Bacilos Gram negativos não-fermentadores de glicose

Keite Nogueira

Importância clínica

• As bactérias que compõem o grupo de BGN-NF são consideradas oportunistas.

• Têm grande importância clínica em casos de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente em:

- unidades de terapia intensiva; - pacientes submetidos a procedimentos invasivos; - unidades de queimados; - em infecções do trato respiratório de pacientes com

fibrose cística (FC).

Importância clínica

• Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii estão entre as bactérias mais isoladas em hemoculturas e amostras do trato respiratório de pacientes sob regime de internação hospitalar.

• No entanto, os demais BGN-NF representam um percentual pequeno de isolados, quando comparados com outros agentes etiológicos, mas alguns deles apresentam resistência elevada a vários antimicrobianos (Complexo B. cepacia e S. maltophilia) e são capazes de causar infecções graves.

Importância clínica

• A prevalência de BGN-NF no trato respiratório de pacientes portadores de fibrose cística, tais como Complexo Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia e Achromobacter xylosoxidans subespécie xylosoxidans, tem aumentado nos últimos anos e pode evoluir como colonização persistente e sérios danos pulmonares.

Isolamento

• A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao laboratório clínico após a coleta.

• Em casos onde não é possível o envio ao laboratório em no máximo até 2 horas, manter a amostra refrigerada.

• Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em meio de transporte tipo Cary-Blair.

• Amostras de sangue devem ser imediatamente inoculadas em frascos apropriados para hemocultura. A

• mostra de escarro muito viscoso deve ser previamente tratada com N-acetil-L-cisteína a 0,5%.

Isolamento• Meios de cultura necessários para o primo isolamento:

- Ágar sangue; - Ágar MacConkey; - Meios seletivos para amostras provenientes de pacientes com

fibrose cística, tais como ágar B. cepacia e meios seletivos para Stenotrophomonas maltophilia.

• Observação:• Os meios de cultura devem ser incubados entre 35ºC e 37ºC, em

aerobiose por 24 a 48 horas.• Geralmente apresentam bom crescimento, mas para a cultura

de pacientes com FC, às vezes é necessário incubação por até 5 dias

Identificação

• Triagem inicial • As características das colônias após incubação devem

ser observadas macroscopicamente quanto ao tamanho, forma, consistência, cor, produção de pigmento, presença ou ausência de reações hemolíticas em ágar sangue e presença ou ausência de crescimento em ágar MacConkey. Importante também observar o crescimento com 24 a 72 h de incubação, em meios Trypticase Soy Agar (TSA) e MacConkey, devido ao crescimento lento de alguns BGN-NF.

B. cepacea

S. maltophilia

A. baumannii Shewanella spp.

P. aeruginosa

Identificação        1. A partir de uma colônia isolada, em cultura pura com 24 a 72 horas de crescimento, proceder à semeadura em:•Meio para diagnóstico presuntivo: Triple Sugar Iron (TSI), EPM - Mili ou IAL (Rugai modificado); •Meio sem adição de corantes para verificar pigmento e manter o inóculo: Trypticase Soy Agar (TSA) inclinado ou ágar comum inclinado; •Caldo para verificar o Gram e a motilidade em lâmina: Trypticase Soy Broth (TSB), ou caldo comum. 2. Incubar a 30ºC por 16 a 48 horas e em seguida realizar a coloração de Gram, oxidase e a motilidade em lâmina a fresco.3. O crescimento pode ser observado até 72 horas pelo fato de alguns BGN-NF crescerem mais lentamente.

Identificação

• Semeadura, leitura e interpretação das provas para triagem inicial

A - TSI ou IAL - Semear com agulha, picando até o fundo do tubo, e estriar a superfície do meio.- Leitura:

• TSI: meio permanece inalterado, vermelho (alcalino), no ápice e na base.

• IAL: meio inalterado e crescimento no ápice (pode ser observado pigmento).

IdentificaçãoB - Oxidase

- Umedecer um papel de filtro, colocado no interior de uma placa de Petri, com solução de oxalato de p-aminodimetilanilina a 1% (mais sensível que as tiras);- A partir do crescimento em TSA, esfregar uma alçada da massa bacteriana, no papel de filtro umedecido, com alça descartável ou de platina, pois a alça de níquel-cromo produz uma reação falso-positiva;- A leitura é feita em 15 segundos a 1 minuto.

IdentificaçãoC - Motilidade

- Colocar uma gota do caldo TSB ou outro caldo com crescimento bacteriano (16 a 48 horas a 30ºC) em uma lâmina nova;

- A leitura tem que ser rápida porque os BGN-NF são aeróbios, portanto a sobrevivência dos mesmos na lamínula é curta.- Leitura:

• Motilidade negativa: movimentos vibratórios fracos ou ausência de movimento;

• Motilidade positiva: presença de bactérias cruzando o campo em diferentes direções, sugerindo flagelo polar, ou bactérias girando em torno de si mesmas, sugerindo flagelo peritríqueo.

Identificação

D - Coloração de Gram- Observar a morfologia das células bacterianas, sua disposição e as suas características tintoriais

Identificação• Identificação bioquímica após a triagem inicial

- A partir do tubo de TSA inclinado ou ágar comum, preparar uma suspensão bacteriana em solução salina 0,85% estéril, ou água destilada estéril, correspondente à escala 0,5 - 1,0 de McFarland.

1- OF ou MEVAG• Semeadura: Inocular 2 a 3 gotas da suspensão bacteriana em:• Tubo OF ou MEVAG (Meio para o Estudo da Via de Ataque aos Glicídeos)

adicionados assepticamente com uma solução aquosa estéril de glicose com concentração final de 1%;

• Os tubos são conservados em banho-maria a 56ºC até o momento da inoculação bacteriana;

• Em um dos tubos adiciona-se assepticamente uma camada de vaselina líquida estéril, dando condições anaeróbias.

Identificação2- Provas complementares: tubos OF ou MEVAG adicionados

assepticamente com uma solução aquosa estéril de adonitol, inositol, lactose, maltose, manitol, sacarose, trealose e xilose (concentração final de 1%);

3- Tubos contendo os aminoácidos lisina descarboxilase e arginina de-hidrolase. Os tubos devem ser incubados em condições anaeróbias, colocando-se uma camada de óleo mineral ou vaselina líquida estéril sobre o caldo;

4- Caldo nitrato e caldo nitrato com tubo de Durhan invertido; 5- Pseudomonas ágar P (piocianina) e Pseudomonas ágar F

(fluoresceína ou pioverdina); 6- Caldos TSB: incubar a 4ºC e 42ºC.

Identificação• 7- ágar citrato de Simmons; • 8- Utilizar os resultados do antibiograma para avaliar os discos de

polimixina e imipenem; 9- A partir do crescimento bacteriano em TSA, utilizando a alça de

níquel-cromo ou descartável, semear em:- Meio uréia-indol: inóculo denso;- Placa de ágar cetrimide, em estrias;- Inocular em forma de botão as placas contendo ágar DNase, ágar gelatina e ágar lipase;- Ágar esculina, fazendo estrias na superfície;- TSA com 1% de lactose, fazendo estrias na superfície.

• Após a semeadura, todos os meios são incubados a 30ºC por 16 a 24 horas, com exceção das placas de ágar Müeller-Hinton com os discos de polimixina e imipenem, que serão incubadas a 35ºC, e dos tubos de TSB para verificar o crescimento em diversas temperaturas.

Identificação• MEVAG:

Distinguem-se 3 tipos de bactérias:• Fermentativas: a acidificação é rápida e igual nos dois tubos

(com e sem vaselina), tornando-os amarelos. Ocorre ou não a produção de gás.

• Oxidativas: moderada acidificação na superfície do tubo aberto (amarelo) e pouca ou nenhuma acidificação no tubo fechado (mantém a cor do meio).

• Inertes ou Alcalinas: pouca ou nenhuma acidificação no tubo fechado (mantém a cor do meio) e nenhuma acidificação ou uma alcalinização mais ou menos forte na superfície do tubo aberto (OF produz coloração azulada e MEVAG um rosa mais intenso).

Identificação

• Aminoácidos lisina, arginina:Os tubos testes devem ser comparados com o tubo controle negativo para interpretação dos resultados. A leitura pode ser realizada até 72 h, se não positivar antes.

• Reação positiva: intensificação da cor púrpura do meio: indica uma reação positiva devido à liberação de enzimas por descarboxilação / hidrólise com aumento de pH do meio.

• Reação negativa: o tubo mantém a cor púrpura original.

Identificação• Redução de nitrato:• O teste é revelado através da adição de 3 gotas do reativo de Griss A com 3 gotas do

reativo de Griss B no caldo nitrato.

• O desenvolvimento de uma coloração vermelha dentro de 1 a 2 minutos indica a presença de nitrito e, portanto, um teste positivo.

• Não ocorrendo a coloração vermelha: • O nitrato não foi reduzido, ou • O nitrato foi reduzido a nitrito e este, reduzido a gás nitrogênio livre. • Nestes casos, adiciona-se uma pitada de zinco em pó. Se o nitrato ainda estiver presente,

este será reduzido pelo zinco e uma coloração vermelha aparecerá dentro de 5 a 10 minutos, indicando que não houve a redução de nitrato a nitrito, portanto teste negativo. Se ocorrer a redução de nitrato a nitrito e este a nitrogênio livre, a cor não se altera.

• Nitrato com Durhan: • Pode-se observar a produção ou não de gás no interior do tubo de Durhan invertido.

Identificação• Pseudomonas ágar P e Pseudomonas ágar F:• Estes meios se destinam a favorecer a síntese da piocianina (ágar

P) e da pioverdina ou fluoresceína (ágar F). A piocianina se manifesta corando o meio de cultura de azul-esverdeado, enquanto que a pioverdina o cora em verde fluorescente;

• Pseudomonas aeruginosa é a única espécie conhecida de bactéria que produz a piocianina;

• Fluoresceína ou pioverdina (F) pode ser produzida por P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida.

• Para confirmar a presença da piocianina, pode-se colocar de 1 mL a 2 mL de clorofórmio em contato com o meio de cultura. A piocianina é solúvel em clorofórmio e o meio torna-se azul. A pioverdina é um pigmento não solúvel em clorofórmio.

Identificação

Caldo TSB para verificar o crescimento a 4ºC e 42ºC:

• Reação positiva: ocorre a turvação do meio. • Reação negativa: não se observa a turvação do

meio.

• Ágar citrato de Simmons:• O teste do citrato de Simmons é indicado para determinar a

capacidade de certas bactérias de utilizarem o citrato como única fonte de carbono para o seu metabolismo;

• O ágar citrato de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, fosfato de amônia como única fonte de nitrogênio e o azul de bromotimol como indicador de pH;

• Quando a bactéria utiliza o citrato, este é removido do meio e CO2 é liberado. O CO2 combina-se com o sódio, do citrato de sódio e água para formar carbonato de sódio, um produto alcalino. Isto aumenta o pH, mudando a cor do meio de verde (negativo) para azul (positivo).

• Discos de polimixina e imipenem:• Polimixina: ausência do halo, Complexo

Burkholderia cepacia é intrinsecamente resistente;

• Imipenem: ausência do halo, Stenotrophomonas maltophilia é intrinsecamente resistente.

• Meio uréia-indol:• Esse meio permite a pesquisa simultânea da urease e da produção de indol:• A atividade da urease é detectada pelo crescimento da bactéria em meio

contendo uréia e usando um indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a uréia é hidrolisada, a amônia se acumula no meio e o torna alcalino. Ocorre aumento no pH, causando a mudança de cor no indicador de amarelo para rosa pink, indicando uma reação positiva.A ausência de mudança na coloração indica um teste negativo (Figura 17);

• O teste do indol determina a capacidade de certas bactérias que possuem a enzima triptofanase de degradar o triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amônia. A presença de indol pode ser detectada pela adição do Reativo de Kovacs, ocorrendo a formação de um anel de coloração vermelho na superfície do meio, indicando uma reação positiva. A ausência de mudança de cor indica que o triptofano não foi hidrolisado e, portanto, a reação é negativa conforme observado na Figura 18.

• Hidrólise da esculina:• O produto hidrolisado reage com o composto férrico

do meio proporcionando um precipitado negro intenso nas provas positivas, podendo ser observado a partir de 6 horas de incubação até 48 horas;

• A coloração castanho-escura é considerada prova negativa;

• A cor é devida à produção de pigmentos por alguns BGN-NF.

• Hidrólise da gelatina:• O teste determina a habilidade de um organismo

produzir enzimas proteolíticas, a gelatinase que liquefazem a gelatina;

• No teste positivo, observa-se um halo leitoso ao redor do inóculo. Se houver dificuldade de visualização do halo, deve-se acrescentar 1 mL a 2 mL de reativo de Frazier ou HCl 1N, banhar a placa e retirar o reativo. Nota-se uma zona transparente ao redor do inóculo produtor de gelatinase

Identificação

• Hidrólise do Tween 80 – Pesquisa da lipase:• No teste positivo, observa-se uma zona de

precipitação ao redor do inóculo.

Identificação• Ágar DNase:• Teste para determinar a capacidade de um organismo

produzir a enzima DNase, que é capaz de degradar o DNA; • Este meio pode conter um corante metacromático

denominado Azul de Toluidina O (TBO). Quando o DNA é hidrolisado, o TBO é complexado, resultando numa coloração pink ao redor do inóculo, determinando uma reação positiva;

• Nos meios que não contêm o corante, deve-se adicionar HCl 1N. A reação positiva apresenta um halo transparente em volta do inóculo, enquanto o restante do meio fica leitoso.

ONPG

• TSA com 1% de lactose - Prova da ß galactosidase – ONPG:

• A presença ou ausência da atividade da enzima ß-galactosidase é demonstrada quando se emprega o composto orgânico – ONPG.

• Numa reação positiva, o reativo ONPG que é incolor, é hidrolizado liberando um composto cromogênico amarelo, o orto-nitrofenil.

Identificação

• Coloração de flagelos é uma prova complementar utilizada, se necessário.

• Para a visualização da disposição e número de flagelos (polar único, polar >1, peritríqueo).

Identificação• Principais semelhanças entre S. maltophilia e Complexo B. cepacia: • Reação de oxidase lentamente positiva; • Móveis; • Lisina positiva; • Hidrólise da esculina variável. • Principais diferenças:

- S. maltophilia • Produzem DNase; • Imipenem R; • Oxidam a maltose rapidamente (antes da glicose). • - Complexo B. cepacia• Não produzem DNase; • Polimixina R; • Oxidam a maioria dos açúcares.

Resistência

• Em geral, os BGN-NF apresentam uma alta resistência aos antimicrobianos.

• Os principais problemas em BGN-NF são a resistência aos carbapenêmicos, que pode ser devida a diversos mecanismos de resistência, tais como:

• Produção de ß-lactamases (metalo-ß-lactamases); • Perda de porina; • Bomba de efluxo

Resistência• P. aeruginosa produtora de metalo-ß-lactamases tem sido

detectada em diversas partes do mundo. • Complexo B. cepacia é intrinsecamente resistente a agentes

antimicrobianos, incluindo ß-lactâmicos, exceto carbapenêmicos

• S. maltophilia é intrinsecamente resistente aos ß-lactâmicos, inclusive carbapenêmicos, devido à produção de ß-lactamases e baixa permeabilidade da membrana celular.

• Um dos grandes problemas no ambiente hospitalar é a multi-resistência apresentada por algumas cepas de Acinetobacter baumannii, alguns sensíveis apenas à polimixina.

• Chryseobacterium também apresentam resistência à polimixina B.