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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
BRUNO BATISTA DE SOUZA
ASPECTOS GENÉTICOS DO GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO
CAMPINAS
2017
2
BRUNO BATISTA DE SOUZA
ASPECTOS GENÉTICOS DO GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução.
Orientadora: Profa Dra Mônica Barbosa de Melo
Campinas
2017
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO BRUNO BATISTA DE SOUZA E
ORIENTADA PELA MÔNICA BARBOSA DE
MELO.
3
FICHA CATALOGRÁFICA
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Campinas, 30 de Agosto de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.(a) Dr.(a). Mônica Barbosa de Melo (orientadora)
Prof.(a). Dr.(a) Mônica Alves
Prof.(a) Dr(a). Cláudia Vianna Maurer-Morelli
Prof. Dr. Marcelo de Lima Ribeiro
Prof. Dr. Niro Kasahara Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
5
DEDICATÓRIA
“Nenhum trabalho de qualidade pode
ser feito sem concentração e auto-
sacrifício, esforço e dúvida”
(Max Beerbohm)
Dedicado à minha esposa Erika e meu
filho Davi
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Profa. Mônica pela minha formação científica, por sua paciência
e inestimável contribuição durante todos esses seis anos de trabalhos.
Agradeço ao meu coorientador Prof. Dr. José Paulo por todos os ensinamentos e contribuição
para minha formação científica.
Agradeço à Daniela Stancato pelas várias ajudas concedidas.
Agradeço aos colegas e amigos do laboratório de genética humana, pelo companheirismo e
momentos de descontração. Obrigado Ana Maria, Ana Luiza, Gislene, Galina, Milena, Paulo,
Pedro, Gabriela, Mirta e Sueli pela companhia, amizade e paciência.
Agradeço à todos os amigos do CBMEG, em especial Letícia pelo companheirismo durante
esses anos
Agradeço aos meus pais, que me deram todo apoio quando decidi seguir carreira acadêmica.
Agradeço à minha esposa Erika pela paciência nessa caminhada e ao meu filho Davi, peças
fundamentais em minha vida e razões do meu esforço.
Por fim, agradeço ao CNPq pela bolsa e financiamento imprescindíveis para a realização deste
projeto
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RESUMO
O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível no mundo, acometendo cerca de
70 milhões de indivíduos, com pelo menos 6,8 milhões de pessoas apresentando cegueira
bilateral. As formas mais comuns são o glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), seguido
pelo glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF). O GPAF é caracterizado por uma alteração
anatômica na íris periférica, a qual leva ao bloqueio do fluxo do humor aquoso com
consequente elevação da pressão intraocular (PIO). Suas formas clínicas incluem a crise aguda,
processo tipicamente unilateral, mais agressivo e sintomático, levando a fortes dores oculares,
dores de cabeça, visão borrada, náuseas e vômitos, e fechamento angular crônico, processo
geralmente indolor e assintomático. Existe uma série de fatores predisponentes que foram
extensivamente estudados na tentativa de explicar as variações populacionais e raciais na
prevalência do GPAF. Além de fatores como sexo, idade e etnia, fatores anatômicos como 1)
posição basal da íris, 2) medida da pressão diferencial e 3) resistência do canal íris-lente podem
também contribuir para o desenvolvimento da doença. As predisposições étnicas e gênero-
específicas e também o histórico familiar sugerem uma base genética para o desenvolvimento
do GPAF. Dois Genome Wide Association Studies (GWAS) confirmaram a associação entre os
loci rs11024102, rs3753841 e rs1015213 e o desenvolvimento do GPAF. O presente estudo
propôs o estudo de características genéticas do GPAF em uma amostra de nossa população por
meio da replicação dos loci previamente associados ao desenvolvimento da doença e o
sequenciamento de exomas em duas famílias informativas para o GPAF. O estudo dos SNPs
rs11024102, rs3753841 e rs1015213 não evidenciou associação entre os SNPs e o
desenvolvimento do GPAF ou suas formas clínicas em nossa população. O estudo de exomas
não evidenciou qual gene poderia estar causando a doença em ambas as famílias.
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ABSTRACT
Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide, affecting
approximately 70 million individuals, with at least 6.8 million people presenting bilateral
blindness. The most common forms are primary open-angle glaucoma (POAG), followed by
primary angle-closure glaucoma (PACG). Primary angle-closure glaucoma is characterized by
an anatomical alteration in the peripheral iris, which leads to blockage of the aqueous humor
outflow and consequent elevation of intraocular pressure (IOP). Its clinical forms include acute
attacks, typically unilateral, more aggressive and symptomatic process, leading to severe eye
pain, headaches, blurred vision, nausea and vomiting, and chronic angle closure, a process that
is painless and asymptomatic. A number of predisposing factors are extensively studied in an
attempt to explain geographic and racial variations in the prevalence of PACG. In addition to
factors such as sex, age and ethnicity, anatomical factors such as 1) basal iris position, 2)
differential pressure measurement, and 3) iris-lens resistance may also contribute to the
development of the disease. Ethnical and gender-specific predispositions as well as family
history suggest a genetic basis for the development of PACG. In an attempt to better
comprehend the genetic aspects of PACG in a sample of the Brazilian population, two
strategies have been used. A replication study was conducted in order to verify the frequency of
rs11024102, rs3753841 and rs1015213 in PACG cases and controls as well as to determine
their association with the disease and its clinical characteristics. These loci have been
associated with the disease in two previous studies. Simultaneously, the evaluation of two
informative families harboring PACG has been performed through exome sequencing. Our
results showed no association between rs11024102, rs3753841 and rs1015213 with PACG
development, as well as with its clinical forms. The exome study could not detect which gene
might be responsible for the development of the disease in both studied families.
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LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
C1QTNF8 C1q And Tumor Necrosis Factor Related Protein 8
CHX10 retinal homeobox 10
CIP Conteúdo Informativo do Polimorfismo
COL11A1 Collagen Type XI Alpha 1 Chain
CQ Controle de qualidade
CTBP2 C-Terminal Binding Protein 2
DHR Doenças hereditárias da retina
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTP didesoxinucleotídeos
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
FALS Esclerose lateral amiotrófica familial
FKBP15 FK506 binding protein 15
FREM2 FRAS1-related extracellular matrix protein 2
GPAA Glaucoma primário de ângulo aberto
GPAA-J Glaucoma primário de ângulo aberto juvenil
GPAF Glaucoma primário de ângulo fechado
GCP Glaucoma congênito primário
GPN Glaucoma de pressão normal
GPR137 G Protein-Coupled Receptor 137
GWAS Genome-wide association study
HGF Hepatocyte growth factor
HSDL2 Hydroxysteroid Dehydrogenase Like 2
HWE Hardy-Weinberg Equilibrium
IC Intervalo de confiança
ITGAE Integrin Subunit Alpha E
LIMS2 LIM Zinc Finger Domain Containing 2
LRRN2 Leucine Rich Repeat Neuronal 2
MFRP Membrane Frizzled-Related Protein
mmHg milímetros de mercúrio
MMP9 Matrix metallopeptidase 9
MTHFR Methylenetetrahydrofolate reductase
ng nanogramas
NID2 Nidogen 2
NNO1 Nanophthalmos 1
OCT Optic Coherence Tomography
OR Odds ratio
PCA análise de componente principal
PCR reação em cadeia da polimerase
RNA ácido ribonucléico
PCMTD1 Protein-L-Isoaspartate (D-Aspartate) O-Methyltransferase Domain Containing 1
PIO Pressão intra-ocular
PLEKHA7 Pleckstrin Homology Domain Containing A7
SNP Polimorfismo de base única
SPA sinéquias periféricas anteriores
ST18 suppression of tumorigenicity 18
TMF1 TATA Element Modulatory Factor 1
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SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................................................... 7
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 8
INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 12
Glaucoma .................................................................................................................................. 12
GPAF: Definição, etiologia e critérios de classificação .................................................................. 13
Fatores de risco ......................................................................................................................... 16
Epidemiologia ............................................................................................................................ 19
Genética envolvida no GPAF ...................................................................................................... 22
JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................... 31
OBJETIVOS GERAIS ........................................................................................................................ 32
CAPÍTULO I .................................................................................................................................... 33
OBJETIVOS GERAIS ..................................................................................................................... 34
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 34
CASUÍSTICA E MÉTODOS ............................................................................................................ 34
Casuística ............................................................................................................................... 34
Grupo caso ............................................................................................................................. 34
Critérios de inclusão e avaliação oftalmológica ....................................................................... 34
Critérios de exclusão .............................................................................................................. 35
Grupo controle ....................................................................................................................... 35
Extração de DNA e genotipagem dos SNPs .............................................................................. 36
Análise estatística .................................................................................................................. 37
RESULTADOS ............................................................................................................................. 37
DISCUSSÃO ................................................................................................................................ 40
CAPÍTULO II ................................................................................................................................... 43
Utilização de exomas para a identificação de variantes associadas a doenças .............................. 44
OBJETIVOS GERAIS ..................................................................................................................... 46
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 46
CASUÍSTICA E MÉTODOS ............................................................................................................ 46
Famílias submetidas à análise de exomas................................................................................ 46
Grupos para confirmação dos achados nos exomas ................................................................. 47
Grupo caso ............................................................................................................................. 47
Critérios de inclusão e avaliação oftalmológica ....................................................................... 47
Critérios de exclusão .............................................................................................................. 48
Grupo controle ....................................................................................................................... 48
Extração de DNA e preparação das bibliotecas para estudo de exomas .................................... 49
Análise Bioinformática ........................................................................................................... 49
Validação dos achados no estudo de exomas .......................................................................... 50
RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................ 51
Controle de Qualidade............................................................................................................ 51
Filtragem dos dados e identificação de variantes .................................................................... 54
Outros achados no sequenciamento de Exomas ...................................................................... 58
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................... 60
11
ANEXO I – FOLHA DE ROSTO DO CONEP ......................................................................................... 74
ANEXO II – TEMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ........................................................ 76
ANEXO III – DADOS CLÍNICOS DOS INDIVÍDUOS PERTENCENTES AO GRUPO CASO ........................... 81
ANEXO IV – DADOS CLÍNICOS DAS FAMÍLIAS ENVOLVIDAS NO ESTUDO DE EXOMAS ....................... 85
ANEXO V – PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP CONTENDO APROVAÇÃO DO SUBPROJETO “ASPECTOS GENÉTICOS DO GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO” COMO ADENDO AO PROJETO “ASPECTOS GENÉTICOS DE DOENÇAS OFTALMOLÓGICAS” ............................................... 87
ANEXO VI – DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS ......................................................................... 91
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INTRODUÇÃO
Glaucoma
O termo Glaucoma refere-se a um grupo de neuropatias ópticas caracterizadas pela
degeneração progressiva e deterioração funcional do nervo óptico (Figura 1), frequentemente
associada a níveis elevados de pressão intraocular (PIO > 21 mmHg), resultando em perda
progressiva da visão periférica e cegueira, caso não seja tratado adequadamente (Quigley &
Broman 2006, Kwon et al. 2009, Weinreb, Aung & Medeiros 2014).
Figura 1: Evolução da deterioração do nervo óptico, em consequência da perda de
células ganglionares da retina (modificado de:
http://www.oftalmologistabh.com.br/wp-content/uploads/2014/10/glaucoma-
evolu%C3%A7%C3%A3o.jpg)
O glaucoma é, mundialmente, a maior causa de cegueira irreversível, com mais de 70
milhões de pessoas afetadas pela doença. Acredita-se que aproximadamente 10% dos
indivíduos glaucomatosos sejam cegos bilateralmente (Weinreb, Aung & Medeiros 2014), e
que mais da metade dos indivíduos desconhecem que são afetados pela doença, pelo fato desta
não apresentar sintomas até atingir seu quadro mais grave (Quigley & Broman 2006). A
redução da acuidade visual em indivíduos com glaucoma é decorrente da perda de axônios das
células ganglionares da retina, sendo que os efeitos da perda da campo visual em um indivíduo
glaucomatoso se dão a partir de 40% de perda de axônios (Quigley 1999).
Os glaucomas podem ser classificados em primários (causa desconhecida) ou
secundários (a causa pode ser identificada através de exame clínico) (Weinreb & Khaw 2004).
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Podem também ser classificados de acordo com o aspecto do seio camerular em aberto ou
fechado (Leske 1983) (Figura 2). As formas mais comuns de glaucoma são: glaucoma primário
de ângulo aberto (GPAA), glaucoma de pressão normal (GPN), glaucoma pseudoexfoliativo e
glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF), sendo o GPAA a forma mais comum da doença
(Quigley & Broman 2006). Os glaucomas primários podem ser classificados também de acordo
com a idade em: congênito (GPC) quando presente ao nascimento, juvenil (GPAA-J) quando o
desenvolvimento ocorre antes dos 40 anos e GPAA adulto (Weinreb & Khaw 2004).
Figura 2: Classificação dos tipos de glaucoma de acordo com o aspecto do seio
camerular. Em A) Glaucoma primário de ângulo aberto, em B) Glaucoma primário
de ângulo fechado (http://franciscolima.com/pt-br/tipos-glaucoma).
GPAF: Definição, etiologia e critérios de classificação
O GPAF é caracterizado pela aposição da íris periférica contra a malha trabecular,
resultando em obstrução no fluxo do humor aquoso (Figura 3), causado por um ângulo já
estreito, com consequente elevação da PIO (Yanoff & Duker 2014). O processo de fechamento
angular primário pode levar ao aumento da pressão intraocular (PIO) e, eventualmente, ao
desencadeamento da neuropatia óptica glaucomatosa. Quando todas estas condições estão
presentes, define-se o GPAF (Foster et al. 2002).
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Figura 3: Esquema evidenciando o bloqueio no fluxo do humor aquoso pela aposição
da íris periférica contra a malha trabecular (modificado de:
http://www.drbrendancronin.com.au/angle_closure_glaucoma/).
Os mecanismos mais comumente identificados de fechamento angular primário são:
bloqueio pupilar e íris em plateau. No bloqueio pupilar, a dilatação da pupila aumenta o
contato da porção posterior da íris com a superfície anterior do cristalino, o que causa aumento
na resistência do fluxo do humor aquoso da câmara posterior para a câmara anterior.
Consequentemente, tal processo cria um gradiente de pressão entre as câmaras posterior e
anterior, fazendo com que a íris periférica seja projetada anteriormente, resultando em um
fechamento angular que bloqueia a passagem do humor aquoso pela malha trabecular.
Repetidos episódios de bloqueio pupilar podem produzir aumentos intermitentes de PIO, além
de levar ao desenvolvimento de sinéquias anteriores periféricas (Sihota 2011).
A íris em plateau ocorre quando o corpo ciliar é posicionado anteriormente ou girado
adiante, causando deslocamento anterior da íris periférica em relação à malha trabecular,
levando ao fechamento aposicional do ângulo iridocorneal. Tal condição pode desencadear
fechamento angular persistente ou fechamento angular acompanhado de elevação da PIO em
consequência da dilatação pupilar mesmo na presença de uma iridectomia, procedimento que
cria um desvio que permite o fluxo do humor aquoso da câmara posterior à câmara anterior
15
(Kumar et al. 2009, Cho et al. 2017). Estudos recentes mostram que íris em plateau pode estar
presente em mais de um terço dos casos de GPAF (Kumar et al. 2008).
A classificação clássica do GPAF é baseada na apresentação clínica, dividindo-o em
agudo e crônico. A forma aguda pode ainda ser dividida em crise aguda, subaguda ou crises
intermitentes dependendo da intensidade e presença dos sintomas e sinais apresentados
incluindo redução abrupta da acuidade visual e dor ocular; a forma crônica é assintomática
(Salmon 1993, Quigley, Friedman & Congdon 2003). O fechamento angular agudo é
tipicamente unilateral, mais agressivo e sintomático, levando a fortes dores oculares, dores de
cabeça, visão borrada, náuseas e vômitos (Ritch, Shields & Krupin 1996). Neste estágio, a
periferia da íris fecha rápida e completamente toda a malha trabecular (fechamento angular
agudo primário), levando à súbita e sintomática elevação da PIO. Na crise subaguda, os
sintomas são menos severos e a PIO pode retornar espontaneamente a valores normais.
Em contraste, no fechamento angular crônico, a íris cobre lentamente porções da malha
trabecular, levando a sinéquias periféricas anteriores (SPA). As SPAs podem ser discretas ou
multi-centradas no início e, gradualmente se expandirem ou se fundirem. A PIO é
gradualmente elevada durante um longo período de tempo. Tal processo é geralmente indolor e
assintomático (Sun et al. 1994, Wright et al. 2016).
Outra classificação é baseada na evolução clínica e no mecanismo de fechamento
angular. Nesta classificação, o estágio inicial é o de suspeito de fechamento angular primário.
Tal termo é utilizado para caracterizar pacientes que possuem maior risco de sofrer fechamento
angular primário. A identificação desta condição se baseia na impossibilidade de se observar, à
gonioscopia, a porção pigmentada da malha trabecular em 180o ou mais, sem manobras
complementares, em posição primária do olhar, em ambiente escuro, com fenda luminosa
estreita e sem iluminar a pupila para evitar a abertura do ângulo (Foster et al. 2002). O estágio
16
seguinte seria esta mesma condição acompanhada de disfunção trabecular caracterizada pela
presença de sinéquias periféricas anteriores e/ou aumento da PIO, classificado como
fechamento angular primário. O GPAF seria constituído pelo fechamento angular primário
associado à neuropatia glaucomatosa (Foster et al. 2002).
Fatores de risco
Existe uma série de fatores predisponentes que foram extensivamente estudados na
tentativa de explicar as variações geográficas e raciais na prevalência do GPAF. Entre os
fatores de risco demográficos incluem-se idade, sexo e etnia (Lowe 1973). Em média, o GPAF
é 3 vezes mais comum em populações asiáticas, em comparação com populações européias
(Foster et al. 1996, Dandona et al. 2000, Foster et al. 2000). Em europeus, o GPAF compreende
6% de todos os casos reportados de glaucoma (Lowe 1973). Por outro lado, em chineses, a
doença corresponde a 47,5% de todos os casos de GPAF no mundo e, é provável que o GPAF
seja responsável pela grande maioria (91%) de cegueira bilateral nesta população. Estima-se
também que 28 milhões de chineses possuam ângulo oclusível (Foster & Johnson 2001,
Quigley, Congdon & Friedman 2001, Sun 2009).
Além de fatores geográficos e população-específicos, a incidência da doença também
aumenta com a idade (Foster et al. 1997). As manifestações de danos oculares como resultado
do GPAF são raramente observadas em pacientes com idade abaixo dos 40 anos. Além disso,
mulheres possuem maior chance de desenvolver GPAF em relação aos homens (Foster et al.
1997, Vajaranant et al. 2010). Estudos mostram que mulheres representam 59% de todos os
casos de glaucoma, alcançando 70% dos casos de GPAF (Thylefors et al. 1995, Quigley &
Broman 2006).
Alguns fatores anatômicos contribuem para que ocorra o fechamento angular: 1)
posição basal da íris, 2) medida da pressão diferencial, e 3) resistência do canal íris-lente. O
17
olho com GPAF, tipicamente apresenta câmara anterior rasa, maior espessura da lente,
hipermetropia e menor tamanho axial (Ritch 1979, Nazm et al. 2009).
Com o aumento do uso de novos métodos de acesso à câmara anterior, como
biomicroscopia e tomografia de coerência óptica ou OCT, parâmetros de segmento anterior
podem ser medidos com mais precisão, entretanto, alguns ângulos fechados não são totalmente
explicados por tais fatores anatômicos, tais como posição basal da íris, medida da pressão
diferencial e resistência do canal iris-lente. Medidas quantitativas mostram que a posição do
processo ciliar é uma diferença importante entre olhos de pacientes com ângulo fechado e olhos
de indivíduos normais, por exemplo, o processo ciliar é girado mais anteriormente em pacientes
com GPAF (Marchini et al. 1998). Uma íris que apresente maior curvatura, que seja mais
volumosa e mais espessa está independentemente associada com ângulo estreito (Wang et al.
2010), tendo sido demonstrado que a espessura da íris possui papel no desenvolvimento do
ângulo fechado e, ultimamente no GPAF (Wang et al. 2013). Menor área e volume da câmara
anterior foram independentemente associados à presença de ângulos estreitos, mesmo após
controle para outros parâmetros biométricos, como profundidade da câmara anterior e
comprimento axial (Wu et al. 2011).
A largura da câmara anterior pode ser indicada como novo fator de risco, sendo que
Nongpiur et al. (2010) notaram que a largura da câmara anterior estava associada com ângulo
estreito, independentemente de idade, gênero e comprimento axial, em dois diferentes estudos
na população de Cingapura (Nongpiur et al. 2010). Congdon et al (1997) mostraram que o
volume da câmara anterior era 25% menor em pacientes com GPAF quando comparados a
indivíduos com olhos normais. Tais características anatômicas do GPAF são, em parte, devido
à posição ou tamanho da lente que está fora de proporção em relação ao globo ocular (Lowe
1970, Phillips 1972). Acredita-se que a lente desempenhe um papel crucial na patogênese do
fechamento angular tanto pelo aumento da sua espessura quanto pelo seu posicionamento mais
18
anterior, resultando em aglomeração angular e maior predisposição ao bloqueio pupilar
(Marchini et al. 1998, Nongpiur et al. 2011). A espessura da lente aumenta com a idade,
fazendo com que um ângulo já estreito fique ainda mais estreito, o que pode ser uma explicação
para o fato de a maioria dos casos de GPAF acometerem indivíduos com idade acima dos 40
anos (Sun et al. 2017).
Uma questão que ainda persiste é a razão de alguns olhos com fechamento angular
desenvolverem crise aguda enquanto outros desenvolvem glaucoma crônico. Estudos anteriores
já mostraram que existem diferenças significantes em parâmetros do segmento anterior quando
olhos com glaucoma agudo são comparados com olhos com glaucoma crônico (Sun et al.
1994). Mais evidências de diferenças biométricas importantes no GPAF agudo e crônico foram
reportadas quando foram realizadas medidas de tais olhos por biomicroscopia. O GPAF crônico
é caracterizado por um segmento anterior menos agrupado, quando comparado ao GPAF agudo
(Marchini et al. 1998). Sihota et al (2005) mostraram que o GPAF agudo apresenta um ângulo
mais estreito e menor processo ciliar quando comparado ao GPAF crônico. Olhos com GPAF
agudo apresentam maior desvio da normalidade quando comparados a olhos com GPAF
crônico, em relação à espessura da lente, profundidade da câmara anterior e diâmetro corneal
(Sihota et al. 2000).
Claramente, uma menor biometria ocular é um fator de risco para o desenvolvimento de
GPAF agudo. Entretanto, podem existir outros fatores fisiológicos levando à crise aguda, visto
que nem todos os pacientes com ângulo estreito desenvolvem crise aguda durante a vida,
mesmo aqueles com nanoftalmo. A dilatação pupilar é um mecanismo comum que pode levar à
crise aguda, o que acontece com frequência quando indivíduos estão no escuro ou sob uso de
certos medicamentos. A largura do ângulo geralmente diminui com o aumento do diâmetro da
pupila e o fechamento aposicional pode ser desenvolvido quando a pupila apresenta dilatação
intermediária (Leung et al. 2007). Porém, Woo et al (1999) mostraram que o estreitamento
19
angular em olhos no escuro não está relacionado ao aumento do contato íris-lente mas sim a
alterações na íris, tais como encurtamento, aumento na espessura e maior abaulamento. Outro
mecanismo proposto para o GPAF agudo em olhos com predisposição anatômica é a expansão
coroidal, fazendo com que lente e íris se movimentem adiante (Phillips 1972). Porém, Yang et
al (2005) não encontraram alterações significantes na posição da lente, abaulamento, posição
relativa ou comprimento axial em olhos com GPAF agudo, quando estes foram acompanhados
por um período de duas semanas. Portanto, ainda é controverso se a expansão coroidal pode
desencadear crise aguda (Yang et al. 2005).
Epidemiologia
Com o envelhecimento da população, espera-se um aumento na prevalência e na
morbidade do glaucoma. Estima-se que, mundialmente, o número de pessoas com idade entre
40-80 anos com GPAF era de 20,17 milhões em 2013. Acredita-se que este número suba para
23,26 milhões em 2020 e 32,04 milhões em 2040. A Ásia compreende 77% de todos os casos
de GPAF (Tham et al. 2014) (Figura 4).
Figura 4. Evolução da prevalência do número de casos de A) Glaucoma primário de ângulo aberto; B)
Glaucoma primário de ângulo fechado; C) Glaucoma (Adaptado de Tham et al., 2014).
A prevalência do GPAF varia entre regiões geográficas e grupos étnicos. Nos últimos
15 anos, surgiram mais de 20 estudos baseados em populações que versam sobre a prevalência
do glaucoma, particularmente na Ásia. Tham et al (2014), mostraram que a prevalência do
20
GPAF é maior na Ásia (1.09%), sendo tal resultado consistente com revisões sobre GPAF
publicadas anteriormente (Quigley & Broman 2006). Dados também mostram que a
prevalência do GPAF na América Latina, Caribe (0.85%) e África (0.60%) é maior que a
prevalência na Europa (0.42%) e América do Norte (0.26%) (Sun et al. 2017).
Em muitos estudos populacionais, o GPAA é o tipo mais comum de glaucoma.
Entretanto, a maior prevalência do GPAF entre esquimós, chineses e mongóis já é conhecida há
muito tempo. Clemmesen & Alsbirk (1971) reportaram altas taxas de GPAF no povo Inuit da
Groelândia (Clemmesen & Alsbirk 1971). Desde então, vários estudos mostraram que as taxas
de GPAF na população Inuit é cerca de 20-40 vezes maior quando comparadas com taxas entre
caucasóides (Arkell et al. 1987, Alsbirk 1992). Dois estudos realizados no nordeste asiático,
mostraram que a prevalência do GPAF é maior que a do GPAA, sendo que um foi realizado na
província de Hovsgol na Mongólia (1,4% vs 0,5%) e outro na cidade de Harbin na China (1,6%
vs 0,7%) (Foster et al. 1996, Qu et al. 2011), sugerindo que o povo sino-mongol seja mais
susceptível ao GPAF do que ao GPAA. De uma perspectiva evolutiva do povo sino-mongol, foi
postulado que câmara anterior rasa pode ter evoluído como adaptação anatômica para que a
córnea resistisse às baixas temperaturas do nordeste Asiático durante a última era do gelo
(Casson 2008).
Dentre todos os estudos epidemiológicos asiáticos, o Meiktila Eye Study em Myanmar,
sul da Ásia, reportou a maior prevalência de GPAF (2,5%) (Casson et al. 2007). Em
comparação, a prevalência de GPAA também foi relativamente alta (2,0%) no mesmo estudo.
O Singapore Malay Eye Study reportou a menor prevalência (0,12%) na população malasiana
de Cingapura, enquanto que a prevalência de GPAF em chineses de Cingapura foi de 1,1%
(Shen et al. 2008).
21
Day et al (2012) mostraram que em indivíduos acima de 40 anos provenientes de
populações de origem européia, 0,4% são afetados pelo GPAF. Já na América Latina, Urbano
et al (2003), avaliando a frequência dos tipos de Glaucoma no Hospital das Clínicas da
Universidade Estadual de Campinas, observaram que GPAF correspondia por 20,4% do total
de casos de glaucoma atendidos no ambulatório. Já Sakata et al (2007), em um estudo regional,
mostraram que a prevalência do GPAF é de 0,7% de afetados na região sul do Brasil. Ambas as
estimativas são maiores que as relatadas em outros estudos de diferentes populações (0,1% e
0,25%) (Congdon, Wang & Tielsch 1992, Quigley & Broman 2006).
Por outro lado, estudos conduzidos em hospitais na China e em outros países asiáticos
mostraram que o GPAF é o tipo mais comum de glaucoma atendido em hospitais/clínicas,
apesar de também se observar aumento na proporção dos casos de GPAA. Na China, Sun et al
(2017) mostraram que o GPAF era responsável por 50%-55% do total dos casos de glaucoma,
ao passo que o GPAA era responsável por 25%-35% do total de casos (aproximadamente
60.000 visitas/ano), em um período de 5 anos. Entretanto, estudos realizados em hospitais estão
sujeitos a vieses, visto que GPAF agudo causa mais sintomas que o GPAA. Como pacientes
com GPAF estão mais sujeitos a buscar assistência médica, pode haver uma superestimação da
incidência de GPAF (Sun et al. 2010).
Em relação ao fato de suspeitos de fechamento angular primário evoluírem para GPAF,
Alsbirk et al (1992) reportaram que em uma coorte de esquimós da Groelândia, 8% de
indivíduos normais e 35% de suspeitos de fechamento angular primário progrediram para um
quadro de crise aguda ou GPAF dentro de um período de 10 anos (Alsbirk 1992). Um estudo
realizado no sul da Índia mostrou que 22% dos suspeitos de fechamento angular primário
progrediram para crise aguda em um período de 5 anos e 28,5% de pacientes com crise aguda
progrediram para GPAF durante o mesmo período (Thomas et al. 2003a, Thomas et al. 2003b).
22
Genética envolvida no GPAF
As predisposições étnicas e gênero-específicas sugerem uma base genética para o
desenvolvimento do GPAF em certas populações (Lowe 1972). O histórico familiar é um dos
maiores fatores de risco para o glaucoma e estimativas apontam que irmãos de pacientes
afetados possuem 3,7 vezes mais chances de desenvolver a doença em relação à população
normal (Alsbirk 1975, Alsbirk 1975). Em esquimós, a prevalência do GPAF em qualquer
parente de primeiro grau de indivíduos afetados é reportada como sendo, no mínimo, 3,5 vezes
maior que na população geral (Alsbirk 1976) e, um estudo populacional realizado na China
mostrou que qualquer histórico familiar de glaucoma confere um risco aumentado de 6 vezes
de se desenvolver a doença (Hu 1989). A herdabilidade do GPAF também foi indicada através
do estudo de gêmeos chineses monozigóticos e dizigóticos (He et al. 2008). Estudos prévios em
gêmeos chineses e em famílias nucleares também reportaram alta herdabilidade estimada para a
PIO, o que corrobora o papel de efeitos genéticos na segregação da PIO dentro das famílias
(van Koolwijk et al. 2007, He et al. 2008). Além disso, estudos mostraram que o tamanho da
câmara anterior é fortemente determinado por componentes genéticos, sugerindo que
características morfológicas que predispõem ao desenvolvimento do GPAF também são
herdadas (Alsbirk 1975, Alsbirk 1975).
Recentes avanços têm indicado vários genes e loci genéticos (Stone et al. 1997, Rezaie
et al. 2002, Monemi et al. 2005, Pasutto et al. 2009) que podem estar associados à etiologia do
GPAA, porém, em relação ao GPAF estes ainda são escassos. A primeira evidência de um
locus genético ligado ao GPAF familial provem da análise de uma grande família com
nanoftalmo, hipermetropia e GPAF. Tal estudo levou à identificação do gene nanophtalmos 1
(NNO1), localizado no cromossomo 11. O NNO1 é o único gene conhecido como causativo
para o GPAF (Othman et al. 1998).
23
Em contraste, um grande número de loci genéticos têm sido identificados, não como
causativos, mas como determinantes de maior suscetibilidade de um indivíduo desenvolver
GPAF (Tabela 1). Vithana et al (2012), através de um estudo GWAS em uma população
asiática de indivíduos com GPAF identificaram 3 loci de susceptibilidade, localizados nos
genes PLEKHA7 (rs11024102), COL11A1 (rs3753841) e entre os genes PCMTD1-ST18
(rs1015213) (Vithana et al. 2012). O COL11A1 é um gene particularmente interessante, visto
que ele codifica duas cadeias alfa do colágeno tipo XI, que é altamente expresso no tecido
escleral. Alguns estudos proveram evidências para o potencial papel do colágeno no glaucoma.
Alterações em depósitos de colágeno causam impacto na biomecânica e na capacidade de
remodelação da esclera e poderiam resultar em alterações que predispõem ao glaucoma, como
alterações no tamanho axial e alterações associadas ao erro refrativo (McBrien, Cornell &
Gentle 2001). Um SNP localizado no gene COL1A1 está associado a um maior risco de miopia
em japoneses e chineses Han (Inamori et al. 2007, Zhang et al. 2011). Imagina-se que outras
variantes genéticas resultem em alterações conformacionais do segmento anterior que
predispõem ao desenvolvimento da doença. Entretanto, diferenças na composição do colágeno
escleral podem estar correlacionadas com aumento na suscetibilidade ao dano axonal em olhos
glaucomatosos (Downs et al. 2001, Norman et al. 2011).
A composição extracelular da esclera é influenciada e modificada como resultado das
flutuações na pressão intraocular (Huang et al. 2013) e variantes associadas ao GPAF também
foram identificadas no gene metalloproteinase-9 (MMP9), que codifica uma enzima que
participa na remodelagem tecidual. A variante rs2250880 no gene MMP9 foi associada à
doença através de um estudo GWAS em uma população do sul da China (Cong et al. 2009).
Outro SNP (rs17576) localizado no mesmo gene foi associado a um maior risco de
desenvolvimento de GPAF em estudos envolvendo GPAF agudo em populações de Taiwan e
Paquistão (Wang et al. 2006, Micheal et al. 2013). Entretanto, em um estudo realizado em
24
Cingapura, avaliando a mesma variante, não observou-se associação significativa com o
desenvolvimento da doença (Aung et al. 2008). A mesma variante de risco (rs17576), além da
variante rs3818249 no gene MMP9 foram associadas ao GPAF na população australiana, o que
ratifica o papel do gene MMP9 em conferir maior risco ao desenvolvimento do GPAF
(Awadalla et al. 2011). Sugere-se que variantes no gene MMP9 afetem a função proteica
prejudicando sua função de remodelagem da matriz extracelular. O MMP9 pode também estar
envolvido em mecanismos de regulagem da PIO, uma vez que a MMP9 e outras MMPs estão
presentes no humor aquoso (Schlötzer-Schrehardt et al. 2003, Robertson, Siwakoti & West-
Mays 2013).
Tabela 1: Genes identificados por estudos de ligação associados ao glaucoma
primário de ângulo fechado e/ou a características de risco (Modificado de Ahram et
al., 2015).
Gene Fenótipo Localização
NNO1 Nanoftalmo, hipermetropia e crise aguda 11p13
PLEKHA7, COLL11A1,
PCMTD1-ST18 GPAF 11p15, 1p21, 8q11.23
COL1A1 Miopia 1p21
MMP9 GPAF 20q13.12
MTHFR GPAF 1p36.3
MFRP GPAF, Nanoftalmo autossômico recessivo,
menor tamanho axial, pequeno diâmetro
corneano
11q23.3
CHX10 GPAF 14q24.3
HGF GPAF e hipermetropia 7q21.1
RSPO1, C3orf26,
LAMA2, GJD2, ZNRF3,
CD55, MIP, ALPPL2
e ZC3H11B
Regulação do tamanho axial
1p34.3, 3q12.1, 6q22.33,
15q14, 22q12.1, 1q32,
12q13, 2q37, 1q41
PRSS56 Crise aguda, microftalmia posterior 2q37.1
ABCC5 GPAF 3q27
MYOC Crise aguda 1q24.3
CYP1B1 GPAF 2p22.2
eNOS GPAF 7q36
HSP70 GPAF 19q13.42
SPARC GPAF 5q33.1
CALCRL GPAF agudo 2q32.1
NEB GPAF canino
EPDR1, GLIS3, DPM2-
FAM102A, CHAT,
FERMT2
GPAF 7p14.1, 9p24.2, 9q34.11,
10q11.23, 14q22.1
25
Além dos genes já citados, outras variantes de risco já foram identificadas nos genes
membrane-type frizzled related protein (MFRP), methylenetetrahydrofolate reductase
(MTHFR) e retinal homeobox 10 (CHX10) (Wang et al. 2008, Micheal et al. 2009). O MFRP e
o CHX10 estão envolvidos na regulação do tamanho e diâmetro axial ocular (Aung et al. 2008,
Wang et al. 2008). Mutações no gene MFRP causam nanoftalmo autossômico recessivo,
caracterizado por menor tamanho axial, alto grau de hipermetropia, maior volume da lente e
menor diâmetro corneano (Kimbrough et al. 1979, Sundin et al. 2005). Quanto ao gene
MTHFR, uma possível função do mesmo é a remodelagem do tecido conectivo e da matriz
extracelular do segmento anterior (Micheal et al. 2009). Os genótipos combinados de dois
polimorfismos no gene MTHFR (C677T e A1298C) estavam associados ao GPAF, mas
também correlacionados a altos níveis de homocisteína no soro de pacientes no Punjab study
(Micheal et al. 2009). Altos níveis plasmáticos de homocisteína podem levar ao dano no DNA
em neurônios e causar apoptose e vulnerabilidade à excitotoxicidade (Kruman et al. 2000).
Além disso, a homocisteína pode diretamente induzir retinopatia através de dano específico às
células ganglionares da retina, mas não a outros neurônios da retina e fotorreceptores (Martin et
al. 2004, Dun et al. 2007). Não existe um consenso se variantes no gene MTHFR podem ou não
estar associados ao GPAF, o que sugere que a presença de polimorfismos neste gene varie em
diferentes populações étnicas (Micheal et al. 2009, Nilforoushan et al. 2012). Como exemplo,
um estudo do tipo caso-controle conduzido com população do norte da Índia não mostrou
associação da variante C677T no gene MTHFR com o GPAF mas, encontrou associação desta
variante com o GPAA (Gupta et al. 2014). Tais dados sugerem que o efeito patogênico de
mutações no gene MTHFR esteja primariamente relacionado à perda de células ganglionares da
retina (o que é uma característica de todos os tipos de glaucoma) devido à toxicidade pela
homocisteína.
26
Outro gene com possível função na regulação do comprimento axial é o hepatocyte
growth factor (HGF). Variantes neste gene foram associadas ao GPAF e hipermetropia na
população Han chinesa e na população nepalesa. Tais condições compartilham menor
comprimento axial e câmara rasa anterior (Awadalla et al. 2011, Jiang et al. 2013). Uma meta-
análise baseada em estudos GWAS para comprimento axial foi realizada em pacientes de etnia
européia e asiática com erro refrativo, o qual juntamente com hipermetropia e miopia é
determinado pelo comprimento axial. Nove loci foram significantes para o comprimento axial,
incluindo, RSPO1, C3orf26, LAMA2, GJD2, ZNRF3, CD55, MIP, ALPPL2 e ZC3H11B (Cheng
et al. 2013). Foram observadas variações na expressão gênica para estes loci em modelo animal
de miopia e em tecidos oculares de humanos. Além disso, os genes RSPO1 e ZNRF3 foram
previamente descritos como influenciadores da sinalização da via Wnt, implicada na regulação
do tamanho do globo ocular (Nakagawa 2004, Fuhrmann 2008, Tomaselli et al. 2011, Hao et
al. 2012). Membros da família R-Spondin, que inclui o gene RSPO1, aparentam agir como
potentes ativadores da via de sinalização Wnt/β-catenina inibindo a proteína transmembrana
ZNRF3 (Hao et al. 2012, Binnerts et al. 2007).
A associação de genes implicados na regulação do comprimento axial também foram
identificados em estudos com modelo animal. Um novo gene codificador de uma serina-
protease (PRSS56) foi associado a um menor comprimento axial em ratos com GPAF. No
mesmo estudo, variações no gene PRSS56 também foram associadas à redução do tamanho
axial em indivíduos com microftalmia p\osterior (Nair et al. 2011). Em um estudo GWAS sobre
profundidade da câmara anterior e GPAF em uma coorte asiática, observou-se que variantes no
gene ATP-binding cassete, sub-family C (CFTR/MRP) e member 5 enconding gene (ABCC5)
influenciam a profundidade da câmara anterior e aumentam o risco do desenvolvimento do
GPAF (Nongpiur et al. 2014). O ABCC5 tem papel na defesa tecidual e em mecanismos de
transdução de sinal celular (Jedlitschky, Burchell & Keppler 2000). Tais achados apoiam o
27
papel de genes modificadores da câmara anterior no risco ao desenvolvimento do GPAF.
Coletivamente, dados de vários estudos sugerem que múltiplos genes contribuem para a
regulação do comprimento axial e câmara anterior, determinando potencial risco ao fechamento
angular primário.
Genes previamente associados ao GPAA (MYOC, OPTN, WDR36 e CYP1B1) foram
investigados sobre possível associação ao GPAF em indivíduos do oriente médio, porém, não
foram encontradas variantes que conferissem risco ao GPAF (Abu-Amero et al. 2007). De
maneira similar, não foram encontradas variantes de risco no gene MYOC em uma coorte
chinesa com GPAF (Aung et al. 2005) apesar de relatos de associação do gene MYOC com o
GPAF em indivíduos de Quebec (Faucher et al. 2002, Vincent et al. 2002). Baseando-se em tais
resultados, é pouco provável que alterações no gene MYOC levem ao desenvolvimento do
GPAF.
Por outro lado, foram observadas associações positivas entre variantes no gene CYP1B1
e o GPAF em pacientes de origem chinesa, indiana e canadense (Chakrabarti et al. 2007, Dai et
al. 2008). Da mesma forma, variantes no gene endothelial nitric oxide synthase (eNOS) e heat-
shock protein 70 (HSP70) foram identificadas em associação com o GPAF na população
paquistanesa (Ayub et al. 2010). Na população Han chinesa foi observada associação marginal
entre alterações no gene eNOS e regulação da profundidade da câmara anterior, sugerindo
possível papel na patogênese do GPAF (Shi et al. 2013).
Adicionalmente, observou-se aumento significante na expressão da secreted protein,
acidic and rich in cysteine (SPARC) na íris de pacientes com GPAF recrutados no Singapore
National Eye Centre (SNEC), quando comparados com controles saudáveis, sugerindo possível
papel do gene SPARC em relação ao GPAF (Chua et al. 2008). A SPARC é uma proteína de
matriz celular, envolvida na remodelação da matriz extracelular e regulação na incorporação do
28
colágeno I nos tecidos, se ligando diretamente a várias fibrilas de colágeno (Brekken & Sage
2001, Bornstein & Sage 2002). Encontra-se presente no humor aquoso e é produzida pelas
células endoteliais da malha trabecular (Yan, Clark & Sage 2000, Pang et al. 2003). Ratos
SPARC-null mostram menores valores de PIO que animais selvagens, o que sugere potencial
papel da proteína SPARC na regulação da PIO (Haddadin et al. 2009).
Ademais, a investigação de duas coortes de pacientes com GPAF agudo e crônico, com
origem no sul da China, levou à identificação de associação entre polimorfismos no gene
CALCRL e GPAF agudo (Cao et al. 2009). O gene CALCRL (calcitonin receptor like) e outros
receptores relacionados são uma família de receptores G-protein-coupled que compreendem
vários subtipos. A atividade desse receptor é mediada por proteínas G, que ativam adenilato
ciclase. A superexpressão deste gene resulta em relaxamento do músculo esfíncter pupilar,
fechamento da câmara anterior e obstrução do fluxo do humor aquoso, levando à elevação da
PIO (Yousufzai, Ali & Abdel-Latif 1999).
O maior conhecimento sobre a genética envolvida no GPAF também pode ser obtida
através do estudo de várias raças de cães com predisposição ao desenvolvimento da doença.
Um estudo GWAS em cães da raça Basset Hound levou à identificação de dois loci de
susceptibilidade ao GPAF, um no cromossomo 14 (COL1A2) e outro no cromossomo 24
(RAB22A) (Ahram et al. 2014). Adicionalmente, outro estudo GWAS de uma forma tardia de
GPAF descrita em cães da raça Dandie Dinmont Terrier levou à identificação de um novo
locus de suscetibilidade no cromossomo 8 (Ahonen et al. 2013). Mais um estudo em famílias
de cães da raça Basset Hound com GPAF mostrou a associação de variações no gene NEB
(Nebulin), proteína de sarcômero altamente expressa no músculo ciliar. Variantes neste gene
também foram associadas com a doença em um estudo com Basset Hounds não aparentados.
Tais achados implicam que o tônus do músculo ciliar pode ser importante para manter uma
configuração aberta do ângulo iridocorneano (Ahram et al. 2015).
29
Um estudo recente GWAS identificou os loci EPDR1 (rs38645), CHAT (rs258267),
GLIS3 (rs736893), FERMT2 (rs7494379), e DPM2–FAM102A (rs373982) como associados ao
GPAF (Khor et al. 2016). O gene EPDR1 codifica uma proteína transmembrana conhecida
como ependymin-related 1. Ela tem um potencial papel na adesão celular, visto que tal proteína
assemelha-se a protocaderinas (Gregorio-King et al. 2002). O gene FERMT2 codifica uma
proteína chamada pleckstrin-homology-domain containing family C member 1 (PLEKHC1), um
componente da matriz celular, e poderia ter papel na adesão celular (Shen et al. 2013). Já o
gene PLEKHC1 pertence a mesma família de plecstrinas que o PLEKHA7, já associado
anteriormente ao GPAF (Vithana et al. 2012). Observações acerca dos genes FERMT2 e
EPDR1, assim como do gene PLEKHA7, implicam o processo de adesão célula-célula como
sendo importante na patogênese do GPAF (Khor et al. 2016).
O gene CHAT, localizado no cromossomo 10 codifica uma colina acetiltransferase. Essa
enzima é responsável pela síntese do neurotransmissor acetilcolina, que possui papel na
constrição pupilar. Medicações anticolinérgicas podem precipitar crise aguda por dilatação
pupilar e subsequente bloqueio pupilar (Mandak et al. 1996, Lachkar & Bouassida 2007).
Portanto, é plausível que variantes em um gene que influencia metabolismo de acetilcolina
possam influenciar o risco para o GPAF (Khor et al. 2016).
Mutações no gene DMP2 foram associadas a defeitos congênitos na glicosilação,
levando a severos fenótipos neurológicos. Não se sabe muito sobre o gene FAM10A, somente
que sua expressão é sensível à adição de β-estradiol (Wang et al. 2004, Barone et al. 2012).
Ambos os genes são expressos em todos os tecidos oculares, o que provê suporte biológico para
a etiologia do GPAF. Porém, mais estudos ainda são necessários afim de se identificar o gene
causativo neste lócus (Khor et al. 2016).
30
O gene GLIS3 é um membro das GLI-similar subfamily of Krüppel-like zinc-finger
proteins. Estudos prévios mostraram que mutações no gene GLIS3 são causa de diabetes
neonatal e hipotireoidismo congênito. SNPs próximos ao GLIS3 foram significantemente
associados ao diabetes tipo 1 em europeus, tipo 2 em indivíduos do leste asiático e níveis
plasmáticos de glicemia em jejum em uma meta-análise de estudos europeus (Kim et al. 2003,
Senée et al. 2006, Barrett et al. 2009, Dupuis et al. 2010, Cho et al. 2011). Tais observações
implicam em vias metabólicas ainda não conhecidas que podem contribuir para a patogênese
do GPAF.
Finalmente, como uma doença complexa, é provável que fatores ambientais participem
no desenvolvimento do GPAF. Estudos populacionais têm reportado associação entre o GPAF
e exposição ao sol, além de níveis de temperatura e pressão atmosférica. Em um estudo
conduzido em Cingapura, foi observado que eram relatadas maiores incidências de GPAF em
dias de maior temperatura (Seah et al. 1997). Por outro lado, um estudo finlandês sugere que o
número de horas sem luz solar pode estar positivamente associada com a incidência de crises
de fechamento angular agudo. Crises agudas também foram reportadas com mais frequência,
durante o inverno e o outono em relação ao verão ou à primavera, na mesma população
(Teikari et al. 1991).
Um fator comum entre todos estes estudos e fatores ambientais é que durante condições
adversas de clima, as pessoas tendem a ficar em suas casas. Isso pode aumentar as chances de
crise aguda devido à dilatação pupilar e subsequente elevação dos níveis de PIO (Subak-Sharpe
et al. 2010). Ainda é incerto se tais fatores ambientais são mais significantes em pacientes com
determinadas predisposições genéticas.
31
JUSTIFICATIVA
A patogênese do GPAF envolve múltiplos fatores anatômicos e fisiológicos.
Consequentemente, este exibe vários indicadores de ser uma doença complexa, causada pela
interação entre fatores genéticos e ambientais. Estudos epidemiológicos sugerem uma base
genética para o GPAF e várias análises foram propostas afim de se investigar tal possibilidade.
Entretanto, as determinantes genéticas que estão por trás da suscetibilidade ao GPAF
permanecem desconhecidas.
Existem poucos estudos genéticos envolvendo pacientes com GPAF e a identificação de
novos loci de susceptibilidade ao desenvolvimento deste tipo de glaucoma podem fornecer
maiores informações sobre a sua etiologia, bem como a relação entre fatores genéticos e a
evolução clínica dos indivíduos. Recentemente, abriu-se a perspectiva de utilização de novos
métodos para a identificação de genes de maior influência em famílias, outrora pouco
informativas nas avaliações convencionais por ligação, por meio da avaliação de exomas.
Portanto, apesar da dificuldade de se obter famílias com GPAF informativas para
análise de ligação devido a características próprias desta afecção ocular, o estudo de famílias
que possuam tal condição por meio da avaliação de exomas pode fornecer maiores
esclarecimentos sobre as determinantes genéticas que levam ao desenvolvimento desta forma
de glaucoma.
Estudos do tipo caso-controle envolvendo diferentes populações têm sido uma
importante maneira de se validar resultados encontrados em estudos GWAS. Pode-se observar
que uma mesma variante pode ter efeito diferente dependendo da população, o que pode ser
explicado pelo background genético das mesmas.
32
Para melhor compreensão dos resultados, este trabalho foi estruturado em capítulos,
sendo o primeiro capítulo um estudo do tipo caso-controle das variantes previamente
associadas ao GPAF e o segundo capítulo sobre a aplicação do sequenciamento de exomas em
duas famílias informativas para a doença.
OBJETIVOS GERAIS
Buscar melhor compreensão das bases moleculares do GPAF através do estudo
caso/controle de variantes já descritas na literatura e através do uso do sequenciamento de
exomas em duas famílias informativas para a doença.
33
CAPÍTULO I
AVALIAÇÃO DOS SNPs rs11024102 NO GENE PLEKHA7, rs3753841 NO GENE
COL11A1 E rs1015213 LOCALIZADO ENTRE OS GENES PCMTD1-ST18 EM UMA
AMOSTRA DA POPULAÇÃO BRASILEIRA PORTADORA DE GPAF
34
OBJETIVOS GERAIS
Compreender melhor, em uma amostra da nossa população, a relação entre a presença
de SNPs previamente associados ao GPAF e o desenvolvimento da doença.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Investigar a frequência dos SNPs rs11024102 no gene PLEKHA7, rs3753841 no gene
COL11A1 e rs1015213 localizado entre os genes PCMTD1-ST18 em dois grupos
independentes (casos e controles)
- Avaliar se a presença dos SNPs tem associação com o desenvolvimento do GPAF e suas
formas clínicas (agudo ou crônico).
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Casuística
Grupo caso
Neste estudo, 153 pacientes com GPAF foram aleatoriamente recrutados no serviço de
Glaucoma do Hospital das Clínicas da Unicamp.
Critérios de inclusão e avaliação oftalmológica
Todos os pacientes foram submetidos à avaliação oftalmológica, incluindo medida da
acuidade visual, biomicroscopia de segmento anterior pela lâmpada de fenda, medida de
pressão intraocular por tonometria de Goldmann, gonioscopia, avaliação do disco óptico e
perimetria.
O fechamento angular primário e o GPAF foram definidos como: 1. O fechamento
angular primário foi caracterizado como visibilização de até 180 graus da porção anterior da
malha trabecular associado com a presença de sinéquias periféricas anteriores e/ou imprinting
da malha trabecular. 2. O GPAF foi definido como, além das alterações goniscópicas descritas
35
anteriormente, a presença de alterações estruturais glaucomatosas do disco óptico incluindo:
redução localizada da rima neural, aumento vertical da escavação, hemorragia e assimetria de
escavação maior ou igual a 0,2 segundo avaliação oftalmológica sob visão binocular e
alterações funcionais de campo visual correspondentes observadas na perimetria
computadorizada acromática, caracterizada por três pontos adjacentes não periféricos com p <
5%, sendo que um deles com p < 1% pertencentes ao gráfico de probabilidades do “pattern
deviation”, “corrected pattern standard deviation” com p < 5% e “glaucoma hemifield test”
apresentando o resultado “borderline” ou “outside normal limits”. A forma aguda do GPAF
foi definida baseada em sintomas clínicos, incluindo dor ocular, dores de cabeça, visão
borrada, náuseas e vômitos associados a valores de PIO maiores de 40 mmHg, edema de
córnea, ângulo fechado, câmara anterior rasa e atrofia setorial da íris.
Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo pacientes que apresentaram ângulo aberto à gonioscopia,
fechamento angular secundário, alterações de segmento anterior compatíveis com glaucomas
secundários (ou de desenvolvimento) e/ou alterações de disco óptico e campo visual que
mimetizassem lesões glaucomatosas.
Grupo controle
O grupo controle foi composto por 324 indivíduos atendidos no ambulatório de
Oftalmologia do Hospital das Clínicas da Unicamp que não apresentaram histórico familiar de
glaucoma ou cegueira de causa desconhecida. Os indivíduos deste grupo apresentam idade
maior ou igual a 50 anos, valores de PIO menores que 16 mmHg e disco óptico sem sinais de
anormalidades.
O protocolo de pesquisa seguiu os princípios enunciados na Declaração de Helsinque,
assim como as determinações do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências
36
Médicas da Unicamp. Todos os indivíduos selecionados foram informados sobre os objetivos
e métodos do estudo, podendo ou não aceitar participar do mesmo, sem constrangimento ou
modificação de sua assistência médica. O projeto possui aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (Anexo V). Todos os indivíduos
participantes do estudo assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo II).
Extração de DNA e genotipagem dos SNPs
Foram coletados oito mililitros de todos os indivíduos submetidos ao estudo. A
extração de DNA foi realizada utilizando-se o protocolo fenol/clorofórmio, conforme descrito
por Sambrool et al. (1989).
As regiões genômicas contendo os SNPs de interesse foram amplificadas por PCR
convencional, preparada com 40 a 100 ng de DNA, 20 pmol de cada primer (tabela 2), 10
pmol de cada dideoxinucleotídeo (dNTP), tampão da enzima 1X (Tampão 10X: Tris-HCL
200 mM, pH 8.4, KCL 50 mM), MgCl2 50 mM e 0.5 U de Taq DNA polimerase
(InvitrogenTM
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). O volume final de reação de 25 µl foi
completado com H2O MiliQ.
As condições de amplificação foram as mesmas para as 3 regiões, exceto pela
temperatura de anelamento, conforme especificado na tabela 2: denaturação inicial a 95°C por
5 minutos, seguido por 35 ciclos a 94°C por 1 minuto, anelamento dos primers em
temperatura específica para cada região por 1 minuto e extensão final a 72°C por 40
segundos, finalizando com uma extensão final a 72°C por 7 minutos. Primers foram
desenhados utilizandos o programas Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) e
GeneRunner®, baseando-se nas sequencias depositadas no NCBI para cada região: rs3753841
(NT_028050), rs11024102 (NT_009237.19) and rs1015213 (NT_008183.20). Todos os
fragmentos amplificados foram submetidos ao sequenciamento direto segundo a metodologia
de Sanger et al. (1975), com BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1®
(Applied
37
Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) e submetidos à eletroforese em aparelho ABI
3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). A presença ou ausência dos SNPs foi
confirmada através do software FinchTV (Geospiza, Seattle, WA).
Tabela 2. Primers direto (F) e reverso (R) com seus respectivos tamanhos de amplicons,
temperaturas de anelamento de alelos de risco.
SNP SEQUÊNCIAS (5’- 3’) PRODUTO
(pb) TA (
oC)
ALELOS
DE RISCO
rs3753841 F – AGATTAGGGCCATGGGAGAT
R – GCATTTCCAGCCACATTCTC 176 62 T
rs11024102 F – CCTCTTCACCTCCAGAATGTC
R – TCCTGCATTTGCAATTACTTT 284 62 C
rs1015213 F - CTCTGGTGGCAATCACTGTC
R - CCCTGACTCTTGCTCCTGAC 291 60 A
pb, pares de bases; TA, temperatura de anelamento
Análise estatística
Todos os genótipos foram avaliados quanto ao equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE).
Fatores de risco associados ao GPAF foram avaliados por regressão logística univariada e
multivariada. P-valores menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
após correção de Bonferroni. Todas as análises foram realizadas utilizando-se o software R®
3.3.2 (https://www.r-project.org/). O cálculo do poder amostral foi realizado pelo software
G*Power 3.1.9 (http://www.gpower.hhu.de/).
RESULTADOS
O grupo caso foi composto por 26,8% (41/153) homens e 73,2% (112/153) mulheres,
enquanto que o grupo controle foi composto por 41,4% (134/324) homens e 58,6% (190/324)
mulheres (p = 0,002). Dentre os 153 casos, 67 foram classificados com GPAF agudo e 70
como GPAF crônico. Dezesseis pacientes (10,45%) apresentaram dados inconclusivos em
relação a tal classificação. As idades médias foram de 69,6±11,2 para o grupo caso e 65,8±8,3
para o grupo controle (p < 0,001). A tabela 3 mostra as frequências alélicas e genotípicas para
38
cada SNP, HWE e conteúdo informativo do polimorfismo (CIP). Todos os SNPs estão em
HWE, após correção por bonferroni. Os dados clínicos dos indivíduos pertencentes ao grupo
caso encontram-se no Anexo III.
Tabela 3. Análise descritiva para os SNPs rs11024102 (n=458), rs3753841 (n=471) e rs1015213
(n=474)
SNP Genótipo
/ Alelo
Controles
n (%)
Casos
n (%)
PHWE
Controles/Ca
sos
PHWE
Controles/Casos
(Bonferroni)
CIP
Controles/Ca
sos
rs11024102
T/T 219
(71,80)
99
(64,71)
0,739 / 0,641 p > 0,05 / p > 0,05 0,226 / 0,268
T/C 78
(25,58)
47
(30,72)
C/C 8
(2,62)
7
(4,57)
T 516
(84,59)
245
(80,07)
C 94
(15,41)
61
(19,93)
rs3753841
T/T 100
(31,15)
42
(28,00)
0,019 / 0,965 0,057 / p > 0,05 0,374 / 0,374
C/T 139
(43,30)
75
(50,00)
C/C 82
(25,55)
33
(22,00)
T 339
(52,80)
159
(53,00)
C 303
(47,20)
141
(47,00)
rs1015213
G/G 242
(75,39)
112
(73,20)
0,856 / 0,329 p > 0,05 / p > 0,05 0,203 / 0,222
G/A 73
(22,74)
36
(23,52)
A/A 6
(1,87)
5
(3,26)
G 557
(86,76)
260
(84,96)
A 85
(13,24)
46
(15,03)
PHWE, p-valor do teste chi-quadrado “goodness-of-fit” para equilíbrio de Hardy-Weinberg; CIP, Conteúdo
Informativo do Polimorfismo.
39
Em relação aos aspectos genéticos, a análise por regressão logística univariada não
detectou associação para as variantes rs11024102, rs3753841 e rs1015213 entre casos e
controles. Sexo e idade foram identificados como fatores de risco quando comparados ambos
os grupos (Tabela 4).
Para o SNP rs11024102, foi alcançado mais de 90% de poder amostral para se detectar
diferenças significativas entre os grupos casos e controle, ao passo que para os SNPs
rs3753841 e rs1015213, o poder amostral alcançado foi de no máximo 20%.
Tabela 4. Análise de associação entre casos e controles através de regressão logística
univariada.
Variável n Categoria P-valor OR 95% IC
Regressão univariada
Sexo 531 F x M 0,0022* 1,926 1,273 – 2,956
Idade 342 – 0,000847* 1,043 1,018 – 1,070
rs11024102 502 CC x TT 0,214 1,935 0,662 – 5,538
TC x TT 0,193 1,333 0,862 – 2,051
C x T 0,043 1,367 0,957 – 1,952
rs3753841 523 CT x CC 0,243 1,341 0,824 – 2,210
TT x CC 0,877 1,044 0,608 – 1,800
T x C 0,478 1,367 0,164 – 1,952
rs1015213 526 GA x GG 0,786 1,065 0,669 – 1,675
AA x GG 0,340 1,800 0,509 – 6,099
A x G 0,825 1,155 0,783 – 1,702
OR, Odds Ratio; IC, Intervalo de Confiança; F, sexo feminino; M, sexo masculino. *Valores que
se mantém significantes após correção por Bonferroni.
Quando o grupo de casos foi estratificado nas formas aguda e crônica, não foi
observada diferença estatisticamente significativa entre genótipos e formas clínicas para os
três SNPs. Idade e sexo permaneceram como fatores de risco, conforme mostra a tabela 5.
40
Tabela 5. Regressão logística univariada: comparação entre formas aguda x crônica.
Modelo Variável n Categoria P-valor OR 95% IC
Agudo x
crônico
rs11024102 133 CC x TT 0,265 2,619 0,533 – 18,987
CT x TT 0,520 1,280 0,604 – 2,740
C x T 0,343 0,707 0,343 – 1,443
rs3753841 133 CT x CC 0,253 1,670 0,695 – 4,080
TT x CC 0,836 1,108 0,419 – 2,949
T x C 0,943 1,009 0,624 – 1,631
rs1015213 GA x GG 0,633 1,593 0,234 – 13,322
AA x GG 0,585 1,666 0,264 – 13,085
A x G 0,768 1,016 0,536 – 1,927
Idade - 0,000847* 1,043 1,017 – 1,069
Sexo M x F 0,0024* 1,926 1,272 – 2,956
OR, Odds Ratio; IC, interval de confiança; F, sexo feminino; M, sexo masculino. *Valores que
se mantém significantes após correção por Bonferroni.
DISCUSSÃO
A população brasileira é altamente miscigenada e etnicamente heterogênea devido a
vários eventos migratórios que ocorreram desde a sua colonização (Melo et al. 2014). Para
melhor explorar o perfil genético de nossa população, conduziu-se um estudo expandido para
verificar qual(is) dos três loci de susceptibilidade ao GPAF identificados por Vithana et al
(2012) e replicados por Khor et al. (2016) poderia(m) estar associado(s) com maior risco de
desenvolvimento de GPAF na nossa amostra da população brasileira. No presente estudo, foi
selecionada uma amostra maior do que a avaliada por Khor et al. (2016) em seu estudo
GWAS (136 casos e 203 controles). No estudo realizado por Khor et al. (2016), a amostra de
indivíduos brasileiros foi incluída em um pool de descendência européia, juntamente com
indivíduos peruanos e poloneses, onde foi observada associação positiva com a doença para
os SNPs rs1015213 (p = 0,00006, Per-allele OR = 1,35) e rs3753841 (p = 0,00076, Per-allele
OR = 1,20), mas não para o SNP rs11024102 (p = 0,38, Per-allele OR = 1,05). Quando uma
41
amostra independente e maior foi avaliada (153 casos e 324 controles), não foi observada
associação positiva entre os SNPs rs11024102 [p = 0,043, Per-allele OR = 1,367 (0.957 –
1,952)], rs3753841 [p = 0,478, Per-allele OR = 1,367 (0,164 – 1,952)] e rs1015213 [p =
0,825, Per-allele OR = 1,155 (0,783 – 1,702)] e o maior risco de desenvolvimento de GPAF.
Algumas hipóteses podem explicar nossos resultados e uma delas envolve as
características genéticas de nossa população. A população brasileira é o resultado,
principalmente, da miscigenação entre europeus, africanos e nativos americanos. A proporção
de tais componentes ancestrais é o resultado de nossa história demográfica e foi estimada em
aproximadamentre 50% de genoma europeu, 30% de genoma africano e 14% de genoma
indígena (Melo et al. 2014).
Métodos comumente utilizados em meta-análises para explicar o efeito de confusão da
estrutura da população incluem o controle genômico através do cálculo do fator de inflação e
Análise de Componentes Principais ou Principal Component Analysis (PCA) (Price et al.
2006). Entretanto, a configuração das populações na PCA depende do número de diferentes
grupos genéticos utilizados como input, o que pode ser influenciado pela miscigenação da
população brasileira. Além disso, em meta-análises, pode ocorrer perda na identificação de
variantes importantes devido à ação de diferentes efeitos genéticos sobre diferentes
populações. Em outras palavras, a meta-análise é capaz de capturar características gerais,
mesmo se o efeito associado for relativamente pequeno. Enquanto isso, a análise de uma
população específica pode não capturar características com pequeno efeito (devido ao
pequeno tamanho amostral), mas pode evidenciar características da população específica em
estudo. Assim sendo, as diferenças entre os resultados do estudo de Khor et al. (2016) e os
apresentados neste trabalho podem ser explicados pelo tamanho amostral e pelo perfil
genético da população brasileira, combinado com outras populações no primeiro estudo e
isolada no presente trabalho.
42
O próximo passo foi investigar se algum dos três SNPs poderia estar associado às
formas aguda ou crônica do GPAF. Não foi observada associação entre os SNPs e o
desenvolvimento das diferentes formas clínicas da doença. Em contraste com nossos
resultados, Chen et al. (2014) encontraram seis SNPs, incluindo o rs1676486 (p = 4,71 ×
10−4
), rs3753841 (p = 0,041), e rs12138977 (p = 0,012) no gene COL11A1, assim como o
rs216489 (p = 0,029), rs11024060 (p = 0,0053), e o rs11024102 (p = 0,042) no gene
PLEKHA7 como associados à forma aguda do GPAF. Não foi observada significância
estatística quando a forma crônica foi comparada ao grupo controle. Outros dois estudos
populacionais reportaram o rs11024102 como fator de risco ao GPAF, mostrando OR = 1,15
(1,01–1,30) para a população Han chinesa (n = 1906) (Chen et al. 2014) e OR = 1,43 (1,0–
1,6) para a população nepalesa (n = 310) (Awadalla et al. 2013). Um estudo na população
indiana não mostrou tal associação (Duvesh et al. 2013).
Uma das limitações deste estudo é o nosso pequeno tamanho amostral. Baseado no
OR observado para cada SNP, um tamanho amostral de 7042 e 1528 indivíduos seriam
necessários para alcançar 95% de poder amostral para os SNPs rs3753841 e rs1015213,
respectivamente.
Em conclusão, os resultados encontrados no presente estudo não foram capazes de
evidenciar associação entre os SNPs rs11024102, rs3753841 e rs1015213 com o
desenvolvimento do GPAF e/ou suas formas clínicas. Mais estudos com maior tamanho
amostral ainda são necessários para melhor compreensão do papel dos três SNPs na
suscetilidade ao GPAF na população brasileira.
43
CAPÍTULO II
UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO DE EXOMAS PARA A
IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES ASSOCIADAS AO GLAUCOMA PRIMÁRIO
DE ÂNGULO FECHADO
44
Utilização de exomas para a identificação de variantes associadas a doenças
O sequenciamento de exomas é uma técnica que permite de maneira seletiva, capturar
e sequenciar regiões codificantes de todo o genoma. Realizados em plataformas de
sequenciamento massivo, ela permite a análise de regiões codificantes do genoma humano
com grande eficácia (Goh & Choi 2012).
A estratégia experimental do sequenciamento de exomas pode ser dividida em duas
etapas: 1) preparação das bibliotecas de DNA genômico e hibridização para captura de arrays
e 2) sequenciamento dos fragmentos-alvo eluídos (Clark et al. 2011).
O uso de sequenciamentos em larga escala vem sendo cada vez mais utilizados para o
diagnóstico genético, especialmente no caso de doenças geneticamente heterogêneas, como
por exemplo, degenerações herdadas da retina (DHR), perda auditiva, cardiomiopatias,
alterações mitocondriais e câncer (Calvo et al. 2012, Rehm 2013, Sommen & Van Camp
2013, Pugh et al. 2014).
Existem várias vantagens para tal abordagem, incluindo a habilidade de realização do
sequenciamento simultâneo de vários genes (Calvo et al. 2012, Rehm 2013, Cottrell et al.
2014, Levenson 2014).
Em estudos de coortes familiares, quando se possui acesso a famílias com a doença de
interesse, o sequenciamento de exomas pode ser aplicado em pelo menos dois membros
familiares afetados. Ao se analisar os resultados, qualquer variante compartilhada pode ser
considerada potencialmente causadora da doença; utilizando-se dados de análise de ligação
com foco na região do intervalo de interesse, é possível reduzir em grande parte o número de
variantes a serem consideradas. Um estudo recente utilizando sequenciamento de exomas foi
realizado em uma família com esclerose lateral amiotrófica familial (FALS). Os autores
recrutaram duas famílias portadoras da doença, selecionaram dois membros afetados de cada
família e realizaram o sequenciamento de exomas. Entre as raras variantes funcionais
45
identificadas, os autores testaram as variantes que segregavam com padrão Mendeliano entre
os membros familiares afetados de ambas as famílias, levando à identificação de um único
gene comum, o Profilin-1 (PFN1) (Wu et al. 2012).
Recentemente, Bilgüvar et al (2010) identificaram uma mutação recessiva no gene
WD-repeat domain 62 (WDR62) em vários pacientes turcos consanguíneos com graves
problemas no desenvolvimento cerebral (Bilgüvar et al. 2010). Mais recentemente, Dixon-
Salazar et al (2012) estudaram uma grande coorte de pacientes consanguíneos e manifestações
clínicas similares utilizando mapeamento de homozigosidade de dados gerados pelo
sequenciamento de exomas. Os autores sequenciaram 22 genes não previamente identificados
como causadores da doença, demonstrando o poder do sequenciamento de exomas como
ferramenta para a descoberta de novos genes (Dixon-Salazar et al. 2012).
A técnica de sequenciamento de exomas tem sido muito utilizada para diagnóstico
genético e descoberta de novos genes devido a seu baixo custo quando comparado ao
sequenciamento de genoma total (Gonzaga-Jauregui, Lupski & Gibbs 2012). Suas vantagens
práticas permitem que um grande número de pacientes sejam mapeados de forma robusta, o
que é um aspecto crucial na descoberta de mutações na pesquisa em genética humana (Goh &
Choi 2012).
46
OBJETIVOS GERAIS
Identificar novos genes candidatos ao desenvolvimento de GPAF e/ou fechamento
angular primário por meio da técnica de sequenciamento de exomas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar nas famílias portadoras de GPAF e/ou fechamento angular primário loci
candidatos por meio da análise de exomas;
- Testar as eventuais variantes identificadas em um grupo de pacientes não relacionados com
GPAF e fechamento angular primário;
- Verificar em um grupo controle a frequência das variantes encontradas;
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Famílias submetidas à análise de exomas
Foram estudadas duas famílias, cada uma compreendendo quatro indivíduos, a saber:
um dos pais afetado pelo GPAF, um dos pais não afetado, um filho com GPAF e um filho não
afetado. Quanto à origem das famílias, a família I é proveniente da cidade de Campinas - SP
(Figura 5) e a família II é proveniente da cidade de São João da Boa Vista - SP, (Figura 6). Os
dados clínicos dos indivíduos afetados encontram-se no Anexo IV.
Figura 5. Família I, proveniente da cidade de Campinas - SP. Os indivíduos I-1 e II-1 foram
confirmados como afetados pelo glaucoma primário de ângulo fechado após avaliação oftalmológica.
A seta indica o probando.
47
Figura 6. Família II, proveniente da cidade de São João da Boa Vista - SP. Os indivíduos I-2 e II-2
são afetados pelo glaucoma primário de ângulo fechado. A seta indica o probando.
Grupos para confirmação dos achados nos exomas
Grupo caso
Um total de 96 pacientes com GPAF foram aleatoriamente recrutados no serviço de
Glaucoma do Hospital das Clínicas da Unicamp.
Critérios de inclusão e avaliação oftalmológica
Todos os pacientes foram submetidos à avaliação oftalmológica, incluindo medida da
acuidade visual, biomicroscopia de segmento anterior pela lâmpada de fenda, medida de
pressão intraocular por tonometria de Goldmann, gonioscopia, avaliação do disco óptico e
perimetria.
O fechamento angular primário e o GPAF foram definidos como: 1. O fechamento
angular primário foi caracterizado como visibilização de até 180 graus da porção anterior da
malha trabecular associado com a presença de sinéquias periféricas anteriores e/ou imprinting
da malha trabecular. 2. O GPAF foi definido como, além das alterações goniscópicas descritas
anteriormente, a presença de alterações estruturais glaucomatosas do disco óptico incluindo:
redução localizada da rima neural; aumento vertical da escavação; hemorragia e assimetria de
escavação maior ou igual a 0,2 segundo avaliação oftalmológica sob visão binocular e,
alterações funcionais de campo visual correspondentes observadas na perimetria
computadorizada acromática, caracterizada por: três pontos adjacentes não periféricos com p
48
< 5%, sendo que um deles com p < 1% pertencentes ao gráfico de probabilidades do “pattern
deviation”; “corrected pattern standard deviation” com p < 5% e “glaucoma hemifield test”
apresentando o resultado “borderline” ou “outside normal limits”. A forma aguda do GPAF
foi definida baseada em sintomas clínicos, incluindo dor ocular, dores de cabeça, visão
borrada, náuseas e vômitos associados a valores de PIO maiores de 40 mmHg, edema de
córnea, ângulo fechado, câmara anterior rasa e atrofia setorial da íris.
Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo pacientes que apresentaram ângulo aberto à gonioscopia,
fechamento angular secundário, alterações de segmento anterior compatíveis com glaucomas
secundários (ou de desenvolvimento) e/ou alterações de disco óptico e campo visual que
mimetizassem lesões glaucomatosas.
Grupo controle
O grupo controle foi composto por 96 indivíduos atendidos no ambulatório de
Oftalmologia do Hospital das Clínicas da Unicamp que não apresentaram histórico familiar de
glaucoma ou cegueira de causa desconhecida. Os indivíduos deste grupo apresentam idade
maior ou igual a 50 anos, valores de PIO menores que 16 mmHg e disco óptico sem sinais de
anormalidades.
O protocolo de pesquisa seguiu os princípios enunciados na Declaração de Helsinque,
assim como as determinações do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências
Médicas da Unicamp. Todos os indivíduos selecionados para o estudo foram informados
sobre os objetivos e métodos do estudo, podendo ou não aceitar participar da mesma, sem
constrangimento ou modificação de sua assistência médica. O prjeto possui aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (Anexo V).
Todos os indivíduos participantes do estudo assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Anexo II).
49
Extração de DNA e preparação das bibliotecas para estudo de exomas
Coletaram-se oito mililitros de sangue periférico em frasco estéril VACUETTE®
contendo EDTA 10% como anticoagulante de cada membro das famílias. A extração de DNA
foi realizada com o kit QIAamp DNA Blood kit (Qiagen, Hamburgo, Alemanha), conforme
instruções do fabricante. O preparo das bibliotecas foi realizado com o kit Nextera® rapid
Enrichment (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA), conforme instruções do fabricante e a
corrida tipo paired-end realizada em aparelho Illumina Hi-Seq 2500 (Illumina, Inc., San
Diego, CA, USA) no Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências
da Vida, LaCTAD.
Análise Bioinformática
Após o recebimentos dos arquivos .fastq de cada indivíduo, foi realizado o controle de
qualidade pela ferramenta FastQC
(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). As reads foram então
alinhadas pelo BWA (http://bio-bwa.sourceforge.net/) utilizando como genoma de referência
a montagem hg38. O processamento pós-alinhamento foi realizado utilizando-se as
ferramentas Picard (https://broadinstitute.github.io/picard/) e GATK
(https://software.broadinstitute.org/gatk/). Após isso, foi realizada detecção de SNPs/indels
pela ferramenta GATK com consequente anotação funcional pela ferramenta wannovar
(http://wannovar.wglab.org/). A ferramenta IGV
(http://software.broadinstitute.org/software/igv/) foi utilizada na visualização das sequências
de interesse.
50
Validação dos achados no estudo de exomas
Foram coletados oito mililitros de sangue periférico de todos os indivíduos incluídos
na validação do estudo. Neste caso, a extração de DNA foi realizada utilizando-se o protocolo
fenol/clorofórmio, conforme descrito por Sambrool et al. (1989). As regiões genômicas de
interesse foram amplificadas por PCR convencional, preparada com 40 a 100 ng de DNA, 20
pmol de cada primer, 10 pmol de cada dideoxinucleotídeo (dNTP), tampão da enzima 1x
(Tampão 10X: Tris-HCL 200 mM, pH 8.4, KCL 50 mM), MgCl2 50 mM e 0.5 U de Taq
DNA polimerase (InvitrogenTM
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). O volume final de
reação de 25 µl foi completado com H2O MiliQ.
As condições de amplificação foram as mesmas para todas as regiões, exceto pela
temperatura de anelamento, conforme especificado na tabela 3: desaturação inicial a 95°C por
5 minutos, seguido por 35 ciclos a 94°C por 1 minuto, anelamento dos primers em
temperatura específica para cada região por 1 minuto e extensão final a 72°C por 40
segundos, finalizando com uma extensão final a 72°C por 7 minutos. Os primers foram
escolhidos por meio dos programas Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) e
GeneRunner®, baseando-se nas sequências depositadas no Ensembl, transcrito
ENST00000337195.9. Todos os fragmentos amplificados foram submetidos ao
sequenciamento direto segundo a metodologia de Sanger et al. (1975), com BigDye
Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1®
(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) e
submetidos à eletroforese em aparelho ABI 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA).
A presença ou ausência de variantes foi confirmada através do software FinchTV (Geospiza,
Seattle, WA).
51
Tabela 6: Sequência de primers para cada éxon do gene CTBP2, com seus respectivos
amplicons e TAs.
ÉXON SEQUÊNCIAS (5’- 3’) PRODUTO (pb) TA (oC)
3 S - GGACTGCTTTGCCTTTTG
AS - AGCCAGCGAAGATTTGAGTG 168 61
4 S - TGCCCTGAGTGATGAGTGG
AS - GGAGTTCAGCAGGAAAGCAG 376 61
5 S - CAGGTTCAAGGGTGATAGGG
AS - AGAGCTCCGGACAACTCCA 285 61
6 S - TTCTCATCTCCGGCCTTG
AS - TTGACTCCGATCTCCTACCC 400 60
7 S - ACTCACCTGGACGCTCTGTT
AS - TGCTACCACCTTTCGACAGAA 293 61
8 S - CCTGTAACCGGCTTTTCTT
AS - GTTCAAAGTGTGGGGGTCAG 233 61
9, 10 S - CGACATTTCCCGCTTACTCT
AS - TTAGCATCTGCGGGAGGTTA 780 61
11 S - GGCCCTATTTCTGTGTGTTC
AS - GGTCCCAAGTGTATCTGAGTGA 248 61
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Controle de Qualidade
O controle de qualidade das amostras foi realizado após o primeiro alinhamento,
utilizando-se os arquivos .bam referentes a cada indivíduo das famílias em estudo. Os
resultados de cada CQ (controle de qualidade) pertencentes à Família I estão demonstrados na
Figura 7 e, os resultados dos CQs pertencentes à Família II são demonstrados na Figura 8. Em
ambas as famílias, não foi necessária a trimagem de reads por consequência de baixa
qualidade.
52
Figura 7: Controle de qualidade pós-alinhamento dos indivíduos pertencentes à Família I.
Em A: CQ indivíduo I-1; Em B: CQ indivíduo I-2; Em C: CQ indivíduo II-1; Em D: CQ
indivíduo II-2.
O CQ dos indivíduos da Família I mostrou boa qualidade de alinhamento para todos
os membros da família, portanto, o pipeline seguiu sem restrições. Ao final do pipeline, foram
identificadas entre 21 mil e 22 mil variantes em éxons, para cada membro da Família (tabela
7).
Tabela 7: Total de variantes identificadas para cada
membro da Família I.
INDIVÍDUO TOTAL DE VARIANTES
IDENTIFICADAS
I-1 21962
II-1 22063
I-2 21864
II-2 21117
53
Figura 8: Controle de qualidade pós-alinhamento dos indivíduos pertencentes à
Família II. Em A: CQ indivíduo I-1; Em B: CQ indivíduo I-2; Em C: CQ indivíduo II-
1; Em D: CQ indivíduo II-2.
O CQ dos indivíduos da Família II, assim como o da Família I, mostrou boa qualidade
de alinhamento para todos os membros, portanto, o pipeline pode seguir sem restrições, sendo
identificadas entre 20 mil e 21 mil variantes em éxons, para cada membro da Família (tabela
8).
Tabela 8: Total de variantes identificadas para cada
membro da Família II.
INDIVÍDUO TOTAL DE VARIANTES
IDENTIFICADAS
I-1 20081
II-1 20786
I-2 20805
II-2 21081
54
Filtragem dos dados e identificação de variantes
O processo de filtragem dos arquivos .csv resultantes das anotações pela ferramenta
wANNOVAR foi realizado conforme os passos descritos na figura 9:
Figura 9: Passos aplicados na filtragem dos arquivos .csv pertencentes à cada família.
Após a aplicação dos filtros, foram priorizados apenas genes relacionados ao processo
de adesão célula-célula, sendo encontradas 5 variantes na família I e 7 variantes na família II
(Tabela 9). Tais variantes encontravam-se em genes distintos porém, observou-se que
indivíduos afetados em ambas as famílias apresentavam diferentes variações em um mesmo
gene, CTBP2.
Selecionadas variantes segregando somente nos indivíduos afetados
Exclusão de variantes com frequência > 0.05 na base de dados ExAC
Exclusão de variantes consideradas toleradas por SIFT
e/ou PolyPhen-2
Exclusão de variantes com valores de PhyloP <
1
Exclusão de variantes com
Phred-score < 40
Exclusão de variantes
homozigotas
55
Tabela 9: Genes segregantes entre afetados e não afetados em ambas as famílias após
filtragem dos dados.
FAMÍLIA GENE
Família I
LIMS1
TMF1
CTBP2
FREM2
ITGAE
Família II
LRRN2
C1QTNF8
CTBP2
FKBP15
GPR137
HSDL2
NID2
Nos indivíduos afetados pertencentes à Família I, a variante rs779036382 no gene
CTBP2 segregava entre eles, estando ausente nos indivíduos não-afetados da mesma família
(Figura 10).
Figura 10. Em A: padrão frameshift causado pelo rs779036382. Em B: sequência normal do
éxon 9 do gene CTBP2.
A variante rs779036382 é uma alteração frameshift, causada por uma deleção de 5 pb
no éxon 9 do gene CTBP2. Sua presença causa deleção do aminoácido 322 e alteração da
matriz de leitura a partir do aminoácido 323 da proteína, que possui 445 aminoácidos em sua
totalidade. Sua frequência é de 8.236e-06 na base de dados ExAC, não sendo até o momento,
na literatura, relacionada a qualquer tipo de quadro clínico.
Em relação à família II, a análise de exomas apresentou as variantes rs76555439 e
rs75408575 segregando entre os indivíduos afetados. Porém, a variante rs76555439 que se
56
trata de um stop códon no aminoácido 8 (K8X) foi identificada como falso positivo. A
aplicação de um filtro que permitia a identificação de variantes sinônimas foi utilizado e
identificou–se a variante rs75408575 segregando entre os indivíduos afetados da família
(Figura 11).
Figura 11. Em A, a seta indica o heterozigoto para a variante rs75408575 (G/A), a
qual segrega entre os indivíduos afetados. Em B, a seta indica indivíduo controle,
homozigoto normal para o alelo G.
A variante rs75408575 é uma variação do tipo sinônima, presente no éxon 11 do gene
CTBP2, correspondente à troca G>A. Possui frequência > 0,01 na base de dados ExAC e foi
levada em consideração por se encontrar em uma região regulatória do gene CTBP2.
Para melhor compreensão da variante, a mesma foi submetida à ferramenta Human
Splice Finder, afim de avaliar se ela possui impacto em sítio de splicing. Como resultado, a
variante foi predita como potencial alteradora de sítio de splicing (Figura 12).
Figura 12: Output da ferramenta Human Splice Site que prediz a variante rs75408575 como
potencial alteradora de sítio de splicing.
As variantes encontradas foram então verificadas em um grupo de 96 casos
esporádicos e 96 controles. Posteriormente, o sequenciamento de toda a região codificante do
gene CTBP2 levou à identificação das variantes descritas na tabela 10. Apenas a variante
rs76804352 foi adicionalmente identifcada, estando presente apenas no grupo caso.
57
Tabela 10: Variantes no gene CTBP2 identificadas após sequenciamento
de casos e controles esporádicos.
Exon Variante Casos Controles P-valor (χ2) ExAC
9 rs76804352 3 0 0,312216 5.634e-03
9 rs779036382 36 38 0,76697 8.236e-06
11 rs75408575 33 45 0,077 < 0,01
Apesar da segregação das variantes entre os indivíduos afetados, o sequenciamento de
casos e controles esporádicos permitiu a identificação das mesmas em ambos os grupos,
sendo todas as variantes encontradas em heterozigose em ambos os grupos, não evidenciando
associação significativa na comparação entre os mesmos.
O gene CTBP2 é composto por 11 éxons em sua forma canônica e está localizado na
região 10q26.1. Sua proteína contém um domínio conservado N-terminal envolvido na
ligação de fatores de transcrição que possuam o sítio consenso PxDLS e o domínio central de
homologia à desidrogenase que tem um grande número de funções, incluindo dimerização
(Hoang, Burnett & Curtiss 2010). O referido gene pode se ligar à β-Catenina e participar na
regulação da via de sinalização Wnt. Alterações em outros genes já foram implicadas como
influenciadores da ativação da via (Nakagawa 2004, Binnerts et al. 2007, Fuhrmann 2008,
Tomaselli et al. 2011, Hao et al. 2012).
A atividade da via de sinalização Wnt/β-catenina é fortemente regulada durante o
desenvolvimento ocular e uma regulação imprópria da via pode resultar em múltiplas
malformações oculares, devido a problemas no processo de diferenciação celular dorsal
(Fujimura 2016). Em tecidos como íris e corpo ciliar, a via é responsável por regular a
diferenciação das margens ciliares e expansão de células-tronco. A sinalização é ativada nas
margens ciliares e promove então a formação do corpo ciliar e íris. Além disso, a sinalização
da Wnt aumenta a proliferação de células-tronco no tecido em maturação ou em corpo ciliar e
íris de adultos (Liu et al. 2007). Estudos com ratos knockout de vários membros da via
58
WNT/β-catenina indicam que a sinalização é essencial para o desenvolvimento ocular
mantendo o correto padrão tecidual, promovendo diferenciação do epitélio pigmentar da
retina, controlando a morfogênese da escavação óptica e mantendo a identidade da retina
dorsal (Fujimura 2016).
Outros achados no sequenciamento de Exomas
Além do gene CTBP2 presente em ambas as famílias, é importante salientar que
outros genes foram identificados após a aplicação dos filtros, conforme consta na tabela 6.
Todos os outros genes foram encontrados isoladamente segregando entre afetados na Família
I ou na Família II. Tais resultados se devem à maneira como foi realizada a aplicação dos
filtros. No presente estudo, os filtros aplicados foram determinados após várias tentativas,
com resultados variáveis, conforme variação dos filtros. Maior atenção ainda deve ser dada
aos genes identificados, já que estes participam de vias consideradas de risco para o
desenvolvimento do GPAF.
A maioria dos SNPs identificados por estudos GWAS estão relacionados a adesão
célula-célula. Khor et al (2016) citam a importância do mecanismo de adesão célula-célula e
do metabolismo de colágeno no desenvolimento do GPAF. Além disso, os autores citam
também que outras vias metabólicas ainda necessitam maior estudo como ativação por
proteínas do tipo zinc-finger, repressores de transcrição e alterações em glicosilação.
Até o momento, apenas 8 regiões genômicas foram implicadas no desenvolvimento do
GPAF, sendo que estas explicam menos de 2% do total de casos. A descoberta de genes de
risco é importante para o entendimento dos mecanismos que levam ao desenvolvimento da
doença, sendo que mais estudos com casos familiares e esporádicos de GPAF ainda são
necessários para o real entendimento de sua fisiopatologia.
59
CONCLUSÕES GERAIS
- O estudo caso/controle não evidenciou associação entre os SNPs rs11024102, rs3753841 e
rs1015213 com o desenvolvimento do GPAF e suas formas clínicas na nossa amostra da
população brasileira.
- Até o momento, estudo de exomas não evidenciou genes associados à etiologia da doença
em ambas as famílias.
- Apesar das variantes identificadas segregando entre os indivíduos afetados das famílias, até
o momento, não foi possível concluir que o gene CTBP2 possa estar envolvido com a
etiologia do GPAF;
- Mais estudos são necessários para se averiguar o papel dos demais genes encontrados na
análise por exomas na etiologia do GPAF.
60
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ANEXO I – FOLHA DE ROSTO DO CONEP
75
76
ANEXO II – TEMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR E ENGENHARIA GENÉTICA – CBMEG
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Título do projeto: Aspectos genéticos e de doenças oftalmológicas
Pesquisadora principal: Dra. Mônica Barbosa de Melo (tel: 019 3521-1143)
Número do CAAE: 49120615.4.0000.5404
SUBPROJETO ASSOCIADO:
( ) Estudo de mutações nos genes CX46, CX50 e HSF4 em pacientes com catarata
congênita
( ) Análise de haplótipos da mutação CYS433ARG no gene myoc associada ao
glaucoma na população brasileira
( ) Aspectos genéticos do glaucoma primário de ângulo fechado
( ) Análise dos genes COL8A2 E SLC4A11 em pacientes com distrofia de FUCHS
( ) Avaliação do polimorfismo Y402H e da deleção CFHR3/CFHR1 no gene cfh em
relação à etiologia da degeneração macular relacionada à idade (DMRI) em uma amostra da
população brasileira
( ) Citocinas inflamatórias e associação com o tratamento e etiologia do glaucoma
primário de ângulo aberto
( ) Avaliação de aspectos genéticos do glaucoma primário de ângulo aberto por meio do
sequenciamento de exoma total
( ) Análise de polimorfismos de base única (SNPs) na região 10q26 E SEU
envolvimento na etiologia da degeneração macular relacionada à idade (DMRI) em uma
amostra da população brasileira
( ) Avaliação de variantes genéticas na determinação da área do disco óptico em
indivíduos normais e com glaucoma na população brasileira
( ) Avaliação dos polimorfismos ɛ2/ ɛ3/ ɛ4 no gene apoe em relação à etiologia do glaucoma
primário de ângulo aberto em uma amostra da população brasileira
77
OBJETIVO DA PESQUISA:
Você está sendo convidado (a) a participar em um projeto de pesquisa envolvendo
indivíduos:
( ) Com catarata
( ) Com glaucoma de ângulo aberto
( ) Com glaucoma de ângulo fechado
( ) Com degeneração macular relacionada à idade
( ) Com distrofia endotelial de Fuchs
Este documento, chamado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, visa assegurar
seus direitos como participante e é elaborado em duas vias, uma que deverá ficar com você
e outra com o pesquisador.
Por favor, leia com atenção e calma, aproveitando para esclarecer suas dúvidas. Se houver
perguntas antes ou mesmo depois de assiná-lo, você poderá esclarecê-las com o
pesquisador. Se preferir, pode levar este Termo para casa e consultar seus familiares ou
outras pessoas antes de decidir participar. Se você não quiser participar ou retirar sua
autorização, a qualquer momento, não haverá nenhum tipo de penalização ou prejuízo.
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS:
Propõe-se avaliar variantes que contribuam para a suscetibilidade a doenças oftalmológicas,
assim como identificar novos genes, ampliando o conhecimento sobre os processos
biológicos envolvidos. Isso poderá melhorar o diagnóstico da doença e poderá levar a um
melhor tratamento no futuro.
PROCEDIMENTO:
Caso concorde em participar desse estudo, os pesquisadores farão perguntas a respeito
dos meus antecedentes médicos e familiais. Uma amostra de sangue venoso será colhida
(10 a 20 mL, o equivalente a duas colheres de sopa). Além disso, você poderá ser
submetido (a) a:
( ) Exame de refração
( ) Biomicroscopia anterior e de fundo
( ) Tonometria
( ) Gonioscopia
( ) Paquimetria
( ) Medida de comprimento axial
( ) Retinografia
( ) Campo visual (Perimetria)
( ) Tomografia de coerência óptica
( ) Microscopia Especular
78
RISCO E DESCONFORTO:
Uma coleta de 10 a 20 mL de sangue venoso será efetuada. Os riscos associados a esse
procedimento são mínimos, podendo ocorrer dor e manchas roxas (equimoses) no local da
coleta do sangue. O desconforto será mínimo, pois se trata de uma coleta de sangue
geralmente da veia do braço que será realizada por profissional treinado e habilitado para
realizar esse procedimento. Hospitalização não será necessária. Os procedimentos
mencionados acima, fazem parte dos cuidados médicos de rotina para um (a) pacientes
com doenças oftalmológicas. Para minimizar o desconforto nos exames onde o contato com
a superfície ocular é necessário (tonometria e paquimetria) será instilada uma gota de colírio
anestésico em cada olho antes de cada procedimento. Pode ocorrer um desconforto de
curta duração associado à luminosidade emitida no olho durante os exames. Durante o
exame de campo visual também poderá ocorrer fadiga devido ao nível de atenção exigido.
Em caso de dano decorrente da pesquisa, está garantida a assistência integral e imediata,
de forma gratuita, pelo tempo que for necessário. Você também tem direito a indenização
em caso de danos.
SIGILO:
Você deve entender que toda informação médica que consta em seu prontuário médico será
submetida aos regulamentos do HC-UNICAMP referentes ao sigilo da informação médica,
excetuando-se os resultados dos testes genéticos decorrentes desse projeto de pesquisa.
Se os resultados ou informações fornecidas resultarem em publicação científica, nenhum
nome será utilizado.
RESSARCIMENTO:
Os procedimentos serão realizados durante as consultas de rotina ao Hospital das Clínicas
da UNICAMP. Você não receberá qualquer valor em dinheiro.
BENEFÍCIOS:
Você não obterá nenhum benefício direto com a colaboração nesse estudo, seu tratamento
provavelmente não será modificado, exceto nos casos em que for descoberto novo
diagnóstico através dos exames realizados. Contudo, os resultados desse estudo podem,
em longo prazo, oferecer benefícios para indivíduos com doenças oftalmológicas,
possibilitando melhor diagnóstico e tratamento adequado. É importante notar que o
diagnóstico pré-sintomático não faz parte dessa pesquisa, mas se você desejar obter
orientação genética, ela será oferecida no Centro de Biologia Molecular e Engenharia
Genética – CBMEG/UNICAMP, tel. (19 3521-1147).
FORNECIMENTO DE INFORMAÇÃO ADICIONAL:
Entende-se que é possível requisitar informações adicionais relativas ao estudo a qualquer
momento. Dra. Mônica Barbosa de Melo estará disponível para responder possíveis dúvidas
e preocupações. Em caso de recurso, denúncias, dúvidas ou reclamações sobre os
aspectos éticos da pesquisa, contatar a secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa.
79
Contatos:
Dra. Mônica Barbosa de Melo: Tel: (19) 3521-1143, e-mail: [email protected], endereço:
Av Cândido Rondon, 400, Cidade Univeritária, (CBMEG-UNICAMP), Distrito de barão
Geraldo, Campinas- SP. CEP: 13083-875.
Comitê de Ética em pesquisa da UNICAMP (CEP): Tel: (19) 3521-8936, e-mail:
[email protected], endereço: Rua: Tessália Vieira de Camargo, 126, Distrito de Barão
Geraldo , Campinas - SP. CEP: 13083-887.
RECUSA OU DESCONTINUAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO:
A participação é voluntária, você pode se recusar a participar ou retirar seu consentimento e
interromper a participação no estudo a qualquer momento (incluindo a retirada da amostra
de sangue) sem comprometer os cuidados médicos que recebe atualmente ou receberá no
futuro no HC-UNICAMP. A Dra. Mônica Barbosa de Melo pode interromper sua participação
nesse estudo a qualquer momento que julgar apropriado, como quando houver fatores de
exclusão que sejam descobertos durante a pesquisa, por exemplo, através da análise dos
prontuários.
Você leu e compreendeu esse termo de consentimento e está de pleno acordo em participar
desse estudo. Logo, informa que:
( ) Autoriza o armazenamento do material biológico e deseja ser consultado (a) para
consentimento em caso de uso de sua amostra em outras pesquisas.
( ) NÃO autoriza o armazenamento do material biológico, devendo o mesmo ser
descartado após o encerramento de sua participação nessa pesquisa.
Obs: O tempo de armazenamento é de 5 anos, podendo ser prorrogado por mais 5 anos.
RESULTADOS DOS EXAMES REALIZADOS (Genéticos):
( ) Deseja ser informado (a) sobre o resultado de meus exames.
( ) NÃO deseja ser informado (a) sobre o resultado de meus exames.
COLETA DE INFORMAÇÕES CLÍNICAS (Prontuários)
( ) Autoriza a utilização dos dados de seus prontuários.
( ) NÃO autoriza a utilização dos dados de seus prontuários.
DISPONIBILIZAÇÃO PÚBLICA DOS DADOS GENÔMICOS
Com o avanço das pesquisas na área genômica, é hoje de grande importância compartilhar
em bancos de dados públicos os resultados de alguns testes moleculares. No
compartilhamento dos dados genômicos é sempre assegurado que não haverá qualquer
referência aos identificadores das amostras, (exemplo de identificadores: nome, filiação,
endereço, número de registro hospitalar), mas poderão ser incluídas informações relevantes
para a interpretação dos dados genômicos no contexto das pesquisas, tais como: sexo,
idade, país e região de procedência, diagnóstico e outras informações clínicas pertinentes.
80
( ) Autoriza que os resultados dos testes genômicos realizados no âmbito deste projeto de
pesquisa sejam disponibilizados em bancos de dados públicos que poderão ser consultados
por pesquisadores da área médica, desde que esses dados não sejam vinculados com
identificadores da amostra.
( ) NÃO autoriza a disponibilização dos resultados dos testes genéticos realizados neste
projeto de pesquisa.
___________________________________________________________________
Nome do (a) participante ou responsável
_________________________________________________ __________________
Assinatura do (a) participante ou responsável Data
RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR:
Asseguro ter cumprido as exigências da resolução 466/2012 CNS/MS e
complementares na elaboração do protocolo e na obtenção deste Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido. Asseguro, também, ter explicado e fornecido uma via deste documento
ao participante. Informo que o estudo foi aprovado pelo CEP perante o qual o projeto foi
apresentado. Comprometo-me a utilizar o material e os dados obtidos nesta pesquisa
exclusivamente para as finalidades previstas neste documento ou conforme o
consentimento dado pelo participante.
___________________________________________________ ___________________
Assinatura do (a) pesquisador (a) ou associado Data
81
ANEXO III – DADOS CLÍNICOS DOS INDIVÍDUOS PERTENCENTES AO GRUPO
CASO
ID SEXO PIO ESCAVAÇÃO IDADE HIST. FAM.
AGUDO OU CRÔNICO
CAMPO VISUAL
695/13 F
698/13 F 13/11 0,8x0,9/ 0,95x0,9 73 NA Agudo "-6,52/ -27,53
699/13 F 13/13 0,6x0,6/ 0,6x0,6 54 - Crônico "-2,98/ -3,08
705/13 M 14/12 total/ 0,8x0,8 53 - Crônico "NC/-7,22
706/13 F 13/13 0,6x0,6/ 0,7x0,6 68 - Crônico -1,75/+0,26
707/13 F
708/13 F 12/12 0,9X0,9/SUBTOTAL 76 - Crônico "-5,20/-16,34
709/13 M 18/16 0,8x0,8/SUBTOTAL 83 - Crônico "-14,28/-24,54
710/13 F 12/10 Total/ 0,9x0,9 88 - Crônico "NC/-19,88
711/13 F 13/14 NC/0,7X0,7
- Agudo "NC/-8,79
712/13 F 20/22 0,8x0,8/ 0,8x0,8 76 - Crônico "-11,87/ -8,77
713/13 F 14/14 0,4X0,4/0,3X0,3 80 + Crônico "-14,41/-6,84
714/13 F 22/11 RN/ 0,7x0,6 69 NA Crônico "NC/-12,14
715/13 F -/13 total/total 57 NA Crônico "NC/NC
716/13 M
717/13 F 9/- 0,7x0,7/ total 75 NA Agudo "-11,93/ -
718/13 F 12/12 0,7x0,7/ 0,9x0,8 89 - Crônico NC/NC
719/13 F 12/14 0,9x0,9/ 0,8x0,8 88 NA Agudo NC/NC
720/13 M 10/16 total/total 80 NA Crônico -
721/13 F 12/12 0,5x0,4/ 0,9x0,9 87 - Crônico NC/NC
722/13 F 12/- 0,4x0,4/- 70 + Crônico "-6,46/-
723/13 F
724/13 M 14/12 0,9X0,9/RN 72 NC Crônico "-19,55/NC
725/13 M 10/11 RN/TOTAL 80 - Crônico "-14,27/-NC
726/13 M 10/ SUBTOTAL/ 76 - Crônico "-25,71/
727/13 F 10/10 0,4X0,4/0,9X0,7 64 - Agudo "-2,54/-10,34
728/13 F 14/14 0,6X0,7/0,7X0,7 55 + Crônico "-5,31/-4,28
729/13 F /10 /SUBTOTAL 81 - Agudo "/NC
730/13 F /31 /TOTAL 58 - Agudo "/NC
731/13 F 10/26 FISIO/0,3X0,3 48
732/13 F 10/11 0,9X0,9/SUBTOTAL 75 - Crônico "-17,83/NC
733/13 M
734/13 F /21 /0,9X0,9 87 - Crônico "/-
735/13 F 20/50 0,6X0,6/0,80,8 68 + Agudo "+0,64/-29,17
736/13 F 15/10 0,6X0,8/0,3X0,3 65 - Agudo "-4,86/-1,34
737/13 F 15/14 0,4X0,5/0,4X0,4 66 - Agudo "-25,61/-6,99
006/14 F 12/12 TOTAL/TOTAL 83 + Crônico "-29,25/-26,61
013/14 F 15/ 0,7X0,8/ 58 + Crônico "-2,55/
82
014/14 F 15/15 0,5X0,6/0,5X0,6 75 - Crônico "-5,70/-9,33
034/14 F 13/12 SUBTOTAL/0,7X0,7 82 - Agudo "-13,68/-3,27
035/14 M 10/ TOTAL/ 84 - Crônico "-4,3/
064/14 M
070/14 F -/11 -/0,7X0,6 67 NC Agudo "-/-0,91
076/14 F 15/12 0,6X0,7/0,8X0,9 68 - Agudo "-5,79/-15,28
085/14 F 6/- 0,7X0,8/- 73 NC Agudo "-6,42/-
095/14 M 12/16 TOTAL/SUBTOTAL 60 - Agudo "-31,93/NC
102/14 M 12/16 0,9X0,8/0,9X0,8 82 NC Agudo "NC/-8,67
119/14 F 12/16 0,8x0,8/0,6x0,6 67 - Crônico "-4,93/-2,78
120/14 M 13/13 0,95X0,95/0,4X0,4 71 NC Agudo "-20,29/-20,89
739/14 F 12/18 0,4X0,4/0,6X0,6 73 NC Agudo "-5,59/NC
740/14 M /12 /TOTAL 71 NC Crônico /-19,95
741/14 F 15/16 0,6x0,6/0,7x0,7 49 NC Agudo "-0,27/-21,75
742/14 F /16 /0,8X0,7 84 NC Agudo "/-4,22
743/14 F 14/11 0,5X0,5/TOTAL 71 + Crônico "-0,22/NC
745/14 F -/12 /0,9X0,9 78 - Crônico /-18,22
746/14 M 11/11 0,8X0,8/0,7X0,7 80 - Crônico "-1,57/-4,34
747/14 F
748/14 F 8/14 0,8X0,7/0,85X0,7 69 - Crônico "-22.51/-3,85
749/14 F 19/11 0,9X0,9/RN 93 - Agudo "-17,63/NC
750/14 F 12/16 RN/TOTAL 65 - Crônico "NC/NC
751/14 F 12/16 0,9X0,9/0,9X0,9 72 NC Crônico "NC/NC
753/14 M
78 - Crônico
754/14 M 12/22 TOTAL/0,5X0,5 65 - Agudo "NC/+0,61
755/14 F 16/12 0,4X0,4/0,5X0,5 70 - Agudo "-5,03/-1,92
756/14 M 55/16 /0,4X0,5 62 - Crônico /-13,56
757/14 F 14/16 0,8X0,8X0,9X0,9 69 - Crônico "-15,52/-9,57
758/14 F /18 /RN 53 - Agudo /NC
759/14 M /9 /TOTAL 64 NC Crônico "/NC
760/14 F 12/15 RN/0,5X0,5 74 - Agudo "NC/-0,27
761/14 F /10 /0,5X0,5 44 - Agudo "/-11,26
766/14 F 28 0.6 x 0.6 61 não Agudo OD=-4.38 dB;OE=-
10.10 dB
769/14 F 25 e 26 0.9 x 0.8 e total x
total 39 não Crônico
OD=-10.3 dB;OE=-24.48 dB
771/14 F
0.9 x 0.9 e totalxtotal 52 não Agudo OD=-12.31 dB
772/14 M 50,14 total x total AO 74 não Crônico
773/14 M 14/ RN/ 74 - Agudo "-4,39/
774/14 F 18/14 0,8X0,8/0,8X0,8 81 - Crônico "-17,28/-11,52
775/14 F 16/16 0,4X0,4/0,7X0,6 71 - Agudo "NC/-6,61
776/14 F 12/20 0,9X0,9/IMPOSSIVEL 48 - Agudo "-24,81/NC
777/14 M 11/09 0,7X0,8/0,8X0,8 62 - Crônico "-4,53/-2,88
787/14 F 10/10 0,4X0,4/0,4X0,4 79 NC Agudo "-5,31/NC
788/14 F 16/17 0,6X0,6/0,6X0,6 60 - Agudo "-9.03/-2,09
790/14 F 32/18 0.4 x 0.4 AO 74 não Agudo OD=-2.81 dB;OE=-
2.62 dB
83
791/14 F 9 e 20 0.7 x 0.4 e 0.9 x 0.9 69 não Agudo OD=-1.81 dB;OE=-
19.11 dB
792/14 F 26/1 0.9 x 0.9 71 não Crônico OD=-7.37 dB;OE=-
21.28 dB
793/14 M 21/2 0.6 x 0.6 AO 67 não Agudo não tem
794/14 M 20/1 0.8 x 0.8 e total x 0.9 69 não Agudo
795/14 M 11/2 0.6 x 0.6 AO 53 não Agudo OD=-0.16 dB;OE=-
0.74 dB
799/14 M 44/44 0.4 x 0.4 AO 73 não Agudo
800/14 F 12/12 0.5 x 0.5 e o.8 x 0.8 83 filho Agudo OD=-3.08 dB;OE=-
6.39 dB
802/14 F 29/2 0.2 x 0.2 AO 76 não Agudo não tem
803/14 M 8/10 0,75X0,75/0,75X0,75 73 - Agudo NC/-5,93
804/14 F 65/18 0,8X0,8/0,35X0,35 87 - Agudo "NC/-1,27
805/14 F 28/25 SUBTOTAL/0,9X0,9 82 + Crônico "-7,59/-2,59
806/14 F 13/13 0,9X0,9/RN 51 NC Agudo "-2,32/-31,78
807/14 F 12/13 0,8X0,8/0,8X0,8 68 - Crônico "-4,58/-4,89
822/14 M 36 e 30 0.2 x 0.2 AO 72 não Crônico OD=-3.66 dB;OE=-
5.62 dB
825/14 F 30 e 32 0.8 x 0.8 e 0.7 x 0.7 61 avó
paterna Crônico
OD=-16.41 dB;OE=-1.51 dB
829/14 F 34 e 26 total x total OD, 0.4 x
0.4 OE 66 mae Crônico
OD=-26.18 dB;OE=-0.26 dB
833/14 F 15/19 0,9X0,9/0,9X0,9 79 - Crônico NC/NC
835/14 F 8/8 0,6X0,6/0,5X0,5 81 - Crônico "-23,21/-3,35
864/14 M 32 e 27 0.9 x 0.9 e 0.6x0.6 57 não Crônico OD=-13.68 dB;OE=-
0.91 dB
865/14 F 16 AO 0.3 x 0.3 AO 71 não Crônico OD=-0.74 dB;OE=-
2.11 dB
873/14 F 18/18 0,6X0,7/RN 64 - Agudo NC/-
876/14 F 14/- TOTAL/- 71 - Crônico "-28,96/-
878/14 M 12/10 0,8X0,9/RN 84 - Crônico "-3,17/-22,38
880/14 F 16/16 0,7X0,8/0,7X0,8 70 NC Crônico "-11,83/-26,44
883/14 F 18/13 0,7X0,7/0,2X0,2 65 - Crônico "-27,36/-10,09
884/14 F 11/09 0,8X0,8/0,9X0,9 68 + Agudo "-1,87/-11,79
887/14 F 19/- 0,8X0,9/- 93 - Agudo "-21,14 OD (UNICO)
936/14 F /17 /0,7X0,7 83 NC Agudo "-/-
937/14 F 8/10 FISIO/FISIO 66 NC Agudo NC/NC
939/14 M 13/17 subtotal/0,9x0,9 83 - Crônico NC/-16,38
946/14 M 16/28 FISIO/RN 55 NC Crônico NC/-30,01
950/14 F 28 e 22 0.7 x 0.7 AO 71 não Crônico OD=-3.70 dB;OE=-
2.90 dB
951/14 M 13/ 0,8X0,9/ 73 - Agudo "-6,2 (OD UNICO)
952/14 F 16/16 0,5X0,5/0,7X0,8 66 + Agudo "-0,19/-0,21
953/14 F 10/ TOTAL/ 71 - Crônico "-18,8/
955/14 F 14/14 0,8X0,8/0,8X0,85 59 NC Agudo "-2,03/-3,97
960/14 M 14/12 0,4X0,3/0,4X0,3 58 - Agudo "-1,16/+0,47
972/14 F 12/10 0,9X0,9/SUBTOTAL 66 + Agudo "-/-
84
974/14 F
982/14 F 09/13 0,4X0,4/0,8X0,85 66 NC Agudo "-16,21/-27,21
983/14 M 12/- 0,7X0,7/- 63 NC Agudo "-15,00/-
985/14 M 12/- 0,6X0,6/ 67 NC Crônico "-1,72/-
986/14 F 12/11 0,3X0,3/RN 78 - Crônico -2,07/NC
987/14 F 11/08 0,4X0,4/0,5X0,5 65 - Agudo -5,31/-2,59
988/14 M 15/15 TOTAL/RN 78 - Crônico "-26,08 (CENTRAL)/-
16,96
989/14 F 12/13 0,3X0,3/0,3X0,3 60 - Agudo "-/-
990/14 F 10/8 0,4X0,5/SUBTOTAL 52 NC Agudo "-1,30/-6,10
991/14 F 15/- 0,9X0,9/- 59 - Agudo "-13,37/-
122/15 F 16/16 0,9X0,9/0,8X0,8 68 - Crônico "-2,01/-2,32
123/15 F 38/35 TOTAL/TOTAL 83 - Agudo "-14,48/-13,58
124/15 F 13/14 0,6x0,5/0,6x0,5 72 - Crônico "-6,71/-1,81
144/15 M /18 /0,4X0,4 78 - Crônico "/-3,24
150/15 M 12/14 0,6X0,9/0,2X0,4 62 - Crônico "-9,79/+0,17
158/15 M 10/10 0,7X0,7/0,6X0,6 59 - Crônico "-0.75/-1,58
174/15 F 12/16 FISIO/FISIO 41 - Agudo "-/-
237/15 F 20/12 TOTAL/0,7X0,8 80 - Crônico "NC/-1,06
252/15 F 16/16 0,7X0,7/0,3X03 63 + Crônico "-23,99/-1,25
310/15 F
336/15 F 18/16
60 + Crônico 2/2
348/15 F
350/15 F
73
351/15 F
435/15 M
490/15 F 18/12 FISIO/FISIO 71 - Agudo "NC/NC
519/15 F 27/52 /0,9X0,9 96 - Agudo "/-13,47
520/15 F 12/12 0,6X0,6/TOTAL 81 - Crônico "3,92/-28,16
588/15 F
589/15 F
189/16 F 26/10 0,4X0,3/0,3X0,3 48 - Agudo "-18,77/NC
199/16 F 17/17 0,7X0,7/0,7X0,7 49 - Agudo "-0,20/-0,71
201/16 F 38/28 0,4X0,5/0,5X0,5 64 - Agudo "-0,18/-0,44
85
ANEXO IV – DADOS CLÍNICOS DAS FAMÍLIAS ENVOLVIDAS NO ESTUDO DE
EXOMAS
FAMÍLIA I
Indivíduo I-1
Idade: 62 anos
Escavação total em OE
Indivíduo II-1
Idade: 39 anos, apresentando crise de glaucoma agudo
Pio: Controlada à apresentação: 08 mmHg OD, 08mmHg OE.
Âmgulo estreito na gonioscopia, realizou iridectomia em ambos os olhos.
FAMÍLIA II
Indivíduo I-2
Idade: 53 anos, crise glaucoma agudo aos 50 anos
PIO: 50 mmHg OD, 15mmHg OE – história colhida no exame
Gonio: sinéquias periféricas anteriores OD, ângulo estreito OE sem sinéquias periféricas
anteriores
FO: escavação 0,2 OD; 0,1 OE.
Iridectomia presente nos dois olhos e PIO controlada no OD com 1 medicação
86
Indivíduo II-2
Idade: 33 anos
PIO: 52 mmHg OD, 14mmHg OE – crise aguda paciente referido de SJBV
Gonio: sinéquias periféricas anteriores OD, ângulo estreito OE sem sinéquias periféricas
anteriores
FO: escavação 0,4 OD, 0,2 OE.
Realizado iridectomia nos dois olhos e PIO controlada no OD com 1 medicação
87
ANEXO V – PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP CONTENDO APROVAÇÃO
DO SUBPROJETO “ASPECTOS GENÉTICOS DO GLAUCOMA PRIMÁRIO DE
ÂNGULO FECHADO” COMO ADENDO AO PROJETO “ASPECTOS GENÉTICOS
DE DOENÇAS OFTALMOLÓGICAS”
88
89
90
91
ANEXO VI – DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS