bioquímica de sistemas das espécies reactivas de oxigénio...

Universidade de Lisboa

Faculdade de Cincias

Departamento de Qumica e Bioqumica

Bioqumica de Sistemas das

Espcies Reactivas de Oxignio:

Estudo sobre a Origem do Stress

Oxidativo na Evoluo

Ricardo Jorge F.T.G. Pais

Mestrado em Bioqumica

(Bioqumica Mdica)

2011

Universidade de Lisboa

Faculdade de Cincias

Departamento de Qumica e Bioqumica

Bioqumica de Sistemas das

Espcies Reactivas de Oxignio:

Estudo sobre a Origem do Stress

Oxidativo na Evoluo

Ricardo Jorge F.T.G. Pais

Mestrado em Bioqumica

Dissertao orientada pelo Prof. Doutor Antnio E.N. Ferreira e pelo Prof. Doutor Fernando Antunes

2011

Ricardo J. Pais Origem do Stress Oxidativo na Evoluo

Dissertao apresentada Faculdade de Cincias

da Universidade de Lisboa para a obteno do grau

de Mestre em Bioqumica. O presente trabalho de

investigao foi realizado no Centro de Qumica e

Bioqumica da Faculdade de Cincias da

Universidade de Lisboa e teve como orientadores o

professor Doutor Antnio Eduardo do Nascimento

Ferreira e o professor Doutor Fernando Jos Nunes

Antunes.


AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeo minha mulher Ana Sofia Santos e ao meu filho Tiago

Alexandre Santos Pais pelo extremo apoio, compreenso e motivao que me deram ao

longo de todo o mestrado. Sem estas duas pessoas, que so o meu ncleo familiar, a

minha vida no seria como , um ambiente propicio ao desenvolvimento tanto pessoal

como profissional.

Aos meus orientadores Antnio e Fernando um profundo agradecimento por

partilharem comigo o vosso saber e experincia, que eu valorizo bastante. Tambm

pelas suas crticas construtivas, sem as quais a minha evoluo como profissional da

cincia seria muitssimo mais lenta. E principalmente, pelo voto de confiana que me

deram de modo a prosseguir este trabalho.

Ao ambiente espectacular do CQB, em especial ao grupo de enzimologia, que

serve de exemplo para muitos locais de trabalho, que de stress apenas tem o estudo do

mesmo na vertente oxidativa. Assim agradeo s seguintes pessoas: prof Ana Ponces,

Nuno Lages, Patrcia Baptista, Ricardo Gomes, Marta Sousa, Gonalo Costa, Francisco

Pinto, Diana Reis, Carlos Cordeiro e Catarina Correia.

Agradeo a todo o pessoal do Grupo de Systems biology do Centro de

Neurocincias de Coimbra, que muito apreciaram este trabalho durante as reunies de

projecto. Em especial ao Rui Benfeitas, pelas discusses, trocas de ideias e sugestes.

Agradeo tambm Fundao da FCUL e a FCT pelo apoio financeiro que deram

a este projecto com a bolsa PTDC/QUI/70523/2006.

A todos os que mencionei, agradeo profundamente do fundo do corao por tudo.


RESUMORESUMORESUMORESUMO

As espcies reactivas de oxignio (ROS) so potencialmente txicas para

organismos vivos por danificar componentes celulares como o DNA, protenas e

membranas. O balano entre os antioxidantes e as ROS induz um estado de stress

oxidativo que pode causar danos celulares, incluindo a perda de funo e morte celular.

geralmente aceite que os sistemas antioxidantes tenham evoludo aps a acumulao

de oxignio na atmosfera e nos oceanos h 1700 Ma. Esta hiptese baseada na presso

selectiva exercida pela utilizao do oxignio como aceitador final de electres no

metabolismo aerbio, que origina a formao endgena de O2-. Embora os oceanos

arqueozicos (3800-2500 Ma) estivessem em anxia, a elevada intensidade de radiao

em conjunto com os elevados nveis de Fe(II), poderiam constituir uma fonte de ROS

exgenos que levasse presso selectiva necessria de modo a motivar a evoluo dos

sistemas antioxidantes. Por estas razes, formulmos a hiptese que a origem dos

sistemas antioxidantes na evoluo anterior acumulao do oxignio atmosfrico h

2300 Ma. Para analisar esta hiptese, desenvolvemos um modelo cintico que simula o

ambiente qumico dos oceanos tendo em conta: as reaces das ROS; processos de

fotlise e radilise da gua; pH e temperatura; enxofre reduzido, cloro, oxignio,

carbono inorgnico e orgnico dissolvidos; qumica de solubilidade do ferro e reaces

de Fenton; ciclo dia-noite. As simulaes com as condies do oceanos, recolhidas a

partir de dados geolgicos e fosseis, permitiu-nos prever como os nveis das ROS

alteraram ao longo da evoluo nas zonas fticas e afticas. O modelo prev para a zona

ftica do oceano arqueozico h 3500 Ma, nveis de radicais H e CO3- 103 vezes

superiores, de HOO 102 vezes superiores e HO, O2- e H2O2 na mesma ordem de

grandeza, quando comparados com a actualidade. O potencial reactivo calculado para

biomolculas, sugere que a zona ftica do oceano arqueozico era 103 vezes mais

reactiva com protenas e aproximadamente igual para o DNA. A anlise filogentica

efectuada coloca o GSH e o Catalase como os antioxidantes mais antigos, com uma

origem estimada de h 3600 Ma e 3500 Ma respectivamente, seguidos do SOD com

uma origem estimada de 3100-2900 Ma atrs. Estes resultados, sugerem uma presso

selectiva precoce nos organismos ancestrais fotossintticos para o desenvolvimento

destes mecanismos de defesa de modo a proteger o seu proteoma e DNA das ROS. Em

concluso, os resultados obtidos suportam a noo de que o stress oxidativo um

evento com uma origem na evoluo anterior acumulao de oxignio na atmosfera.


ABSTRACTABSTRACTABSTRACTABSTRACT

Reactive Oxygen Species (ROS) are potentially toxic to living cells by damaging

cellular components like proteins, membranes and DNA. The unbalance between ROS

and the antioxidant system induces an oxidative stress state that may cause cellular

damage, including loss of function and cell death. It is widely assumed that the

antioxidant systems have evolved after oxygen accumulation in Earth atmosphere and

oceans 1.7 Ga ago. This hypothesis is based on the selective pressure driven by oxygen

usage as the final electron acceptor in the aerobic metabolism that generates the

intracellular superoxide radical. Although the early-earth ocean 3800 Ma ago was

anoxic, the higher UV and gamma radiation intensity, together with the higher levels of

Iron (II), could be a significant exogenous source of ROS to drive the necessary

selective pressure towards the development of antioxidant systems. Therefore, we

hypothesize that the origin of the antioxidant system is prior to oxygen accumulation at

2300 Ma ago. To address this issue we set up a kinetic model that simulates the ocean

chemical environment system taking in account: ROS reactions, photolysis and

radiolysis processes; pH and temperature; oxygen, chloride, reduced sulfur, inorganic

and organic carbon concentrations; iron chemistry and Fenton reactions; and the light

dark cycle. Simulations with the early Earth conditions gathered from geological and

fossil records allowed us to predict how the ROS levels changed across evolution in the

aphotic and photic zones of the ocean. The model predicts 103-fold higher H and CO3-

levels, 102-fold higher levels of HOO and similar HO, O2- and H2O2 levels in the

arqueozoic photic zone compared to present day. The calculated reactivity of ROS

towards biological molecules makes the arqueozoic ocean environment 103-fold more

oxidant to amino acid moieties and as much oxidant to DNA molecules. Phylogenetic

analysis places GSH and Catalase as the oldest antioxidant with an estimate origin at

3600 Ma and 3500 Ma ago respectively, followed by CuZnSOD and FeSOD with an

estimated origin at 3100-2900 Ma ago. These results suggest an early selective pressure

to ancestral photosynthetic organisms to develop these defense mechanisms to protect

their DNA and proteomes from ROS. In conclusion, the results shown here support the

notion that oxidative stress is an evolutionary event that precedes oxygen accumulation

in the atmosphere.


ABREVIATURASABREVIATURASABREVIATURASABREVIATURAS

A/G-GLY Adenina-Guanina DNA Glicosidase (EC 3.2.2.-)

DIC Carbono inorgnico dissolvido (CO2 + HCO3- +CO3

2-)

DNA cido desoxirribonucleico

DOM Matria orgnica dissolvida

eV Electro Volt (1eV = 1,6 10-19 J)

GPX Glutationo peroxidase ( EC 1.11.1.9)

GSH Glutationo reduzido ( -L-Glutamyl-L-cysteinylglycine)

GSR Glutationo redutase ( EC 1.8.1.7)

GSSG Glutationo oxidado (Glutationo dissulfido)

Ma Milhes de anos

NIST National Institute of Standards and Technology

PRX Peroxiredoxina tpica 2 cistenas (EC 1.11.1.15)

ROS Espcies reactivas de oxignio

RNApol RNA polimerase III (EC 2.7.7.6)

RS Espcies reactivas

SHC Esqualeno Hopeno ciclase (EC 5.4.99.17)

SOD Superoxido dismutase (EC 1.15.1.1)

SQMO Esqualeno monoxigenase (EC 1.14.99.7 )

UFAs cidos gordos insaturados

UV Radiao Ultravioleta

UVA Radiao Ultravioleta classe A (315-400 nm)

UVB Radiao Ultravioleta classe B (280-315 nm)

UVC Radiao Ultravioleta classe C (200-280 nm)


NDICENDICENDICENDICE 1. INTRODUO 1

1.1. Stress Oxidativo 1

1.2. Espcies Reactivas de Oxignio 1

1.3. Sistemas Antioxidantes 5

1.4. Origem da Vida e Evoluo 9

1.5. Stress oxidativo e a Evoluo dos Sistemas Antioxidantes 10

1.6. Objectivos deste Trabalho 14

1.7. Modelao Cintica 15

1.8. Filogentica Molecular 16

2. MTODOS 17

2.1. Descrio do Modelo cintico 17

2.1.1. Equaes Diferenciais 18

2.1.2. Processos Cinticos 19

2.1.3. Variveis Independentes 25

2.1.4. Simulao do modelo cintico 30

2.1.5. Anlise de Sensibilidade das RS aos Parmetros do Modelo 30

2.1.6. Estimativa da Reactividade das RS com Biomolculas 31

2.2. Anlise Filogentica 33

2.2.1. Construo de rvores filogenticas 34

2.2.2. Estimativa da Origem dos Antioxidantes na Evoluo 36

3. RESULTADOS 39

3.1. Validao do Modelo Cintico 39

3.2. Simulao da Formao de ROS na Superfcie dos Oceanos Ancestrais 44

3.3. Anlise de Sensibilidade das RS aos Parmetros Cinticos 49

3.4. Anlise de Sensibilidade s Variveis Independentes do Modelo 56

3.5. Perfil das ROS ao longo da profundidade nos Oceanos Ancestrais 60

3.6. Perfil Evolutivo das ROS e Potencial Oxidante no Oceano 66

3.7. Anlise Filogentica da Origem dos Sistemas Antioxidantes 69

4. DISCUSSO 71

5. CONCLUSO 81

6. PERSPECTIVAS 82

7. BIBLIOGRAFIA 83


1

1.1.1.1. INTRODUOINTRODUOINTRODUOINTRODUO

O principal objectivo deste trabalho de investigao esclarecer a origem do stress

oxidativo e dos sistemas antioxidantes na evoluo, durante o perodo anterior

acumulao de O2 na atmosfera. Nesta introduo, define-se o stress oxidativo, espcies

reactivas de oxignio e alguns sistemas antioxidantes mais abundantes nos organismos

vivos. A problemtica da origem do stress oxidativo e antioxidantes durante a evoluo

apresentada, bem como a estratgia seguida no seguimento deste trabalho de modo a

responder s questes emergentes desta problemtica.

1.1. Stress Oxidativo

O stress oxidativo pode ser definido como o balano entre os nveis de

molculas oxidantes e as molculas com actividade antioxidante na clula. Quando este

balano favorece os oxidantes, a clula experiencia um estado de stress ao qual os

componentes celulares sofrem danos mediados por oxidaes, podendo provocar

mutaes genticas, inactivao de funes biolgicas ou mesmo a morte celular. Em

humanos, o stress oxidativo tambm conhecido por ser um dos principais responsveis

pelo envelhecimento e desenvolvimento de patologias como cancro, Alzheimer,

Parkinson e doenas cardiovasculares (Sies 1997, Finkel e Holbrook 2000, Kehrer

2000). No universo das molculas oxidantes, destacam-se as espcies reactivas de

oxignio (ROS), que normalmente so associadas ao stress oxidativo.

1.2. Espcies Reactivas de Oxignio

As espcies reactivas de oxignio (ROS) so molculas que contm oxignio e

reagem espontaneamente com outras molculas de uma forma rpida, sendo um

processo redox que envolve a transferncia de electres ou tomos de hidrognio para

essas molculas oxidando-as.

Em muitos casos, as ROS so radicais por possurem um electro

desemparelhado no tomo de oxignio. Estas podem ocorrer em sistemas vivos por via

endgena, principalmente por intermdio do metabolismo aerbio, ou por via exgena

com origem em factores ambientais como a radiao ionizante e toxinas (Finkel e

Holbrook 2000, Sonntag 1987, Sies 1997).


2

Ao longo de quarenta anos de investigao demonstrou-se que as espcies

reactivas com maior frequncia e toxicidade para os sistemas biolgicos so: o radical

io superxido (O2-), o radical hidrxilo (HO), o radical hidroperxilo (HOO), e o

radical xido ntrico (NO). Outras espcies reactivas txicas podem formar-se

destacando-se: o perxido de hidrognio (H2O2), o peroxinitrito (O=NOO-), os radicais

perxilo e alcxilo (ROO e RO ), o radical carbonato (CO3-) e os radicais de enxofre

(RS). O H2O2 no um radical mas pode reagir com metais pelas reaces de Fenton

originado o radical HO, sendo um agente txico amplamente usado como bactericida

(Sonntag 1987, Finkel e Holbrook 2000, Kehrer 2000, Vesel e Wilhelm 2003).

A toxicidade das ROS est associada sua elevada reactividade com

componentes celulares como as protenas, o DNA e lpidos, causando danos oxidativos

(Sonntag 1987, Finkel e Holbrook 2000, Kehrer 2000, Vesel e Wilhelm 2003). No

caso das protenas, as ROS reagem com os resduos de aminocidos e produzem uma

grande variedade de compostos oxidados e reactivos. A formao destes compostos

pode alterar a estrutura e funo das protenas, levar formao de agregados insolveis

txicos de grandes dimenses e alterar as vias de sinalizao celular, resultando num

estado desregulado que pode levar morte celular ou cancerigenese (Sonntag 1987,

Kehrer 2000, Finkel e Holbrook 2000). Quanto aos danos no DNA, d-se

principalmente pela formao de bases oxidadas como a 8-hidroxideoxiguanosina, que

so responsveis por erros na hibridao pela substituio de citosinas por adeninas

durante a transcrio (Finkel e Holbrook 2000, Sonntag 1987). Estes erros podem levar

a mutaes genticas, alteraes na regulao da expresso gnica e cancerigenese

(Sonntag 1987, Kehrer 2000, Finkel e Holbrook 2000). A peroxidao lipdica, um

processo qumico em cadeia que activado por radicais como o HOO e o HO na

presena de O2 e envolve a abstraco dos tomos de H (bis)allicos nos cidos gordos

insaturados (UFAs) (Dirks, Faiman e Huyser 1981, Salvador, Antunes e Pinto 1994).

Este processo txico para as clulas que contm este tipo de lpidos incorporados nas

suas membranas pelo que compromete a integridade e funo da membrana, derivado

acumulao de perxidos orgnicos reactivos (ROOH) e radicais RO e ROO formados

(Dirks, Faiman e Huyser 1981, Salvador, Antunes e Pinto 1994, Sonntag 1987, Kehrer

2000).


3

As fontes endgenas de ROS in vivo variam desde processos fotoqumicos,

autoxidao e reaces enzimticas, em que podem estar envolvidos vrios compostos

endgenos (Kehrer 2000). O nmero de enzimas associados formao endgena de

ROS elevada e na sua maioria est associada ao metabolismo aerbio pela

dependncia directa com o O2. Os Citocromos P450, Oxidases, Peroxidases,

Lipoxigenases e Desidrogenases so os principais enzimas envolvidos na formao

endgena de ROS. Muitos autores tm proposto o mitocndrio como a principal fonte

de ROS em clulas eucaritas, pela formao do radical O2- a partir da transferncia de

electres da semiquinona (HQ) para o O2 na cadeia transportadora de electres junto

aos complexos I e III (Figura 1). Embora algumas estimativas indiquem que a

quantidade de O2- formado no mitocndrio pode ir at 2% do consumo total de O2,

actualmente ainda se desconhecem os nveis formados em condies normais e

patolgicas (Kehrer 2000, Finkel e Holbrook 2000). Geralmente, aceite que a

formao de H2O2 d-se pela dismutao do O2- catalisada pelo Superxido dismutase,

contudo o O2- tambm pode reagir com o ubiquinol (QH2) com a formao de H2O2 e

HQ (Kehrer 2000, Finkel e Holbrook 2000).

Figura 1 Esquema da formao de ROS na cadeia transportadora de electres da membrana interna do mitocndrio, adaptado de (Kehrer 2000, Finkel e Holbrook 2000) . No complexo I e II h transferncia de electres para ubiquinona (Q) com formao de ubiquinol (QH2). O ubiquinol (QH2) cede os electres ao complexo III e o citocromo c (Cyt c) transfere os electres do complexo III para o complexo IV, que reduz o O2 a gua. No interior dos complexos I e III, o oxignio reage com o intermedirio semiquinona (HQ) formando o radical O2

-, durante o ciclo redox da ubiquinona (Q). O O2- tambm reage com o

ubiquinol (QH2) levando formao de H2O2.


4

A formao exgena de ROS normalmente associada radiao ionizante como

a ultravioleta (UV), raios X e gama (). Este tipo de radiao tem elevado potencial de

formar radicais por um mecanismo quntico de absoro de energia em molculas que

leva quebra ligaes, originando os respectivos radicais e a sua difuso (Sonntag

1987). O estudo dos efeitos da radiao em biologia ao longo de 50 anos, tem

proporcionado estimativas dos rendimentos da formao de radicais em funo da

intensidade ou dose aplicada, para muitos compostos (Sonntag 1987). Na natureza, as

fontes de radiao mais abundantes so a radiao UV solar e a radiao gama

proveniente de istopos radioactivos como o 40K. Para a radiao UV, usualmente tem-

se determinado experimentalmente os rendimentos qunticos () da formao de

radicais em compostos puros e em funo da intensidade de radiao (fotes.s-1)

aplicada a comprimento de onda fixo. Estes rendimentos qunticos () encontram-se

amplamente expressos na literatura, dados em n de molculas de radical formado por

cada foto incidente. Na maioria dos casos, tem-se observado a proporcionalidade

directa entre a intensidade de radiao UV aplicada e a formao destes radicais. Um

sistema qumico bem caracterizado a fotlise da gua pura pela radiao UV, cujos

de formao dos radicais H e HO (172nm = 0,42) foram estudados em funo do

comprimento de onda (Gernot, et al. 1998). Quanto formao de radicais pela radiao

gama, esta tem sido caracterizada experimentalmente em funo da dose de radiao

gama aplicada. Em sistemas biolgicos, usa-se o termo dose de radiao para a

quantidade de energia absorvida por massa de matria exposta a essa radiao. A

unidade SI de dose de radiao de exposio o Gray (Gy), que corresponde energia

absorvida em Joules por cada Kg de matria (1Gy =1J/Kg). Os rendimentos qumicos

(G) para a formao de radicais, na presena de radiao gama encontram-se

determinados experimentalmente para muitos compostos. Estes rendimentos qumicos

correspondem ao n molculas formadas por cada 100 eV (1 eV = 1,6x10-19 J) de

energia absorvida pela matria e proporcional dose (Sonntag 1987). A radilise da

gua na presena de radiao gama um sistema bem caracterizado, cujas ROS

formadas so o HO (G=2,8), o H (G=0,60), o H2O2 (G=0,75) e os electres aquosos

(e- aq) com um G=2,7 (Sonntag 1987, Gordeev e Ershov 2008).


5

1.3. Sistemas Antioxidantes

O sistema de defesa antioxidante comummente encontrado na maioria dos

organismos composto por um conjunto de pequenas molculas orgnicas (metabolitos

antioxidantes) e por duas famlias de enzimas acoplados de uma forma anloga ao

esquematizado na figura 2. O sistema enzimtico, inicia-se com o enzima da famlia dos

superxido dismutases (SOD), que catalisa a reaco de dismutao do radical O2- a

H2O2, e na segunda etapa, um enzima da famlia dos peroxidases ou dos catalases, que

catalisam a reduo do H2O2. Os metabolitos antioxidantes so compostos que possuem

elevado potencial reactivo com ROS removendo-as em troca da sua oxidao (Sies

1997, Finkel e Holbrook 2000). Estes tm um papel importante na remoo dos radicais

formados, onde se destacam o L-ascorbato (vitamina C), o glutationo (GSH) e o -

tocoferol (vitamina E) (Kehrer 2000, Sonntag 1987, Sies 1997, Salvador, Antunes e

Pinto 1994). No quadro 1, apresentam-se algumas das suas caractersticas principais e

reactividade com as ROS.

Figura 2 Esquema geral das defesas antioxidantes presente na maioria dos organismos.


6

Quadro 1 Reactividade dos trs principais antioxidantes qumicos e sua ocorrncia na natureza.

a) (Bonifacic, Ljubenkov e Eckert-Maksic 1994) f) (Sekaki, Gardes-Albert e Ferradini 1984)

b) (Mitsuta, et al. 1990) g) (Asada e Kanematsu 1976)

c) (Cabelli e Bielski 1983) h) (Chen e Hoffman 1973)

d) (Redpath e Willson 1973) i) (Arudi, Sutherland e Bielski 1983)

e) (Misik, et al. 1993) j) (Salvador, Antunes e Pinto 1994)

Neste estudo, apenas focaremos os enzimas antioxidantes Catalase,

Peroxiredoxina, Glutationo peroxidase e Superxido dismutases (CuZn e Fe/Mn).

O Catalase (EC 1.11.1.6) um enzima presente em quase todos os organismos e

o seu mecanismo enzimtico ocorre em duas etapas, no dependendo de ciclos de

regenerao e equivalentes redutores (Zamocky, Furtmuller e Obinger 2008). Tem cerca

de 500 aminocidos na sua cadeia polipeptdica e caracteriza-se por apresentar um

centro activo com um ferro hmico, que catalisa a reaco de dismutao do H2O2, por

um mecanismo compostos pelas reaces redox 1 e 2 (Zamocky and Koller 1999).


7

Os Superxido dismutases, (SOD, EC 1.15.1.1) so metaloenzimas (155-220

aminocidos de comprimento) que apresentam um mecanismo enzimtico composto

pelas reaces 3 e 4, onde M o cofactor metlico que est inserido no centro cataltico

e n o respectivo estado de oxidao menor (Richardson, et al. 1975, Tainer, et al. 1983,

Borgstahl, et al. 1992, Barondeau, et al. 2004).

Estes enzimas distinguem-se principalmente pelos diferentes metais e ligandos que

compem o motivo do centro cataltico, sendo que foram encontradas as seguintes trs

classes:

1) Com um tomo de cobre e zinco (CuZn-SOD, n=1) ligado a 6 resduos de

cisteina e 1 resduo de aspartato no centro activo (Richardson, et al. 1975);

2) Com um tomo de ferro ou mangans (Fe/Mn-SOD, n=2) ligado a 3 resduos de

histidina e 1 resduo de aspartato no centro activo (Borgstahl, et al. 1992);

3) Com um tomo de nquel (Ni-SOD, n=2) ligado ao motivo His-Cys-X-X-Pro-

Cys-Gly-X-Tyr no centro activo (Barondeau, et al. 2004);

Os CuZn-SOD e Fe/Mn-SOD esto presentes em quase todos os organismos

(animais, plantas, fungos e bactrias), ao passo que os Ni-SOD apenas se encontram em

algumas bactrias.

As peroxiredoxinas so uma superfamlia de peroxidases no hmicas que

utilizam o grupo tiol da cistena no centro activo para reduzir o H2O2 numa primeira

etapa. So caracterizadas por apresentarem motivos conservados volta do resduo de


8

cistena que diferem apenas com a subfamlia. As peroxiredoxinas tpicas com duas

cistenas (PRX) so as mais abundantes e encontram-se codificadas em muitos

organismos pertencentes a todos os reinos taxonmicos. A funo antioxidante deste

enzima homodimrico centra-se na sua actividade cataltica de reduo do H2O2,

peroxinitrito e perxidos orgnicos (Cha, Hong e Kim 2007, Rhee, Chae e Kim 2005,

Rouhier e Jacquot 2005). O mecanismo de actuao consiste na reduo do H2O2 pelo

centro dissulfdico, formando uma ligao dissulfdica entre as duas cistenas (reaco

6). O centro dissulfdico reciclado principalmente pela Tioredoxina custa de

equivalentes redutores (reaco 6).

O Glutationo peroxidase (GPX, EC 1.11.1.9 / EC 1.11.1.12) um peroxidase

no hmico de dimenses com cerca de 165 aminocidos e que se encontra na

maioria dos organismos vivos e

presente em vrios compartimentos

celulares, tais como o ncleo, o citosol e

a membrana. O GPX contm um centro

activo com uma selnio-cistena que

catalisa a reduo do H2O2 ou perxidos

orgnicos (ROOH) pelo glutationo

(reaco 7).

Duas molculas de glutationo reduzido (GSH) so oxidadas com a formao de uma

ligao dissulfdica (GS-SG), seguidamente o Glutationo redutase (GSR) recicla o GS-

SG convertendo-o novamente a GSH, segundo um mecanismo de aco esquematizado

na reaco 8.


9

1.4. Origem da Vida e Evoluo

Segundo a teoria da evoluo, a terra formou-se h cerca de 4600 Ma e a vida surgiu

aps uma evoluo qumica ocorrida no ambiente pr-bitico dos oceanos ancestrais,

durante o perodo Hadeano (4600-3800 Ma). Durante os primeiros Ma, a presena da

radiao UV, descargas elctricas e temperaturas elevadas, nas condies dos oceanos

pr-biticos, proporcionaram a sntese de compostos orgnicos como os nucletidos,

aminocidos e cidos gordos (Bernstein 2006, Williams e Da Silva 2006, Madigan,

Martinko e Parker 1997). A consequente polimerizao e organizao destes compostos

em estruturas membranares formaram os primeiros organismos auto replicativos com

patrimnio gentico (RNA/DNA) e actividade cataltica (Madigan, Martinko e Parker

1997, Williams e Da Silva 2006). A descoberta de microfsseis com 3600 Ma, em

rochas no Warrawoona na Austrlia (estromatlitos), constituem uma evidncia de ter

existido organismos celulares autotrficos nos ambientes ocenicos e pensa-se que a

origem da vida, tal como conhecemos, tenha ocorrido num perodo entre os 4000 e os

3600 Ma atrs (Madigan, Martinko e Parker 1997, Williams e Da Silva 2006).

Considerando o Neo-Darwinismo, todas as espcies contemporneas descendem de um

organismo ancestral comum. Ao longo da evoluo, os descendentes deste ancestral

sofreram processos de mutao e seleco natural pelo meio ambiente, que levou a

diversidade de espcies hoje encontradas. Na figura 3, encontram-se resumidos os

principais marcos histricos da evoluo dos organismos vivos na Terra, baseados em

registos fsseis e geolgicos.


10

1.5. Stress oxidativo e a Evoluo dos Sistemas Antioxidantes

O stress oxidativo tem suscitado controvrsia e gerado debate na comunidade

cientfica. Para autores como Galea e Brown (2009), o stress oxidativo e os

antioxidantes surgiram na evoluo aps a acumulao de O2 atmosfrico h 2300 Ma,

usualmente denominado como o grande acontecimento oxidativo. Estes autores

relacionam o stress oxidativo com o O2 no meio ambiente, proveniente da fotossntese

oxignica pelas cianobactrias residentes nas zonas fticas (0-150 m de profundidade)

dos oceanos ancestrais durante o perodo paleoproterozico (2500-1800). A acumulao

de O2 na atmosfera, durante o perodo proterozico, considerada o motivo da evoluo

dos eucaritas aerbios h cerca de 1700 Ma. Paralelamente, com o metabolismo

Figura 3 Principais eventos durante a evoluo das espcies ao longo da histria

da Terra (Madigan, Martinko e Parker 1997, Williams e Da Silva 2006).


11

respiratrio mitocondrial emergente surgiu o stress oxidativo, que se presume ter sido a

presso selectiva para a evoluo dos sistemas antioxidantes (Finkel e Holbrook 2000,

Kehrer 2000, Galea e Brown 2009, Holland 2006). Galea e Brown (2009), propem que

a evoluo dos Eucaritas est correlacionada com a sntese dos esterides (colesterol,

ergosterol, sitosterol), e esta tenha sido uma adaptao ao aumento de O2 atmosfrico

(Figura 4), colocando os enzimas desta via de biossntese como biomarcadores

evolutivos do aumento do O2. Holland (2006) fez uma estimativa detalhada dos nveis

de O2 no oceano ao longo da evoluo, com base em dados geolgicos (figura 4) sendo

consistente com a hiptese de Galea e Brown. Segundo Holland, os oceanos ancestrais

durante a Era arqueozica (3800-2500 Ma atrs) encontravam-se em condies de

anxia, com nveis 104 vezes inferiores aos actuais. No inicio da Era proterozica

(2500-1800 Ma atrs), as suas estimativas sugerem que o O2 aumentou na atmosfera e

oceanos para valores entre 1-2%, quando comparados com os valores da actualidade.

Figura 4 Variao da concentrao de O2 na atmosfera e oceanos ao longo da evoluo (esquerda),

adaptado de Holland (2006). Evoluo da sntese dos esterides em Eucaritas e a evoluo do O2

(direita), adaptado de Galea e Brown (2009).


12

Na literatura, no so encontrados estudos que indiquem quando surgiram os

antioxidantes e quais seriam. No entanto, pensa-se que os primeiros enzimas

antioxidantes a evoluir foram os Catalases e os SODs pela sua ampla distribuio nos

organismos vivos e que este evento possa ter ocorrido h cerca de 3000-2500 Ma

(Williams e Da Silva 2006), baseado no facto dos organismos anaerbios tambm

possurem tais defesas. Por outro lado, foi proposto a evoluo tardia da sntese das

vitaminas C e E h 400-300 Ma, por serem exclusivamente sintetizadas nas plantas e

com uma origem na evoluo h cerca de 500 Ma (Venturi e Venturi 2007).

Cockell (1998, 2000) estimou os nveis de radiao UVA (315-400 nm), UVB

(280-315 nm) e UVC (200-280 nm) superfcie do oceano e ao longo da histria da

terra, tendo em conta o espectro da radiao solar, ausncia da camada do ozono e

luminosidade (Figura 5). No seu trabalho, sugere que a radiao UV-B e UV-C da terra

primitiva h 3800 Ma era efectivamente uma fonte de stress ambiental capaz de inibir a

fotossntese, provocar danos no DNA de cianobactrias e que as ROS possam estar

envolvidas nos danos associados ao fotossistema. A origem da fotossntese oxignica na

evoluo foi estimada em 2560 (2310-2907) Ma atrs e apesar de estar em acordo com a

hiptese de origem do stress oxidativo aps a acumulao de O2, h que ter em conta a

origem da fotossntese anoxignica h 3190 (2800-3630) Ma (Battistuzzi, Feijao e

Hedges 2004). Estes dados, juntamente como os de Cockell, sugerem que os

organismos fototrficos, possam ter estado expostos a stress durante a exposio

radiao UV antes de se ter acumulado O2 na atmosfera (Era arqueozica).

Draganic (2005), sugeriu que a radiao gama proveniente do istopo

radioactivo 40K presente no oceano arqueozico h 3800 Ma atrs, era uma fonte

significativa de compostos oxidantes como o O2 e H2O2. No seu trabalho, estimou a

energia depositada de 0,29 mGy/ano na gua do oceano 3800 Ma e o seu decaimento

(figura 4a). A sua concluso foi baseada num modelo da radilise composto por 87

reaces, que lhe permitiu calcular a quantidade de 3,0 x1019 g de O2 e 1.1 x1018 g de

H2O2 produzidos em todo o oceano por ano.


13

Figura 5 a) Variao da intensidade da radiao UV-A, UV-B, UV-C e gama (40K) ao longo da evoluo

(Cockell 2000, Draganic 2005) b) Variao da concentrao de dixido de carbono superfcie do

oceano ao longo da evoluo (Cockell 2000, Williams e Da Silva 2006, Woodruff 1982, Bernstein 2006).

c) Variao da temperatura (linha contnua) e durao do dia (tracejado) superfcie do oceano ao longo

da evoluo (Woodruff 1982).

Outro aspecto importante de salientar o Fe(II) libertado nas fendas hidrotermais e

que se difunde pelo oceano. As concentraes de Fe(II) dissolvido, estimadas para os

oceanos arqueozicos h 3800 Ma, situam-se entre os 0,1 a 1 M, tendo em conta

apenas as concentraes de O2 dissolvido nestes oceanos de 10-200 nM (Bernstein

2006, Williams e Da Silva 2006). Estes nveis de Fe(II) dissolvido so cerca de 106

vezes superiores aos actuais (1-30 pM) e poderiam catalisar a formao significativa de

ROS pela reaco de Fenton com o H2O2 e na presena de O2 residual. A qumica do

ferro nos oceanos no s se resume oxidao do Fe(II) a Fe(III) pelo O2 e H2O2, mas

tambm pelas suas reaces com as ROS, as quais se listam de seguida:

0,01

0,1

1

10

100

010002000300040005000

Inte

nsid

ade

de R

adia

o

Tempo (Ma a atrs)

UVA (W.m-3)

UVB (W.m-3)

UVC (W.m-3)

40K (Gy/ano)

a)

0,001

0,01

0,1

1

10

010002000300040005000

[CO

2 ] (

mM

)

Tempo (Ma a atrs)

b)

0

5

10

15

20

25

30

0

10

20

30

40

50

60

010002000300040005000

Dur

ao

do

dia

(hor

as)

Tem

pera

tura

(C

)

Tempo (Ma a atrs)

c)


14

No entanto, na gua do mar, o Fe(III) forma uma mistura de complexos oxo-

hidrxidos e agregados coloidais insolveis no reactivos, que acabam por precipitar,

formando depsitos de xidos de ferro (III) no fundo dos oceanos (A. R. Bowie 2002,

Achterberg, et al. 2001, Bowie e Waite 2007). Foram encontrados vrios depsitos de

Fe3O4 e Fe2O3 com 1800 Ma a 3800 Ma anos e que constituem uma prova destes

eventos oxidativos nos oceanos ancestrais (Williams e Da Silva 2006, Holland 2006) .

1.6. Objectivos deste Trabalho

Os argumentos apresentados pelos vrios autores nas discusses apresentadas no

ponto anterior levaram-nos s seguintes questes:

(1) Ser que nas condies anxicas dos oceanos ancestrais (4000-2500 Ma), a

radiao elevada em conjunto com os elevados nveis de Fe(II) seriam fontes

significativas de ROS?

(2) Os nveis de ROS exgenos nos oceanos ancestrais seriam suficientes para

exercer a presso selectiva necessria para a evoluo dos sistemas

antioxidantes?

(3) Quais as ROS formadas e como variaram ao longo da evoluo?

(4) Quais seriam os sistemas antioxidantes que evoluram em resposta ao stress

oxidativo?

Baseado nos argumentos de Cockell e Draganic, formulmos a hiptese que a

evoluo dos sistemas antioxidantes anterior acumulao do O2 atmosfrico h

2300 Ma.


15

De modo a investigar a hiptese e responder s questes 1, 2 e 3 acima

mencionadas, desenvolveu-se um modelo cintico que descreve o ambiente qumico dos

oceanos. Este modelo tem em conta: reaces radicalares; processos de fotlise e

radilise; concentrao de carbono orgnico, inorgnico, cloro e O2 dissolvidos;

oxidao de ferro e enxofre; temperatura; pH; profundidade e durao do dia. A

vantagem de recorrer a esta abordagem terica justificada pela impossibilidade

experimental na quantificao in situ das ROS nestes ambientes e pela complexidade da

rede reaccional e parmetros envolvidos.

Com o objectivo de responder questo 4 e reforar a hiptese proposta, elaborou-

se um estudo filogentico com alguns enzimas antioxidantes e estimou-se a sua origem

na evoluo. Neste estudo, analisam-se os enzimas antioxidantes: Catalase,

Peroxiredoxina Glutationo peroxidase, Superxido dismutases (CuZn e Fe/Mn),

Glutationo sintetase (presena de GSH) e um enzima de reparao de danos no DNA

por ROS (A/G Glicosilase). A escolha destes enzimas foi sobretudo por se encontrarem

presentes numa grande variedade de organismos representativos dos quatro principais

reinos taxonmicos (Monera, Plantae, Fungi e Animalia) e pela disponibilidade das

suas sequncias em bases de dados como a UniProt, que torna possvel a anlise

filogentica de modo a inferir um ancestral comum e estimar a origem na evoluo.

1.7. Modelao Cintica

No presente trabalho, recorreu-se modelao cintica como ferramenta

fundamental no estudo da formao de ROS no ambiente ocenico. A modelao

cintica consiste na construo de modelos matemticos com base em sistemas de

equaes diferenciais cujas variveis e parmetros descrevem com razovel

aproximao uma determinada realidade. Esta metodologia tem ganho nfase no campo

da biologia ao longo dos ltimos 40 anos com inmeros casos de sucesso, respondendo

a questes biolgicas cujo experimentalismo no consegue responder. Savageau (1969),

foi o primeiro a introduzir a ideia de aproximar a cintica de processos bioqumicos por

um modelo de sistemas de equaes diferenciais que recorre a funes de potncia

(Sistemas-S). Esta metodologia permitiu-lhe mostrar as vantagens do design metablico

de uma via linear com controlo por inibio negativa, presente nos sistemas biolgicos.

Esta metodologia tem um carcter geral e foi largamente aplicada em problemas

subsistentes nas reas da gentica, metabolismo, qumica, populacional, imunologia e


16

fisiologia (Voit 2000). Tem sido demonstrado que estes modelos cinticos conseguem

descrever com preciso os vrios processos biolgicos a que se propem, tendo sido

verificados experimentalmente (Voit 2000). Os modelos cinticos de Antunes (1996) e

Salvador (1994) so exemplos de sucesso que contriburam para avanos no

conhecimento actual cientfico no estudo do stress oxidativo e dos sistemas

antioxidantes.

1.8. Filogentica Molecular

A Filogentica molecular um ramo cientifico que se dedica anlise da

composio de molculas biolgicas como o DNA e protenas de modo a estabelecer

relaes evolutivas entre organismos. Estas anlises resultam em rvores filogenticas,

cujos ramos indicam a distncia gentica entre organismos que tem um ancestral

comum. Os primeiros trabalhos surgiram na dcada de 60 e ao longo dos anos foram

largamente usados com elevado sucesso na classificao taxonmica das espcies

(Madigan, Martinko e Parker 1997). Actualmente, esta tcnica tem sido auxiliada por

tcnicas bioinformticas que desde a implementao dos algoritmos de agrupamento at

visualizao das rvores filogenticas, facilitaram e melhoraram esta metodologia.

Tem se verificado uma extensa aplicao destas tcnicas no estudo das relaes

evolutivas entre vrias espcies e entre a mesma espcie, em relao a biomolculas

como enzimas e protenas com funes idnticas (Zamocky, Furtmuller e Obinger

2008). Esta tcnica tambm tem sido usada com elevado sucesso para estimar os tempos

de divergncia evolutiva entre os vrios grupos taxonmicos e a origem da vida (Nei,

Xu e Glazko 2001).


17

2.2.2.2. MTODOMTODOMTODOMTODOSSSS

As metodologias utilizadas neste trabalho de investigao so compostas por

mtodos matemticos e computacionais, que consistem no desenvolvimento de um

modelo cintico com o propsito de descrever a formao de ROS no ambiente

ocenico e a construo de rvores filogenticas de modo a se estimar o momento da

origem de antioxidantes especficos durante a evoluo. De seguida, descrevem-se os

respectivos mtodos.

2.1. Descrio do Modelo cintico

Desenvolveu-se um modelo cintico baseado em equaes diferenciais ordinrias

(ODE) com o objectivo de simular a dinmica de formao e consumo das espcies

reactivas de oxignio (ROS) no ambiente dos oceanos (figura 6). Os processos

qumicos, fsicos e biolgicos includos no modelo so:

Formao primria de HO, H, e- (aq) e H2O2 durante a radilise da gua

pela radiao gama do 40K presente no oceano;

Formao primria de radicais HO, H durante a fotlise da gua pela

radiao UVA, UVB e UVC incidente no oceano;

Variao da intensidade da radiao UV ao longo do dia e da profundidade

no oceano;

Reaces de espcies qumicas primrias entre si e com os seguintes

componentes ocenicos: O2, carbono inorgnico dissolvido (DIC), matria

orgnica dissolvida (DOM) e Cl-;

O influxo de Fe(II) e de SH2, proveniente da sua produo nas zonas

hidrotermais.

A solubilidade do ferro no oceano e as suas reaces com as ROS.

A oxidao do enxofre reduzido pelo O2 e ROS;

O pH e temperatura no oceano;

O consumo biolgico de H2O2 nos oceanos.


18

Figura 6 Representao esquemtica e simplificada do modelo cintico da formao exgena de espcies

reactivas de oxignio (ROS) no oceano. DIC o carbono inorgnico total dissolvido, DOM a matria

orgnica dissolvida.

2.1.1. Equaes Diferenciais

O modelo descrito por um sistema de 14 ODEs com a seguinte expresso

matemtica geral:

,

Onde;

Ci a concentrao da espcie qumica i;

Pi a velocidade de formao da espcie i por fotlise da gua pela radiao UV

solar;

Ri a velocidade de formao da espcie i pela radilise da gua.

Ji o influxo da espcie i proveniente da sua produo hidrotermal

vj a velocidade j da formao ou consumo da espcie i.

(i,j) o coeficiente estequiomtrico da reaco j associado formao (positivo)

ou consumo (negativo) da espcie i.

As espcies qumicas i que so consideradas como variveis dependentes nas ODEs

acima referidas so: H2O2, HO, H, e- (aq), HOO

, O2-,HO2

-, CO2-, CO3

-, HCO2-,

Fe2+, Fe3+ e o Fe (coloidal). As restantes espcies qumicas, nomeadamente: O2, HO-,

H+, CO2, HCO3- e CO3

2-, consideram-se como variveis independentes.


19

2.1.2. Processos Cinticos

O modelo considera as 73 reaces qumicas presentes no quadro 2 e respectivos

parmetros cinticos. No modelo, assumiu-se que todas as velocidades reaccionais

seguem a lei de aco das massas. A relao entre a temperatura e as constantes

cinticas das reaces presentes no quadro 2 dada pela equao de Arrhenius (kj = Aj

e-Ea/RT). As reaces esto agrupadas em mdulos que correspondem aos seguintes

processos: (1) reaces radical-radical durante a radilise e fotlise da gua; (2)

solubilidade do ferro na gua do mar e reaces com ROS; (3) reaces das ROS com o

DIC e formao de radicais carbonato; (4) principais reaces de consumo de radicais

nos oceanos que consideram as reaces com DOM, enxofre reduzido, Cl- e o consumo

biolgico de H2O2. As constantes cinticas presentes no mdulo 1 e respectivas energias

de activao foram retiradas de Buxton (1988). Segundo este autor, as energias de

activao das reaces limitadas por difuso variam entre 10-18 kJ.mol-1, e por este

motivo assumiu-se o valor de 12,6 kJ.mol-1, que corresponde energia de difuso da

gua para as reaces que envolvem radicais, tal como proposto por Gordeev (2008).

No mdulo 2, as reaces e constantes cinticas que descrevem a solubilidade do ferro

no oceano foram retiradas do modelo de Rose e Waite (2002), que foi validado

experimentalmente. Neste modelo, o Fe(III) dissolvido forma na gua do mar

complexos oxo-hidrxidos coloidais no reactivos (Fe coloidal) pela lei cintica

v31=k31[ FeII + FeIII] (Rose e Waite 2003, Bowie e Waite 2007). Posteriormente, o Fe

coloidal sofre um processo precipitao com a formao de Fe2O3 (s), com uma lei

cintica de primeira ordem, dependente da concentrao de Fe coloidal. Para as

reaces das ROS com metais de transio nos oceanos, optou-se por represent-las no

modelo pelas reaces com o Fe(II) e Fe(III), que se encontram bem caracterizadas

cinticamente e so as principais fontes de ROS por esta via pela reaco de Fenton

(Rose e Waite 2002, Finkel e Holbrook 2000, Salvador, Antunes e Pinto 1994). As

constantes cinticas dos mdulos 3 e 4 incluem todas as reaces que se encontram

disponveis no portal do NIST, que envolvem a formao de radicais de carbono,

reaces de oxidao do enxofre reduzido pelas ROS, e reaces do Cl- com as RS. A

reaco de dismutao do O2- pela DOM com formao de H2O2 foi identificada e

caracterizada para o sistema oceano (Goldstone e Voelker 2010), e a sua constante

cintica de pseudo-primeira ordem, usada neste modelo, foi estimada

experimentalmente por Heller (2009). As constantes de primeira ordem da reaco da


20

DOM com o CO3- e com o HOO no oceano, foram estimadas tendo em conta que a

sua reactividade mdia com a matria orgnica cerca de 3000 e 35 vezes superiores

reactividade com o O2- (Helbling e Zagarese 2003). O consumo biolgico de H2O2 nos

oceanos um processo determinante para a concentrao de H2O2 em estado

estacionrio e a sua velocidade foi determinada experimentalmente em muitos tipos de

oceanos, com uma constante cintica de primeira ordem mdia estimada de 0,01

(Helbling e Zagarese 2003, Heller e Croot 2009).

Quadro 2 Reaces qumicas usadas no modelo e respectivas constantes cinticas e energias de activao.

N Reaco k Ea (KJ/mol) [ref]

M O D U L O 1

1 HO + HO2

- OH- + HOO 7,5 x 109 M-1.s-1 12,6 a,b 2 HO + H2O2 HOO + H2O 2,7 x 107 M-1.s-1 14,0 a,b 3 HO + O2

- OH- + O2 8,0 x 109 M-1.s-1 12,6 a,b 4 HOO + HO H2O + O2 6,0 x 109 M-1.s-1 12,6 a,b 5 HO + HO H2O2 5,5 x 109 M-1.s-1 8,0 a,b 6 e- (aq) + HO OH- 3,0 x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 7 H + O2 HOO 2,1 x 1010 M-1.s-1 12.6 a,b 8 H + O2

- HO2- 2,0 x 1010 M-1.s-1 12.6 a,b 9 H + HOO H2O2 1,0 x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 10 H + H2O2

H2O + HO 9,0 x 107 M-1.s-1 13,6 a,b 11 H + HO H2O 7,0 x 109 M-1.s-1 12,6 a,b 12 H + H H2 7,8 x 109 M-1.s-1 12,6 a,b 13 e- (aq) + O2

O2- 1,9 x 1010 M-1.s-1 13,0 a,b 14 e- (aq) + O2

- HO2- + OH- 1,3 x 1010 M-1.s-1 18,8 a,b 15 e- (aq) + HOO HO2- 2,0 x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 16 e- (aq) + H H2 + OH- 2,5x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 17 e- (aq) + H2O2 HO+ OH- 1,1 x 1010 M-1.s-1 15,1 a,b 18 e- (aq) + H+ H 2,3 x 1010 M-1.s-1 12,2 a,b 19 e- (aq) + e- (aq) H2 + OH- + OH- 5,5 x 109 M-1.s-1 20,5 a,b 20 HOO + O2

- O2 + HO2- 8,1 x 105 M-1.s-1 8,8 a,b 21 HOO + HOO H2O2 + O2 3,7 M-1.s-1 24,7 a,b 22 H2O2

+ HOO H2O + O2 +HO 7,0 x 105 M-1.s-1 20,0 a,b 23 HOO H+ + O2- 4,5 x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 24 H+ + O2

- HOO 2,0 x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 25 H2O2 H+ + HO2- 3,56 x 10-2 s-1 12,6 a,b 26 H+ + HO2

- H2O2 2,0 x 1010 M-1.s-1 12,6 a,b 27 H + OH- H2O + e- (aq) 1,8 x 107 M-1.s-1 26,0 a,b 28 O2

- + O2- O2 + OH- + HO2- 0,35 M-1.s-1 12,6 a,b

29 O2- + H2O2

O2 + HO + OH- 16

M-1.s-1 20,0 a,b

M O D U L O 2

30

Fe2+ + 2OH- Fe[OH]2(s)

2,0 x 103

M-1.s-1

29,4

c, d

31 Fe3+ + OH- Fe (colloidal) 4,11 x 107 M-1.s-1 29,4 d, e 32 Fe (colloidal) Fe3+ 2,3 x 10-4 s-1 29,4 d, e 33 Fe (colloidal) Fe2O3 (s) 1,0 x 10-7 s-1 29,4 d, e 34 Fe2+ + O2 Fe3+ + O2- 13 M-1.s-1 9,4 c, f 35 Fe3+ + O2

- Fe2+ + O2 2,0 x 106 M-1.s-1 9,4 c, f, g, h 36 Fe2+ + O2

- + 2H+ Fe3+ + H2O2 2,0 x 106 M-1.s-1 9,4 c, f, g, h 37 Fe3+ + H2O2 Fe2+ + O2- + 2H+ 3,5 x 102 M-1.s-1 9,4 c, f, g, h 38 Fe2+ + HO Fe3+ + OH- 3,4 x 108 M-1.s-1 9,4 c, f, g, h 39 Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO+ OH- 2,0 x 104 M-1.s-1 9,4 c, f, g, h 40

Fe2+ + HOO Fe3+ + HO2-

8,0 x 105

M-1.s-1

9,4

f, i


21

M O D U L O 3

41

CO2

+ HO CO3- + H+ 1,0 x 106

M-1.s-1

12,6

a, i

42 CO2 + H CO2- + H+ 1,0 x 106 M-1.s-1 12,6 a, i

43 CO2 + e- (aq) CO2- 7,7 x 109 M-1.s-1 12,6 a, i

44 HCO3- + e- (aq) CO3- + H+ 1,0 x 106 M-1.s-1 12,6 a, i

45 HCO3- + H CO3- + 2H+ 4,4 x 104 M-1.s-1 12,6 a, i

46 HCO3- + HO CO3- + H2O 1,0 x 107 M-1.s-1 21,2 a, i

47 CO32- + HO CO3- + OH- 4,0 x 108 M-1.s-1 23,6 a, i

48 CO3- + HO CO32- + OH- 3,0 x 109 M-1.s-1 12,6 a, i

49 CO3- + H2O2 HCO3- +HOO 4,3 x 105 M-1.s-1 12,6 a, i

50 CO3- + O2

- CO32- + O2 6,5 x 108 M-1.s-1 12,6 a, i 51 CO3

- + HO2-

HCO3- + O2- 3,0 x 107 M-1.s-1 12,6 a, i 52 CO3

- + CO3-

CO2 + HO2- 2,0 x 107 M-1.s-1 12,6 a, i 53 CO3

- + CO2-

CO2 + CO3-2 5,0 x 107 M-1.s-1 12,6 a, i 54 CO2

- + H2O2 HO + OH- + CO2 6,0 x 105 M-1.s-1 12,6 a, i

55 CO2-

+ O2 O2- + CO2 4,2 x 109 M-1.s-1 12,6 a, i 56 CO2

- + HCO3

- HCO2- + CO3- 2,0 x 103 M-1.s-1 12,6 a, i

57 HCO2- + CO3

- CO2- + HCO3- 1,5 x 105 M-1.s-1 12,6 a, i 58 HCO2

- + HO CO2- + H2O 3,9 x 109 M-1.s-1 12,6 a, i

59 HCO2- + H CO2- + H2

2,1 x 108

M-1.s-1

12,6

a, i

M O D U L O 4

60

SH- + O2 SO42- + H+

1,0 x 100

M-1.s-1

33,4

j, k

61 SH- + e- (aq) HS 1,0 x 107 M-1.s-1 12,6 a, i 62 SH- + HO HS + OH- 9,0 x 109 M-1.s-1 12,6 a, i 63 SH- + HOO HS + HO2- 4,0 x 104 M-1.s-1 12,6 a, i 64 SH- + O2

- HS + O2 4,0 x 102 M-1.s-1 12,6 a, i 65 SH- + H2O2 HS + 2OH- 1,8 x 103 M-1.s-1 12,6 a, i 66 Cl- + H HCl 1,0 x 105 M-1.s-1 12,6 a, i 67 Cl- + e- (aq) Cl2- 1,0 x 106 M-1.s-1 12,6 a, i 68 Cl- + HO ClHO 3,0 x 109 M-1.s-1 12,6 a, i 69 Cl- + O2

- ClO2 20 M-1.s-1 12,6 a, i 70 2O2

- H2O2 +O2 0,004 s-1 12,6 a, l, m

71 CO3- HCO3- 12 s

-1 12,6 a, n

72 HOO H2O2 0,14 s

-1 12,6 a, n

73 H2O2 clula 0,01 s-1 ----- n

a) (Buxton, et al. 1988) b) (Gordeev e Ershov 2008) c) (Rose e Waite 2002) d) (Liu e Millero 2002) e) (Rose e Waite 2003) f) (Sheng, Chi e Horng 1999) g) (Salvador, Antunes e Pinto 1994)

h) (Antunes, et al. 1996) i) NIST (http://kinetics.nist.gov/solution) j) (O Brien e Birkner 1977) k) (Cline e Richards 1969) l) (Goldstone e Voelker 2010) m) (Heller e Croot 2009)


22

As concentraes do Fe(II) e do SH- nos oceanos dependem do potencial

oxidativo do ambiente e dos seus processos de transporte, difuso, e produo nas zonas

hidrotermais (Williams e Da Silva 2006, A. R. Bowie 2002, Bowie e Waite 2007,

Bernstein 2006, Achterberg, et al. 2001). Por esta razo incluram-se parmetros da

entrada de Fe(II) e do SH- na zona reaccional, designados de fluxos de entrada (J).

Assumiu-se que os fluxos de entrada so uma caracterstica do oceano que proporciona

a reposio do ferro consumido, por transporte derivado s correntes martimas e que se

manteve constante ao longo da evoluo. O JFe(II) foi inferido de modo a obter-se na

simulao, com os parmetros do oceano actual, os valores 10-30 nM de Fe(II)

reportados por Hansard (2009) e Bowie (2002). Para o JSH- procedeu-se de forma

anloga ao JFe(II), tendo em conta a concentrao tpica de 1 nM nas zonas oxigenadas

dos oceanos e longe da superfcie (Luther e Tsamakis 1989). Os valores de influxo de

Fe(II) e SH- usados no modelo de modo a estar dentro dos valores acima descritos

foram de 0,3 nM.h-1. Para as restantes espcies, no se considerou o influxo, pois

tratam-se de espcies reactivas cuja difuso limitada pelo seu consumo local.

A principal fonte de radiao gama presente nos oceanos dada pelo istopo 40K,

que possui um decaimento lento de 1% por cada 100 Ma e presente em concentraes

significativas (Draganic 2005). Considerou-se que a formao de RS pela radiao

gama nos oceanos exclusivamente proveniente da radilise da gua, pela radiao

emitida do 40K. A velocidade de formao das RS i no oceano (Ri) por esta via foi

calculada com a seguinte expresso:

Onde;

Gi o rendimento qumico da radilise da gua em n de molculas de i formadas

por cada 100 eV de energia gama absorvida (ver quadro 3).

I(40K) a intensidade de radiao absorvida por 1 Kg de matria ou dose de

radiao absorvida por unidade de tempo, expressa em eV.s-1.Kg-1.

N o n de avogadro (6,022 x 1023).

a densidade mdia do oceano (1,025 kg.dm-3)


23

A velocidade de formao de RS i pela fotlise da gua (Pi) por radiao UV solar no

oceano foi calculada pela seguinte expresso:

,

,

,

Onde;

, , ,!, ," so os rendimentos qunticos representativos do

nmero de molculas de i produzidas por cada foto incidente na gua pela

radiao na zona do UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (200-280

nm), respectivamente.

# , #! e #" so as intensidades de radiao UVA, UVB e UVC

instantneas, presentes localmente no oceano e expressas em J.s-1.dm-3 e

constituem uma varivel independente do sistema.

$%&'& ) , $%&'& )! e $%&'& )", so as energias mdias de 1 foto

na gama do UVA (5,5x10-19 J), UVB (6,6x10-19 J) e UVC (8,3x10-19 J),

calculados a partir da lei E=hc/, recorrendo ao comprimento de onda mdio do

UVA (360 nm), UVB (300 nm) e UVC (240 nm).

* o n de avogadro (6,022 x 1023).

A gua o principal componente do oceano (96,5 %) e a sua decomposio por

radiao UV produz os radicais H e HO em igual proporo (Gernot, et al. 1998). Por

esta razo, consideramos que este processo o principal processo fotoltico que produz

radicais e desprezmos os outros. Os rendimentos qunticos do H e do HO (+,+ )

para a radiao UVA, UVB e UVC foram estimados a partir dos rendimentos qunticos

determinados experimentalmente em funo do comprimento de onda, por Germot

(1998) dos 100-200 nm e por Nikogosyan (1983) dos 250-400 nm. Estes valores foram

linearizados, aplicando o logaritmo de base natural ao valor do e determinou-se a sua

recta de tendncia (Figura 7). A expresso do +,+ em funo do comprimento de

onda em nm foi derivada, elevando a base natural potncia -0,0194 +2,5166 (recta de

tendncia). Os rendimentos qunticos da formao de H e HO pela fotlise da gua

para os intervalos do UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (200-280 nm)


24

foram estimados pela media dos rendimentos qunticos no respectivo intervalo de ,

dado pela seguinte expresso:

,,,-

.,/0123,4/55 1617

Os respectivos valores dos rendimentos qunticos calculados encontram-se

apresentados no quadro 3.

Figura 7 Rendimento quntico da formao de H e HO pela fotlise da gua pura em funo do

comprimento de onda. De 100 a 200 nm dados experimentais tirados de Germot (1998). De 250 a 400 nm

dados experimentais retirados Nikogosyan (1983). Recta de tendncia presente no grfico (tracejado) e

respectiva equao.

Quadro 3 Rendimentos qumicos da radilise da gua (G) e qunticos da fotlise da gua () usados no modelo. Os valores de G foram retirados de Sonntag (1987) e Gordeev (2008). Os foram estimados a partir dos em funo do comprimento de onda em Germot (1998) dos 100-200 nm e por Nikogosyan (1983).

Espcies qumicas (i) G , , ,

H2O2 0,750 0,000 0,000 0,000

HO 2,800 0,013 0,039 0,130

H 0,600 0,013 0,039 0,130

e- (aq) 2,700 0,000 0,000 0,000

Ln[(H,HO)]= -0,0194 + 2,5166R = 0,9799

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

100 150 200 250 300 350 400

Ln [

(H

O, H

)]

(nm)


25

2.1.3. Variveis Independentes

Neste modelo, consideram-se como variveis independentes a [O2] dissolvido, a

concentrao das espcies de carbono inorgnico (CO2, HCO3- e CO3

2- ) dissolvidos, a

[H+] e [OH-] (pH), a concentrao de matria orgnica dissolvida (DOM), a

concentrao de Cl-, a temperatura (T), a intensidade de radiao UV e a intensidade de

radiao gama. O clculo de cada uma destas variveis descrito de seguida.

As concentraes de O2, CO2, HCO3-, CO3

2- so aproximadamente constantes no

sistema ocenico por se encontrarem em equilbrio com a atmosfera (Holland 2006,

Williams e Da Silva 2006, Dore, et al. 2009, Millero, et al. 2002), deste modo assumiu-

se que estas espcies qumicas so constantes no modelo. Os valores da concentrao de

O2 e CO2 dissolvido encontram-se disponveis na literatura para os oceanos actuais e a

sua alterao ao longo da evoluo foi estimada com base em dados geolgicos (ver

figura 4 e 5 na seco 1.5 da Introduo). As concentraes de HCO3- e CO3

2- nos

oceanos dependem directamente dos seguintes equilbrios qumicos:

Neste modelo, as concentraes de HCO3- e CO3

2- so calculadas algebricamente

a partir da concentrao de CO2, assumindo os equilbrios qumicos acima mencionados

e recorrendo ao clculo das suas constantes de equilbrio (K1 e K2) no sistema ocenico

em funo da temperatura (T em Kelvin) e salinidade (S=35%) pelas expresses obtidas

experimentalmente por Millero (2002), que se seguem:

:. / 3

2 /.;<

pK/ ? @8,712 @ 9,46 10.: @ 3 S K 8,56 10.4 S3 K1355,1

TK 1,7976 lnPTQ


26

:3. 3 :

.

2 3.RST

UV3 ? 17 @ 0,0126 S @ 7,93 10.4 S3 K936,3

T@ 1,87 lnPTQ @ 2,62

ST

K 0,075 S3

T

As concentraes de H+ e OH- so calculadas a partir do pH do oceano, pelas

equaes: PW2Q ? 10.R+ e PXW.Q ? 10./.R+ . O pH um parmetro ambiental

ocenico que se encontra tamponado pelo carbono inorgnico dissolvido (DIC) e pode

ser calculado a partir do equilbrio cido-base dos carbonatos (Dore, et al. 2009,

Millero, et al. 2002). Segundo estes autores, as seguintes reaces esto directamente

relacionadas com a modulao do pH no oceano e neste trabalho desenvolveu-se um

modelo cintico que as inclui de modo a simular o equilbrio cido-base do oceano

(quadro 4).

Quadro 4 Modelo cintico do pH do oceano em funo da temperatura e concentrao de dixido de carbono. As constantes cinticas foram retiradas de Schulz (2006) e os valores de pK1 e pK2 de Millero (2002). Equaes diferenciais e clculo do pH

Velocidades cinticas e concentraes iniciais

Constantes

dPHCO:

.Qdt

? v/ @ v3 @ v: K v

d_CO:3.`

dt? v: @ v

dPH2Qdt

? v/ @ v3Kv: K v4 @ v5

dPOH.Qdt

? v4 @ v5

pH = - Log [H+]

v/ ? k/ PCO3Q v3 ? k3 PHCO:

.QPH2Q v: ? k: PHCO:

.Q v ? k _CO:

3.`PH2Q v4 ? k4 PH3OQ v5 ? k POH.QPH2Q PHCO:

.Q ? 1735 M _CO:

3.` ? 550 M PH2Q ? 0,01 M POH.Q ? 1 M

k/ ? 3,0 10.3 s./

k3 ? k/

10.;/ M./. s./

k: ? 5,0 10./ s./

k ? k3

10.;3 M./. s./

k4 ? 2,5 10.4 s./ k5 ? 1,4 10// M./. s./ PCO3Q ? 10 M PH3OQ ? 55 M


27

De modo a simplificar o modelo cintico, o pH do oceano calculado em funo

da concentrao do CO2 dissolvido e temperatura a partir da funo

pH ? @0,42 Ln PCO3Q K 3,28 K 0,0094 T @ 25. Os primeiros dois termos desta

funo, obtiveram-se com o ajuste de uma funo logaritmica aos valores de pH em

funo do CO2 dissolvido para a temperatura de 25 C, obtidos a partir da simulao

com o modelo cintico dos carbonatos descrito no quadro 4 (dados no mostrados). Para

contemplar o efeito da variao da temperatura (T) no pH, acrescentou-se um terceiro

termo funo com a forma de T @ 25. O valor de = 0,0094 foi calculado de

modo a descrever a variao do pH em funo da CO2 para as temperaturas entre os 10

e 80 C, obtidos por simulao com o modelo cintico dos carbonatos e presentes na

figura 8a. Testou-se a funo pH ? @0,42 Ln PCO3Q K 3,28 K 0,0094 T @ 25

comparando os seus valores com o pH determinado experimentalmente no oceano por

Steinberg (1998), com diferentes concentraes de CO2 (figura 8b) e verificou-se que a

funo descreve o pH em funo do CO2 e temperatura.

Figura 8 pH do oceano em funo do CO2 dissolvido e temperatura. Os pontos do grfico da esquerda

correspondem aos valores de pH obtidos por simulao com o modelo cintico dos carbonatos (quadro 4),

para diferentes temperaturas (T). Os pontos da direita, correspondem a valores de pH determinados

experimentalmente no oceano a 20C (Steinberg, Millero e Zhu 1998). As linhas continuas correspondem

ao clculo do pH com a funo pH ? @0,42 Ln PCO3Q K 3,28 K 0,0094 T @ 25.

4

5

6

7

8

9

0,01 0,1 1 10 100

pH

[CO2] (mM)

T = 10 C

T = 20 C

T = 30 C

T = 50 C

T = 80 C

7,9

8,0

8,1

8,2

8 10 12 14 16 18

pH

[CO2 ]( M)


28

O Cl- um dos componentes mais abundantes do oceano, com uma concentrao

mdia de 0,5 M e a sua incluso deve-se elevada reactividade com o HO, que leva

formao de cido hipocloroso. Este instvel e rapidamente se dissocia em Cl- e H2O

(Helbling e Zagarese 2003). Os radicais de enxofre HS, o H2, e o SO42- produzidos

durante os processos apresentados no quadro 2, no foram considerados no modelo por

motivos de simplificao. A excluso do SO42- justificada por este no ser reactivo

com as ROS. A excluso do H2 baseia-se no facto de ser um gs inerte, que se liberta

facilmente para a atmosfera, mantendo as suas concentraes prximas do residual,

tornando a sua reactividade nos oceanos desprezvel (Bernstein 2006, Williams e Da

Silva 2006). No caso do HS, a sua elevada especificidade para reagir com o O2 e a

capacidade de dimerizao, torna esta espcie praticamente inexistente nos oceanos,

sendo os sulfatos os produtos finais do mecanismo reaccional subjacente (O Brien e

Birkner 1977, Cline e Richards 1969).

Considerou-se que a temperatura constante ao longo do dia, assumindo o valor

mdio superfcie (Woodruff 1982), que se encontra apresentado na figura 5c da seco

1.5 da introduo. Teve-se em conta uma diminuio linear ao longo da profundidade

ocenica at aos 800 m com base nas determinaes experimentais de Dore (2009) e

Miller (2005). Estimou-se um declive de 0,042 C/m por regresso linear a partir dos

pontos correspondentes ao perfil da temperatura em funo da profundidade que se

encontra em Miller (2005). Assim sendo, incluiu-se no modelo a funo gh ? g @

0,042 h , que d a temperatura a x metros de profundidade, onde T0 a temperatura

superfcie.

A intensidade da radiao gama no oceano (I) uma varivel independente

neste modelo, que varia ao longo do tempo, sendo calculada pelo decaimento isotpico

do 40K estimado por Draganic (2005), com a seguinte expresso:

j .4,/ /kl m ;

Onde, I expresso em eV.Kg.s-1 e t o tempo decorrido em Ma aps a origem

da Terra h 4700 Ma.


29

Neste modelo, a intensidade de radiao UVA, UVB e UVC so variveis

independentes que so calculadas para cada instante t pela seguinte funo sinusoidal

cortada:

.n o ;

Onde;

I a intensidade mxima de exposio ao UV na superfcie do oceano;

Vq o coeficiente de atenuao ao longo da profundidade para a radiao UV ;

h a profundidade a durao do dia t o tempo o tipo de radiao UV ( A, B ou C)

Os valores de I so obtidos a partir das intensidades estimadas para cada

classe de UVs em Cockell (2000) ao longo da evoluo. Os coeficientes de atenuao

Vq usados neste modelo foram obtidos de Piazena (2002) e so: -0,0616 (UVA); -

0,1402 (UVB) e -0,1546 (UVC). No quadro 6 apresentam-se todas as variveis

independentes usadas neste modelo.

Quadro 6 Variveis independentes usadas no modelo ocenico.

Era (Ma atrs)

[O2] ( M )

[CO2] ( M )

T0 (C)

I(UVA) (w.m-3)

I(UVB)0 (w.m-3)

I(UVC)0 (w.m-3)

I(40K) (106 eV.Kg.s-1)

(h)

4500 0,022 14084,5 55 54,3 11,2 3,0 91,8 3,60

4000 0,022 5633,80 38 56,6 11,7 3,1 71,1 4,50

3500 0,022 2253,50 25 58,9 12,2 3,2 55,1 5,40

3000 0,022 845,100 20 61,2 12,6 3,4 42,7 6,40

2500 0,022 563,400 18 63,5 13,1 3,5 33,1 7,30

2000 2,200 253,500 17 65,8 13,4 3,1 25,7 8,30

1500 4,400 84,5000 15 68,1 13,7 2,8 19,9 9,20

1000 11,00 16,9000 13 70,3 13,5 1,8 15,4 10,1

500 55,00 9,90000 14 71,8 10,5 0,1 11,9 11,1

0 220,0 10,0000 18 71,3 3,70 0,0 9,20 12,0


30

2.1.4. Simulao do modelo cintico

O modelo acima descrito foi implementado no software de anlise e simulao

PLAS (Ferreira 2000), onde todas as simulaes foram executadas. Neste, o sistema de

equaes diferenciais (ODEs) foi resolvido numericamente por integrao recorrendo

ao algoritmo LSODA (Petzold 1983). Este algoritmo, permite alternar mediante o

comportamento do processo integrativo, visando aumentar o sucesso na obteno das

solues numricas. As simulaes so executadas a partir dos valores nulos de

concentrao inicial das variveis, numa janela de tempo correspondente a obter-se no

mnimo 100 ciclos dia e noite, at todos os valores oscilarem na forma de ciclo limite,

sem haver alteraes no valor mdio dirio calculado. Cada simulao executada

parametrizada para as condies ambientais estimadas de cada poca (ver quadro 6,

seco 2.1.3), considerados como constantes durante a janela de tempo usada. No CD

em anexo a esta tese, inclui-se as implementaes do modelo, juntamente com alguns

scripts usados que foram usados nas simulaes.

2.1.5. Anlise de Sensibilidade das RS aos Parmetros do Modelo

A sensibilidade da concentrao de cada RS a cada parmetro cintico do modelo

acima descrito foi obtida por simulao, onde se variou 1% do valor de cada parmetro

cintico isoladamente, mantendo os restantes constantes. O valor da concentrao da

RS, obtido no instante em anlise foi usado no clculo da respectiva sensibilidade, como

descrito por Voit (2000). As sensibilidades (S1%) das RS a cada parmetro cintico que

compe o modelo (quadros 2 e 3 da seco 2.1.2) foram calculadas recorrendo

seguinte expresso matemtica:

/%

Onde,

ki a variao na constante cintica da reaco i que corresponde a 1% da

constante cintica ki0 ;

ki0 a constante cintica retirada da literatura e usada nas previses do modelo;

[RS]0 a concentrao de espcie reactiva obtida por simulao com as ki0 no

instante em anlise;


31

[RS] a variao da concentrao da espcie reactiva RS obtida nas simulaes

com e sem o aumento de 1% na constante cintica ki..

A sensibilidade das RS s variveis independentes O2, CO2, Fe(II) , SH-, DOM,

temperatura, intensidade de radiao UV) , intensidade de radiao gama e pH

foram estudadas pelo varrimento individual no valor de cada uma destas variveis

independentes, dentro dos valores limite plausveis e recorrendo ao modelo cintico.

Os varrimentos nestes parmetros foram executados por series de simulaes, em

que se variou o parmetro analisado em intervalos iguais, mantendo os restantes

parmetros constantes. A sensibilidade de cada RS variao de cada varivel

independente foi visualizada atravs do traado de grficos dos logaritmos das

concentraes mdias de exposio diria das RS em funo dos logaritmos da

varivel independente. Nestes grficos, a sensibilidade em cada ponto dada pelo

declive da recta tangente nesse ponto.

2.1.6. Estimativa da Reactividade das RS com Biomolculas

Os danos oxidativos provocados pelas RS com biomolculas, foram estimados

pelo clculo das constantes de pseudo-primeira ordem (kj), compostas pelo produto do

valor correspondente concentrao mdia de exposio diria das RS, obtidas por

simulao, com o valor da constante mdia da sua reaco com: 1) aminocidos em

protenas (aa); 2) cidos gordos insaturados (UFAs); 3) nucletidos em cidos

nuclecos (DNA). As concentraes mdias de exposio diria para as RS foram

calculadas por integrao da curva da concentrao das RS durante a simulao, no

intervalo que corresponde ao ltimo ciclo dia-noite e dividindo pelo respectivo

intervalo.

Para os aminocidos em protenas, calculou-se a mdia pesada das constantes

cinticas ki das reaces dos 20 aminocidos essenciais com as espcies reactivas (RSj),

tendo em conta a sua frequncia em protenas (fi) e respectiva fraco de exposio ao

solvente (i), com apresentado na equao 1, de forma anloga ao descrito em Salvador

(1994).


32

s3

s/

No caso da peroxidao lipdica, calculou-se a mdia das constantes cinticas ki

referentes reaco de cada ROS com os cidos gordos insaturados (UFAs)

representados por LHn, onde n o grau de insaturao. Para estas espcies, as

constantes dizem respeito s reaces de iniciao do mecanismo de peroxidao

lipdica. Estas constantes calcularam-se a partir da lei cintica determinada por Dirks

(1981) que considera a concentrao de O2 (equao 2).

t

/3

s5

s/3

/3

/3

No caso do DNA, usou-se as constantes de reaco da espcie reactiva j com

nucletidos presentes no DNA (ki), determinadas directamente em cadeias de DNA

(equao 3).

Calculou-se tambm o potencial reactivo do ambiente (kox), que consiste na soma

de todas as kj para cada tipo de biomolcula e dada pelas seguintes expresses:

o u o u o u

As constantes cinticas das reaces com aminocidos foram retiradas da base

de dadas do NIST (http://kinetics.nist.gov/solution) e os parmetros fi e i em Antunes

(1996). No caso das reaces com o DNA, estas podem ser encontradas no portal do

NIST e Sonntag (1987). Para as reaces com os UFAs, recorreu-se base de dados do

NIST e a Salvador (1994). As constantes encontradas na literatura acima referidas

encontram-se apresentadas no quadro 7 e para as reaces que no se encontraram

assumiu-se k = 0.


33

Quadro 7 Constantes de segunda ordem k de reaco das espcies reactivas com aminocidos, DNA e acidos gordos insaturados (LHn) expressas em unidades M-1.s-1. Os parmetros fi e i correspondem frequncia de aminocidos em protenas (www.expasy.org) e fraco de exposio dos aminocidos ao solvente (Antunes, et al. 1996) respectivamente.

k (HO) k (H) k (HOO) k(O2

-) k(CO3-) k(CO2

-) f (%)

Ala 4,8 x108 2,7 x105 4,4 x101 6,0 x10-2 1,0 x103 0 8,27 0,26

Arg 3,5 x109 4,5 x106 6,3 x101 1,3 x10-1 9,0 x104 0 5,53 0,36

Asn 3,8 x107 4,3 x105 5,4 x101 1,6 x10-1 0 0 4,05 0,37

Asp 7,5 x107 2,7 x106 1,2 x101 1,8 x10-1 0 0 5,45 0,38

Cys 4,7 x1010 1,0 x109 6,0 x102 1,5 x101 1,8 x108 0 1,36 0,09

Glu 2,3 x108 5,2 x106 3,0 x101 3,9 x10-1 0 0 6,76 0,38

Gln 2,4 x108 0 2,3 x101 2,5 x10-1 0 0 3,94 0,38

Gly 1,7 x107 8,0 x104 4,9 x101 4,2 x10-1 1,0 x103 1,0 x107 7,09 0,28

His 5,0 x109 2,3 x108 9,5 x101 1,0 x100 4,3 x106 2,0 x105 2,27 0,22

Leu 1,7 x109 1,6 x107 2,3 x101 2,1 x10-1 0 0 9,67 0,15

Lys 3,8 x108 1,5 x106 1,3 x101 3,3 x100 0 0 5,85 0,48

Ile 1,8 x109 7,0 x106 3,9 x101 2,0 x100 0 0 5,99 0,12

Met 8,1 x109 3,8 x108 4,9 x101 3,3 x10-1 1,2 x108 0 2,42 0,15

Phe 6,5 x109 7,1 x108 1,8 x102 3,6 x10-1 5,0 x104 0 3,86 0,12

Pro 6,5 x108 7,0 x105 1,7 x101 1,6 x10-1 0 0 4,68 0,36

Ser 3,2 x108 1,2 x106 5,5 x101 5,3 x10-1 0 0 6,50 0,34

Thr 5,1 x108 9,2 x108 1,3 x101 2,1 x10-1 0 0 5,33 0,30

Trp 1,3 x1010 2,0 x109 2,4 x102 2,4 x101 4,9 x108 1,0 x105 1,08 0,15

Tyr 1,2 x1010 4,0 x108 1,0 x102 1,0 x101 1,4 x108 1,0 x105 1,08 0,24

Val 6,6 x108 1,7 x107 1,1 x101 1,8 x10-1 0 0 6,87 0,86

DNA 2,5 x108 6,0 x107 1,0 x107 1,0 x106 1,0 x103 1,0 x104 ---- ----

LH1 5,0 x108 0 1,2 x103 1,0 x10-2 0 0 ---- ----

LH2 5,0 x108 0 1,2 x103 1,0 x10-2 0 0 ---- ----

LH3 5,0 x108 0 1,7 x103 1,0 x100 0 0 ---- ----

LH4 5,0 x108 0 3,1 x103 1,0 x100 0 0 ---- ----

LH5 5,0 x108 0 6,7 x103 1,0 x100 0 0 ---- ----

LH6 5,0 x108 0 1,6 x104 1,0 x100 0 0 ---- ----

2.2. Anlise Filogentica

O mtodo apresentado foi adaptado de Nei (2001) no sentido de estimar a origem

temporal de vrios enzimas antioxidantes ao logo da evoluo. Consiste na construo

de rvores filogenticas de biomarcadores evolutivos e antioxidantes, calcular as

respectivas divergncias evolutivas e compar-las de modo a inferir a origem temporal

na evoluo dos antioxidantes.


34

2.2.1. Construo de rvores filogenticas

Construram-se rvores filogenticas dos enzimas antioxidantes (Catalase,

Peroxiredoxina, Glutationo peroxidase, Superxido dismutases (CuZn e Fe/Mn),

Glutationo sintetase, A/G Glicosilase) e dos seguintes biomarcadores evolutivos:

Esqualeno monooxigenase (SQMO), Esqualeno-hopeno ciclase (SHC) e RNA

polimerase I (RNApol). A escolha destes enzimas antioxidantes prende-se por se

encontrarem presentes no genoma de espcies evolutivamente muito afastadas como os

eucaritas e procaritas, colocando-as como boas hipteses de terem surgido numa

etapa precoce na evoluo. A escolha do SHC como marcador evolutivo devido a ter

uma origem na evoluo anterior a 2700 Ma atrs, baseada na descoberta de hopenos

em microfsseis com 2700 Ma (Fischer 2008, Madigan, Martinko e Parker 1997,

Summons, et al. 2006). Considerou-se o SQMO como biomarcador por ter uma origem

na evoluo anterior a 2300 Ma, baseado no facto de ser o primeiro enzima da via da

biossintese do colesterol e a evoluo deste estar associada ao aumento de O2 na

atmosfera (Summons, et al. 2006). Seleccionou-se o RNA polimerase (RNApol) como

biomarcador por se encontrar disponvel na UniProt para todas as espcies usadas nas

construes das rvores filogenticas e por ser considerado como existente nos

organismos ancestrais que surgiram h mais de 3500 Ma atrs (Nei, Xu e Glazko 2001,

Madigan, Martinko e Parker 1997, Williams e Da Silva 2006). O uso deste terceiro

biomarcador, com uma origem na evoluo prxima da origem da vida, permite-nos

inferir um valor numrico para origem na evoluo dos outros biomarcadores.

Para a construo de pares de rvores filogenticas (Biomarcador/Antioxidante),

recolheram-se da base de dados da UniProt (www.uniprot.org), as sequncias de

aminocidos correspondentes s protenas biomarcadoras e antioxidantes, de modo a

constituir pares de conjuntos (Biomarcador/Antioxidante), segundo o esquema de

seleco da figura 9 e com as seguintes caractersticas:

1) As sequncias seleccionadas para cada par de conjuntos

Biomarcador/Antioxidante, pertencem a grupos taxonmicos que tm uma

divergncia evolutiva entre si prxima da origem da vida na Terra;

2) Cada grupo taxonmico possui o maior nmero possvel de espcies

representativas;

3) Em cada espcie, cada protena corresponde a uma nica sequncia de

aminocidos;


35

4) Cada par de conjuntos Biomarcador/Antioxidante possuem o mesmo nmero de

sequncias e partilham as mesmas espcies.

Figura 9 Esquema de seleco das sequncias de aminocidos de protenas na base de dados da

UniProt, pertencentes a espcies comuns de modo a formar os pares (Antioxidantes/Biomarcadores). O

marcador SQMO inclui a divergncia evolutiva entre as bactrias e eucaritas h cerca de 3557 Ma (Nei,

Xu e Glazko 2001). O marcador SHC refere-se divergncia evolutiva ocorrida no filo das bactrias,

durante a separao das proteobactrias das outras bactrias em ramos distintos h cerca de 3644 Ma

(Nei, Xu e Glazko 2001, Battistuzzi, Feijao e Hedges 2004).

No conjunto total de sequncias de protenas marcadoras (SQMO, SHC e

RNApol) de diferentes espcies disponveis na UniProt, a distribuio taxonmica dos

pares (Antioxidante/Biomarcador) seleccionados encontram-se resumidos no quadro 8.

Consideraram-se as sequncias provenientes de anotaes manuais e automticas, desde

que esteja identificado a funo pelo EC e nome do enzima. Derivado incerteza

associada s sequncias provenientes de anotaes automticas, principalmente se

correspondem ao antioxidante em questo, apenas se seleccionaram aquelas que se

relacionavam filogeneticamente com as manuais, inserindo-se no respectivo grupo

taxonmico, nas rvores filogenticas construdas.


36

Quadro 8 Distribuio das espcies que compem os pares (Antioxidante/Biomarcador) nos principais grupos taxonmicos utilizados na construo das arvores filogenticas.

SQMO SHC RNApol

Eucaritas Procaritas Proteobac. Fir./Cia./Act. Eucaritas Procaritas.

Catalase 6 41 34 11 40 50

GPX 7 48 30 13 45 49

PRX 5 29 29 8 27 33

CuZnSOD 5 46 25 8 41 37

Fe/MnSOD 7 49 39 16 46 61

GSHS 5 43 34 7 42 46

A/G-GLY 16 25 36 13 15 54

As rvores filogenticas foram inferidas por alinhamentos mltiplos das

sequncias de aminocidos de protenas nos conjuntos seleccionados, atravs da

ferramenta bioinformtica ClustalW2 (Larkin 2007), disponvel no portal do EMBL-

EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Os alinhamentos foram feitos com o

algoritmo de agrupamento Neighbour joining (Atteson 1997), a matriz de substituio

BLOSUM e os respectivos parmetros recomendados no portal. Recorreu-se ao

software Archaeopteryx (Han e Zmasek 2009) para visualizar e analisar os filogramas e

onde foi estabelecida a raiz pelo ponto mdio entre a maior distncia calculada (Nei, Xu

e Glazko 2001). As rvores construdas das espcies mencionadas no quadro 8

encontram-se para visualizao no CD em anexo, juntamente com a lista identificativa

das respectivas espcies e cdigos da UniProt.

2.2.2. Estimativa da Origem dos Antioxidantes na Evoluo

A estimativa da origem dos sistemas antioxidantes teve como base o clculo das

distncias genticas entre o ancestral comum e as espcies presentes (dAEi) em cada par

de rvores filogenticas (Biomarcador/Antioxidante). Como distncia gentica usou-se

o nmero de substituies de aminocidos que ocorreram ao longo da evoluo (Nei,

Xu e Glazko 2001). Assumindo que a taxa de mutao constante ao longo da

evoluo, a dAE proporcional ao tempo de divergncia entre o ancestral e a espcie

considerada (Ochman e Wilson 1987). Os tempos de divergncia dos antioxidantes em

cada espcie (TEi ) so calculados pela relao :


37

vmowm xywyv mowm

v xywy

Como as rvores filogenticas construdas apresentam espcies muito distantes em

termos evolutivos, os tempos de divergncia so iguais ao tempo de origem na

evoluo. Considerando o espao amostral de todos os TEi calculados com os 3

biomarcadores, a origem dos antioxidantes na evoluo estimada pela mdia

aritmtica. Recorreu-se a testes no paramtricos de Mann-Whitney para comparar entre

tempos de origem dos antioxidantes estimados, executados com o software GraphPad

Prism (www.graphpad.com/prism/ ).

Assumiu-se que o tempo de divergncia correspondente ao biomarcador RNApol

(Tz{;|) igual ao tempo de divergncia evolutiva entre o ancestral comum e as

espcies que compem as rvores filogenticas como ilustrado na figura 10. Assim

sendo, no caso das rvores filogenticas que traduzem as relaes filogenticas entre os

eucaritas e procaritas, usou-se o tempo de divergncia mdio de 3557 Ma estimado

por Nei e Glatzko (2001). Para as rvores filogenticas que traduzem as relaes

filogenticas entre as proteobactrias e outros grupos taxonmicos procariticos, usou-

se o tempo de divergncia mdio de 3644 Ma estimado por Battistuzzi (2004).

Figura 10 Esquema das divergncias evolutivas entre as espcies que compem as rvores filogenticas

do Esqualeno-Hopeno ciclase (SHC) (esquerda) do Esqualeno monooxigenase (SQMO) (direita).


38

Os tempos de divergncia dos biomarcadores do SHC e SQMO (Txywy)

foram calibrados com o Tz{;|, tendo em conta as seguintes condies:

1) Taxa de substituio de aminocidos constante ao longo da evoluo;

2) Tempo de divergncia do SQMO > 2300 Ma;

3) Tempo de divergncia do SHC > 2700 Ma;

Desta forma, possvel calcular o tempo de divergncia do SHC e SQMO pela

relao directa entre as distncias genticas e o tempo de divergncia do RNApol. Na

calibrao do SQMO usaram-se 57 sequncias de aminocidos e na calibrao do SHC

um total de 60, para inferir rvores filogenticas que partilham as mesmas espcies com

o calibrador (RNApol). A partir destas, como se pretende um valor nico,

contabilizaram-se todas as distncias genticas (dAEi) nas rvores filogenticas do

calibrador e calibrado e calculou-se o tempo de divergncia do SQMO e SHC pelas

seguintes relaes:

},v },

s/

v z{;|s/

}~-v }~-

s/

v z{;|s/

Os T}, e T}~- calculados desta forma foram de 2818 Ma e 3341 Ma respectivamente,

que esto dentro das condies limite impostas a estes biomarcadores.


39

3.3.3.3. RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS

3.1.Validao do Modelo Cintico

O modelo foi validado por um conjunto de testes de modo a obter-se a confiana

necessria para efectuar previses acerca dos nveis de ROS no oceano. Cada teste

consiste na simulao de uma experincia retirada da literatura, em condies

controladas e bem definidas pelo seu autor. As experincias foram seleccionadas de

modo a representar os vrios processos que compem o modelo. Todas as simulaes

foram executadas sem qualquer ajuste nos parmetros, nas condies descritas pelos

autores, e os resultados obtidos foram comparados com os valores experimentais.

O processo de validao do modelo iniciou-se com o mdulo 1, que consiste nas

reaces entre ROS na gua pura, presentes no quadro 2 da seco dos mtodos. O teste

deste mdulo consiste na anlise de um conjunto de simulaes e experincias que

descrevem a formao e decomposio de H2O2 em gua pura, na presena de diferentes

intensidades de radiao ionizante, concentrao de O2 e tempera

bioquímica de sistemas das espécies reactivas de oxigénio...

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