BIOL O G I A

G e n é t i c a M o l e c u l a r

P r o f a . R i t a d e C á s s i a d e M o u r a

P r o f a . M a r í l i a d e F r a n ç a R o c h a

P r o f a . M a r i a T e r e s a M a r q u i m N o g u e i r a C o r n é l i o

2a edição | Nead - UPE 2013

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)Núcleo de Educação à Distância - Universidade de Pernambuco - Recife

Moura, Rita de CássiaBiologia: genética molecular/Rita de Cássia de Moura; Marília de França

Rocha; Maria Tereza Marquim Nogueira Cornélio. – Recife: UPE/NEAD, 2011.

64 p.

1. Genética Molecular 2. Biologia 3. Educação à Distância I. Universidade de

Pernambuco, Núcleo de Educação à Distância II. Título

CDD – 17ed. – 575.1 Claudia Henriques – CRB4/1600

BFOP-090/2011

M929b

UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO - UPE

ReitorProf. Carlos Fernando de Araújo Calado Vice-ReitorProf. Rivaldo Mendes de Albuquerque

Pró-Reitor AdministrativoProf. Maria Rozangela Ferreira Silva

Pró-Reitor de PlanejamentoProf. Béda Barkokébas Jr.

Pró-Reitor de GraduaçãoProfa. Izabel Christina de Avelar Silva

Pró-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa Profa. Viviane Colares Soares de Andrade Amorim

Pró-Reitor de Desenvolvimento Institucional e ExtensãoProf. Rivaldo Mendes de Albuquerque

NEAD - NÚCLEO DE ESTUDO EM EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA

Coordenador GeralProf. Renato Medeiros de Moraes

Coordenador AdjuntoProf. Walmir Soares da Silva Júnior

Assessora da Coordenação GeralProfa. Waldete Arantes

Coordenação de CursoProf. José Souza Barros

Coordenação PedagógicaProfa. Maria Vitória Ribas de Oliveira Lima

Coordenação de Revisão GramaticalProfa. Angela Maria Borges CavalcantiProfa. Eveline Mendes Costa LopesProfa. Geruza Viana da Silva

Gerente de ProjetosProfa. Patrícia Lídia do Couto Soares Lopes

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Equipe de DesignAnita Sousa/ Gabriela Castro/Renata Moraes/ Rodrigo Sotero

Coordenação de SuporteAfonso Bione/ Wilma SaliProf. José Lopes Ferreira Júnior/ Valquíria de Oliveira Leal

Edição 2013Impresso no Brasil

Av. Agamenon Magalhães, s/n - Santo AmaroRecife / PE - CEP. 50103-010Fone: (81) 3183.3691 - Fax: (81) 3183.3664

Genética Molecular

Profa. Rita de Cássia de Moura Carga Horária I 60HColaboradoras: Profa. Marília de França Rocha Profa. Maria Teresa Marquim Nogueira Cornélio

aPreSentaÇÃo

Caros alunos, vocês iniciam uma nova jor-nada que os levará a conhecimentos tão intrigantes quanto interessantes. Além da habitual dedicação que todos deverão ter à disciplina, destaco a importância de de-senvolver a habilidade de abstração que permitirá uma aprendizagem mais rápida e prazerosa. Os primeiros geneticistas estavam interes-sados em compreender o mecanismo da hereditariedade, particularmente o modo de transmissão dos genes por meio da re-produção. A partir da década de 1930, os genes passaram a ser reconhecidos como entidades físicas, o que os tornou candida-tos a objeto de estudo através de métodos bioquímicos e biofísicos. Estudos focados nesta nova abordagem permitiram que a natureza química dos genes fosse desven-dada bem como foram um marco para a Genética, pois, a partir do momento em que os biólogos deixaram de perceber os genes apenas como unidades de herança e passaram a considerá-los unidades de in-formação biológica, nascia um novo ramo da Genética, a Genética Molecular.

O termo Genética Molecular é comumen-te usado para se referir à área da Genéti-ca, que estuda todos os aspectos do gene. Desde a década 1950, os biólogos mole-

culares têm buscado compreender e descre-ver os processos relacionados ao modo de transmissão da informação biológica, ao seu acondicionamento e à maneira pela qual esta informação torna-se disponível para a célula. Vários estudos colaboraram para a descober-ta da estrutura dos genes; para a descrição da molécula de DNA; para a compreensão da organização e função dos genes; descrição de novos tipos de moléculas de RNA; carac-terização dos processos da expressão gênica e dos diferentes modos de controle da ex-pressão tanto em organismos procariontes quanto em eucariontes; descrição e aplicação de ferramentas moleculares, dentre outros conhecimentos.

Nós teremos, durante esta disciplina, a opor-tunidade de estudar as descobertas e os pro-cessos moleculares acima citados e compre-ender os conceitos fundamentais em genética molecular, com ênfase na descrição dos prin-cipais processos moleculares, organização e função dos genes, organização molecular em vírus e bactérias, os métodos moleculares e suas aplicações. Contudo, é importante que todos compreendam que a energia direciona-da a este propósito não se trata simplesmente do cumprimento de mais uma tarefa propos-ta pelo docente em resposta à estrutura cur-ricular do curso de Ciências Biológicas. Pode-mos garantir que é bem mais que curiosidade científica ou obrigação, pois a dimensão al-cançada pela Genética Molecular, através de sua aplicação na agricultura, medicina e meio ambiente, tem provocado uma grande reper-cussão social, portanto é natural o espaço que as novas descobertas têm conseguido na mídia e notória, a importância do estudo des-ta disciplina, em particular pelos profissionais da área de saúde (Medicina, Biologia, Nutri-ção, Farmácia, etc.).

A disciplina Genética Molecular apresenta conceitos fundamentais para compreensão do modo de organização da estrutura mo-lecular do material genético; do mecanismo através do qual o material genético é repli-cado; do processo de expressão da informa-ção genética; de como o material genético muda com o tempo; da descrição de siste-mas biológicos modelos (vírus e bactérias); da manipulação genética e dos mecanismos

envolvidos na regulação da expressão gêni-ca. Adicionalmente permitirá aos estudantes uma visão geral sobre o impacto significativo que a genética tem obtido sobre a sociedade, em particular sua aplicação na medicina e na agricultura modernas.

Os conteúdos que serão estudados na discipli-na Genética Molecular estão distribuídos em quatro capítulos. Capítulo 1- A estrutura e a replicação do DNA; Capítulo 2- Expressão gê-nica, Mutação e reparo do DNA; Capítulo 3- Genética de vírus e bactérias, Técnicas de ge-nética molecular e suas principais aplicações; Capítulo 4- Regulação da expressão gênica em procariontes e eucariontes.

O estudo de qualquer área da Genética requer o exercício do desprendimento, esforço e de-dicação contínuos, o que resulta não apenas na compreensão dos mecanismos (para alguns mistérios) como também na capacidade de participar efetivamente de discussões refe-rentes a aspectos éticos que têm sido comuns nos dias atuais. A Genética Molecular propi-ciará o embasamento necessário para compre-ensão da dimensão alcançada pela Engenharia Genética, sua importância, e por que não seus prós e contras.

Neste capítulo, manteremos o padrão apre-sentado nos capítulos das disciplinas Genéti-ca Geral e Citogenética, isto é, cada capítulo apresentará atividades de revisão e de pesqui-sa, com o objetivo de aprofundar conteúdos e verificar seus conhecimentos. Você continua-rá sendo desafiado pela Fix, a esfinge que foi apresentada durante a disciplina de Genética Geral. Contudo, é importante lembrar que o maior desafio está sempre dentro do próprio homem, consiste no que ele verdadeiramen-te deseja e no quanto é capaz de transformar sonho em realidade. Por isso, esperamos que essa disciplina não seja apenas mais uma opor-tunidade de crescimento intelectual, e sim que contribua, através da beleza, complexidade e precisão dos processos moleculares para o sur-gimento de um novo modo de ver a vida, com mais profundidade e consciência.

Desejamos-lhes sucesso nessa nova etapa de aprendizagem.

Oi, sou Fix, leoa alada com ca-beça humana e só posso ser vencida pelo intelecto. Meu primeiro desafio foi quando via-java pela Grécia, anos atrás.

Decifra-me ou te devoro! “Qual o ser que anda de manhã com quatro patas, ao meio dia com duas e, à tarde, com três e que, contrariamen-te à lei geral, é mais fraco quando têm maior número de membros?” Essa é fácil, porém de-safio mesmo é o que tenho para vocês.

O caminho do conhecimento é árduo, mas ex-tremamente gratificante para aquele que nele se aventurar. Convido a quem tiver coragem a en-trar na maravilhosa viagem do conhecimento.

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Ácido deSoxirribonucléico (dna) a eStrutura e a rePlicaÇÃo do dna

introduÇÃo

Iniciaremos nosso estudo, relatando as des-cobertas que levaram à determinação do DNA como material genético e à descrição da estrutura da molécula de DNA. Destaca-remos suas funções biológicas, particular-mente a capacidade que a molécula tem de sofrer replicação, a qual ocorre devido a sua composição e organização, que permitem a ação de um complexo enzimático capaz de sintetizar a cópia precisa da molécula de DNA, garantindo a transmissão da informa-ção genética de célula a célula, portanto, de geração a geração.

Neste capítulo, estudaremos o ácido de-soxirribonucléico - DNA, sua estrutura e o processo de replicação, responsável pela produção de cópias do DNA. O período correspondente às décadas de 1920 até os primeiros anos de 1950 foi fundamental para descrição e compreensão de processos moleculares. Dentre tantas descobertas, po-demos destacar a descrição da dupla héli-ce de DNA por Watson e Crick, em 1953 e salientar que estes pesquisadores contaram com conhecimentos prévios, os quais foram relevantes e estão destacados a seguir: 1- a descrição dos genes como sendo fatores he-reditários por Mendel, embora ainda não se soubesse sua natureza física; 2- o reconhe-cimento da mutação como um fator capaz

Profa. Rita de Cássia de Moura Carga Horária I 15HColaboradoras: Profa. Marília de França Rocha Profa. Maria Teresa Marquim Nogueira Cornélio

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10de alterar o funcionamento do gene; 3- a teo-ria, um gene, uma proteína; 4- o conhecimen-to de que os cromossomos estão constituídos de DNA e proteínas; 5- uma série de outras descobertas reveladas por experimentos reali-zados a partir dos anos 1920, os quais serão descritos no item 2.

Saiba MaiS

Ácido desoxirribonucléico: ver DNA.

DNA: ácido desoxirribonucléico molécula de desoxir-ribonucleotídeos, enrolada em dupla hélice, respon-sável pela informação genética.

Genes: segmento de DNA, que produz um RNA ou cadeia polipeptídica e inclui regiões que antecedem e seguem a região codificadora, representada pelos éxons..

Mutação: geralmente associada à alteração em um único gene (mutação de ponto ou gênica), embora possa designar, em um sentido mais amplo, alteração nos cromossomos, no genoma ou no organismo; al-teração nas células somáticas ou germinativas.

A replicação do DNA continua sendo um tema interessante, apesar de já terem passado mais de 50 anos da descoberta da dupla hélice. Atualmente há um grande interesse no estudo da maquinaria protéica, o replissomo, respon-sável pela ação coordenada de um complexo de proteínas, que se associam e atuam de for-ma coordenada, para que a replicação do DNA seja rápida e precisa.

obJetiVo Geral

Compreender os conceitos fundamentais em genética molecular, com ênfase na descrição dos principais processos moleculares, na orga-nização e função dos genes, na organização molecular em vírus e bactérias, nos métodos moleculares e suas aplicações.

obJetiVoS eSPecÍFicoS • Reconhecer os principais experimentos

que identificaram o DNA como material genético

• DescreveraestruturadoDNA

• Compreenderomecanismode replicaçãodo DNA

• Comparara replicaçãoemprocarionteseeucariontes.

1. de Que SÃo FeitoS oS GeneS?

1.1 exPeriMentoS Que coMProVaM Que o dna é o Material Genético

Para responder a pergunta “De que são feitos os genes?”, os pesquisadores precisaram des-crever a natureza química do material genéti-co. Um caminho promissor foi o de investigar as substâncias bioquímicas presentes nos cro-mossomos, pois já se sabia que os cromosso-mos continham genes. Em meados de 1920, vários experimentos foram realizados, até que fossem conhecidos os componentes biológi-cos do cromossomo: ácidos nucléicos (DNA e RNA) e proteína. A partir dessa descoberta, outras perguntas precisavam ser respondidas, dentre elas, qual desses componentes biológi-cos teria maior variabilidade, sendo, portanto, capaz de variar de uma forma simples a uma forma complexa, o que implicaria capacidade de variação de estruturas químicas. A falta de conhecimento sobre a estrutura da molécula de DNA fez com que os biólogos concluíssem equivocadamente que o material genético era a proteína.

No final da década de 1930, tornou-se cres-cente a necessidade de se ter uma prova expe-rimental do material genético, pois, nessa épo-ca, já havia evidências de que o DNA do mesmo modo que a proteína poderia formar longos polímeros e apresentar diferentes formas. Dois experimentos foram cruciais para a identifi-cação do material genético: a descoberta da transformação bacteriana e a caracterização química do material genético em bacteriófagos.

Saiba MaiS

Bacteriófagos: vírus cujo hospedeiro é uma bactéria.

1.1.1 PRINCÍPIO TRANSFORMANTE

Frederick Griffith, em 1928, descobriu um tipo de recombinação em Streptococcus pneumo-

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11niae (pneumococos), responsável pela transfor-mação bacteriana. Como os demais organis-mos, esta bactéria exibe variabilidade genética que pode ser observada através de fenótipos diferentes (tipo = I e II; aspecto = rugoso (R) e liso (L); tamanho = grande e pequeno; cápsula = ausente e presente; virulência = avirulenta e virulenta). Os caracteres informativos obser-vados por Griffith foram: a presença ou ausên-cia de uma cápsula de polissacarídeo, a qual pode ser de vários tipos antigênicos (tipo I, II, III, etc), e o tipo de cápsula.

O cultivo de pneumococos em meio de ágar e sangue, em placas de Petri permitiu que fos-sem observadas colônias virulentas, grandes e lisas denominadas de tipo S bem como colô-nias avirulentas, pequenas, rugosas, denomi-nadas de tipo R (Figura 1).

Figura 1- Aspecto das colônias de duas linhagens de Strep-tococcus penumoniae. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

vivo: o camundongo morreu, e as bactérias IIIS foram recapturadas.

O resultado obtido na etapa número 4 foi inesperado, pois, ao invés de o camundongo permanecer saudável, morreu, indicando que algum componente do tipo IIIS morto (princí-pio transformante) tinha transformado o tipo IIR em tipo IIIS.

Figura 2- Experimento de Griffith: transformação em Streptococcus penumoniae. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Funda-mentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.A grande descoberta de Griffith se deu a partir

do experimento em que amostras de diferen-tes combinações de caracteres de pneumo-cocos (tipo IIIS, tipo IIR, virulenta, avirulenta, viva, morta) foram injetadas em camundon-gos, ocasionando ou não a morte dos animais e posteriormente recapturadas das bactérias a partir destes. A Figura 2 ilustra as etapas que compõem este experimento. Podemos resumi--las da seguinte forma:

1. amostra tipo IIIS viva injetada em camun-dongo vivo: o camundongo morreu, e as bactérias IIIS foram recapturadas;

2. amostra tipo IIIS morta por aquecimento injetada em camundongo vivo: o camun-dongo permaneceu vivo;

3. amostra tipo IIR viva injetada em camundon-go vivo: o camundongo permaneceu vivo;

4. amostra tipo IIIS morta por aquecimento mais tipo IIR viva injetada em camundongo

1.1.2 PROVA QUE O DNA MEDEIA A TRANSFORMAÇÃO

A prova de que o DNA medeia a transformação foi obtida por Oswald Avery e colaboradores em 1944. Estes pesquisadores selecionaram uma amostra de células S mortas por aque-cimento, contendo o princípio transformante, a qual teve os seus componentes individuais submetidos à degradação através de enzimas específicas, capazes de degradar DNA, RNA ou proteínas. A amostra inicial de células IIIS foi subdivida em três amostras, as quais foram degradadas separadamente, por desoxirribu-cuclease (DNAse), que degrada DNA; ribunu-clease (RNAse), que degrada RNA; e protease, que degrada proteína. Dos três tratamentos apenas, aquele que utilizou DNAse apresen-

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12tou efeito sobre a atividade transformante, mostrando, portanto, que a informação genética em pneumococos está presente no DNA. (Figura 3)

1.1.3 OS GENES DE BACTERIÓFAGOS SÃO FEITOS DE DNA

Em 1952 Hershey e Chase mostraram que o material genético do bacteriófago ou fago T2 estava presente no DNA e não, na proteína. Estes pesquisadores levaram em consideração o fato de esse vírus ser composto por 50% de DNA e 50% de proteína bem como a informação de que o DNA contém fósforo, mas não, enxofre, e que a proteína contém enxofre e nenhum fósforo. Daí por diante, eles precisaram apenas marcar o DNA do fago com isótipo radioativo do fósforo 32P, ao invés do fósforo normal 31P. Do mesmo modo, marcaram a cápsula de proteína com o enxofre 35S, ao invés do enxofre normal 32S. Os fagos marcados com 35S foram misturados a uma cultura de E. coli por alguns minutos, as células infectadas foram submetidas a um liquidificador, e depois transferidas para tubos de ensaio onde se pôde observar que a maior parte da radioatividade poderia ser retirada das células, sem afetar a prole. Quando foram usados fagos marcados com 32P, verificou-se que a radioatividade estava, predominantemente, dentro da célula. A cultura foi centrifugada; as bactérias, contendo o DNA do fago, foram coletadas na parte inferior do tubo, enquanto as partículas vazias dos fagos ficaram em suspensão.(Figura 4)

Figura 3- O DNA como princípio transformante. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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Os experimentos apresentados até o momento não deixaram dúvidas quanto à natureza do material genético em procariontes. Contudo, os pesquisadores continuaram insatisfeitos, pois não sabiam se seria possível extrapolar essas evidências para organismos superio-res. Essas dúvidas foram elucidadas a partir da descrição da dupla hélice de DNA, a qual apresentou uma estrutura compatível com as necessidades do material genético.

2. a eStrutura do dna

2.1 natureZa QuÍMica

O DNA ou ácido desoxirribonucléico é um polí-mero ou molécula de cadeia longa, que possui várias unidades individuais denominadas de monômeros, unidas em série. Os monômeros, também chamados de nucleotídeos, são con-siderados as unidades básicas da molécula de DNA, além de serem observados, compondo os ácidos nucléicos; também desempenham diferentes papéis na célula. O nucleotídeo está composto por três componentes: 1- um açú-car; 2- uma base nitrogenada e 3- um ácido fosfórico. (Figura 5a)

Figura 4 – Experimento de Hershey e Chase. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Figura 5- Componentes estruturais dos ácidos nucléicos.

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14Saiba MaiS

Nucleotídeo: molécula constituída de um grupamen-to fosfato, uma pentose (desoxirribose, no DNA ou ribose, no RNA) e uma base nitrogenada (púrica, com dois anéis ou pirimídica, com um anel), responsável pela formação dos ácidos nucléicos. Compare com o nucleosídeo.

1. O açúcar do nucleotídeo é uma pentose denominada 2’- desoxirribose, cuja forma é de cadeia linear ou estrutura de Fischer (Figura 5b). A denominação 2’- desoxirri-bose indica que a estrutura da ribose foi modificada a partir da substituição do gru-pamento hidroxila (-OH) unido ao átomo do carbono 2’ por um hidrogênio (-H). Os carbonos são sempre numerados da mes-ma forma 1’, 2’, 3’, 4’, 5’ e 6’, os quais são chamados de um linha, dois linha e assim por diante. A numeração dos carbonos é importante, pois ela indica à qual posição do carbono outros componentes do nucle-otídeo estão ligados.

2. As bases nitrogenadas são estruturas sim-

ples, ligadas ao carbono 1’ do açúcar e que se apresentam em forma de anel simples ou duplo. As bases adenina e guanina são denominadas purinas e são de anel duplo, enquanto as bases timina e citosina são de anel simples e são chamadas de pirimidi-nas. (Figura 5c)

3. O ácido fosfórico, ao ser adicionado a uma molécula que contém apenas um açúcar ligado a uma base, a qual é denominada nucleosídeo, provoca a conversão dessa molécula em um nucleotídeo, através da ligação do ácido fosfórico ao carbono 5’ do açúcar. (Figura 5d)

Os nucleotídeos que se polimerizam na forma-ção do DNA são de quatro tipos diferentes: 2’ desoxiadenosina 5’ trifosfato (dATP); 2’desoxi-guanosina 5’ trifosfato (dGTP); 2’desoxicitidina 5’ trifosfato (dCTP); 2’desoxitimidina 5’ trifos-fato (TTP), os quais podem também ser cha-mados de A, G, C e T, respectivamente.

Saiba MaiS

Bases nitrogenadas: compostos nitrogenados que são incorporados aos nucleosídeos ou nucleotídeos. São classificadas em púrica, com dois anéis (como

exemplo, adenina e guanina) ou pirimídica, com um anel e (como exemplo, citosina, timina, uracila).

Nucleosídeo: molécula constituída de uma pentose (desoxirribose, no DNA ou ribose, no RNA) e uma base nitrogenada (púrica, com dois anéis ou pirimí-dica, com um anel). Compare com o nucleotídeos.

Para que haja a formação de polinucleotídeos, é necessário que os nucleotídeos se unam atra-vés de grupamentos fosfato. A ligação de mo-nômeros de nucleotídeos se dá a partir da união do grupamento -fosfato acoplado ao carbono 5’ de um dos nucleotídeos ao carbono 3’ do próximo nucleotídeo na cadeia. A ligação que ocorre entre os nucleotídeos se chama ligação fosfodiéster, a qual também é conhecida como 3’-5’ fosfodiéster, e indica quais os átomos de carbono no açúcar que participam da ligação. É importante destacar que o polinucleotídeo possui duas terminações diferentes. Em uma das extremidades, observamos um nucleotídeo cujo grupamento trifosfato ligado ao carbono 5’ não participa da ligação fosfodiéster. Esta terminação é chamada 5’-P terminal. Na outra extremidade, o grupamento 3’-hidroxila não reage e é denominada 3’-OH terminal. Na Fi-gura 6, podemos observar a estrutura de um pequeno polinucleotídeo, permitindo a me-lhor compre-ensão de sua organização química, a qual permite a ocorrên-cia de duas terminações distintas que fazem com que os poli-nucleotídeos possuam um sentido que pode ser 5’-3’ ou 3’-5’.

Figura 6 - Formação de cadeia polinucle-otídica. Fonte: genomasur.com/lecturas/Guia02-2.htm

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15Um outro tipo de ácido nucléico encontrado em células vivas é o RNA ou ácido ribonucléico, que, do mesmo modo que o DNA, também é um polinucleotídeo e possui um importante papel na Genética Molecular. Apesar das gran-des semelhanças entre DNA e RNA, podemos destacar importantes diferenças: 1- o açúcar no RNA é a ribose; 2- o RNA contém uracil ao invés de timina; 3- o RNA, em geral, se apre-senta como polinucleotídeo único; 4- os nu-cleotídeos que se polimerizam para formar o RNA são: adenosina 5’ trifosfato, guanosina 5’ trifosfato, citidina 5’ trifosfato e uridina 5’ trifosfato.

SAIBA MAIS

Ácido ribonucléico: ver RNA.

RNA: ácido ribonucléico - molécula sintetizada na maioria dos organismos, a partir de um molde de DNA.

2.2 duPla Hélice e ForMaS alternatiVaS

A dupla hélice de DNA foi descrita em 1953, por James Watson e Francis Crick (Figura 7), tendo sido uma das mais importantes des-cobertas da Biologia, em particular, da Ge-nética Molecular. Para compreender melhor como estes pesquisadores chegaram ao mo-delo da estrutura da molécula de DNA, é im-portante conhecer os experimentos realiza-dos por Erwin Chargaff e Rosalind Franklin. O trabalho realizado por Chargaff e colabo-radores usou técnicas sensíveis de cromato-grafia para quantificar as quatro bases ni-trogenadas presentes no DNA de amostras de diferentes organismos. Os dados obtidos permitiram observar que o número de ade-ninas é igual ao de timinas e que o núme-ro de citosinas é igual ao de guaninas, ou seja, A=T e C=G. Já o experimento realizado por Rosalind, em 1952, permitiu, através da análise de difração de raios X, técnica pre-viamente desenvolvida por Maurice Wilkins, mostrar que o DNA é uma hélice com duas periodicidades regulares de 3,4 Å e 34 Å ao longo do eixo da molécula.

Figura 7 – James Watson (esquerda) e Francis Crick (direita). Fonte: www.hps.cam.ac.uk/medicine/studying.html

Considerando as informações disponíveis sobre a estrutura e a função da molécula de DNA até o momento, Watson e Crick analisaram várias possibilidades e verifica-ram que, apenas, o modelo da dupla hélice correspondia às sete características consi-deradas por eles, como sendo prováveis e relevantes para descrever um modelo de molécula estável: 1- a dupla hélice contém dois polinucleotídeos, o que foi observado a partir da análise da densidade do DNA; 2- as bases nitrogenadas estão arranjadas no interior da hélice, e o arcabouço de açú-car fosfato, na parte externa da molécula; 3- Pontes de hidrogênio unem as bases ni-trogenadas dos dois polinucleotídeos (duas pontes entre A e T, e três pontes entre G e C). Esta característica é considerada muito importante, pois mostra a complementari-dade de bases; 4- a dupla hélice executa um giro a cada 10 pares de bases; 5- os dois po-linucleotídeos da dupla hélice têm sentidos opostos (5’-3’e 3’-5’), e essa característica é fundamental para replicação, transcrição e recombinação; 6- a dupla hélice apresenta dois sulcos diferentes; 7- a dupla hélice é dextrógira. (Figura 8)

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A dupla hélice descrita por Watson e Crick é denominada de forma B com 10pb por giro da hélice e diâmetro de 19 Å, porém existem outras formas, como, por exemplo, a forma A, que é uma dupla hélice mais compacta e possui 11pb por giro da hélice e diâmetro de 23 Å, e a forma Z, que apresenta a particula-ridade de girar para esquerda (levógira), dife-rindo, portanto, do observado nas formas B e A (dextrógiras), as quais giram para a direita. Existem ainda estruturas helicoidais adicionais, as formas C, D e E, as quais são produzidas sob condições de laboratório.

Desafio da FIX: constru-am o modelo tridimen-sional do DNA através da técnica do origa-mi. Para isso, acessem: www.sbg.org.br/Ge-neticaEscola2/web/vol-2Num1.htm - Estrutura do DNA em origami, possibilidades didáticas.

2.3 tiPoS de SeQuÊnciaS de dna

Os genomas de procariontes estão constituí-dos predominantemente de sequências únicas de pares de bases, o que indica que a maioria dos genes está presente no genoma, apenas, uma vez.

Estudos realizados através de análises mate-máticas da cinética de renaturação dos DNAs eucarióticos tem permitido observar diferentes tipos de DNA. Três classes principais foram des-critas para eucariontes: 1- DNA de sequência única, uma a dez cópias por genoma; 2- DNA de sequência moderadamente repetitiva, 10 a 105 cópias por genoma; 3- DNA de sequência altamente repetitiva, mais de 105 cópias por genoma. A quantidade de qualquer um dos três tipos de sequências no genoma varia de espécie para espécie. Entretanto, sabe-se que as sequências únicas constituem cerca de 40 a 70% do genoma da maior parte dos animais e plantas. Já as sequências moderadamente repetitivas são consideradas bastante hetero-gêneas, e as sequências altamente repetitivas são compostas por DNA satélite e não, satélite.

Saiba MaiS

Genoma: conjunto completo de DNA de uma célula ou organismo.

DNA satélite: porção do DNA altamente repetitivo, que apresenta densidade de sedimentação específi-ca. Não confundir com o satélite dos cromossomos acrocêntricos.

Replicação: duplicação do material genético a partir de moléculas originais de DNA.

Figura 8- Propriedades da molécula de DNA: complementaridade e polaridade inversa. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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3. de Que Modo o dna e oS croMoSSoMoS SÃo rePlicadoS?

3.1 rePlicaÇÃo SeMiconSerVatiVa

Durante a multiplicação celular, é preciso que a molécula de DNA seja duplicada ou replicada, para que as células filhas recebam a informa-ção genética presente na célula mãe. Descre-veremos, a partir de agora, como uma dupla hélice de DNA pode originar duas moléculas filhas; o mecanismo de replicação; as enzi-mas envolvidas no processo de replicação e as principais diferenças, quando comparamos a replicação em eucariontes e procariontes. A característica de complementaridade das ba-ses nitrogenadas na estrutura da molécula de DNA possibilita que ela apresente um poten-cial natural para replicação, pois cada um dos seus filamentos pode ser usado como molde para síntese de um filamento complementar. Contudo, a maneira como se dá o processo de replicação não é tão óbvio assim, o que levou à proposição de várias estratégias. Dentre elas, as mais aceitas foram: 1- replicação semicon-servativa, na qual cada molécula-filha possui um filamento parental e outro recém sinteti-zado; 2- replicação conservativa, na qual uma das moléculas-filhas possui dois filamentos de origem parental, e a outra possui dois filamen-tos recém-sintetizados; 3- replicação dispersiva consiste na produção de moléculas-filhas com filamentos parcialmente de origem parental e recém-sintetizado. (Figura 9)

Um dos experimentos mais interessantes den-tro da Biologia foi o de Meselson-Stahl (1958), no qual foram usados isótipos de nitrogênio, tanto na forma normal 14N quanto o 15N, considerado nitrogênio pesado, que permitiu distinguir, dentre as três propostas de repli-cação, qual delas é realmente funcional. O experimento consistiu no cultivo de células de E. coli por várias gerações, em um meio com o nitrogênio pesado 15N, o qual foi substituído pelo 14N. Após o crescimento celular em um meio com 14N, o DNA foi extraído e analisado em gradientes de transferência de densidade de cloreto de césio (CsCl). Os resultados mos-traram-se coerentes com a replicação semicon-servativa e poderão ser observados com mais detalhes na Figura 10.

Figura 9- Modelos de replicação do DNA: semiconservativo, conser-vativo e dispersivo. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Funda-mentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Figura 10 – Experimento de Meselson e Stahl demonstrando a replica-ção semiconservativa. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fun-damentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

3.1.1 FORQUILHAS E ORIGENS DE REPLICAÇÃO

O estudo da replicação em procariontes teve início com o trabalho de Jonh Cairns em 1963, no qual foram cultivadas células de E. coli em meio, contendo [3H] timidina em tempos va-riados: as células foram lisadas com cuidado, e os cromossomos, removidos em membra-nas de filtragem, sendo afixados em lâminas e guardadas no escuro para posterior análise. As auto-radiografias mostraram que os cromos-somos de E. coli são circulares durante a re-plicação e que os dois filamentos da molécula parental se deselicoidizam e sofrem replicação semiconservativa simultaneamente. Cairns su-geriu que a replicação ocorre a partir de um ponto de origem e que prossegue unidirecio-nalmente, em torno do círculo. Experimentos

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18subseqüentes constataram que a replicação em E. coli, como em outros organismos que possuem cromossomos lineares, é bidirecional e que cada estrutura em forma de Y consiste em uma forqui-lha de replicação, e as duas forquilhas de replicação são movidas em sentidos opostos, até percor-rer todo o cromossomo circular (Figura 11). Entretanto, a replicação bidirecional não é universal, como observado no colifago P2, que apresenta replicação unidirecional.

A origem de replicação, também chamada replicon, é única em cromossomos de proca-riontes, enquanto que, em eucariontes, são múltiplas; em ambos os casos, ocorrem em sítios ou sequências específicas denominadas de sequências de replicação autônoma (ARS). É esperado que ocorram múltiplas origens de replicação em eucariontes, visto que é neces-sário que a replicação da molécula de DNA, presente em cada cromossomo, seja replicada ordenadamente.

3.2 aParato enZiMÁtico

Para que uma molécula de DNA seja replica-da, é necessário que ocorra a desilecoidização dos dois filamentos parentais, despareamento de bases na origem de replicação bem como a progressão desse despareamento ao longo da molécula em ambas as direções, formando as forquilhas de replicação. Além desses,passos iniciais, é necessário que haja a síntese de poli-nucleotídeos na medida em que os filamentos da molécula se separam. Para que tudo isso ocorra, é necessária a ação de várias enzimas, as quais constituem um aparato complexo en-zimático, no qual cada uma delas terá sua im-portância e efetiva participação. Dentre elas, destacamos:

1. DNA helicase, responsável pelo mecanismo de desilecoidização da molécula de DNA através do uso de energia derivada do ATP;

2. SSB são proteínas de ligação ao DNA unifila-mentar, impedindo que o filamento sofra re-naturação ou forme estruturas em grampo;

3. DNA topoisomerase, enzimas que catali-sam quebras transitórias e adicionam ou removem superélices na molécula de DNA.

4. DNA primase, sintetiza um primer de RNA,

o qual fornece a extremidade 3’OH, neces-sária para a ação da DNA polimerase;

5. DNA polimerase, enzima capaz de sinte-

tizar um novo polinucleotídeo a partir da adição de desoxiribonucleotídeos no sen-tido 5’-3’ (atividade polimerásica), corres-pondentes aos pares de bases complemen-tares, presentes no filamento molde. Para manter-se ativa, a polimerase requer o 5’ trifosfato de cada um dos quatro desoxir-ribonuclesídeos, íons de Mg+ e DNA pré--existente. Existem, em procariontes, três tipos de DNA polimerase: a DNA polime-rase I, que apresenta as funções de repa-ro, replicação e excisão do primer; a DNA polimerase II, cuja função é de reparo e a DNA polimerase III, denominada também de replicase, por ser a principal enzima de replicação em E. coli. Todas as polimera-ses precisam de uma ponta 3’OH e de um molde de DNA apropriado. A atividade exonucleásica no sentido 3’-5’ das DNAs polimerases revisa os filamentos recém- sintetizados. (Figura 12)

Saiba MaiSPrimer: pequena sequência de RNA sintetizada pela primase e adicionada a um molde de DNA para início da síntese de DNA.

Exonucleásica: ver exonuclease.

Exonuclease: enzima que cliva o DNA e/ou RNA a par-tir de uma extremidade; atua no reparo do DNA.

Figura 11- Replicação bidirecional em procariontes. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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6. DNA ligase, enzima que catalisa o fecha-mento covalente de cortes nas moléculas de DNA, através da energia de nicotidami-na adenina dinucleotídeo (NAD) ou adeno-sina trifosfato (ATP);

Além das enzimas relacionadas acima, outros tipos de enzimas participam da replicação como, por exemplo, as proteínas DNA A, DNA B, DNA C, DNA T, DNA J, DNA K, Pri A, Pri B, Pri C e HU, todas participantes do processo de iniciação da replicação e da formação das for-quilhas bidirecionais.

3.3 coMPlexo MecaniSMo de rePlicaÇÃo

Estudos de auto-radiografia e microscopia eletrônica revelaram que a síntese dos dois filamentos-filhos se dá na mesma direção, em ambas as forquilhas de replicação. Conside-rando que os filamentos da molécula de DNA

são complementares e que apresentam pola-ridade oposta, a polimerização deve ocorrer na extremidade 5’ de um filamento (amplia-ção 3’-5’) e na extremidade 3’ do outro fila-mento (ampliação 5’-3’). Sabendo ainda que todas as DNAs polimerases precisam de uma extremidade 3’OH livre, para realizar a síntese do polinucleotídeo (sentido 5’-3’), é possível perceber que estamos diante de um paradoxo, o qual só foi resolvido a partir da descoberta de que a síntese de um filamento de DNA é contínua (sentido 5’-3’), enquanto a do outro é descontínua (sentido 3’–5’), ou seja, apesar dos filamentos de DNA estarem sendo ampli-ficados em sentido físicos opostos, eles estão sendo ampliados no sentido químico 5’- 3’. A síntese do filamento descontínuo se dá através da síntese de fragmentos curtos (sentido 5’-3’), os quais foram denominados fragmentos de Okasaki em homenagem ao pesquisador, que os descobriu na década de 1960. Como a síntese do filamento descontínuo gera vários

Figura 12- Atividades da DNA polimerase I de E. coli. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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20fragmentos de DNA, estes são considerados como um produto intermediário no processo de replicação e são posteriormente ligados co-valentemente, a partir da ação da DNA ligase. Essa enzima não tem ação sobre o preenchi-mento de lacunas ou gaps oriundos do proces-so de replicação. Estes espaços são fechados pela ação de uma DNA polimerase. (Figura 13)

Saiba MaiS

Polimerização: união química de duas ou mais molé-culas do mesmo tipo, para formar um novo compos-to, tendo os mesmos elementos em iguais propor-ções. Possui peso molecular mais alto e propriedades físicas diferentes.

Os filamentos da molécula parental continuam se separando. Para tal, é necessário que a mo-lécula sofra um mecanismo de deselicoidiza-ção, o qual será catalizado pelas enzimas DNA helicases, as quais, através de energia derivada de ATP, são capazes de desenrolar a molécula de DNA. Além das diferentes helica-ses, cuja ação também promove a quebra das pontes de hidrogênio e, portanto, separação das bases, é necessário que as proteínas SSB se liguem cooperativamente ao DNA unifilamen-tar, evitando, dessa forma, a renaturação do filamento de DNA ou a formação de estruturas secundárias. É importante também destacar que a deselicoidização da molécula promove a formação de um eixo de rotação, que im-pede que o DNA permaneça superelicoidizado positivamente, diante da forquilha de replica-ção. As enzimas DNA topoisomerases são as responsáveis pelo eixo de rotação necessário à replicação de moléculas circulares e compre-endem dois tipos: As topoisomerases são de dois tipos: topoisomerase I e topoisomerase II. Ambas produzem quebras transitórias nas moléculas, as quais são mantidas por ligações covalentes, contudo diferem quanto à capaci-dade de gerar quebras unifilamentares e bifila-mentares, respectivamente.

Assim que o aparato de replicação é for-mado, a replicação é iniciada pela ação da DNA primase, enzi-ma responsável pela síntese de um primer de RNA, o qual apre-senta à DNA polime-rase uma extremidade 3’OH livre. Os dois fi-lamentos necessitam do primer, embora o filamento descon-tínuo precise de vá-rios primers, um para cada fragmento de Okasaki. A replicação no filamento descon-tínuo é iniciada por um complexo pro-téico, formado pela DNA primase e DNA

Figura13- Síntese semidescontínua. Observe os fragmentos de Okasaki.

Figura 14- Replicação em E. coli: síntese contínua (filamento 3’-5’) e descontínua (filamento 5’-3’). Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Considerando as informações que temos até o momento, podemos, então, descrever sucinta-mente todas as etapas do processo de replica-ção. (Figura 14) Inicialmente, devemos recor-dar que estamos estudando a re-plicação semicon-servativa, adotan-do como exemplo a replicação em E. coli, a qual se inicia a partir do reconhec imen-to da origem de replicação deno-minado OriC. O reconhec imen-to da sequência presente em OriC por um conjun-to de proteínas pré-iniciais é res-ponsável pela separação dos filamentos espe-cificamente no ponto de origem.

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21na várias unidades teloméricas repetidas, que servirão de molde para que a DNA polimerase complete a síntese do filamento complementar.

Para melhor compreensão da replicação aces-sem o aplicativo GBOL material genético http://www.ufv.br/dgb/gbol/htm/gbol23.htm. Nele vocês poderão, de forma dinâmica, percorrer todos os passos de mecanismo de replicação.

Desafio da FIX: Vocês podem tentar reavaliar os principais conceitos da Genética mendelia-na e da Genética mole-cular através da elabo-ração de um mapa de conceito. Para tal, aces-sem www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/vol1Num2htm - Men-del enrolado na dupla hélice.

reViSando conHeciMentoS

1. Os avanços e a importância da genética molecular são evidentes em diversas áre-as, tais como na medicina e na agricultura. Para melhor compreendê-los, é fundamen-tal ter conhecimentos sobre a estrutura bá-sica da molécula do DNA. Para tanto, es-quematize a unidade básica da molécula, mostrando (identificando) o grupamento fosfato, o açúcar e a base nitrogenada.

2. Com base no segmento de DNA represen-tado abaixo, responda as alternativas.

5...GGGATCCTGCCCAAAATC...3

a) Quantos desoxirribonucleotídeos consti-tuem esta molécula?b) Quantas ligações duplas e triplas de pontes de hidrogênio estãopresentes no segmento complementar?c) Represente a cadeia complementar deste segmento.

3. Você aprendeu que a replica-

helicase, denominado primossomo. O primos-somo é ativado pela energia do ATP e move-se pelo filamento. A DNA polimerase III sinteti-za os filamentos-filhos. No caso do filamento descontínuo, após a síntese dos fragmentos de Okasaki, os primers são retirados, e a DNA po-limerase I preenche os gaps através da síntese de DNA. Logo em seguida, os fragmentos são unidos pela DNA ligase. A DNA polimerase II atua na correção de possíveis erros durante a síntese dos filamentos-filhos. Imediatamente após a replicação de um segmento de DNA, este é superelicoidizado negativamente pela topoisomerase girase, sendo posteriormente dobrado e condensado no genoma. Todas as enzimas citadas acima atuam de forma coor-denada, em cada forquilha de replicação. O aparato completo, que se move na forquilha de replicação, é chamado de replissomo.

Saiba MaiS

Renaturação: conversão do DNA do estado de fita única para o de fita dupla, após desnaturação.

Primossomo: um complexo de replicação, que con-tém atividades de DNA primase e DNA helicase.

3.4 rePlicaÇÃo eM eucarionteS

A maior parte dos experimentos de replica-ção foi realizada em procariontes, contudo as informações disponíveis são suficientes para considerarmos que a maioria dos aspectos do processo de eplicação é similar em proca-riontes e eucariontes. Algumas diferenças me-recem ser destacadas. São elas: 1- os primers de RNA e os fragmentos de Okasaki são mais curtos em eucariontes; 2- a síntese de DNA em eucariontes ocorre numa etapa específica do ciclo celular; 3- os eucariontes possuem múl-tiplas origens de replicação; 4- os eucarion-tes possuem cinco tipos de DNA polimerase α (alfa),β (beta),γ (gama),δ (delta),ε (epsilon), sendo a γ especifica para as mitocôndrias; 5- para cada forquilha de replicação, os eucarion-tes usam duas DNAs polimerases diferentes (α para a descontínua e δ para a contínua); 6- a molécula de DNA linear em eucariontes difi-culta a replicação das extremidades da molé-cula no filamento descontínuo. Esse problema é contornado pela enzima telomerase, a qual possui um molde de RNA, cuja ação adicio-

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22ção do DNA envolve um complexo de enzimas com papéis específicos que visa à ma-nutenção da integridade genética nas moléculas-filhas. A seguir, citamos algu-mas dessas enzimas, e você deverá relacioná-las com as funções correspondentes.

1- DNA polimerase III2- Helicase3- Proteínas SSB4- DNA ligase5- Primase

( ) Religa o arcabouço de DNA, catalisando as ligações fosfodiéster.( ) Sintetiza o iniciador do processo da replicação.( ) Adiciona nucleotídeos às novas cadeias.( ) Responsável pelas quebras das pontes de hidrogênio.( ) Ligam-se ao DNA unifilamentar, impedindo a reconstituição da dupla hélice.

4. Sabemos que as descobertas científicas resultam de pesquisas realizadas com muito rigor e dedicação, muitas das quais levam anos para serem concluídas. É importante e necessário conhecermos os trabalhos de tantos cientistas que fizeram e fazem com que a ciência se desenvolva e traga benefícios para o nosso planeta. A seguir, relacionamos algumas etapas de experimentos ou deduções que favoreceram o crescimento na área da biologia molecular.

1. As cepas de Bactérias tipo IIR foram transformadas em tipo IS. O princípio transformante é o material genético.

( ) Watson e Crick

2. A digestão do DNA com desoxirribonuclease destruiu total-mente a capacidade transformadora. O princípio transforman-te é o DNA.

( ) Maurice Wilkins e Rosalind Franklin

3. Amostras de DNA e proteínas foram marcadas respectivamente, com os radioisótopos 32P e 35S. Mais de 80% do 32P estavam presentes no pellet da bactéria. O material genético é o DNA.

( ) Frederick Griffith

4. Deduziram que o DNA existe na forma de dupla hélice. ( ) Avery, MacLeod e McCarty

5. A análise por difração de raios X indica que o DNA é uma mo-lécula helicoidal.

( ) Alfred Hershey e Marta Chase

Identifique os principais autores envolvi-dos.

reFerÊnciaLEITURA FUNDAMENTAL

SNUSTAD, D. P. e SIMMONS M. J. Fundamen-tos de Genética: Guanabara Koogan S/A, 2000.

LEITURA COMPLEMENTAR

GRIFFITHS, A. J. F.; WESSLER, S. R.; LEWONTIN, R. C.;GELBART, W. M.; SUZUKI, D. T.e MILLER, J. H. Introdução à Genética: Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan S/A, 2006.

SITES

http://www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/vol2Num1.htm

http://www.ufv.br/dgb/gbol/htm/gbol23.htm

http://www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/vol1Num2htm-

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exPreSSÃo GÊnica, MutaÇÃo e reParo do dna

introduÇÃo

Iniciaremos nosso estudo conceituando genes, descrevendo seus modos de orga-nização e de expressão, ou seja, como os genes expressam sua informação biológica e a disponibilizam à célula. Veremos, ain-da, as possíveis alterações que ocorrem na sequência de nucleotídeos da molécula de DNA e as diferentes formas de correção ou reparo.

Neste capítulo, estudaremos os genes, não mais considerando a sua composição, mas, a sua estrutura e a sua forma de transmis-são da informação biológica. No que diz respeito à transmissão das informações, estudaremos os processos que compõem a expressão gênica, a transcrição e a tradução bem como os diferentes tipos de moléculas de RNA e o código genético.

Adicionalmente, abordaremos, ainda, de forma sucinta, os principais agentes res-ponsáveis pela mutação das sequências de nucleotídeos da molécula de DNA, as prin-cipais consequências das mutações e os di-ferentes modos de reparo do DNA.

obJetiVoS eSPecÍFicoS

• Compararoprocessodetranscriçãoemprocariontes e eucariontes;

Profa. Rita de Cássia de Moura Carga Horária I 15HColaboradoras: Profa. Marília de França Rocha Profa. Maria Teresa Marquim Nogueira Cornélio

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24• Descreveroprocessodetradução;

• Distinguirosdiferentestiposdemutação;

• Identificar os mecanismos de reparo damolécula de DNA.

1. tranSMiSSÃo da inForMaÇÃo biolÓGica

1.1 GeneS e inForMaÇÃo biolÓGica

Um gene consiste em um segmento de uma molécula de DNA, com comprimento variável, que transporta a informação biológica. A in-formação está contida no gene, sob a forma de instruções, as quais orientarão a síntese de uma molécula de RNA, que poderá ou não subseqüentemente orientar a síntese de uma molécula de proteína.

A informação biológica de um gene é lida em, apenas, um dos dois polinucleotídeos da du-pla hélice, o qual é chama-do filamento molde (direção 3’5’), que serve de modelo para a síntese de uma molécula complementar de RNA duran-te a transcrição (Figura 1).

A maior parte dos genes está distribuída alea-toriamente e de forma intercalar ao longo da extensão de uma molécula de DNA. Contu-do, em alguns casos, os genes encontram-se agrupados separadamente, organizados em grupos de genes que possuem unidades de informações biológicas correlacionadas. São exemplos de grupos de genes, os operons e as famílias multigênicas. Operons consistem em um grupamento de genes, que codificam uma série de enzimas participantes de uma via bioquímica. Este tipo de grupamento é carac-terístico de bactérias. Por outro lado, em dife-rentes organismos, podemos observar famílias multigênicas, nas quais os genes também se encontram correlacionados, e que, apesar de serem distintos, possuem sequências idênticas. Existem dois tipos de famílias multigênicas:

1. Família multigênica simples, na qual todos os genes são idênticos. A maioria dos or-ganismos superiores possui esse tipo de fa-mília, como, por exemplo, as cópias múlti-plas do gene RNAr 5S (Figura 2a).

2. Família multigênica complexa são grupos de genes similares, embora não idênticos,

como, por exemplo, os genes dos polipep-tídios da globina em vertebrados. A família multigênica da globi-na possui ainda pseu-dogenes (ψ), que são genes muito parecidos com os outros genes da família, embora te-nham perdido sua fun-ção (Figura 2b).

Saiba MaiS

Família multigênica: conjun-to de genes que descendem de um gene ancestral co-mum, que sofreu duplicação e divergência; grupo de ge-nes que codificam produtos homólogos com funções se-melhantes.

Pseudogenes: gene inativo dentro de uma família mul-tigênica.Figura 1- Filamento molde (direção 3’5’) servindo de modelo para a

síntese de uma molécula complementar de RNA durante a transcrição. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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Pesquisa da Fix: Você deve estar se pergun-tando por que um dado organismo preci-sa de repetições de ge-nes? Para compreender melhor este evento, pesquise, em livros e em sites especializa-dos, exemplos de gru-pamentos de genes, com ênfase no papel que desempenham e no seu grau de conservação.

Alguns genes são ditos descontínuos, pois se apresentam divididos em unidades distintas, separadas por segmentos de DNA. As unida-des que contêm a informação biológica são chamadas éxons, e as sequências intermedi-árias, íntrons. Os genes descontínuos podem ser observados em vírus, eubactérias, arqueo-bactérias e organismos superiores.

1.1.1 O DOGMA CENTRAL

Francis Crick, 1958, descreveu o processo hoje conhecido como expressão gênica como sen-do a transferência da informação biológica contida no DNA de um gene para o RNA, e, posteriormente, para proteína. Crick conside-rou ainda que o fluxo de informação é unidire-cional, ou seja, que a proteína não pode orien-tar a síntese de RNA e que o RNA não pode orientar a síntese de DNA. Esta parte do Dog-ma foi questionada a partir de 1970, quando independentemente, Howard Temin e David

Baltimore descobriram que, em alguns vírus, a informação biológica pode ser transferida do RNA para o DNA (Figura 3).

Saiba MaiS

Éxons: segmento de um gene mantido após o pro-cessamento e traduzido nos ribossomos.

Íntrons: segmento de DNA, que se intercala aos éxons, sendo retirado durante o processamento do RNA e, portanto, não traduzido.

Figura 2- Famílias multigênicas. (a) simples – genes RNAr 5S de Droso-phila; (b) complexa – grupos de genes da globina humana.

Figura 3- Fluxo da informação genética: replicação, transcrição e tra-dução ocorrem em todos os organismos; transcrição reversa ocor-re em células infectadas com vírus com RNA. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

2. exPreSSÃo GÊnica

2.1 tranScriÇÃo

A transcrição é o primeiro estágio da expressão gênica, processo através do qual o filamento molde de DNA orienta a síntese de um fila-mento complementar de RNA, denominado transcrito. Como a maioria dos experimentos pioneiros na Genética Molecular, as primeiras descrições do processo de transcrição ocorre-ram em organismos procariontes. Este fato se deve à simplicidade desses organismos em compara-ção aos eucariontes.

Lista da Fix: Para relembrar e compreender melhor, faça uma lista comparativa entre procariontes e euca-

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26riontes, considerando as características básicas e a organização e a estrutura gênica.

A sequência de DNA molde na transcrição será a de DNA não molde do gene (sentido 5’3’), ou seja, a sequência capaz de orientar um transcrito de RNA similar ao filamento de DNA não molde (Figura 4).

Saiba MaiS

Transcrição: processo através do qual as moléculas de RNA são sintetizadas pela RNA polimerase a partir de um molde de DNA.

Expressão gênica: manifestação fenotípica dos genes.

2.1.1 RNA POLIMERASE

A enzima RNA polimerase responsável pela transcrição de todos os genes de E.coli foi des-coberta em 1958. A RNA polimerase é uma grande proteína formada por subunidades po-lipeptídicas diferentes (α2ββ’σ), denominada holoenzima (peso molecular de 480.000 dal-tons), a qual pode se organizar de outra for-ma (α2ββ’), na qual o cerne da enzima (peso molecular de 395.000 daltons) está separado da subunidade σ (sigma). Diferentemente, os organismos eucariontes apresentam RNA po-limerase mais complexas (oito a doze subuni-dades com peso molecular superior a 500.000

daltons), classificadas em três ti-pos diferentes: RNA polimerase I, II e III, que transcrevem genes de RNA ribossomal; RNA mensagei-ro e pequeno nuclear; RNA trans-portador, pequeno nuclear e ri-bossomal 5S, respectivamente. 2.1.2 ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO

A transcrição é dividida em três etapas: início, alongamento e término. Na primeira etapa, ocorre o reconhecimento do sítio de início da transcrição pela RNA polimerase. Este sítio é sinalizado por uma região chamada promo-tor ou sequência promotora, que está localizada anteriormente ao gene. Estas sequências são iguais ou muito similares em diferentes organismos, de modo que estas possam ser reconhecidas pela

RNA polimerase, o que faz com que sejam co-nhecidas também como sequências concenso. Em E. coli, a sequência promotora foi descri-ta como sendo composta por duas unidades diferentes, uma denominada boxe -35 (5’-TT-GACA-3’) e a outra, boxe -10 (5’-TATAAT-3’), ambas recebendo a denominação de boxes -35 e -10 devido a sua localização na molécula de DNA, em relação ao início da transcrição (Figura 5).

Saiba MaiS

Promotor: sequência de DNA localizada na extremi-dade 5’ de um gene e reconhecida pela RNA polime-rase, para dar início à transcrição.

Para que uma molécula de RNA seja sintetiza-da, é necessário que ocorra a polimerização de subunidades de ribonucleotídeos, a qual pode ser resumida como: n(NTP) →RNA com n nucleotídeos de comprimento + n - 1(PPi); nesta reação, o grupo 3’-OH de um ribonucle-otídeo reage com o grupo 5’-P do segundo, formando uma ligação fosfodiéster. Isto impli-ca a subseqüente perda de uma molécula de pirofosfato (PPi) para cada ligação formada. O RNA transcrito é, portanto, sintetizado no sen-tido 5’→3. A enzima que catalisa esta reação chama-se RNA polimerase.

Figura 4- A transcrição usa apenas um filamento molde de DNA. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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Ainda na etapa de início, podemos observar que a subunidade σ da holoenzima RNA poli-merase (α2ββ'σ) em E. coli é responsável pela localização do sítio promotor. Inicialmente é formado pela RNA polimerase e o DNA, um complexo chamado promotor fechado (a en-zima cobre cerca de 60pb desde o boxe -35 ao -10), logo depois no boxe -10, ocorre a quebra do pareamento de bases e a deseli-coidização da molécula de DNA, formando o complexo promotor aberto. Após a formação desse complexo, a subunidade --é liberada e a holoenzima é convertida ao cerne da enzima. Verificamos, ainda, o pareamento dos dois primeiros ribonucleotídeos com o filamen-to molde na posição +1 e +2 e a síntese da primeira ligação fosfodiéster da molécula de RNA (Figura 6).

seu estado. Uma outra característica do alon-gamento refere-se à velocidade da transcrição, a qual é variável. Verificamos, ainda, que o transcrito produzido é maior que o gene, pois uma sequência inicial ou transcrito líder que antecede o gene também sofre transcrição bem como uma região posterior ao gene e an-terior ao término da transcrição.

Figura 5 –Transcrição: início. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Figura 6 – Complexo promotor fechado. http://paginas.terra.com.br/educacao/biolmol/Genetica-Medicina/index.htm

Na etapa de alongamento (Figura 7), a RNA polimerase desenrola a molécula de DNA, na medida em que avança, adicionando ribonu-cleotídeos à extremidade 3’ da molécula de RNA. Apenas uma parte da molécula é aberta durante a transcrição, pois, após a polimeri-zação, o transcrito se dissocia do filamento molde, permitindo que a dupla hélice volte ao

Figura 7- Transcrição: alongamento. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

O término da transcrição consiste na disso-ciação da RNA polimerase e liberação do RNA transcrito. Pode ocorrer de duas formas: 1- Através de palíndromos complementares, que são sequências capazes de se parearem den-tro do filamento de DNA ou de RNA transcri-to, formando haste-alça ou grampo, seguido de uma sequência de cinco a dez adeninas no DNA, a qual se pareia com uma sequência de Uracilas do RNA e posterior rompimento do pareamento com subseqüente liberação do RNA; 2- Proteína dependente de rô é um outro tipo de finalizador da transcrição, que atua na ausência de sequências de As. A proteína cha-mada rô (peso molecular de 276.000 daltons) liga-se à molécula de RNA e a libera após o pareamento intrafilamentar, responsável pela formação de haste-alça ou grampo (Figura 8).

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28Saiba MaiS

Palíndromos: sequência de DNA cuja sequência complementar é a mesma, lida de forma equivalente em ambas as direções.

2.1.3 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIONTES

A transcrição em eucariontes, apesar de ser si-milar ao observado em procariontes, apresen-ta-se mais complexa, em especial, na etapa de início. As três RNAs polimerases (I, II e III) reco-nhecem promotores diferentes, de modo que a transcrição é específica para grupos de ge-nes. A formação do complexo de pré-iniciação se dá pela polimerase e por vários fatores de transcrição, como, por exemplo, TFIID, TFIIA, os quais estão envolvidos no reconhecimento dos promotores pela RNA polimerase. A etapa de ligação da RNA polimerase ao complexo en-volve outros fatores de transcrição.

Saiba MaiS

Fatores de transcrição: proteína que se liga ao DNA para ativar e regular a transcrição gênica.

Dentre eles, podemos destacar o TFIIH, que é uma helicase com atividade de dissociação do DNA, permitindo o início da transcrição. A etapa de término ainda precisa ser melhor es-tudada, sabendo-se que fatores de transcrição

Figura 8- Transcrição: término; liberação do RNA através de haste-alça ou grampo. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

devem se dissociar do complexo no final do gene, levando à sua desintegração.

Aprofunde seu conhecimento, consultando o capítulo 12 do livro: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Edito-ra Guanabara Koogan. Acessem o site: http://www.ufv.br/dgb/gbol

2.2 tiPoS de rna

a) O RNA mensageiro (RNAm) é produzido a partir da informação biológica de uma sequ-ência gênica. Ele é intermediário entre o gene e o produto da tradução e, em geral, não tem vida longa na célula, sendo, portanto, produ-zido sempre que necessário. Este tipo de RNA sofre modificações e processamento antes do processo de tradução em eucariontes, en-quanto em procariontes, ele é cópia direta do gene. As principais modificações consistem em alterações químicas nas duas extremidades da molécula de RNAm, remoção de íntrons, e, em alguns casos, alterações na sequência de nu-cleotídeos do RNAm.

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29Inicialmente, vamos discutir as modificações químicas nas extremidades do RNAm, as extremida-des 5’ são revestidas por uma estrutura complexa m7GpppNpN, onde m7G é o nucleotídeo, que transporta a base modificada 7-metilguanina, e que é adicionado à molécula de RNAm após a transcrição. Na extremidade 3’ da maioria dos RNAsm de eucariontes, é adicionada cerca de 250 nucleotídeos A, formando uma cauda denominada cauda poli (A): ...pNpNpA(pA)npA. Este tipo de modificação é chamado poliadenilação e é produzido pela enzima poli (A) polimerase (Figura 9). Um outro tipo de modificação consiste na remoção de íntrons e reunião de éxons, antes que ocorra a tradução. Este processo, denominado de recomposição (splicing), é considerado com-plexo e ocorre em genes descontínuos (Figura 10).

Saiba MaiS

Poliadenilação: adição de sequência de resíduos de adenina à extremidade 3’ de um pré RNAm (RNA heterogêneo), em eucariotos.

Figura 9- Inserção do 7-metil guanosina e da cauda poli A. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Figura 10- Mecanismo de recomposição (splicing). Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Gua-nabara Koogan.

Pesquisa da Fix: você pode desvendar os mistérios desse proces-so, pesquisando sobre sinais envolvidos na re-moção de íntrons, vias de remoção e diferen-tes tipos de íntrons. Ver bibliografia indicada.

Por último, conversaremos um pouco sobre a edição de RNA, ou seja, a modificação de um RNAm através da inserção de novos nucleo-tídeos ou pela deleção de nucleotídeos. Este tipo de modificação é responsável pela obten-

ção de duas proteínas com funções bioquími-cas diferentes, oriundas da informação bioló-gica de um mesmo gene.

b) O RNA ribossomal (RNAr) é um dos com-ponentes dos ribossomos, que são estruturas complexas com grande atuação no processo de tradução. Nos ribossomos, encontramos uma cópia de cada um dos tipos de RNAr exis-tentes, três RNAsr em ribossomos de proca-riontes e quatro em eucariontes. O transcrito primário do RNAr é chamado pré-RNAr e con-tém os tipos de RNAr (16S, 23S e 5S em pro-cariontes, e 18S, 5,8S e 28S em eucariontes), separados por espaçadores. Os genes de 5S

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30em eucariontes encontram-se separados dos demais genes de RNAr. Tanto para procarion-tes como em eucariontes, existem repetições de unidades de transcrição do RNAr e ocorrem cerca de sete cópias em procariontes e de 50 a 5.000 cópias, em eucariontes (Figura 11).

Saiba MaiS

Inserção: adição de qualquer segmento de DNA; também pode se referir à alteração cromossômica estrutural.

Deleção: perda de qualquer segmento de DNA; também pode se referir à alteração cromossômica estrutural.

Ribossomos: organelas celulares constituídas de RNAr e proteínas; organelas responsáveis pela tradução.

c) O RNA transportador (RNAt) é relativamente pequeno, possuindo cerca de 74 a 96 nucleo-tídeos para diferentes moléculas de distintos organismos. Todas as moléculas de RNAt for-mam uma configuração que se assemelha a um trevo, o qual está constituído dos seguin-tes componentes: braço aceptor, braço D ou DHU, braço anticódon, braço extra ou variável e braço TψC (Figura 12). Veremos, com mais detalhes no item tradução, o papel desempe-nhado pelos braços do RNAt. Em procarion-tes e eucariontes, os RNAt são transcritos em precursores de RNAt, que são processados e, posteriormente, liberados como RNAt madu-ros. Do mesmo modo que o RNAr, o RNAt também possui múltiplas cópias em respos-

Figura 11- RNAs ribossomais (RNAr) e proteínas na formação dos ribossomos. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Figura 12- Configuração em trevo do RNAt. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

ta à demanda celular. Pesquisa da Fix: Existem outros tipos de RNA, como, por exemplo, o pequeno nuclear e o RNA de interferência. Este último descoberto no início dos anos 2000. Aproveite este momen-to, em que sua curiosi-dade está aguçada e pesquise sobre o papel dos RNAs pequeno nuclear e de interferência

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31na célula.2.3 cÓdiGo Genético

A descrição completa do código genético só foi determinada no ano de 1966, quando se elucidou a colinearidade entre o gene e apro-teína e a correspondência entre cada códon do código a uma trinca de nucleotídeos. A partir daí, foi possível conhecer as características do código, dentre elas:

1. o código é redundante, no qual todos os aminoácidos, exceto a metionina e o trip-

tofano, possuem mais de um códon; 2. é considerado não-ambíguo, ou seja, uma

trinca só pode codificar um aminoácido; 3. sem superposição, isto é, uma dada base

pertence a uma só trinca; 4. é contínuo, não existindo espaçamento

entre os códons; 5. o código é quase universal, pois códigos

fora do padrão foram observados em ge-nes mitocondriais de Drosophila, fungos e leveduras;

6. o código contém códons de pontuação dos tipos códons de iniciação (AUG - me-tionina) e finalização (UAA, UGA e UAG)

Tabela 1 - Código Genético. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

(Tabela 1).2.4 traduÇÃo

A tradução é o segundo processo da expressão gênica, diferente da transcrição, ocorrendo no citoplasma, em eucariontes e de forma conco-mitante com a transcrição em procariontes. É considerado um processo complexo, que en-volve muitos elementos. Para que a tradução ocorra adequadamente, é fundamental que o código genético seja respeitado. O RNAt é im-prescindível durante esse processo, pois cada

molécula de RNAt é específica a um dos 20 aminoácidos envolvidos na síntese protéica. O RNAt sofre aminoacilação, ou seja, cada RNAt forma uma ligação com um aminoácido espe-cífico. O aminoácido se liga à extremidade do braço aceptor do trevo do RNAt através da liga-ção do grupamento carboxila do aminoácido e do grupamento 3’-OH do nucleotídeo termi-nal do RNAt. Esta associação é controlada pela aminoacil-RNAt sintetase. Após a ligação do aminoácido correto ao braço aceptor do RNAt, a molécula necessita completar a ligação entre

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32o RNAm e o polipeptídeo por meio do reconhecimento do códon correto e da ligação a ele. A alça anticódon do RNAt liga-se a ele através do pareamento de bases, pois é complementar ao códon.

Da mesma forma que a transcrição, a tradução também apresenta três etapas: início, alongamen-to e término. Como exemplo do processo de tradução, veremos as etapas em E. coli. No início, a subunidade menor do ribossomo (30S) se ligará a uma molécula de RNAm em um ponto es-pecífico (5’-AGGAGGU-3’), antecedente ao códon de início do gene. Esta sequência é chamada sequência de Shine-Dalgarno. Logo após a localização do sítio de início, a subunidade migra até encontrar o códon AUG, que corresponde ao códon de início da tradução. Quando um RNAt associado à metionina é formilado (fmet) e forma pares de bases com o códon de iniciação locali-zado na subunidade 30S, declaramos que foi formado o complexo de iniciação. Participam, ainda, da formação desse complexo alguns fatores de iniciação (IF1, IF2, IF3) (Figura 13).

Figura 13 – Início da Tradução- fatores de iniciação (IF1, IF2, IF3). Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Durante a etapa de alongamento da cadeia polipeptídica, a subunidade maior do ribosso-mo se liga ao complexo através da hidrólise da molécula de GTP associada ao complexo de ini-ciação, gerando dois sítios distintos. O primei-ro sítio denominado Peptidil ou P’ é ocupado

pelo RNAtfmet aminoacetilado. O segundo sítio chamado sítio aminoacil ou A posiciona-se so-bre o segundo códon do gene. O alongamento se inicia, quando o RNAt correto se encaixa no sítio A e forma pares de bases com o segundo códon. Alguns fatores de alongamento são ne-

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33cessários (EF-Tu, EF-Ts) para a entrada do aminoacil RNAt no sítio A. Após a ocupação dos dois sítios, ocorrerá uma ligação peptídica entre o grupamento carboxila do fmet e o grupamento amino do se-gundo aminoácido. A enzima que catalisa esta reação é a peptidil transferase. O ribossomo desliza ao longo do RNAm, de modo que o RNAt a-a se encaixe no sítio P e o RNAtfmet se dissocie do sítio A, liberando-o, para que outro RNAt aminoacetilado possa penetrar no sítio A. Esse processo é chamado de translocação, repetindo-se várias vezes, durante o ciclo de alongamento (Figura 14).

Figura 14- Alongamento da tradução. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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Na etapa de término da tradução, um dos três códons finalizadores (UAA, UAG ou UGA) se apresenta ao sítio A. Um dos dois fatores de liberação (RF1 ou RF2) entra no sítio A e cliva o polipeptídio a partir do RNAt final. Um terceiro fator (RF3) desempenha um papel secundário

Figura 14- Alongamento da tradução. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

nesse processo. Após a ação desses fatores e liberação do polipeptídio, o complexo de tradução é desfeito, as subunidades do ribos-somo se separam, e os fatores são liberados (Figura 15).

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Figura 15- Término da tradução. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

2.4.1 TRADUÇÃO EM EUCARIONTES

A tradução em procariontes e eucariontes é bastante similar, contudo difere em alguns as-pectos. São eles: 1- A subunidade pequena do ribossomo reconhece uma estrutura capsular, a qual se liga à extremidade 5’ do RNAm, de-pois se move ao longo do RNAm, até alcançar um códon iniciador; 2- O RNAt iniciador trans-porta uma metionina não formilada; 3- o início da tradução requer mais fatores de iniciação do que o necessário para procariontes; 4- a

iniciação em eucariontes requer a hidrólise de uma molécula de ATP; 5- o término da tradu-ção requer a hidrólise de uma molécula de GTP.

Desafio da Fix: através da modelagem, vocês podem realizar os pro-cessos de transcrição e tradução, os quais ne-cessitam de abstração. Para isso, acessem www.sbg.org.br/GeneticaEs-

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36cola2/web/vol2Num1.htm - O ensino da trans-crição e tradução para portadores de necessi-dades educativas especiais - visuais e pessoas de visão normal. Uma outra forma dinâmica de trabalhar com esses processos é acessar o Programa GBOL (http://www.ufv.br/dgb/gbol - Genética Molecular- Dogma central), no qual é permitido ao usuário acompanhar os pro-cessos de forma automática ou passo a passo (botão manual), além de alterar a velocidade da apresentação das etapas da transcrição ou da tradução.

3. MutaÇÃo e reParo da Molécula de dna

3.1 MutaÇÃo

Mutação é uma alteração do material gené-tico de células (ou vírus), podendo ocorrer no genoma, nos cromossomos ou no gene. Geralmente, quando nos referimos à muta-ção, estamos tratando de uma alteração em um único gene, conhecida como mutação de ponto ou gênica.

Uma mutação é uma pequena alteração na molécula de DNA, a qual pode ocorrer duran-te o processo de replicação, podendo ou não ser corrigida. Quando o erro não é corrigido, ocorre o mau pareamento entre os filamentos da molécula filha, promovendo a formação de moléculas-netas diferentes, uma apresen-tando a sequência correta de nucleotídeos, enquanto a outra apresenta uma mutação. As mutações podem ser neutras ou graves, por isso, para minimizar os problemas que podem advir das mutações, os organismos possuem mecanismos de reparo do DNA, os quais corrigem o mau pareamento e as pos-síveis alterações.

As mutações podem ocorrer dentro de um gene ou em regiões intergênicas. Se a muta-ção ocorrer em um gene, ela pode alterar o produto gênico e provocar uma alteração de fenótipo. Contudo, se a mutação ocorrer em uma região intergênica, ela provavelmente não terá efeito sobre a célula e será denomina-da de silenciosa.

3.1.1 TIPOS DE MUTAÇÃO

Para classificar as mutações, em geral, são considerados os seguintes aspectos: o tipo de alteração sofrida pela sequência de DNA; os possíveis efeitos provocados pela mutação e as possíveis alterações fenotípicas resultantes da mutação.

3.1.1 TIPOS DE MUTAÇÃO

Para classificar as mutações, em geral, são considerados os seguintes aspectos: o tipo de alteração sofrida pela sequência de DNA; os possíveis efeitos provocados pela mutação e as possíveis alterações fenotípicas resultantes da mutação.

1. Mutações na sequência de DNA

A mutação pode ser denominada de mutação de ponto (Figura 16a), quando ocorre a subs-tituição de um nucleotídeo por outro. Pode ser classificada de transição, por exemplo, quando ocorre a substituição de uma purina por ou-tra purina (A « G) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (T « C). Pode ainda ser uma transversão, se a alteração for de uma purina para uma pirimidina ou vice-versa (A ou G « T ou C). São verificadas, ainda, mutações do tipo inserção ou deleção, nas quais ocorre a adição ou remoção de um par ou vários pares de bases. Existe ainda a inversão, que consis-te na retirada de uma sequência da molécula de DNA e sua reintegração na mesma posição, porém invertida.

Saiba MaiS

Mutação de ponto: alteração em um loco gênico es-pecífico, podendo ser ocasionada por substituição, inserção ou deleção de uma única base (ou poucas).

Mutação silenciosa: aminoácidos equivalentes fun-cionalmente podem substituir-se reciprocamente, e, assim, o produto mutante funciona como o original.

Transição: substituição de base púrica por púrica ou pirimídica por pirimídica.

Transversão: substituição de base púrica por pirimídi-ca ou vice-versa.

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2. Mutações em um gene

Pode ser qualquer um dos tipos de mutações na sequência de DNA, considerando que es-tas ocorram em uma região codificante de um gene.

A mutação pode ser dita silenciosa, quando a alteração de um nucleotídeo modificar, em ge-ral, a terceira base de um códon, provocando alteração do códon, mas não, do aminoáci-do. Isso ocorre devido à redundância do có-digo genético. Contudo, se a mutação ocorrer no primeiro ou no segundo nucleotídeo do códon, a mutação é denominada de sentido trocado, a qual alterará a base e, por conse-guinte, o aminoácido. A mutação sem sentido também é uma mutação de ponto, que muda um códon especificador para um códon fina-lizador. Por último, falaremos da mutação ca-paz de provocar mudança na matriz de leitura; essa mutação pode ser dos tipos inserção ou deleção, pois a adição ou remoção de pares de bases que não seja múltiplo de três provocará alteração na tradução (figura 16b).

SAIBA MAIS

Deleção: perda de qualquer segmento de DNA; tam-bém pode se referir à alteração cromossômica estru-tural.

Inversão: quebra e rotação de 180º de qualquer seg-mento de DNA; também pode se referir à alteração cromossômica estrutural.

Mutação de sentido trocado: a substituição de uma base troca o aminoácido original por outro.

Mutação sem sentido: mutação que gera um códon finalizador.

Mutação por mudança na matriz de leitura: mutação por deleção ou adição de número de bases não múl-tiplo de três, alterando a leitura.

3. Mutação em um organismo

Consiste na ocorrência de uma mutação capaz de formar um fenótipo mutante. Este mutan-te poderá perder parcialmente a atividade de uma dada proteína, que passa a ter sua ati-vidade reduzida, aumentada ou nula. Isso ocorre em procariontes e eucariontes. Vários

Figura 16- Tipos de mutação. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Gua-nabara Koogan.

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38exemplos de mutantes foram observados em E. coli, dentre eles, os mutantes dos tipos au-xotróficos, condicional-letais, sensíveis à tem-peratura, resistentes a antibióticos e mutantes regulatórios.

Pesquisa da Fix: pesquise sobre esses tipos de mu-tantes e procure observar as consequências prove-nientes da mutação para o mutante, a ciência e a sociedade.

A mutação poderá, também, gerar um produ-to gênico incapaz de desempenhar sua função na célula. Neste caso, a célula poderá morrer, e esta mutação será considerada letal. Vários exemplos foram destacados na disciplina Ge-nética Geral, dentre esses um letal dominante em humanos, a Acondroplasia.

SAIBA MAIS

Letal: gene ou genótipo que, ao se expressar, ocasio-na morte ao seu portador.

3.1.2 AGENTES MUTAGÊNICOS

Vimos que as mutações podem ocorrer devido a erros no processo de replicação. Além desses erros, a mutação pode também ser provenien-te da ação de mutágenos, que se encontram freqüentemente no meio e provocam altera-ções na molécula de DNA. Vejamos alguns ti-pos principais, como: 1-análogos de bases, os quais podem substituir uma base durante a re-plicação, como por exemplo, a 5-bromouraci-la, que é derivada da timina por uma substitui-ção do grupamento metila (-CH3) por bromina (-Br); 2- agentes intercalantes são compostos que se intercalam na dupla hélice, provocan-do perturbação na replicação, provavelmente devido à inserção de pares de bases. Este tipo de mutágeno é comumente usado em labo-ratórios de pesquisa; em geral, são corantes, como, por exemplo, a acridina e o brometo de etídeo; 3- o calor é um dos mutágenos am-bientais mais importante, é capaz de clivar as ligações entre as bases púricas e seus açúca-res, e em menor escala, também, afetam as ligações das bases pirimídicas; 4- a radiação ultravioleta, que causa dimerização das bases,

ou seja, faz com que as bases se juntem, origi-nando deleções durante a replicação do DNA.

Você sabia que o câncer é uma doença genéti-ca, embora nem sempre seja hereditário ?

Pesquisa da Fix: pesqui-se os principais agentes mutagênicos responsá-veis por mutações em protooncogenes, suas consequências e as eta-pas de desenvolvimento do câncer (mutação ® metástase).

Desafio da Fix: o Programa GBOL (http://www.ufv.br/dgb/gbol - Mutações) disponibiliza vá-rias formas de trabalhar com o tema muta-ções. Vocês poderão observar as várias formas mutantes em Drosophila, a diversidade genéti-ca em plantas, como o milho, maracujá e fei-jão, além de ter acesso ao código genético por diferentes formas. Acessem e divirtam-se.

3.2 reParo

O reparo do DNA é um processo complexo, no qual existe um número variável de proteínas, como, por exemplo, em E. coli foram obser-vadas 24 proteínas diferentes. Existem vários tipos de mecanismos de reparo, dentre eles destacaremos quatro, que são: 1- reparo di-reto, que consiste na reversão de uma altera-ção estrutural; 2- reparo por excisão de bases, que ocorre através da ação de enzimas (uracila DNA glicosilase, endonucleases, fosfodiestera-ses, polimerases); 3- reparo de excisão de nu-cleotídeos, realizado por várias enzimas, que fazem quebras unifilamentares em ambos os lados de um nucleotídeo danificado; 4- repa-ro de mau pareamento, que corrige erros in-troduzidos durante a replicação no filamento filho. Pesquisa da Fix: você sabia que existem vá-rias síndromes humanas oriundas de defeitos no sistema de reparo de DNA? Alguns exemplos são o Xeroderma pig-mentoso, a Síndrome de

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39Bloom, a Pancitopenia de Fanconi e a Atalaxia--telangiectasia. Para ter acesso a informações sobre essas doenças, utilize o site de busca: http://www.google.

reViSando conHeciMentoS

1. Com qual sequência de 5’ a 3’, a sequência 5’ – ACTGCCATGCTA – 3’ em um filamento molde de DNA codifica uma molécula de RNA ?a) 5’...TGACGGTACGAT...3’b) 5’...UAGCAUGGCAGU..3’c) 5’...TAGCATGGCAGT...3’d) 5’...UGACGGUACGAU..3’e) 5’...ATCGTACCGAGA...3’

2. Teste seus conhecimentos sobre as bases da expressão gênica, analisando as afir-mativas abaixo e assinalando-as como ver-dadeiras ( V ) ou falsas ( F ). Em seguida, justifique as respostas consideradas falsas.

( )Em procariontes e eucariotes, as mo-léculas de RNAm são sintetizadas no sentido 5’→3’, com a adição de ribonu-cleotídeos ao grupo 3-hidroxila na ponta da cadeia da molécula.

( )Cada códon, presente no RNAm, é específico para um aminoácido, assim como cada aminoácido é codificado por, apenas, um tipo de códon.

( ) Para início da transcrição, a RNA polime-rase liga-se a um sítio específico de DNA denominado de promotor.

( ) O código genético é composto por có-dons, cada um deles sendo constituído de três nucleotídeos.

( ) Nas células eucarióticas, os segmentos íntrons e éxons são traduzidos de for-mas diferentes ; os primeiros codificam proteínas estruturais, e os segundos, proteínas repressoras ou reguladoras.

( ) Os códons que representam finalização de cadeia são encontrados no RNAt.

( ) A enzima aminoacil-RNAt sintetase catalisa as ligações entre aminoácidos e moléculas de RNAt.

3. Utilize a tabela do código genético para citar duas seqüências diferentes do RNAm que podem codificar a seguinte seqüência de aminoácidos: Arginina – Glicina – Histi-dina – Aspartato – Alanina.

4. As mutações são classificadas em vários ti-pos, alguns dos quais estão citados abaixo. Faça a correta associação entre esses tipos com as características e os exemplos. (Pes-quise a tabela do código genético)

Tipo Características Exemplo1. Sentido contrário

A. Substituição de uma purina por uma piri-midina ou vice versa.

I. G para A

2. Transição B. Substituição de uma purina por outra puri-na ou de uma pirimidina por outra pirimidi-na.

II. T para G

3. Silenciosa C. Resulta na substituição de um aminoácido por outro tipo.

III. ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA para ATG GGA GCT CTA TGA ACC TAA

4. Transversão D. Muda um códon especifi-cador de uma aminoácido para um códon finalizador, oca-si onan-do o término prematuro da tradução.

IV. ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA para ATG AGA GCT CTA TTA ACC TAA

5. Sem sentido

E. Altera o có-don, mas não altera o ami-noácido a ser codificado.

V. ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA para ATG GGA GCT CTA TTG ACC TAA

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40Assinale a alternativa que faz a correta as-sociação

a) 1DII; 2AI; 3BIV; 4CV; 5EIII.b) 1BIV; 2EII; 3AV; 4CIII; 5DI.c) 1CIV; 2BI; 3EV; 4AII; 5DIII.d) 1EII; 2CIV; 3DV; 4AIII; 5BI.e) 1BI; 2AIII; 3EIV; 4CII; 5DV.

5. Você aprendeu que há diferentes tipos de sistemas de reparo do DNA. Pesquise so-bre o reparo de mau pareamento e respon-da: 1) Por que é importante as enzimas de reparo reconhecerem qual a fita parental e a recém sintetizada? 2) Como é realizado o reconhecimento?

reFerÊnciaSLEITURA FUNDAMENTAL

SNUSTAD, D. P. e SIMMONS M. J. Fundamen-tos de Genética: Guanabara Koogan S/A, 2000.

LEITURA COMPLEMENTAR

GRIFFITHS, A. J. F.; WESSLER, S. R.; LEWONTIN, R. C.;GELBART, W. M.; SUZUKI, D. T.e MILLER, J. H. Introdução à Genética: Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S/A, 2006.

SITES

http://www.ufv.br/dgb/gbol

www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/vol-2Num1.htm

http://www.google

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Genética de VÍruS e bactériaS, técnicaS de Genética Molecular e SuaS PrinciPaiS aPlicaÇõeS

introduÇÃo

Estudaremos os vírus, que constituem a mais simples forma de vida, e as bactérias sob os seguintes aspectos: ciclo de vida, organização genômica e recombinação. Es-tes conhecimentos permitirão uma melhor compreensão da variabilidade genética bem como contribuirão para o melhor entendi-mento das metodologias adotadas na bio-logia molecular.

obJetiVoS eSPecÍFicoS

• Compararosciclosdevidadosbacterió-fagos;

• Distinguirosdiferentestiposderecombi-nação em bactérias;

• Conhecerasprincipaistécnicasdegené-tica molecular.

Profa. Rita de Cássia de Moura Carga Horária I 15HColaboradoras: Profa. Marília de França Rocha Profa. Maria Teresa Marquim Nogueira Cornélio

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1. VÍruSOs vírus são biologicamente tão simples que alguns pesquisadores consideram que eles não são organismos, embora hoje concordem que são parasitos ultracelulares permanentes; que a maioria depende da maquinaria enzimática da célula hospedeira para replicar e transcrever seus genes e que necessitam dos ribossomos e do aparato de tradução do hospedeiro. Quan-to a sua origem, considera-se que o fato de eles dependerem da célula hospedeira, seja ela bacteriana ou eucariótica, indica que os vírus evoluíram depois do aparecimento da célula, provavelmente a partir de segmentos de DNA ou RNA, os quais teriam adquirido a capacida-de de se replicar independente do genoma da célula hospedeira.

Existem diferentes tipos de vírus; os mais estu-dados são aqueles capazes de infectar bacté-rias, denominados de bacteriófagos ou fagos, os quais veremos com mais detalhes abaixo.

Saiba MaiS

Bacteriófagos (fagos) – vírus que infecta bactérias.

1.1 bacteriÓFaGoS

Os bacteriófagos estão constituídos de ácido nucléico e proteínas. A proteína é responsável pela formação de um revestimento chamado capsídeo, o qual contém em seu interior o ge-noma do fago. O capsídeo pode apresentar três tipos de estrutura básica: Icosaédrica, em forma geométrica; filamentar ou helicoidal, em forma de bastão; cabeça e cauda, uma combinação de uma estrutura icosaédrica a uma cauda filamentar (Figura 1).

1.1.1 CICLOS DE VIDA DE BACTERIÓFAGOS

Para exemplificar os ciclos de vida dos bac-teriófagos, usaremos exemplos de fagos que infectam a E. coli: o T4 para o ciclo lítico ou virulento e o λ (lambda) para o ciclo lisogênico ou temperado.

1.1.1.1 CICLO LÍTICO

O primeiro passo para que o T4 infecte a E. coli é a ligação do fago a uma proteína recepto-

ra (chamada OmpC) na superfície da bactéria. Depois da ligação, o fago introduz o seu DNA na bactéria, através de sua cauda.

Logo após a introdução do DNA do fago, a síntese de DNA, RNA e proteínas da bactéria é desligada, por um complexo entre a RNA polimerase modificada da célula hospedeira e as proteínas iniciais do fago, as quais são pro-duzidas dentro de minutos, após a infecção. A RNA polimerase modificada reconhece os promotores dos genes do fago e catalisa sua transcrição. Um aspecto importante do ciclo de T4 consiste na adição de grupos hidroxi-metila às citosinas do fago, protegendo-as da degradação por nucleases produzidas pelo fago, as quais degradam o DNA da bactéria hospedeira. Proteínas posteriores também são produzidas e são responsáveis pela formação de estruturas da cabeça e cauda do fago. Este

Figura 1 - Estrutura do capsídeo. a-eletromicrografia, b- diagrama. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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43ciclo dura 22 minutos e é encerrado quando o fago codifica uma enzima chamada lisozima, a qual junto com outras proteínas rompe a bactéria hospedeira e libera cerca de 100 a 300 fagos da prole (Figura 2).

Figura 2 - Ciclo lítico. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

1.1.1.2 CICLO LISOGÊNICO

O fago λ , como a maioria de outros fagos temperados, pode seguir o ciclo lítico, embora freqüen-temente utilize o ciclo lisogênico, cuja diferença básica consiste na integração do genoma do fago ao DNA hospedeiro. Logo após a entrada do DNA do fago na bactéria, ocorre a integração, e o bacteriófago passa a ser chamado de profago. A integração ocorre devido ao processo de recom-binação, que é possível graças a uma pequena região (cerca de 15pb) idêntica entre a molécula de DNA do fago e o genoma de E. coli.

O profago integrado pode permanecer na molécula hospedeira, por muitas gerações da célula. Ele pode ser induzido por estímulos químicos ou físicos a assumir o ciclo lítico. Para que isso ocor-ra, é necessária uma segunda recombinação, que excisa o genoma do fago do DNA hospedeiro. O DNA do fago se replica, as proteínas de revestimento são sintetizadas, a célula se rompe, e os novos fagos λ são liberados (Figura 3).

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Figura 3- Ciclo lisogênico. Fonte: Pierce, B.A. (2004) Genética um enfoque conceitual. Editora Guanabara Koogan.

1.1.2 ORGANIZAÇÃO GÊNICA

Quando dizemos que os bacteriófagos estão constituídos de ácidos nucléicos, nos referimos ao fato de alguns fagos terem como material genético o DNA e outros, o RNA. O genoma dos fagos, seja de DNA ou RNA, pode ser bi-filamentar ou unifilamentar. Pode ainda estar constituído de, apenas, uma molécula ou de um número de moléculas diferentes. Nesse caso, dizemos que o genoma é segmentado.

Os genomas de bacteriófagos são relativamen-te pequenos, como, por exemplo, o genoma do M13, que possui 6.407 nucleotídeos e um pouco mais de dez genes conhecidos; o ΦX174 com 5.386 nucleotídeos armazena informação biológica extra, pois possui genes superpostos, os quais compartilham sequências de nucleo-tídeos que codificam 11 proteínas diferentes com mais de 2.300 aminoácidos. Por outro lado, alguns bacteriófagos possuem genomas maiores, como o T4, com 166kb e cerca de 150 genes, e o fago λ com 49,5kb e mais de 44 genes.

Pesquisa da FIX: considerando que a estrutura básica do vírus HIV é comum a de outros vírus eucarióticos, podemos usá-lo como modelo

para traçar uma comparação entre bacterió-fagos e vírus eucariótico. Além de termos, é claro, a oportunidade de conhecer um pouco sobre sua estrutura, ciclo de vida, genoma e curso da infecção. Pesquise esse tema no ca-pítulo 16, do livro: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan e em outras bibliografias especializadas.

Desafio da Fix: acesse o texto Gripe aviária: Se-guindo as pegadas de um novo vírus, Eliana M. B. Dessen, no site abai-xo. http://www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/Vol1Num1.htm

2. bactériaS

2.1 recoMbinaÇÃo eM bactériaS: uMa ViSÃo Geral

As bactérias se reproduzem assexuadamente, contudo, elas também possuem o modo de re-produção sexuada, o qual permite a recombi-

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45nação entre o cromossomo de uma linhagem doadora com o cromossomo de uma linhagem receptora, de forma unidirecional. Como não há processo meiótico em procariontes, devido à ausência de citoesqueleto, a recombinação não é necessariamente recíproca. Uma bacté-ria contém um cromossomo, em geral circular, o qual possui milhares de genes. Pode ter, ain-da, elementos extracromossômicos denomina-dos plasmídeos.

Saiba MaiS

Plasmídeo – DNA circular extracromossômico encon-trado em bactérias, possui capacidade de auto-repli-cação e serve como vetor de clonagem.

Os três principais tipos de transferência gené-tica em bactérias são: transformação, proces-so pelo qual uma molécula de DNA doadora é captada no meio e incorporada ao genoma de uma célula receptora; conjugação, proces-so no qual as bactérias fazem contato efetivo, e há transferência de DNA de uma célula do-adora para uma célula receptora; transdução, transferência de DNA de uma célula para ou-tra, através de vírus. Todos os três processos são ditos parassexuais, visto que a recombina-ção não ocorre através da meiose.

2.1.1 TESTE PARA TRANSFORMAÇÃO, CONJUGAÇÃO E TRANSDUÇÃO

Os tipos parassexuais de transferência gênica em bactérias podem ser separados através de critérios simples, são eles: sensibilidade à de-soxirribonuclease (DNase) e dependência de contato célula-célula (ver Quadro 1). Estes cri-térios são facilmente testados, pois basta que se adicione ao meio, contendo linhagens de bactérias envolvidas na recombinação. Caso não ocorra a recombinação, o processo envol-vido deve ser do tipo transformação, no qual o DNA fica livre no meio e facilmente pode ser degradado pela DNase. Na conjugação e transdução, o DNA não fica livre no meio. O processo de conjugação deverá ser verificado através do experimento do tubo em U, no qual bactérias de duas linhagens diferentes são co-locadas nos braços opostos de um tubo de cultura em forma de U. Como nesse proces-so ocorre contato célula-célula, o filtro evita a passagem da molécula de DNA de um braço para o outro, evitando a recombinação.

Contudo, se a DNase estiver presente no meio de cultura do tubo em U, e ainda assim ocorrer recombinação, é porque o processo envolvido é do tipo transdução.

2.1.2 TRANSFORMAÇÃO

A transformação é um processo que só ocor-re em bactérias ditas competentes, pois estas possuem a maquinaria enzimática e as proteí-nas necessárias para captar moléculas de DNA livres no meio e transportá-las para o citoplas-ma. Apenas as células que portam um fator competente, uma pequena proteína que induz a síntese de oito a dez proteínas envolvidas na transformação. Como exemplo, usaremos o Streptococcus pneumoniae, onde uma célula competente liga-se a um grande filamento bi-filamentar de DNA em sítios receptores espe-cíficos na superfície da bactéria. Após o reco-nhecimento e ligação ao sítio, a molécula de DNA move-se através da membrana celular, e um dos dois filamentos de DNA é hidrolisado por uma exonclease, recebendo, desse modo, energia para o transporte do DNA através da membrana. O filamento de DNA não degrada-do é transportado através da membrana. Esse DNA está revestido com proteínas de ligação ao DNA, e proteínas de recombinação procu-ram regiões homológas na célula receptora (Figura 4). Este tipo de recombinação é unidi-recional e não recíproco.

Pesquisa da FIX: o processo de transfor-mação pode diferir de bactéria para bactéria, por isso sugiro que vo-cês pesquisem em sites e na bibliografia reco-mendada o processo de transformação em Haemophilis influenzae, para que possam co-nhecer outro modo de transformação.

Quadro 1: Critérios para o reconhecimento dos três processos parassexuais.

Processo de recombinação

Critério: Contato celular

Critério: sensibi-lidade à DNase

Transformação Não Sim

Conjugação Sim Não

Transdução Não Não

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Figura 4- Transformação em Streptococcus pneumoniae. Fonte: Snus-tad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Gua-nabara Koogan.

2.1.3 CONJUGAÇÃO

A conjugação é o processo no qual ocorre transferência de material genético de uma li-nhagem de bactérias para outra, unidirecio-nalmente, criando genótipos de recombina-ção. Durante a conjugação, o DNA bacteriano pode ou não ser transferido para uma célula receptora. Em um cruzamento entre uma célu-la doadora F+ x F-, os genes da célula doadora raramente são transferidos para uma célula re-ceptora, o que ocorre é a transferência de um plasmídeo chamado fator F de fertilidade, que torna a célula receptora F+. Os genes do fator F facilitam o contato celular e a transferência do fator F, enquanto que alguns genes do fa-tor F- direcionam a síntese de filamentos (pili) sexuais. O fator F se insere no cromossomo bacteriano, devido à presença de sequências de inserção denominadas (IS). A replicação do fator F é do tipo círculo rolante, e apenas um

filamento de DNA é transferido para célula receptora, onde sofre replicação e passa a ser bifilamentar. A frequência de recombinação, em geral, é baixa, podendo, contudo, ocor-rer, caso o fator F se integre ao cromossomo (Figura 5).

Figura 5 - Conjugação F+ x F- Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

A frequência de recombinação pode ser alta, caso o fator F esteja integrado ao genoma da célula doadora. Esta célula é denominada de Hfr (alta frequência de recombinação). A cé-lula Hfr inicia a transferência a partir do ponto de origem da replicação do fator F integrado. A replicação círculo rolante transfere o DNA da célula doadora para a célula receptora, onde ele passa a ser bifilamentar. A célula receptora permanece F-, pois apenas uma parte do fator F foi transferido e integrado à célula, entre-tanto ela poderia passar a ser F+, caso todo o cromossomo bacteriano fosse transferido (Figura 6).

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Figura.6 - Conjugação F+ x Hfr. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Pesquisa da FIX: além dos fatores F+ e F-, exis-te o fator F’, pesquise um pouco sobre esse fator e compare-o com os fatores F+ e F-.

2.1.4 TRANSDUÇÃO

Na transdução, os genes bacterianos são em-balados no capsídeo do fago, devido a erros, durante o ciclo de vida do vírus. Após a lise da célula hospedeira, os vírus serão liberados e in-fectarão outra célula, na qual ocorrerá a trans-ferência de material genético. Podem ocorrer dois tipos de transdução:

1. generalizada, na qual o fago pode transfe-rir qualquer segmento do genoma da célu-la doadora para receptora;

2. especializada, na qual ocorre transferência de segmentos restritos do genoma de uma célula para outra (Figura 7).

Figura 7- Transdução especializada e generalizada. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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482.2 ORGANIZAÇÃO GÊNICA

Como se organizam os genes em bactérias? Essa pergunta é muito ampla, por isso ao invés de tentar, de forma resumida, respon-dê-la, achamos adequado mais uma vez usarmos a E. coli como exemplo, visto que é um dos organismos modelo da Genética bem como a bactéria melhor estudada até o momento.

Figura 8- Genoma de Escherichia coli. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Em E. coli, o tamanho do genoma corresponde a 4.639,221pb, com cerca de 4.280 sequên-cias hipoteticamente codificantes de proteínas ou genes, desses genes apenas 1/3 são bem conhecidos. O tamanho das sequências inter-gênicas é de 118pb. Os genes que especificam proteínas, RNAs estáveis e DNA repetitivo cor-respondem a cerca de 87,5%, 0,6% e 0,7% do genoma, respectivamente. Os 10,7% restantes do genoma devem envolver sequências regu-ladoras dentre outras sequências ainda desco-nhecidas (Figura 8).

3. técnicaS de Genética Molecular e SuaS PrinciPaiS aPlicaÇõeS

3.1 conSideraÇõeS GeraiS

A década de 70 do século XX foi crucial para os geneticistas moleculares, pois foi a partir do desenvolvimento de novas tecnologias que se tornou possível o isolamento de sequências

gênicas, a recombinação de moléculas de DNA in vitro bem como o seqüenciamento de áci-dos nucléicos, o uso de microscopia eletrônica e de outras técnicas analíticas. Muito do que se sabe hoje sobre os genes, deve-se a análises moleculares através da aplicação de tecnolo-gias do DNA recombinante e subseqüente clo-nagem gênica. Discutiremos, de forma sucin-ta, algumas das principais ferramentas usadas em análises moleculares, como, por exemplo, as enzimas de restrição, a reação em cadeia da polimerase e suas principais aplicações.

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493.2 técnicaS uSadaS Para clonaGeM

3.2.1 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (RES) Para que se possa clonar e sequênciar qualquer gene de interesse, é fundamental o uso de en-zimas de restrição, as quais são produzidas por microorganismos e possuem a capacidade de reconhecer sequências diferentes de nucleotí-deos no DNA. As REs cortam a molécula de DNA apenas em sequências específicas ditas sítios de restrição (ver Quadro 2). A nomen-clatura usada para determinar o tipo de REs, baseia-se na espécie de microorganismo que a produziu, como, por exemplo, a endonuclease de restrição EcoRI. A primeira letra se refere a inicial do gênero (Escherichia), e as demais, ao início do nome da espécie (coli), seguido da linhagem bacteriana (R) e da referência ao fato de ter sido a primeira enzima de restrição iden-tificada nesta linhagem (I).

Saiba MaiS

DNA recombinante – DNA sintetizado artificialmente, onde uma sequência específica de DNA de um orga-nismo é inserido no genoma de outro.

Clonagem gênica – método que envolve a multiplica-ção de sequências de DNA incorporadas a um vetor de clonagem, em geral um plasmídeo, um cosmídeo ou um fago, capaz de se replicar ao ser introduzido em um hospedeiro adequado.

Enzimas de Restrição (REs) – enzima, oriunda de bac-térias, capaz de reconhecer uma sequência específica de ácido nucléico e cortar dentro do sítio de restrição.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – ver PCR

PCR ou Reação em Cadeia da Polimerase – Técnica utilizada na rápida amplificação enzimática in vitro de sequências específicas de DNA.

3.2.2 MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTES

O fato da enzima de restrição cortar um par específico de nucleotídeos, independente do organismo (fago, humano, camundongo, mosca, etc), permite que sejam produzidos fragmentos com as mesmas extremidades, ou seja, complementares, seja qual for à origem do DNA. Esses fragmentos oriundos de distintos organismos podem ser fusio-nados, gerando uma molécula de DNA re-combinante (Figura 9). Após a produção do DNA recombinante, é necessário agora que ele seja amplificado, isto é, que sejam produzidas muitas cópias ou clones desta molécula. Para que isto ocorra, é preciso que a molécula de DNA recombinante seja inserida em um vetor de clonagem, o qual é auto-replicante, como, por exemplo, plasmídeos. Como já sabemos, os plasmídeos são moléculas de DNA extracro-mossômico presentes em microorganismos. O seu tamanho varia de 1kb (= 1.000pb) a mais de 200kb. Além dos plasmídeos, outros vetores são usados de acordo com suas ca-racterísticas e capacidade de inserto, sendo os principais tipos: bacteriófagos, cosmídeos e cromossomos artificiais.

Figura 9 - Formação de molécula de DNA recombinante. Fonte: Snus-tad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Gua-nabara Koogan.

Quadro 2 – Sequências de reconhecimento e sítios de restrição de algumas enzimas de

restrição.Enzima Fonte Sequência de

reconhecimento e Sítio de restrição

EcoRI Escherichia coli GˇAATTCCTTAAˆG

HindIII Haemophilus influenzae lR

AˇAGCTTTTCGAˆA

AluI Arthobacter luteus

AGˇCTTCˆGA

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50Saiba MaiS

Inserto – sequência de DNA a ser inserida em um ve-tor de clonagem.

Cosmídeos – vetor de clonagem construído pela in-serção da sequência cos do fago lambda em um plas-mídeos, permitindo a clonagem de insertos de 30 a 46 kb de tamanho.

Cromossomos artificiais – vetor capaz de propagar insertos maiores do que os encontrados em fagos e cosmídeos. Podem ser de origem bacteriana (BAC), de levedura (YAC), ou até mesmo humana (HAC).

Um vetor de clonagem possui três componen-tes básicos: 1- origem de replicação; 2- gene marcador dominante selecionável; 3- ao me-nos um sítio de restrição (Figura 10). Os veto-res atualmente mais usados possuem um sítio de policlonagem.

Figura 10- Vetor de clonagem e seus componentes básicos. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Edi-tora Guanabara Koogan.

sejam favoráveis ao gene marcador selecioná-vel presente no vetor (Figura 11).

A triagem de uma biblioteca de DNA é feita principalmente pela seleção genética, podendo também ser feita através do uso de sequências de DNA ou RNA como sondas de hibridização ou através de anticorpos que reconhecem pro-dutos gênicos.

Saiba MaiS

Sítio de Policlonagem – sequência de DNA reconheci-da por diferentes enzimas de restrição.

Sondas de Hibridização – pequena molécula (cerca de mil pb) de ácido nucléico marcado (radioativa-mente ou enzimaticamente) usada na detecção de sequências complementares de DNA ou RNA.

Figura 11- Construção de bibliotecas de DNA. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

3.2.3 CONSTRUÇÃO E TRIAGEM DE BIBLIOTECAS DE DNA

O primeiro passo para clonagem consiste na construção de uma biblioteca de DNA genô-mico, que corresponde a um conjunto de dife-rentes fragmentos de DNA do genoma inteiro. O processo é iniciado com o isolamento do DNA total de um organismo, o qual é digerido por enzimas de restrição, gerando vários seg-mentos de DNA, os quais são inseridos em um vetor de clonagem apropriado. Após a ligação dos fragmentos do DNA genômico ao DNA ve-tor, as moléculas recombinantes são inseridas em células hospedeiras, em geral E. coli, para posterior replicação in vivo. As bactérias trans-formadas, ou seja, que contêm o DNA vetor, deverão crescer em um meio, cujas condições

VocÊ Sabia

Você sabia que além das bibliotecas genômicas, exis-tem as bibliotecas cromossômicas e de cDNA (DNA complementar)? Ambas são mais específicas que a biblioteca genômica e são úteis para o mapeamento cromossômico e estudos de expressão gênica, respec-tivamente.

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51Desafio da FIX: visite o site da Sociedade Brasilei-ra de Genética e consulte a prática de DNA recom-binante (Enzima de res-trição), Octavio Henrique de O. Pavan. http://www.sbg.org.br/GeneticaEsco-la2/web/Vol1Num2.htm

3.3 anÁliSe Molecular de ÁcidoS nucléicoS e GeneS

3.3.1 ELETROFORESE

A eletroforese é usada para separação de ma-cromoléculas com tamanhos e cargas dife-rentes. Como as moléculas de DNA possuem

Figura 12 - Eletroforese. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

carga por unidade de massa essencialmente constante, elas se separam em géis de agarose ou acrilamida com base em seu tamanho ou conformação. São feitas cavidades em uma extremidade do gel, onde são depositadas as amostras de DNA, e é passada uma corrente elétrica no gel. Os fragmentos de DNA migram para extremidade positiva do gel. Isso ocorre, porque o grupo fosfato de cada nucleotídeo da molécula de DNA tem carga negativa. Após a eletroforese, os fragmentos são separados pelo tamanho e são observados como bandas a partir de sua revelação por corantes espe-cíficos, como o brometo de etídio. Alternati-vamente também se pode usar um marcador radioativo ou químico (Figura 12). A eletrofo-rese em gel é usual em experimentos de DNA recombinante.

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Figura 13 - Transferência de Southern. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

3.3.2 ANÁLISE DE DNA POR HIBRIDIZAÇÃO E TRANSFERÊNCIA DE SOUTHERN

Esta técnica permite localizar genes e sequên-cias de DNA em fragmentos de restrição sepa-rados por eletroforese em gel, em particular, pela transferência das moléculas de DNA do gel para uma membrana de nitrocelulose ou

3.3.3 ANÁLISE DE RNA POR HIBRIDIZAÇÃO E TRANSFERÊNCIA DE NORTHERN

O procedimento da análise de RNA é similar ao descrito na transferência de Southern. Contu-do, as moléculas de RNA são muitos sensíveis à degradação por RNase e, em geral, contém uma estrutura secundária. Por isso, se deve ter cuidado quanto a contaminação de materiais e manutenção das moléculas de RNA desnatu-radas durante a eletroforese, para garantir que elas se separem pelo tamanho. A hibridização e transferência de Northern podem ser usadas para o estudo temporal da expressão de genes.

Pesquisa da FIX: pes-quise, na literatura recomendada e em sites, a análise de pro-teínas por hibridiza-ção e transferência de Western e compare este procedimento com Southern e Northern.

náilon (Figura 13). O DNA é desnaturado an-tes da transferência, colocando-se o gel numa solução alcalina. Após a transferência, o DNA é imobilizado na membrana por secagem ou radiação UV e identificado por uma sonda ra-dioativa de DNA, a qual será hibridizada à se-quência de interesse, cuja sequência de nucle-otídeos é complementar à sequência da sonda.

3.3.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a amplificação de uma sequência selecionada de DNA milhares de vezes. Este procedimento só pode ser usado, quando se conhecem as sequências de nucleotídeos das extremidades da sequência de interesse. É necessário o uso de oligonucleotídeos sintéticos complementa-res a estas sequências conhecidas, servindo de início para amplificação destas.

A PCR compreende três etapas, são elas: Eta-pa 1, o DNA genômico a ser amplificado é desnaturado por aquecimento a 95-97°C, por 15 a 30 segundos; etapa 2, o DNA des-naturado é helicoidizado a um excesso de primers de oligonucleotídeos sintéticos, in-cubando-os juntos a 50-60°C por 30 segun-dos; etapa 3, a DNA polimerase (atualmente substituída por uma DNA termoestável, a Taq polimerase) é usada para replicar o segmen-to de DNA, o primer fornece a extremidade

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533’-OH livre para a ampliação, e o DNA genômico desnaturado fornece o molde. A polimeri-zação é feita a 70-72°C por 1,5 minuto (Figura 14). O procedimento é repetido muitas vezes, até que se obtenha o nível de amplificação desejada.

Saiba MaiS

Oligonucleotídeos – molécula curta de DNA (cerca de 8 a 50 pb), usualmente utilizada como sonda.

Primers – pequeno oligonucleotídeo de uma sequência definida que se liga a um molde de DNA, para dar início à replicação (sintetizado pela primase) ou à reação em cadeia da polimerase (sintetizado artificialmente).

Figura 14 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Fonte: Snustad D.P. e Sim-mons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

A PCR tem sido usada no diagnóstico de do-enças hereditárias humanas, diagnóstico pré--natal, casos forenses, clonagem e sequen-ciamento. A principal vantagem do uso dessa metodologia se deve ao uso de DNA isolado de amostras muito pequenas.

Desafio da FIX: procure saber mais sobre apli-cações das técnicas de Genética Molecular. Para tal, acesse: http: /www.biotecnologia.com.br. Neste site, você terá aces-so a entrevistas e artigos científicos sobre temas relacionados à Biologia Molecular e Biotecno-logia, como, por exemplo, clonagem, marca-dores moleculares, terapia gênica do câncer, dentre outros.

Saiba MaiS

Sequenciamento – determinação da sequência de ba-ses de um fragmento de DNA ou RNA bem como da sequência de aminoácidos de uma proteína.

reViSando conHeciMentoS

1. Vimos que as bactérias, embora não reali-zem reprodução sexuada, realizam outros processos que permitem a recombinação gênica, denominados de parasexuais. Três tipos básicos de recombinação são obser-vados, cada um apresentando particulari-dades. Faça a correta associação entre as características apresentadas e o tipo espe-cífico de recombinação.

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2. A Reação em cadeia de polimerase (PCR) tem sido um recurso valioso para ampli-ficação (um milhão ou mais de vezes) de sequências específicas de DNA em poucas horas. Dentre os processos apresentados abaixo, assinale com um X aqueles que ocorrem durante a aplicação dessa técnica.

dependendo do organismo e do tamanho do genoma. Um dos vetores valiosos para mapear e seqüenciar genomas eucarióti-cos corresponde a a) Plasmídeosb) Cosmídeosc) YACsd) Bacteriófagose) Sondas híbridas

5. Sobre as atuações das enzimas de restri-ção, analise as afirmativas abaixo.I. Quebram as pontes de hidrogênio e se

intercalam entre as duas fitas de DNA, favorecendo a clonagem de um seg-mento molecular específico.

II. Reconhecem e clivam as duas fitas de DNA em sítios específicos.

III. Protegem os organismos que as produ-zem contra a ação de DNA exógenos.

IV. Ligam-se a sítios específicos do DNA e, associadas a proteínas histônicas, favo-recem a amplificação gênica.

Estão corretas:a) I e II.b) I e III.c) II e III.d) III e IV.e) II e IV.

reFerÊnciaSLEITURA FUNDAMENTAL

SNUSTAD, D. P. e SIMMONS M. J. Fundamen-tos de Genética: Guanabara Koogan S/A, 2000.

LEITURA COMPLEMENTAR

GRIFFITHS, A. J. F.; WESSLER, S. R.; LEWONTIN, R. C.;GELBART, W. M.; SUZUKI, D. T.e MILLER, J. H. Introdução à Genética: Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S/A, 2006.

SITES

http://www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/Vol1Num1.htm

http://www.sbg.org.br/GeneticaEscola2/web/Vol1Num2.htm

( a ) Conjugação ( ) Molécula de DNA lde uma célula doadora é captada do ambiente externo e in-corporada no genoma de uma célula receptora.

( b ) Transdução ( ) O DNA é transferido de uma célula para outra, através de um vírus bacte-riano.

( ) As bactérias que têm a ca-

pacidade de receber DNA são denominadas de com-petentes.

( c ) Transformação ( ) Formação do pili sexual. ( ) É necessária a presença de

um bacteriófago.

( ) Replicação da região de interesse com a atuação de uma DNA polimerase especial tolerante ao calor, por exemplo, a taq polimerase.

( ) Formação de um híbrido molecular que identifi-ca regiões mutadas no genoma.

( ) Ativação de genes promotores, ocasionando in-tensa replicação gênica.

( ) Desnaturação de todo o DNA envolvido no pro-cesso.

( ) Duplicação de ácidos nucléicos através da DNA e RNA polimerase, após estas moléculas serem separadas por eletroforese em gel de agarose.

( ) Helicoidização do DNA desnaturado a primers.

Dentre os eventos assinalados por você, rela-cione-os por ordem de acontecimentos e expli-que sucintamente, como são realizados.

3. Uma biblioteca de cDNA não apresenta ín-trons, porquea) é construída a partir de DNA genômico. b) os íntrons são retirados in vitro depois

da construção do cDNA. c) é construída com genes isolados do

cromossomo bacteriano.d) é construída a partir de RNAm.e) é construída a partir do filamento mol-

de de DNA.

4. No processo de clonagem gênica, diferen-tes tipos de vetores podem ser utilizados,

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reGulaÇÃo da exPreSSÃo GÊnica eM ProcarionteS e eucarionteS

introduÇÃo A totalidade de genes de uma célula repre-senta uma grande quantidade de informação biológica, a qual não é requisitada, integral-mente e a todo tempo, pela célula. Entretan-to, alguns genes permanecem sempre ativos, como, por exemplo, genes de RNA e de pro-teínas ribossomais, RNA polimerase e histo-nas, dentre outros. Os genes que codificam produtos desse tipo e que são continuamen-te expressos são denominados genes consti-tutivos (mantenedores). Entretanto, o mais freqüentemente observado é a atividade de genes, de acordo com a necessidade da cé-lula, fazendo com que algumas informações biológicas sejam necessárias, o que determina a expressão de alguns genes. De um modo geral, podemos dizer que os organismos são capazes de regular a expressão de seus ge-nes. A regulação gênica pode ocorrer em cin-co níveis principais. São eles: transcricional, processamento do RNA, estabilidade do RNA, traducional e pós-traducional. Abordaremos, prioritariamente, neste capítulo, tanto para procariontes como eucariontes, o nível mais comum de regulação gênica, o transcricional.

Profa. Rita de Cássia de Moura Carga Horária I 15HColaboradoras: Profa. Marília de França Rocha Profa. Maria Teresa Marquim Nogueira Cornélio

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56Saiba MaiS

Genes constitutivos (mantenedor) – gene cuja expressão é essencial à manutenção da função da maioria ou de todos os tipos de células.

obJetiVoS eSPecÍFicoS

• Distinguir os tipos de controle positivo enegativo da expressão gênica;

• Diferenciarosoperonsindutíveisdosope-rons repressíveis;

• Conhecer os principais mecanismos deação do nível de regulação transcricional em eucariontes;

• Diferenciarosmecanismosreguladoresemprocariontes e eucariontes.

1. reGulaÇÃo GÊnica eM ProcarionteS As mudanças ambientais afetam diretamente a expressão de genes em bactérias. Consideran-do a E. coli como exemplo, observamos que o fato de essa bactéria possuir vários genes que codificam diferentes enzimas, capazes de me-tabolizar qualquer um dos diferentes açúca-res, não implica necessariamente na expressão contínua de todos os seus genes que utilizam açúcar. Isso é compreensível, visto que impli-caria um gasto energético desnecessário, pois não faz sentido que a bactéria requisite uma enzima, se no meio não houver oferta imedia-ta de um determinado açúcar. Podemos, en-tão, dizer que as bactérias só expressam genes codificantes de enzimas necessárias, enquanto os demais genes são mantidos inativados.

As enzimas envolvidas em vias catabólicas, como lactose e galactose, são ditas indutíveis, pois ligam a expressão de genes em respos-ta à presença de uma substância no meio. Os genes regulados deste modo são denomina-dos indutíveis, e suas enzimas são chamadas enzimas indutíveis, diferente das enzimas que compõem as vias anabólicas, que, em geral, são repressíveis. Tanto a indução como a re-pressão ocorrem no nível da transcrição, que é considerado o nível de regulação gênica mais comum para procariontes e vírus.

1.1 controle PoSitiVo e neGatiVo da exPreSSÃo GÊnica

A regulação gênica pode ser ligada ou desli-gada por indução ou repressão dos genes, respectivamente. Para que isso ocorra, existem dois mecanismos de controle, tanto positivos como negativos. Em ambos os casos, existe a participação de genes reguladores, os quais codificam produtos que regulam a expressão de outros genes.

No mecanismo de controle positivo, o produ-to do gene regulador liga a expressão de um ou mais genes estruturais. Já o mecanismo de controle negativo precisa do produto do gene regulador para desligar a expressão dos genes estruturais. A figura 1 ilustra os mecanismos de controle positivo e negativo nos sistemas indutíveis e repressíveis.

Saiba MaiS

Genes reguladores – genes cuja função primária é controlar a síntese dos produtos de outros genes.

Genes estruturais – genes que codificam a estrutura primária (sequência de amininoácidos) de um poli-peptídeo.

O produto do gene regulador pode ser deno-minado de ativador, quando este é capaz de ativar a expressão gênica no sistema de con-trole positivo, podendo, também, ser chama-do de repressor, caso reprima a expressão gê-nica no sistema de controle negativo. Para que a proteína reguladora seja capaz de se ligar ao sítio de ligação da proteína reguladora (RBS), o qual fica adjacente ao promotor do(s) gene(s) estrutural(ais), é necessária a presença ou ausência de moléculas efetoras na célula. Essas moléculas são denominadas indutores ou co-repressores, quando estão envolvidas na indução ou repressão, respectivamente.

Desafio da FIX: analise a figura 1 e descreva, sucintamente, os meca-nismos de controle indu-tível negativo e positivo, repressível negativo e po-sitivo.

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Figura 1 - Mecanismos de controle positivo e negativo nos sistemas indutíveis e repressíveis. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Funda-mentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

1.2 oPeronS

Operons são unidades coordenadamente regu-ladas de expressão gênica. O modelo de ope-ron (controle negativo) foi descrito para E. coli por Jacob e Monod, em 1961, através do qual esses pesquisadores explicaram a regulação dos genes que codificam as enzimas necessá-rias para o uso de lactose nessa bactéria. Para compreender como o operon é regulado, é im-portante conhecer os componentes que fazem

parte dele (Figura 2). São eles: um conjunto de genes estruturais; um promotor (sítio de li-gação da RNA polimerase) e um operador (sí-tio de ligação de uma proteína regulatória). A regulação acontece através de dois elementos reguladores, o produto do gene regulador e o operador. Quando o repressor está ligado ao operador, não ocorre a transcrição. A ligação do repressor ao operador, desligando os genes estruturais, como dito anteriormente, depende da presença ou ausência da molécula efetora.

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Figura 2- Componentes do operon. Fonte: Snustad D.P. e Sim-mons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Os operons indutíveis e repressíveis podem ser distinguidos pela ligação apenas do repressor ou de um complexo repressor-efetor ao opera-dor. Quando se trata de um operon indutível, o repressor livre se liga ao operador, desligan-do a transcrição. Já no caso do operon repres-sível, o repressor livre não consegue se ligar ao operador; é preciso a formação do complexo repressor-efetor (co-repressor), que é capaz de se ligar ao operador, impedindo a transcrição (Figura 3).

Figura 3 - Operons indutíveis (a) e repressíveis (b). Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

A B

1.2.1 OPERON DA LACTOSE

O operon da lactose (lac) é, dentre os conheci-dos e estudados em E. coli, o melhor caracteri-zado, e foi, a partir de estudos sobre ele, que Ja-cob e Monod propuseram o modelo do operon.

O operon lac contém um promotor (P), um operador (O) e três genes estruturais: o gene lacZ, que codifica a β-galactosidade; o lacY, que codifica a β-galactosídeo permease e o lacA, que codifica a β-galactosídeo transaceti-lase (Figura 4). Com relação à função das enzi-

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59mas codificadas pelo operon lac, sabemos que a β-galactosídeo permease bombeia a lactose para o interior da célula e que a β-galactosidade quebra a lactose em glicose e galactose. O papel da transacetilase não é bem conhecido.

Figura 4- O operon lac. paginas.terra.com.br/.../aula4_controle.htm

O promotor do operon lac con-tém dois componentes separa-dos. São eles: 1- o sítio de ligação da RNA polimerase; 2- o sítio de ligação de uma proteína chama-da proteína ativadora do catabo-lismo (CAP), cuja função consiste em impedir que o operon lac seja induzido na presença de glicose.

1.2.1.1 INDUÇÃO

O operon lac é do tipo indutível de controle negativo. O gene re-gulador (I) desse operon codifica um repressor, cuja forma ativa corresponde a um tetrâmero contendo quatro cópias do pro-duto do gene I. Na ausência do indutor, o repressor se liga ao operador, impedindo que a RNA polimerase catalise a transcrição dos três genes estruturais. Con-tudo, na presença do indutor (alolactose), é formado o com-plexo repressor-indutor, levan-do à liberação do repressor do operador e subseqüente trans-crição dos genes (Figura 3). A alolactose é derivada da lactose em uma reação catalisada pela β-galactosidade. Para que a alo-lactose esteja presente no meio, é necessário que algumas enzimas dos genes estruturais sejam produzidas no estado não in-duzido, fornecendo, dessa maneira, um nível mínimo de atividade enzimática.

Figura 3 - Operons indutíveis. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

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601.2.1.2 REPRESSÃO CATABÓLICA

A repressão catabólica (ou efeito da glicose) assegura que a glicose seja catabolizada quan-do presente, em detrimento a outras fontes de energia. Por isso, quando a glicose está pre-sente no meio, ela impede a indução do ope-ron lac. Isto ocorre porque a glicose impede a ação de adenilciclase, a enzima que catalisa a formação de uma molécula efetora chama-da adenosina-3’, 5’-monofosfato (cAMP) a partir de ATP. Quando há baixa concentração de cAMP, a proteína CAP não pode se ligar ao promotor do operon lac, portanto não ocorre a ligação da RNA polimerase de forma eficien-te ao promotor, e a taxa de transcrição não excede a 2%. Por outro lado, se a proteína CAP e a molécula efetora cAMP estiverem presentes em concentrações suficientes, elas formarão um complexo, o qual se liga ao promotor, in-duzindo à transcrição do operon lac, exercen-do, neste caso, um controle positivo.

Pesquisa da FIX: um ou-tro operon de E. coli bas-tante estudado é o trip-tofano (trp). Pesquise, na literatura recomendada, a composição e a estru-tura desse operon bem como os níveis de regula-ção de sua expressão.

Desafio da FIX: para ter acesso à animação dos operons lac e trp, acessem o site www.whfree-man.com/pierce. Cliquem na capa do livro: Ge-netics: A conceptual approuch by Benjamin A. Pierce. Genetics 1e. Selecionem Genetics in mo-tion, Chapter 16 - Control of gene expression.

2. reGulaÇÃo GÊnica eM eucarionteSOs mecanismos de regulação gênica em eucarion-tes são mais complexos que os observados em pro-cariontes, e isso se deve, principalmente, por se tra-tar de organismos multicelulares, os quais possuem diferentes tipos de células. Os diferentes genes presentes nessas células sofrem regulação espacial e temporal de sua expressão por meio de diver-sos mecanismos moleculares. Estudaremos alguns

exemplos que ilustram a regulação em nível trans-cricional e de processamento do RNA bem como da organização e ativação/inativação cromossômica.

2.1 tranScricional

A regulação gênica em nível transcricional é mediada por interações DNA-protéina. Estas proteínas são chamadas de fatores de trans-crição, e muitas delas possuem dois domínios quimicamente importantes, um de ligação ao DNA e o outro, de ativação transcricional. Um fator de transcrição pode se ligar a um acentu-ador (enhancer) ou fazer contato com proteí-nas em dois ou mais acentuadores, ou ainda, interagir diretamente com proteínas associa-das ao promotor. Estes contatos e interações podem induzir a mudanças conformacionais nas proteínas, através da ação do domínio de ativação transcricional. Estas mudanças permi-tem que a RNA polimerase inicie a transcrição. Existem vários motivos estruturais resultantes de associações entre aminoácidos, em suas cadeias polipeptídicas. Dentre eles, os mais conhecidos são: zinc finger; hélice-giro-hélice; zíper de leucina e hélice-alça-hélice.

Saiba MaiS

Fatores de transcrição – proteínas responsáveis pela expressão de um gene.

Acentuador – sequência reguladora de DNA que interage com fatores de transcrição específicos, au-mentando a frequência da transcrição de sequências adjacentes.

Os acentuadores são sequências repetidas que apresentam atividade parcial de regulação, em geral são grandes e funcionam de modo histo-específico. Eles apresentam três propriedades básicas:

1. atuam a distâncias grandes; 2. funcionam independente de sua orienta-

ção (normal ou invertida); 3. seus efeitos independem de sua posição

(anterior ou posterior ao gene).

Estas propriedades permitem distinguir os acentuadores dos promotores.

A indução da atividade transcricional também se dá pela ação de fatores ambientais e bioló-gicos. Como exemplo, temos as proteína de

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61choque térmico observadas na Drosophila me-lanogaster e, em muitos outros organismos, as quais têm sua expressão regulada através do estresse provocado pelo calor, que induz a transcrição de genes, que codificam estas proteínas. Em D. melanogaster, por exemplo, a proteína de choque térmico HSP70 (peso molecular de 70 quilodáltons) é codificada quando a temperatura excede 33°C. A trans-crição induzida pelo calor é mediada por um polipeptídio denominado fator de transcrição Heat-Shock (ou de choque térmico). Quando a mosca é estressada pelo calor, esses fatores de transcrição são quimicamente alterados por fosforilação e associam-se a elementos de res-posta heat-shock, promovendo o estímulo da transcrição dos genes hsp70 (Figura 5).

Figura 5- Transcrição de genes de choque térmico HSP70. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

RNAm, que codifica uma proteína reguladora, a proteína SXL. A presença dessa proteína em embriões regula a expressão de um conjunto de genes, fazendo com que esses embriões se desenvolvam como fêmeas. Contudo, nos machos (XY), ocorre a recomposição alternati-va do transcrito Sxl, com inclusão de um éxon com códon finalizador, levando à produção de um polipeptídio sem função reguladora, de modo que, em embriões XY, na ausência da proteína SXL, um conjunto diferente de genes é expresso, fazendo com que os embriões se desenvolvam como machos (Figura 6).

Saiba MaiS

Recomposição alternativa – formas alternativas de re-moção de íntrons e reunião de éxons na geração de RNAm maduro, a partir do transcrito primário, pos-sibilitando a formação de diferentes polipeptídeos oriundos de um mesmo gene.

Figura 6- Recomposição alternativa do gene Sxl em Drosophila. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Como já foi discutido no capítulo 2, todos já sabem que a maioria dos genes eucarióticos possuem íntrons, e que esses íntrons são ex-cisados por um processo chamado recompo-sição. Além deste tipo de recomposição, pode ocorrer, também, a recomposição alternativa. A recomposição alternativa dos transcritos é um modo de regulação gênica, que pode ser utilizada para possibilitar que um único gene codifique diferentes polipeptídeos. Um exem-plo bastante interessante de recomposição al-ternativa pode ser observado durante a expres-são de genes envolvidos na determinação do sexo em Drosophila. O gene regulador do pro-cesso de determinação sexual em Drosophila está localizado no cromossomo X e foi deno-minado sexo-letal (Sxl). Nas fêmeas (XX), esse gene sofre recomposição para produzir um

Pesquisa da FIX: pes-quise, na literatura re-comendada e em sites, exemplos de regulação gênica através da meti-lação e imprinting do DNA.

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622.2 orGaniZaÇÃo croMoSSÔMica x reGulaÇÃo da exPreSSÃo

Quando falamos de expressão gênica e orga-nização cromossômica, estamos nos referindo à possibilidade de alteração da transcrição de genes, a partir de sua transferência para outros sítios dentro do cromossomo. Dentre vários exemplos, vamos detalhar o que pode ocorrer em genes de Drosophila, quando estes, devido a rearranjos cromossômicos dos tipos inversão e translocação, são transferidos de uma região eucromática para uma região heterocromáti-ca, levando ao funcionamento anormal ou, até mesmo, ao silenciamento desses genes. O mau funcionamento dos genes pode levar à mistura de caracteres normais e mutantes no mesmo indíviduo, o que é chamado de variegação de efeito de posição.

Muitos exemplos de variegação de efeito de posição foram descritos em Drosophila, dentre eles o alelo salpicado white é um bom exemplo. Neste caso, o alelo selvagem do gene white mudou de posição devido a uma inversão, que o transferiu de uma região eucromática para uma região heterocromática no cromossomo X.

Esta mudança de posição do gene white al-terou a expressão do gene, levando a um fe-nótipo de olho salpicado. Este exemplo ilustra bem a ação da heterocromatina na repressão da expressão gênica, que pode ocorrer devido ao alto grau de condensação dessa cromatina bem como pela inacessibilidade dessa região à maquinaria transcricional.

2.3 atiVaÇÃo e inatiVaÇÃo croMoSSÔMica

Organismos, cujos mecanismos de determina-ção sexual são do tipo XX/XY ou XX/XO, preci-sam usar estratégias para equalizar a atividade dos genes ligados ao cromossomo X nos dois sexos. Para exemplificar diferentes tipos de ati-vação e inativação do cromossomo X, vamos estudar a hiperativação do X em Drosophila e a inativação do X em fêmeas de mamíferos.

A compensação de dose gênica em Drosophila requer a ação de quatro genes diferentes, os quais são chamados de msl, e seus produtos,

de proteínas MSL. Estes genes são conhecidos também como loci letais de machos, pois se eles sofrerem mutações, o cromossomo X não será hiperativado, e os machos morrerão. Cada uma das quatro proteínas MSL se liga especi-ficamente ao X nos machos e se associam a dois RNAs diferentes, roX1 e roX2, produzidos pelo cromossomo X. Ainda não se conhece detalhadamente como este complexo MSL e RNAs roX hiperativam genes ligados ao X em machos. Contudo, especula-se que o comple-xo facilite a acetilação do X e posterior altera-ção na estrutura da cromatina, intensificando a atividade transcricional do único X do macho (Figura 7a).

Figura 7- Mecanismos de compensação de dose gênica. Fonte: Snustad D.P. e Simmons M.J. (2001) Fundamentos de Genética. Editora Guanabara Koogan.

Quanto à inativação aleatória de um dos cro-mossomos X de fêmeas de mamíferos, esta tem início em um sítio chamado centro de inativação do X (XIC) e, a partir deste ponto, se propaga em sentidos opostos para as ex-tremidades do cromossomo. Entretanto, nem todos os genes do cromossomo X inativado são silenciados, como, por exemplo, o gene XIST, que se encontra dentro do XIC. O gene XIST codifica um RNA funcional, que reveste gradativamente o cromossomo X, reprimindo a maioria dos genes do X inativo (Figura 7b). É importante destacar que no mecanismo de

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63compensação de dose em mamíferos, o X que permanece ativo é paradoxalmente o que re-prime o seu gene XIST.

reViSando conHeciMentoS

1. No modelo do operon, a principal função do gene promotor é:

a) produzir uma proteína repressorab) ser o sítio de ligação para a molécula

indutora.c) ser o sítio de ligação para a RNA poli-

merase.d) produzir uma proteína acentuadora.

2. Você tem conhecimento de que, nas mu-lheres, um dos cromossomos X sofre pro-cesso de inativação, tornando-se quase todo heterocromático. Sobre esse proces-so, analise as afirmativas abaixo e identifi-que as corretas.

I. A inativação de um dos cromossomos X tem início em um sítio específico deno-minado centro de inativação do X (XIC).

II. Um cromossomo X com o alelo XIST

inativo permanece eucromático, en-quanto um cromossomo X com alelo XIST ativo é heterocromatinizado.

III. O gene XIST codifica um RNA não tra-

duzido, o qual permanecerá no núcleo e será fundamental na inativação do X.

IV. No caso das células masculinas, as

quais contêm XY, o gene XIST encon-tra-se ativo.

São corretas apenas as afirmativas:a) I, II e III.b) I, II e IV.c) II, III e IV.d) I e IV.e) II e IV.

3. As afirmativas abaixo referem-se ao pro-cesso de regulação gênica em procarion-

tes, exemplificado através do operon lac-tose de E.coli.

I - Quando a proteína repressora liga-se ao gene operador, a RNA polimerase liga--se ao gene promotor dando início ao pro-cesso de transcrição e, conseqüentemente, dando início à formação das três enzimas necessárias ao metabolismo da lactose.

II - A RNA polimerase, após se ligar ao gene promotor, realiza o processo da transcrição dos três genes estruturais, envolvendo as regiões denominadas de íntrons e éxons.

III - O gene promotor corresponde a uma sequência de nucleotídeos na qual a RNA polimerase reconhece e se encaixa para dar início a transcrição.

IV - O operon Lac contém um promotor (P), um operador (O) e três genes estruturais: o gene lacZ que codifica a β-galactosidase; o lacY que codifica a β-galactosídeo perme-ase e o lacA que codifica a β-galactosídeo transacetilase.

Estão corretas as afirmativas:a) I e IV.b) II e III.c) I e II.d) II e IV.e) I e III.

4. O processo de regulação gênica em pro-cariontes envolve diferentes mecanismos moleculares cujo princípio básico consiste na ativação ou repressão de genes especí-ficos. Ambos os processos se enquadram em duas categorias de controle da regu-lação: positiva e negativa, cada uma apre-sentando particularidades. A seguir, asso-cie as características apresentadas ao tipo de controle de regulação.

(1) Controle positivo

(2) Controle negativo

( ) O produto do gene regulador corresponde a um ativador.

( ) O produto do gene regulador corresponde a um repressor.

( )O produto do gene regulador la-ga-se ao sítio de ligação da pro-teína reguladora, impedindo a transcrição de genes específicos.

( ) O modelo de operon Lac é u exempolo.

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5. Você estudou que tanto em procariontes quanto em eucariontes, fatores ambientais podem induzir a expressão de genes. Em Drosophila melanogaster., por exemplo, a temperatura acima de 33ºc leva à ativação de genes codificadores de proteínas espe-cíficas (proteínas de choque térmico), as quais ajudam no controle da temperatura celular interna. Pesquise sobre esse exem-plo e responda:

a) Qual o peso molecular e a denomina-ção da referida proteína?

b) Qual o gene que a codifica?

c) De que modo esse gene é ativado?

reFerÊnciaS

LEITURA FUNDAMENTAL

SNUSTAD, D. P. e SIMMONS M. J. Fundamen-tos de Genética: Guanabara Koogan S/A, 2000.

LEITURA COMPLEMENTAR

GRIFFITHS, A. J. F.; WESSLER, S. R.; LEWONTIN, R. C.;GELBART, W. M.; SUZUKI, D. T.e MILLER, J. H. Introdução à Genética: Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S/A, 2006.

SITES

www.whfreeman.com/pierce