Aprendizagem Rural (SENAR–ARMG), pela

oportunidade que me é dada de transmitir meus aprendizados aos produtores

rurais.

Aos colegas de doutorado Flávio Pimentel (Embrapa) e Ricardo

Monteiro Correa, pelo companheirismo e apoio técnico nos trabalhos, e aos

colegas do Laboratório de Química Orgânica, em especial Fernando, Luiz

Gustavo, Lidiane, Milena.

À Universidade Federal de Lavras, por intermédio dos docentes e

funcionários, pela oportunidade e satisfação desta realização, o agradecimento

de um Esaliano.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –

CNPq, pela concessão da bolsa de estudo ao autor.

Ao Departamento de Química da Universidade Federal de Viçosa -UFV,

em especial ao prof. Dr. Luiz Cláudio de Almeida Barbosa, pela cessão do

Laboratório de Química Orgânica para realização de análises cromatográficas.

À Fundação do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, em especial ao

Dr. Maurílio José Soares, pelos trabalhos realizados sob sua orientação no

Laboratório de Biologia Celular de Microrganismos do Departamento de

Ultra-Estrutura e Biologia Celular, e também a toda a equipe, pelo prazeroso

convívio profissional.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS......................................................................................... i

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... iii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................... iv

RESUMO GERAL............................................................................................. v

GENERAL ABSTRACT .................................................................................. vi

CAPÍTULO I ...................................................................................................... 1

1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 2

2 REFERENCIAL TEÓRICO.......................................................................... 5

2.1 Breve histórico e mercado dos óleos essenciais de eucalipto no Brasil ......... 5 2.2 Óleos voláteis ou essenciais ........................................................................... 6 2.3 Óleos essenciais de eucalipto ....................................................................... 11 2.4 Usos e efeitos de óleos essenciais de eucalipto............................................ 14 2.5 Variações no rendimento de óleos essenciais de eucalipto e dos

constituintes químicos ................................................................................. 16 2.6 Protozoários tripanosomatídeos e uso de plantas para seu controle............. 16

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 19

CAPÍTULO II - AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO E DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE FOLHAS DE EUCALYPTUS CITRIODORA HOOK. COLHIDAS EM DIFERENTES ÉPOCAS DO ANO EM MUNICÍPIOS DE MINAS GERAIS ............................................................................................................ 22

RESUMO .......................................................................................................... 23

ABSTRACT...................................................................................................... 24

1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 25

2 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 27

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 30

4 CONCLUSÕES ............................................................................................. 39


CAPÍTULO III - AVALIAÇÕES DE RENDIMENTOS E DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE FOLHAS DE TRÊS ESPÉCIES DE EUCALYPTUS COLHIDAS EM DIFERENTES ÉPOCAS DO ANO EM MUNICÍPIOS DE MINAS GERAIS ............................................................................................................ 42

RESUMO .......................................................................................................... 43

ABSTRACT...................................................................................................... 44

1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 45



4 CONCLUSÕES ............................................................................................. 59


CAPÍTULO IV - IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES DO ÓLEO ESSENCIAL DE EUCALYPTUS CAMALDULENSIS DEHNH. E O EFEITO DESSE ÓLEO SOBRE O CRESCIMENTO DO PROTOZOÁRIO TRIPANOSOMATÍDEO HERPETOMONAS SAMUELPESSOAI........................................................................................... 62

RESUMO .......................................................................................................... 63

ABSTRACT...................................................................................................... 65

1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 66 1.1 Aspectos gerais sobre protozoários tripanosomatídeos................................ 66 1.2 Uso de espécies vegetais com propriedades tripanosomicidas .................... 67 1.3 Óleos essenciais de eucalipto ....................................................................... 69



4 CONCLUSÕES ............................................................................................. 78


ANEXO ............................................................................................................. 82

i

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1 Pag. TABELA 1.1. Espécies de eucalipto utilizadas para produção de óleo

essencial, finalidades, rendimentos, seus constituintes majoritários e teores .................................................................. 13

CAPÍTULO 2 TABELA 2.1. Teor de umidade (U%) obtido no Sistema Dean & Stark em

folhas jovens e frescas de Eucalyptus citriodora Hook. colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais. 30

TABELA 2.2. Análise de variância com teste F a 5% de probabilidade para

o rendimento de óleo essencial extraído de folhas jovens de E. citriodora Hook. colhidas em duas épocas e em três municípios de Minas Gerais ..................................................... 31

TABELA 2.3. Rendimento de óleo essencial em porcentagem de volume de

óleo por peso de folhas jovens e frescas, em Base livre de Umidade (% v/p BLU) de E. citriodora Hook. colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais .................... 32


óleo por peso de folhas jovens e frescas de (%v/p) de E. citriodora Hook. colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais ..................................................... 32

TABELA 2.5. Constituintes presentes (%) no óleo essencial extraído de

folhas jovens e frescas de E. citriodora Hook., colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais .................... 34

ii

CAPÍTULO 3 TABELA 3.1. Teor de umidade (U%) obtido em folhas jovens e frescas de

três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais ..................................................... 50

TABELA 3.2. Análise de variânica com teste F a 5% de probabilidade para

o rendimento de óleo essencial extraído de folhas jovens e frescas de três espécies de Eucalyptus em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais .............................................. 52


óleo por peso de folhas jovens e frescas, em Base livre de Umidade (% v/p BLU), de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais 52


óleo por peso de folhas jovens e frescas (%v/p) de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais ..................................................... 53

TABELA 3.5. Constituintes presentes (%) nos óleos essenciais extraídos de

folhas jovens e frescas de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais 56

CAPÍTULO 4 TABELA 4.1 Teores (%) dos constituintes químicos identificados no óleo

essencial extraído de folhas frescas de E. camaldulensis Dehnh colhidas em janeiro de 2005 em Bom Sucesso, MG .... 75

iii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 Pág.FIGURA 1.1. Representação do ciclo biossintético dos metabólitos

secundários .............................................................................. 9 FIGURA 1.2. Representação esquemática da biossíntese dos terpenos pelas

vias do mevalonato e 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXPS), com exemplos de monoterpenos presentes em alguns óleos essenciais de eucalipto ............................................................. 10

FIGURA 1.3. Representação da estrutura molecular do 1,8-cineol,

citronelal e felandreno ............................................................. 12 FIGURA 1.4. Esquema de corte transversal de folha de eucalipto ................ 14 CAPÍTULO 2 FIGURA 2.1. Representações das estruturas moleculares dos constituintes

químicos encontrados no óleo essencial de E. citriodora Hook. ........................................................................................ 35

FIGURA 2.2. Cromatogramas obtidos do óleo essencial de folhas jovens e

frescas de E. citriodora Hook., colhidas em duas épocas em três locais de Minas Gerais ...................................................... 36

CAPÍTULO 4 FIGURA 4.1. Resultado do efeito do óleo essencial de E. camaldulensis

Dehnh. sobre o crescimento do protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai .................................................. 76

iv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

alt. altitude

cm centímetro

Da Dalton

e.g. em geral

e.t. em tempo

FOB Free On Border

Kg quilograma

m metro

mg miligrama

mg mL-1 miligrama por mililitro

mL mililitro

mm milímetro

p.e. por exemplo

S Sul

W Oeste

µL microlitro

ºC grau Celsius

v

RESUMO GERAL

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Caracterização fitoquímica de óleos essenciais de eucalipto e seu efeito sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. 2006. 82 p., Tese (Doutorado em Agronomia Fitotecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG1.

Espécies do gênero Eucalyptus são utilizadas em reflorestamentos no Brasil, pela grande plasticidade e por desenvolverem-se com alto vigor em diferentes condições ambientais. Em torno de 20 espécies são citadas pela produção de óleos essenciais, com interesse pela diversidade de constituintes químicos presentes em cada um, sendo divididos em três grupos em função do seu uso final: 1) óleos medicinais, apresentam na sua composição química altos teores de 1,8-cineol; 2) óleos com finalidades industriais, que possuem o felandreno, mentol e piperitona entre outros, como constituintes majoritários; e 3) óleos para perfumaria, em que o citronelol e citronelal estão presentes como majoritários. Esses óleos podem sofrer variações no seu rendimento e na sua composição química pela influência de fatores genéticos e ambientais. Nos tratamentos de doenças humanas, várias espécies de plantas têm sido utilizadas, sendo os óleos essenciais de eucalipto também utilizados, inclusive contra alguns protozoários patogênicos. Objetivou-se neste trabalho buscar informações acerca das variações que ocorrem nos óleos essenciais de eucalipto e nos seus constituintes majoritários, em diferentes épocas do ano e locais de cultivo, assim como o efeito desse óleo essencial sobre um protozoário tripanosomatídeo. Observou-se que ocorrem variações nos óleos essenciais e constituintes majoritários, de acordo com a época de colheita e local de cultivo. O óleo essencial de uma espécie de eucalipto apresentou propriedade tripanosomicida.

1 Comitê orientador: Dr. Gabriel José de Carvalho – UFLA (Orientador), Drª Maria das

Graças Cardoso – UFLA.

vi

GENERAL ABSTRACT

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Phytochemical and biological evaluation of eucalyptus essential oil. 2006. 82 p. Thesis (Doctorate in Agronomy Crop Science) - Federal University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil.1

Eucalyptus species are often used for reforestation in Brazil for their phenotypic plasticity and ability to acclimate in response to several environmental conditions. About 20 species are cited due to their chemical diversity in essential oil production. Species are divided into three groups according to their final usage: 1) oils for medical purposes show high contents of 1,8-cineole in their chemical composition; 2) oils for industrial purposes show phellandrene, menthol and piperitone as major components; and 3) oils for perfumery purposes show citronellal as a major component. Genetic and environmental factors may cause variations in yielding and chemical composition. Several species of plants have been widely used as medicine, being eucalyptus essential oil also used as trypanocide. In the present study, variations in Eucalyptus essential oils and its mayor components in different seasons and locations and its effectiveness against a protozoan, were investigated. Eucalyptus essential oil and its mayor components were affected by harvest time and location. Furthermore, trypanocide properties in some eucalyptus essential oils were observed.

1 Guidance Committee: Dr Gabriel José de Carvalho - UFLA (Major Professor),

Drª Maria das Graças Cardoso – UFLA.

1

CAPÍTULO I



2

1 INTRODUÇÃO

Alternativas de produção associadas à preservação ambiental e ao

aumento do nível de emprego e renda têm sido geradas visando a melhoria da

qualidade de vida dos produtores e sociedade em geral. O plantio de florestas

tem sido utilizado, assim como a utilização de Sistemas Agroflorestais (SAF’s),

que consiste na combinação de cultivos simultâneos e/ou seqüenciais de espécies

arbóreas naturais e/ou introduzidas com culturas agrícolas anuais, frutíferas,

pastagens, etc, são exemplos destas alternativas (Rodigheri, 1998).

Segundo Pereira (1987), dentre as espécies utilizadas, as do gênero

Eucalyptus destacam-se pela grande plasticidade e por desenvolverem-se com

alto vigor em diferentes condições ecológicas. No Brasil são encontrados

plantios desde o Rio Grande do Sul até o Amazonas. São utilizadas pela

importância de sua madeira como combustível para siderurgia, indústria

moveleira, construção civil, postes, fabricação de papel e produção de folhas

para a extração do óleo essencial, atividade que vem se destacando no mercado

brasileiro.

De acordo com Doran (1991) entre as mais de 600 espécies de eucalipto

existentes, em torno de 20 são citadas pela produção de óleo essencial, com

interesse pela gama de constituintes químicos presentes em cada um desses

óleos. Esses encontram-se divididos em três grupos, em função do seu uso final:

óleos medicinais, óleos industriais e óleos para perfumaria.

É considerado óleo essencial para uso medicinal aqueles que

apresentam teores de 1,8-cineol acima de 70% e baixos teores de felandreno.

Esse tipo de óleo é encontrado nos Eucalyptus globulus Labill., E. tereticornis

Sm., E. smithii R.T. Baker, E. camaldulensis Denhn., entre outros (Lassak,

1988; Doran, 1991; Vitti, 1999). Segundo Matos et al. (2004), algumas espécies

de eucalipto demonstraram apresentar atividade contra bactérias, fungos,

3

protozoários etc. Várias doenças humanas são causadas por protozoários e

vitimam centenas de milhares de pessoas por ano nos países tropicais e

subtropicais, onde a população tem acesso restrito aos medicamentos

tradicionais. Além disso, existe um número limitado de medicamentos utilizados

nos tratamentos dessas doenças, sendo o tratamento bastante controverso pelo

custo do risco-benefício, devido aos efeitos colaterais das drogas disponíveis, e

também da resistência adquirida pelos protozoários patogênicos (Mello, 1997).

Os óleos essenciais de eucalipto utilizados em perfumaria possuem o

citronelal como constituinte majoritário, sendo o E. citriodora Hook. a fonte

mais rica e econômica conhecida desse composto. Esses óleos fazem parte da

composição de perfumes para diversos fins, sendo mais usado em produtos de

limpeza, como sabões e desinfetantes (Vitti & Brito, 2003).

Já nos óleos com finalidades industriais, os constituintes majoritários

são o felandreno, matéria-prima para desinfetantes e desodorantes, o mentol que

é um flavorizante de produtos medicinais, e a piperitona, que a partir dela é

fabricado o timol, utilizado como preservativo para colas, pastas e gomas

(Doran, 1991).

Xavier (1993) cita que os óleos essenciais de eucalipto podem sofrer

variações no rendimento e na sua composição química, pela influência de vários

fatores. Entre esses, pode-se citar como relevantes o genético, as condições

ambientais (luz, água, temperatura, solo, tipo de manejo florestal, etc), os

fisiológicos (parte utilizada da planta, a idade da planta e da folha, etc), além da

técnica de extração e análise de óleo, considerado como um quarto fator na

contribuição das variações qualitativa e quantitativa.

Assim, além dessa revisão bibliográfica sobre óleos essenciais de

eucalipto apresentada no Capítulo I, buscou-se nos Capítulos II e III avaliar o

rendimento de óleo essencial e dos seus constituintes químicos presentes em

folhas de Eucalyptus citriodora Hook., E. camaldulensis Denhn e E. urophylla

4

L.D. Pryor, colhidas em fevereiro (verão) e agosto (inverno) de 2005, em Bom

Sucesso, São Bento Abade e São João del Rei, municípios de Minas Gerais. Foi

avaliado também, o efeito do óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis

Denhn. sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai,

apresentado no Capítulo IV.

5

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Breve histórico e mercado dos óleos essenciais de eucalipto no Brasil

O Eucaliptus globulus Labill. foi a primeira espécie do gênero

introduzida no Brasil, em 1855, e a partir de 1903, deu-se o início do cultivo de

outras espécies para a Companhia Paulista de Estradas de Ferro (CPEF) em

Jundiaí, SP (Braga, 1971). Hoje, o Brasil possui a maior área do mundo plantada

com eucalipto, com mais de 3 milhões de hectares e aproximadamente 30

espécies diferentes, sendo que Minas Gerais tem a maior área do País.

(Sociedade Brasileira de Silvicultura, 2001).

A exploração das folhas de Eucalyptus para a produção de óleo essencial

é realizada no Brasil desde a II Guerra Mundial, quando do colapso na

importação do óleo de citronela de Java (Romani, 1972). Com a implantação da

lei dos incentivos fiscais houve uma ampliação da área plantada com eucalipto.

Isso propiciou também um aumento da produção de óleo essencial,

principalmente do E. citriodora Hook., espécie mais cultivada e considerada

uma das melhores fontes naturais de citronelol e citronelal, utilizados nas

indústrias de perfumaria. Das regiões produtoras no Brasil, o Estado de São

Paulo apresenta-se com destaque na produção de óleo essencial de E. citriodora

Hook., e representou, nos anos de 1970, 80% da produção mundial (Braga,

1971).

Por volta de 1990, a produção mundial de todos os tipos de óleo de

eucalipto foi de 5.000 toneladas. Desses, 63% foram destinados para fins

medicinais, 33% para perfumaria e 4% para indústria, sendo a China

considerado o maior produtor de óleo essencial de eucalipto, respondendo por

65% a 75% da produção global (Coppen, 1995). Nessa época, no Brasil, a

6

produção de óleo essencial de E. citriodora Hook. foi de aproximadamente 500

toneladas, totalizando US$646,117.00 (Vitti, 1999; Santos, 2002).

Ainda segundo Santos (2002), em 1995, a produção brasileira de óleo

essencial de E. citriodora Hook. foi estimada em 1.000 toneladas, sendo 90%

destinados à exportação, com produção concentrada nos estados de São Paulo e

Minas Gerais.

Em 2000, as exportações brasileiras desse tipo de óleo totalizaram

US$ 1,190,794.00 com um volume de 275 t e, em 2005, houve um crescimento

de 10% no volume exportado, totalizando 303 t e crescimento de 63% no valor

comercializado, ou seja US$1,941,467.00, com uma recuperação de preços de

US$ 4.32 L-1 em 2000 para US$6.41 L-1 em 2005, já que em 1996 o litro de óleo

foi comercializado a US$6.86. Em 2006, nos dois primeiros meses, o preço FOB

de óleo exportado foi de US$6.74 L-1, com um volume de 22 t (Brasil, 2006).

Quanto às importações de óleos essenciais de eucalipto, em 2000 e 2005,

os volumes foram de 540 t e 1.060 t e os preços de US$4.36 L-1 e US$6.31 L-1,

respectivamente. Em janeiro e fevereiro de 2006, foram importados, 25 t desse

óleo, no valor de US$6.64 L-1 (Brasil, 2006).

2.2 Óleos voláteis ou essenciais

Os óleos voláteis são produtos obtidos de partes de plantas por meio de

destilação por arraste com vapor d’água, ou obtidos por espressão de pericarpos

de frutos cítricos. São substâncias constituídas de numerosos compostos

voláteis, lipofílicas, sendo geralmente odoríferas e líquidas. São denominados de

óleos essenciais, óleos etéreos ou essências, em razão de algumas de suas

características físico-químicas, sendo a principal delas a volatilidade (Simões et

al., 2004).

7

São formados por misturas que envolvem de 50 a mais de 100

compostos orgânicos voláteis e são classificados como terpenos. Esses

compostos podem ser desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e

terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos

orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre (Simões et al.,

2004).

Na mistura, os compostos presentes apresentam-se em diferentes

concentrações, sendo um deles o composto majoritário, outros em menores

teores e alguns em baixíssimas concentrações (traços). Como exemplo, cita-se o

1,8-cineol como o principal composto de óleo de algumas espécies de eucalipto,

com teores acima de 80%, e no óleo essencial de bergamota (Citrus aurantium

subsp bergamia (Risso) Wight & Arn), esse composto apresenta-se com um teor

em torno de 0,002% (Simões et al., 2004).

A maioria dos óleos essenciais é constituída de derivados

fenilpropanóides ou de terpenóides, havendo predominância destes últimos.

Os fenilpropanóides são formados com base no ácido chiquímico, que

forma as unidades básicas dos ácidos cinâmico e ρ-cumárico. Em seguida, por

meio de reduções enzimáticas, produzem propenilbenzenos e/ou alilbenzenos;

por oxidações com degradação das cadeias laterais, formam aldeídos aromáticos,

e por ciclizações enzimáticas intramoleculares, produzem cumarinas (Simões et

al., 2004). Compostos, como, por exemplo, o metil chavicol encontrado em

folhas de Ocimum basilicum L. tem a sua biosíntese por essa rota (Deschamps,

2005).

A via do mevalonato (MVA) é a mais discutida. Por meio dela, são

formados os sesquiterpenos e triterpenos, derivados do isopreno. Sua ocorrência

se dá no citoplasma da célula e a sua origem biossintética pode ser resumida

pelo metabolismo da glicose pela via do acetato e reduzido a mevalonato, numa

reação irreversível, em que o mevalonato é convertido em

8

isopentenil-pirofosfato (IPP) ou isopreno ativo (unidade básica na formação dos

terpenos e esteróides, com 5 carbonos – C5) e o seu isômero

dimetilalil-pirofosfato (DMAPP) (Deschamps, 2005).

Mais recentemente, outra rota, a via 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (Via

DOXP, DXPS ou MEP) de ocorrência nos cloroplastos das células, tem sido

discutida. Nela, o piruvato e o gliceraldeído 3-fosfato, formados durante o

metabolismo primário, formam o 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DOXP) e, em

seguida, o 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP). Após sucessivas reações, são

formados tanto o isopentenil-pirofosfato (IPP) quanto o seu isômero, o

dimetilalil-pirofosfato (DMAPP). Essa rota parece estar envolvida na biossíntese

de carotenóides, fitóis, monoterpenos, diterpenos, tetraterpenos e plastoquinonas

(Wanke et al., 2001; Deschamps, 2005).

Após a formação do IPP e DMAPP, tanto pela via do mevalonato quanto

pela via DXPS, os esqueletos carbonados dos terpenóides são formados pela

condensação de um número variável de unidades pentacarbonadas (isopreno).

De acordo com a regra do isopreno, predomina a condensação cabeça-cauda,

para formar o geranil-pirofosfato (GPP), farnesil-pirofosfato (FPP) e

geranilgeranil-pirofosfato (GGPP). Com base nesses compostos, são formados

os terpenóides de acordo com a classe de cada um, ou seja, o GPP dará origem

aos monoterpenos (C10), que podem ser cíclicos e acíclicos; o FPP originará os

sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpenos (C30); e o GPP os diterpenos

(C20) e tetraterpenos (C40) (Rohdich et al., 2003; Deschamps, 2005).

Na Figura 1.1 é apresentado o esquema do ciclo biossintético dos

metabólitos secundários, com destaque para as vias do chiquimato, do

mevalonato e DXPS.

9

PEP

3-Fosfoglicerato (3 PGA)

Acetil CoA

Piruvato

Eritrose- 4-Fosfato

Metabolismo Primário

CO2

FS

Aminoácidos Alifáticos

Ciclo Ácido Tricarboxílico

Metabolismo Secundário

Fenilpropanóides

Via Ácido Mevalônico

Isoprenóides IPP / DMAPP

Terpenóides e Esteróides

Via Ácido Malônico

Ácido Chiquímico

Alcalóides

Fenóis

Via DXPS

Lignanas Ligninas

Cumarinas

Aminoácidos aromáticos

FIGURA 1.1. Representação do ciclo biossintético dos metabólitos secundários (Adaptado de Simões et al., 2004; Deschamps, 2005)

Na Figura 1.2 é apresentado um esquema ilustrativo das rotas de

biossíntese dos terpenos pelas vias do mevalonato e

1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXPS), com exemplos de monoterpenos

formados e presentes nos óleos essenciais de algumas espécies de eucalipto.

10

? Via Mevalonato

HMG CoA

Mevalonato

Mevalonato 5-Fosfato

Mevalonato 5 DiFosfato

Acetil CoA AA

HMGS

HMGR

PMK

MDC

2-Fosfo-4-(Citidina-5’-Di-fosfo)- 2-C-Metil-D-Eritritol

? Via DXPS

1-Deoxi-D-Xilulose 5 Fosfato

2-C-Metil-D-Eritritol 4-Fosfato

4-(Citidina-5’-DiFosfo)-2-C-Metil-D-Eritritol

2-C-Metil-D-Eritritol-2,4--Ciclodifosfato

DXR

MCT

CMK

MECPS

?

x 1

Monoterpenos C10 GPP OP P

Acíclicos Citronelal

CHO

Citral

C H O

Citronelol

CH2OH

α-Pineno

β-Pineno

1,8-Cineol O

Bicíclicos

Piperitona O

MentolO H

Limoneno

Monocíclicos

Cíclicos

x 3

OPP

Tetraterpenos C40

Diterpenos C20 GGPP

Sesquiterpenos C15Triterpenos C30

FPP

OPP

x 2

IPPIDMAPIPP OPP

OPP

Isopreno Ativo

FIGURA 1.2. Representação esquemática da biossíntese dos terpenos pelas vias do mevalonato e 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXPS), com exemplos de monoterpenos presentes em alguns óleos essenciais de eucalipto (Adaptado de Deschamps, 2005).

11

2.3 Óleos essenciais de eucalipto

Pesquisas de Doran (1991) mostraram que os óleos essenciais de

eucalipto, assim como outros óleos, são sintetizados com a finalidade de

sobrevivência e/ou manutenção da planta, conferindo à ela capacidade de

adaptação às condições do meio em que vive, p.e. contra o frio no estádio de

plântula, maior proteção contra predadores, funções ecológicas e efeitos

alelopáticos com outras plantas (como inibidores da germinação) e redução da

perda de água. Nesses óleos, monoterpenos e sesquiterpenos representam os

principais compostos e os diterpenos representam constituintes minoritários,

além de hidrocarbonetos, ácidos, álcoois, cetonas, aldeídos e ésteres.

De acordo com esse mesmo autor, das próximas de 20 espécies citadas

para produção de óleo essencial, o interesse se deve a presença do constituinte

majoritário em cada um deles, os quais se encontram divididos em três grupos,

em função do seu uso final: óleos medicinais, óleos industriais e óleos para

perfumaria.

Os óleos essenciais de eucalipto para uso medicinal são aqueles que

apresentam teores de 1,8-cineol (Figura 1.2.a) acima de 70% e baixos teores de

felandreno, constituinte considerado indesejável pela ação cardíaca, com um teor

máximo de 5% estabelecido pelas farmacopéias (Simões et al., 2004). Esse tipo

de óleo é encontrado nas espécies Eucalyptus globulus Labill., E. tereticornis

Sm., E. smithii R.T. Baker., E. camaldulensis Denhn., entre outros (Matos,

2002).

Os óleos para perfumaria possuem o citronelal (Figura 1.2.b) como

constituinte majoritário, sendo o E. citriodora a fonte mais rica e econômica

conhecida desse composto.

Os óleos com finalidades industriais apresentam altos teores de

felandreno (Figura 1.2.c), utilizado como matéria-prima para desinfetantes e

12

desodorizantes; a piperitona e alfa-pineno, usados como intermediários para

síntese do timol (utilizado em preservativos para gomas, pastas, colas etc); e o

mentol (flavorizante de produtos medicinais e alimentícios). Espécies utilizadas

para essa finalidade não são cultivadas no Brasil (Vitti & Brito, 2003; Simões et

al., 2004).

O

H O

a b c

FIGURA 1.3. Representação da estrutura molecular do: a – 1,8-cineol (C10H18O); b - citronelal (C10H18O); c – felandreno (C10H17). UFLA, Lavras – MG, 2006.

Algumas espécies utilizadas para extração de óleo essencial, conforme a

finalidade, estão relacionadas na Tabela 1.1 apresentando também o rendimento

e o teor do componente majoritário do óleo.

13

TABELA 1.1. Espécies de eucalipto utilizadas para produção de óleo essencial, finalidades, rendimentos, seus constituintes majoritários e teores.

Componente majoritário Espécies

Rendimento Óleo (% p/p Folhas

Frescas) Nome Teor %

Óleos medicinais

E. camaldulensis 0,3 – 2,8 Cineol 80 - 90 E. cneorifolia 2,0 Cineol 40 - 90 E. dives (var. cineol) 3,0 - 6,0 Cineol 60 - 75 E. dumosa 1,0 – 2,0 Cineol 33 - 70 E. eaeophara 1,5 – 2,5 Cineol 60 - 80 E. globulus 0,7 - 2,4 Cineol 60-85 E. leucoxylon 0,8 – 2,5 Cineol 65 – 75 E. oleosa 1,0 – 2,1 Cineol 45 – 52 E. polybractea 0,7 – 5,0 Cineol 60 – 93 E. radiata subesp. radiata (var. cineol) 2,5 – 3,5 Cineol 65 - 75 E. sideroxylon 0,5 – 2,5 Cineol 60 – 75 E. smithii 1,0 – 2,2 Cineol 70 – 80 E. tereticornis 0,9 - 1,0 Cineol 45 E. viridis 1,0 – 1,5 Cineol 70 – 80

Óleos Industriais

E. dives (var. felandreno) 1,5-5,0 Felandreno 60-80 E. dives (var. piperitona) 3,0-6,5 Piperitona 40-56 E. elata (var piperitona) 2,5-5,0 Piperitona 40-55 E. radiata subesp. radiata (var. felandreno) 3,0 – 4,5 Felandreno 35 - 40

Óleos para Perfumaria

E. ctriodora (var citronelal) 0,5-2,0 Citronelal 65-80 E. macarthurii 0,2-1,0 Acetato de geranila 60-70 E. staigeriana 1,2-1,5 Citral (a + b) 16-40

Fonte: Lassak (1988) e Doran (1991).

14

Nas plantas do gênero Eucalyptus (Myrtaceae), os óleos essenciais são

produzidos em estruturas secretoras, em que a secreção é formada em células

(glândulas endógenas) (Figura 1.3) que eventualmente se rompem e liberam

estas substâncias na cavidade resultante do rompimento das glândulas. Essas

glândulas encontram-se distribuídas em todo o parênquima foliar da maioria das

espécies, as quais, em algumas delas, podem ser visualizadas como pontos

translúcidos quando a folha é observada contra a luz (Doran, 1991).

Parênquima paliçádico

Parênquima lacunoso

Epiderme inferior

Epiderme superior

Glândula endógena

FIGURA 1.4. Esquema de corte transversal de folha de eucalipto (adaptado de Oliveira et al., 1998). UFLA, Lavras – MG, 2006.

2.4 Usos e efeitos de óleos essenciais de eucalipto

A extração do óleo essencial de eucalipto apresenta uma relativa

simplicidade, quando utilizado o processo de destilação por arraste com vapor

d’água, sendo em muitos países a exploração desse óleo transformada em nível

de indústria semi-artesanal.

Óleos essenciais contendo 1,8-cineol ou eucaliptol são utilizados em

preparações e produtos farmacêuticos, em loções para uso local como anestésico

suave e anti-séptico e é recomendado em cosméticos para remover manchas da

pele. Em uso interno, o cineol apresenta ação secreolítica, ou seja, provoca a

15

atividade secretora do epitélio respiratório e facilita a fluidificação e expulsão do

muco em problemas respiratórios. É usado também para aromatizar ambientes

(Matos et al., 2004). O E. tereticornis, que produz o cineol e terpineol, também é

utilizado no tratamento das vias respiratórias (Matos, 2002).

O “macrocarpal A”, isolado dos E. macrocarpa e E. globulus, é

considerado o princípio antibacteriano dessas espécies, e outros “macrocarpals”

mostraram-se eficazes no tratamento da laringite e foram considerados muito

ativos contra bactérias orais. Os “euglobals” também apresentaram atividade

antiinflamatória sendo considerado um forte inibidor da granulação tóxica,

promotores de tumores (Matos et al., 2004).

A eucaliptona, outro constituinte extraído das folhas de eucalipto,

apresentam ação contra Streptococcus mutans e S. sobrinus e outras bactérias

cariogênicas. Extrato aquoso das folhas e o óleo essencial de E. globulus são

ativos contra Staphylococcus aureus, e as sementes dessa mesma espécie

apresentam efeito antiinflamatório e redução nas inflamações de ouvido (Matos

et al., 2004).

Schnitzler et al. (2001), pesquisando os óleos essenciais de melaleuca e

eucalipto contra o Vírus Simples da Herpes (HSV), constataram o efeito

antiviral e indicaram essas espécies como promissoras nos tratamentos de

infecções recorrentes de herpes.

Franceschini Filho (2004) relata que o óleo essencial de E. citriodora,

E. maculata e E. tereticornis mostraram-se capazes de impedir a reprodução da

bactéria Mycobacterium tuberculosis, causadora da tuberculose. Devido à sua

capacidade de ser solúvel em gordura, o óleo atravessa a membrana, fazendo

com que suas substâncias bactericidas atuem diretamente dentro do bacilo,

impedindo sua reprodução, em detrimento dos remédios tradicionais, que, por

não se dissolverem em gordura, não ultrapassam a membrana do bacilo.

16

Dos óleos para perfumaria, o E. citriodora é a fonte mais rica e

econômica conhecida de citronelal, substância irritante para mucosa do trato

respiratório, mas que apresenta um poder anti-séptico, que justifica seu uso

como agente de limpeza, como aromatizante e desinfetante de pisos e sanitários,

(Matos, 2002).

2.5 Variações no rendimento de óleos essenciais de eucalipto e dos

constituintes químicos

Segundo Vitti & Brito (2003), os óleos essenciais de eucaliptos podem

sofrer variações na sua composição química e no rendimento, de acordo com a

parte utilizada da planta, a idade da planta e da folha, as condições ambientais, o

tipo de manejo florestal, os métodos para amostragem das folhas, os processos

para extração e de análise de óleo, além da variabilidade genética. Desses, o

genético tem sido um dos mais estudados, pois é o instrumento utilizado para o

melhoramento de espécies, visando ao incremento na produção e componente

químico desejável.

O ambiente no qual a planta se desenvolve exerce grande influência

sobre a produção e a composição dos óleos. Temperatura, umidade relativa,

insolação, ventos etc são relatados como fatores de influência. Estudos

realizados em outros países apresentaram resultados de maiores produções de

óleo essencial de eucaliptos em determinadas épocas do ano, como no inverno e

primavera (Wang et al., 1997; Vitti & Brito, 2003).

2.6 Protozoários tripanosomatídeos e uso de plantas para seu controle

Em vários estudos com tripanosomas, tem sido demonstrado a

viabilidade do uso de plantas com possíveis propriedades tripanosomicidas.

17

Mikus et al. (2000) relataram o efeito tóxico dos óleos essenciais de Thymus

vulgaris e Melaleuca alternifolia sobre o Trypanosoma brucei, a tripanosomíase

africana transmitida pela mosca “tse-tsé”. Essa doença causa mais de 350 mil

vítimas anuais, principalmente no continente africano, tendo merecido ao longo

dos tempos o empenho dos cientistas, que tentam a todo custo minorar o

sofrimento causado pela picada da mosca.

Plantas de uso popular têm sido utilizadas nos tratamentos de doenças

causadas por protozoários, como no caso da malária, em que mais de 30 espécies

de vegetais são utilizadas, sendo algumas com validação médica (Hidalgo,

2003).

Holetz et al. (2002) verificaram o efeito no crescimento e diferenciação

celular de H. samuelpessoai sob o efeito de extratos brutos ou óleos essenciais

de 15 plantas medicinais adicionados ao meio definido. Concluíram que a Lippia

alba, Piper regnellii, Stryphnodendron adstrigens e Tanacetum vulgare

apresentaram atividade antiprotozoário. Esses mesmos autores sugeriram que

esses vegetais podem ser utilizados como modelos para seleção de plantas que

contêm drogas tripanosomicidas.

Holetz et al. (2003), em trabalho semelhante, verificaram que o óleo

essencial de Ocimum gratissimum também abre perspectivas promissoras para o

uso de mais drogas de origem vegetal com propriedade tripanomicida.

Sarquis (2003), em estudos de aspectos epidemiológicos da doença de

Chagas na zona rural de Juguaruana, Ceará, observou 1.773 exemplares de

espécies de triatomídeos (barbeiros) capturados e identificou 302 deles

infectados pelo T. cruzi. Constatou também que das 631 pessoas residentes na

comunidade, 23 indivíduos apresentaram soropositividade, sendo confirmada em

17 desses casos.

Na bibliografia acerca dessas doenças tropicais, demonstra-se a

importância que essas doenças representam, principalmente aos moradores da

18

zona rural das mais diversas regiões do Brasil e outros países tropicais. Dessa

maneira, há um consenso de que compostos que apresentam atividade

tripanosomicida, principalmente os obtidos de extratos de plantas de uso

popular, precisam ser mais investigados.

19

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22

CAPÍTULO II

AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO E DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS

DO ÓLEO ESSENCIAL DE FOLHAS DE Eucalyptus citriodora Hook.

COLHIDAS EM DIFERENTES ÉPOCAS DO ANO EM MUNICÍPIOS DE

MINAS GERAIS

23

RESUMO

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Avaliação do rendimento e dos constituintes químicos do óleo essencial de folhas de Eucalyptus citriodora Hook. colhidas em diferentes épocas do ano em municípios de Minas Gerais. In: ______. Caracterização fitoquímica de óleos essenciais de eucalipto e seu efeito sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. 2006. Cap. 2, p.22-41. Tese (Doutorado em Agronomia. Fitotecnia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.1 O óleo essencial de Eucalyptus citriodora Hook.é a fonte mais rica e econômica de citronelal, substância bastante utilizada nas indústrias de perfumaria, terapêutica, etc. A exploração dessa substância pode apresentar excelentes perspectivas comerciais. Fatores ambientais são capazes de afetar o rendimento, a composição e a quantidade dos constituintes dos óleos essenciais. Assim, objetivou-se neste trabalho avaliar o rendimento do óleo essencial e dos constituintes químicos extraídos de folhas frescas de E. citriodora em fevereiro e agosto de 2005, nos municípios de Bom Sucesso, São Bento Abade e São João del Rei. O óleo essencial foi obtido por meio de hidrodestilação, com posterior centrifugação do hidrolato. Determinou-se a umidade da matéria-prima, sendo o rendimento de óleo essencial expresso em volume por peso com Base Livre de Umidade (%v/p BLU). Os constituintes do óleo essencial foram identificados e quantificados, utilizando-se a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Pelos resultados obtidos, verificou-se que o teor de óleo essencial foi influenciado pela época e local de cultivo. A colheita realizada no município de São João del Rei no mês de fevereiro foi a que propiciou os maiores rendimentos. Os dados cromatográficos indicaram haver alterações na composição química, sendo o citronelal o constituinte majoritário, apresentando teores entre 67% a 87%, seguido do citronelol, com teores entre 8% a 20%, atendendo, portanto as exigências das indústrias de perfumaria.

1 Comitê orientador: Dr Gabriel José de Carvalho – UFLA (Orientador), Drª Maria das


24

ABSTRACT

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Yield and main chemical components evaluation of essential oil from Eucalyptus citriodora Hook. leaves harvested in different seasons in several locations of the Commonwealth of Minas Gerais. In: ______. Phytochemical and biological evaluation of eucalyptus essential oil. 2006. Chapter 2, p.22-41. Thesis (Doctorate in Agronomy Crop Science) - Federal University of Lavras, Lavras, MG1

The essential oil from Eucalyptus citriodora Hook. is the richest and the most economical source of citronellal, a substance used in perfumery and therapeutic industries, etc. The growing market provides an excellent opportunity of exploration. Oil composition, components and yield can be affected by environmental factors, therefore, this work aimed to evaluate both essential oil of fresh leaves of E. citriodora main components and yield in different seasons. The harvest took place in February and August of 2005 in three different municipalities. Hydrodistillation followed by hydrosol centrifugation were used to extract essential oil. Raw material content and yield (volume/weight) on a Moisture Free Basis (BLU) were determined. Essential oil components were identified by gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-EM). Results showed that essential oil content were influenced by both timing and location of the harvest. February harvest in the City of São João del Rei, MG showed the highest yield. Chromatographic data showed changes in chemical composition being citronellal the major component (67-87%) followed by citronellol (8- 20%) meeting perfumery industries requirements.

1 Guidance Committee: Dr Gabriel José de Carvalho - UFLA (Major Professor), Drª

Maria das Graças Cardoso – UFLA.

25

1 INTRODUÇÃO

A denominação de óleo essencial refere-se a um grupo de substâncias

naturais aromatizantes, que são extraídas de diversas partes de plantas, por meio

de destilação por arraste com vapor d’água, e os obtidos por espressão de

pericarpos cítricos. São constituídos de numerosos compostos voláteis, com

tensões de vapor elevadas, odoríferos, insolúveis em água, porém, solúveis em

álcool e em vários solventes imiscíveis na água (Simões et al., 2004).

Os óleos essenciais presentes em algumas espécies de Eucalyptus

(Myrtaceae) são sintetizados em estruturas secretoras, em que a secreção é

formada em glândulas endógenas que eventualmente se rompem e liberam

substâncias na cavidade resultante do rompimento das glândulas. Esses óleos

podem estar envolvidos nas interações animal-planta, planta-microrganismos e

planta-planta, com a finalidade de sobrevivência e/ou manutenção da planta,

conferindo a ela capacidade de adaptação às condições do meio em que vive,

p.e., contra o frio no estádio de plântula, maior proteção contra predadores,

apresentar funções ecológicas e efeitos alelopáticos com outras plantas

(inibidoras de germinação) e redução da perda de água (Doran, 1991).

Nolasco (1996) considerou que as perspectivas comerciais de utilização

dos óleos essenciais são excelentes, diante das restrições ao uso de aromatizantes

artificiais. Das espécies do gênero Eucalyptus, em torno de 20 produzem óleos

essenciais e são citadas comercialmente pela gama de constituintes químicos

identificados em cada óleo e encontram-se divididos em três grupos em função

do seu uso final: óleos medicinais, óleos industriais e óleos para perfumaria.

Dos óleos para perfumaria, o E. citriodora Hook. é a fonte mais rica e

econômica conhecida de citronelal, substância irritante para a mucosa do trato

respiratório, porém utilizada desde a fabricação de cosméticos até a

aromatização de produtos de limpeza, como sabões e detergentes, além de

26

possuir propriedade anti-séptica, justificando seu uso como agente de limpeza,

aromatizantes e desinfetantes de pisos e sanitários (Vitti, 1999; Matos, 2002).

Vitti (1999) ressalta que fatores ambientais são capazes de afetar a

produtividade, a composição e a quantidade dos constituintes dos óleos

essenciais. Dentre esses, a umidade relativa, a radiação solar, a temperatura e o

estresse hídrico são relevantes Esse pesquisador cita que os óleos essenciais de

eucalipto podem sofrer variações na sua composição química e no rendimento,

de acordo com a parte utilizada, a idade, as condições ambientais, o tipo de

manejo florestal, os métodos para amostragem das folhas, os processos para

extração e de análise de óleo, além da variabilidade genética.

Wang et al. (1997) apresentaram resultados de maiores produções de

óleo essencial de eucaliptos em determinadas épocas do ano (inverno e

primavera). Vitti & Brito (2003) corroboram com essas informações e relatam

maior rendimento de óleo essencial e de citronelal em E. citriodora quando a

colheita foi realizada no inverno e primavera.

O monitoramento dos princípios ativos e o estudo dos fatores envolvidos

na variação dos teores desses constituintes são fundamentais nas recomendações

de manejo do ambiente, otimizando a produção e a conservação desses

compostos químicos, conforme Castellani (1997).

Nesse contexto, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de

verificar a ocorrência de variações nos rendimentos do óleo essencial e dos

constituintes químicos presentes em folhas de Eucalyptus citriodora Hook.

colhidas nos meses de fevereiro e agosto de 2005, em Bom Despacho, São

Bento do Abade e São João del Rei, municípios de Minas Gerais.

27

2 MATERIAL E MÉTODOS

O material utilizado, folhas jovens e frescas de Eucalyptus citriodora

Hook., foram colhidas em reflorestamentos da Gerdau Florestal, em Bom

Sucesso (20º58’S, 44º48’W e 950 m alt.), São Bento Abade (21º36’S, 44º59’W

e 970 m alt.) e São João del Rei (21º16’S, 44º54’W e 910 m alt.), municípios de

Minas Gerais. Esses locais estão distantes entre si de aproximados 100 Km, e

apresentam clima do tipo Cwb pela classificação climática de Köeppen,

caracterizado por verão chuvoso e inverno seco e precipitação média anual de

1.411 mm, sendo a temperatura média anual de 19,3 ºC.

As colheitas foram realizadas entre os dias 25 - 28 de fevereiro e 25 - 30

de agosto de 2005, sempre até as 10 horas, em dias sem precipitação

pluviométrica, com umidade relativa máxima de 60%.

As análises de solo utilizadas foram realizadas pela empresa para fins de

adubação de manutenção da fertilidade da área do reflorestamento. O

espaçamento utilizado foi de 2,0 x 3,0 m, com a finalidade para produção de

madeira e carvão utilizado em siderurgia.

As parcelas utilizadas para o experimento foram constituídas de

67 plantas em 400 m2 (20 x 20 m) nos três locais, localizadas no interior de

talhões com a referida espécie. Dessas 67, foram sorteadas e identificadas

20 plantas para posterior colheita de folhas, e constituíram um tratamento. Cada

tratamento foi estabelecido como folhas de E. citriodora colhidas em cada época

e local, totalizando seis tratamentos.

As plantas utilizadas eram rebrotas com três anos de idade (com 5,0 a

7,0 metros de altura), de árvores com um corte realizado aos sete anos. As folhas

colhidas situavam-se no terço inferior da planta, de ramos com diâmetro inferior

a 1,5 cm.

28

Foram colhidas para fins de análise, em torno de 200 g de folhas jovens

por planta, totalizando quatro quilogramas de folhas das 20 plantas de cada

talhão em cada época e local, e constituiu uma amostra composta. Em seguida,

estas foram homogeneizadas e retiradas amostras de 50 gramas cada, que

constituiu uma amostra. Foram utilizadas três amostras de cada tratamento para

as extrações de óleo essencial e avaliação de umidade das folhas.

Para determinação do teor de umidade das folhas, utilizou-se o Sistema

de Dean & Stark, cujo funcionamento baseia-se no princípio da imiscibilidade

de solventes; nesse caso, o ciclohexano e a água, de acordo com Pimentel et al.,

(2006).

Para obtenção do óleo essencial das folhas frescas, empregou-se a

técnica por hidrodestilação, utilizando o aparelho Clevenger modificado. As

amostras (50 g) foram acondicionadas em balões com 500 mL de água destilada.

A extração foi realizada no período de duas horas, conforme Matos (1988).

Centrifugou-se o hidrolato, em uma centrífuga de cruzeta horizontal

(raio = 5 cm) a 4.500 rpm (aproximados 1.130 forças g) por 60 segundos,

conforme estudos preliminares (Castro et al., 2005). O rendimento do óleo

essencial foi calculado e expresso em volume de óleo por peso de folhas frescas

(%v/p) e com base na matéria seca ou Base Livre de Umidade

(%v/p BLU) (Pimentel et al., 2006).

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, sendo os

efeitos das épocas de colheita e dos locais de cultivo comparados pelo teste de

Tukey quando significativos (Ferreira, P, 2000). As análises estatísticas foram

realizadas utilizando-se o Sistema de Análise de Variância – SISVAR, segundo

Ferreira, D. (2000).

As análises qualitativas dos óleos foram realizadas por cromatografia

gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/EM), utilizando-se um aparelho

Shimadzu CG–17A com detector seletivo de massa modelo QP 5000 sob as

29

seguintes condições experimentais: coluna capilar de sílica fundida

(30 m x 0,25 mm) com fase ligada DB5 (0,25 µm de espessura de filme);

temperatura do injetor de 220 ºC; programação da coluna com temperatura

inicial de 40 ºC, sendo acrescidos 3 ºC a cada minuto até atingir 240 ºC; gás

carreador hélio (1 mL min-1); taxa de split 1:10; volume injetado de 1 µL

(1% de solução em diclorometano) e pressão inicial na coluna de 100,2 KPa. As

condições de EM foram: energia de impacto de 70 eV; velocidade de

decomposição 1.000; intervalo de decomposição de 0,50; e fragmentos de 45 Da

a 450 Da decompostos. Injetou-se, nas mesmas condições das amostras, uma

mistura de hidrocarbonetos (C9H20; C10H22: C11H24; ... C24H50; C25H52 e C26H54).

A identificação dos constituintes foi realizada comparando-se os espectros

obtidos com os do banco de dados do aparelho e pelo índice de Kovats calculado

para cada constituinte, conforme Adams (1995).

A determinação dos teores dos constituintes químicos do óleo essencial

foi efetuada por meio de cromatografia gasosa por ionização de chamas (FID),

utilizando-se um aparelho Shimadzu GC–17A, nas seguintes condições

experimentais: coluna capilar DB5; temperatura do injetor de 220 ºC;

temperatura de detector FID de 240 ºC; programação da coluna com temperatura

inicial de 40 ºC até 240 ºC; gás carreador nitrogênio (2,2 mL min-1); taxa de

split 1:10; e volume injetado de 1 µL (1% de solução em diclorometano) e

pressão na coluna de 115 KPa. A quantificação de cada constituinte foi realizada

por meio de normalização de áreas (%). Para as análises qualitativas e

quantitativas utilizou-se apenas uma amostra de óleo essencial de eucalipto

obtido em cada tratamento.

30

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nas três áreas onde foram realizadas as colheitas de folhas frescas, o

plantio de eucalipto tem sido utilizado, pelas características favoráveis de

topografia, tipo de solo, clima etc, além da proximidade das unidades

consumidoras – siderúrgicas.

Os resultados das análises de solo das três áreas onde foram realizadas as

colheitas estão apresentados no Anexo 1.

Pelos resultados dos valores de umidade (U%) obtidos e apresentados na

Tabela 2.1, pode-se observar que folhas colhidas no mês de fevereiro

apresentaram maiores teores de umidade em relação às folhas colhidas no mês

de agosto, para as três localidades. Provavelmente, esses maiores valores de

umidade ocorreram devido à maior precipitação pluviométrica em fevereiro

(207 mm), em relação ao mês de agosto (33 mm).

TABELA 2.1. Teor de umidade (U%) obtido no Sistema Dean & Stark de folhas jovens e frescas de Eucalyptus citriodora Hook. colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Épocas de colheita Local

Fevereiro Agosto Bom Sucesso 52,0 44,0 São Bento Abade 54,0 50,0 São João del Rei 60,0 48,0

A importância de se determinar a umidade das amostras frescas

utilizadas em extrações de óleos essenciais é que essa, em termos de massa

31

absoluta de material úmido, pode conduzir a rendimentos expressivamente

diferentes e levar a interpretações distintas do rendimento de óleo essencial de

E. smithii R.T.Baker, conforme pesquisou Fabrowski (2002).

Dessa maneira, o rendimento de óleo essencial extraído de folhas jovens

de E. citriodora Hook. foi avaliado em Base Livre de Umidade (BLU) e pelos

resultados obtidos, verificou-se que houve efeito significativo a 5% de

probabilidade pela análise de variância para as variáveis: época de colheita e

local de cultivo e também para a interação desses. Por meio dessa interação,

observou-se haver variação do rendimento de óleo essencial extraído de folhas

jovens de E. citriodora dependendo da época de colheita e do local de cultivo.

Os resultados das análises de variância e do teste de médias são apresentados nas

Tabelas 2.2 e 2.3, respectivamente.

TABELA 2.2. Análise de variância com teste F a 5% de probabilidade para o rendimento de óleo essencial extraído de folhas jovens de E. citriodora Hook.colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

FV GL SQ QM Fc Pr>Fc Época 1 16.492939 16.492939 63.333 0.0000 * Local 2 6.524811 3.262406 12.528 0.0012 * Época * Local 2 3.551944 1.775972 6.820 0.0105 * Erro 12 3.125000 0.260417 -- --

Total corrigido 17 29.694694 -- -- -- * Significativo a 5% pelo teste F; CV = 13,57%; Média geral = 3,76%

32

TABELA 2.3. Rendimento de óleo essencial em porcentagem de volume de óleo por peso de folhas jovens e frescas, em Base Livre de Umidade (% v/p BLU) de E. citriodora Hook., colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Época de colheita Local de cultivo

Fevereiro Agosto São João del Rei 6,15 aA 3,06 bA Bom Sucesso 4,28 aB 2,56 bA São Bento Abade 3,72 aB 2,79 bA Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Esses resultados dos rendimentos de óleo essencial em %v/pBLU foram

superiores e variaram de 180% a 250% em relação aos resultados dos

rendimentos quando não se considerou a umidade das folhas (%v/p), os quais

estão apresentados na Tabela 2.4.

TABELA 2.4. Rendimento de óleo essencial em porcentagem de volume de óleo por peso de folhas jovens e frescas (% v/p) de E. citriodora Hook., colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Época de colheita Local de cultivo

Fevereiro Agosto São João del Rei 2,46 aA 1,59 bA Bom Sucesso 2,05 aB 1,43 bA São Bento Abade 1,71 aB 1,39 aA Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

33

Independente do local, quando a colheita foi realizada no mês de

fevereiro, os resultados foram superiores para o rendimento de óleo essencial de

eucalipto. Esses resultados divergem das informações obtidas na literatura

acerca da produção de metabólitos secundários, nas quais cita-se que esses são

obtidos em maiores rendimentos quando a planta encontra-se em situações

menos favoráveis ou “stress”, ou seja, esperavam-se maiores rendimentos de

óleos essenciais no mês de agosto, por se tratar de uma época que apresenta uma

baixa precipitação pluviométrica (33 mm), e temperaturas diuturnas reduzidas

(média de 15 ºC, chegando a 5 ºC), em relação ao mês de fevereiro, que

apresentou precipitações e temperaturas favoráveis ao desenvolvimento das

plantas.

Ao considerar a época de colheita, a de fevereiro em São João del Rei

apresentou resultados superiores de produção de óleo, ao passo que para a

colheita realizada em agosto, não houve diferença significativa entre os três

locais.

Esses valores diferem daqueles encontrados por Andrade & Gomes

(2.000), que estudaram o rendimento de óleo essencial de E. citriodora no

município de Seropédica, RJ, onde foram obtidos maiores rendimentos de óleo

extraído de folhas maduras colhidas no outono (início da estiagem), quando

comparado com folhas colhidas no verão (período chuvoso). De maneira

semelhante, Galanti (1987) e Vitti & Brito (1999) ressaltaram que a colheita de

folhas de eucalipto realizada nos meses mais secos do ano (abril a setembro)

propicia um maior rendimento de óleo essencial e consideram que nesse período

essa concentração é maior em razão do menor teor de umidade nas folhas,

obtendo-se melhor qualidade da essência.

Com relação ao rendimento de óleo essencial e ao local de cultivo,

Chalchat et al. (2001) estudaram a dinâmica do acúmulo de óleo essencial em

folhas de E. camaldulensis Dehnh. Os autores encontraram rendimentos de 1,0%

34

a 2,6% de óleo em plantas cultivadas na Tailândia; de 0,8% a 1,3% de óleo em

plantas cultivadas no Marrocos, e, de plantas cultivadas em Israel (Jerusalém),

encontraram rendimento médio de 0,50% de óleo essencial. Ressaltaram que

essas variações ocorreram provavelmente devido ao local de cultivo, o que

interfere no desenvolvimento fisiológico das plantas e produção de óleos.

Na Tabela 2.5, são apresentados os constituintes identificados com seus

teores (%) e seus respectivos índices de Kovats, no óleo essencial de

E. citriodora nas duas épocas de colheita e nos três municípios considerados.

Na identificação e quantificação dos constituintes químicos no óleo

essencial de folhas frescas de E. citriodora, analisados por CG-EM e CG com

detector FID das amostras colhidas nas duas épocas e nos três locais, pelos

resultados verificou-se haver uma similaridade na composição química. Foram

identificados seis constituintes principais, além de outros, sendo o citronelal o

mais abundante, seguindo-se de citronelol e dos constituintes β-pineno,

1,8-cineol, isopulegol e viridiflorol (Figura 2.1).

TABELA 2.5. Constituintes presentes (%) no óleo essencial extraído de folhas jovens e frescas de E. citriodora Hook. colhidas em duas épocas em três municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Épocas de colheita

Fevereiro Agosto Compostos presentes IK

BS SBA SJR BS SBA SJR β-Pineno 980 -- -- 0,36 -- 0,58 0,52 1,8-Cineol 1.033 1,38 1,32 1,02 2,25 0,40 -- Isopulegol 1.145 1,61 2,39 2,95 2,92 3,30 2,33 Citronelal 1.153 77,87 87,99 83,03 67,64 84,33 86,11 Citronelol 1.228 18,04 8,30 11,60 20,84 11,39 11,05 Viridiflorol 1.590 0,22 -- -- -- -- -- Outros 0,88 0,00 1,04 6,35 0,00 0,00

Total 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 BS – Bom Sucesso; SBA – São Bento Abade; SJR – São João del Rei.

35

H O

OH

OH

a b c

O

H

OH

H

d e f

FIGURA 2.1. Representações das estruturas moleculares dos constituintes

químicos encontrados no óleo essencial de E. citriodora Hook. a - citronelal (C10H18O); b – citronelol (C10H20O); c – isopulegol (C10H18O); d - 1,8-cineol (C10H18O); e – viridiflorol (C15H26O); f – β-pineno (C10H16). UFLA, Lavras – MG, 2006.

Os cromatogramas obtidos na identificação e quantificação dos

constituintes químicos presentes no óleo essencial de eucalipto de folhas frescas

colhidas nas duas épocas e em três locais de MG, estão apresentados na

Figura 2.2, na qual se podem observar os maiores picos, correspondentes aos

constituintes citronelal e citronelol.

36

FIGURA 2.2. Cromatogramas obtidos do óleo essencial de folhas jovens e frescas de E. citriodora Hook., colhidas em duas épocas em três locais de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Pelos resultados obtidos, infere-se que no mês de fevereiro a

concentração de citronelal foi superior no óleo essencial extraído de folhas

colhidas em São Bento Abade, diferentemente de folhas colhidas em São João

del Rei, onde o teor foi superior no óleo de folhas colhidas em agosto.

Bom Sucesso / Agosto Bom Sucesso / Fevereiro

São Bento do Abade / Fevereiro São Bento do Abade / Agosto

São João del Rei / Fevereiro São João del Rei / Agosto

37

O teor de citronelal, o constituinte majoritário, variou de 2% a até 30%

de acordo com o tratamento utilizado, ou seja, entre as épocas de colheita e os

locais considerados.

Observa-se também que os teores de citronelal e citronelol, os

constituintes majoritários presentes no óleo de E. citriodora, variaram de acordo

com as épocas de colheita e os locais de cultivo. Esperava-se que a variação de

citronelal fosse inversamente proporcional à variação de citronelol, devido a

reações de oxidação desse. No entanto, verificou-se essa ocorrência apenas no

óleo obtido de folhas colhidas em São Bento Abade para as duas épocas

avaliadas. No óleo obtido de folhas colhidas em Bom Sucesso, o teor de

citronelal reduziu 10%, de fevereiro para agosto, enquanto o citronelol aumentou

apenas 2% entre as mesmas duas épocas. Já no município de São João del Rei, o

citronelol praticamente não sofreu alteração no teor entre essas épocas enquanto

o citronelal aumentou mais de 3% de fevereiro para agosto. Esses dados indicam

uma necessidade no conhecimento da extração de óleos essenciais, quando se

deseja obter um produto com maiores rendimentos e com maiores teores do

constituinte desejado em cada óleo.

Esses resultados diferem em parte dos obtidos por Vitti & Brito (1999),

que relataram ocorrer um maior teor de citronelal no óleo essencial de folhas de

eucalipto colhidas nos meses mais secos do ano (abril a setembro), com

obtenção de melhor qualidade da essência. Fabrowski (2002), estudando a

sazonalidade de óleo essencial de E. smithii, encontrou maiores teores de

1,8-cineol (85,16%) em folhas adultas colhidas no verão, seguindo-se da

colheita realizada no outono (82,34%), primavera (80,44%) e inverno (78,25%).

Quanto aos compostos presentes nos óleos essenciais, Magalhães (1988)

considera que no óleo de E. citriodora, como em outros óleos essenciais, cada

componente tem um perfil característico e cada aroma e sabor é uma

combinação dos perfis de seus constituintes; em certos casos, pode haver

38

predominância de um componente, como, por exemplo, do citronelal no óleo

essencial dessa espécie.

Ao considerar os constituintes do óleo essencial e o local de cultivo,

Chalchat et al. (2001) encontraram teores de 1,8-cineol no E. camaldulensis

entre 69% a 75% na Tailândia, de 72% a 84% na Austrália e Marrocos, de 43%

a 55% na Turquia e Burundi e de 29% no Sri Lanka e Austrália; nesse último

local, os constituintes variaram também conforme a época de colheita.

De forma geral, os resultados obtidos no presente trabalho corroboram

com os obtidos pelos autores acima citados, mostrando variações no rendimento

de óleo essencial e dos constituintes majoritários, de acordo com a época de

colheita das folhas e do local de cultivo das plantas.

Deve-se, portanto, tentar aliar as condições de cultivo, como o local e a

época de colheita, quando se deseja maximizar os rendimentos na extração de

óleo essencial de E. citriodora Hook., bem como dos teores do constituinte

químico de interesse presente no óleo.

39

4 CONCLUSÕES

Pode-se inferir que houve uma influência do local de cultivo e da época

de colheita no rendimento do óleo essencial e dos constituintes químicos

presentes em folhas frescas de Eucalyptus citriodora Hook.

O maior rendimento de óleo essencial de E. citriodora foi obtido da

extração de folhas colhidas no mês de fevereiro em São João del Rei, MG.

O citronelal foi o constituinte químico encontrado em maiores teores no

óleo essencial de E. citriodora, em folhas colhidas em fevereiro em São Bento

Abade, MG.

40


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41

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42

CAPÍTULO III

AVALIAÇÕES DE RENDIMENTOS E DOS CONSTITUINTES

QUÍMICOS DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE FOLHAS DE TRÊS ESPÉCIES

DE Eucalyptus COLHIDAS EM DIFERENTES ÉPOCAS DO ANO EM

MUNICÍPIOS DE MINAS GERAIS

43

RESUMO

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Avaliações de rendimentos e dos constituintes químicos de óleos essenciais de folhas de três espécies de Eucalyptus colhidas em diferentes épocas do ano em municípios de Minas Gerais. In: ______. Caracterização fitoquímica de óleos essenciais de eucalipto e seu efeito sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. 2006. Cap. 3, p.42-61. Tese (Doutorado em Agronomia. Fitotecnia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.1 Os óleos essenciais de Eucalyptus apresentam finalidades múltiplas de acordo com o constituinte majoritário presente em cada um deles. Óleos para fins medicinais apresentam o 1,8-cineol como composto majoritário; óleos industriais apresentam o felandreno em maiores teores; e naqueles utilizados em indústrias de perfumaria, o citronelal é o constituinte majoritário. O rendimento, a composição e a quantidade dos constituintes majoritários desses óleos essenciais podem sofrer influência de fatores ambientais e genéticos. Assim, objetivou-se neste trabalho avaliar o rendimento e os constituintes químicos no óleo essencial de folhas frescas de Eucalyptus camaldulensis Dehnh., E. citriodora Hook. e E. urophylla L.D. Pryor. Essas foram colhidas em fevereiro e agosto de 2005, nos municípios de Bom Sucesso e São João del Rei (Minas Gerais). Os óleos essenciais foram obtidos por meio de hidrodestilação utilizando-se o aparelho de Clevenger modificado. Determinou-se a umidade da matéria-prima, sendo o rendimento de óleo essencial expresso em volume de óleo por peso de folhas secas com Base Livre de Umidade (% v/pBLU). Para o estudo da identificação e quantificação dos constituintes presentes do óleo essencial, utilizou-se a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Pelos resultados obtidos, verificou-se que o teor de óleo essencial foi influenciado pela interação da espécie utilizada, da época e do local de colheita. O E. citriodora coletado em São João del Rei apresentou maior rendimento de óleo no mês de fevereiro. O citronelal foi o constituinte majoritário identificado no óleo de E. citriodora, enquanto nos óleos de E. camaldulensis e E. urophylla, o constituinte majoritário foi o 1,8-cineol.



44

ABSTRACT

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Yield and main chemical components evaluation of essential oil from leaves of three species of Eucalyptus harvested in different seasons locations of the Commonwealth of Minas Gerais. In: ______. Phytochemical and biological evaluation of eucalyptus essential oil. 2006. Chapter 3, p.42-61. Thesis (Doctorate in Agronomy Crop Science)-Federal University of Lavras, Lavras, MG.1

Eucalyptus essential oil serves multiple purposes according to their major chemical constituent. Oils used for medical purposes show 1,8-cineole as the major compound, also known as eucalyptol; oils used for industrial purposes show higher contents of phellandrene; and oils used for perfumery industry show citronellal as major component. Yield, composition as well as major components quantity of these essential oils can be influenced by both genetic and environmental factors. This work aimed to evaluate essential oil major components and yield of fresh leaves of E. camaldulensis Dehnh., E. citriodora Hook. and E. urophylla L.D.Pryor. Harvest took place in February and August of 2005, in three different municipalities. Hydrodistillation was used to extract essential oil using the modified Clevenger apparatus. The raw material moisture was determined. The essential oil yield was expressed in volume of oil per dry leaves weight on moisture free basis. Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used in order to identify and to quantify essential oil components. Results showed that interaction among species, harvest time and location had influence on essential oil yield. The E. citriodora showed a higher oil yield in February in the City of São João del Rei. Citronellal was found to be the major component in E. citrodora oil and 1,8-cineole was the major component in E. camaldulensis and E. urophylla.



45

1 INTRODUÇÃO

Segundo a International Organization for Standardization (ISO), óleos

voláteis são produtos obtidos de partes de plantas por meio de destilação por

arraste com vapor d’água, ou obtidos por espressão de pericarpos de frutos

cítricos. São substâncias constituídas de numerosos compostos voláteis,

lipofílicas, sendo geralmente odoríferas e líquidas. Também denominados de

óleos essenciais, óleos etéreos ou essências, devido a algumas de suas

características físico-químicas, sendo a principal delas a volatilidade (Simões et

al., 2004).

Doran (1991) e Harbone (1993) mostraram que em algumas espécies de

Eucalyptus os óleos essenciais são sintetizados em glândulas endógenas, que

eventualmente se rompem liberando substâncias na cavidade resultante do

rompimento dessas glândulas. Considera-se que há uma relação entre os óleos

essenciais com funções ecológicas da planta, como a sobrevivência e/ou

manutenção dessa conferindo a ela capacidade de adaptação às condições do

meio em que vive. Podem estar envolvidos em efeitos alelopáticos, como nas

interações animal-planta, planta-microrganismos e planta-planta. Os óleos

essenciais de algumas espécies de Eucalyptus apresentam boas perspectivas de

comercialização, sendo o Brasil um dos países que mais produzem alguns desses

óleos. Cerca de 20 espécies de eucaliptos produzem óleos essenciais de interesse

comercial, sendo esses óleos divididos em três grupos em função do seu uso

final: óleos medicinais, óleos industriais e óleos para perfumaria.

Entre os óleos para perfumaria, a espécie E. citriodora Hook. é a fonte

mais rica e econômica de citronelal, utilizado desde a fabricação de cosméticos

até a aromatização de produtos de limpeza, como sabões e detergentes. Possui

propriedade anti-séptica, o que justifica seu uso como agente de limpeza,

aromatizante e desinfetante de pisos e sanitários (Vitti, 1999; Matos, 2002).

46

Segundo Simões et al. (2004), óleos de eucaliptos que apresentam

propriedades medicinais são aqueles que apresentam em sua composição o

1,8-cineol, como por exemplo encontrado no óleo essencial da espécie

E. globulus Labill. Essa espécie não é muito cultivada no Brasil, sendo sugerido

que outras espécies que também apresentem o 1,8-cineol na sua composição

devam ser mais investigadas.

De acordo com Wang et al., (1997), a produtividade, a composição e os

teores dos constituintes químicos dos óleos essenciais podem sofrer alterações

devido a fatores genéticos e ambientais. A umidade relativa, radiação solar,

temperatura e o estresse hídrico são alguns dos fatores ambientais citados como

relevantes. Além desses, citam-se, entre outros, a parte utilizada, a idade da

planta e da folha, o tipo de manejo florestal, métodos de amostragem das folhas,

processos de extração e de análise de óleo (Simon et al., 1992; Vitti, 1999).

Vitti & Brito (2003) encontraram maiores rendimentos e maiores

concentrações de citronelal no óleo essencial da espécie E. citriodora Hook. em

determinadas épocas do ano (inverno e primavera).

Chalchat et al. (2001) mostraram que o óleo essencial de

E. camaldulensis Dehnh. apresentou como constituinte majoritário, o 1,8-cineol,

ocorrendo variações nos teores desse de acordo com o local de cultivo das

plantas utilizadas.

Assim, no presente trabalho objetivou-se verificar as variações dos

rendimentos e dos constituintes químicos do óleo essencial de três espécies de

Eucalyptus em diferentes épocas e locais de colheita.

47


O material utilizado, folhas jovens e frescas de Eucalyptus

camaldulensis Dehnh., E. citriodora Hook. e E. urophylla L.D.Pryor. foram

colhidas em reflorestamentos da Gerdau Florestal em Bom Sucesso (20º58’S,

44º48’W e 950 m alt.) e São João del Rei (21º16’S, 44º54’W e 910 m alt.),

municípios de Minas Gerais. Esses apresentam clima do tipo Cwb pela

classificação climática de Köeppen, caracterizado por verão chuvoso e inverno

seco com precipitação média anual de 1.411 mm e temperatura média anual de

19,3 ºC.

As colheitas foram realizadas entre os dias 25 - 28 de fevereiro e 25 - 30

de agosto de 2005, sempre até as 10 horas, em dias sem precipitação

pluviométrica com umidade relativa máxima de 60%. As folhas frescas foram

fragmentadas e separadas em amostras de 50 gramas; quando necessário, foram

mantidas sob refrigeração com temperatura em torno de 2 ºC.

As análises de solo utilizadas foram realizadas pela empresa para fins de

adubação de manutenção da fertilidade da área do reflorestamento. O

espaçamento utilizado foi de 2,0 x 3,0 m, com a finalidade para produção de

madeira e carvão utilizado em siderurgia.

As parcelas utilizadas para o experimento foram constituídas de 67

plantas em 400 m2 (20 x 20 m) nos dois locais, localizados no interior de talhões

com a referida espécie. Dessas 67, foram sorteadas e identificadas 20 plantas

para posterior colheita de folhas, e constituíram um tratamento. Cada tratamento

foi estabelecido como folhas de eucalipto de cada espécie em cada época e local,

totalizando 12 tratamentos.


7,0 m de altura) de árvores com um corte realizado aos sete anos. As folhas

48

colhidas situavam-se no terço inferior da planta, de ramos com diâmetro inferior

a 1,5 cm.


por planta, totalizando quatro quilogramas das 20 plantas de cada talhão de cada

espécie em cada época e local, e constituíram uma amostra composta. Em

seguida, essas foram homogeneizadas e retiradas amostras de 50 gramas cada

uma, constituindo uma amostra. Foram utilizadas três amostras de cada

tratamento para as extrações de óleos essenciais e avaliação de umidade das

folhas.

Para determinação do teor de umidade das folhas, utilizou-se o Sistema


de solventes; nesse caso, o ciclohexano e a água, conforme Pimentel et al.,

(2006).

Para obtenção do óleo essencial das folhas frescas, utilizou-se o aparelho

Clevenger modificado, conforme Matos (1988). As amostras (50 g) foram

acondicionadas em balões com 500 mL de água destilada. A extração foi

realizada no período de duas horas. Centrifugou-se o hidrolato utilizando uma

centrífuga de cruzeta horizontal (raio = 5 cm) a 4.500 rpm

(aproximados 1.130 forças g) por 60 segundos, conforme estudos preliminares

(Castro et al., 2005). O rendimento do óleo essencial foi calculado e expresso em

volume de óleo por peso de folhas frescas (%v/p) e com base na matéria seca ou

Base Livre de Umidade (%v/p BLU) (Pimentel et al., 2006).

Os dados obtidos nas avaliações foram submetidos à análise de

variância, sendo os efeitos das espécies de eucalipto, das épocas de colheita e

dos locais de cultivo comparados pelo teste de Tukey quando significativos

(Ferreira, P., 2000). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o

Sistema de Análise de Variância – SISVAR, conforme Ferreira, D. (2000).

49











decomposição 1.000; intervalo de decomposição de 0,50; e fragmentos de

45 Daltons a 450 Daltons decompostos. Injetou-se, nas mesmas condições das

amostras, uma mistura de hidrocarbonetos (C9H20; C10H22: C11H24; ... C24H50;

C25H52 e C26H54). A identificação dos constituintes foi realizada

comparando-se os espectros obtidos com os do banco de dados do aparelho e

pelo índice de Kovats calculado para cada constituinte, conforme Adams (1995).



utilizando-se um aparelho Shimadzu GC–17A nas seguintes condições



inicial de 40 ºC até 240 ºC; gás carreador nitrogênio (2,2mL min-1); taxa de split

1:10; e volume injetado de 1 µL (1% de solução em diclorometano) e pressão na

coluna de 115 KPa. A quantificação de cada constituinte foi realizada por meio

de normalização de áreas (%).

50


Foram utilizadas as espécies Eucalyptus camaldulensis Dehnh.,

E. citriodora Hook. e E. urophylla L.D. Pryor nas duas localidades, pela

disponibilidade de mesmas espécies com a mesma idade nesses reflorestamentos

da Gerdau Florestal (rebrotas com 3 anos).

Nas duas áreas onde foram realizadas as colheitas de folhas frescas, o

plantio de eucalipto é utilizado pelas características favoráveis de topografia,

tipo de solo, clima etc, além da proximidade das unidades consumidoras –

siderúrgicas.

Os resultados das análises de solo, das duas áreas onde foram realizadas

as colheitas, estão apresentados no Anexo 1.

Pelos resultados dos valores de umidade (U%) obtidos e apresentados na

Tabela 3.1, constatou-se que folhas colhidas no mês de fevereiro apresentaram

maiores teores de umidade, independente da espécie e local de colheita.

Provavelmente, esses maiores valores ocorreram devido à maior precipitação

pluviométrica média em fevereiro (207 mm) em relação ao mês de agosto

(33 mm), na média dos dois municípios.

TABELA 3.1. Teor de umidade (U%) obtido em folhas jovens e frescas de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Municípios Bom Sucesso São João del Rei Espécie

Fevereiro Agosto Fevereiro Agosto E. citriodora 52 44 60 48 E. camaldulensis 54 46 58 48 E. urophylla 57 46 54 46

51

Essa consideração deve-se ao fato de que a umidade, em termos de

massa absoluta de material úmido, pode conduzir a rendimentos diferentes com

interpretações distintas, conforme pesquisa com óleo essencial de E. smithii R.T.

Baker realizada por Fabrowski (2002).

Os rendimentos de óleos essenciais extraídos de folhas jovens e frescas

das três espécies de eucalipto foram avaliados em Base Livre de Umidade

(BLU) e pelos resultados obtidos, verificou-se que houve efeito significativo a

5% de probabilidade pela análise de variância, para as variáveis espécie de

eucalipto utilizada, época de colheita e local de cultivo, e também para a

interação desses. A probabilidade foi não-significativa apenas para a interação

local de cultivo e época de colheita. Ou seja, existe uma probabilidade de que

ocorra variação na produção de óleos essenciais de eucaliptos, das três espécies

consideradas, dependendo da época de colheita e do local de cultivo.

Os resultados da análise de variância e do teste de médias são

apresentados nas Tabelas 3.2 e 3.3, respectivamente.

52

TABELA 3.2. Análise de variância com teste F a 5% de probabilidade para o rendimento de óleo essencial extraído de folhas jovens e frescas de três espécies de Eucalyptus em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

FV G SQ QM Fc Pr>Fc Espécie 2 72.443817 36.221908 148.105 0.0000 * Local 1 1.120069 1.120069 4.580 0.0427 *

Época 1 5.499025 5.499025 22.485 0.0001 *

Espécie* Local 2 4.366772 2.183386 8.927 0.0013 *

Espécie*Época 2 12.600950 6.300475 25.761 0.0000 *

Local*Época 1 0.153403 0.153403 0.627 0.4361 NS

Espécie*Época*Local 2 3.798572 1.899286 7.766 0.0025 *

Erro 24 5.869667 0.244569

Total corrigido 35 105.85557

* Significativo a 5% pelo teste F; CV = 24,21%; Média geral: 2,04


óleo por peso de folhas jovens e frescas, em Base Livre de Umidade (% v/p BLU), de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Municípios Bom Sucesso São João Del Rei Espécie

Fevereiro Agosto Fevereiro Agosto E. citriodora 4,28 bA 2,56 cA 6,15 aA 3,06 cA E camaldulensis 1,45 bB 0,93 bB 0,93 bB 2,22 aA E. urophylla 1,24 aB 0,74 aB 0,55 aB 0,39 abB Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

53

Esses resultados dos rendimentos de óleo essencial em %v/p BLU foram

superiores e variaram de 180 a 250% em relação aos resultados obtidos quando

não se considerou a umidade das folhas (% v/p), e esses estão apresentados na

Tabela 3.4.

TABELA 3.4. Rendimento de óleo essencial em porcentagem de volume de óleo por de folhas jovens e frescas (%v/p) de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Municípios Bom Sucesso São João Del Rei Espécie

Fevereiro Agosto Fevereiro Agosto E. citriodora Hook. 2,05 bA 1,43 cA 2,46 aA 1,59 cA E camaldulensis Dehnh 0,67 bB 0,50 bB 0,40 bB 1,20 aA E. urophylla L.D.Pryor 0,53 aB 0,40 aB 0,25 aB 0,21 aB

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Independente da época de colheita e do local de cultivo, a espécie

E. citriodora Hook. apresentou os maiores rendimentos de óleo essencial

Em relação ao local de cultivo, plantas cultivadas em São João del Rei

expressaram maior produção de óleo essencial.

Quanto à época de colheita, para a realizada no mês de fevereiro, os

resultados foram superiores para o rendimento de óleo essencial, exceto para o

tratamento em que a espécie E. camaldulensis foi cultivada em São João del Rei,

sendo o mês de agosto aquele em que houve o maior rendimento de óleo.

Essa divergência nos resultados, apesar de contraditória, nos direcionam

no sentido de se esperar que isso ocorra, ou seja, os maiores teores de óleos

54

ocorreriam de fato em agosto, devido às condições menos favoráveis, o que

poderia condicionar a planta a alguma condição de “stress”, como menores

precipitação pluviométrica (33 mm) e temperaturas (média de 15 ºC, chegando a

5 ºC), em relação ao mês de fevereiro, que apresentou precipitações e

temperaturas favoráveis ao desenvolvimento das plantas.

Com relação à época de colheita das folhas, os resultados obtidos

diferem dos encontrados por Andrade & Gomes (2000) no município de

Seropédica, RJ, já que obtiveram maior rendimento de óleo essencial de E.

citriodora de folhas maduras colhidas no outono em relação às folhas colhidas

no verão. Com resultados semelhantes, Vitti & Brito (1999) consideraram que

folhas de eucalipto colhidas nos meses mais secos do ano (abril a setembro)

propiciaram um maior rendimento de óleo essencial, em razão do menor teor de

umidade nas folhas.

Para a espécie E. camaldulensis, folhas colhidas no mês de agosto no

município de São João del Rei apresentaram maior rendimento de óleo

(2,22%v/pBLU) sendo semelhantes aos resultados encontrados pelos autores

acima citados.

Já para a espécie E. urophylla, praticamente não houve diferença

significativa entre os locais e épocas de colheita para o rendimento de óleo

essencial. Esta espécie apresentou os menores rendimentos de óleo essencial

porém não diferiram estatisticamente dos tratamentos com E. camaldulensis.

O local de cultivo também demonstrou exercer influência no rendimento

de óleo essencial de E. camaldulensis e E. citriodora. Resultados semelhantes a

esses, foram obtidos por Chalchat et al. (2001), os quais encontraram

rendimentos de óleo essencial de E. camaldulensis de 1,0% a 2,6% em plantas

cultivadas na Tailândia, enquanto plantas cultivadas no Marrocos produziram de

0,8% a 1,3% e apenas 0,50% foi obtido de plantas cultivadas em Israel

55

(Jerusalém). Concluíram que o local de cultivo influenciou largamente na

produção de óleo essencial.

Magalhães (1988) ressalta que no óleo de E. citriodora, como em outros

óleos, cada constituinte tem um perfil característico e cada aroma e sabor é uma

combinação dos perfis de seus constituintes; em certos casos, pode haver

predominância de um componente, como, por exemplo do citronelal no óleo

essencial dessa espécie.

Na identificação e quantificação dos constituintes químicos presentes

nos óleos essenciais de folhas frescas das três espécies de Eucalyptus, analisados

por CG-EM e CG com detector FID das amostras colhidas nas duas épocas e nos

dois locais, pelos resultados verificou-se uma composição química definida para

cada um dos óleos conforme a espécie de eucalipto utilizada.

O óleo extraído de cada uma das espécies apresentou uma composição

química definida; esses constituintes apresentaram variações nos seus teores, de

acordo com a época de colheita das folhas e do local de cultivo.

Para o E. citriodora, o constituinte majoritário citronelal variou de

67,64% a 86,11%, e não seguiu um padrão, ou seja, no município de Bom

Sucesso, o maior teor foi obtido de folhas colhidas em fevereiro, ao passo que

em São João del Rei, o maior teor foi obtido de folhas colhidas em agosto. Os

maiores teores de citronelal foram obtidos em plantas cultivadas em São João

del Rei.

Para as espécies de E. camaldulensis e urophylla, o constituinte

majoritário identificado foi o 1,8-cineol, com variações de 25,73% a 70,27% e

de 36,73% a 72,54%, respectivamente. Para as duas espécies, os óleos extraídos

de folhas no mês de agosto no município de Bom Sucesso foram os que

apresentaram maiores teores desse constituinte.

56

Na Tabela 3.5 são apresentados os constituintes identificados com seus

teores (%) e respectivos índices de Kovats, presentes nos óleos essenciais das

três espécies de eucaliptos, colhidas em duas épocas nos dois municípios de

MG.

TABELA 3.5. Constituintes presentes (%) nos óleos essenciais extraídos de folhas jovens e frescas de três espécies de Eucalyptus colhidas em duas épocas em dois municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Municípios

Bom Sucesso São João del Rei Espécies e constituintes IK Fevereiro Agosto Fevereiro Agosto

E. camaldulensis Dehnh. α-Pineno 939 -- 5,00 -- 12,39 β-Pineno 980 0,70 3,99 1,51 14,85 ρ-Cimeno 1.026 2,94 0,77 -- -- 1,8-Cineol 1.033 25,73 70,27 46,61 63,69 γ-Terpineno 1.062 0,74 0,53 -- -- 4-Transpinocarveol 1.139 -- -- 3,31 -- 4-Terpineol 1.177 1,51 1,55 -- -- α-Terpineol 1.189 2,54 5,61 13,28 2,55 (E)-Farneseno 1.458 -- -- 4,70 -- Ledol 1.565 -- -- 2,85 -- Globulol 1.583 3,91 8,32 18,92 6,51 Viridiflorol 1.590 -- -- 5,26 -- Benzil Benzoato 1.762 34,18 -- -- -- Mandelonitrila 22,61 -- -- -- Outros 5,14 3,96 3,56 0,1

Total 100,0 100,0 100,0 100,0 “Continua....”

57

“TABELA 3.5. Continuação.”

Municípios Bom Sucesso São João del Rei Espécies e constituintes IK

Fevereiro Agosto Fevereiro Agosto E. citriodora Hook.

β-Pineno 980 -- -- 0,36 0,51 1,8-Cineol 1.033 1,38 2,25 1,02 -- Isopulegol 1.145 1,61 2,92 2,95 2,33 Citronelal 1.153 77,87 67,64 83,03 86,11 β-Citronelal 1.153 0,90 2,82 0,80 -- Citronelol 1.228 18,04 20,84 11,60 11,05 Viridiflorol 1.590 0,20 -- -- -- Outros 0,00 3,53 0,24 0,00

Total 100,0 100,0 100,0 100,0 E. urophylla L.D.Pryor

α-Pineno 939 -- -- -- 26,00 β-Pineno 980 -- -- -- 4,63 O-Cimeno 1.022 1,47 4,77 -- 9,26 1,8-Cineol 1.033 36,73 72,54 43,00 47,43 Isopulegol 1.145 17,12 -- 13,39 -- α-Terpineol 1.189 3,22 1,35 4,13 1,40 Terpenil Acetato 1.315 2,74 -- -- -- Citronelil Acetato 1.354 13,05 16,15 12,75 9,65 Espatulenol 1.576 -- 1,30 -- 0,70 Óxido de Cariofileno 1.581 6,64 3,89 6,20 0,93 Outros 19,03 0,00 20,53 0,00

Total 100,0 100,0 100,0 100,0 IK – Índice de Kovats (Adams, 1995).

Ao considerar o local de cultivo, Chalchat et al. (2001) encontraram

teores variáveis de 1,8-cineol no E. camaldulensis em diversos locais

considerados, como de 69% a 75% na Tailândia; de 72% a 84% na Austrália e

58

Marrocos; de 43% a 55% na Turquia e Burundi e de 29% no Sri Lanka e

Austrália; nesse último local variou também conforme a época de colheita.

De forma geral, os resultados do presente trabalho corroboram com os

obtidos pelos autores acima citados, que sugeriram ocorrer variações no

rendimento de óleo essencial e do composto majoritário, de acordo com a

espécie utilizada, a época de colheita das folhas e o local de cultivo das plantas.

Assim, é importante definir a melhor época para se expressar o maior

potencial de produção de óleos essenciais e seus constituintes químicos, para

cada espécie e região, de tal forma que o produtor possa ter maior rendimento a

partir de suas plantas.

59

4 CONCLUSÕES

A produção de óleos essenciais foi influenciada pela espécie de eucalipto

utilizada, época de colheita e local de cultivo.

A espécie Eucalyptus citriodora Hook.apresentou o maior rendimento de

óleo essencial, obtido da extração de folhas jovens colhidas no mês de fevereiro

de 2005, em São João del Rei, MG, e pode ser considerada como promissora

para produção de óleo essencial na região, principalmente para óleos com altos

teores de citronelal, de interesse das indústrias de perfumaria.

Já para o Eucalyptus camaldulensis Dehnh., o melhor rendimento de

óleo essencial foi obtido de folhas colhidas no mês de agosto de 2005, em São

João del Rei; porém, com teor médio de 1,8-cineol. Sugere-se mais estudos

sobre a referida espécie para justificar seu uso como produtora de óleos

essenciais de uso medicinal, principalmente se cultivada na região considerada

neste estudo.

A espécie E. urophylla L.D. Pryor não apresentou resultados

promissores de produção de óleos essenciais com altos teores de 1,8-cineol, não

sendo considerada para tal finalidade na região.

60



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61

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62

CAPÍTULO IV

IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES DO ÓLEO ESSENCIAL DE

Eucalyptus camaldulensis DEHNH. E O EFEITO DESSE ÓLEO SOBRE O

CRESCIMENTO DO PROTOZOÁRIO TRIPANOSOMATÍDEO

Herpetomonas samuelpessoai

63

RESUMO

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Identificação dos constituintes do óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis Dehnh. e o efeito desse óleo sobre o crescimento do protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. In: ______. Caracterização fitoquímica de óleos essenciais de eucalipto e seu efeito sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. 2006. Cap. 4, p.62-81. Tese (Doutorado em Agronomia. Fitotecnia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.1

Extratos de plantas com compostos biologicamente ativos vêm sendo testados em Herpetomonas samuelpessoai, um protozoário tripanosomatídeo não-patogênico utilizado como modelo de estudo devido às suas semelhanças biológicas com o Trypanossoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas. Algumas espécies de Eucalyptus (Myrtaceae) apresentam interesse por sua produção e composição de óleos essenciais. De acordo com a composição química de cada um, podem ser utilizados para produtos farmacêuticos, perfumarias e industriais. O óleo essencial de E. camaldulensis Dehnh apresenta como componente majoritário o 1,8-cineol, composto com propriedades medicinais comprovadas. Objetivou-se neste trabalho identificar e quantificar os constituintes químicos presentes no óleo essencial de E. camaldulensis e avaliar o efeito desse sobre o crescimento celular do protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. Folhas frescas foram utilizadas para obtenção do óleo essencial. Para a identificação e quantificação dos constituintes presentes no óleo, utilizaram-se a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e a cromatografia gasosa com detector FID. O componente majoritário encontrado no óleo essencial de E. camaldulensis foi o 1,8-cineol, com 59,43%, um composto com propriedades medicinais comprovadas. Culturas de H. samuelpessoai na concentração de 5x106 células mL-1 foram incubadas em meio Brain Heart Infusion suplementado com 10% de soro fetal bovino e contendo diferentes concentrações do óleo (10, 1 e 0,1 mg mL-1). Após 24 horas, realizou-se a contagem das células em câmara de Neubauer em microscópio ótico de campo claro com aumento de 40x. Resultados do estudo biológico demonstraram um efeito inibitório do óleo essencial de E. camaldulensis sobre o crescimento celular de H. samuelpessoai. A dose que inibiu 50% do crescimento celular (IC50) foi estimada em aproximadamente



64

90,1 µg mL-1. Concluiu-se que o óleo essencial de E. camaldulensis apresenta-se como um potencial agente fitoterápico para o controle de protozoários tripanosomatídeos e de outros parasitos que afetam a saúde humana.

65

ABSTRACT

CASTRO, Nilmar Eduardo Arbex de. Eucalyptus camaldulensis Dehnh. essential oil chemical components and their effect on trypanosomatid protozoan Herpetomonas samuelpessoai growth. In: ______. Phytochemical and biological evaluation of eucalyptus essential oil. 2006. Chapter 4, p.62-81. Thesis (Doctorate in Agronomy Crop Science) - Federal University of Lavras, Lavras, MG.1

Plant extracts with biologically active compounds have been tested on Herpetomonas samuelpessoai, a non-pathogenic trypanosomatid protozoan, used as a study model due to its biological similarities with Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas’disease. Some Eucalyptus (Myrtaceae) species are of interest, related to essential oils production and composition. Essential oil serves pharmaceutical, phytochemical, perfumery industries according to their major chemical constituents. E. camaldulensis essential oil has 1,8-cineol as main compound, that is known to have medical properties. The aim of this work was to identify and quantify the major components of the E. camaldulensis essential oil and to evaluate its effect on trypanosomatid protozoan Herpetomonas samuelpessoai cell growth. Hydrodistillation of fresh leaves followed by hydrosol centrifugation were used to extract essential oil. Gas chromatography with FID detector was used to identify and quantify essential oil chemical components. Oil from E. camaldulensis was found to have the highest levels of 1,8-cineol (59,43%), well known for its medical properties. H. samuelpessoai cultures with concentration of 5x106 cells.mL-1 were incubated in Brain Heart Infusion supplemented with 10% fetal calf serum and containing different essential oil concentrations (10, 1 or 0.1 mg.mL-1). Assessment of growth by cell counting in a Neubauer chamber was determined after 24 h, by light microscopy, using a 40X objective. The results showed the inhibitory effect of E. camaldulensis essential oil on H. samuelpessoai cell growth. A dose of about 90.1 µg.mL-1 inhibited 50% cell growth (IC50). Therefore, E. camaldulensis essential oil is a potential phytotherapeutic agent for the control of parasites that affect the humans such as trypanosomatid protozoa.



66

1 INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos gerais sobre protozoários tripanosomatídeos

Doenças causadas por protozoários causam grande mortalidade humana

em países tropicais e subtropicais, com um número limitado de medicamentos

utilizados no tratamento de tripanosomíases, amebíases, leishmanioses e

malária.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é

uma infecção endêmica das Américas Central e do Sul. Nas pessoas infectadas,

grande parte dos casos é diagnosticado durante a fase crônica e o tratamento

específico apresenta-se controverso, devido às dificuldades para avaliar sua

eficácia e os custos do risco-benefício, sobretudo ao se considerarem os efeitos

colaterais das drogas disponíveis e a resistência que os protozoários patogênicos

adquirem a elas (Mello, 1997; Essawi & Srour, 2000).

Protozoários da família Trypanosomatidae compreendem um vasto

número de espécies, algumas das quais podem causar doenças como as

leishmanioses e a doença de Chagas. No entanto, outros tripanosomatídeos

não-patogênicos aparecem como importantes modelos para o estudo sobre os

processos da biologia celular básica, replicação de RNA, variação gênica, etc.

(De Souza & Motta, 1999). Diversos grupos de pesquisas utilizam como modelo

biológico a Herpetomonas samuelpessoai, um tripanosomatídeo não patogênico

de insetos que apresenta antígenos semelhantes ao T. cruzi (Souza et al, 1974;

Tagboto & Townson, 2001).

O ciclo do T. cruzi envolve uma fase em mamíferos, em que o parasita se

multiplica intracelularmente sob a forma amastigota, e uma fase no intestino de

insetos hematófagos da família Reduviidae conhecidos popularmente como

“barbeiros”, onde esses protozoários se desenvolvem extracelularmente sob a

67

forma epimastigota. A forma responsável pela transferência entre hospedeiros e

vetores, é a tripomastigota, que ocorre tanto nos mamíferos quanto nos insetos.

Nos mamíferos os tripomastigotas localizam-se no sangue e recebem o nome de

tripomastigotas sanguíneas, enquanto que nos insetos recebem o nome de

tripomastigotas metacíclicos e localizam-se no trato digestivo. Essa

heterogeneidade genética e biológica do T. cruzi permite infectar um número

elevado de hospedeiros, o que dificulta ainda mais seu controle nas várias fases

de seu ciclo (Carreira, 2001).

Gonzalez (1997) estudou a interação parasita/hospedeiro com insetos

vetores infectados com T. cruzi, tendo sugerido a existência de um controle

neuro-endócrino dos insetos sobre as células epiteliais do tubo digestivo e o

crescimento da membrana perimicrovilar (revestimento interno do estômago), o

que fornece um ambiente propício ao desenvolvimento e à sobrevivência do

T. cruzi.

Sarquis (2003), em estudos de aspectos epidemiológicos da doença de

Chagas na zona rural de Juguarana, Ceará, observou 1.773 exemplares de

espécies de triatomíneos (barbeiros) capturados e identificou 302 deles

infectados pelo T. cruzi. Constatou também que das 631 pessoas residentes na

comunidade, 23 indivíduos apresentaram soro-positividade, confirmada em

17 desses casos.

1.2 Uso de espécies vegetais com propriedades tripanosomicidas

Plantas de uso popular têm sido utilizadas nos tratamentos de doenças

causadas por protozoários, como no caso da malária, onde mais de 30 espécies

de vegetais são utilizadas, sendo algumas com validação médica (Hidalgo,

2003). Em vários estudos com tripanosomas verificou-se a viabilidade do uso de

plantas com possíveis propriedades tripanosomicidas. Mikus et al. (2000)

68

relataram o efeito tóxico dos óleos essenciais de Thymus vulgaris e Melaleuca

alternifolia sobre o Trypanosoma brucei, o agente causador da

tripanosomíase- africana, transmitida pela mosca “tsé-tsé”. Esse mal causa mais

de 350 mil vítimas anuais, principalmente no continente africano, tendo

merecido ao longo dos tempos o empenho dos cientistas, em tentar minorar a

todo custo, o sofrimento causado pela doença.

Holetz et al. (2002) verificaram o efeito de extratos brutos ou óleos

essenciais de 15 plantas medicinais adicionados ao meio definido sobre o

crescimento e diferenciação celular do tripanosomatídeo Herpetomonas

samuelpessoai. Concluíram que Lippia alba, Piper regnellii, Stryphnodendron

adstrigens e Tanacetum vulgare apresentaram atividade anti-protozoário. Esses

pesquisadores sugeriram que esses vegetais podem ser utilizados como modelos

para seleção de plantas que cont}em drogas tripanosomicidas.

Holetz et al. (2003), em trabalho semelhante com Herpetomonas

samuelpessoai, verificaram que o óleo essencial de Ocimum gratissimum teve

um efeito inibitório sobre o crescimento dos parasitas, abrindo, assim,

perspectivas promissoras para o uso de mais drogas de origem vegetal com

propriedades tripanosomicidas.

Nesses trabalhos demonstram-se a diversidade de pesquisas e a

importância que essas doenças representam, principalmente aos moradores da

zona rural, nas mais diversas regiões do Brasil e outros países tropicais. Pela

vasta bibliografia acerca dessas doenças tropicais, existe um consenso de que

compostos que apresentem atividade tripanosomicida, principalmente os obtidos

de extratos de plantas de uso popular, precisam ser mais bem investigados.

Nolasco (1996) considera que as perspectivas comerciais de utilização

dos óleos essenciais são excelentes, pelas finalidades a que se destinam. O uso

desses óleos na terapia é um conceito que precisa ser amplamente estudado, pelo

potencial que representam nas formulações farmacêuticas, além de um número

69

bastante amplo de vegetais existentes nas diversas regiões, onde os habitantes

locais poderiam fazer mais uso e com maior segurança dessas espécies.

1.3 Óleos essenciais de eucalipto

Os óleos essenciais referem-se a um grupo de substâncias naturais

aromatizantes, que são extraídas de diversas partes de alguns vegetais por meio

de destilação por arraste com vapor d’água ou obtidas ao se espremer pericarpos

cítricos. São substâncias líquidas constituídas de numerosos compostos voláteis,

com tensões de vapor elevadas, odoríferos, insolúveis em água, porém solúveis

em álcool e em vários solventes imiscíveis na água. Também são descritos como

óleos voláteis, óleos etéreos ou essências (Simões et al., 2004).

Das espécies do gênero Eucalyptus (Myrtaceae), cerca de 20 espécies

produzem óleos essenciais e são citadas comercialmente pela gama de

constituintes químicos identificados em cada óleo. Estes óleos encontram-se

divididos em três grupos em razão do seu uso final: óleos medicinais, óleos

industriais e óleos para perfumaria (Doran, 1991).

Óleos essenciais de eucaliptos com propriedades medicinais são aqueles

que apresentam em sua composição o 1,8-cineol. Entre as espécies produtoras

desse tipo de óleo, o E. globulus é uma das principais, apresentando teores de

30% a 90% de 1,8-cineol. Essa espécie não é muito cultivada no Brasil, razão

pela qual existem estudos com outras espécies como E. camaldulensis,

E. smithii, E. tereticornis e E. dives (var. cineol), que também apresentam cineol

na composição de seus óleos, com rendimentos variados em cada espécie (Vitti

& Brito, 2003).

Óleos essenciais contendo cineol ou eucaliptol são utilizados em

preparações e produtos farmacêuticos, em loções para uso local como anestésico

suave e anti-séptico. A eucaliptona, outro constituinte extraído das folhas,

70

apresenta ação contra Streptococcus mutans, S. sobrinus e outras bactérias

cariogênicas. O extrato aquoso das folhas e o óleo essencial de Eucalyptus

globulus mostraram-se ativos contra Staphylococcus aureus (Matos et al., 2004).

Segundo Franceschini Filho (2004), em pesquisa realizada na

Universidade Estadual Paulista - UNESP Araraquara, constatou-se que os óleos

essenciais de E. citriodora, E. maculata e E. tereticornis mostraram-se capazes

de impedir a reprodução da bactéria Mycobacterium tuberculosis, causadora da

tuberculose, pois devido à sua solubilidade em gordura, atravessam a membrana,

fazendo com que suas substâncias bactericidas atuem diretamente dentro do

bacilo.

Schnitzler et al. (2001), em avaliações dos óleos essenciais de melaleuca

e eucalipto contra o Vírus da Herpes Simples (HSV), constataram o efeito

anti-viral e indicaram essas espécies como promissoras nos tratamentos como

agentes anti-virais em infecções recorrentes de herpes.

Nesse contexto, com o presente trabalho objetivou-se identificar os

constituintes químicos do óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis Denhn e

avaliar o efeito desse óleo sobre o protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas

samuelpessoai.

71


O material vegetal utilizado foi obtido no reflorestamento da Gerdau

Florestal em Bom Sucesso, Minas Gerais (20º58’S, 44º48’W e 950 m alt.). Essa

região apresenta clima do tipo Cwb pela classificação climática de Köeppen,

caracterizado por verão chuvoso e inverno seco e precipitação média anual de

1.411 mm, sendo a temperatura média anual de 19,3 ºC. Foram utilizadas folhas

frescas de Eucalyptus camaldulensis Dehnh. colhidas em janeiro de 2005.


7,0 m de altura), de rebrotas com um corte realizado aos sete anos. As folhas

colhidas situavam-se no terço inferior da plantas, de ramos com diâmetro

inferior a 1,5 cm.


por planta, totalizando quatro quilogramas das 20 plantas do talhão considerado.

Em seguida, essas foram homogeneizadas e retiradas amostras de 50 gramas

cada uma, constituindo uma amostra. Foram utilizadas três amostras/repetições

para as extrações de óleo e avaliações de umidade das folhas frescas e de

rendimento de óleo essencial. Para o ensaio biológico, as três amostras de óleo

essencial, obtidas por meio da hidrodestilação, foram misturadas, de onde foi

retirada uma amostra de 1 mL.

Para a determinação do teor de umidade das folhas, utilizou-se o Sistema


de solventes; nesse caso, o ciclohexano e a água, conforme Pimentel et al.

(2006).

Para a obtenção do óleo essencial das folhas frescas, utilizou-se o

aparelho Clevenger modificado. As amostras (50 g) foram acondicionadas em

balões, juntamente com 500 mL de água destilada. A extração foi realizada no

72

período de duas horas, conforme Matos (1988). Para a separação do óleo,

utilizou-se o método de centrifugação do hidrolato numa centrífuga de cruzeta

horizontal (raio = 5 cm) e centrifugado a 4.500 rpm (aproximados

1.130 forças g) por 60 segundos, conforme estudos preliminares (Castro et al.,

2005). As extrações de cada tratamento foram realizadas em três repetições. O

rendimento médio do óleo essencial obtido foi calculado com base na matéria

seca ou Base Livre de Umidade, e apresentado em volume de óleo produzido por

quantidade de folhas secas (%v/p BLU) (Pimentel et al., 2006).











decomposição 1.000; intervalo de decomposição de 0,50; e fragmentos de

45 Daltons a 450 Daltons decompostos. Injetou-se, nas mesmas condições das

amostras, uma mistura de hidrocarbonetos (C9H20; C10H22: C11H24; ... C24H50;

C25H52 e C26H54). A identificação dos constituintes foi realizada

comparando-se os espectros obtidos com os do banco de dados do aparelho e

pelo índice de Kovats calculado para cada constituinte, conforme Adams (1995).



utilizando-se um aparelho Shimadzu GC–17A nas seguintes condições


73


inicial de 40 ºC até 240 ºC; gás carreador nitrogênio (2,2mL min-1); taxa de split

1:10; e volume injetado de 1 µL (1% de solução em diclorometano) e pressão na

coluna de 115 KPa. A quantificação de cada constituinte foi realizada por meio

de normalização de áreas (%).

Foram utilizadas culturas axênicas de Herpetomonas samuelpessoai,

mantidas a 28 ºC em meio Brain Heart Infusion (BHI) contendo 10% de soro

fetal bovino, com passagens a cada 24 horas. Uma solução-estoque de óleo

essencial de Eucalyptus camaldulensis foi preparada com 2 g mL-1 em

dimetilsulfóxido (DMSO), seguindo-se de diluição em meio BHI a 1:100

(concentração final do óleo: 20 mg mL-1); nessas condições, a concentração final

de DMSO é de 0,01% e não apresenta efeito tóxico sobre as células. Esse meio

foi, então, diluído no momento de uso, de modo a se obter diferentes

concentrações de trabalho do óleo essencial (10, 1 e 0,1 mg mL-1).

Os protozoários (5x106 células mL-1) foram incubados por 24 horas a

28 ºC em placas de 24 poços contendo o meio BHI com as diferentes

concentrações do óleo. Após o tempo de incubação, realizou-se a contagem das

células em um hemacitômetro (câmara de Neubauer), em microscópio ótico com

objetiva de 40 vezes. O experimento foi realizado em triplicata, sendo os

resultados expressos em porcentagem de inibição de crescimento da população

de protozoários em 24 horas para cada concentração utilizada. Com base nesses

dados, foi calculado o valor da dose IC50, isto é, a concentração de óleo essencial

que inibiu o crescimento das culturas dos parasitas em 50%.

74


A umidade das folhas jovens e frescas de Eucalyptus camaldulensis

Dehnh. colhidas em janeiro e avaliado pelo Sistema de Dean & Stark, indicou

um teor médio de 57% para as três amostras. Esta consideração deve-se ao fato

de que a umidade, em termos de massa absoluta de material úmido, pode

conduzir a rendimentos diferentes com interpretações distintas, conforme

pesquisa com óleo essencial de E. smithii R.T. Baker, realizada por Fabrowski

(2002).

O óleo essencial, extraído dessas folhas, foi avaliado em Base Livre de

Umidade, e o resultado obtido indicou um rendimento médio das três amostras

de 2,80% v/pBLU.

Na identificação e quantificação dos constituintes químicos no óleo

essencial, extraído de folhas frescas de E. camaldulensis colhidas em janeiro no

município de Bom Sucesso, MG, analisados por CG-EM e CG com detector FID

das amostras, os resultados indicaram a presença de nove constituintes, sendo o

1,8-cineol o mais abundante com 59,43%. Na Tabela 4.1 são apresentados esses

constituintes com seus teores e respectivos índices de Kovats.

75

TABELA 4.1. Teores (%) dos constituintes identificados no óleo essencial extraído de folhas frescas de E. camaldulensis Dehnh. colhidas em janeiro de 2005 em Bom Sucesso, MG. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Constituintes IK % no óleo essencial

α-Pineno 939 0,75 β-Pineno 980 0,52 1,8-Cineol 1.033 59,43 4-Terpineol 1.177 2,93 α-Terpineol 1.189 9,10 (E)-Farneseno 1.458 4,06 Ledol 1.565 1,86 Globulol 1.583 13,37 Viridiflorol 1.590 3,26 Outros -- 4,72

Total 100,0

Fabrowski (2002), em pesquisa de óleo essencial de E. smithii R.T.

Baker., encontrou maiores teores de 1,8-cineol (85,16%) em folhas adultas

colhidas no verão, seguindo-se da colheita realizada no outono (82,34%),

primavera (80,44%) e inverno (78,25%).

Chalchat et al., (2001) encontraram teores variados de 1,8-cineol no

E. camaldulensis, entre 69% a 75% na Tailândia, de 72% a 84% na Austrália e

Marrocos, de 43% a 55% na Turquia e Burundi e de 29% no Sri Lanka e

Austrália; nesse último local, os constituintes variaram também conforme a

época de colheita.

No ensaio biológico, o óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis

Dehnh. apresentou efeito inibitório sobre o crescimento celular de

Herpetomonas samuelpessoai, de uma maneira dose-dependente. Pelos dados

obtidos e apresentados na Figura 4.1, pode-se observar que o crescimento foi

inibido em 55,4%, 62,3% e 96,2% nas concentrações de 0,1, 1 e 10 mg mL-1,

76

respectivamente. A dose que inibiu 50% do crescimento celular (IC50) foi

estimada em aproximadamente 90,1 µg.mL-1.

55,462,3

96,2

0

25

50

75

100

0,0 0,1 1,0 10,0

Concentração do óleo essencial de E. camaldulensis – mg mL-1

Índi

ce d

e In

ibiç

ão d

e C

resc

imen

to

FIGURA 4.1. Resultado do efeito do óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis Dehnh. sobre o crescimento do protozoário tripanosomatídeo Herpetomonas samuelpessoai. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Efeito similar sobre o crescimento de culturas de Herpetomonas

samuelpessoai foi obtido no tratamento com óleo essencial de Ocimum

gratissimum, e esse apresentou um IC50 que variou de 90 mg mL-1 a

100 mg mL-1 (Holetz et al., 2003).

O óleo essencial de E. camaldulensis demonstrou atividade contra o

protozoário H. samuelpessoai. Em outros estudos, demonstrou-se que alguns

77

óleos essenciais de eucaliptos apresentaram um potencial efeito microbicida.

Assim, o extrato aquoso das folhas e o óleo essencial de Eucalyptus globulus

mostraram-se ativos contra Staphylococcus aureus (Matos et al., 2004), ao passo

que óleos essenciais de E. citriodora, E. maculata e E. tereticornis mostraram-se

capazes de impedir a reprodução da bactéria Mycobacterium tuberculosis

(Franceschini Filho, 2004). Óleos essenciais de eucalipto também apresentaram

efeitos antivirais, sendo ativos contra o Vírus da Herpes Simples (Schnitzler et

al., 2001).

O óleo essencial de E. camaldulensis é rico em 1,8-cineol (59,43%), que

possivelmente é o principal componente que atua sobre o tripanosomatídeo

H. samuelpessoai. Sabe-se que esse óleo tem efeito como anestésico suave e

anti-séptico (Matos et al., 2004). Sua característica anestésica é conseqüente de

sua solubilidade em lipídeos, facilitando, assim, a sua penetração através das

membranas celulares, podendo, então, atuar diretamente em alvos dentro das

células. Mais estudos são necessários para se verificar que organelas ou vias

metabólicas do protozoário estão sendo atingidas pelo óleo essencial de

E. camaldulensis.

78

4 CONCLUSÕES

O Eucalyptus camaldulensis Dehnh. cultivado na região de Bom Sucesso

apresentou rendimento satisfatório de óleo essencial, com teores intermediários

de 1,8-cineol, seu constituinte majoritário.

Pelos resultados do efeito inibitório do óleo essencial de

E. camaldulensis sobre a Herpetomonas samuelpessoai, verificou-se que esse

óleo é um potencial agente fitoterápico para o controle de protozoários

tripanosomatídeos e de outros parasitos que afetam a saúde humana.

São sugeridas, mais investigações sobre esse óleo essencial, e sua

atividade inibitória sobre o crescimento de protozoários.

79



CARREIRA, J.C.A. O ciclo extracelular do Trypanosoma cruzi: cinética de colonização nas glândulas de cheiro do gambá (Didelphis marsupialis), a interação entre diferentes subpopulações do parasita e o papel dos Glicoinositolfosfolipídeos (GIPLS) nesta interação "in vitro" "in vivo". 2001. 100p. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária)-Fundação Oswaldo Cruz-Rio de Janeiro.


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82

ANEXO

TABELA 1A. Resultados das análises de solo realizadas nas três áreas utilizadas para colheita de folhas jovens e frescas de Eucalyptus em municípios de Minas Gerais. UFLA, Lavras – MG, 2006.

Atributos Bom Sucesso São Bento Abade São João del Rei

pH em água 4,8 4,9 5,4 P (mg/dm3) 0,9 2,4 0,9 K (mg/dm3) 30,0 46,0 20,0 Ca (cmolc/dm3) 0,4 0,5 0,4 Mg (cmolc/dm3) 0,2 0,5 0,4 Al (cmolc/dm3) 0,6 1,0 0,5 H + Al (cmolc/dm3) 5,2 5,8 3,4 S (cmolc/dm3) 0,7 1,1 0,9 T (cmolc/dm3) 5,9 6,9 4,3 V (% dag/kg) 11,9 15,9 20,9 MO (% dag/kg) 2,5 3,0 1,9 B (mg/dm3) 0,2 0,3 0,3 Zn (mg/dm3) 0,6 1,4 0,8 Cu (mg/dm3) 2,9 1,4 1,9 Fe (mg/dm3) 47,6 54,5 40,7 Mn (mg/dm3) 10,1 30,4 4,4 S-SO4 (mg/dm3) 2,7 12,6 2,7 P-rem (mg/L) 14,4 17,2 15,2

caracterizaÇÃo fitoquÍmica de Óleos essenciais de

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