estudo epidemiolgico da poxvirose bovina no...
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1. INTRODUÇÃO
As poxviroses são doenças causadas por vírus da família Poxviridae, que
acometem o homem e os animais. Tipicamente ocorre nas poxviroses a presença de
lesões difusas na pele e mucosas que progridem de máculas para pápulas,
vesículas e pústulas antes de formar crostas e cicatrizar (ACHA e SZYFRES, 1986).
Nos últimos cinco anos, inúmeros casos de doença pústulo-vesicular
ocorreram em diversas fazendas nos Estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas
Gerais acometendo o gado bovino leiteiro e pessoas, principalmente retireiros e seus
familiares, nos quais as características clínicas descritas favoreciam a possibilidade
da doença ser causada por um vírus da família Poxviridae, posteriormente
comprovada por diagnóstico laboratorial. Na ocasião, DAMASO et al. (2000)
isolaram e caracterizaram molecularmente o vírus Cantagalo (CTGV) de espécimens
clínicos de bovinos na cidade de Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro,
TRINDADE et al. (2003), isolaram o vírus Araçatuba na cidade de Araçatuba no
Estado de São Paulo e LEITE (2003), o vírus Passatempo em Passatempo no
Estado de Minas Gerais.
A partir de 2002, têm sido observado surtos de doença pústulo-vesicular no
gado leiteiro e pessoas de fazendas leiteiras no Sul do Estado do Espírito Santo,
com características clínicas semelhantes aos casos descritos nos Estados do Rio de
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Janeiro, São Paulo e Minas Gerais. Esses surtos vêm causando grandes prejuízos
econômicos na agropecuária da região, onde em algumas propriedades 100% dos
bovinos foram acometidos, bem como a importância na saúde pública, como uma
zoonose, com ocorrência de casos humanos que necessitaram de hospitalização,
justificando uma pesquisa de investigação mais detalhada do problema em pauta.
Objetivou-se, neste trabalho, realizar um estudo epidemiológico dos surtos
das poxviroses no gado leiteiro e casos humanos do Estado do Espírito Santo,
identificando molecularmente o agente causador, bem como a adoção e divulgação
das medidas de controle da doença junto aos órgãos responsáveis pela Sanidade
Animal, Saúde Pública e aos proprietários de gado leiteiro.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Família Poxviridae
Os vírus DNA classificados na família Poxviridae são os maiores e mais
complexos vírus conhecidos, os quais se replicam no citoplasma de células de
hospedeiros vertebrados e invertebrados. A família abrange um grande grupo de
patógenos de importância médica e veterinária (MOSS, 1996).
A doença pústulo-vesicular típica de poxvírus é conhecida como “varíola” e
se caracteriza clinicamente pelo aparecimento de lesões difusas na pele e mucosas,
que progridem de máculas para pápulas, vesículas e pústulas antes de formar
crostas e cicatrizar. A maioria das lesões contém células com múltiplas inclusões
intracitoplasmáticas denominadas “pocks” que representam o local de replicação
viral nas células infectadas (TRIPARTHY et al., 1981, ACHA e SZYFRES, 1986).
A historia dos poxvírus tem sido predominada pelo Variola virus (VARV), o
agente etiológico da varíola humana, que acompanhou o homem por muitos séculos
causando mortes e lesões graves e irreversíveis (GUIDO e ESPER, 2002).
Atualmente, o VARV vem tendo importância mundial, pelo temor do seu uso, como
arma biológica (SCHATZMAYR, 2001, SILVA, 2001).
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Um outro exemplo de poxvírus muito estudado é o Vaccinia virus, que vem
sendo objeto de estudo intensivo como vetor para introdução de genes imunizantes
ativos, como vacinas de vírus vivo para uma variedade de doenças em humanos e
animais domésticos (BROOKS et al., 2000).
2.1.1. Classificação
A família Poxviridae é subdividida em duas subfamílias, com base no
espectro dos hospedeiros vertebrados ou insetos: Chordopoxvirinae (poxviroses de
vertebrados) e Entomopoxvirinae (poxviroses de insetos) (Tabela 1).
A subfamília Chordopoxvirinae é subdividida em oito (08) gêneros
(Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus,
Suipoxvirus, Molluscipoxvirus e Yatapoxvirus), e os membros de cada gênero
exibem uma morfologia e uma gama de hospedeiros semelhantes, bem como
alguma relação antigênica. As principais espécies de cada gênero, hospedeiro e
distribuição geográfica estão apresentadas nas Tabelas 2 a 6. Existem outros
poxvírus que ainda não estão bem classificados, incluindo os novos vírus que são
descobertos constantemente, como os isolados de lagartos, rãs, cervos, cangurus,
entre outros. (MURPHY et al., 1999).
Tabela 1. Estrutura Taxonômica da família Poxviridae.
Família Poxviridae Subfamília Chordopoxvirinae
Gênero Orthopoxvirus Gênero Parapoxvirus Gênero Avipoxvirus Gênero Capripoxvirus Gênero Leporipoxvirus Gênero Suipoxvirus Gênero Molluscipoxvirus Gênero Yatapoxvirus
Subfamília Entomopoxvirinae
Gênero Entomopoxvirus A Gênero Entomopoxvirus B Gênero Entomopoxvirus C
(ESPOSITO et al., 2005)
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Tabela 2. Gênero Orthopoxvirus: Vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica.
Vírus Abreviação Principais Hospedeiros
Distribuição Geográfica
Camelpox virus
CMLV
Camelo
Ásia e África
Cowpox virus CPXV Bovino, humano, felino e roedor
Europa e Ásia
Ectromelia virus ECTV Camundongo Europa
Monkeypox virus MPXV Macaco, Roedor e Humano
África
Raccoonpox virus RCNV Guaxinim América do Norte
Taterapox virus GBLV Gerbilo África
Vaccinia virus VACV Humano, Bovino, Búfalo, suíno e Coelho
Mundial
Buffalopox virus BPXV Búfalo, Bovino e Humano Índia
Rabbitpox virus RPXV Coelho EUA e Holanda
Variola virus VARV Humano Erradicado
Volepox virus VPXV Camundongo da Califórnia Califórnia
Uasin Gishu virus UGV Cavalo África
(Adaptado de ESPOSITO et al., 2005)
Tabela 3. Gênero Parapoxvirus: Vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica.
Vírus Abreviação Principais Hospedeiros
Distribuição Geográfica
Orf virus ORFV Ovino, Caprino, Humano Mundial
Pseudocowpox virus ou
Paravaccinia vírus
PCPV
Bovino e Humano
Mundial
Bovine papular stomatitis virus
BPSV Bovino e Humano Mundial
Parapoxvirus of red deer in New Zealand
PVNZ Cervo vermelho Nova Zelândia
Auzduk disease virus - Camelo África e Ásia
Sealpox virus - Foca e Humano Mundial
(Adaptado de ESPOSITO et al., 2005).
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Tabela 4. Gênero Avipoxvirus: vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica.
Vírus Abreviação Principais Hospedeiros
Distribuição Geográfica
Canarypox virus CNPV Canário, aves Mundial
Fowlpox virus FWPV Aves Mundial
Juncopox virus JNPV Aves Mundial
Mynahpox virus MYPV Aves Mundial
Pigeonpox virus PGPV Pombo, aves Mundial
Psittacinepox virus PSPV Psitacídeos, aves Mundial
Quailpox virus QUPV Codornizes, aves Mundial
Sparrowpox virus SRPV Pardal, aves Mundial
Starlingpox virus SLPV Aves Mundial
Turkeypox virus TKPV Peru, aves Mundial
(Adaptado de ESPOSITO et al., 2005)
Tabela 5. Gênero Capripoxvirus: Vírus, Abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica.
Vírus Abreviação Principais Hospedeiros
Distribuição Geográfica
Goatpox virus GTPV Cabra Ásia e África
Sheeppox virus SPPV Carneiro Ásia e África
Lumpy skin disease virus LSDV Bovino África
(Adaptado de ESPOSITO et al., 2005)
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Tabela 6. Gêneros Leporipoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus, Yatapoxvirus: Vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica.
Gênero Vírus Abreviação Principais Hospedeiros
Distribuição Geográfica
Leporipoxvirus
Hare fibroma virus
FIBV
Lebre (Lepus
capensis)
Europa
Myxoma virus MYXV
Lebre e coelho
América do Sul e EUA
Fibroma virus -
Lebre e coelho
EUA
Squirrel fibroma
virus SFV
Esquilo (Sciurus sp)
EUA
Suipoxvirus
Swinepox virus
SWPV
Suíno
Mundial
Molluscipoxvirus
Molluscum
contagiosum virus MOCV
Humano
Mundial
Yatapoxvirus Tanapox virus TANV
Roedor e Humano
África Yaba monkey
tumor virus YMTV Macaco e Humano
África
(Adaptado de ESPOSITO et al., 2005)
Os gêneros Orthopoxvirus e Parapoxvirus destacam-se como os principais
causadores de poxviroses em humanos e animais domésticos, como demonstrado
nas Tabelas 2 e 3.
2.1.2. Estrutura e composição dos poxvírus
Os vírions dos poxvírus são os maiores, de importância médica e veterinária,
descritos pela microscopia. As aparências das partículas virais variam de acordo
com o método de preparação, mas a maioria dos poxvírus, quando observados por
microscopia eletrônica, se apresentam como partículas em forma retangular
medindo aproximadamente 250 X 200 X 200 nm. Em contraste, os vírus do gênero
Parapoxvirus, Entomopoxvirus A e Entomopoxvirus B são ovóides e medem
aproximadamente 260 X 160 nm (Tabela 7 e Figura 1). (MOSS, 2001)
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Tabela 7. Família Poxviridae: Morfologia e tamanho do genoma.
Subfamília Gênero Morfologia Tamanho aproximando
Genoma Chordopoxvirinae
Orthopoxvirus Retangular 200 Kbp
Parapoxvirus
Ovóide
140 Kbp
Avipoxvirus
Retangular
260 Kbp
Capripoxvirus
Retangular
150 Kbp
Leporipoxvirus
Retangular
160 Kbp
Suipoxvirus
Retangular
170 Kbp
Molluscipoxvirus
Retangular
180 Kbp
Yatapoxvirus
Retangular
145 Kbp
Entomopoxvirinae
Entomopoxvirus A
Ovóide
260 -370 Kbp
Entomopoxvirus B
Ovóide
236 Kbp
Entomopoxvirus C
Retangular
250 -380 Kbp
(Adaptado de MOSS, 2001)
Figura 1. Micrografia eletrônica do Orthopoxvirus e Parapoxvirus
A B
A – Orthopoxvirus
B – Parapoxvirus
(SCHATZMAYR et al., 2000)
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A estrutura dos poxvírus é complexa e carece de simetria icosaédrica ou
helicoidal exibida por outros vírus, sendo envelopado por uma dupla membrana
lipoprotéica. A maioria dos poxvírus é formada por uma camada externa de
estruturas protéicas tubulares, arranjadas irregularmente, conferido uma aparência
característica. Em contraste, os membros do gênero Parapoxvirus são cobertos por
longos e finos túbulos protéicos que, por causa da superposição desses túbulos,
parecem ser arranjados na forma cruzada, assemelhando-se a uma esfera de fios. A
parte interior inclui um cerne bicôncavo e dois corpúsculos laterais de natureza
desconhecida. O cerne contém o DNA viral e diversas proteínas virais (Figura 2).
(MURPHY et al., 1999).
Figura 2. Diagrama da estrutura do vírion dos gêneros Orthopoxvirus e Parapoxvirus.
Membrana do cerne
)
Membrana Externa
Envelope
Corpúsculo Lateral
Superfície Tubular
Membr
Membrana Externa Envelope
Corpúsculo Lateral
Superfície Tubular
A – Gênero: Orthopoxvirus
(adaptado de FENNER, 1996)
A composição química d
principais componentes dos vírio
lipídeos e DNA, correspondendo
dos vírions. Algumas das proteí
constituem em colesterol e fosfoli
O cerne contém um gran
com tamanho variando de 130–
capacidade de codificar aproxi
enzimas envolvidas no process
Cerne (DNA e
proteínas virais)
ana do cerne
B – Gênero: Parapox
os poxvírus assemelha-se a de uma
ns do Vaccinia virus, por exemplo, sã
90%, 5%, 3,2%, respectivamente da
nas são glicosiladas ou fosforiladas,
pídios. (MOSS, 1996).
de genoma viral de DNA de filamento
380kbp, rico em bases de adenina e
madamente duzentas (200) proteína
o de síntese do ácido nucléico e c
Cerne (DNA e
proteínas virais
virus
bactéria. Os
o proteínas,
composição
e os lipídios
linear duplo
timina, com
s, incluindo
omponentes
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estruturais dos vírus. A seqüência completa do genoma é conhecida em vários
poxvírus como o VARV e o VACV (BROOKS et al., 2000).
2.1.3. Replicação dos poxvírus
Os poxvírus são peculiares entre os vírus DNA, visto que todo ciclo de
replicação ocorre no citoplasma das células infectadas. As células infectadas
apresentam muitas inclusões intracitoplasmática denominadas “pocks”, que
representam o local de replicação viral (TRIPARTHY et al., 1981).
O ciclo de replicação dos poxvírus está esquematizado na Figura 3 e
descrito abaixo nas alíneas a, b e c, sendo representado pelo Vaccinia virus, que é o
protótipo dos poxvírus em termos de estrutura e replicação.
Figura 3. Ciclo de replicação do Vaccinia virus.
Cerne
Envoltório mRNA intermediário
Desnudamento Penetração Replicação Adsorção
Fatores de transcrição
tardios
DNA-polimerase mRNA tardio
RNA-polimerase
Enzima de formação do capsídeo Poli(A)-polimerase
Fatores de transcrição intermediários mRNA inicial
Fator de transcrição
RNA-polimerase
Fatores nucleares ?
Envoltório de Golgi Maturação
(EEV)
(IMV) (IEV) Liberação
(adaptado de MOSS, 1996)
Enzimas tardias Fatores de transcrição
iniciais Proteínas estruturais
Organi- zação
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a) Etapas 1, 2, 3 e 4 - Fixação, penetração e desnudamento do vírus:
A partícula viral estabelece contato com a superfície celular e, a seguir,
funde-se com a membrana celular, liberando o cerne no citoplasma. No interior dos
poxvírus encontramos a RNA-polimerase viral que transcreve metade do genoma
viral em mRNA precoce. Esses mRNAs após serem transcritos no interior do cerne
do vírus são liberados no citoplasma da célula. A proteína de “desnudamento”
produzida após a infecção viral libera o DNA viral dos cernes, finalizando a primeira
parte do ciclo de replicação.
b) Etapas 5, 6 e 7 – Replicação do DNA viral e síntese de proteínas virais:
Entre as proteínas iniciais produzidas após a infecção pelo vírus, destacam-
se a DNA-polimerase e a Timidina-quinase que são enzimas envolvidas na
replicação viral. A replicação inicia-se logo após o processo de desnudamento,
ocorrendo em regiões distintas do citoplasma, que aparecem como “fábricas” ou
corpúsculos de inclusão em micrografias eletrônicas. Ocorre a transcrição de
mRNAs intermediários, que cuja expressão precede temporariamente a dos
mRNAs tardios. O mRNA viral tardio é traduzido em grandes quantidades de
proteínas estruturais e em pequenas quantidades de outras proteínas e enzimas
virais (BROOKS et al., 2000).
c) Etapas 8, 9, 10, 11 e 12 - Maturação e liberação:
As proteínas estruturais organizam-se para acondicionar o DNA, formando
as partículas virais, chamadas de vírions maduros intracelulares infectivos (IMV),
que são transportados pelos microtúbulos até o Complexo de Golgi, onde podem
adquirir as membranas do Complexo, formando os vírus envelopados intracelulares
(IEV); chegando à periferia da célula, fundem-se com a membrana citoplasmática
da célula, resultando na liberação dos vírus envelopados extracelulares (EEV)
(MOSS, 1996).
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2.1.4. Mecanismos de evasão dos poxvírus
Os poxvírus são especialmente adaptados para interferir na resposta imune
do hospedeiro. Em primeiro, por possuírem um genoma com capacidade de codificar
150 – 200 proteínas, facilitando a codificação de proteínas que interfere na resposta
imune do hospedeiro. E em segundo, por não dependerem dos mecanismos de
transcrição da célula, pois codificam as enzimas e fatores necessários para a sua
transcrição viral. Essas propriedades contribuem para a habilidade dos poxvírus de
interferir na expressão dos genes do hospedeiro sem afetar a expressão dos genes
virais (MOSS e SHISLER, 2001).
Recentemente, descobriu-se que vários genes dos poxvírus assemelham-se
a genes de mamíferos, que codificam proteínas semelhantes e/ou homólogas ao do
hospedeiro, tornando-se passíveis de inibir os mecanismos de defesa do
hospedeiro. Os exemplos incluem os homólogos com o receptor do fator de necrose
tumoral, o receptor do interferon gama e o receptor de interleucina-1, que funcionam
interrompendo as redes de complemento e outras citocinas importantes para
resposta imune do hospedeiro (BOWIE et al., 2000).
OIE e PICKUP (2001), descobriram que os poxvírus possuem a capacidade
de interferir na regulação da ativação do NF-kB (Fator Nuclear kB) do hospedeiro,
interferindo indiretamente na resposta imune inata e adquirida, pois o NF-kB abrange
uma série de fatores de transcrição que regulam a expressão de numerosos genes
que codificam proteínas que são elementos essenciais para resposta imune inata e
adquirida do hospedeiro.
2.2. Poxviroses Bovina As lesões associadas as poxviroses ocorrem principalmente nas tetas e
úbere de bovinos, apresentando-se principalmente nas formas proliferativas,
ulcerativas e crostosas, abrindo porta para infecções secundárias. Essas lesões são
dolorosas e geralmente não são diferenciadas de outras lesões nas tetas do bovino
(TIMMS et al., 1998).
O conhecimento sobre a epidemiologia e a história natural dos poxvírus e as
suas conseqüências clínicas em bovinos tem evoluído nos últimos anos, mas
continua sendo objeto de especulações. Roedores, felinos e bovinos são os
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prováveis reservatórios desses agentes, servindo de fonte de infecção para outros
animais e para o homem (WELBLEN, 2002).
A transmissão geralmente ocorre pelas mãos dos ordenhadores ou pelo
equipamento de ordenha, bem como pela inalação de partículas contaminadas. A
penetração do vírus ocorre em lesões pré-existentes na pele, principalmente nas
tetas e úbere (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
Os poxvírus geralmente são resistentes as condições ambientais, ao calor,
dessecação, desinfetantes e são capazes de manter sua infectividade em restos
celulares por muitos anos (MURPHY et al., 1999).
As perdas econômicas resultam da inconveniência na hora da ordenha, por
causa da sensibilidade das tetas, infecções secundárias como mastite, gastos com
medicamentos e assistência veterinária (LIEBERMANN, 1999).
No Brasil, poxviroses em bovinos foram descritas no Rio de Janeiro (SILVA
e MORAES, 1960) e Minas Gerais (REIS et al.; 1970) e vários outros casos foram
descritos ao longo dos anos (WELBLEN, 2002). Os mais recentes foram o que
ocorreram no Estado do Rio de Janeiro acometendo o gado leiteiro e os
ordenhadores (DAMASO et al., 2000, SCHATZMAYR et al., 2000, FERNANDES,
2003), Mato Grosso do Sul (FAGLIARI et al., 1999), São Paulo (TRINDADE et al.,
2003) e Minas Gerais (LOBATO et al, 2004). 2.2.1. Varíola Bovina A varíola bovina ou varíola dos bovinos é uma doença de pele contagiosa e
benigna de bovinos causada pelo Cowpox virus (CPXV), caracterizada pelo
aparecimento de lesões pustulosas tipicamente nas tetas e úbere, raramente
generalizada (MURPHY et al., 1999).
A síndrome clínica ocorria de forma benigna e esporádica, restrita aos países
da Europa e Ásia, mas a incidência parece ter diminuído, a ponto de ser rara nessas
regiões. Em um rebanho atingido, a morbidade varia de acordo com as condições de
higiene, cuidados com saúde e imunidade dos animais, causando perdas
econômicas pela dificuldade no momento da ordenha, gasto com assistência
veterinária, casos de mastite e assistência médica com os ordenhadores que
geralmente são acometidos (WELBLEN, 2002).
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A transmissão ocorre principalmente através das mãos dos ordenhadores e
das ventosas das ordenhadeiras, sendo a transmissão por artrópodes uma opção
ainda não confirmada. É uma zoonose quase que restrita aos ordenhadores, que
são acometidos durante a ordenha e na manipulação com os animais doentes. A
disseminação de um rebanho para outro ocorre provavelmente pela introdução de
novos animais ou pelas mãos dos ordenhadores, onde os animais acometidos
geram uma imunidade protetora, que pode permanecer por vários anos (MURPHY et
al., 1999).
A porta de entrada dos vírus são as soluções de continuidade nas tetas e
úbere, onde após um período de incubação de 03 a 06 dias, há formação de um
eritema roseolar, seguido de pápulas firmes e em relevo de cor clara, com uma zona
de hiperemia em torno da base. Posteriormente ocorre a formação da vesícula e
pústula amarelada com uma dura crosta, vermelha e aderida, medindo 1 a 2 cm,
antes da cicatrização (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
Na fase inicial do desenvolvimento da doença pode ser observado febre
prodrômica irregular e uma dor à pressão da teta e úbere, não permanecendo
durante a cicatrização da lesão (LIEBERMANN, 1999).
As lesões são principalmente observadas no período de vesícula, mas que
logo se rompem pela ação mecânica da ordenha, formando uma úlcera que progride
para o estágio de crosta, que geralmente são poucas por tetas, que podem não
permanecer em vacas que estão sendo ordenhadas, sendo substituídas por uma
ulceração profunda (MURPHY et al., 1999).
As lesões normalmente estão localizadas nas tetas e úbere, podendo em
casos mais graves, acometer partes interna da coxa e raramente o períneo, vulva e
boca, abrindo porta para uma infecção secundária. O desenvolvimento da dor
interfere na liberação do leite, dificultando a ordenha e facilitando o aparecimento de
mastite (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
O prognóstico é bom, mas em geral as lesões permanecem de 3 a 10
semanas, de acordo com as medidas de controle das infecções secundárias
(LIEBERMANN, 1999). No diagnóstico diferencial da varíola bovina deve-se levar em consideração
as seguintes patologias: Pseudovaríola; Mamilite ulcerativa bovina; Impetigo do
úbere; Fibropapiloma da teta; lesões pelo Vaccinia virus; Febre aftosa; Lesões
traumáticas; Lesões químicas. (LIEBERMANN, 1999).
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O CPXV pode causar infecções em bovinos, humanos, animais de
zoológicos e animais domésticos, com distribuição dos casos nas regiões da Europa
e Ásia (FENNER, 1996). No Brasil, ainda não temos relato de isolamento do CPXV
de bovinos e humanos (TRINDADE et al., 2003).
2.2.2. Pseudovaríola A pseudovaríola bovina em bovinos, varíola mamária bovina ou “nódulos dos
ordenhadores” em humanos é causada pelo Pseucowpox virus ou Paravaccinia virus
(Vírus da Pseudovaríola-PCPV), do gênero Parapoxvirus, apresentando
características morfológicas diferentes do gênero Orthopoxvirus (ESPOSITO et al,
2005).
A forma de transmissão e disseminação são as mesmas apresentadas na
Varíola bovina, diferindo no contexto de distribuição, na qual a Pseudovaríola tem
distribuição mundial. A morbidade varia de 60 a 100% no gado bovino leiteiro,
acometendo principalmente vacas recém paridas ou introduzidas no rebanho.
O PCPV ocorre como infecções endêmicas em bovinos em muitos paises do
mundo (MURPHY et al., 1999).
O período médio de incubação é de seis dias, tendo como principal porta de
entrada as soluções de continuidade na pele da teta e úbere. Inicialmente aparece
um ligeiro edema ou eritema, ao qual segue a formação de uma película de
exsudato brilhante que em 48 horas há formação de uma pápula. As pápulas
formam finas escaras que cicatrizam, sem haver a formação de vesículas
amareladas, como na varíola bovina. Os sintomas clínicos são variáveis,
caracterizado por lesões crônicas ou agudas, podendo existir até 10 (dez) lesões por
teta. (LIEBERMANN, 1999).
As lesões agudas iniciam-se como eritema no local de replicação do vírus,
progredindo para vesícula ou pústula que se rompem em 48h, formando finas
escaras, que cicatrizam dando origem as crostas, que medem 0,5 a 2,5 cm de
diâmetro. Após 10 dias elas se soltam deixando uma lesão anelada em forma de
ferradura. A doença desaparece em média de 20 dias após os primeiros sintomas.
As lesões crônicas também se iniciam como eritema, mas logo progridem para
crostas cinza-amareladas, moles e escamosas, que são desgastadas pela ordenha,
que podem persistir por meses. (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
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No diagnóstico diferencial da Pseudovaríola bovina devem ser consideradas
as seguintes patologias: Varíola Bovina; Mamilite ulcerativa bovina; Impetigo do
úbere; Fibropapiloma da teta; lesões pelo Vaccinia virus; Febre aftosa; Lesões
traumáticas; Lesões químicas. (MURPHY et al., 1999).
2.2.3. Doença causada pelo Vaccinia virus
O Vaccinia virus (Vírus vaccínia-VACV) faz parte do gênero Orthopoxvirus, que
se originou provavelmente em isolado do vírus da varíola bovina. Sendo utilizado
inicialmente para produzir vacinas contra a varíola humana (GUIDO e ESPER,
2002).
Nas décadas de 60 e 70, época de intensa vacinação com VACV, eram
comuns os relatos de surtos do VACV em animais domésticos, como bovinos,
porcos e búfalos que eram contaminados pelas pessoas recém vacinadas que, por
sua vez, transmitiam o vírus às pessoas em contato com as lesões (LUM et al.,1967,
TOPCIU et al.,1976). Com a interrupção da vacinação, os surtos desapareceram,
confirmando a suposição consenso na literatura de que o VACV não teria um
reservatório animal, não permanecendo dessa forma na natureza (FENNER et al.,
1989). A exceção ocorreu na Índia, com aparecimento de surtos de Buffalopox virus
(BPXV), agente causal de uma zoonose de grande importância econômica,
detectada até os dias de hoje (KOLHAPURE et al., 1997).
Os primeiros relatos foram descritos nas décadas de vacinação antivariólica
no Egito e na Índia, onde criações de búfalos eram afetadas. As lesões nas tetas e
úberes dos búfalos eram transmitidas para vacas e para mãos e braços de
ordenhadores, de forma semelhante às lesões por CPXV e VACV. Nos anos 80
comprovou-se que o BPXV é uma cepa do VACV, derivada provavelmente de cepas
vacinais utilizadas na profilaxia da varíola naqueles países e que, de alguma forma,
o vírus se estabeleceu na natureza encontrando algum reservatório animal
(DUMBELL e RICHARDSON, 1993).
O BPXV era considerado apenas uma exceção à regra. Contudo, a
caracterização do vírus Cantagalo (DAMASO et al., 2000) e do vírus Araçatuba
(TRINDADE et al.,2003) no Brasil, como causadores de infecções em bovinos e
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ordenhadores, reforçaram a idéia de que o VACV pode realmente se estabelecer na
natureza.
Através de métodos moleculares, foi traçada a origem do vírus Cantagalo,
como uma cepa vacinal (VACV-IOC), produzida no Instituto Oswaldo Cruz-RJ e
utilizada na campanha da Organização Mundial de Saúde (OMS) para a erradicação
da varíola no Brasil nos anos 60 e 70 (DAMASO et al., 2000); e o vírus Araçatuba
como uma nova cepa do VACV ou um desdobramento do vírus Cantagalo
(TRINDADE et al.,2003) 2.2.4. Estomatite Papular dos Bovinos A estomatite papular dos bovinos ou estomatite papulosa dos bovinos é uma
doença viral infecciosa benigna, com distribuição mundial, caracterizada por lesões
ulcerativas ou erosivas da mucosa oral de bovinos. É causada pelo Bovine papular
stomatitis virus (Vírus da estomatite papular dos bovinos - BPSV), pertencente ao
gênero Parapoxvirus. A sua importância baseia-se no seu diagnóstico diferencial e
como abertura de porta para infecções secundárias. (MOSS, 1996).
O Bovine papular stomatitis virus tem distribuição mundial, acometendo
bovinos, mas também podem acometer o homem. A transmissão ocorre através de
contato direto ou através de alimentos contaminados, ocorrendo principalmente na
primavera e no verão, após ação de fatores estressantes para os animais (MURPHY
et al., 1999). A morbidade pode alcançar 100%, principalmente na faixa etária de duas
semanas a dois anos de idade, induzindo uma imunidade baixa e pouco duradoura,
podendo ocorrer recidivas da infecção (BLOOD e RADOSTITS, 1991)
As lesões iniciam-se como pequenas pápulas no local de penetração do vírus,
adquirem coloração vermelho escuro, expandindo-se para periferia, e com aspecto
arredondado. À medida que a lesão se expande, o centro fica cinza-acastanhado,
coberto por um tecido necrótico, que se apresentam em crostas quando as lesões
são externas (LIEBERMANN, 1999).
As lesões estão confinadas ao focinho, narinas, mucosa da boca e
ocasionalmente na mucosa do esôfago. Na boca as lesões acometem toda
superfície interna, sendo mais comum nos lábios e próximo aos dentes. As lesões
individuais cicatrizam de 04 (quatro) a 07 (sete) dias, podendo permanecer por
18
várias semanas, além de favorecer a entrada para infecções secundárias. O animal
pode apresentar febre baixa (39,5 °C), anorexia transitória, ptialismo e perda de
peso (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
2.2.5. Dermatose Nodular dos Bovinos A Dermatose Nodular dos Bovinos, Doença da Pele Granulosa ou “Lumpy
Skin Disease” é uma doença de evolução aguda, subaguda ou inaparente que afeta
os bovinos; caracterizada por febre e aparecimento de nódulos cutâneos
circunscritos que podem necrosar. A musculatura esquelética e mucosa do aparelho
digestivo e respiratório também podem ser acometidas (LIEBERMANN, 1999).
O agente etiológico da dermatose nodular dos bovinos é o Lumpy skin
disease virus (Vírus da dermatose nodular dos bovinos), pertencente ao gênero
Capripoxvirus, com características morfológicas semelhantes ao Vaccinia virus
(MURPHY et al.,1999).
O hospedeiro natural da Lumpy skin disease virus é o bovino e os
hospedeiros experimentais são os ovinos, caprinos, girafas e antílopes. A
distribuição geográfica da doença esta restrita na África, Egito e Israel, com
morbidade variando entre 5 a 85% e mortalidade entre 1 a 10% (MURPHY et
al.,1999).
A transmissão ainda é desconhecida, sendo os artrópodes os principais
suspeitos. O vírus tem sido encontrado na pele, lesões cutâneas, crostas, saliva,
secreção nasal, leite, sêmen, músculo e linfonodos de animais acometidos. O
período de incubação médio é de 12 dias, febre (40 - 41 °C) com duração de 4 a 14
dias, e surgimento de tumorações ou nódulos na pele medindo entre 1 a 5 cm,
generalizado em todo o corpo. (LIEBERMANN, 1999).
O animal apresenta abatimento, anorex salivação excessiva, secreção
oculonasal e agalaxia; nódulos na pele, no te
aumento significativo dos linfonodos, podendo
tamanho normal. Podem-se observar complicaçõ
aborto, infecção intra-uterina. As lesões podem
1999).
14ia,
13 cido subcutâneo e musculatura; oatingir em até quatro vezes o
es como mastite, tendinite, artrite,
durar semanas. (LIEBERMANN,
19
2.3. Diagnóstico O diagnóstico das poxviroses é realizado clínico e laboratorialmente. O
diagnóstico clínico geralmente não é suficiente, tornando-se necessário estabelecer
um diagnóstico laboratorial específico (IKETANI et al., 2002).
Os testes para o diagnóstico específico das poxviroses são geralmente de
três princípios:
1) Através da demonstração da partícula viral, antígeno viral ou ácido nucléico;
2) Através da demonstração do anticorpo viral;
3) Visualização das inclusões intracitoplasmaticas.(MURPHY et al.,1999).
2.3.1. Isolamento Viral As lesões cutâneas e o líquido vesicular constituem as amostras de escolha
para o isolamento do vírus. Os poxvírus são estáveis e permanecem viáveis em
amostras clínicas durante várias semanas, mesmo sem qualquer refrigeração
(BROOKS et al., 2000).
O isolamento do vírus é efetuado por inoculação do líquido vesicular ou
macerado de crostas na membrana corioalantóide de ovo embrionário (MCA) ou em
cultura de células de origem humana e de primatas, que são as mais susceptíveis
(WELBLEN, 2002). Fibroblastos de embrião de galinha (CEF), células epitelióides do
carcinoma laríngeo humano (HEp-2), células fibroblastóides de rim de hamster baby
(BHK-21), Células do glioma de rato (C6), células epitelióides do túbulo distal de rim
canino (MDCK), células fibroblastóides de rim de macaco verde africano (Vero),
células epitelióides de rim de macaco verde africano (BSC-40) e fibroblastos de
embrião de camundongos normais NIH/3T3 são as principais linhagens de células
utilizadas no isolamento dos poxvírus (DAMASO et al., 2000).
2.3.2. Microscopia Eletrônica A microscopia eletrônica é um instrumento utilizado na diferenciação dos
agentes, levando-se em conta o tamanho e a morfologia viral, a qual pode ser
realizada de material clínico direto ou de cultura celular (BROOKS et al., 2000).
20
Os Orthopoxvivus possuem a forma retangular, medem 220-450nm de
comprimento por 140-260nm de largura, mas não podem ser distinguidos uns dos
outros à microscopia eletrônica, devido a seu tamanho e morfologia semelhantes.
Entretanto, podem ser facilmente diferenciados dos Parapoxvirus que são ovóides e
medem 250-300nm de comprimento por 150-190nm de largura (SCHATZMAYR et
al., 2000).
2.3.3. Sorologia O diagnóstico sorológico baseia-se na detecção de anticorpos através de
técnicas laboratoriais como: Ensaio imunoenzimático (ELISA), Inibição da
Hemaglutinação (HI), Imunofluorescência (IF) e Soroneutralização Viral (SN),
distinguindo entre os gêneros, mas nenhum desses testes distingue os vírus do
gênero Orthopoxvirus uns dos outros (FENNER, 1996, KURODA, et al., 1999).
2.3.4. Diagnóstico histopatológico
É realizada uma incisão tomando como amostra a escara e o tecido
subjacente, enviando ao laboratório em solução de formalina a 10%, onde após
preparo das amostras serão observadas as inclusões intracitoplasmaticas, que são
patognomônicas (MURPHY et al.,1999).
2.3.5. Técnicas Moleculares As técnicas de biologia molecular de diagnóstico são utilizadas para
caracterizar molecularmente o agente etiológico. A reação em cadeia da polimerase
(PCR), constitui uma das principais técnicas de diagnóstico molecular na
determinação dos agentes etiológicos das poxviroses (ROPP et al.,1995, MEYER et
al.,1997).
A técnica de PCR, desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis, consiste na
amplificação específica de um curto segmento definido de ácido desoxirribonucléico
(DNA) in vitro usando uma DNA polimerase, um molde de DNA genômico, desoxi-
nuclotídeos-trifosfatos (dNTP`s – adenina, guanina, citosina e timina) e iniciadores
21
(primers) ou oligonucleotídeos flanqueando o segmento a ser amplificado (MEYER
et al.,1994).
A técnica de PCR possibilita a reprodução de milhares de cópias de um
determinado fragmento de DNA molde, a partir de amostras de diferentes materiais
como líquido vesicular, crostas, escaras das lesões e do isolado da cultura celular
(ROPP et al.,1995).
2.3.6. Caracterização Molecular de Orthopoxvirus A caracterização molecular de um Orthopoxvirus pode ocorrer a partir de
genes ou regiões subgenômicas conservadas do DNA viral, como os genes Timidina
Quinase (TK), Corpúsculo de Inclusão do Tipo Acidofílico (ATI), Hemaglutinina (HA)
(DA FONSECA, et al., 2002)
O gene da hemaglutinina (HA) é um gene não estrutural que codifica uma
glicoproteína do envelope viral na fase final da infecção por Orthopoxvirus.
(DAMASO et al., 2000).
A proteína do corpúsculo de inclusão citoplasmática do tipo acidofilíca é
codificada pelo gene ATI, molecularmente caracterizada em várias espécies de
Orthopoxvirus, porem alguns Orthopoxvirus podem não possuir esse gene
(ULAETO, et al., 1996).
O gene TK é um gene altamente conservado no genoma dos Orthopoxvirus,
sendo responsável em codificar a timidina-quinase, uma enzima participante do
metabolismo de ácidos nucléicos. Esse gene tem sido utilizado amplamente para
caracterização molecular de Orthopoxvirus (TRINDADE, et al 2003).
2.4. Prevenção e Controle O tratamento das poxviroses bovina é sintomático, com uso de
antibioticoterapia tópica ou sistêmica, e uso de soluções iodofórmicas para
prevenção das infecções secundárias e agravamento das lesões (BLOOD e
RADOSTITS, 1991).
A prevenção e o controle consistem basicamente nas medidas de higiene na
ordenha. Pois, não se dispõe de vacinas eficientes contra as poxviroses em bovinos
e pouco se sabe sobre o papel do colostro ou imunidade passiva neste grupo de
22
enfermidades (ACHA e SZYFRES, 1986). A imunidade adquirida por uma infecção
prévia com o Vaccinia virus ou Cowpox virus não protege os animais do
Pseudocowpox virus (WELBLEN, 2002).
A prevenção da disseminação é difícil, pois o vírus é transmitido por contato
direto e indireto, entretanto para minimizar a disseminação deve-se:
1. Realizar a desinfecção correta das ordenhadeiras e antissepsia das mãos dos
ordenhadores;
2. Evitar o trabalho de ordenhadores de outras propriedades;
3. Lavar as tetas com água e sabão, bem como a imersão em solução de tintura
alcoólica de um desinfetante, antes da ordenha;
4. Ordenhar por último os animais com lesões, gerando uma linha de ordenha;
5. Examinar os tetos e o úbere antes da aquisição de animais de reposição;
6. Manter as tetas e úberes sadios;
7. Higienizar todas as instalações;
8. Não realizar o transporte dos animais doentes para outra propriedade;
9. Realizar a quarentena dos animais recém adquiridos;
(Adaptado BLOOD e RADOSTITS,1991).
2.5. Infecção zoonótica humana por poxvírus Os vírus da família Poxviridae são epiteliotrópicos e comumente produzem
lesões cutâneas no homem e animais. Dentre os oito (08) gêneros da família
Poxviridae os Orthopoxvirus, os Parapoxvirus e os Yatapoxvirus são os mais
conhecidos causadores de zoonoses humanas (Tabela 8). A maioria desses casos
tem caráter ocupacional, esporádico, baixa morbidade e com lesões cutâneas. A
exceção é o Monkeypox, com significante morbidade e mortalidade entre crianças.
(JONES, 2004).
23
Tabela 8. Principais vírus da família Poxviridae causadores de infecção zooonótica.
Gênero Vírus Abreviação Doença Cowpox virus CPXV Cowpox ou Varíola Bovina
Monkeypox virus MPXV Monkeypox ou Varíola dos macacos
Buffalopox virus BPXV Buffalopox ou Varíola dos Búfalos
Vaccinia virus VACV Lesão localizada Cantagalo virus
(Similar ao Vaccinia virus)
- Lesão localizada
Araçatuba virus (Similar ao Vaccinia
virus)
- Lesão localizada
Orthopoxvirus
Passatempo virus (Similar ao Vaccinia
virus)
- Lesão localizada
Orf virus ORFV Dermatite pustular contagiosa
Pseudocowpox virus ou Paravaccinia
vírus
PCPV Pseudocowpox ou Nódulo dos ordenhadores
Bovine papular stomatitis virus
BPSV Estomatite papular dos bovinos
Parapoxvirus
Sealpox virus
- Sealpox
Yatapoxvirus Tanapox virus TANV Tanapox
Os casos de infecção zoonótica humana por poxvírus possuem em comum o
aparecimento de lesões cutâneas após um período de incubação variável, com
lesões que progridem de máculas para pápulas, podem desenvolver pústulas antes
de formar crostas e cicatrizar. Geralmente observam-se poucas lesões cutâneas,
usualmente associadas com febre, adenopatia e graus variáveis de prostração
(BAXBY e BENNETT, 1997).
2.5.1. Monkeypox
Monkeypox ou varíola dos macacos é causada pelo Monkeypox virus, uma
poxvirose caracterizada por lesões pústulo-vesiculares na pele e mucosa,
principalmente dos animais, podendo acometer os humanos, tendo como principais
reservatórios os esquilos e outros roedores. A monkeypox humana é uma zoonose
viral rara, endêmica na África Central e Ocidental, que recentemente emergiu nos
24
Estados Unidos da América, caracterizando a primeira ocorrência da monkeypox
humana no hemisfério ocidental. (Di GIULIO e ECKBURG, 2004).
Após 1997, o monkeypox humano atraiu pouca atenção mundial. Entretanto
em maio de 2003, o CDC/Atlanta/EUA recebeu relatórios da região Central dos EUA,
sobre 81 casos de pacientes que desenvolveram febre e rash cutâneo após o
contato com cães da pradaria domesticados e outros mamíferos. Dos 81 casos, 32
foram confirmados laboratorialmente como Monkeypox humano, uma doença nunca
relatada previamente no hemisfério ocidental (Di GIULIO e ECKBURG, 2004).
As investigações identificaram uma remessa internacional de
aproximadamente 800 pequenos mamíferos, como esquilos (Funisciurus spp,
Heliosciurus spp), ratos gigantes da Gambia (Cricetomys spp), porcos-espinho
(Atherurus spp) e ratos (Graphiurus spp, Hybomys spp) de Ghana para o Texas,
como a fonte mais provável para a introdução de MPXV nos EUA, pois foram
encontrados 06 animais infectados por MPXV. (CDC, 2003)
2.5.2. Varíola Bovina A varíola bovina ou cowpox é causa pelo CPXV, que acometem os bovinos e
o homem, com característica zoonótica extremamente rara e restrita aos países da
Europa e Ásia. Embora originalmente descrita como infecção adquirida pelos
ordenhadores do gado bovino leiteiro, existem casos de infecção humana
resultantes do contato com roedores (WOLFS et al, 2002).
O período de incubação da varíola bovina no homem é de aproximadamente
07 (sete) dias. Inicialmente observa-se um abrupto aumento da temperatura, mal
estar generalizado, associado com cefaléia, adenopatia regional, mialgia e algumas
vezes náusea e vômito. As lesões cutâneas geralmente aparecem nas mãos e na
face, iniciando com pápulas vermelhas, frequentemente solitárias que se
transformam em pústulas com posterior formação de escaras enegrecidas, como
observadas nas lesões do Antraz. Ocasionalmente desenvolvem-se lesões oculares,
podendo causar cegueira, mas com baixa letalidade. (BAXBY et al, 1994).
A infecção pelo Cowpox virus confere uma imunidade contra a varíola
humana, fato explorado inicialmente por Edward Jenner em 1796 na Inglaterra,
quando vacinou com sucesso uma criança contra varíola humana, utilizando material
25
da varíola bovina de um ordenhador. Contudo a imunidade decresce com o tempo, e
uma segunda infecção pelo Cowpox vírus pode ocorrer (JONES, 2004).
2.5.3. Buffalopox O Buffalopox ou varíola do búfalo é uma doença endêmica no rebanho
bufalino da Índia, ocasionada pelo BPXV, provavelmente uma subespécie do VACV.
A doença nos búfalos, e por vezes nos bovinos, é indistinguível clinicamente da
varíola bovina, podendo ser transmitida aos seres humanos, com aparecimento de
lesões localizadas, semelhantes ao cowpox, mas menos severa (KOLHAPURE et
al., 1997).
Recentes surtos sugerem a existência de infecção subclínica, em que
evidências sorológicas de anticorpos neutralizantes para BPXV têm sido
encontradas em crianças que nunca tiveram contato com animais infectados.
Algumas crianças têm desenvolvido lesões generalizadas quando em contato com
familiares com BPXV, sugerindo a transmissão pessoa a pessoa (KOLHAPURE et
al., 1997).
2.5.4. Cantagalo virus, Araçatuba virus e Passatempo virus Nos últimos cinco anos, inúmeros casos de doença pústulo-vesicular
ocorreram em diversas fazendas nos Estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas
Gerais, acometendo o gado bovino leiteiro e pessoas, principalmente retireiros e
seus familiares, nos quais as características clínicas e o diagnóstico laboratorial
identificaram cepas de Vaccinia-like virus, da família Poxviridae como causador dos
surtos. Na ocasião DAMASO et al. (2000), isolaram e caracterizaram
molecularmente de lesões dos bovinos o Cantagalo virus (CTGV) na cidade de
Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro; TRINDADE et al. (2003), o Araçatuba virus
na cidade de Araçatuba no Estado de São Paulo; LEITE (2003), o Passatempo virus
em Passatempo no Estado de Minas Gerais e NAGASSE-SUGAHARA et al. (2004),
o Vaccinia-like virus como causador de surtos de poxvirose em humanos nos
Estados de Minas Gerais, São Paulo e Goiás.
Como descrito no item 2.2.3. a origem do Cantagalo virus, através de
métodos moleculares, foi traçada à cepa vacinal (VACV-IOC), produzida no Instituto
26
Oswaldo Cruz-RJ e utilizada na campanha da Organização Mundial de Saúde
(OMS) para a erradicação da varíola no Brasil nos anos 60 e 70 (DAMASO et al.,
2000). Determinou-se que tanto o Araçatuba virus e o Passatempo virus seriam
novas cepa do VACV ou desdobramento do vírus Cantagalo (TRINDADE et al.,
2003, LEITE, 2003), reforçando a idéia de que o VACV pode realmente se
estabelecer na natureza, como observado com BPXV.
As lesões cutâneas em humanos causadas pelos Cantagalo virus,
Araçatuba virus, Passatempo virus e os outros Vaccinia-like virus são semelhantes
às causadas pelo CPXV. (TRINDADE et al., 2003, LEITE, 2003, NAGASSE-
SUGAHARA et al., 2004).
2.5.5. Dermatite pustular contagiosa, Nódulo dos Ordenhadores, Estomatite papular bovina A Dermatite pustular contagiosa é uma doença que acomete os ovinos e
caprinos e o Nódulo dos Ordenhadores e a Estomatite papular bovina acomete
principalmente os bovinos, mas o vírus pode ser transmitido ao homem através do
contato direto com os animais infectados. É considerada uma doença humana
ocupacional, onde a transmissão pessoa a pessoa ocorre raramente.
O período de incubação varia de 03 a 07 dias, com aparecimento de pápulas
eritrematosas que progridem para formação de escaras, que cicatrizam após 06 a 08
semanas. As características clínicas são similares, com aparecimento de lesões
solitárias e em poucos casos generalizadas, usualmente na mão ou braço,
facilmente reconhecidas em trabalhadores de áreas endêmicas. Contudo, lesões
atípicas podem ser confundidas com antraz, cowpox, lesões herpéticas, granuloma
piogênico e carcinoma de células escamosas. A cegueira tem sido relatada como
complicação da Dermatite pustular contagiosa. (BOWMAN et al,1981; HANSEN et
al, 1997; YIRREL e VESTEY, 1994)
2.5.6. Sealpox Sealpox ou varíola das focas é uma poxvirose que acomete principalmente
as focas, podendo ser transmitidas ao homem, causando lesões semelhantes as da
Dermatite Pustular Contagiosa. Os casos humanos descritos na literatura são de
27
tratadores de focas agredidos por animais infectados como as focas do porto (Phoca
vitulina) e as focas acinzentadas (Halichoerus grypus). Recentemente um técnico em
animais marinhos da costa da Escócia apresentou o desenvolvimento de lesões
semelhantes a da dermatite pustular contagiosa, após a mordida de uma foca
acinzentada. O diagnóstico laboratorial pelo PCR confirmou a presença do Sealpox
virus como o agente causador do sealpox, descartando o Orf virus (JONES, 2004)
2.5.7. Tanapox Tanapox é uma infecção cutânea muito comum em regiões da África,
sobretudo no Quênia e no Zaire, causada pelo Tanapox virus, um vírus que foi
isolado pela primeira vez em 1962 no Quênia. É uma doença febril e está associada
com uma ou duas lesões muito semelhante a do monkeypox, o que a torna
importante no diagnóstico diferencial. Ocorre em todas as idades, principalmente
entre os tratadores de animais, mas acredita-se que a transmissão por artrópodes
contaminados seja possível. (JEZEK et al, 1985)
O tanapox começa com um período febril de 3 a 4 dias, podendo incluir
cefaléia intensa, prostração e adenopatia regional. Em geral, as lesões iniciam-se
como pápulas que evoluem para uma necrose central, sem a formação de pústula,
que cicatrizam em 4 a 7 semanas. Um recente caso foi relatado na Europa em um
turista que retornara de uma viagem à África. (STICH et al, 2002)
28
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Distribuição das amostras Os espécimens clínicos foram coletados em 28 propriedades de gado de
leite, com notificação de casos de doença pústulo-vesicular em bovinos e/ou
pessoas, distribuídas em oito (8) municípios (Alegre, Atílio Vivacgua, Cachoeiro do
Itapemirim, Castelo, Itapemirim, Piúma, Presidente Kennedy e Rio Novo do Sul)
todos localizados no Sul do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002
a maio de 2005.
Os dados referentes às propriedades, aos animais e aos humanos foram
anotados em planilhas de dados (em anexo).
3.2. Coleta dos espécimens clínicos Todas as amostras foram identificadas quanto à procedência, data, origem
animal ou humana, tipo e local da lesão, idade, sexo, raça, sadio ou doente. Após a
identificação, as amostras foram transportadas refrigeradas ao Laboratório de
Sanidade Animal (LSA)/CCTA/UENF, e armazenadas a –20 oC.
29
3.2.1. Crostas das lesões
As crostas das lesões de animais e ordenhadores foram coletadas com
auxílio de uma pinça e acondicionadas em recipientes estéreis para posterior
transporte. Foram coletadas um total de 50 amostras de crostas, sendo 3 de
ordenhadores e 47 de bovinos de leite.
3.2.2. Sangue
As amostras de sangue de bovinos e ordenhadores (adultos e jovens),
doentes e sadios, foram coletadas em tubos vacuette (Greiner Bio-one) com ativador
de coágulo e gel separador para posterior obtenção do soro no Laboratório de
Virologia Veterinária LSA/CCTA/UENF. Foram coletadas um total de 200 amostras
de sangue de bovinos (100 bovinos clinicamente doentes e 100 clinicamente sadios)
e 91 amostras de sangue humana, sendo 89 de ordenhadores (67 clinicamente
doentes e 22 clinicamente sadios) e 2 doentes não ordenhadores
3.3. Isolamento viral O isolamento viral, a partir das crostas, foi realizado no Laboratório de Vírus
do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais, em Belo Horizonte/MG.
3.3.1. Suspensão de crostas Cada amostra de crosta foi macerada em Solução Salina Tamponada (PBS)
0,01M pH 7.2 acrescido com gentamicina (100mg/L), anfotericina B (5mg/L) e
penicilina potássica ou sódica (400.000 U/L). A maceração ocorreu com auxílio de
um gral e areia fina lavada e autoclavada. A suspensão obtida foi coletada e
centrifugada a 2790 x g a 4 °C por 5 minutos em Microcentrífuga EPPENDORF, para
coleta do sobrenadante e armazenamento em freezer -70 °C.
30
3.3.2. Multiplicação viral em membrana corialantóide de ovos embrionados Um volume de 100 µL do sobrenadante obtido do macerado de cada crosta,
com auxílio de uma seringa de 1 mL e agulha 13 x 0,4 mm, foi inoculado na
membrana corialantóide de ovos embrionados de galinha (MCA) com 10 dias de
vida. Para a inoculação em membrana corialantóide realizou-se o deslocamento da
câmara de ar dos ovos com auxílio do ovoscópio; os ovos encontravam-se
previamente limpos e desinfectados com tintura de iodo 2%. Os ovos foram
acondicionados em estufa umedecida a 37 °C durante 72 horas e transferidos para
câmara fria a 4 °C por 12 horas. As MCA`s foram retiradas assepticamente dos ovos,
coletando-se a região com presença de lesões do tipo “pocks”, e armazenadas a -70
°C.
3.3.3. Multiplicação viral em células Vero Cada amostra de MCA com lesão do tipo “pocks” foi macerada em Solução
Salina Tamponada (PBS) 0,01M pH 7.2 acrescido com gentamicina (100mg/L),
anfotericina B (5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (400.000 U/L). A maceração
ocorreu com auxílio de um gral e areia fina autoclavada. A suspensão obtida foi
coletada e centrifugada a 2790 x g a 4 °C por 5 minutos em Microcentrífuga
EPPENDORF para obter a suspensão viral.
Células Vero cultivadas em monocamada nas garrafas de cultivo celular de
50 mL (75 cm2)foram infectadas com 100 µL da suspensão viral diluída em 1 mL de
meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL), acrescido
de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica
(200.000 U/L). Após o período de 1 hora de adsorção em estufa a 37 °C,
acrescentou-se 4 mL de meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável
da GibcoBRL), suplementado com 1% de soro fetal bovino (SFB) e com antibióticos
gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica
(200.000 U/L). A garrafa foi mantida em estufa 37 °C até o aparecimento de efeito
citopático (ECP) em forma de placa de lise.
Após o aparecimento do ECP, o meio foi descartado da garrafa e as células
desprendidas com auxilio de um raspador. As células desprendidas foram diluídas
em Solução Salina Tamponada (PBS) 0,01M pH 7.2 e centrifugadas a 251 x g a 4 °C
31
por 5 minutos em Microcentrífuga EPPENDORF. O sobrenadante foi desprezado e o
sedimento (extrato celular) foi armazenado a -70 °C.
3.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para Orthopoxvirus
A técnica de PCR para Orthopoxvirus, a partir do DNA viral extraído do
extrato celular, foi realizada no Laboratório de Vírus do Departamento de
Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, em Belo Horizonte/MG.
3.4.1. Extração de DNA viral
As extrações de DNA viral foram realizadas através da técnica do
Fenol/Clorofórmio a partir dos extratos celulares (item 3.3.3) como descrito por
FONSECA (1998).
3.4.2. Amplificação dos genes ATI e TK As regiões codificadoras do gene ATI e TK foram amplificadas por meio da
reação de polimerase em cadeia (PCR), utilizando uma mistura padrão, contendo
30ng de DNA viral extraído, 20 pmoles de iniciadores específicos, 20 mM de
nucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 µL de tampão Taq polimerase 10X, 1,5
mM de MgCl2, 2,5 U de Taq polimerase (Promega, USA) e H2O Mili Q estéril, em um
total de 20 µL de reação. As amostras foram cobertas com óleo mineral estéril e o
processamento foi realizado em aparelho Perkin Elmer Cetus (Perkin, USA) modelo
N 801-150 conforme descrito por LEITE (2003).
Os oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a reação de PCR do
gene ATI foram desenhados por MEYER et al (1997), a partir da região codificadora
do gene ATI do Cowpox vírus:
• ATI up: 5’ AATACAAGGAGGATCT 3’
• ATI low: 5’ CTTAACTTTTTCTTTCT 3’
As reações de PCR do gene ATI foram programadas com base na
metodologia descrita por MEYER et al (1997):
32
• 01 ciclo de 94 °C por 5 minutos, 43 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos;
• 30 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 43 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos;
• 01 ciclo de 94 °C por 1 minuto, 43 °C por 1 minuto e 72 °C por 15 minutos.
Os oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a reação de PCR para
o gene TK foram desenhados por FONSECA et al (1998):
• TK up: 5’ GCGAGGATCCAACGGCGGACATATTCAG 3’
• TK low: 5’ GCAGAAGCTTTGAGTCGATGTAACAC 3’
As reações de PCR do gene TK foram programadas com base na
metodologia descrita por MARQUES et al (2001):
• 01 ciclo de 95 °C por 5 minutos, 45 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos;
• 30 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 45 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos;
• 01 ciclo de 94 °C por 1 minuto, 45 °C por 1 minuto e 72 °C por 15 minutos.
Os fragmentos amplificados foram fracionados eletroforeticamente em gel de
agarose 1%, acrescido de 0,5 µg/mL de brometo de etídio, sob voltagem de 110 V.
Os fragmentos foram analisados e fotografados.
3.5. Soroneutralização para Orthopoxvirus
A neutralização utilizando os soros inativados a 56 °C por 1 hora dos
bovinos, ordenhadores e não ordenhadores clinicamente doentes e sadios foi
realizada em placas de 6 poços, sendo que para cada soro utilizou-se um poço com
500.000 células VERO implantadas. O vírus utilizado foi o Vaccinia virus WR, diluído
a 10-6 em meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL),
acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica
ou sódica (200.000 U/L). Os soros foram diluídos em meio Auto-pow, acrescido de
gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica
(200.000 U/L), nas diluições de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640.
Para cada diluição de soro utilizou-se 300 µL do soro e 300 µL do vírus
diluído a 10-6, preparando um mistura de 600 µl que foi mantida sob agitação a 37 °C
por 1 hora, para posterior inoculação em células.
As placas contendo células inoculadas, foram incubadas a 37 °C por 01 hora
para a adsorção viral, em seguida acrescentou-se meio Auto-pow (MEM – Meio
mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL), suplementado com 1% SFB e
33
acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica
ou sódica (200.000 U/L), retornando a estufa a 37 °C até o aparecimento de ECP.
Após o aparecimento de ECP as placas foram retiradas da estufa, o meio foi
desprezado e as células foram fixadas em solução de formol 10% por 30 min e
corados com solução de cristal violeta por 15 min.
O titulo de cada soro foi obtido a partir da maior diluição onde houve redução
de 50% do número de placas de lise com relação as placas produzidas no controle
de vírus. O controle de vírus consistiu na utilização de uma placa inoculada com 300
µL do vírus diluído a 10-6 e 300 µL de meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle
autoclavável da GibcoBRL) com 1% de SFB e acrescido de gentamicina (50mg/L),
anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L).
3.6. Divulgação e controle do surto
Estabeleceu-se uma parceria técnica entre a Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Universidade Federal do Espírito Santo (UFES),
Instituto de Defesa Agropecuário e Florestal do ES (IDAF-ES) e Secretaria de Estado
da Saúde, possibilitando, desta forma, a distribuição das informações sobre o surto e
a identificação dos casos, envolvendo os produtores, a comunidade rural, os Postos
de Saúde e os órgãos de Defesa Sanitária e Sanidade Animal do Estado do Espírito
Santo.
34
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos a partir do estudo do surto de poxvirose bovina e
humana no Estado do Espírito Santo estão sendo apresentados e discutidos em
tópicos.
4.1. Distribuição geográfica dos casos de poxvirose bovina e humana
Os casos de poxvirose bovina e humanas notificados e estudados no Estado
do Espírito Santo ocorreram no período de agosto de 2002 a maio de 2005 em 28
propriedades de gado de leite de oito municípios (Alegre, Atílio Vivacqua, Cachoeiro
do Itapemirim, Castelo, Itapemirim, Piúma, Presidente Kennedy e Rio Novo do Sul),
localizados no Sul do Estado, como mostra a Tabela 9 e a Figura 4.
Todos os oito (8) municípios encontram-se localizados na região Sul do
Estado, próximos aos Estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais, onde foram
notificados surtos de poxviroses bovina e humana, como descrito por DAMASO et al
(2000) e LOBATO et al (2004). Essa proximidade favorece o acometimento, nos
outros 29 municípios do Sul do Espírito Santo, principalmente os 17 municípios que
se encontram sob risco iminente da doença, por terem divisas com os municípios já
acometidos, uma vez que a principal forma de disseminação da doença baseia-se na
35
comercialização informal de bovinos sem o acompanhamento dos órgãos
fiscalizadores, como o IDAF-ES, prática essa comum entre as propriedades
visitadas. Além disso, a utilização da mesma mão-de-obra (ordenhador) entre
propriedades vizinhas, certamente contribuiu na disseminação da doença, tornado-
se necessário à aplicação imediata de ações de controle e profilaxia da doença,
restringindo-se ao máximo a sua disseminação.
Figura 4. Distribuição geográfica dos casos de poxvirose bovina e humana nos municípios do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
BA
Casos de Poxvirose Bovina e Humana
Municípios
A. Alegre B. Atílio Vivacqua C. Cachoeiro de Itapemirim D. Castelo E. Itapemirim F. Piúma G. Presidente Kennedy H. Rio Novo do Sul
MG
RJ
Oceano Atlântico
36
Tabela 9. Localização geográfica dos municípios do Estado do Espírito Santo com casos de poxvirose bovina e humana, no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Coordenadas
Município Latitude Longitude
Altura
Alegre -20:45:49 Sul -41:31:59 Oeste 254
Atílio Vivacqua -20:54:51 Sul -41:11:54 Oeste 85
Cachoeiro de Itapemirim -20:50:56 Sul -41:06:46 Oeste 36
Castelo -20:36:13 Sul -41:11:05 Oeste 100
Itapemirim -21:00:40 Sul -40:50:02 Oeste 20
Piúma -20:50:16 Sul -40:43:19 Oeste 2
Presidente Kennedy -21:05:56 Sul -41:02:48 Oeste 55
Rio Novo do Sul -20:51:45 Sul -41:56:11 Oeste 70
Fonte: IBGE Ao comparamos a Tabela 10 com os dados do IBGE (2000) sobre produção
de leite nos municípios e no Estado do ES, observamos que umas das principais
regiões produtoras de leite do Espírito Santo, responsável por mais de 42% da
produção de leite do Estado, já se encontra acometida pela doença, principalmente
os municípios de Alegre, Cachoeiro de Itapemirim e Presidente Kennedy, que foram
os mais acometidos, e que juntos representam mais de 33% da produção de leite do
Sul do Espírito Santo.
4.2. Características epidemiológicas da poxvirose bovina
Observa-se, na Tabela 10, que 28 propriedades de 08 dos 78 municípios
localizados no Estado do Espírito Santo foram acometidas com a poxvirose bovina,
onde as porcentagens da incidência clínica da poxvirose no gado leiteiro, variaram
entre 10,2 e 100% com média de 52,7%, demonstrando a alta morbidade do vírus e
o caráter epidêmico da doença, mesmo em propriedades com diferentes sistemas de
manejos, como na fazenda G04, possuidora de um grande rebanho leiteiro.
Os municípios mais acometidos foram Alegre, Cachoeiro de Itapemirim e
Presidente Kennedy, possuindo 78,6% (n=22) das 28 propriedades acometidas no
Estado do Espírito Santo.
37
Tabela 10. Incidência clínica da poxvirose no gado leiteiro em propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Município Propriedade Leiteira
N° Bovino de leite
N° bovinos clinicamente doentes
*Incidência Clínica - %
A01 58 44 75,9 A02 40 35 87,5 A03 45 35 77,8 A04 30 28 93,3 A05 13 12 92,3 A06 34 23 67,6 A07 12 12 100 A08 50 30 60 A09 60 50 83,3 A10 40 30 75
Alegre
A11 25 10 40 Atílio
Vivacqua
B01
08
04
50
C01
212
80
37,7
C02 70 35 50 C03 60 20 33,3 C04 30 27 90 C05 40 36 90 C06 26 03 11,5
Cachoeiro de Itapemirim
C07 60 10 16,6
Castelo
D01
30
30
100
Itapemirim
E01
32
28
87,5
Piúma
F01
30
06
20
G01
48
30
62,5
G02 80 40 50 G03 256 103 40,2
Presidente Kennedy
G04 170 80 47
H01
49
05
10,2
Rio Novo do
Sul H02 12 08 66,7
Total
28
1620
854
52,7 * Os cálculos das incidências foram realizadas no momento da visita em cada propriedade. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul.
38
Tabela 11. Incidência clínica x sistema de higienização e antissepsia das tetas e das mãos dos ordenhadores nas propriedades com poxvirose no gado leiteiro no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Propriedade *Sistema de Higienização
e Antissepsia das tetas *Sistema de Higienização e Antissepsia das mãos
dos ordenhadores
Incidência Clínica - %
A01 não não 75,9 A02 não não 87,5 A03 não sim 77,8 A04 não não 93,3 A05 não não 92,3 A06 não não 67,6 A07 não não 100 A08 não não 60 A09 não não 83,3 A10 não não 75 A11 sim sim 40 B01 não não 50 C01 sim sim 37,7 C02 sim sim 50 C03 sim sim 33,3 C04 não não 90 C05 não não 90 C06 sim sim 11,5 C07 sim sim 16,6 D01 não não 100 E01 não não 87,5 F01 não não 20 G01 não não 62,5 G02 não não 50 G03 não sim 40,2 G04 não não 47 H01 sim sim 10,2 H02 não não 66,7
* Informações obtidas a partir dos responsáveis pelas propriedades. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul.
Essa variação dos valores de incidência clínica observada em nosso estudo
entre as propriedades, pode estar diretamente relacionada às medidas de higiene
durante a ordenha. As propriedades que possuíam um sistema de higienização,
antissepsia das tetas e das mãos dos ordenhadores, antes e após a ordenha, como
na fazenda H01, tiveram uma das menores taxas de incidência, como mostrado na
Tabela 11. Esses dados corroboram com a descrição de WELBLEN (2002), sobre a
39
transmissão das poxviroses bovinas, ocorrer principalmente por contato direto com
as mãos do ordenhador e os equipamentos de ordenha.
Tabela 12. Distribuição mensal do início da poxvirose no gado leiteiro nas propriedades no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Município Propriedade Mês Ano A01 maio 2003 A02 abril 2003 A03 maio 2003 A04 maio 2003 A05 maio 2003 A06 maio 2003 A07 maio 2003 A08 setembro 2002 A09 setembro 2002 A10 dezembro 2002
Alegre
A11 janeiro 2003 Atílio Vivacqua B01 maio 2005
C01 agosto 2002 C02 agosto 2002 C03 agosto 2002 C04 setembro 2002 C05 agosto 2002 C06 outubro 2002
Cachoeiro de Itapemirim
C07 setembro 2002 Castelo D01 outubro 2003
Itapemirim E01 setembro 2002 Piúma F01 outubro 2002
G01 agosto 2002 G02 setembro 2002 G03 agosto 2002
Presidente Kennedy
G04 agosto 2002 H01 setembro 2002
Rio Novo do Sul H02 outubro 2002 An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul.
Ao analisarmos a Tabela 12, detectamos que as primeiras propriedades
acometidas pela poxvirose foram as localizadas em Presidente Kennedy e
Cachoeiro de Itapemirim, e que a maioria dos casos de poxvirose bovina no gado
leiteiro no Sul do Espírito Santo teve início entre os meses de maio e setembro,
sugerindo um caráter sazonal da doença, principalmente no período seco no Estado.
40
A rápida disseminação da doença dentro da propriedade e para outras
propriedades, os altos valores de incidência clínica e o possível caráter sazonal da
doença no gado leiteiro do Espírito Santo, estão de acordo com o que fora relatado
por LOBATO et al (2004), no gado leiteiro de Minas Gerais.
4.3. Quadro clínico da poxvirose no gado leiteiro.
O quadro clínico da poxvirose no gado leiteiro do Sul do Espírito Santo
consistiu-se basicamente de lesões pústulo-vesiculares cutâneas dolorosas,
geralmente múltiplas, localizadas principalmente nas tetas, com 94,85% dos animais
apresentando lesões restritas nas tetas, como mostra a Tabela 13.
Tabela 13. Distribuição dos casos de poxviroses segundo localização das lesões no gado leiteiro nas propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Localização da lesão N° de bovinos % Teta 810 94,85
Úbere e Teta 43 5,03 Face 01 0,12 Total 854 100
Na fase inicial do desenvolvimento da doença, observou-se uma febre
prodrômica irregular e uma dor à pressão da teta e úbere, as vesículas eram
facilmente observadas, mas logo se rompiam, provavelmente pela ação mecânica da
ordenha, formando uma ulceração que progredia para crosta, que cicatrizava em
média de 20 dias após os primeiros sinais.
As Figuras 5.A., 5.B., 5.C, 5.D. e 5.E., demonstram as etapas de
desenvolvimento das lesões da poxvirose bovina, em que as lesões progrediam de
pápula para pústula-vesicular, e rapidamente se transformavam em ulceração de
borda irregular, com contornos eritemato-edematoso, formando crostas antes de
cicatrizar. O quadro clínico da poxvirose bovina do gado leiteiro no Espírito Santo é
compatível com outras poxviroses bovinas, como descrito por TIMMS et al. (1998) e
MURPHY et al. (1999), mas com rápida disseminação.
41
Mú
For Figura 5. Lesões pústulo-vesiculares ulcerativaspoxvirose no Sul do Espírito Santo. 5.A. Formavesícula; 5.C. Múltiplas úlceras irregulares nas teLesão em processo de cicatrização.
Figura 5.C. ltiplas Úlceras
Figura 5.A. Pápula
FiguraCic
nas tetas do gadção de pápula; 5.B.tas; 5.D. Formação d
Figura 5.B. Vesícula
5.E. Lesão atrizando
Figura 5.D.mação de crosta
o leiteiro com Formação de e crosta; 5.E.
42
Tabela 14. Produção de leite x Incidência clínica da poxvirose no gado leiteiro em propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Município Propriedade Leiteira
Incidência Clínica %
* Queda na Produção de Leite - %
A01
75,9
50
A02 87,5 40 A03 77,8 40 A04 93,3 50 A05 92,3 50 A06 67,6 30 A07 100 60 A08 60 50 A09 83,3 50 A10 75 30
Alegre
A11 40 30 Atílio
Vivacqua
B01
50
40
C01
37,7
20
C02 50 30 C03 33,3 20 C04 90 60 C05 90 60 C06 11,5 5
Cachoeiro de
Itapemirim
C07 16,6 20
Castelo
D01
100
60
Itapemirim
E01
87,5
60
Piúma
F01
20
10
G01
62,5
30
G02 50 30 G03 40,2 30
Presidente Kennedy
G04 47 30
H01
10,2
5
Rio Novo do
Sul H02 66,7 30
Total 28 52,7 36,4 *: A porcentagem de queda na produção de leite foi obtida a partir das informações dos responsáveis pelas propriedades. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul.
43
Os dados apresentados na Tabela 14, baseiam-se nas informações da
queda da produção leiteira fornecidas pelos responsáveis pelas propriedades, os
quais mostram a queda na produção de leite das propriedades leiteiras acometidas
com a poxvirose bovina, gerando grandes perdas econômicas, uma vez que as
mesmas vivem da produção e comercialização do leite. Além da perda econômica
com a queda na produção de leite, as propriedades tiveram prejuízos econômicos
com gastos com medicamentos, honorários de médicos veterinários e dificuldade na
contratação de ordenhadores, pois os mesmos estavam receosos com a doença ou
já estavam acometidos pela mesma.
Tabela 15. Distribuição dos casos de poxviroses do gado leiteiro, segundo idade e raça, em propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Faixa Etária em anos 02-04 05-07 08-10 11-14 Total
Raça n° % n° % n° % n° % n° %
Mestiça 139 100 343 94,23 215 83,98 59 62,10 756 88,52 Holandesa - - 10 2,75 24 9,38 22 23,16 56 6,56
Girolanda - - 05 1,37 17 6,64 10 10,53 32 3,75
Parda Suíça - - 06 1,65 - - - - 06 0,70
Patuá - - - - - 04 4,21 04 0,47
Total 139 16,28 364 42,62 256 29,98 95 11,12 854 100
Considerando os dados da Tabela 15, 42,62% dos animais acometidos
estavam dentro da faixa etária de 05 a 07 anos de idade, e 88,52% dos animais
eram animais mestiços, mas com acometimentos nas várias faixas etárias e raças
de bovino de leite. Esses dados estão de acordo com o padrão zootécnico do gado
leiteiro do Sul do Espírito Santo, que segundo o IBGE (2000) e o IDAF-ES (Instituto
Estadual de Defesa Agropecuária e Florestal do Espírito Santo) a faixa etária
predominante é a de 05 a 10 anos, predominando animais mestiços e da raça
holandesa. Com isso não podemos afirmar que exista diferenças de acometimento
da doença entre as raças leiteiras e as faixas etárias acometidas, e sim com relação
ao seu tipo de exploração, em que todos os animais eram bovinos leiteiros,
destinados à produção de leite.
44
4.4. Características epidemiológicas da poxvirose humana Foram notificados e estudados 69 casos de poxvirose humana no Estado do
Espírito Santo, onde todos ocorreram no mesmo período e nas mesmas
propriedades dos casos de poxvirose bovina, como descritas no item 4.2. Dos 69
casos, 97,1% (67 indivíduos) exerciam trabalho pecuário e rural, com a função
principal de ordenhador do gado bovino leiteiro, como mostrado na Tabela 16.
Os outros dois casos foram de familiares dos ordenhadores. No primeiro
caso, a de uma senhora de 34 anos, do lar e esposa de ordenhador. Relatou que
não teve contato com os animais doentes e que contraiu a doença durante a
lavagem das roupas do marido que estava clinicamente doente. No segundo caso,
uma menina de 05 anos, filha de ordenhador doente, contraiu a doença ao perfurar a
mão com a agulha utilizada pelo pai para romper a vesícula da sua mão, segundo
relato dos pais.
Esses dados demonstram que essa poxvirose é uma doença ocupacional
com caráter zoonótico, como em outras infecções zoonóticas humanas por poxvírus
descritas por JONES (2004).
Tabela 16. Distribuição dos casos de poxvirose humana, segundo ocupação, nas propriedades leiteiras localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Principal Ocupação N° %
Ordenhador do gado bovino leiteiro 67 97,10
Do lar e esposa de ordenhador 01 1,45
Filha de ordenhador 01 1,45
Total 69 100
Quando se observa a Tabela 17, verifica-se que os valores de incidência
clínica da poxvirose entre os ordenhadores variaram de 0 a 100% com média de
75,28%, valores que demonstram a alta morbidade do vírus e o caráter epidêmico da
doença entre ordenhadores, com valores maiores que nos bovinos, justificado pelo
caráter ocupacional da doença, levando o homem a um contato maior e em mais
vezes com os animais doentes, aumentando as possibilidades de transmissão.
Observa-se também que somente as propriedades A03 e G03, das 28 propriedades
com casos de poxvirose bovina, não apresentaram casos humanos, isso pode ser
45
explicado em parte pelo uso de luvas pelos ordenhadores no momento da ordenha
dos animais doentes, e pela sistematização de antissepsia e assepsia durante e
após a ordenha, como demonstrado na Tabela 11. Tabela 17. Incidência clínica da poxvirose nos ordenhadores de gado leiteiro no Sul do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Município Propriedade Leiteira
N° ordenhadores
N° ordenhadores clinicamente doentes
Incidência Clínica - %
A01
03
03
100
A02 04 02 50 A03 03 0 0 A04 02 02 100 A05 02 02 100 A06 01 01 100 A07 04 04 100 A08 06 03 50 A09 03 03 100 A10 01 01 100
Alegre
A11 02 01 50 Atílio
Vivacqua
B01
03
03
100
C01
04
04
100
C02 05 04 80 C03 04 02 50 C04 04 04 100 C05 03 01 33,3 C06 02 02 100
Cachoeiro de Itapemirim
C07 05 05 100
Castelo
D01
04
04
100
Itapemirim
E01
02
02
100
Piúma
F01
06
04
66,6
G01
02
02
100
G02 02 01 100 G03 02 0 0
Presidente Kennedy
G04 02 02 100
H01
04
01
25
Rio Novo do
Sul H02 04 04 100
Total
28
89
67
75,28 * Os cálculos das incidências foram realizadas no momento da visita em cada propriedade. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul.
46
4.5. Quadro clínico da poxvirose em humanos
Lesões na pele, febre (igual ou superior 39°C), linfoadenomegalia
regionalizado e mialgia foram os sinais e sintomas apresentados em 100% dos
doentes. Com relação às lesões na pele, 100% dos indivíduos referiram ter tido
vesículas com posterior formação de crostas.
Segundo relato dos doentes, a fase inicial do desenvolvimento da doença
apresentava-se uma febre prodrômica irregular igual ou superior 39°C, que durava
de 03 a 07 dias, com mialgia, fraqueza muscular e linfoadenomegalia regional. As
lesões iniciavam-se com prurido, dor e formações pústulo-vesiculares principalmente
nas mãos, como demonstra a Tabela 18 e as Figuras 6.A., 6.B., 6.C., 6.D., 6.E., 6.F.
Formavam crostas e cicatrizavam 15 a 30 dias após o seu aparecimento. Alguns
casos necessitaram de hospitalização, mas todos evoluíram para cura, em torno de
20 a 30 dias.
O quadro clínico dessa poxvirose é compatível com o quadro clínico do
Cowpox virus em humanos, descrito por BAXBY et al (1994), mas com maior
virulência, como os ocasionados por Vaccinia-like virus, em surtos de poxviroses,
descritos por (DAMASO et al., 2000, TRINDADE et al., 2003, LEITE, 2003 e
NAGASSE-SUGAHARA et al., 2004).
Tabela 18. Distribuição dos casos de poxviroses, segundo localização das lesões nos ordenhadores do Sul do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Localização da lesão N° de ordenhadores % Mão 57 85,01
Mão e Braço 06 8,95 Mão e Perna 02 3,02 Mão e Boca 01 1,51
Mão e Escroto 01 1,51 Total 67 100
Na Tabela 18 verifica-se, que 100% apresentaram lesões nas mãos. Dentre
esses, 85,01% apresentaram lesões somente na mão. O restante apresentava além
das lesões nas mãos, lesões no braço, na perna, boca e escroto; indicando a mão
como local inicial e disseminador do vírus para as outras partes do corpo.
47
L
L
L L
L
Figura 6. Lesões pústulo-vesiculares ulcerativas nas mãpoxvirose no Sul do Espírito Santo. 6.A. Lesão com 10 diavesícula; 6.C. Lesão com 20 dias; 6.D. Lesão com 20 dias6.F. Lesão com 20 dias
Figura 6.B. esão 15 dias
Figura 6.A. esão 10 dias
Figura 6.C. esão 20 diasL
Figura 6.E.esões 20 dias
Figura 6.D. esão 20 dias
os;
Figura 5.F. esão 20 dias
s de ordenhadores com ; 6.B. Lesão com 15 dias 6.E. Lesões com 20 dias;
48
Comparando as Tabelas 13 e 18, pode-se observar que a região mais
acometida dos animais é a teta e dos ordenhadores as mãos, evidenciando que
essa seria a principal forma de disseminação do bovino ao homem e do homem aos
animais, uma vez que o ordenhador trabalha em contato direto com a teta. Esses
dados corroboram com os dados de TIMMS et al. (1998) e WELBLEN (2002), para
as outras poxviroses bovinas do gado leiteiro e zoonoticas para homem.
Tabela 19. Distribuição dos casos de poxviroses, segundo idade e sexo dos ordenhadores do Sul do Estado do Espírito Santo, no período agosto de 2002 a maio de 2005. Sexo Masculino Feminino Total Faixa etária n° % n° % n° % % acumulada
10 - 14
07
10,94
00
-
7
10,45
10,45
15 - 19 07 10,94 01 33,33 8 11,94 22,39 20 - 24 09 14,06 01 33,33 10 14,92 37,31 25 - 29 12 18,75 00 - 12 17,91 55,22 30 - 34 06 9,38 00 - 6 8,96 64,18 35 - 39 13 20,32 01 33,33 14 20,89 85,07 40 - 44 05 7,81 00 - 5 7,46 92,53 45 - 49 01 1,56 00 - 1 1,49 94,02 50 - 54 01 1,56 00 - 1 1,49 95,51 55 - 59 01 1,56 00 - 1 1,49 97 60 - 64
02 3,12 00 - 2 3,00 100
Total 64 95,52 03 4,48 67 100 100 Quando se observa a Tabela 19, verifica-se que os casos ocorreram em
indivíduos de 10 a 64 anos, sendo que 92,53% concentraram-se em indivíduos com
menos de 44 anos, principalmente na faixa etária de 35 a 39 anos correspondente a
20,89% dos casos. Quanto ao sexo, 95,52% se deram em indivíduos do sexo
masculino. Esses dados refletem e estão de acordo com o perfil do trabalhador
pecuarista do Espírito Santo, que em sua maioria são homens na faixa etária de 25
a 39 anos, segundo censo demográfico do IBGE em 2000.
4.6. Isolamento viral em MCA e células Vero Coletou-se um total de 50 amostras de crostas, nos diferentes municípios
acometidos, sendo 03 de ordenhadores e 47 de bovinos de leite. Todas as 50
amostras foram maceradas e inoculadas na membrana corialantóide de ovos
49
embrionados de galinha (MCA) com 10 dias de vida (MCA`s), onde, após 72 horas,
todas as MCA`s apresentaram lesões brancas e opacas, não hemorrágicas,
característica de infecção por Orthopoxvirus, como descrito por FENNER et al,
(1989) e observados por TRINDADE et al, (2003) e FERNANDES (2003), conforme
ilustrado na Figura 7. A visualização deste efeito característico não só nos permitiu a
confirmação da presença de um agente viral no material obtido, como também a
identificação inicial deste agente como um membro do gênero Orthopoxvirus, como
responsável do surto de poxvirose bovina e humana no Sul do Estado do Espírito.
Figura 7. Membranas Corioalantódes de embriões de galinha (MCA) com múltiplas lesões brancas e opacas, não hemorrágicas, com 72h de incubação após inoculação com macerados de crostas dos bovinos e humanos com poxvirose.
As 50 suspensões virais obtidas em MCA foram utilizadas para infecção em
células Vero em monocamada, sendo que 15 amostras dos diferentes municípios
(03 humanas e 12 do gado leiteiro) demonstraram ECP característico de vírus da
Família Poxviridae.
4.7. Amplificação por PCR dos genes ATI e TK
Realizou-se a extração de DNA viral das 15 amostras que demonstraram
ECP na monocamada das células Vero, para realização da técnica de PCR dos
genes ATI e TK. Todas as amostras foram amplificadas para ambos os genes, como
mostra a Tabela 20 e visualizado com o gene TK na Figura 08. Esses resultados
confirmando que o agente etiológico da poxvirose bovina e humana do Sul do
Estado do Espírito Santo é do gênero Orthopoxvirus, provavelmente um Vaccinia-
50
like virus, como o vírus Cantagalo (CTGV) isolado por DAMASO et al.(2000), das
lesões de bovinos na cidade de Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro, o vírus
Araçatuba isolado por TRINDADE et al. (2003), na cidade de Araçatuba no Estado
de São Paulo, o vírus Passatempo por LEITE (2003), em Passatempo no Estado de
Minas Gerais e o Vaccinia-like virus em humanos em Minas Gerais, São Paulo e
Goiás por NAGASSE-SUGAHARA et al. (2004).
Tabela 20. Dados sobre a caracterização molecular das amostras virais isoladas a partir do surto de poxvirose bovina e humana no Sul do Espírito Santo
Amplificação por PCR *Amostra Gene TK Gene ATI
Humana 01 + + Humana 02 + + Humana 03 + + Bovina 01 + + Bovina 02 + + Bovina 03 + + Bovina 04 + + Bovina 05 + + Bovina 06 + + Bovina 07 + + Bovina 08 + + Bovina 09 + + Bovina 10 + + Bovina 11 + + Bovina 12 + +
* amostras de DNA viral extraídos dos extratos celulares infectados
Essa confirmação de mais um Estado do Brasil, esta sendo acometido por
surto de Orthopoxvirus, com disseminação entre animais e humanos, sustenta a
necessidade de mais pesquisas sobre o assunto, principalmente na identificação de
possíveis reservatórios animais e da Filogenética desses vírus.
51
1 9 1 2 3 4 5 6 7
500 pb
Figura 8. AmpliDNA viral extrafracionados eleetídeo.
M: Marcador d(1): Controle n(2): Extrato cel(3): Extrato cel(4): Extrato cel(5): Extrato cel(6): Extrato cel(7): Extrato cel(8): Extrato cel(9): Extrato cel(10): Extrato ce(11): Extrato ce(12): Extrato ce(13): Extrato ce(14): Extrato ce(15): Extrato ce(16): Extrato ce(17): Extrato ce 4.8. Soroneutra Os resu
anticorpos neu
humanos, estão
Na Tab
testados não a
gênero Orthopo
M
ficaídotro
e pegaulaulaulaulaulaulaulaulalulululululululu
liz
lta
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ap
ela
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xvi
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esotivr inr inr inr inr inr inr inr in
lar lar lar lar lar lar lar lar
aç
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21
se
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2
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mo;fefefefefefefefe
infinfinfinfinfinfinfinf
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3
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4
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5
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10
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tas:
ra VV WR; a humanaa humanaa humanaa bovina; a bovina; a bovina; a bovina; tra bovina;tra bovina;tra bovina;tra bovina;tra bovina;tra bovina;tra bovina;tra bovina;
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utralização
virus, no s
19 e 20. nte 5% dos
icorpos ne
1
1 1 1do genes. Os pr1% cora
; ; ;
, para d
angue d
animais
utralizant
1
1 1530 pb
TK das amostras de odutos obtidos foram do com brometo de
etectar a presença de
e 200 bovinos e 91
clinicamente doentes
es contra o vírus do
52
Esse resultado, provavelmente ocorreu, devido a coleta do sangue ter sido
realizada no inicio da infecção. Observa-se que 50% dos animais clinicamente
sadios no momento da coleta e sem historia de sintomatologia clínica, apresentaram
títulos de anticorpos neutralizantes, demonstrando a alta ocorrência de animais
assintomáticos. Isso certamente, diminuirá os efeitos esperados das ações de
medidas de controle, tornando-se necessário a implementação de um controle
sorológico para detectar esses animais, testes esses ainda não disponíveis
comercialmente.
Tabela 21. Porcentagem dos títulos de anticorpos neutralizantes para Orthopoxvirus, das amostras de soros bovinos de leite, coletados nas propriedades com surto de poxvirose no Sul do Estado do Espírito Santo, no período agosto de 2002 a maio de 2005.
**Estado Clínico *Titulo do Soro Doente Sadio
negativo 05% (n= 5) 50% (n=50) 1:20 02% (n= 2) 05% (n= 5) 1:40 17% (n=17) 10% (n=10) 1:80 27% (n=27) 35% (n=35) 1:160 25% (n=25) - 1:320 20% (n=20) - ≥ 1:640 04% (n= 4) -
Total 100% (n=100) 100% (n=100) * O titulo de cada soro foi obtido a partir do inverso da maior diluição na qual houve redução de 50% do número de placas de lise com relação as placas produzidas no controle de vírus ** Estado clínico: Doente (presença de lesões pustulo-vesicular); Sadio (ausência de lesões pustulo-vesicular) Quando se observa a Tabela 22, verificamos que mais de 90% dos
ordenhadores clinicamente doentes apresentaram títulos altos de anticorpos
neutralizantes para Orthopoxvirus, e somente dois ordenhadores foram negativos,
fato esse devido, provavelmente, aos baixos níveis de anticorpos neutralizantes no
momento da coleta do sangue. Ao analisar os clinicamente sadios, observa-se que
50% apresentaram anticorpos neutralizantes, isso pode ser explicado em parte por
uma infecção subclínica nesses indivíduos. Outra possibilidade seria a memória
imunológica induzida pela vacina contra Varíola humana, em alguns desses
indivíduos. A vacina deixou de ser aplicada após a sua erradicação em 1980,
segundo Organização Mundial da Saúde.
53
Realizou-se a soroneutralização dos 02 casos humanos clinicamente
doentes, mas não ordenhadores relatados no item 4.4. Tanto a esposa de
ordenhador quanto a filha de ordenhador, foram positivas na soroneutralização, com
títulos de 1:320 e 1:80, respectivamente.
Tabela 22. Porcentagem dos títulos de anticorpos neutralizantes para Orthopoxvirus das amostras de soros dos ordenhadores, coletados nas propriedades com surto de poxvirose no Sul do Estado do Espírito Santo, no período agosto de 2002 a maio de 2005.
**Estado Clínico *Titulo do Soro Doente Sadio
negativo 2,98% (n= 2) 50,00% (n=11) 1:20 2,98% (n= 2) 18,18% (n=04) 1:40 1,49% (n= 1) 4,54% (n= 1) 1:80 28,36% (n=19) 9,09% (n= 2) 1:160 23,88% (n=16) 4,54% (n= 1) ≥ 1:320 40,31% (n=27) 13,65% (n= 3)
Total 100% (n=67) 100% (n=22) * O titulo de cada soro foi obtido a partir do inverso da maior diluição na qual houve redução de 50% do número de placas de lise com relação as placas produzidas no controle de vírus ** Estado clínico: Doente (presença de lesões pustulo-vesicular); Sadio (ausência de lesões pustulo-vesicular) A soroneutralização confirma que o Orthopoxvirus foi o agente etiológico do
surto de poxvirose bovina e humana no Espírito Santo.
4.9. Fluxograma de notificação, identificação e controle do surto
Estabeleceu-se uma parceria técnica entre a Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, Universidade Federal do Espírito Santo, o Instituto de
Defesa Agropecuário e Florestal do Espírito Santo (IDAF-ES) e Secretaria de Estado
da Saúde, em que os casos suspeitos de poxvirose bovina e/ou humana fossem
notificados e encaminhados ao Laboratório de Sanidade Animal/CCTA/UENF para
visita e constatação do caso, conforme Fluxograma 01. .
54
Fluxograma 01. Fluxo das notificações de casos suspeitos de poxvirose bovina e/ou humana no Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005.
Casos humanos suspeitos de poxvirose
Casos bovinos suspeitos de poxvirose
Unidade Municipal de Saúde
CCA/UFES
IDAF-ES
Médicos Veterinários
Secretaria Municipal de Saúde
LSA/CCTA/UENF Secretaria Estadual de Saúde
CCA/UFES: Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo. IDAF-ES: Instituto de Defesa Agropecuária e Florestal do Espírito Santo. LSA/CCTA/UENF: Laboratório de Sanidade Animal do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
Essa parceria possibilitou uma maior abrangência, na notificação e detecção
dos novos casos de poxvirose humana e bovina no Estado do Espírito Santo,
facilitando e melhorando a distribuição das informações e do controle da
disseminação da doença. Contamos com o envolvimento dos Produtores, da
Comunidade Rural, dos Postos de Saúde, das Secretarias Municipais e Estadual de
Saúde, bem como os órgãos de Defesa Sanitária e Sanidade Animal do Estado do
Espírito Santo.
A parceria contribuiu para a divulgação das informações sobre a doença e a
implantação das ações de controle, que se basearam nos seguintes itens:
1. Implementação da linha de ordenha nas fazendas, bem como a realização da
desinfecção das ordenhadeiras e antissepsia das tetas e das mãos dos
ordenhadores;
2. Lavagem das tetas com água e sabão, e a imersão em solução de tintura
alcoólica iodada a 2%, após a ordenha;
3. Evitar o trânsito na propriedade de pessoas, principalmente trabalhadores de
outras propriedades;
55
4. Examinar as tetas e o úbere antes da aquisição de animais de reposição;
5. Proibição da comercialização dos animais das propriedades positivas;
6. Implementação da quarentena dos animais recém adquiridos
7. Manter as tetas e úberes sadios;
8. Promover a higiene de todas as instalações;
9. Orientação aos funcionários e proprietários das propriedades sobre a doença
e as suas medidas de controle;
10. Divulgação da doença e do fluxograma de notificações, via comunicado
através da Secretaria de Estado da Saúde e as Secretarias Municipais de
Saúde.
56
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES
O surto de poxvirose bovina e humana foi causado por um Orthopoxvirus,
provavelmente um Vaccinia-like virus, com alta morbidade;
A poxvirose bovina causada pelo Orthopoxvirus no Espírito Santo
apresentou caráter epidêmico e com tendência a sazonalidade nos períodos
mais secos, entre maio e setembro;
A poxvirose humana causada pelo Orthopoxvirus no Espírito Santo é uma
doença ocupacional e com caráter zoonótico;
As propriedades de gado de leite dos municípios localizados na região Sul
do Espírito Santo encontram-se sob risco iminente do surto de
Orthopoxvirus;
Essa poxvirose humana e bovina representa uma doença de importância
econômica e de saúde pública.
Medidas de controle devem ser implementadas pelos órgãos responsáveis
pela Sanidade Animal e Humana, visando o controle da doença, impedindo
sua disseminação para outras regiões.
Estudos devem ser implementados, no intuito de descobrir possíveis
reservatórios animais, e no estudo Filogenético desses vírus;
57
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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