boletim de pesquisa 109 e desenvolvimento issn 1676 - 1340

Transcriptoma de Musa acuminata no dataMusa.Outubro, 2005
TRANSCRIPTOMA DE Musa acuminata NO DATAMusa
República Federativa do Brasil Luiz Inácio Lula da Silva Presidente Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Conselho de Administração Luis Carlos Guedes Pinto Presidente Silvio Crestana Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Ernesto Paterniani Helio Tollini Marcelo Barbosa Saintive Membros Diretoria-Executiva da Embrapa Silvio Crestana Diretores Executivos José Geraldo Eugênio de França Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu Sá Embrapa Recursos Genéticos e Bioteconologia José Manuel Cabral de Sousa Dias Chefe-Geral Maurício Antônio Lopes Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Maria Isabel de Oliveira Penteado Chefe-Adjunto de Comunicação e Negócios Maria do Rosário de Moraes Chefe-Adjunto de Administração
Recursos Genéticos e Biotecnologia ISSN 1676 - 1340
Outubro, 2005
Manoel Teixeira Souza Júnior
Candice Mello Romero Santos
Marly Catarina Felipe Coelho
Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) – Brasília, DF CEP 70770-900 – Caixa Postal 02372 PABX: (61) 3448-4600 Fax: (61) 3340-3624 http://www.cenargen.embrapa.br e.mail:[email protected] Comitê de Publicações Presidente: Maria Isabel de Oliveira Penteado Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante
Maria Alice Bianchi Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão
1ª edição 1ª impressão (2005)
T 772 Transcriptoma de Musa acuminata no DATAMusa / Manoel Teixeira Souza Júnior ... [et al.]. – Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, 2005. 21 p. – (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, 1676 – 1340; 109)
1. Musa acuminata – Transcriptoma. 2. DATAMusa - banco de dados - genômica de banana. 3. DATAMusa - banco de dados - genômica estrutural. 4. DATAMusa - banco de dados – transcriptoma. 5. DATAMusa - banco de dados – análogos de genes de resistência I. Souza Júnior, Manoel Teixeira. II. Série.
584.39 – CDD 21.
Manoel Teixeira Souza Júnior1
Candice Mello Romero Santos2
Marly Catarina Felipe Coelho8
Ana Yamaguishi Ciampi10 Pietro Piffanelli11 Robert Neil Gerald Miller12
1 PhD - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 2 Dr - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 3 PhD - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 4 Dr - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 5 PhD - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 6 MsC - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 7 PhD - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 8 MsC - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 9 PhD - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 10 Dr - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 11 PhD - Parco Tecnológico Padano / Lodi -Italy 12 PhD - Universidade Católica de Brasília(UCB)
SUMÁRIO
RESUMO ...................................................................................................................................4
ABSTRACT...............................................................................................................................5
INTRODUÇÃO .........................................................................................................................6
RESULTADO ..........................................................................................................................10
RESUMO
O projeto de pesquisa intitulado “Análise da Estrutura Primária do Genoma A de Musa acuminata”, financiado pelo Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), e executado pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, em parceria com a Universidade Católica de Brasília (UCB) e o Centro Francês de Pesquisa Agrícola para o Desenvolvimento Internacional (CIRAD), no período de fevereiro de 2002 a junho de 2005, resultou na criação do DATAMusa. O DATAMusa é um banco de dados de genômica de banana composto de informações de genômica estrutural, de transcriptoma e de análogos de genes de resistência. A parte referente ao transcriptoma no DATAMusa é resultado da produção e caracterização de sete bibliotecas de cDNA, e teve o intuito de descobrir os genes expressos em folhas submetidas a estresse de temperatura, folhas infectadas com o patógeno Mycosphaerella fijiensis em estágio precoce e tardio de infecção, flor masculina, raízes de plantas in vitro e casca verde de Musa acuminata. No total foram produzidas 17.113 seqüências, sendo que após a análise de qualidade e limpeza das seqüências restaram 13.297 seqüências de alta qualidade. A análise destas seqüências permitiu a identificação de 5.317 clusters, sendo 1.647 contigs e 3.570 singlets, os quais foram denominados Musa acuminata Assembled EST Sequences (MaAES). Dos 5.317 MaAES, 1.975 (37.2%) não apresentaram homologia com as seqüências depositadas nos bancos de dados públicos.
ABSTRACT The research project entitled "Analysis of the Primary Structure of the A Genome of Musa acuminata", financed by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), and executed by Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, in partnership with the Catholic University of Brasília (UCB) and the French Center of Agricultural Research for Internacional Development (CIRAD), between February 2002 and June 2005, resulted in the launching of the DATAMusa. The DATAMusa is a banana genomics database that contains information on structural genomic, transcriptome and resistance genes analogs. The transcriptome data in the DATAMusa derived from the production and characterization of seven cDNA libraries, which were produced in order to discover genes expressed in leaves submitted to temperature stress, leaves in early and late stages of infection by the pathogen Mycosphaerella fijiensis, male flowers, roots of in vitro plants and green peel of M. acuminata. A total of 17,113 sequences were produced out of the seven cDNA libraries. After trimming the sequences, 13,297 sequences of high quality were kept for further analysis. The assembling of these sequences allowed the identification of 5,317 clusters (being 1,647 contigs and 3,570 singlets), which were denominated Musa acuminata Assembled EST Sequences (MaAES). Out of the 5,317 MaAES, 1,975 (37.2%) showed no matches with existing sequences in public databases.
INTRODUÇÃO
A banana (Musa spp.) é uma espécie cultivada em diversos países tropicais
e possui um importante papel social e econômico. O Brasil é o segundo maior
produtor mundial de bananas, tendo produzido 6.469,470 Mt (9.5% da
produção mundial) no ano 2003, em uma área de 507,000 hectares (FAO,
2004).
A bananeira é cultivada de Norte a Sul do País, sendo fundamental para a
complementação da dieta alimentar das populações de baixa renda.
Praticamente toda fruta produzida é comercializada no mercado interno. A
maioria dos bananicultores é composta por pequenos produtores, e o setor da
bananicultura no Brasil gera mais de 500 mil empregos diretos. A banana é
considerada uma rica fonte de energia, minerais e vitaminas.
O Programa Internacional para o Melhoramento de Musa (PROMUSA),
ligado à Rede Internacional para o Melhoramento de Banana e Plátano (INIBAP -
www.inibap.org), é um mecanismo de colaboração e troca de informações entre
pesquisadores envolvidos no melhoramento genético de Musa no mundo. Em
2001, o PROMUSA incentivou a formação e abrigou o consórcio internacional do
Genoma Musa (Global Musa Genomics Consortium - GMGC), dos quais a
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, a Universidade Católica de Brasília
(UCB) e o Centro Francês de Pesquisa Agrícola para o Desenvolvimento
Internacional (CIRAD) são membros fundadores. O GMGC tem como objetivo
decifrar o genoma de Musa para com isso garantir a sustentabilidade da banana
como alimento básico para grande parte da população mundial. Isto deverá ser
alcançado mediante um maior entendimento da genética e do genoma deste
gênero, permitindo elaborar novas estratégias de melhoramento genético e de
transgenia direcionada.
O estudo da genômica funcional ou transcriptoma da bananeira permitirá a
elucidação detalhada da função de milhares de genes envolvidos nos processos
de diferenciação e desenvolvimento e/ou processos envolvidos nas respostas às
alterações do ambiente biótico/ou abiótico. Visando entender o perfil de
expressão de diferentes genes, algumas metodologias podem ser utilizadas, tal
como o sequenciamento em larga escala de clones de cDNA, gerando os
chamados “Expressed Sequence Tags” (ESTs).
Esta metodologia permite identificar os transcritos específicos dentro de
uma biblioteca de cDNA, gerando um perfil quantitativo e qualitativo de
diferentes tecidos, tipos de células e estágios de desenvolvimento, sendo
considerada uma ferramenta interessante para estudos de expressão gênica, e
mapeamento genético (BOGUSKI e SCHULER, 1995; BRENDEL et al., 2002;
RONNING et al., 2003; RUDD, 2003).
O presente boletim de pesquisa relata as atividades de pesquisa em
transcriptoma de banana coordenadas e executadas pela Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia dentro do projeto de pesquisa “Análise da Estrutura
Primária do Genoma A de Musa acuminata”, em parceria com a Universidade
Católica de Brasília (UCB) e o Centro Francês de Pesquisa Agrícola para o
Desenvolvimento Internacional (CIRAD), no período de fevereiro de 2002 a junho
de 2005, e que fazem parte do DATAMusa.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Bibliotecas de cDNA: A análise de transcriptoma de banana realizada no
projeto de pesquisa “Análise da Estrutura Primária do Genoma A de Musa
acuminata” utilizou seqüências de DNA obtidas a partir de sete bibliotecas de
cDNA de banana (Tabela 1).
Duas bibliotecas de cDNA de folha de Musa acuminata ssp. burmannicoides
var. Calcutta 4 (AA) submetidas a estresse de temperatura (calor e frio) foram
produzidas (SANTOS et al., 2005). Esta é uma variedade diplóide (Musa
Germplasm Information System - MGIS accession number ITC0249) que
pertence à seção EUMUSA. As plantas utilizadas foram obtidas inicialmente no
Banco Ativo de Germoplasma de banana da Embrapa Mandioca e Fruticultura,
em Cruz das Almas-Bahia (www.cnpmf.embrapa.br).
Para a construção da biblioteca de estresse de alta temperatura foram
utilizadas folhas de plantas micropropagadas in vitro e que tinham sido
aclimatadas em câmaras de ambiente controlado (80% de umidade relativa, 25
°C, e regime de 14 horas de luz). A primeira coleta de folhas (H0) foi realizada
após as plantas terem sido submetidas à temperatura de 25 °C por 72 horas.
Após a primeira coleta a temperatura foi elevada para 35 °C, e novas amostras
foram coletadas após uma (H1), duas (H2) e três (H3) horas da mudança na
temperatura. A temperatura foi então elevada a 45 °C, e novas amostras foram
coletadas após uma (H4), duas (H5), três (H6), nove (H7), e 21 horas (H8) da
mudança na temperatura.
Para a construção da biblioteca de estresse de baixa temperatura, amostras
de folha (C0) foram coletadas de plantas sob temperatura de 25 °C por 72
horas. Após a primeira coleta a temperatura foi reduzida para 15 °C, e novas
amostras foram coletadas após uma (C1), duas (H2) e três (H3) horas da
mudança na temperatura. A temperatura foi então reduzida para 5 °C, e novas
amostras foram coletadas após uma (C4), duas (C5), três (C6), nove (H7), e 21
horas (H8) da mudança na temperatura. As folhas de bananeira coletadas foram
imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e transferidas para o freezer a -
80 °C até o início do processo de extração do RNA total.
Para a produção das bibliotecas de cDNA de flores masculinas e casca
verde de banana, os respectivos tecidos foram coletados de plantas de M.
acuminata ssp. burmannicoides var. Calcutta 4 (AA) mantidas no campo
experimental da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Para a produção
da biblioteca de cDNA de raízes, raízes foram coletadas de plantas desta
variedade mantidas em cultivo in vitro. O material vegetal depois de coletado,
foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e transferido para freezer –80
°C até início do processo de extração de RNA total.
Duas bibliotecas de cDNA foram construídas a partir de folhas de banana
infectadas in vitro com o agente causal da Sigatoka Negra, o ascomiceto
Mycosphaerella fijiensis Morelet (Forma perfeita) e Paracercospora fijiensis
(Morelet) Deighton (Forma imperfeita). Uma das bibliotecas foi construída com a
variedade M. acuminata ssp. burmannicoides var. Calcutta 4 (AA), altamente
resistente a este fungo, enquanto que a outra foi construída com a variedade do
Grupo Cavendish denominada Grand Naine (AAA), altamente susceptível ao
fungo. Estas duas bibliotecas de cDNA foram produzidas nas dependências do
CIRAD em Montpellier, França, haja vista que a Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia não tinha permissão para manusear este fungo em Brasília.
2. Extração de RNA total e purificação de poli (A) + RNA: O RNA total foi
isolado das folhas (sadias e infectadas) e raízes utilizando-se o kit “Plant RNA
Reagent” (Invitrogen Life Technologies, USA), de acordo com o protocolo
apresentado pelos fabricantes, enquanto que RNA total da casca verde e das
flores masculina foram isolados de acordo com Chang et al. (1993). Para todas
bibliotecas, o RNA total foi submetido à purificação de poli (A) + RNA utilizando
o kit “Micro FastTrack 2.0 mRNA Isolation” (Invitrogen Life Technologies, USA),
seguindo protocolo apresentado pelos fabricantes.
3. Construção das bibliotecas de cDNA: As bibliotecas foram construídas
utilizando-se o kit “Creator Smart cDNA library” e o vetor pDNR-LIB (Clontech
Laboratories, Inc., USA).
4. Sequenciamento: As extremidades 5' dos clones de cDNA foram
seqüenciadas na plataforma de sequenciamento de DNA da Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia (http://www/laboratorios/psd/psd.html) utilizando-se o
oligonucleotídeo iniciador “M13 forward” (5`- TGT AAA ACG ACG GCC AGT -
3`) e o seqüenciador automático ABI3700.
Os eletroferogramas gerados foram então submetidos ao Sistema GENOMA
da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
(http://genoma.cenargen.embrapa.br/genoma/) e estocados no MUSA_ESTs
database do Laboratório de Bioinformática até processamento e análise de
5. Avaliação da qualidade e limpeza das seqüências: Os eletroferogramas
gerados no sequenciamento dos clones de cDNA foram inicialmente analisados
pelo programa Phred (EWING et al., 1998), que avaliou a qualidade dos picos
correspondentes a cada base seqüenciada, conferindo um valor de qualidade a
cada uma. Para esta análise foram estabelecidos os parâmetros de aceitação das
seqüências conforme Telles e Silva (2001) com Phred superior a 20,
correspondendo a um erro a cada 1000 bases e tamanho mínimo de seqüência
de 140 bases. A remoção de seqüências ribossomais, de poli-(A), de seqüências
de baixa qualidade, de regiões do vetor e de adaptadores, foi conduzida
conforme Telles e Silva (2001).
6. Agrupamento das seqüências: As seqüências de alta qualidade foram
submetidas à montagem utilizando o programa CAP3 (HUANG e MADAN,
1999).
7. Identificação dos genes: Utilizando o programa BLASTx (ALTSCHUL et al.,
1997), com e value <10 –5, verificou-se a similaridade entre os “MaAES” e as
seqüências no banco de dados GenBank nr (BENSON et al., 2002), MIPS
Arabidopsis thaliana (SCHOOF et al., 2002) e SwissProt (GASTEIGER et al.,
2001), e para predizer a função das proteínas codificadas pelos genes expressos
realizou-se o Blastx contra o banco de dados KOG (Eukaryotic Orthologous
Groups) (TATUSOV et al., 2003).
RESULTADOS
O total de 17.113 seqüências foram obtidas a partir das sete bibliotecas de
cDNA (Tabela 1), e estas seqüências apresentaram tamanho médio de 913
bases. Destas 17.113 seqüências, 3.816 (22,3%) foram descartadas após a
análise de qualidade. Estas seqüências foram descartadas por serem
ribossomais (42 seqüências ou 0,2%), por derrapagem (666 seqüências ou
3,9%), por tamanho do inserto (2.520 seqüências ou 14,7%), e por qualidade
(588 seqüências ou 3,4%). As seqüências restantes (13.297ou 77,7%), após a
limpeza, apresentaram número médio de bases com Phred acima de 20, por read
bom, igual ou superior a 570 nucleotídeos.
As 13.297 seqüências de alta qualidade foram agrupadas utilizando-se a
ferramenta CAP3 (HUANG e MADAN, 1999), tendo produzido 5.317 “Musa
acuminata Assembled EST Sequences” (MaAES). Destes, 1.647 MaAES eram
contigs (agrupamentos formados por duas ou mais seqüências) e 3.670 eram
singlets (agrupamento formado por uma seqüência) (Figura 1).
A freqüência de distribuição das seqüências após o agrupamento é
apresentada na Figura 2. Dos 5.317 MaAES, 14 são compostos por 50 ou mais
seqüências, e o mais populoso foi resultado da junção de 502 seqüências. A
maioria dos MaAES (95,1% ou 5.057 MaAES) são compostos por 1-5
seqüências, e 69 % destes foram compostos por um transcrito.
As seqüências consenso dos 5.317 MaAES foram inicialmente submetidas
ao Blastx (e value <10 –5) (ALTSCHUL et al., 1997) contra o banco de dados
GenBank nr (BENSON et al., 2002). Entre estas, 79 (1,48%) apresentaram
homologia com proteínas conhecidas de banana (Tabela 2), e 1.593 (30%) não
apresentaram homologia com nenhuma proteína neste banco de dados.
Os MaAES mais abundantes, que continham 413 e 502 transcritos,
apresentaram homologia com Anx1 e Ribulose bisphosphate carboxylase small
chain, respectivamente (Tabela 3).
Para predizer a função das proteínas codificadas pelos 5.317 MaAES,
realizou-se o Blastx (e value <10 –5) contra o banco de dados KOG (Eukaryotic
Orthologous Groups) (TATUSOV et al., 2003), o qual contém grupos de
proteínas ortológas de sete genomas de eucariontes. Esta comparação resultou
em 2.451 (46,1%) MaAES com homologia a proteínas com função conhecida e
2.866 (53,9%) sem homologia com as seqüências depositadas neste banco.
Os MaAES que apresentaram homologia com o banco de dados KOG foram
categorizados em 22 classes funcionais, dos quais 15,7% correspondem a
genes envolvidos com modificação pós-tradução, “turnover” de proteínas e
função chaperona; 12,8% com a predição de função geral; 12,1% com genes
envolvidos com a tradução; 7,5% com genes com função não conclusiva; 6,1%
com genes envolvidos com a transdução de sinal; e 5,4% com genes com
função desconhecida (Figura 3).
Quando comparados com a base de dados MIPs Arabidopsis thaliana,
3.479 MaAES (65,4%) apresentaram homologia com seqüências descritas
naquele banco; enquanto que 2.425 (45,6%) apresentaram homologia com
seqüências protéicas depositadas na base de dados SwissProt.
É importante salientar que 1.549 MaAES (29,1%) não apresentaram
homologia com as seqüências protéicas depositadas nos bancos de seqüências
testados, utilizando-se Blastx com e value <10 –5. Portanto, aproximadamente
1/3 dos MaAES caracterizados nesta biblioteca de cDNA são de genes ainda não
descritos em nenhuma das quatro bases de dados utilizadas para comparação.
Todas as seqüências consenso dos 5.317 MaAES foram depositadas no
DATAMusa e estão disponíveis para acesso pelos interessados, mediante
assinatura de acordo de confidencialidade e de transferência de material, no
endereço http://genoma.embrapa.br/musa.
Bibliotecas Nº de
temperatura
1.440
temperatura
1.440
Casca 2.420
em estágio inicial de infecção
3.902
em estágio avançado de infecção
3.812
os
Figura 1. Distribuição dos MaAES após agrupamento com a ferramenta CAP3 das seqüências classificadas como de
alta qualidade.
14
Figura 2. Freqüência de distribuição das seqüências de todas as bibliotecas de cDNA agrupadas mediante uso da
ferramenta CAP3.
15
3670
840
313 151 83 53 32 25 18 14 10 15 10 8 7 5 7 5 2 4 6 1 2 2 2 2 5 1 3 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0
1000
2000
3000
4000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 32 35 36 38 41 48 58 64 73 74 85 103 153
176 266
298 307
407 413
Tabela 2. Homologia das seqüências consenso dos MaAES com as
seqüências de Musa acuminata depositadas no banco de dados
Genbank nr.
gb|AAM48480.1| lectin [Musa acuminata] 1e-74
gb|AAL05886.1| germin-like protein [Musa acuminata] e-102
gb|AAK54834.1| profilin [Musa acuminata] 1e-70
sp|O24045|RBS_MUSAC Ribulose bisphosphate carboxylase small chain 5e-79
gb|AAT35818.1| abscisic stress ripening protein-like protein [Musa acuminata] 3e-25
gb|AAK54834.1| profilin [Musa acuminata] 9e-56
gb|AAQ14245.1| actin [Musa acuminata] e-104
gb|AAO15471.1| ethylene receptor-like protein [Musa acuminata] 9e-61
gb|AAT67244.1| BTF3b-like transcription factor [Musa acuminata] 2e-67
emb|CAC81811.1| putative chitinase [Musa acuminata] 6e-25
gb|AAG44759.1| metallothionein-like protein [Musa acuminata] 5e-13
gb|AAR88777.1| putative membrane protein type I [Musa acuminata] 1e-15
gb|AAM69298.1| unknown [Musa acuminata] 1e-15
gb|AAB82774.1| ripening-associated protein [Musa acuminata] 3e-33
gb|AAV70659.1| glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Musa acuminata] e-174
gb|AAL05886.1| germin-like protein [Musa acuminata] 2e-88
gb|AAV65145.1| sucrose phosphate synthase [Musa acuminata] 3e-25
gb|AAB71138.1| S-adenosyl-L-methionine synthetase homolog [Musa acuminata] 2e-88
gb|AAB71138.1| S-adenosyl-L-methionine synthetase homolog [Musa acuminata] e-115
16
gb|AAB71138.1| S-adenosyl-L-methionine synthetase homolog [Musa acuminata] 7e-63
gb|AAD28755.1| cytosolic fructose-1,6-bisphosphatase [Musa acuminata] e-143
gb|AAO11776.1| alpha-amylase precursor [Musa acuminata] 3e-28
gb|AAK82991.1| actin [Musa x paradisiaca] e-106
gb|AAF19195.1| pectate lyase 1 [Musa acuminata] 6e-24
gb|AAO21213.1| cell wall invertase [Musa acuminata] 2e-56
gb|AAL05885.1| endochitinase [Musa acuminata] 9e-66
gb|AAL05886.1| germin-like protein [Musa acuminata] 4e-81
gb|AAM10554.1| ribulose bisphosphate carboxylase large subunit [Musa acuminata] 9e-51
gb|AAR96011.1| hypothetical protein [Musa acuminata] 4e-35
gb|AAB82772.2| beta-1, 3-glucananse [Musa acuminata] 8e-66
emb|CAA64856.1| 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase [Musa acuminata] 2e-58
gb|AAL73122.1| putative 0-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase-like 6e-09
gb|AAL14240.1| proteinase inhibitor [Musa acuminata] 6e-16
gb|AAR96010.1| calmodulin-like protein [Musa acuminata] 3e-52
gb|AAN31756.1| expansin1 [Musa acuminata] 3e-70
gb|AAL27555.1| hypothetical protein [Musa acuminata] 4e-41
gb|AAQ14245.1| actin [Musa acuminata] 6e-47
gb|AAL06348.1| submergence induced protein-like protein [Musa acuminata] 8e-07
gb|AAR96006.1| 4-nitrophenylphosphatase-like protein [Musa acuminata] 8e-46
gb|AAR00513.1| 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase [Musa acuminata] e-117
gb|AAR96008.1| ARIADNE-like protein [Musa acuminata] 5e-67
17
gb|AAL82597.1| aspartate aminotransferase 2 [Musa acuminata] 9e-53
gb|AAM69298.1| unknown [Musa acuminata] 5e-20
gb|AAK07428.2| malate synthase [Musa acuminata] 7e-21
SP|O24045|RBS_MUSAC Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplast 2e-65
SP|O24045|RBS_MUSAC Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplast 4e-18
18
Tabela 3. MaAES mais populosos e suas similaridades com as seqüências
protéicas depositadas na base de dados Genebank nr.
Número de
48 gb|AAN60205.1| photosystem II 10 kDa protein [Xerophyta humilis]
58 gb|AAB82774.1| ripening-associated protein [Musa acuminata]
64 gb|AAG44759.1| metallothionein-like protein [Musa acuminata]
73 gb|AAG44759.1| metallothionein-like protein [Musa acuminata]
73 emb|CAB52585.1| metallothionein-like protein [Elaeis guineensis]
85 gb|AAF35186.1| lipid transfer protein precursor [Gossypium hirsutum]
103 gb|AAT35818.1| abscisic stress ripening protein-like protein [Musa
acuminata].
298 gb|AAN60205.1| photosystem II 10 kDa protein [Xerophyta humilis]
407 gb|AAK30204.1| endoxyloglucan transferase [Daucus carota]
413 gb|AAR13288.1| Anx1 [Gossypium hirsutum]
502 sp|O24045|RBS_MUSAC Ribulose bisphosphate carboxylase small chain
19
0
2
4
6
8
10
12
14
16
A B C D E F G H I J K L M O P Q R S T U V Z *
Funcional classification
Fr eq
ue nc
y %
Figura 3. Classificação funcional e freqüência das classes de MaAES de acordo com
Eukaryotic Clusters of Orthologs (KOG). Significado das categorias funcionais: A, Processamento e modificação do RNA, B, Estrutura e dinâmica da cromatina C, Produção e conversão de energia, D, Controle do ciclo celular e mitose, E, Metabolismo e transporte de aminoácido, F, Metabolismo e transporte de nucleotídeos, G, Metabolismo e transporte de carboidratos, H, Metabolismo de coenzimas I, Metabolismo de lipídeos, J, Tradução, K, Transcrição, L, Replicação e Reparo, O, Modificação pós- tradução, turnover de proteínas, função chaperona, P, Metabolismo e transporte de íons inorgânicos, Q, Biosíntese de metabólicos secundários, transporte e catabolismo, R, Somente predição de função geral, S, Função desconhecida, T, Transdução de sinal, U, Trânsito intracelular e secreção, Z, Citoesqueleto e * corresponde à função não conclusiva.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, Oxford, GB, v. 25, n. 17, p. 3389-402, 1997.
BENSON, D. A.; KARSCH-MIZRACHI, I.; LIPMAN, D. J.; OSTELL, J.; WHEELER, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research, Oxford, GB, v. 30, n. 1, p. 17-20, 2002.
20
BOGUSKI, M. S.; SCHULER, G. D. Establishing a human transcript map. Nature Genetics, New York, v. 10, p. 369-371, 1995.
BRENDEL, V.; KURTZ, S.; WALBOT, V. Comparative genomics of Arabidopsis and maize: prospects and limitations. Genome Biology. Reviews, v. 3, p. 1005.1-1005.6, 2002.
CHANG, S.; PURYEAR, J.; CAIRNEY, J. A. Simple and efficient method for isolating RNA from Pine trees. Plant Molecular Biology Reporter, Athens, v. 11, n. 2, p. 115-116, 1993.
EWING, B.; HILLIER, L.; WENDL, M. C.; GREEN, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research, Cold Spring Harbor, US, v. 8, n. 3, p. 175-85, 1998.
FAO. Disponível em: <www.fao.org>. Acesso em: abr. 2004.
GASTEIGER, E.; JUNG, E.; BAIROCH, A. SWISS-PROT: connecting biological knowledge via a protein database. Current Issues Molecular Biology, v. 3, n. 3, p. 47-55, 2001.
HUANG, X.; MADAN, A. CAP3: a DNA sequence assembly program. Genome Research, Cold Spring Harbor, US, v. 9, n. 9, p. 868-77, 1999.
RONNING, C. M.; STEGALKINA, S. S.; ASCENZI, R. A.; BOUGRI, O.; HART, A. L.; UTTERBACH, T. R.; VANAKEN, S. E.; RIEDMULLER, S. B.; WHITE, J. A.; CHO, J.; PERTEA, G. M.; LEE, Y.; KARAMYCHEVA, S.; SULTANA, R.; TSAI, J.; QUACKENBUSH, J.; GRIFFITHS, H. M.; RESTREPO, S.; SMART, C. D.; FRY, W. E.; VAN DER HOEVEN, R.; TANKSLEY, S.; ZHANG, P.; JIN, H.; YAMAMOTO, M. L.; BAKER, B. J.; BUELL, C. R. Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiology, Minneapolis, v. 131, n. 2, p. 419-29, 2003.
RUDD, S. Expressed sequence tags alternative or complement to whole genome sequences? Trends in Plant Science, Oxford, GB, v. 8, p. 321-329, 2003.
SANTOS, C. M. R.; MARTINS, N. F.; HORBERG, H. M.; ALMEIDA, E. R. de; COELHO, M. C.; TOGAWA, R. C.; SILVA F. R. da; CAETANO, A. R.; MILLER, R. N.; SOUZA JÚNIOR, M. T. Analysis of expressed sequence tags from Musa acuminata ssp. burmannicoides, var. Calcutta 4(AA) leaves submitted to temperature stresses. Theoretical And Applied Genetics, Berlin, v. 110, p. 1517–1522, 2005.
SCHOOF, H.; ZACCARIA, P.; GUNDLACH, H.; LEMCKE, K.; RUDD, S.; KOLESOV, G.; ARNOLD, R.; MEWES, H. W.; MAYER, K. F. MIPS Arabidopsis thaliana Database (MAtDB): an integrated biological knowledge resource based
21
on the first complete plant genome. Nucleic Acids Research, Oxford, GB, v. 30, n. 1, p. 91-3, 2002.
TATUSOV, R. L.; FEDOROVA, N. D.; JACKSON, J. D.; JACOBS, A. R. KIRYUTIN, B.; KOONIN, E. V.; KRYLOV, D. M.; MAZUMDER, R.; MEKHEDOV, S. L.; NIKOLSKAYA, A. N.; RAO, B. S.; SMIRNOV, S.; SVERDLOV, A. V.; VASUDEVAN, S.; WOLF, Y. I.; YIN, J. J.; NATALE, D. A. The COG database: an updated version includes eukaryotes. Bionformactics, v. 4, p. 1-14, 2003.
TELLES, G. P.; SILVA, F. L. da. Trimming and clustering sugarcane ESTs. Genetics and Molecular Biology, Ribeirao Preto, v. 24, p. 17-23, 2001.
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Resumo
Abstract
Introdução
Outubro, 2005
República Federativa do Brasil
Presidente
Roberto Rodrigues
Conselho de Administração
Kepler Euclides Filho
José Manuel Cabral de Sousa Dias
Chefe-Geral
Chefe-Adjunto de Administração
ISSN 1676 - 1340
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
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1ª edição
T 772 Transcriptoma de Musa acuminata no DATAMusa / Manoel Teixeira
Souza Júnior ... [et al.]. – Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2005.
21 p. – (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 1676 – 1340; 109)
1. Musa acuminata – Transcriptoma. 2. DATAMusa - banco de dados - genômica de banana. 3. DATAMusa - banco de dados - genômica estrutural. 4. DATAMusa - banco de dados – transcriptoma. 5. DATAMusa - banco de dados – análogos de genes de resistência I. Souza Júnior, Manoel Teixeira. II. Série.
584.39 – CDD 21.
Resumo XE "Resumo"
O projeto de pesquisa intitulado “Análise da Estrutura Primária do Genoma A de Musa acuminata”, financiado pelo Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), e executado pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, em parceria com a Universidade Católica de Brasília (UCB) e o Centro Francês de Pesquisa Agrícola para o Desenvolvimento Internacional (CIRAD), no período de fevereiro de 2002 a junho de 2005, resultou na criação do DATAMusa. O DATAMusa é um banco de dados de genômica de banana composto de informações de genômica estrutural, de transcriptoma e de análogos de genes de resistência. A parte referente ao transcriptoma no DATAMusa é resultado da produção e caracterização de sete bibliotecas de cDNA, e teve o intuito de descobrir os genes expressos em folhas submetidas a estresse de temperatura, folhas infectadas com o patógeno Mycosphaerella fijiensis em estágio precoce e tardio de infecção, flor masculina, raízes de plantas in vitro e casca verde de Musa acuminata. No total foram produzidas 17.113 seqüências, sendo que após a análise de qualidade e limpeza das seqüências restaram 13.297 seqüências de alta qualidade. A análise destas seqüências permitiu a identificação de 5.317 clusters, sendo 1.647 contigs e 3.570 singlets, os quais foram denominados Musa acuminata Assembled EST Sequences (MaAES). Dos 5.317 MaAES, 1.975 (37.2%) não apresentaram homologia com as seqüências depositadas nos bancos de dados públicos.
Abstract XE "Abstract"
The research project entitled "Analysis of the Primary Structure of the A Genome of Musa acuminata", financed by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), and executed by Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, in partnership with the Catholic University of Brasília (UCB) and the French Center of Agricultural Research for Internacional Development (CIRAD), between February 2002 and June 2005, resulted in the launching of the DATAMusa. The DATAMusa is a banana genomics database that contains information on structural genomic, transcriptome and resistance genes analogs. The transcriptome data in the DATAMusa derived from the production and characterization of seven cDNA libraries, which were produced in order to discover genes expressed in leaves submitted to temperature stress, leaves in early and late stages of infection by the pathogen Mycosphaerella fijiensis, male flowers, roots of in vitro plants and green peel of M. acuminata. A total of 17,113 sequences were produced out of the seven cDNA libraries. After trimming the sequences, 13,297 sequences of high quality were kept for further analysis. The assembling of these sequences allowed the identification of 5,317 clusters (being 1,647 contigs and 3,570 singlets), which were denominated Musa acuminata Assembled EST Sequences (MaAES). Out of the 5,317 MaAES, 1,975 (37.2%) showed no matches with existing sequences in public databases.
Introdução XE "Introdução"
A banana (Musa spp.) é uma espécie cultivada em diversos países tropicais e possui um importante papel social e econômico. O Brasil é o segundo maior produtor mundial de bananas, tendo produzido 6.469,470 Mt (9.5% da produção mundial) no ano 2003, em uma área de 507,000 hectares (FAO, 2004).
A bananeira é cultivada de Norte a Sul do País, sendo fundamental para a complementação da dieta alimentar das populações de baixa renda. Praticamente toda fruta produzida é comercializada no mercado interno. A maioria dos bananicultores é composta por pequenos produtores, e o setor da bananicultura no Brasil gera mais de 500 mil empregos diretos. A banana é considerada uma rica fonte de energia, minerais e vitaminas.
O Programa Internacional para o Melhoramento de Musa (PROMUSA), ligado à Rede Internacional para o Melhoramento de Banana e Plátano (INIBAP - www.inibap.org ), é um mecanismo de colaboração e troca de informações entre pesquisadores envolvidos no melhoramento genético de Musa no mundo. Em 2001, o PROMUSA incentivou a formação e abrigou o consórcio internacional do Genoma Musa (Global Musa Genomics Consortium - GMGC), dos quais a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, a Universidade Católica de Brasília (UCB) e o Centro Francês de Pesquisa Agrícola para o Desenvolvimento Internacional (CIRAD) são membros fundadores. O GMGC tem como objetivo decifrar o genoma de Musa para com isso garantir a sustentabilidade da banana como alimento básico para grande parte da população mundial. Isto deverá ser alcançado mediante um maior entendimento da genética e do genoma deste gênero, permitindo elaborar novas estratégias de melhoramento genético e de transgenia direcionada.
O estudo da genômica funcional ou transcriptoma da bananeira permitirá a elucidação detalhada da função de milhares de genes envolvidos nos processos de diferenciação e desenvolvimento e/ou processos envolvidos nas respostas às alterações do ambiente biótico/ou abiótico. Visando entender o perfil de expressão de diferentes genes, algumas metodologias podem ser utilizadas, tal como o sequenciamento em larga escala de clones de cDNA, gerando os chamados “Expressed Sequence Tags” (ESTs).
Esta metodologia permite identificar os transcritos específicos dentro de uma biblioteca de cDNA, gerando um perfil quantitativo e qualitativo de diferentes tecidos, tipos de células e estágios de desenvolvimento, sendo considerada uma ferramenta interessante para estudos de expressão gênica, e mapeamento genético (BOGUSKI e SCHULER, 1995; BRENDEL et al., 2002; RONNING et al., 2003; RUDD, 2003).
O presente boletim de pesquisa relata as atividades de pesquisa em transcriptoma de banana coordenadas e executadas pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia dentro do projeto de pesquisa “Análise da Estrutura Primária do Genoma A de Musa acuminata”, em parceria com a Universidade Católica de Brasília (UCB) e o Centro Francês de Pesquisa Agrícola para o Desenvolvimento Internacional (CIRAD), no período de fevereiro de 2002 a junho de 2005, e que fazem parte do DATAMusa.
Material e Métodos XE "Material e Métodos"
1. Bibliotecas de cDNA: A análise de transcriptoma de banana realizada no projeto de pesquisa “Análise da Estrutura Primária do Genoma A de Musa acuminata” utilizou seqüências de DNA obtidas a partir de sete bibliotecas de cDNA de banana (Tabela 1).
Duas bibliotecas de cDNA de folha de Musa acuminata ssp. burmannicoides var. Calcutta 4 (AA) submetidas a estresse de temperatura (calor e frio) foram produzidas (SANTOS et al., 2005). Esta é uma variedade diplóide (Musa Germplasm Information System - MGIS accession number ITC0249) que pertence à seção EUMUSA. As plantas utilizadas foram obtidas inicialmente no Banco Ativo de Germoplasma de banana da Embrapa Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas-Bahia ( www.cnpmf.embrapa.br ).
Para a construção da biblioteca de estresse de alta temperatura foram utilizadas folhas de plantas micropropagadas in vitro e que tinham sido aclimatadas em câmaras de ambiente controlado (80% de umidade relativa, 25 °C, e regime de 14 horas de luz). A primeira coleta de folhas (H0) foi realizada após as plantas terem sido submetidas à temperatura de 25 °C por 72 horas. Após a primeira coleta a temperatura foi elevada para 35 °C, e novas amostras foram coletadas após uma (H1), duas (H2) e três (H3) horas da mudança na temperatura. A temperatura foi então elevada a 45 °C, e novas amostras foram coletadas após uma (H4), duas (H5), três (H6), nove (H7), e 21 horas (H8) da mudança na temperatura.
Para a construção da biblioteca de estresse de baixa temperatura, amostras de folha (C0) foram coletadas de plantas sob temperatura de 25 °C por 72 horas. Após a primeira coleta a temperatura foi reduzida para 15 °C, e novas amostras foram coletadas após uma (C1), duas (H2) e três (H3) horas da mudança na temperatura. A temperatura foi então reduzida para 5 °C, e novas amostras foram coletadas após uma (C4), duas (C5), três (C6), nove (H7), e 21 horas (H8) da mudança na temperatura. As folhas de bananeira coletadas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e transferidas para o freezer a - 80 °C até o início do processo de extração do RNA total.
Para a produção das bibliotecas de cDNA de flores masculinas e casca verde de banana, os respectivos tecidos foram coletados de plantas de M. acuminata ssp. burmannicoides var. Calcutta 4 (AA) mantidas no campo experimental da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Para a produção da biblioteca de cDNA de raízes, raízes foram coletadas de plantas desta variedade mantidas em cultivo in vitro. O material vegetal depois de coletado, foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e transferido para freezer –80 °C até início do processo de extração de RNA total.
Duas bibliotecas de cDNA foram construídas a partir de folhas de banana infectadas in vitro com o agente causal da Sigatoka Negra, o ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (Forma perfeita) e Paracercospora fijiensis (Morelet) Deighton (Forma imperfeita). Uma das bibliotecas foi construída com a variedade M. acuminata ssp. burmannicoides var. Calcutta 4 (AA), altamente resistente a este fungo, enquanto que a outra foi construída com a variedade do Grupo Cavendish denominada Grand Naine (AAA), altamente susceptível ao fungo. Estas duas bibliotecas de cDNA foram produzidas nas dependências do CIRAD em Montpellier, França, haja vista que a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia não tinha permissão para manusear este fungo em Brasília.
2. Extração de RNA total e purificação de poli (A) + RNA: O RNA total foi isolado das folhas (sadias e infectadas) e raízes utilizando-se o kit “Plant RNA Reagent” (Invitrogen Life Technologies, USA), de acordo com o protocolo apresentado pelos fabricantes, enquanto que RNA total da casca verde e das flores masculina foram isolados de acordo com Chang et al. (1993). Para todas bibliotecas, o RNA total foi submetido à purificação de poli (A) + RNA utilizando o kit “Micro FastTrack 2.0 mRNA Isolation” (Invitrogen Life Technologies, USA), seguindo protocolo apresentado pelos fabricantes.
3. Construção das bibliotecas de cDNA: As bibliotecas foram construídas utilizando-se o kit “Creator Smart cDNA library” e o vetor pDNR-LIB (Clontech Laboratories, Inc., USA).
4. Sequenciamento: As extremidades 5' dos clones de cDNA foram seqüenciadas na plataforma de sequenciamento de DNA da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia ( http://www/laboratorios/psd/psd.html ) utilizando-se o oligonucleotídeo iniciador “M13 forward” (5`- TGT AAA ACG ACG GCC AGT - 3`) e o seqüenciador automático ABI3700.
Os eletroferogramas gerados foram então submetidos ao Sistema GENOMA da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia ( http://genoma.cenargen.embrapa.br/genoma/ ) e estocados no MUSA_ESTs database do Laboratório de Bioinformática até processamento e análise de seqüências.
5. Avaliação da qualidade e limpeza das seqüências: Os eletroferogramas gerados no sequenciamento dos clones de cDNA foram inicialmente analisados pelo programa Phred (EWING et al., 1998), que avaliou a qualidade dos picos correspondentes a cada base seqüenciada, conferindo um valor de qualidade a cada uma. Para esta análise foram estabelecidos os parâmetros de aceitação das seqüências conforme Telles e Silva (2001) com Phred superior a 20, correspondendo a um erro a cada 1000 bases e tamanho mínimo de seqüência de 140 bases. A remoção de seqüências ribossomais, de poli-(A), de seqüências de baixa qualidade, de regiões do vetor e de adaptadores, foi conduzida conforme Telles e Silva (2001).
6. Agrupamento das seqüências: As seqüências de alta qualidade foram submetidas à montagem utilizando o programa CAP3 (HUANG e MADAN, 1999).
7. Identificação dos genes: Utilizando o programa BLASTx (ALTSCHUL et al., 1997), com e value <10 –5, verificou-se a similaridade entre os “MaAES” e as seqüências no banco de dados GenBank nr (BENSON et al., 2002), MIPS Arabidopsis thaliana (SCHOOF et al., 2002) e SwissProt (GASTEIGER et al., 2001), e para predizer a função das proteínas codificadas pelos genes expressos realizou-se o Blastx contra o banco de dados KOG (Eukaryotic Orthologous Groups) (TATUSOV et al., 2003).
Resultado XE "Resultado" s
O total de 17.113 seqüências foram obtidas a partir das sete bibliotecas de cDNA (Tabela 1), e estas seqüências apresentaram tamanho médio de 913 bases. Destas 17.113 seqüências, 3.816 (22,3%) foram descartadas após a análise de qualidade. Estas seqüências foram descartadas por serem ribossomais (42 seqüências ou 0,2%), por derrapagem (666 seqüências ou 3,9%), por tamanho do inserto (2.520 seqüências ou 14,7%), e por qualidade (588 seqüências ou 3,4%). As seqüências restantes (13.297ou 77,7%), após a limpeza, apresentaram número médio de bases com Phred acima de 20, por read bom, igual ou superior a 570 nucleotídeos.
As 13.297 seqüências de alta qualidade foram agrupadas utilizando-se a ferramenta CAP3 (HUANG e MADAN, 1999), tendo produzido 5.317 “Musa acuminata Assembled EST Sequences” (MaAES). Destes, 1.647 MaAES eram contigs (agrupamentos formados por duas ou mais seqüências) e 3.670 eram singlets (agrupamento formado por uma seqüência) (Figura 1).
A freqüência de distribuição das seqüências após o agrupamento é apresentada na Figura 2. Dos 5.317 MaAES, 14 são compostos por 50 ou mais seqüências, e o mais populoso foi resultado da junção de 502 seqüências. A maioria dos MaAES (95,1% ou 5.057 MaAES) são compostos por 1-5 seqüências, e 69 % destes foram compostos por um transcrito.
As seqüências consenso dos 5.317 MaAES foram inicialmente submetidas ao Blastx (e value <10 –5) (ALTSCHUL et al., 1997) contra o banco de dados GenBank nr (BENSON et al., 2002). Entre estas, 79 (1,48%) apresentaram homologia com proteínas conhecidas de banana (Tabela 2), e 1.593 (30%) não apresentaram homologia com nenhuma proteína neste banco de dados.
Os MaAES mais abundantes, que continham 413 e 502 transcritos, apresentaram homologia com Anx1 e Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, respectivamente (Tabela 3).
Para predizer a função das proteínas codificadas pelos 5.317 MaAES, realizou-se o Blastx (e value <10 –5) contra o banco de dados KOG (Eukaryotic Orthologous Groups) (TATUSOV et al., 2003), o qual contém grupos de proteínas ortológas de sete genomas de eucariontes. Esta comparação resultou em 2.451 (46,1%) MaAES com homologia a proteínas com função conhecida e 2.866 (53,9%) sem homologia com as seqüências depositadas neste banco.
Os MaAES que apresentaram homologia com o banco de dados KOG foram categorizados em 22 classes funcionais, dos quais 15,7% correspondem a genes envolvidos com modificação pós-tradução, “turnover” de proteínas e função chaperona; 12,8% com a predição de função geral; 12,1% com genes envolvidos com a tradução; 7,5% com genes com função não conclusiva; 6,1% com genes envolvidos com a transdução de sinal; e 5,4% com genes com função desconhecida (Figura 3).
Quando comparados com a base de dados MIPs Arabidopsis thaliana, 3.479 MaAES (65,4%) apresentaram homologia com seqüências descritas naquele banco; enquanto que 2.425 (45,6%) apresentaram homologia com seqüências protéicas depositadas na base de dados SwissProt.
É importante salientar que 1.549 MaAES (29,1%) não apresentaram homologia com as seqüências protéicas depositadas nos bancos de seqüências testados, utilizando-se Blastx com e value <10 –5. Portanto, aproximadamente 1/3 dos MaAES caracterizados nesta biblioteca de cDNA são de genes ainda não descritos em nenhuma das quatro bases de dados utilizadas para comparação.
Todas as seqüências consenso dos 5.317 MaAES foram depositadas no DATAMusa e estão disponíveis para acesso pelos interessados, mediante assinatura de acordo de confidencialidade e de transferência de material, no endereço http://genoma.embrapa.br/musa .
Tabela 1. Número total de seqüências de ESTs das bibliotecas de cDNA geradas.
Bibliotecas
1.440
1.440
2.155
Casca
2.420
Folhas de bananeira infectadas com Mycosphaerella fijiensis em estágio inicial de infecção
3.902
Folhas de bananeira infectadas com Mycosphaerella fijiensis em estágio avançado de infecção
3.812
Total
17.113
1647
3670
0
1000
2000
3000
4000
Contigs
Singlets
transcritos
Figura 1. Distribuição dos MaAES após agrupamento com a ferramenta CAP3 das seqüências classificadas como de alta qualidade.
3670
840
313
151
83
53
32
25
18
14
10
15
10
8
7
5
7
5
2
4
6
1
2
2
2
2
5
1
3
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1000
2000
3000
4000
Grupos
Figura 2. Freqüência de distribuição das seqüências de todas as bibliotecas de cDNA agrupadas mediante uso da ferramenta CAP3.
Tabela 2. Homologia das seqüências consenso dos MaAES com as seqüências de Musa acuminata depositadas no banco de dados Genbank nr.
Gene
E-value
e-100
1e-74
5e-65
e-102
1e-70
5e-79
3e-25
9e-56
8e-54
e-104
9e-61
2e-67
3e-72
6e-25
5e-13
1e-15
8e-13
1e-96
1e-15
3e-33
4e-74
e-174
6e-13
2e-88
6e-27
6e-64
6e-20
4e-77
4e-92
2e-27
3e-25
2e-88
e-115
3e-45
7e-63
e-143
3e-28
4e-64
1e-66
4e-35
e-106
3e-34
6e-24
2e-56
9e-66
4e-81
9e-51
4e-35
7e-13
8e-66
5e-11
2e-58
2e-37
6e-09
6e-16
3e-52
3e-70
3e-85
4e-41
6e-47
8e-07
4e-46
8e-46
7e-30
1e-25
2e-11
e-117
5e-67
2e-12
2e-41
1e-19
1e-83
9e-53
5e-20
1e-11
7e-21
2e-08
2e-65
4e-18
Tabela 3. MaAES mais populosos e suas similaridades com as seqüências protéicas depositadas na base de dados Genebank nr.
Número de Seqüências
48
48
58
64
73
73
74
85
103
153
266
298
307
407
413
502
0
2
4
6
8
10
12
14
16
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
O
P
Q
R
S
T
U
V
Z
Frequency %
Figura 3. Classificação funcional e freqüência das classes de MaAES de acordo com Eukaryotic Clusters of Orthologs (KOG). Significado das categorias funcionais: A, Processamento e modificação do RNA, B, Estrutura e dinâmica da cromatina C, Produção e conversão de energia, D, Controle do ciclo celular e mitose, E, Metabolismo e transporte de aminoácido, F, Metabolismo e transporte de nucleotídeos, G, Metabolismo e transporte de carboidratos, H, Metabolismo de coenzimas I, Metabolismo de lipídeos, J, Tradução, K, Transcrição, L, Replicação e Reparo, O, Modificação pós-tradução, turnover de proteínas, função chaperona, P, Metabolismo e transporte de íons inorgânicos, Q, Biosíntese de metabólicos secundários, transporte e catabolismo, R, Somente predição de função geral, S, Função desconhecida, T, Transdução de sinal, U, Trânsito intracelular e secreção, Z, Citoesqueleto e * corresponde à função não conclusiva.
Referências bibliográficas
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, Oxford, GB, v. 25, n. 17, p. 3389-402, 1997.
BENSON, D. A.; KARSCH-MIZRACHI, I.; LIPMAN, D. J.; OSTELL, J.; WHEELER, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research, Oxford, GB, v. 30, n. 1, p. 17-20, 2002.
BOGUSKI, M. S.; SCHULER, G. D. Establishing a human transcript map. Nature Genetics, New York, v. 10, p. 369-371, 1995.
BRENDEL, V.; KURTZ, S.; WALBOT, V. Comparative genomics of Arabidopsis and maize: prospects and limitations. Genome Biology. Reviews, v. 3, p. 1005.1-1005.6, 2002.
CHANG, S.; PURYEAR, J.; CAIRNEY, J. A. Simple and efficient method for isolating RNA from Pine trees. Plant Molecular Biology Reporter, Athens, v. 11, n. 2, p. 115-116, 1993.
EWING, B.; HILLIER, L.; WENDL, M. C.; GREEN, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research, Cold Spring Harbor, US, v. 8, n. 3, p. 175-85, 1998.
FAO. Disponível em: <www.fao.org>. Acesso em: abr. 2004.
GASTEIGER, E.; JUNG, E.; BAIROCH, A. SWISS-PROT: connecting biological knowledge via a protein database. Current Issues Molecular Biology, v. 3, n. 3, p. 47-55, 2001.
HUANG, X.; MADAN, A. CAP3: a DNA sequence assembly program. Genome Research, Cold Spring Harbor, US, v. 9, n. 9, p. 868-77, 1999.
RONNING, C. M.; STEGALKINA, S. S.; ASCENZI, R. A.; BOUGRI, O.; HART, A. L.; UTTERBACH, T. R.; VANAKEN, S. E.; RIEDMULLER, S. B.; WHITE, J. A.; CHO, J.; PERTEA, G. M.; LEE, Y.; KARAMYCHEVA, S.; SULTANA, R.; TSAI, J.; QUACKENBUSH, J.; GRIFFITHS, H. M.; RESTREPO, S.; SMART, C. D.; FRY, W. E.; VAN DER HOEVEN, R.; TANKSLEY, S.; ZHANG, P.; JIN, H.; YAMAMOTO, M. L.; BAKER, B. J.; BUELL, C. R. Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiology, Minneapolis, v. 131, n. 2, p. 419-29, 2003.
RUDD, S. Expressed sequence tags alternative or complement to whole genome sequences? Trends in Plant Science, Oxford, GB, v. 8, p. 321-329, 2003.
SANTOS, C. M. R.; MARTINS, N. F.; HORBERG, H. M.; ALMEIDA, E. R. de; COELHO, M. C.; TOGAWA, R. C.; SILVA F. R. da; CAETANO, A. R.; MILLER, R. N.; SOUZA JÚNIOR, M. T. Analysis of expressed sequence tags from Musa acuminata ssp. burmannicoides, var. Calcutta 4(AA) leaves submitted to temperature stresses. Theoretical And Applied Genetics, Berlin, v. 110, p. 1517–1522, 2005.
SCHOOF, H.; ZACCARIA, P.; GUNDLACH, H.; LEMCKE, K.; RUDD, S.; KOLESOV, G.; ARNOLD, R.; MEWES, H. W.; MAYER, K. F. MIPS Arabidopsis thaliana Database (MAtDB): an integrated biological knowledge resource based on the first complete plant genome. Nucleic Acids Research, Oxford, GB, v. 30, n. 1, p. 91-3, 2002.
TATUSOV, R. L.; FEDOROVA, N. D.; JACKSON, J. D.; JACOBS, A. R. KIRYUTIN, B.; KOONIN, E. V.; KRYLOV, D. M.; MAZUMDER, R.; MEKHEDOV, S. L.; NIKOLSKAYA, A. N.; RAO, B. S.; SMIRNOV, S.; SVERDLOV, A. V.; VASUDEVAN, S.; WOLF, Y. I.; YIN, J. J.; NATALE, D. A. The COG database: an updated version includes eukaryotes. Bionformactics, v. 4, p. 1-14, 2003.
TELLES, G. P.; SILVA, F. L. da. Trimming and clustering sugarcane ESTs. Genetics and Molecular Biology, Ribeirao Preto, v. 24, p. 17-23, 2001.
PhD - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Dr - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
MsC - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
MsC - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
PhD - Parco Tecnológico Padano / Lodi -Italy
PhD - Universidade Católica de Brasília(UCB)
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Candice: NAO ESQUECER DE MARCAR A COLUNA DESEJADA NO EIXO X, NA PRODUCAO DO GRAFICO: ESCOLHER ROTULO X
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boletim de pesquisa 109 e desenvolvimento issn 1676 - 1340

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