avanços clínicos em fígados bioartificiais. suas características... fígado

Avanços clínicos

em fígados

bioartificiais

Suas características...

Fígado

... e funções:

1. Metabolismo de hidratos de carbono, lípidos e proteínas

2. Degradação de drogas e Inactivação de hormonas

3. Excreção da Bilirrubina

4. Depósito de vitaminas e minerais

5. Activação da vitamina D

FígadoFígado

A falha hepática é uma consequência final de doenças do fígado. Esta falha pode ser classificada como:

• Falha hepática aguda (ALF)

• Falha hepática crónica

Termo usado quando a falha ocorre em pessoas saudáveis comfígados normais.

Termo usado quando há perda da função hepática devido a uma doença hepática crónica.

Ex.: Facada.

Ex.: Cirrose.

Formas de sobrevivência face à falha hepática:

• Transplante de fígado

Prós:É um método utilizado em ALF e em falha hepática crónica, tendo a percentagem de sobrevivência aumentado.Contras:No entanto é um processo que nem sempre está disponível.

Alternativas ao transplante de fígado em investigação:

• Transplante de células isoladas

• Engenharia de tecido de estruturas implantáveis

• Transplante de tecido transgénico (animal)

É um dos métodos mais utilizados em certo tipo de doenças. Exemplo: transplante de hepatócitos.

• Aparelhos de substituição da função hepática bioartificialmente e extracorporais

Existem muito poucos casos de sucesso.

Aparelhos ou técnicas de substituição da função hepática não biológicos e extracorporais:

• Hemodiálise

• Plasmaferése (Plasma Exchange)

• Hemoperfusão com carvão, resina ou enzimas imobilizadoras

Aparelhos de substituição da função hepática bioartificialmente e extracorporais:

Este aparelhos são usados à mais de 40 anos e são usados principalmente como:

• sistemas temporários, antes de transplantes para assegurar parte da função do fígado.

• Facilitar a regeneração numa ALF.

• Ajudar na recuperação de uma descompensação hepática aguda.

Aparelhos de substituição da função hepática bioartificiais e extracorporais:

• Os hepatócitos possuem inúmeras funções, entre elas a de síntese, metabolismo, desintoxicação e excreção da bílis...

Algumas dificuldades:

• ... assim como algumas que são desconhecidas ou são indetectáveis, mas que são importantes no metabolismo.

Temas em análise:

• Escolha de componentes celulares

• Determinação do fenótipo dos hepatócitos

• Design Bioreaccional

• Regulação e Segurança

• Experiências Clínicas

Tentativa de criar um aparelho que simule ou suporte um ambiente biológico.

Escolha de componentes celulares:

• Células Primárias

Extraídas directamente de um dador, são capazes de se dividir uma ou duas vezes em cultura. Sobrevivem durante algum tempo desde que em boas condições, acabando por morrer de “velhice”.

• Immortalized Cells ou Transformed Cells

• Células tumorais

Ao contrário das células primárias, estas continuam a crescer, devido a alterações das propriedades de crescimento celular.

• Células Estaminais

Estas células devem ser estudadas tendo em conta a sua viabilidade, potencial de interacções adversas e na eficácia em criar uma função específica das células do fígado.

Células Primárias animais:

Foram estudadas células de porcos, coelhos, cães e roedores.Apesar de se ter conseguido poucas informações relativamente à manutenção da função das células hepáticas in vitro, tem-se conseguido manter estável, por exemplo a secreção da albumina.Em geral, sabe-se que são precisas condições específicas para manter o fenótipo hepático in vitro.

Células Primárias humanas:

Estas células seriam o ideal para estudo, no entanto a sua reserva é limitada. Tem sido usado em aplicações BAL e em transplante de hepatócitos. Estas células proliferam facilmente in vivo paradoxalmente ao que acontece em cultura.

Immortalized Cells:

Descritas como o resultado de uma cultura de um gel de colagénios.

Células derivadas de tumores hepáticos têm sido usados em práticas clínicas, apesar de o risco de transmissão oncogénica ser ainda uma incerteza. No entanto tem havido um esforço no sentido de controlar e aumentar a segurança do uso destas células através de:

sensores de temperatura;introdução de “genes suícidas”;remoção completa dos mediadores oncogénicos.

Células tumorais:

Entre elas, consideram-se: células estaminais embrionárias, células de fígado adulto e células transdiferenciáveis não hepáticas.

Células estaminais:

Células Primárias

Células derivadas de tumores

Células estaminais

Estabilização do fenótipo do hepatócitoEstabilização do fenótipo do hepatócito

Problemas na utilização de hepatócitos primários:Problemas na utilização de hepatócitos primários: Células dependentes de ancoragem;Células dependentes de ancoragem; Difíceis de manter Difíceis de manter in vitroin vitro;;

……e:e: Quando enzimaticamente isoladas e cultivadas em mono-Quando enzimaticamente isoladas e cultivadas em mono-

camada ou cultura de suspensão rapidamente perdem a sua camada ou cultura de suspensão rapidamente perdem a sua morfologia de fígado adulto e as funções enquanto morfologia de fígado adulto e as funções enquanto diferenciadas;diferenciadas;

…….assim muitos investigadores têm procurado inspiração na .assim muitos investigadores têm procurado inspiração na micro-estrutura do fígado para modelos de cultura que micro-estrutura do fígado para modelos de cultura que substituam as estruturas que se perdem do micro-sistema do substituam as estruturas que se perdem do micro-sistema do hepatócito hepatócito in vivoin vivo;;


Métodos mais comuns envolvem:Métodos mais comuns envolvem: Manipulação do ambiente da matriz extra-celular;Manipulação do ambiente da matriz extra-celular;

MediaMedia composição composição;;

Promoção da interacção intercelular (homotípicas e Promoção da interacção intercelular (homotípicas e heterotípicas);heterotípicas);


Manipulação do ambiente da matriz extra-celular:Manipulação do ambiente da matriz extra-celular: Este método envolve variações na composição e topologia Este método envolve variações na composição e topologia

das células;das células; Foi desenvolvida a cultura Sanduíche para imitar o micro-Foi desenvolvida a cultura Sanduíche para imitar o micro-

sistema do hepatócito adulto onde as células ficam entre sistema do hepatócito adulto onde as células ficam entre matrizes extra-celular no espaço de Disse;matrizes extra-celular no espaço de Disse;

Células nesta configuração expressam muitas funções Células nesta configuração expressam muitas funções específicas do fígado de forma estável. Contudo, tentativas específicas do fígado de forma estável. Contudo, tentativas para avançar neste método de cultura depararam-se com para avançar neste método de cultura depararam-se com um sucesso muito limitado até agora;um sucesso muito limitado até agora;


MediaMedia composição: composição: Modificações, por exemplo a nível hormonal, definidas Modificações, por exemplo a nível hormonal, definidas

mediamedia, e adição de baixas concentrações de , e adição de baixas concentrações de dimethyldimethyl sulfoxidesulfoxide ou ou dexamethasonedexamethasone são conhecidas por ajudar a são conhecidas por ajudar a estabilizar a morfologia, sobrevivência e funções estabilizar a morfologia, sobrevivência e funções específicas do fígado, do hepatócito;específicas do fígado, do hepatócito;

Contudo, estes métodos não são aplicáveis ao design do Contudo, estes métodos não são aplicáveis ao design do BAL, devido à exposição sistémica dos indivíduos a estes BAL, devido à exposição sistémica dos indivíduos a estes especializados e não-fisiológicos componentes especializados e não-fisiológicos componentes mediamedia;;


Finalmente…Finalmente…

Promoção da interacção intercelular (homotípicas e Promoção da interacção intercelular (homotípicas e heterotípicas):heterotípicas):

As funções específicas do fígado encontram-se As funções específicas do fígado encontram-se estabilizadas nos hepatócitos que estão co-cultivadas com estabilizadas nos hepatócitos que estão co-cultivadas com células não-parenquimais (células não-parenquimais (nonparenchymalnonparenchymal) (interacções ) (interacções heterotípicas);heterotípicas);

Apesar de os mecanismos moleculares precisos que se Apesar de os mecanismos moleculares precisos que se encontram por trás do efeito de co-cultura não serem encontram por trás do efeito de co-cultura não serem conhecidos, é provável que esteja envolvido um conhecidos, é provável que esteja envolvido um mecanismo de estímulo altamente conservado (ao longo da mecanismo de estímulo altamente conservado (ao longo da evolução);evolução);

Embora este conceito não tenha sido ainda aplicado a um Embora este conceito não tenha sido ainda aplicado a um aparelho BAL clínico, merece a nossa consideração;aparelho BAL clínico, merece a nossa consideração;

Design do bio-reactorDesign do bio-reactor

Existem quatro tipos principais de bio-reactores:Existem quatro tipos principais de bio-reactores: Fibra oca (Fibra oca (hollow fibrehollow fibre););

Placa achatada e mono-camada (Placa achatada e mono-camada (flate plateflate plate););

Camadas ou folhetos perfurados (Camadas ou folhetos perfurados (perfused beds or perfused beds or saffoldssaffolds););

Camadas com células encapsuladas ou suspensas (Camadas com células encapsuladas ou suspensas (beds beds with encapsulated or suspended cellswith encapsulated or suspended cells););

Design do bio-reactorDesign do bio-reactor

Um BAL bem sucedido e clinicamente eficaz deveria satisfazer Um BAL bem sucedido e clinicamente eficaz deveria satisfazer alguns critérios importantes:alguns critérios importantes:

Transporte bidireccional de massa adequado;Transporte bidireccional de massa adequado;

Manutenção de viabilidade e função da célula;Manutenção de viabilidade e função da célula;

Potencial para avanços para níveis terapêuticos;Potencial para avanços para níveis terapêuticos;

Regulação e SegurançaRegulação e Segurança

Devido á sua natureza híbrida, a classificação Devido á sua natureza híbrida, a classificação dos BAL quanto ao tipo tem sido alterada.dos BAL quanto ao tipo tem sido alterada.

Originalmente eram classificados como aparelhos.

Actualmente, devido á sua componente biológica e aos seus produtos de secreção, são classificados como dispositivos biológicos e fármacos.

Novas linhas de orientação consensuais para os BAL estão a ser desenvolvidas por um conjunto de organizações.

As preocupações de segurança para os BAL são as mesmas que As preocupações de segurança para os BAL são as mesmas que para outras terapias celulares e que incluem reacções de para outras terapias celulares e que incluem reacções de resistência a antigénios desconhecidos, xenozoonose e células resistência a antigénios desconhecidos, xenozoonose e células cancerígenas.cancerígenas.


Anticorpos para o antigénio da porcina foram encontrados em pacientes tratados com recurso aos BAL, ainda que o impacto clínico deste facto não seja claro.No entanto, este factor de “potencial” rejeição pode ganhar relevância ao serem aplicados sucessivos tratamentos recorrendo a este método.


Dispositivos BAL contendo células humanas ou linhas de produção celular será mais apropriado para tratamentos clínicos repetitivos.

A colocação de filtros “downstream”, para garantir a remoção das células imortalizadas do fluido circulatório foi aceite como uma boa medida de precaução.

Infecções XenozoonóticasInfecções Xenozoonóticas

Foi descoberto no genoma dos porcos um agente – “PERV” -, que poderá ser perigoso em termos infecciosos.

No entanto, apesar de demonstrado, in vitro, que poderia infectar o tecido humano, pacientes que se submeteram a tratamentos com um dispositivo BAL baseado em porcina, tiveram todos resultado negativo num teste de detecção de infecção por PERV

Este resultado sugere que os humanos não são contagiáveis por este agente.

Estrutura dos Testes ClínicosEstrutura dos Testes Clínicos

Tem sido posta á prova por alguns factores, entre os quais:

1 - A possível variação do “percurso” da falha de função do fígado, etiologicamente dependente

2 - A escolha do parâmetro de controlo

Tipicamente, os pacientes são dispostos aleatoriamente em relação a uma terapia médica padrão.


No entanto, existem diferenças claras entre uma perfusão extracorporal e algum tipo de terapia não invasiva.

Por exemplo, existem observações irrisórias de melhoramentos em termos de estabilidade hemodinâmica devido a acumulação de citocina em superfícies inorgânicas de circuitos extracorporais, para além das complicações que podem resultar deste tipo de intervenção.


Uma alternativa é utilizar um controlo não biológico como uma (diálise venosa contínua), muito usada em pacientes com falha da função hepato-renal.

Este tipo de controlo permite também monitorizar a temperatura central do corpo, o que poderá ser bastante relevante, uma vez que descobertas recentes sugerem que a hipotermia pode baixar a pressão no crânio e reduzir edemas cerebrais.


3 – A escolha do “end point”. 3 – A escolha do “end point”.

Os testes actuais tem usado “end points” de 30-dias Os testes actuais tem usado “end points” de 30-dias de sobrevivência e 30-dias de sobrevivência com de sobrevivência e 30-dias de sobrevivência com transplantação livre.transplantação livre.

No entanto existem alguns “end points” secundários No entanto existem alguns “end points” secundários que podem ser considerados e que consistem na que podem ser considerados e que consistem na melhoria da pressão de perfusão cerebral e do grau de melhoria da pressão de perfusão cerebral e do grau de encefalopatia.encefalopatia.


Pelo facto de que os pacientes ALF tem um Pelo facto de que os pacientes ALF tem um determinado intervalo de tempo onde podem ser determinado intervalo de tempo onde podem ser subtmetidos a transplante, mas dependendo de subtmetidos a transplante, mas dependendo de alguns critérios esse transplante pode ser feito num alguns critérios esse transplante pode ser feito num curto espaço de tempo, podem ser geradas algumas curto espaço de tempo, podem ser geradas algumas ambiguidades nos testes e obter-se resultados pouco ambiguidades nos testes e obter-se resultados pouco esperados.esperados.

Uma potencial alternativa é estudar os 30 dias de Uma potencial alternativa é estudar os 30 dias de sobrevivência e os “end-points” secundários em sobrevivência e os “end-points” secundários em pacientes não candidatos a transplantes e que, por pacientes não candidatos a transplantes e que, por consequência, avaliam de uma forma realista o consequência, avaliam de uma forma realista o potencial dos BAL no suporte ás funções do fígado.potencial dos BAL no suporte ás funções do fígado.

Testes Clínicos Progressivos em Aparelhos Testes Clínicos Progressivos em Aparelhos BioArtificiais Extracorporais (BAL)BioArtificiais Extracorporais (BAL)

Embora os BAL não tenham obtido aprovação por parte da Embora os BAL não tenham obtido aprovação por parte da FDA para uso no tratamento de patologias do fígado, FDA para uso no tratamento de patologias do fígado, alguns testes clínicos já estão a ser realizados;alguns testes clínicos já estão a ser realizados;

ALF – Acute Liver Failure

BAL – Bioartificial Liver devices

Quais as dificuldades encontradas?Quais as dificuldades encontradas?

Uma dificuldade que aparece ao analisarmos os dados Uma dificuldade que aparece ao analisarmos os dados clínicos é a incapacidade para determinar o papel dos clínicos é a incapacidade para determinar o papel dos hepatócitos funcionais em oposição a perfurações hepatócitos funcionais em oposição a perfurações extracorporais a si mesmo, dado que a estrutura de alguns extracorporais a si mesmo, dado que a estrutura de alguns BAL incorporam filtrações de carvão vegetal;BAL incorporam filtrações de carvão vegetal;

Qual a solução ideal?Qual a solução ideal?

Idealmente, a comparação deve ser feita entre Idealmente, a comparação deve ser feita entre a filtração de carvão vegetal isolada, células a filtração de carvão vegetal isolada, células mortas ou não-hepatócitas, uma vez que estas mortas ou não-hepatócitas, uma vez que estas últimas concedem benefícios em termos de últimas concedem benefícios em termos de sobrevivência em alguns modelos animais de sobrevivência em alguns modelos animais de ALF;ALF;

Nestes dados, podemos ainda encontrar alguns pontos Nestes dados, podemos ainda encontrar alguns pontos relevantes:relevantes:

- As células deverão ser congeladas?

- Deve o dispositivo ser perfurado com plasma ou

todo com sangue?

Qual é o papel da heparina VsVs o da anticoagulação com citrato ?

Estas questões são de uma importância crucial tanto para o bem-estar dos pacientes como para a sobrevivência dos hepatócitos

no dispositivo

Por um lado, ao crio-preservarmos as células Por um lado, ao crio-preservarmos as células estamos a limitá-las em termos funcionaisestamos a limitá-las em termos funcionais

No entanto, por outro lado, estamos a ganhar No entanto, por outro lado, estamos a ganhar flexibilidade em termos de tempo e de flexibilidade em termos de tempo e de planeamento de possíveis terapiasplaneamento de possíveis terapias

Deverão as células ser congeladas?Deverão as células ser congeladas?

Deve o dispositivo ser pulverizado com Deve o dispositivo ser pulverizado com plasma ou todo com sangue? plasma ou todo com sangue?

O uso de sangue tem a vantagem de podermos O uso de sangue tem a vantagem de podermos utilizar os eritrócitos como veículos de entrega de utilizar os eritrócitos como veículos de entrega de oxigénio para os BAL;oxigénio para os BAL;

No entanto, a activação de leucócitos e No entanto, a activação de leucócitos e consequentemente a danificação da célula pode consequentemente a danificação da célula pode ocorrer;ocorrer;

De forma oposta, a plasmaferese e perfuração De forma oposta, a plasmaferese e perfuração com plasma preserva a viabilidade das células com plasma preserva a viabilidade das células hematopoiéticas;hematopoiéticas;

No entanto, a solubilidade do oxigénio no plasma No entanto, a solubilidade do oxigénio no plasma é bastante reduzida;é bastante reduzida;

Qual é o papel da heparina Qual é o papel da heparina VsVs o da o da anticoagulação com citrato ?anticoagulação com citrato ?

Mostrou-se em alguns estudos que, a Mostrou-se em alguns estudos que, a anticoagulação usando a heparina pode causar anticoagulação usando a heparina pode causar acumulação lipídica e danos em hepatócitos acumulação lipídica e danos em hepatócitos fenotipicamente estáveis;fenotipicamente estáveis;

ConclusãoConclusão

Apesar de estes testes não comprovarem a Apesar de estes testes não comprovarem a eficácia dos dispositivos BAL, os conhecimentos eficácia dos dispositivos BAL, os conhecimentos obtidos permitirão uma melhor abordagem no obtidos permitirão uma melhor abordagem no futuro desta temática, causando um impacto futuro desta temática, causando um impacto positivo na próxima geração de dispositivos BAL;positivo na próxima geração de dispositivos BAL;

SumárioSumário

Com o crescente aumento da incidência de Com o crescente aumento da incidência de doenças no fígado e a falta de doação de órgãos, doenças no fígado e a falta de doação de órgãos, terapias baseadas nas células (hepatócitos) estão terapias baseadas nas células (hepatócitos) estão a sobressair cada vez mais como um tratamento a sobressair cada vez mais como um tratamento possível;possível;

Actualmente, muitos dispositivos BAL estão em Actualmente, muitos dispositivos BAL estão em avaliação clínica;avaliação clínica;

O Futuro dos dispositivos BALO Futuro dos dispositivos BAL

Dependerá da escolha e estabilização dos Dependerá da escolha e estabilização dos componentes celulares;componentes celulares;

Embora as linhas de produção celular ofereçam Embora as linhas de produção celular ofereçam uma fonte celular ilimitada, hepatócitos primários uma fonte celular ilimitada, hepatócitos primários são preferíveis devido à sua ampla expressão em são preferíveis devido à sua ampla expressão em termos de especificidade de funções do fígado;termos de especificidade de funções do fígado;

Células primárias xenogénicas existem em Células primárias xenogénicas existem em quantidades enormes, mas preocupações de quantidades enormes, mas preocupações de ordem imunológica e infecciosa conduzem ao uso ordem imunológica e infecciosa conduzem ao uso de células humanas ou derivadas;de células humanas ou derivadas;

Para melhorar e manter a funcionalidade dos hepatócitos Para melhorar e manter a funcionalidade dos hepatócitos primários, a estrutura do bio-reactor deve suportar as primários, a estrutura do bio-reactor deve suportar as ligações e interacções celulares, interacções da matriz ligações e interacções celulares, interacções da matriz celular e potencial para novos avanços;celular e potencial para novos avanços;

Enquanto a segurança dos dispositivos BAL já foi Enquanto a segurança dos dispositivos BAL já foi estabelecida, não existem padrões uniformes de eficácia, estabelecida, não existem padrões uniformes de eficácia, que varia com a etiologia da falência do fígado;que varia com a etiologia da falência do fígado;

Um consenso a nível da estrutura dos testes clínicos é Um consenso a nível da estrutura dos testes clínicos é necessário!necessário!

Além disso, uma melhor interligação entre o processo de Além disso, uma melhor interligação entre o processo de regeneração do fígado e as terapias baseadas em regeneração do fígado e as terapias baseadas em dispositivos BAL serão fulcrais no sentido de se optimizar a dispositivos BAL serão fulcrais no sentido de se optimizar a implementação desta técnica;implementação desta técnica;

O que há ainda a melhorar?O que há ainda a melhorar?

avanços clínicos em fígados bioartificiais. suas características... fígado

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