avaliação da presença de micro-organismos e...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

ELOÁ CRISTINA BÍCEGO PEREIRA

Avaliação da presença de micro-organismos e suscetibilidade

antimicrobiana de Enterococcus faecalis isolados de canais radiculares de

dentes submetidos ao retratamento endodôntico por indicação protética

Piracicaba

2017

ELOÁ CRISTINA BÍCEGO PEREIRA

Avaliação da presença de micro-organismos e suscetibilidade

antimicrobiana de Enterococcus faecalis isolados de canais radiculares de

dentes submetidos ao retratamento endodôntico por indicação protética

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra em

Clínica Odontológica, na Área de Endodontia.

Orientadora: Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ELOÁ CRISTINA BÍCEGO PEREIRA ORIENTADA PELA PROFA. DRA. BRENDA PAULA FIGUEIREDO DE ALMEIDA GOMES

Piracicaba

2017

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em

sessão pública realizada em 21 de Fevereiro de 2017, considerou a candidata ELOÁ

CRISTINA BÍCEGO PEREIRA aprovada.

PROFa. DRa. BRENDA PAULA FIGUEIREDO DE ALMEIDA GOMES

PROF. DR. CARLOS AUGUSTO DE MORAIS SOUTO PANTOJA

PROF. DR. ALEXANDRE AUGUSTO ZAIA

A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo

de vida acadêmica do aluno.

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho especialmente a Deus, que possibilitou todos estes

acontecimentos em minha vida.

AOS MEUS PONTOS DE APOIO

Aos meus pais Luis Estevão Pereira e Ersone Antônia Bícego Pereira. Por todo o

amor e apoio em todos os momentos e estiveram presentes em todas as minhas

conquistas, sempre me incentivando. Sem eles nada na minha vida seria possível.

Obrigada por todo amor e carinho.

Aos meus irmãos Estéfani Maiolini Bícego Pereira e Luis Maiolini Bícego Pereira. O

apoio e momentos de descontração são essenciais para nossa jornada. Obrigada pelo

companheirismo e compreensão em todos os momentos.

Aos meus avós Gerson Bícego, Edna Luciano Bícego e Silvia Maiolini Pereira. Que

me deram tanto amor e exemplo de fé e perseverança na vida. Obrigada por estarem

tão presentes em minha vida.

Agradeço a toda minha família, por todo o suporte, amor, carinho. Amo muito vocês.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À minha orientadora Profª Drª Brenda Paula Figueiredo De

Almeida Gomes. Agradeço por ter me escolhido como orientada, por ter

me ensinado tanto e por estar sempre me proporcionando tantas

oportunidades de crescimento. A senhora é uma pessoa iluminada, sempre

em busca de atualização, nos servindo de exemplo na vida científica e

pessoal. Temos muito que aprender com a senhora. Obrigada pela

dedicação do seu tempo e por ter me oferecido suporte nos momentos que

precisava. Sou muito grata e orgulhosa por tê-la como orientadora.

AGRADECIMENTOS

À Direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de

Campinas, na pessoa do seu diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.

A CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado.

À Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado Tabchoury coordenadora do Programa de

Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e a Profa Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz,

coordenadora do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.

Aos professores da área de Endodontia, profa. Dra. Adriana de Jesus Soares, prof.

Dr. Alexandre Augusto Zaia, profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida

Gomes, prof. Dr. Caio Cezar Randi Ferraz e prof. Dr. José Flávio Affonso de

Almeida, por serem importantes para a minha formação durante a minha trajetória

acadêmica.

Aos funcionários Ana Godoy e Maicon Ricardo Zieberg Passini por estarem sempre

presentes e me ajudarem, assim como a Tiffany Abreu.

À Ana Paula Carone, Claudinéia Prata Pradela, Érica A. Pinho Sinhoreti, Lucas de

Almeida Cruz e Raquel Q. Marcondes Cesar, profissionais da secretaria da Pós-

Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de

Campinas.

A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade

Estadual de Campinas.

Aos colegas de mestrado da Endodontia, Augusto Rodrigues Lima, Bruna Alves T.

Ueno, Bruna Milaré Angelieri, Diogo Henrique da Silva, Flávia M. Saavedra e

Paula, Humberto Ramah Menezes de Matos, Jaqueline Mafra Lazzari Priscila

Amanda Francisco e Rafaela Casadei Chapola.

Aos colegas de doutorado da Endodontia Aline Cristine Gomes, Ana Carolina C. L.

de Cerqueira Neto, Aniele Carvalho Lacerda, Andréa Cardoso Pereira, Érika

Manuela Asteria Clavijo, Felipe Nogueira Anacleto, Maria Cristina Coelho de

Carvalho e Marlos Ribeiro Barbosa.

As minhas amigas Eloisa de Souza, Marina dos Santos Faria, Amanda Farias

Gomes, Caroline Nieto, Fernanda Maria Mazoni dos Reis, Daniela Cibim, Bruna

Massoni, Cassia Cestari Toia, Jafra Furtado, Suelem Chasse, por terem feito de

toda esta jornada mais feliz, com muitos momentos de descontração e companheirismo.

Aos alunos de Iniciação Cientifica Pedro Luis Gusmão, Rafaela Rocha Van

Linschoten, Flávia Salviano Alves e a Jéssica Rodrigues, por trabalharem comigo e

serem meus amigos. Sinto que crescemos juntos a cada dia.

Ao Marlos Barbosa Ribeiro pela sua amizade, ajuda e conselhos. Obrigada por me

ajudar a lapidar o meu trabalho.

Ao meu amigo Rodrigo Arruda Vasconcelos, obrigada pela sua amizade e por toda a

sua ajuda.

A todos os pacientes que confiaram em meu trabalho e colaboraram com minha

pesquisa, sem eles nada seria possível.

Aos professores que participaram da minha banca de qualificação, Dr. José Flávio

Affonso de Almeida, Dra. Fernanda Graziela Côrrea Signoretti, Dra. Janaina

Orlandi Sardi, por contribuirem nas correções da minha dissertação de mestrado.

A todos de que de alguma forma participaram desta minha caminhada, meu muito

obrigada.

Resumo

Os micro-organismos e seus subprodutos são responsáveis pelo desencadeamento das

infecções secundárias e/ou persistentes dos canais radiculares(CR). A diversidade

microbiana destes canais é menor, quando comparada à da infecção primária, com

prevalência da espécie bacteriana Enterococcus faecalis. Objetivos: Avaliar a presença

de micro-organismos e a suscetibilidade antimicrobiana de E. faecalis isolados de

dentes submetidos ao retratamento endodôntico por motivo protético. Foi feito o

monitoramento microbiológico antes e após o preparo químico-mecânico (PQM) e após

o uso de uma medicação intracanal. Metodologia: Vinte dentes indicados para

retratamento endodôntico por motivo protético com ausência de lesão periapical foram

incluídos nesta pesquisa. Amostras microbianas coletadas dos CR foram plaqueadas

em FAA (Fastidious Anaerobe Agar) e em meio seletivo m-Enterococcus. Detecçao de

E. faecalis foi realizada por PCR com primer espécie-específico e sequenciamento

parcial do gene 16S rRNA. As cepas isoladas de E. faecalis, foram testadas quanto sua

suscetibilidade antimicrobiana, através do método de difusão em disco. Resultados:

Micro-organismos foram encontrados em todos os CR, havendo uma redução nos seus

níveis após o PQM e uso da medicacao intracanal. Sete CR apresentaram crescimento

microbiano no meio seletivo. Dos 43 micro-organismos que cresceram no m-

Enterococcus, 41 cepas foram identificadas como E. faecalis por PCR com primer

espécie-específico e sequenciamento. Destes isolados, foi observada suscetibilidade

das cepas à amoxicilina (41/41), amoxicilina com ácido clavulânico (38/41), ampicilina

(38/41), doxiciclina (33/41) fosfomicina (33/41) e tetraciclina (30/41). Entre as cepas,

houve resistência à clindamicina (38/41), gentamicina (35/41), rifampicina (20/41) e

vancomicina (17/41). Conclusão: Micro-organismos foram encontrados nos CR de

dentes indicados ao retratamento por motivo protético e sem lesão periapical. O meio

seletivo m-Enterococcus mostrou alta especificidade com resultados similares ao

método molecular. As cepas isoladas de E. faecalis apresentaram variados graus de

resistência aos agentes antimicrobianos, sendo mais suscetíveis à amoxicilina,

amoxicilina + ácido clavulânico e ampicilina.

Palavras-Chave: Micro-organismo, Endodontia, Enterococcus faecalis.

Abstract

Microorganisms and their by-products are responsible for the triggering of secondary

and / or persistent root canal (RC) infections. The microbial diversity of these root canals

is lower when compared to the primary infection, with a prevalence of the bacterial

species Enterococcus faecalis. Objectives: To evaluate the presence of microorganisms

and antimicrobial susceptibility of E. faecalis isolated from teeth submitted to endodontic

retreatment due to prosthetic reasons. Microbiological monitoring was done before and

after the chemical-mechanical preparation (PQM) and after the use of an intracanal

medication. Methodology: Twenty teeth indicated for endodontic retreatment due to

prosthetic reasons with absence of periapical lesion were included in this study.

Microbial samples collected from RC were plated in FAA (Fastidious Anaerobe Agar)

and in m-Enterococcus selective medium. Detection of E. faecalis was performed by

PCR with primer-specific and partial sequencing of the 16S rRNA gene. The strains

isolated from E. faecalis were tested for their antimicrobial susceptibility by the disc

diffusion method. Results: Microorganisms were found in all RCs, with a reduction in

their levels after PQM and intracanal medication use. Seven RC showed microbial

growth in the selective medium. Out of the 43 microorganisms grown on m-

Enterococcus, 41 strains were identified as E. faecalis by PCR with specific primer and

sequencing. Susceptibility against amoxicillin (41/41), amoxicillin with clavulanic acid

(38/41), ampicillin (38/41), doxycycline (33/41) fosfomycin (33/41) and tetracycline

(30/41) was observed in the tested strains. Among the strains, there was resistance

against clindamycin (38/41), gentamicin (35/41), rifampicin (20/41) and vancomycin

(17/41). Conclusion: Microorganisms were found in all the cases indicated to the

endodontic retreatment due to prosthetic reasons. The selective medium m-

Enterococcus showed high specificity with similar results to the molecular methods. E.

faecalis strains presented varying degrees of resistance to antimicrobial agents, being

more susceptible to amoxicillin, amoxicillin + clavulanic acid and ampicillin.

Keywords: Microorganism, Endodontics, Enterococcus faecalis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Radiografia periapical do dente 31. 23

Figura 2 – Descontaminação do campo operatório, abertura

coronária e coleta dos canais radiculares. 25

Figura 3 – Sistemas de irrigação e agitação dos irrigantes utilizados. 28

Figura 4 – Câmara de anaerobiose e processamento microbiológico. 31

Figura 5 – Etapas de Identificação fenotípica. 33

Figura 6 – Etapas para a realização do antibiograma com discos de

antibióticos. 39

Figura 7 – Formação dos halos de inibição ao redor do disco

contendo antibióticos selecionados em placas semeadas com E.

faecalis.

40

Figura 8 – Nível de micro-organismos nas diversas fases do

retratamento endodôntico. 46

Figura 9 – Identificação da espécie E. faecalis por cultura, PCR e

sequenciamento. 47

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Divisão dos grupos de acordo com a substância química

auxiliar e medicação intracanal utilizada. 27

Tabela 2 – Método de coleta e armazenamento das amostras

microbiológicas. 30

Tabela 3 – Concentrações dos antibióticos utilizados. 38

Tabela 4 – Valores interpretativos do tamanho dos halos de inibição

(diâmetro) dos antibióticos nos testes de Enterococcus spp. (CLSI-

2012).

41

Tabela 5 – Caracterização da amostra pelo tempo do tratamento

endodôntico inicial. 43

Tabela 6 – Prevalência dos grupos dentais incluídos na pesquisa. 43

Tabela 7 – Qualidade da obturação e selamento coronário dos

dentes submetidos ao retratamento endodôntico. 44

Tabela 8 – Avaliação da carga bacteriana na guta-percha pelos

terços radiculares. 45

Tabela 9 – Avaliação fases do retratamento endodôntico na redução

dos níveis bacterianos globais e por substâncias químicas auxiliares

(UFC/mL). Média±desvio padrão.

45

Tabela 10 – Frequência de crescimento bacteriano a partir da

cultura, detectadas em meio m-Enterococcus, em diferentes

sítios/etapas de crescimento.

47

Tabela 11 – Número de cepas de Enterococcus faecalis classificadas

de acordo com o halo de inibição, classificado em suscetível,

intermediário e resistente.

49

LISTA DE ABREVIATURAS

CR – Canal(is) radicular(es)

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

FAA – Fastidious Anaerobe Agar

NaOCl – Hipoclorito de sódio

NMF – Núcleo Metálico fundido

MIC – Medicação intracanal

PQM – Preparo químico-mecânico

SQA – Substância(s) química(s) auxiliar(es)

UFC – Unidade Formadora de Colônia

SUMÁRIO Páginas

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DA LITERATURA 4

3 PROPOSIÇÃO 17

4 MATERIAL E MÉTODOS 18

5 RESULTADOS 39

6 DISCUSSÃO 46

7 CONCLUSÃO 50

REFERÊNCIAS 51

ANEXOS 73

Anexo 1 – Aspectos clínicos e radiográficos dos dentes submetidos ao retratamento endodôntico por indicação protética

73

Anexo 2 – Contagem das UFC/mL em Meio de cultura FAA 74

Anexo 3 - Presença de Enterococcus através do crescimento em meio M-Enterococcus

75

Anexo 4 - Ficha clínica utilizada na pesquisa 76

Anexo 5 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP- Unicamp 80

1

1 INTRODUÇÃO

O tratamento endodôntico tem como objetivo a desinfecção do canal radicular

(CR) e o selamento coronário e apical herméticos (Rôças et al, 2016). O principal fator

etiológico das infecções endodônticas está relacionado à presença de micro-

organismos e seus subprodutos (Kakehashi et al, 1965; Gomes et al, 1994, 1996;

Rahimi et al, 2014; Barbosa-Ribeiro et al, 2016a). No entanto, a eliminação total de

micro-organismos é dificultada pela anatomia complexa do sistema de canal radicular e

a sua persistência ou a recontaminação destes canais pode promover o insucesso do

tratamento endodôntico (Gomes et al, 2015). Deste modo, aliado às técnicas de

limpeza, modelagem e obturação, é necessário a reabilitação protética adequada do

elemento dentário, pois a deficiência ou ausência do selamento coronário pode

favorecer à infiltração microbiana (Siqueira et al, 2005a;b; Song et al, 2014; Landys et

al, 2015; Pedro et al, 2016).

A infecção secundária é caracterizada pela reinfecção do canal radicular,

podendo ser resultado de uma infiltração coronária, obturação deficiente, ou cárie

recidivante (Siqueira et al, 2014). No momento que o dente em questão for submetido à

nova reabilitação, está indicado a avaliação de um possível retratamento, mesmo que

não seja evidenciado o insucesso através da lesão periapical (Friedman & Stabholtz,

1986; ESE, 2006; Oliveira et al, 2013; Gomes et al, 2013b).

A microbiota das infecções secundárias e/ou persistentes é diferente da presente

nas infecções primárias. Este fato se deve ao processo de seleção dos micro-

organismos e por eles serem capazes de sobreviver em um meio com restrição

nutricional (Nóbrega et al, 2013; Endo et al, 2013, Tennert et al, 2014, Zhang et al,

2015). Enterococcus faecalis é um micro-organismos frequentemente isolado destes

canais (Endo et al, 2013; Gomes et al, 2013b; Ribeiro, 2015), sendo um coco gram-

positivo; anaeróbio facultativo; com diferentes mecanismos de resistência, resultado de

alterações fisiológicas ou estruturais da célula bacteriana (Forbes et al, 1998; Barbosa-

Ribeiro et al, 2016b). A identificação desta espécie nos canais radiculares varia entre

24% a 97,5%, dependendo do método utilizado, tradicional ou molecular (Murad et al,

2014, Barbosa-Ribeiro et al, 2016a).

2

E. faecalis apresenta genes de virulência que dificultam sua remoção durante o

PQM, favorecem a formação de biofilme, conferem maior resistência antimicrobiana e

facilitam sua penetração nos túbulos dentinários (Pinheiro et al, 2003; Siqueira Jr &

Rôças, 2004; Gomes et al, 2006; Skucaite et al, 2010; Zhu et al, 2010; Endo, 2012;

Marinho et al, 2012; Endo et al, 2013; Gomes et al, 2013b; Dale et al, 2015; Barbosa-

Ribeiro et al, 2016b).

Várias técnicas de instrumentação são utilizadas para a remoção da guta-percha

e limpeza dos canais radiculares de dentes tratados endodonticamente, tais como limas

de aço manual, limas de aço inoxidável manual, brocas de Gates-glidden, e limas

rotatórias de movimento contínuo (Wilcox, 1989; Imura et al, 2000; Bueno et al, 2006;

Inan & Aydin, em 2012). Atualmente, pesquisas vêm comprovando a superioridade das

limas rotatórias de movimento reciprocante quando comparadas às outras técnicas,

principalmente quanto ao tempo de preparo, a remoção de micro-organismos, a menor

extrusão de debris, e a remoção de material obturador (Zuolo et al, 2013; Rios et al,

2014; Silva et al, 2014; Bernardes et al, 2015; Grande et al, 2015; Martinho et al, 2015;

Souza et al, 2015; Crozeta et al, 2016).

Durante o PQM dos canais radiculares são utilizadas substâncias tais como

clorexidina, hipoclorito de sódio, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), entre outras

(Dornelles-Morgental et al, 2011; Gomes et al, 2013a; Shenoi et al, 2016; Gonçalves et

al, 2016; Zandi et al, 2016). A clorexidina é efetiva contra uma gama de micro-

organismos, inclusive E. faecalis, e uma vez associada à instrumentação mostra grande

redução dos seus níveis bacterianos (Gomes et al, 2013a).

Para potencializar a ação das substâncias químicas durante o PQM pode-se

utilizar o ultrassom, passivamente ou ativamente, com pontas adequadas para a

agitação intracanal (Leoni et al, 2016; Rico-Romano et al, 2016; Herrera et al, 2016).

Pesquisas têm revelado alterações na resistência antimicrobiana dos micro-

organismos encontrados nos canais radiculares (Murray, 1990; Morrison et al, 1997;

Shepard & Gilmore, 2002; Pinheiro et al, 2003; Owens, 2008; Hawkey, 2008; Poeschl et

al, 2010; Skucaite et al, 2010; Endo, 2012; Barbosa-Ribeiro et al, 2016b). Nos casos de

retratamento, destaca-se a resistência do gênero Enterococcus, que além da

resistência ao PQM, apresenta também resistência a uma variedade de antibióticos

3

comumente utilizados na terapêutica, por mutação do DNA ou por aquisição de um

novo DNA (Murray, 1990; Morrison et al, 1997). Os antibióticos aos quais os

enterococos apresentam maior resistência incluem eritromicina, tetraciclina,

cloranfenicol e vancomicina (Murray, 1990; Morrison et al, 1997; Mundy et al, 2000;

Shepard & Gilmore, 2002; Owens, 2008; Hawkey, 2008; Skucaite et al, 2010; Barbosa-


A presente pesquisa foi realizada com o objetivo de verificar se dentes

encaminhados para o retratamento endodôntico por motivo protético, e sem lesão

periapical, apresentavam micro-organismos viáveis. Além disso, seria importante

observar se estes micro-organismos pertenciam ao gênero Enterococcus e verificar a

resistência dos mesmos aos antibióticos mais utilizados na clínica odontológica.

4

2 REVISÃO DA LITERATURA

2. 1. Epidemiologia do Retratamento endodôntico

O índice de sucesso do retratamento endodôntico está ligado a uma série de

fatores como a experiência do operador e grau de dificuldade do tratamento, visto que

obturações antigas, presença de retentores intrarradiculares, fratura de instrumentos,

perfurações, desvios e reabsorções dificultam a instrumentação do canal radicular em

toda a sua extensão. Além disto, outros fatores como a presença de lesão periapical e a

realização de uma restauração imediatamente após o tratamento endodôntico

influenciam o índice de sucesso (Torabinejad et al, 2009; Burry et al, 2016).

Os levantamentos dos índices de sucesso do tratamento/retratamento

endodôntico são baseados em avaliações clínico-radiográficas que avaliam a

persistência ou surgimento de lesão periapical, presença de sinais e sintomas clínicos,

presença de restauração coronária. Estas proservações são realizadas no mínimo a

cada ano, e se há duvidas quanto ao sucesso, deve-se proservar anualmente até

completar 4 anos (ESE, 2006).

Sjogren et al, em 1990, realizaram um estudo avaliando o índice de sucesso dos

tratamentos endodônticos, e observaram que nos casos que os dentes não

apresentavam lesão periapical, estes tinham 96% de sucesso, contra 86% nos dentes

associados a lesões periapicais, isto foi concluído após proservações de 8 a 10 anos do

tratamento endodôntico.

Quadros, em 2003, avaliou os procedimentos endodônticos realizados por alunos

do último ano de graduação da FOP-Unicamp e observou que 66,7% dos retratamentos

endodônticos apresentaram sucesso, 14,3% estavam em processo de reparação e 19%

foram considerados como insucesso. Ela observou também que os casos que

possuíam lesão periapical prévia ao tratamento endodôntico inicial apresentaram um

índice de sucesso (55,5%) significantemente menor do que nos casos sem lesão

periapical (89,8%). Concluiu que os índices de sucesso do retratamento são inferiores

ao tratamento endodôntico inicial, os quais apresentaram 78,5% de sucesso, sendo que

a presença de lesão periapical prévia ao tratamento influencia negativamente o índice.

5

Em 2004, Gorni & Gagliani realizaram um levantamento e caracterização dos

fatores que interferem no sucesso do retratamento endodôntico, este realizado por

especialistas, apresentando um índice geral de sucesso de 69%. No entanto foi

observada grande diferença quando o elemento dentário possuía alterações

morfológicas, com 48,7% de sucesso. Além deste fator, foi observado que a presença

de lesão periapical prévia ao tratamento endodôntico influenciava o índice de sucesso,

pois este era de 61,7% contra 89,5% dos dentes sem lesão periapical prévia evidente

radiograficamente.

Imura et al, 2007, único operador, especialista, avaliaram os 2000 casos de

tratamentos endodônticos realizados em sua clínica. O sucesso dos retratamentos

endodônticos convencionais foi de 85,9%. O único fator que afetou negativamente o

índice foi os grupos dentários, visto que molares apresentaram menores valores do que

pré-molares e incisivos.

Torabinejad et al, em 2009, realizaram uma revisão sistemática comparando o

índice de sucesso entre o retratamento endodôntico convencional e a cirurgia

parendodôntica ao longo do tempo. Observou que inicialmente a cirurgia

parendodôntica apresenta maior índice, no entanto quando avaliado de 4-6 anos houve

uma inversão dos índices, sendo que o retratamento convencional mostrou maior

previsibilidade ao longo do tempo.

Ng et al, 2011, investigaram os fatores que influenciam a condição periapical

após o tratamento e retratamento endodôntico. Observaram que as condições que

melhoram a cicatrização periapical foram: presença de lesão periapical de pequeno

tamanho, obtenção da patência foraminal, extensão da limpeza do canal radicular

próximo ao forame, uso de EDTA após o uso de NaOCl, não associação de clorexidina

2% ao NaOCl, ausência de perfuração, ausência de flare-ups, ausência de

sobreobturação, e presença de restauração coronária satisfatória. Neste trabalho

também foi observado o índice de sucesso de 84,6% dos retratamentos realizados,

reduzindo para 66,7% quando ausente o selamento coronário.

Eyuboglu et al, 2016, avaliaram o índice de sucesso de retratamentos realizados

em sessão única e a frequência que ocorreram complicações periapicais, sendo os

tratamentos realizados por um único operador e especialista. As consultas de

6

proservações revelaram 90,9% de sucesso, sendo que todos os retratamentos

endodônticos foram finalizados com a restauração coronária. Os autores concluíram

que os retratamentos endodônticos em única sessão se mostraram favoráveis ao índice

de sucesso, e somente o tamanho da lesão afetou significantemente o índice.

As falhas técnicas têm caracterizado como um dos fatores que induzem a

redução do índice de sucesso, evidenciadas por levantamentos epidemiológicos que

apontaram a relação entre o insucesso e restaurações e obturações inadequadas.

Levantamentos realizados apontam a importância do tratamento restaurador e a grande

redução do índice de sucesso quando o selamento coronário se apresenta deficiente ou

ausente, mesmo relacionado a um tratamento endodôntico bem realizado (Ray & Trope,

1995; Siqueira et al, 2005; Pedro et al, 2016), assim como uma maior incidência de

lesão periapical nestes casos (Kirkevang et al, 2000; Pedro et al, 2016).

Huumonen et al, em 2016, avaliaram a prevalência de lesões periapicais de

dentes tratados endodonticamente, na população da Finlândia. Com este estudo

relacionaram o insucesso do tratamento endodôntico inicial à obturação inadequada.

Esta dobrou o risco das lesões periapicais, mais frequentes em molares do que nos

outros grupos dentais. Já Alfouzan et al, em 2016, avaliando a condição periapical e a

qualidade dos tratamentos realizados na população da Arábia Saudita, observaram que

um tratamento endodôntico inadequado, qualidade da restauração e o tipo de material

utilizado para as restaurações influenciaram na presença de lesões periapicais.

A dificuldade técnica em que se realizar um retratamento endodôntico é maior

quando comparado a um tratamento endodôntico inicial, e a diferença entre a

habilidade de clínico-gerais e especialistas influenciam o índice de sucesso (Alley et al,

em 2004). Estes autores realizaram proservações por 5 anos dos dentes tratados por

clínicos e especialistas. O índice encontrado foi de 89,7% para clínicos e 98,1% para

especialistas. O índice de insucesso teve associação direta com a ausência de

selamento coronário, sendo este responsável por 20,8% dos insucessos ocorridos,

explicitando sua importância na restauração imediatamente após o tratamento

endodôntico.

7

2. 2. Infecções secundárias: dentes submetidos ao retratamento endodôntico

A presença dos micro-organismos e seus subprodutos são fundamentais para o

estabelecimento das doenças pulpares, constituindo uma relação de causa e efeito

estabelecida por Kakehashi et al, 1965. Sendo assim, a remoção dos micro-organismos

e a neutralização de seus subprodutos são essenciais para previsibilidade dos

tratamentos ou retratamentos endodônticos. Para que isso ocorra é necessária a

limpeza, modelagem e selamento hermético do sistema de canais radiculares (Schilder,

1974), além da restauração imediata do elemento dentário (Ray & Trope, 1995; Siqueira

et al, 2005). Falhas técnicas nestas etapas favorecem a persistência/ entrada de micro-

organismos nos canais radiculares, sendo indicado o retratamento endodôntico. (Ford &

Rhodes, 2004)

A resolução dos retratamentos endodônticos inicia-se pelo conhecimento do

material obturador utilizado, sendo estes cones de prata ou de guta-percha e cimentos

endodônticos. A guta-percha foi introduzida por Bowman, em 1867, é o material de

escolha até os dias atuais, com propriedade elástica satisfatória (Maniglia-Ferreira et al,

2005). A obturação é complementada por cimentos endodônticos com variadas

composições, mas com propriedade de selamento do canal radicular (Marroquín et al,

2015; Yildirim et al, 2016).

O diagnóstico e planejamento do retratamento endodôntico são essenciais para

o estabelecimento do tratamento adequado. Endodontistas e pós-graduandos tendem

a indicar mais retratamentos do que clínico-gerais e alunos de graduação (Wenteler et

al, 2015; Çiçek et al, 2016). Com a evolução das técnicas e qualificação profissional,

houve um aumento da previsibilidade dos retratamentos endodônticos convencionais,

assim como das cirurgias parendodônticas. Durante o planejamento deve-se considerar

estas opções, antes da indicação de exodontia e instalação de um implante, já que o

dente em si apresenta melhor função na cavidade oral (Torabinejad & White, 2016).

De acordo com Friedman & Stabholtz em 1986, no planejamento de uma nova

reabilitação protética, diante de casos de sucesso do tratamento endodôntico, com

ausência de imagem radiográfica de lesão periapical, mas com obturação insatisfatória,

deve-se indicar o retratamento endodôntico convencional.

8

Além disso, o tempo da realização do tratamento endodôntico inicial influencia o

selamento do canal radicular, visto que ocorre a degradação do material obturador ao

longo do tempo. Foi reportado que após 15 anos já existe a redução da capacidade de

selamento da guta-percha, comprometendo a longevidade do tratamento (Maniglia-

Ferreira et al, 2007).

A contaminação do canal radicular por micro-organismos pode ocorrer

coronalmente ou apicalmente, no entanto, são as falhas ou ausências dos materiais

restauradores as principais causas de insucesso do tratamento endodôntico (Ray &

Trope, 1995; Siqueira et al, 2005). Nas situações em que o selamento coronário estiver

ausente ou apresentar falhas e expor o material obturador ao meio bucal, a

recontaminação pela saliva ocorre em pouco tempo, podendo variar de 3 dias a 3

meses (Swanson & Madison, 1987; Magura et. al, 1991; Khayat et al, 1993; Siqueira et

al, 2000; Gadê Neto, 2004; Aminsobhani et al, 2010; Oliveira et al, 2013; Markose et al,

2016; Al-Maswary et al, 2016).

A reabilitação protética adequada influencia não somente no selamento,

impedindo infiltração coronária e/ou cárie secundária, como na manutenção do dente

por maior tempo na cavidade bucal, impedindo fraturas. Portanto é necessária a

restauração adequada dos dentes (Alvanforoush et al, 2016). Aquilino & Caplan (2002),

realizaram um estudo avaliando dentes tratados endodonticamente com e sem coroa

protética, observaram que os dentes que não possuíam coroa protética foram perdido 6

vezes mais do que os dentes que haviam coroa protética instaladas após a obturação.

Stavropoulou & Koidis (2007), afirmaram que coroas protéticas unitárias se

mostraram superiores após 10 anos, do que restaurações diretas que duram por

pequenos períodos de tempo. Skupien et al, (2016) mostrou a superioridade das

coroas unitárias quanto a menor necessidade de reintervenções, no entanto concluiu

que ambos apresentam bons resultados com o tempo.

Os casos indicados aos retratamentos são mais complexos, visto que existem os

obstáculos como o próprio material obturador, coroas protéticas, retentores

intrarradiculares. No entanto, também existem as dificuldades não resolvidas no

tratamento endodôntico inicial, como as calcificações, degraus, perfurações, fraturas de

instrumentos (Taylor et al, 2016).

9

A maioria das infecções secundárias ou persistentes resulta-se de uma infecção

intrarradicular, sendo o retratamento endodôntico convencional indicado. Este se

consiste da remoção de materiais obturadores dos canais radiculares e da realização

de uma nova modelagem, limpeza e obturação desses canais (Siqueira et al, 2014).

A abertura coronária adequada inicia-se com a remoção de restaurações ou

coroas anteriores e cáries secundárias, permitindo uma visualização ideal dos canais

radiculares. Após esta etapa, quando há presença de retentores intrarradiculares,

independente do material, a sua remoção é necessária para o estabelecimento de uma

nova limpeza e modelagem do canal. A remoção destes retentores pode ser realizada

de diversas formas, com saca-pinos, desgastes com brocas ou ultrassons, no entanto

visando a manutenção do dente e não a sua fragilização (Stabholtz & Friedman, 1988;

Kim et al, 2016).

Após a abertura coronária e remoção de possíveis retentores intrarradiculares

deve-se remover o material obturador. Isto pode ser feito com limas manuais, limas

rotatórias de rotação contínua, limas rotatórias reciprocantes, solventes ou associação

com ultrassom. Essa etapa é importante, pois além da remoção da guta-percha e

cimento obturador, estão sendo removidos micro-organismos que se mantiveram

viáveis (Del Fabbro et al, 2016)

Estudos comparando os métodos de remoção do material obturador mostram

que as limas rotatórias reciprocantes geram menor tempo de preparo, extrusão apical

de debris dentinários, menor quantidade de material remanescente, maior resistência à

fratura, exige menor habilidade para a execução e mesma capacidade em remover

micro-organismos e endotoxinas, quando comparadas às limas manuais e limas de

rotação contínua (Silva et al, 2014; Grande et al, 2015; Marinho et al, 2015; Uzunoglu &

Turker, 2016; Çanakçi et al, 2016; Kaşıkçi et al, 2016). O uso do ultrassom durante o

PQM auxilia na remoção do material remanescente, assim como de micro-organismos e

endotoxinas presentes (Martinho et al, 2015; Bernardes et al, 2015; Herrera et al, 2016;

Keles et al, 2016).

Para favorecer a remoção da guta-percha durante a instrumentação dos canais

radiculares, foi muito utilizada a químico-plastificação da mesma através do uso de

solventes, com destaque ao clorofórmio. Este apresenta superioridade na remoção da

10

massa obturadora quando comparado à outros solventes, no entanto é tóxico aos

tecidos periapicais, causa transporte do canal radicular e reduz a força de ligação aos

adesivos resinosos (Chutich et al, 1998; Mohammadzadeh Akhlaghi et al, 2013; Karataş

et al, 2016; Demibuga et al, 2016)

Todos os solventes de guta-percha promovem a formação de uma smear layer

química de difícil remoção, deixando maior quantidade de material obturador residual

nas paredes dos canais radiculares. Desta forma são indicados somente em casos de

difícil remoção do material obturador (Wilcox, 1989; Bueno, 1995; Oliveira, 2002;

Takahashi et al, 2009; Horvath et al, 2009; Jain et al, 2015; Souza et al, 2015). A

utilização de clorexidina gel na remoção da guta-percha mostra-se superior aos

solventes na limpeza das paredes do canal radicular (Oliveira, 2002).

Sabendo das contraindicações dos solventes, torna-se essencial a limpeza dos

canais radiculares através de uma instrumentação adequada e do uso substâncias

químicas auxiliares (SQA) de diferentes composições, com destaque ao NaOCl,

clorexidina e EDTA. Estas substâncias têm como objetivo principal dissolver

quimicamente os tecidos necróticos remanescentes, remover debris dentinários e

micro-organismos e seus subprodutos (Endo et al, 2012; Gomes et al, 2013b; van der

Sluis, 2015; Attur et al, 2016; Donyavi et al, 2016; Hertel et al, 2016; Zandi et al, 2016).

Um quesito importante durante o PQM é a ação de fluxo e refluxo gerada pelo

uso de uma solução irrigante. Esta é responsável por uma redução significativa das

endotoxinas (Marinho et al, 2014), podendo ser realizada através de seringas e agulhas

convencionais (manuais) ou sistemas como EndoVac. A irrigação convencional gera

uma pressão positiva e o EndoVac uma pressão negativa. A pressão negativa impede a

extrusão apical dos irrigantes, promove uma melhor limpeza do canal radicular e não

apresenta efeito vapor lock (Pawar et al, 2012; Tuncer & Unal, 2014; Pasricha et al,

2015; Konstantinidi et al, 2016).

A agitação ultrassônica passiva do EDTA faz com que a SQA penetre melhor nos

túbulos dentinários, proporcionando uma maior desinfecção dos canais radiculares e

favorecendo o selamento dos cimentos endodônticos (van der Sluis et al, 2007; Schmidt

et al, 2015; Akcay et al, 2016; Conde et al, 2016; Herrera et al, 2016).

11

2.3 .Infecções secundárias: Microbiota identificada nestes casos

A microbiota de canais radiculares com insucesso do tratamento endodôntico

mostra-se diferente das infecções primárias, visto que estas bactérias são capazes de

resistir aos procedimentos antimicrobianos e medicamentos utilizados na terapia

endodôntica; a um meio escasso de nutrientes, com relações bacterianas mínimas.

Estas condições associadas às alterações de temperatura, pH, tensão de oxigênio e a

capacidade de defesa do hospedeiro determinam a composição microbiológica destas

infecções (Sundqvist, 1992; Gomes et al, 2013b; Nóbrega et al, 2013).

A maioria dos autores concorda que as infecções primárias apresentam maior

diversidade e carga bacteriana do que as secundárias (Rolph et al, 2001; Pinheiro et al

2003; Siqueira & Rôças, 2004; Foschi et al, 2005; Gomes et al, 2005, 2006; 2013b;

2015; Schirrmeister et al , 2007; Blome et al, 2008; Rôças et al, 2008; Endo et al,

2014; Barbosa-Ribeiro et al, 2016a).

Os micro-organismos anaeróbios facultativos Gram-positivos são mais

encontrados nos casos de infecções secundárias do que em infecções primárias, por

serem mais resistentes à terapia endodôntica e por conseguirem permanecer em fase

de latência. Portanto se ocorrer o contato destes micro-organismos residuais com o

meio externo, facilitado pelas infiltrações coronárias, estes poderão ser capazes de se

multiplicar e reinfectar os canais radiculares (Gomes et al, 2013b).

Dentre os micro-organismos anaeróbios facultativos, Gram-positivos, a espécie

mais prevalente nos casos de insucesso endodôntico é o Enterococcus faecalis

(Pinheiro et al, 2003, 2004; Endo et al, 2013; Barbosa-Ribeiro et al, 2016a; Łysakowska

et al, 2016). Além disso, este microrganismo tem a capacidade de formação biofilme,

que o protege contra a ação da maioria das SQA e medicações intracanal utilizadas (Al-

Ahmad et al, 2014; Singh & Kapoor, 2014; Yap et al, 2014; Dale et al, 2015).

As técnicas de cultura relataram a presença de Enterococcus, Propionibacterium,

Actinomyces, Parvimonas, Staphylococcus spp e Candida nos canais de dentes com

insucesso do tratamento endodôntico (Pinheiro et al, 2003, 2004; Endo et al, 2013;

Gomes et al, 2013b; Barbosa-Ribeiro et al, 2016; Łysakowska et al, 2016). Bactérias

como Dialister, Eubacterium, Fusobacterium, Gemella, Mogibacterium,

12

Peptostreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Selenomonas, Synergistes,

Solobacterium e Treponema foram também encontradas nos canais radiculares por

métodos moleculares (Gomes et al, 2013b). A chance de se encontrar E faecalis na

infecção secundária é de 9 vezes maior (Gomes et al, 2013b), visto ao processo de

seleção existente nos canais radiculares.

Murad et al, (2014), através da técnica molecular checkerboard DNA-DNA

hybridization observaram uma diversidade de micro-organismos, sendo que os E.

faecalis estiveram presentes em 28%.

Rodrigues et al, (2015), avaliaram a microbiota de dentes com insucesso

endodôntico através do real-time PCR, e detectaram 81% de estreptococos e 24% de

E. faecalis,

Barbosa-Ribeiro et al(2016a) identificaram por cultura e testes bioquímicos a

espécie E. faecalis em todas as fases do retratamento endodôntico, no entanto nas

amostras iniciais também estiveram presentes Aerococcus spp, e Staphylococcus spp.

Zandi et al, 2016, utilizando o método molecular real-time PCR, observaram

Streptococcus spp em 57% dos canais radiculares e E. faecalis em 6%.

O grande destaque e importância da espécie E. faecalis ocorre pela dificuldade

da sua remoção no canal radicular, causados por seus diversos fatores de virulência

que possibilitam a formação de biofilme, resistência a antibióticos, entre outros (Dale et

al, 2015; Barbosa-Ribeiro et al, 2016b; Khalifa et al, 2016), portanto a persistência deste

micro-organismo pode ocorrer mesmo em casos que foram bem realizados (Molander

et al, 1998).

Fráter et al, 2013, compararam a eficácia de diferentes substâncias químicas

contra biofilme do canal radicular in vitro, e observaram que o NaOCl 5,25% se mostrou

mais eficaz, quando comparado à Solumium Dental, clorexidina 0,2%, Neomagnol,

solução fosfato tamponado (PBS).

Zandi et al, 2016, avaliaram a efetividade de soluções de NaOCl 2,5% e 5,25% e

gel de NaOCl a 2,5% em biofilmes de E. faecalis, sendo observado a superioridade na

redução das unidades formadoras de colônias das soluções sobre o gel.

13

2.4 Antibióticos no uso odontológico

Os antibióticos têm a função de controlar uma infecção, no entanto, quando

prescritos indiscriminadamente, resultam na emergência da resistência bacteriana,

tornando os mesmos menos efetivos ou até mesmo sem efeito (National Action plan for

combating antibiotic-resistant bacteria, 2014).

A microbiota oral sofre alterações quando se ingere um antibiótico, visto que este

medicamento não seleciona especificamente as bactérias a serem mortas. A cavidade

oral é composta por aproximadamente de 50-100 bilhões de bactérias, representadas

por em média 700 espécies bacterianas, dependendo do sítio oral e do indivíduo (Aas

et al, 2005). A maioria das bactérias tem sido associada com saúde, e após o uso de

antibióticos, elas diminuem em número, ocorrendo a proliferação de bactérias

resistentes, alterando assim esta microbiota. (Krishnan et al, 2016; Ferrer et al, 2016).

Além das alterações na microbiota oral, os antibióticos também causam

alterações na microbiota sistêmica. Pesquisas realizadas no Reino Unido e na Suécia

coletaram amostras da saliva e fezes de pacientes que fizeram uso de antibiótico

sistêmico. Foi observado modificações da microbiota nas fezes por maior tempo do que

na saliva. Em ambas as coletas houve seleção dos micro-organismos mais resistentes

após a ingestão dos antibióticos (Zaura et al, 2015).

Para a prevenção da resistência bacteriana aos antibióticos, estes devem ser

utilizados somente quando indicados. Quando o paciente é saudável, a indicação deve

se manter aos casos de envolvimento sistêmico da infecção, com a presença de febre,

mal-estar geral, limitação da abertura bucal, taquicardia, celulite, falta de apetite, ou

linfadenite (AAE, 2008; DHA, 2016). Importante destacar que o antibiótico não substitui

o tratamento endodôntico ou a drenagem de abscesso. A indicação errônea feita por

muitos profissionais não colabora com a efetividade do tratamento endodôntico (AAE,

2006; Lewis, 2008; Federowicz et al, 2013; Andrade, 2014; Hoskin et al, 2016; DHA,

2016).

Os pacientes que devem receber profilaxia antimicrobiana são os que

apresentam cardiopatias específicas, pacientes com substituição articular total ou com

algum grau de imunodepressão. Seu uso previne a endocardite bacteriana durante os

14

procedimentos odontológicos. Estes antibióticos devem ser de menor espectro e por

período curto de uso (Andrade, 2014; Franklin et al, 2016; Holmstrup & Klausen, 2016).

O Reino Unido recomendou através de seu guia, que a profilaxia antibiótica não

deve ser realizada prevenindo a endocardite durante os procedimentos odontológicos,

assim como o enxaguatório bucal de clorexidina não deve ser recomendado nestes

pacientes com finalidade profilática (National Institute for health and care excellence –

NICE, 2008).

As prescrições desnecessárias de antibiótico favorecem o mecanismo de

resistência bacteriana. As bactérias podem alterar o sítio alvo, modificar as enzimas,

podem degradar os antibióticos, alterar a permeabilidade dos antibióticos, gerar afluxo

dos antibióticos às células bacterianas, entre outras (Vranakis et al, 2014).

Na odontologia, diversos países têm realizado levantamentos para mapear o uso

de antibióticos. Na Arábia Saudita, por exemplo, a prescrição desnecessária por

dentistas correspondeu a 27,3% (Iqbal, 2015), no Canadá em 62,2% (Marra et al,

2016). Já na Escócia (Reino Unido), 10% das prescrições foram realizadas sem

indicação clínica (Elouafkaoui et al, 2016).

Cope et al, em 2016, realizaram uma auditoria avaliando o uso de antibióticos no

Pais de Gales, UK. Neste estudo observaram que as prescrições dos antibióticos foram

em sua maioria desnecessárias. Em 268/5.595 casos as prescrições foram para

pacientes com pulpite irreversível, e em 1.654/5.595 casos para abscesso apical agudo

sem envolvimento sistêmico. A maioria não foi associada às intervenções clínicas, ou

seja, o paciente não recebia tratamento e também não retornava para a resolução da

infecção.

Outro dado importante observado em alguns países como, por exemplo, no caso

do Brasil e do Sudão, são as auto prescrições de antibiótico. No Brasil, um

levantamento mostrou que 14,3% dos pacientes que foram atendidos no serviço de

plantão fizeram uso de antibióticos antes da intervenção odontológica e 16,1% após o

tratamento, ambos auto-prescritos (De-Paula et al, 2014). Já no Sudão, os

farmacêuticos dispensam as prescrições por motivo de falta de atendimento médico

suficiente para toda a população. No entanto, estas prescrições são sem

15

acompanhamento e diagnóstico preciso, gerando consequências para o paciente (Salim

& Elgizoli, 2016).

E. faecalis está presente em diversas infecções, como as infecções endodônticas

e as infecções do trato urinário. Seu monitoramento quanto a resistência a antibióticos é

importante, inclusive em âmbito hospitalar, para adoção de medicamentos mais

eficazes (Skucaite et al, 2010; Barbosa-Ribeiro et al, 2016b; Cai et al, 2017). Nos

hospitais, a presença de E. faecalis resistentes à vancomicina é uma preocupação

muito grande, pois a resolução da infecção é dificultada (Isenman & Fisher, 2016;

Jakovac et al, 2016). A resistência antibiótica desta espécie vem aumentando, incluindo

à eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol, e, mais recentemente, à vancomicina, devido

às prescrições indevidas (Murray, 1990; Morrison et al, 1997; Mundy et al, 2000;

Poeschl et al, 2010; Skucaite et al, 2010; Endo, 2011, 2014; Ribeiro 2015, Barbosa-


Diversas pesquisas têm sido feitas na área de Endodontia da FOP-UNICAMP

avaliando a suscetibilidade antibiótica do E. faecalis (Pinheiro et al, 2003; Delboni,

2009; Endo et al, 2014; Di Santi et al, 2015, Barbosa-Ribeiro et al, 2016b)

Pinheiro et al (2003), utilizando o E-test, mostraram que as cepas isoladas dos

canais radiculares foram suscetíveis à benzilpenicilina, amoxicilina e amoxicilina com

clavulanato. Já Delboni em 2009, mostrou a suscetibilidade à amoxicilina com ácido

clavulânico, amoxicilina e à moxifloxacina, com resistência de 78,5% das cepas à

rifampicina e 71,4% à azitromicina.

Endo et al, em 2014, utilizando o E-test, mostraram cepas de E. faecalis

suscetíveis à amoxicilina, moxifloxacina, vancomicina, benzilpenicilina e amoxicilina

com ácido clavulânico e resistentes a rifampicina (4/12), tetraciclina (2/12), doxiciclina

(1/12), eritromicina (3/12) e azitromicina (8/12).

Di Santi et al, em 2015, utilizando o E-test, observaram que cepas de E. faecalis

apresentaram suscetibilidade à amoxicilina e à associação de amoxicilina com ácido

clavulânico, sendo que algumas cepas apresentaram resistentes à eritromicina e

azitromicina.

16

Barbosa-Ribeiro et al, em 2016b, utilizando o E-test, encontrou cepas de E.

faecalis 100% suscetíveis à amoxicilina com ácido clavulanato, e resistentes à

clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, metronidazol, moxifloxacina e rifampicina.

Já Komiyama et al, em 2016, avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana do E.

faecalis isolados de amostras obtidas da cavidade oral através de um bochecho com

PBS, utilizando o método de diluição seriada de acordo com as normas do, CLSI. Os

autores observaram maior suscetibilidade à amoxicilina (87,7%) e ampicilina (84%) e

maior resistência das cepas à tetraciclina (53,8%) e eritromicina (43,4%).

Anderson et al, em 2016, observaram a suscetibilidade de cepas de E. faecalis

isoladas de alimentos, amostras clínicas obtidas de infecções nosocomiais

(hospitalares) e sítios orais (infecções endodônticas, placa dentais e saliva), utilizando o

VITEK AST-P616 card (bioMérieux Deutschland GmbH, Nürtingen, Germany). Todas as

cepas foram resistentes à eritromicina, mas suscetíveis à ampicilina, imipenem,

tigeciclina, nitrofurantoin e vancomicina. Das 28 cepas isoladas endodonticamente, 10

foram resistentes à tetraciclina. Em relação à gentamicina, houve resistência de cepas

isoladas da saliva (19/36), e de isolados clínicos (8/15). No entanto não houve

resistência das cepas isoladas de alimentos e dos canais radiculares.

Desta forma, dúvidas quanto à presença de micro-organismos em dentes

tratados endodonticamente, mas indicados para retratamento endodôntico por motivo

protético, devido a algum grau de inadequação do tratamento anterior ou pelo tempo do

tratamento endodôntico inicial, motivou o desenvolvimento desta pesquisa. Além disso,

a literatura demonstra a permanência de Enterococcus faecalis em dentes com

insucesso do tratamento endodôntico, estando estes desenvolvendo resistência aos

antibióticos prescritos na clínica odontológica.

17

3 Proposição

Objetivo geral

Avaliar a presença de micro-organismos e a suscetibilidade antimicrobiana de

Enterococcus faecalis isolados de canais radiculares de dentes submetidos ao

retratamento endodôntico por indicação protética, assintomáticos.

Objetivos específicos

1 Quantificar a presença de micro-organismos cultiváveis nos terços radiculares,

2 Avaliar o efeito do preparo químico-mecânico utilizando duas substâncias químicas

auxiliares(NaOCl 6% e Clorexidina 2% gel) e medicação intracanal realizados

durante o retratamento endodôntico na redução microbiana,

3 Identificar Enterococcus faecalis através da cultura com meio seletivo, PCR e

sequenciamento,

4 Monitorar o padrão da resistência antimicrobiana das cepas de Enterococcus

faecalis.

18

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Autorização para realização da pesquisa

O presente trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP), recebendo a aprovação para o seu

seguimento (protocolo 119/2015). O Certificado consta inserido no ANEXO 5.

Para participação deste estudo, os pacientes assinaram um Termo de

Consentimento livre e esclarecido, conforme as normas vigentes no referido Comitê de

Ética em pesquisa envolvendo seres humanos.

4.2 Seleção dos voluntários da pesquisa

Inicialmente foram analisadas 500 fichas de encaminhamento de pacientes dos

Cursos de Atualização e Especialização em Endodontia da Faculdade de Odontologia

de Piracicaba (FOP/UNICAMP). Foram selecionados apenas os casos encaminhados

para retratamento endodôntico por motivo protético de dentes com ausência de lesão

periapical (Figura 1), com no mínimo dois anos do tratamento endodôntico inicial,

caracterizando o sucesso do tratamento.

Foram excluídos da pesquisa dentes com quaisquer fatores que poderiam

interferir na microbiota do canal radicular como: uso de antifúngicos e antibióticos (< 3

meses); presença de doença periodontal (bolsa > 3mm); dentes com ausência de

selamento coronário; dentes com fratura radicular; dentes com impossibilidade de

isolamento absoluto; presença de sintomatologia; presença de lesão ou espessamento

periapical; presença de edema dos tecidos periapicais; presença de fístulas; e dentes

com mobilidade.

Após avaliação clínica prévia 20 dentes (unirradiculares e multirradiculares),

foram incluídos no presente estudo, nos casos de dentes multirradiculares, foi coletado

o canal mais amplo, sendo o palatino nos superiores e distal nos inferiores.

19

Figura 1. Radiografia periapical do dente 31 evidenciando a presença de tratamento endodôntico a 3 mm do ápice e ausência de lesão periapical.

4.3 Exame clínico (anamnese e exame físico)

Foram realizadas as anamneses, onde foram anotados os dados pessoais de

cada paciente (idade e gênero, história médica), histórico de tratamentos odontológicos

(incluindo o tempo que foi realizado o tratamento endodôntico anterior).

Aspectos clínicos e radiográficos

Durante o exame clínico foram registradas informações sobre o dente a ser

retratado e sua condição atual, segundo Pinheiro et al (2003). Características internas,

como o aspecto físico do canal radicular também foi avaliado. Todos esses dados foram

preenchidos na ficha de cada paciente (Anexo 4).

Radiograficamente foi avaliado se existia presença de cárie e a qualidade da

restauração presente, assim como falhas na margem da restauração, presença ou não de

espaços entre o material restaurador e a parede do canal. Para a análise radiográfica

foram utilizados os parâmetros utilizados por Pinheiro et al, 2003, nos quais a obturação

endodôntica é classificada como boa quando radiograficamente não se observava áreas

radiolúcidas na obturação ou entre o material obturador e a parede do canal, e o material

20

obturador se encontrava a uma distância de até 2 mm do ápice radiográfico. Se um ou

mais desses critérios não fosse atingido, a obturação era considerada ruim.

4.4. Procedimentos clínicos

Parte do método usado neste estudo foi descrito previamente em detalhe por

Gomes et al, 2015. Todos os materiais e instrumentais utilizados na presente pesquisa

foram esterilizados a 250ºC através de calor seco (estufa) por um período de 30

minutos, tornando-os apirogênicos.

Anteriormente ao começo do tratamento foi realizada a descontaminação da face

do paciente com clorexidina 0.2%. Após isso, o dente a ser tratado recebeu um

polimento coronário com auxilio da Escova de Robson e pedra pomes, seguido pela

anestesia local e isolamento absoluto do dente, com arco de Ostby e dique de borracha.

Foi realizado o vedamento interface coroa-lençol com o cianoacrilato (Super Bonder,

Loctite, São Paulo, SP) para que não ocorresse contaminação durante o retratamento.

Todo o conjunto do isolamento absoluto foi vedado com resina fotopolimerizável

(TopDam, FGM, Joinville, SC), para garantir estabilidade do isolamento.

Após a vedação foi realizada a desinfecção do campo operatório, que envolve a

porção coronária exposta, o grampo, o dique de borracha, e o arco de Ostby. A

desinfecção foi feita com swabs estéreis e umidecidos, em água oxigenada 30% (v/v),

NaOCl 2,5% por 30 segundos cada e em seguida, neutralização com solução estéril de

tiosulfato de sódio 5% (Möller, 1966), ilustrado na Figura 2. Foi testada a eficácia da

desinfecção através da coleta de amostra, feita com swab estéril o qual foi plaqueado

em placa de Fastidious Anaerobe Agar (FAA, Lab M, Bury, UK) acrescido de 5%

sangue desfibrinado de carneiro, que foi incubada na câmara de anaerobiose.

21

Figura 2. Descontaminação do campo operatório, abertura coronária e coleta dos canais radiculares. A- Descontaminação da face da paciente com Clorexidina; B- Polimento coronário; C- Anestesia local do dente; D; E- Desinfecção do campo operatório; F- Abertura coronária realizada com broca de alta rotação associada a irrigação com soro fisiológico; G-; H- Desobturação do canal radicular por terços radiculares, com auxílio da Reciproc R25; I- Coleta do canal radicular.

Após a desinfecção do campo operatório foi realizada a abertura coronária, em

alta rotação e irrigação com soro fisiológico estéril, para a redução do aquecimento da

ponta esférica diamantada (#1012 ou #1014). Após a finalização da abertura, com a

forma de contorno e conveniência desejada (#3082), o campo operatório foi novamente

desinfectado e neutralizado, seguindo os mesmos passos anteriores. Quando havia a

presença de núcleos metálicos fundidos, a sua remoção foi realizada através da técnica

SISU, a qual se trata de dois ultrassons simultâneos em posições antagônicas, com

pontas de ultrassom inativas.

22

A desobturação do canal radicular foi feita de forma seriada, de maneira a coletar

individualmente a guta-percha correspondente a cada terço. Para a remoção da guta-

percha de cada terço foi utilizado o sistema Reciproc iniciado pela lima R25 (VDW,

Munique, Alemanha). Foram utilizadas três limas Reciproc R25, sendo estas utilizadas

para desobturação para cada terço radicular, para diminuir o carreamento de debris de

um terço para o outro. Não foi utilizado nenhum solvente ou substância química auxiliar

para a desobturação do canal, somente soro fisiológico estéril para manter o ambiente

propício para as coletas microbianas.

Para a confirmação da patência e obtenção do comprimento de trabalho, que foi

equivalente a posição zero, foi utilizado o localizador apical (Novapex, Forum

Technologies, Rishon le-zion, Israel). A verificação da remoção do material obturador foi

feita com auxílio do microscópio clínico (Opto Eletrônica S.A., São Carlos, SP) e

realização de uma radiografia periapical.

4.5 Coleta microbiológica

As coletas foram realizadas de duas formas distintas, uma com auxílio de limas

endodônticas e outra com cones de papel absorvente, ambos estéreis e apirogênicos.

Durante a desobturação seriada feita com limas individuais R25, conforme se atingia o

comprimento da divisão dos terços radiculares, coronário (GC), médio (GM) e apical

(GAP). Quando havia presença de núcleos metálicos fundidos, este núcleo foi coletado

com cone de papel absorvente esfregando-o sobre sua estrutura. As amostras foram

introduzidas em tubos tipo eppendorfs previamente esterilizados, contendo 1,0 mL do

meio de transporte pré-reduzido VMGA III – Viability Medium Goteberg Agar (Dahlén et

al, 1993) e transportadas em jarros a vácuo para a câmara de anaerobiose (Don

Whitley Scientific, Bradford, UK) do Laboratório de Microbiologia da disciplina de

Endodontia da FOP-UNICAMP para processamento por cultura microbiológica, após o

término do procedimento clínico, não sendo ultrapassado o prazo de 4 horas para seu

processamento.

Após a desobturação, foi realizada a coleta inicial do canal radicular em toda sua

extensão, na posição zero estabelecida pelo localizador apical. O canal foi irrigado com

23

soro fisiológico e 3 cones de papel estéril/apirogênico foram introduzidos, um de cada

vez, em toda a extensão do canal, sendo esta coleta denominada (A1). A seguir os

pacientes foram divididos aletoriamente em dois grupos de acordo com a substância

química auxiliar empregada (Tabela 1). Concomitantemente ao uso da substância, foi

realizado o preparo mecânico com as limas Reciproc. A cada sessão foi realizado um

novo preparo químico-mecânico utilizando o mesmo calibre das limas das sessões

anteriores, para evitar alargamento excessivo dos dentes

Tabela 1. Divisão dos grupos de acordo com a Substância Química auxiliar

(SQA) e medicação intracanal(MIC) utilizadas.

Grupos n SQA MIC

G1 10 CLX 2% gel CLX 2% gel + Ca(OH)2

G2 10 NaOCl 6% CLX 2% gel + Ca(OH)2

Para melhorar a eficiência da irrigação e evitar o extravasamento do NaOCl foi

utilizado o sistema EndoVac (Discus Dental, Culver, CA, USA), sendo que no grupo G1,

a substância irrigadora foi o soro fisiológico, e no grupo G2, foi o NaOCl 6%, no entanto,

entre as trocas de limas o soro fisiológico foi utilizado no G2 para padronização do

tempo de contato das substâncias químicas.

24

Figura 3. Sistemas de irrigação e agitação dos irrigantes utilizados. A- Utilização do sistema EndoVac durante o PQM dos canais radiculares. B- Agitação ultrassônica passiva.

Após a instrumentação de todo o canal, o mesmo foi irrigado com 5mL de soro

fisiológico para remover todas as SQA utilizadas. A seguir procedeu-se a neutralização

da SQA. Para a Clorexidina foi utilizado tween 80 + lecitina de soja e para o NaOCl 6%,

o tiossulfato de sódio 5%. A seguir o canal foi novamente irrigado com 5 mL de soro

fisiológico, aspirado. O canal foi então irrigado com 1 mL de EDTA 17%, o qual foi

agitado ultrassonicamente por 30 s, com auxílio da ponta E1- Irrisonic em potência de 1,

ou seja, 10% (Helse Dental, Santa Rosa de Viterbo, SP, Brasil), ilustrado na Figura 3.

Esta ponta foi mantida 2mm aquém do comprimento real do canal. A irrigação com

EDTA foi feita em 3 tempos de 30 s e a cada irrigação o EDTA foi renovado. Logo a

seguir o canal foi irrigado novamente com soro fisiológico, para então realizar a coleta

após o PQM (D1).

O canal foi preenchido com soro fisiológico, por 7 dias, com selamento coronário

de uma camada de 2mm de coltosol (Vigodent, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e

restauração com resina composta fotopolimerizável Z250 (3M Dental Products, St Paul,

MN, EUA). Passados estes 7 dias, o paciente retornou para a realização das coletas do

canal radicular, antes do PQM (A2), seguindo todos os procedimentos anteriormente

detalhados. Após um novo PQM com EDTA foi feita a coleta D2. A seguir foi colocada a

medicação intracanal a base de hidróxido de cálcio e clorexidina 2% gel, na proporção

1:1, inserida com auxílio de uma Lentulo, por 30 dias. Foi dada especial atenção para o

preenchimento completo do canal com a medicação. Um pellet de algodão foi usado

para condensar a medicação ao nível da entrada do canal e uma radiografia periapical

foi realizada para garantir a qualidade de preenchimento do canal radicular. A seguir o

dente foi restaurado com resina composta fotopolimerizável.

Depois de 30 dias de medicação intracanal, os canais foram assepticamente

acessados, sob isolamento absoluto, de acordo com o protocolo para a desinfecção

como anteriormente descrito. A medicação intracanal foi removida com uma lima K#40

contra as paredes laterais do canal radicular e irrigação abundante com 10 mL de

solução salina. Em seguida, novas coletas foram realizadas (DMIC).

25

Antes de obturação, a instrumentação final do canal radicular foi realizada com a

utilização de três instrumentos manuais maiores do que o diâmetro apical obtido após

PQM. Este procedimento foi associado com o protocolo de irrigação para cada grupo.

Após, todos os canais radiculares foram irrigados com sua respectiva solução

neutralizadora. Os canais foram irrigados com 3 ml de EDTA 17% durante 1 minuto,

seguido por uma lavagem final com 10 mL de solução salina estéril / apirogênica. A

seguir os canais foram novamente coletados (D3).

Em seguida, os dentes foram obturados tridimensionalmente utilizando cones de

guta-percha cortados com uma régua calibradora e lâmina de bisturi, em 2 calibres

além da lima anatômica final, modelados com clorexidina 2% gel e travados no canal

radicular em 2mm aquém do comprimento real do dente. Após este procedimento, o

canal foi seco com auxilio de cones de papel absorvente calibrados no comprimento

real do dente, para então ser realizada a obturação do canal, a qual foi utilizado o a a

cimento endodôntico a base de óxido de zinco e eugenol (Endomethasone N,

Septodont; Saint Maur des Sossés Cedex, França), espatulado até não obter mais

brilho. As cavidades de acesso foram seladas com uma camada de 2mm de coltosol e

resina composta fotopolimerizável.

26

Resumindo, as coletas realizadas foram nomeadas de:

Guta-percha cervical (GC);

Guta-percha média: (GM);

Guta-percha apical: (GAP);

Antes do PQM 1: (A1);

Depois do PQM 1: (D1);

Antes do PQM 2, após 7 dias: (A2);

Depois do PQM 2: (D2);

Depois da medicação intracanal: (DMIC);

Depois do PQM 3: (D3).

Para as coletas das amostras microbiológicas dos canais radiculares

foram utilizados 3 cones de papel absorventes estéreis e apirogênicos, que foram

individualmente introduzidos no comprimento pré-determinado pelo localizador

apical, permanecendo nesta posição por 60 segundos. Em caso de canal seco, este

era umedecido com soro fisiológico estéril e apirogênico, para assegurar uma cultura

viável (Tabela 2). Em todos os casos foram coletadas amostras de um canal

radicular apenas. Em casos de dentes bi ou multirradiculares, as amostras foram

coletadas do canal mais amplo, de maneira a confinar o exame microbiológico em

um único ambiente ecológico.

Tabela 2. Método de coleta e armazenamento das amostras microbiológicas

Amostra Instrumento Qtd Comprimento Meio

1 Microbiológico Limas

endodônticas 01 Terço cervical

Tubo tipo eppendorf com 1,0 mL de VMGA III


endodônticas 01 Terço Médio



endodônticas 01 Terço Apical


4 Microbiológico Ponta papel 03 No ápice Tubo tipo eppendorf com 1,0 mL de VMGA III

27

4.6. Processamento microbiológico das amostras

4.6.1. Cultura microbiológica, Sequenciamento genético

Cultivo, isolamento, incubação e identificação preliminar dos micro-organismos

Figura 4. Câmara de anaerobiose e processamento microbiológico. A- Câmara de anaerobiose utilizada para o plaqueamento e cultivo. B- Plaqueamento do VMGA em placas de FAA, dentro da câmara de anaerobiose.

No interior da cabine de anaerobiose, ilustrados na Figura 4, o tubo de

Eppendorf contendo VMGA III e o material coletado foram agitados por 60 segundos

para facilitar a dispersão dos micro-organismos. Após isso, foram realizadas diluições

seriadas em 1/10, 1/100, e 1/1.000 utilizando Fastidious Anaerobe Broth (Lab M, Bury,

Inglaterra), e cada uma das coletas e diluições foram inoculados 50 μL do VMGA em

placas de Fastidious Anaerobe Ágar (Lab M, Bury, Inglaterra) + 5% de sangue

desfibrinado de carneiro + 1 mg/L de Menadiona (Vitamin K3; 2-Methyl-1,4-

naphthoquinone – SIGMA M5625, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) + 1 mg/L de

Hemina (Hemin Bovine Minimum 80% – SIGMA H5533); e em placas contendo o meio

seletivo m-Enterococcus (Difco BD, Sparks, Maryland, MD, EUA).

As placas de FAA foram incubadas em anaerobiose a 37ºC, numa atmosfera de

10% H2, 10% CO2 e 80% N2 até 14 dias, para permitir a detecção de micro-organismos

anaeróbios estritos de crescimento lento. Para seleção do gênero Enterococcus spp,

as placas com o meio seletivo, foram incubadas em estufa bacteriológica de CO2 a

37°C por 2 dias, para permitir o crescimento de micro-organismos deste gênero (Endo,

2012).

28

Após a incubação, cada placa foi examinada em lupa estereoscópica (Lambda

Let 2, Atto Instruments CO, Hong Kong) em aumento de 3 vezes. As unidades

formadoras de colônias (UFC/mL) foram contadas utilizando as placas de FAA, por

oferecer uma maior diversidade e crescimento de micro-organismos.

O número de UFCs foi determinado a partir da contagem do número de colônias

nas placas contendo o meio de cultura FAA. Para a obtenção do número de UFCs

presentes na amostra por mL (amostra inicial) foi necessário multiplicar por 2.000 ou

200.000 o número de UFCs observadas na contagem das placas, dependendo da

diluição realizada. A escolha da placa para contagem de UFCs estava relacionada à

possibilidade de contar de forma individual o número de UFCs presentes. Quando não

possibilitado a contagem na amostra inicial, foram utilizadas as diluições 10-2 ou 10-3.

Ou seja, quando a diluição 10-2 foi escolhida, o valor correspondente a essa diluição

era 100 vezes menor que o inicial (1 mL). A alíquota plaqueada foi de 50 μL, ou seja,

20 vezes menor que 1,0 mL. Portanto o fator de multiplicação do número de UFCs

obtido seria 2.000. Entretanto, quando a diluição 10-3 foi escolhida, o valor

correspondente a essa diluição era 1.000 vezes menor que o inicial (1 mL). A alíquota

plaqueada foi de 50 μL, ou seja, 20 vezes menor que 1,0 mL. Portanto o fator de

multiplicação do número de UFCs obtido seria 200.000 (Endo, 2012).

A diferenciação das colônias foi realizada de acordo com as suas características

macroscópicas no ágar, o que é facilitado pela adição de sangue, observando-se:

tamanho, cor, forma, textura, elevação, borda, superfície, consistência, opacidade e

hemólise (nenhum, hemólise parcial ou hemólise completa) (Endo, 2012). As diferentes

colônias foram diferenciadas e subcultivadas, com o objetivo de obtenção de culturas

puras (Endo, 2012).

Após a diferenciação, foi realizado o isolamento das colônias em uma placa

contendo BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro e outra em FAA + 5% de

sangue desfibrinado de carneiro + hemina (1 mg/L) + vitamina K (1 mg/L), e testadas

quanto ao seu requerimento gasoso, colocando-se uma placa na estufa bacteriológica

e outra na câmara de anaerobiose, respectivamente; observando em qual condição

gasosa houve crescimento bacteriano. As espécies que cresceram somente em

incubação anaeróbica foram consideradas anaeróbias estritas, após verificar

crescimento negativo em estufa bacteriológica e em cabine de CO2 (Jouan, IG 150,

29

Saint-Herblain, França). As espécies que cresceram nas três condições gasosas foram

caracterizadas anaeróbias facultativas (Endo, 2012).

A morfologia bacteriana foi obtida a partir de colônias puras após cada

incubação, através da coloração de Gram, e testadas quanto à produção de catalase.

No presente estudo, todas as diferentes colônias que cresceram no meio m-

Enterococcus tiveram sua morfologia testada pela coloração de Gram e teste de

produção de catalase, como mostrado em Figura 5.

Todos os tubos tipo Eppendorf contendo as amostras em VMGA III e o material

coletado, imediatamente após a retirada das alíquotas para diluição e para o

plaqueamento nos meios de cultura citados acima, foram estocados em freezer –80°C

para futura análise molecular (Endo, 2012).

Figura 5. Etapas da Identificação fenotípica. A- Plaquemento da amostra em meio de cultura seletivo m-Enterococcus; B- Isolamento das cepas selecionadas; C- Coloração de Gram (cocos Gram-positivos); D- Teste de produção de catalase (negativa).

30

4.5.2. Processamento molecular (PCR)

Extração de DNA bacteriano

As bactérias que foram cultivadas do meio m-Enterococcus e isoladas em

culturas puras em placas de BHI tiveram o DNA extraído através do kit “QIAamp

DNA mini kit” (QIAGEN, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções fornecidas

pelo fabricante. O kit é especifico para essa finalidade e contém uma variedade de

tampões, centrifugações e filtragens para que o material genético seja extraído e

então re-suspendido em uma solução eluente para que possa ser armazenado a

-20ºC. Após a extração, foi quantificada a concentração do DNA em cada amostra

através do espectrofotômetro para ácidos nucléicos NanoDrop 2000 (Thermo

Scientific, Wilmington, DE, EUA).

Amplificação do gene 16S rRNA - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A amplificação do gene 16S rRNA é necessária para identificação genotípica

dos micro-organismos isolados. Foi utilizado a PCR no termociclador GenePro

Thermal Cycler (Bioer Technology, Hangzhou, China) para amplificação da região do

gene 16S rRNA com os primers espécie-específico:

Univ Forward GCAAGGCTTCTTAGAGA

Univ Reverse CATCGTGTAAGCTAACTTC

A reação foi realizada através de um volume total de 50µL, sendo 13µL foram

oriundos de um mix de reagentes. A quantidade de DNA e água MiliQ estéril variou

de acordo com a concentração de DNA extraído de cada amostra, respeitando a

quantidade final, que deverá ser de 37 µL O mix de reagentes foi composto por 5µL

de Buffer 10X PCR; 1,5µL de Cloreto de Magnésio; 4µL de dNTP; 1 µL Primer Univ

F (25 pmol); 1 µL Primer Univ R (25 pMol); 0,5µL de Platinum Taq DNA Polymerase

(Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

A concentração de DNA utilizada na reação foi de aproximadamente 100

ng/µL (Siqueira et al, 2001; Viana et al, 2007).

31

Os parâmetros do ciclo para amplificação incluiu uma pré-desnaturação por 4

minutos a 94°C, seguida por 30 ciclos com desnaturação a 94°C por 45 segundos +

anelamento a 60°C por 45 segundos + extensão a 72°C por 1,5 minutos, e

concluindo-se com uma extensão final a 72°C por 15 minutos (Ribeiro et al, 2011).

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese horizontal em gel

de agarose 1%, por aproximadamente 45 minutos a 90V e temperatura ambiente em

tampão TAE 1X (Tris Acetato EDTA). Após a eletroforese, o gel foi corado em

brometo de etídio por 5 minutos, seguido por água destilada, observado sob luz UV

e a imagem era então fotografada e gravada. Reações positivas deveriam ter as

bandas de tamanhos apropriados (1500 pares de base). Um controle positivo de

DNA extraído de uma cepa padrão ATCC de E. faecalis foi usado para comprovação

do sucesso da reação, assim como um controle negativo que estava ausente de

DNA bacteriano, com o objetivo de verificar se houve contaminação nos reagentes

ou na água MiliQ utilizada.

Identificação microbiana através do Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA

O sequenciamento foi iniciado pela extração do DNA das cepas bacterianas

de Enterococcus faecalis que sofreram uma prévia identificação através da cultura

com meio seletivo, coloração de Gram, teste de catalase e PCR com primer espécie-

específico. Esta extração utilizou o kit QIAmp DNA mini kit®, seguindo as instruções

do fabricante, após esta etapa, foi realizada a quantificação do DNA através do

espectrofotômetro NanoDrop 2000.

Após a quantificação do DNA, houve a amplificação do gene rRNA iniciada

por uma reação de PCR universal no termociclador GenePro Thermal Cycler, para

esta amplificação com os primers proposto por Paster et al, 2001:

Univ Forward 5’ GAG AGT TTD ATY MTG GCT CAG 3’

Univ Reverse 5’ GAA GGA GGT GWT CCA RCC GCA 3’

A reação utilizou uma concentração de DNA de 100 ng/µL (Siqueira et al, 2001;

Viana et al, 2007; Ribeiro, 2015). O mix de reagentes foi composto por 5µL de Buffer

10X PCR (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil); 4µL de Cloreto de Magnésio (50 mM)

(Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 2µL de dNTP (40nmol) (Invitrogen São Paulo,

32

SP, Brasil), 1µL Primer Univ F (25 pmol) (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 1µL

Primer Univ R (25 pMol) (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 0,2µL de Platinum Taq

DNA Polymerase (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil). O volume total foi de 50µL. O

ciclo foi iniciado por uma desnaturação inicial por 4 minutos a 94°C, seguida por 30

ciclos com desnaturação a 94°C por 45 segundos / anelamento a 60°C por 45

segundos / extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos, concluindo com uma

extensão final a 72°C por 15 minutos (Ribeiro et al, 2011).

Após a reação de amplificação, estes foram analisados por eletroforese

horizontal em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, por 45 minutos a

90V em tampão TAE 1X (Tris Acetato EDTA), seguido da observação sob luz UV e a

imagem foi fotografada. Os produtos da PCR foram purificados com kit de

purificação “QIAquick® Gel Extraction” (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), seguindo as

recomendações do fabricante. Após esta purificação, o DNA foi novamente

quantificado e novamente analisado por eletroforese horizontal em gel de agarose

1%. Para o sequenciamento, as amostras tiveram o DNA padronizado em 20ng/µL,

sendo que quando as concentrações estavam maiores que esta, foi realizada a

eluição com a solução do kit de purificação.

Após esta etapa, foi realizada a reação de sequenciamento através do mix de

reagentes com 3µL do DNA purificado, 2 µL de Sequencing buffer 5X (Applied

Biosystems Carlsbad, CA, EUA), 1µL do BigDye TerminatorCycle Sequencing

(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), 3µL de água ultrapura (Invitrogen, São

Paulo, SP, Brasil), e 1µL do primer “533R – TKA CCG CGG CTG CTG” (Invitrogen,

São Paulo, SP, Brasil). Os parâmetros do ciclo para amplificação iniciaram por uma

desnaturação inicial por 1 minuto a 96°C, seguida por 40 ciclos com desnaturação a

96°C por 15 segundos / anelamento a 50°C por 15 segundos e extensão a 60°C por

4minuto, e concluindo por uma extensão final a 60°C por 1 minuto.

Posteriormente, as amostras foram submetidas à precipitação, sob

refrigeração com gelo para evitar seu aquecimento e também sem a presença de

luz.

Como continuação a reação de sequenciamento, 1µL de acetato de sódio

(1,0M) + EDTA (2,5mM) foi adicionado a cada amostra, deixando descansar por

1minuto. Após isto, 40µL de etanol 95% foi distribuído em cada tubo, e submetido a

centrifugação a 1.200rpm por 15min a 4°C, e o sobrenadante descartado após esta

33

etapa. Outro ciclo de centrifugação foi realizado, acrescentando 100µL de etanol

70% sob 1.200 rpm por 5min, e descartado o sobrenadante. Os tubos Eppendorf

com as amostras permaneceram semi-abertos por 24h para secagem, protegidos da

luz por papel alumínio.

Após esse período, as amostras foram suspendidas em 10µL de formamida;

vortexadas; em termociclador, as amostras foram submetidas à desnaturação a

95ºC por 5 min, dispostas na placa de 96 poços do aparelho “3500 Genetic Analizer”

(Applied Biosystems/Hitachi). A análise do DNA foi feita utilizando o sistema “ABI

3500 DNA Analyser” (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), alcançando em

média sequências entre 350 a 700 bases. As corridas foram feitas em capilares de

50 cm utilizando o polímero POP7, e as sequências foram analisadas pelo software

Sequencing Analysis 5.3.1 utilizando o Base Caller KB.

As sequências obtidas foram analisadas quanto à qualidade dos nucleotídeos

e similaridade, utilizando-se o programa CLC Genomics Workbench v6.5 (Qiagen

Company, Silkeborgvej, Dinamarca). Um arquivo no formato “FASTA” foi obtido com

as sequências de boa qualidade, que foram alinhadas pelo software Mega 6

(Molecular Evolutionary Genetics Analysis). As sequências alinhadas foram

comparadas com as sequências depositadas no GenBank (Ribeiro et al, 2011), pelo

programa Basic Local Alignment Tool for Nucleotides (BLASTn). Para um alto nível

de qualidade das sequências, admitiram-se índices de confiança para cada

nucleotídeo acima de 97%.BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied

Biosystems,Carlbad, CA, EUA)

34

Antibiograma

O antibiograma foi realizado com cepas bacterianas identificadas

primeiramente como Enterococcus faecalis através da cultura no meio seletivo m-

Enterococcus, seguido pelo PCR simples, com primer espécie-específico para E.

faecalis, e pelo sequenciamento. As concentrações dos antibióticos utilizados

encontram-se listadas na Tabela 3.

Tabela 3. Concentrações dos antibióticos utilizadas

Antibiótico Concentração

Amoxicilina 25µg

Amoxicilina+Ácido clavulânico 20µg+10µg

Ampicilina 10µg

Azitromicina 15µg

Ciprofloxacina 5µg

Clindamicina 2µg

Cloranfenicol 30µg

Doxiciclina 30µg

Eritromicina 15µg

Fosfomicina 200µg

Gentamicina 10µg

Levofloxacina 5µg

Nitrofurantoin 300µg

Norfloxacina 10µg

Rifampina 5µg

Teicoplanina 30µg

Tetraciclina 30µg

Vancomicina 30µg

As cepas de E faecalis foram subcultivadas em placas de BHI Ágar (BHIA),

sendo depois incubadas por 18-24 h a 37ºC em estufa de 10% CO2 (Jouan, Saint-

Herblain, França). Após crescimento em meio sólido, colônias isoladas foram

suspensas em tubos contendo 5 mL de NaCl a 0,85%. Após agitação mecânica, a

35

suspensão foi ajustada em espectrofotômetro com transmitância de 800 nm, até

atingir a concentração equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland (1,5 x 108

bactéria/mL). Tal concentração de inóculo foi utilizada por promover crescimento

semi-confluente dos E. faecalis (Koo et al, 2000).

A seguir, o inóculo bacteriano foi plaqueado, de forma uniforme, diretamente

sobre a superfície de placas contendo Mueller Hinton Agar (Oxoid, Basingstoke,

UK), com o uso de um swab estéril. Todo este procedimento foi realizado em

triplicata. Após o plaqueamento, com auxílio de uma pinça flambada e resfriada, os

discos de antibióticos foram depositados sobre as placas, com uma leve pressão

com a ponta da pinça para adesão, mantendo espaço suficiente para que não

houvesse coincidência dos halos. As placas foram deixadas por 2 horas a

temperatura ambiente para permitir a difusão do antibiótico e a seguir foram

incubadas na cabine de C02 a 37ºC por 18 a 24 horas. A Figura 6 mostra as etapas

para a realização do antibiograma com discos de antibióticos.

Figura 6. Etapas para a realização do antibiograma com discos de antibióticos.

A- Isolamento de uma cepa bacteriana em placa de BHI, mantida em estufa CO2 a

37oC por 18-24h; B- Coleta de uma colônia isolada utilizando uma alça plástica

estéril; C- Transferência da colônia para tubo contendo NaCl; Padronização da

turbidez do inóculo de acordo com a escala 0.5 de McFarland; F- Colocação dos

discos contendo antibiótico nas placas de Mueller Hinton Ágar.

36

Após a incubação a leitura foi realizada pela medida do diâmetro das zonas

de inibição microbiana, com o auxílio de paquímetro digital (Figura 7).

Figura 7. Formação dos halos de inibição ao redor do disco contendo

antibióticos selecionados em placas semeadas com E. faecalis.

Os resultados foram comparados com os padrões de

suscetibilidade/resistência fornecidos pelo CLSI, 2012 (Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing; Clinical and Laboratory. Standards Institute PA

Clinical and Laboratory Standards Institute- CLSI, 2012), como mostrado na Tabela

4.

37

Tabela 4. Valores interpretativos do tamanho dos halos de inibição

(diâmetro) dos antibióticos nos testes de Enterococcus spp. (CLSI-2012).

Zona de inibição(diâmetro)

Agente antibiótico Sensível Intermediário Resistente

Amoxicilina (AMO) ≥17 - ≤16

Amoxicilina+Ácido clavulânico (AMC) ≥18 17-14 ≤13

Ampicilina (AMP) ≥17 - ≤16

Azitromicina (AZI) ≥18 17-14 ≤13

Ciprofloxacina (CIP) ≥21 20-14 ≤15

Clindamicina (CLI) ≥21 20-13 ≤14

Cloranfenicol (CLO) ≥18 17-11 ≤12

Doxiciclina (DOX) ≥16 15-11 ≤12

Eritromicina (ERI) ≥23 22-12 ≤13

Fosfomicina (FOS) ≥16 15-11 ≤12

Gentamicina (GEN) ≥15 14-11 ≤12

Levofloxacina (LVX) ≥17 16-12 ≤13

Nitrofurantoin (NIT) ≥17 16-13 ≤14

Norfloxacina (NOR) ≥17 16-11 ≤12

Rifampicina (RIF) ≥20 19-15 ≤16

Teicoplanina (TEC) ≥14 13-9 ≤10

Tetraciclina (TET) ≥19 18-13 ≤14

Vancomicina (VAN) ≥17 16-13 ≤14

38

Análise Estatística

Foi utilizado ANOVA para medidas repetidas, o qual é um teste paramétrico para

amostras pareadas ou dependentes, e Teste de Friedman, o qual se trata de um

teste não paramétrico para amostras pareadas ou dependentes (p<0,05).

39

5 RESULTADOS

Todos os casos apresentaram-se assintomáticos em todos os momentos do

retratamento endodôntico. Houve maior prevalência de mulheres (n=13). Dentre os

pacientes, nenhum apresentou doença periodontal, mobilidade dental, dor a

palpação, dor a percussão nem dor prévia. O tempo do tratamento endodôntico

inicial foi de 8,58±6,29 anos (Tabela 5). Os dentes que foram incluídos na pesquisa

estão presentes na Tabela 6, constituindo-se de 11 unirradiculares e 9

multirradiculares.

Tabela 5. Caracterização da amostra pelo tempo do tratamento

endodôntico inicial.

Tempo do tratamento endodôntico inicial (anos) n %

2 a 4 anos 6 30%

5 a 10 anos 8 40%

> 10 anos 6 30%

Total 20 100%

Tabela 6. Prevalência dos grupos dentais incluídos na pesquisa.

Grupos dentais n Frequência

Incisivo Central Superior 2 10%

Incisivo Lateral Superior 3 15%

Incisivo Lateral Inferior 1 5%

Canino Superior 1 5%

Pré-molar Superior 3 15%

Pré-molar Inferior 4 20%

Molar Superior 2 10%

Molar Inferior 4 20%

Total 20 100%

40

Em relação a qualidade da obturação observada na radiografia de diagnóstico

e seguindo os critérios previamente estabelecidos, observou-se maior prevalência

de obturação considerada ruim(12/20) em comparação com aquelas consideradas

boas(8/20). Todos os dentes estavam com restaurações definitivas (Tabela 7).

Tabela 7. Qualidade da obturação e selamento coronário dos dentes submetidos ao retratamento endodôntico.

Qualidade da obturação n %

Bom (obturação e limite adequados) 8 40%

Ruim (limite, áreas radiolúcidas ou deficiência no alargamento) 12 60%

Limite apical + Espaços vazios + Deficiência no alargamento 4 20%

Espaços vazios + Deficiência no alargamento 3 15%

Limite apical + Deficiência no alargamento 2 10%

Limite apical + Espaços vazios 2 10%

Deficiência no alargamento 1 5%

Selamento coronário n %

Resina Composta 15 75%

Núcleo Metálico Fundido+Coroa unitária 5 25%

Total 20 100%

Micro-organismos foram encontrados em todos os canais radiculares através

do cultivo no meio FAA. Na tabela 8 foi possível avaliarmos a quantidade de micro-

organismos cultiváveis presentes nos terços radiculares, com maior carga na coleta

do terço coronário, seguida do terço médio e apical, com diferença estatisticamente

significante entre os terços cervical e apical (p≤0,05). Já na Tabela 9, podemos

observar a redução bacteriana nos níveis globais e entre as substâncias utilizadas,

sendo que não foi observada diferença estatisticamente significante entre as

substâncias (p≤0,05).

41

Tabela 8. Avaliação da carga bacteriana na guta-percha pelos terços

radiculares (UFC/mL).

Guta-percha Valores Globais

Cervical 64,8±63,8 A

Média 32,8±29 A,B

Apical 7,6±6,5 B

Teste de Friedman p≤0,05

Tabela 9. Avaliação fases do retratamento endodôntico na redução dos níveis

bacterianos globais e por substâncias químicas auxiliares (UFC/mL). Média±desvio

padrão.

Substância química auxiliar

Fase do tratamento

Valores

Globais CLX 2% gel NaOCl 6%

Inicial 87,25±86,2 A 101,4±98,5 A 73,1±58,99 A

Após 1º.PQM 2,45±2,3 B 0,6±0,4 B 4,3±3,08 B

Antes 2º.PQM (canal vazio-2ª

sessão) 6,7±6,7 B 3,7±3,65 B 9,7±9,5 B

Depois 2º. PQM (2ª sessão) 0,2±0,15 B 0,2±0,17 B 0,2±0,06 B

Depois MIC (30 dias-3ª sessão) 1,1±0,8 B 1,2±1,08 B 1±0,07 B

Depois 3º. PQM (3ª sessão) 0 B 0 B 0 B

ANOVA para medidas repetidas. Letras diferentes indicam diferença estatística

significativa entre si (p<0,05).

A redução da carga bacteriana foi observada em todos os momentos do

retratamento endodôntico, no entanto após o canal ter sido mantido vazio por 7 dias,

houve um aumento quando comparado a coleta depois do PQM 1, sem diferença

estatística. Todas as etapas de preparo atuaram para uma efetiva desinfecção do

canal radicular (Figura 9).

42

Figura 8. Nível de micro-organismos nas diversas fases do retratamento endodôntico.

Identificação da espécie Enterococcus faecalis através da cultura, PCR e

sequenciamento

Através da cultura com meio seletivo M-Enterococcus foi possível observar a

prevalência do gênero Enterococcus, os quais estavam presentes em 60% (12/20)

das amostras do caso clínico estudado, e estiveram ausentes em 40% (8/20) das

amostras coletadas. Para caracterização fenotípica, foram realizadas as analises de

coloração de Gram e reação de catalase. De todos os isolados no meio m-

Enterococcus, dois apresentaram catalase positiva, portanto foram excluídos. Nos

outros a catalase foi negativa, como esperado para bactérias do gênero

Enterococcus. Na tabela 10 estão descritos os sítios/etapa de crescimento

bacteriano detectados através da técnica de cultura(meio m-Enterococcus).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

GutaCervical

GutaMédia

GutaApical

AntesPQM 1

DepoisPQM 1

AntesPQM 2

DepoisPQM 2

DepoisMIC

DepoisPQM 3

43

Tabela 10. Frequência de crescimento bacteriano a partir da cultura,

detectadas em meio m-Enterococcus, em diferentes sítios/ etapas de

crescimento.

Sítio/ Etapa Coletados n

GC 10/20

GM 8/20

GAP 4/20

A1 12/20

D1 1/20

A2 8/20

Guta-percha cervical (GC); Guta-percha média: (GM); Guta-percha apical: (GAP);

Antes do PQM 1: (A1); Depois do PQM 1: (D1); Antes do PQM 2, após 7 dias: (A2).

Na Figura 09 podemos verificar a alta seletividade do meio m-Enterococcus utilizado

na identificação de Enterococcus quando comparado com o PCR com primers

espécie-específico e Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA.

Figura 9. Identificação da espécie E. faecalis por cultura, PCR e sequenciamento.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Cultura PCR Sequenciamento

43 41 41

44

Após o crescimento pela cultura em meio seletivo e identificação por PCR e

sequenciamento, as 41 cepas identificadas como Enterococcus faecalis foram

testadas quanto sua suscetibilidade antibiótica contra os 18 antibióticos. Na Tabela

11 podemos observar os valores obtidos no antibiograma das cepas isoladas

clinicamente.

45

Tabela 11. Número de cepas de Enterococcus faecalis classificadas de

acordo com o halo de inibição, classificado em suscetível, intermediário e

resistente (n=41).

Halo de inibição (diâmetro)

Antibióticos Suscetível Intermediário Resistente

Amoxicilina (AMO) 41 0 0

Amoxicilina+Ácido clavulânico (AMC) 38 2 1

Ampicilina (AMP) 38 0 3

Azitromicina (AZI) 7 12 22

Ciprofloxacina (CIP) 7 16 18

Clindamicina (CLI) 2 1 38

Cloranfenicol (CLO) 34 5 2

Doxiciclina (DOX) 33 5 3

Eritromicina (ERI) 7 28 6

Fosfomicina (FOS) 33 7 1

Gentamicina (GEN) 1 5 35

Levofloxacina (LVX) 15 15 11

Nitrofurantoin (NIT) 1 33 7

Norfloxacina (NOR) 14 26 1

Rifampicina (RIF) 5 16 20

Teicoplanina (TEC) 21 14 6

Tetraciclina (TET) 30 5 6

Vancomicina (VAN) 9 15 17

46

6 DISCUSSÃO

O conhecimento da presença dos micro-organismos, quando caracterizado o

insucesso do tratamento endodôntico com evidência radiográfica de lesão periapical,

é bem estabelecido na literatura. Não obstante, ainda há uma lacuna nos trabalhos

in vivo no que diz respeito à presença de micro-organismos nos casos submetidos

ao retratamento endodôntico por motivos protéticos, sem lesão periapical. No intuito

de assegurar a longevidade de uma nova reabilitação protética, é indicado o

retratamento endodôntico, justificado pela degradação do material obturador ao

longo do tempo. Trabalhos indicam que após 15 anos já existe uma degradação da

guta-percha e redução de sua capacidade de selamento, comprometendo a

longevidade do tratamento (Maniglia-Ferreira et al, 2007).

Nos casos selecionados podemos relacionar a maior prevalência de micro-

organismos no terço coronário, com a possível infiltração pela restauração presente,

mesmo que definitiva, pois onde há perda ou deficiência do selamento coronário,

trabalhos na literatura indicam que o tempo de infiltração ocorre entre 3 dias a 3

meses (Swanson & Madison, 1987; Magura et. al, 1991; Khayat et al, 1993; Siqueira

et. al., 2000; Gadê Neto, 2004; Aminsobhani et al, 2010; Oliveira et al, 2013;

Markose et al, 2016; Al-Maswary et al, 2016). A ausência ou a deficiência do

tratamento restaurador é a principal característica relacionada a falha do tratamento

endodôntico (Ray & Trope, 1995; Kirkevang et al, 2000; Siqueira et al, 2005; Pedro

et al, 2016).

Os resultados desta pesquisa mostram a presença dos micro-organismos nos

casos de dentes submetidos ao retratamento endodôntico por motivo protético, ou

seja, sem imagem radiográfica de lesão periapical, sendo que, todos os casos

incluídos nesta pesquisa possuíam selamento coronário definitivo, com restauração

de resina composta ou núcleo metálico fundido associado à coroa total definitiva,

concordando com Shetty et al., 2015, que avaliando os materiais restauradores,

concluíram existir infiltração coronária em todas os materiais, inclusive resina

composta e amálgama de prata.

Ressalta-se que as coletas de guta-percha do terço coronário apresentam-se

com maior carga bacteriana quando comparado às coletas dos terços médio e

apical, com diferença estatisticamente significante, tendo uma diminuição

47

progressiva da carga bacteriana cervical para apical, justificado pelo tamanho e

número, permeabilidade dos túbulos dentinários (Carrigan et al, 1984; Stauffacher et

al, 2016), e maior proximidade com a cavidade oral, sendo mais suscetível assim, às

infiltrações de micro-organismos pela saliva (Vieira et al, 2012; Muliyar et al, 2014;

Taschieri et al, 2014; Mathur et al, 2015).

Além disso, foi observada uma redução estatisticamente significante da carga

bacteriana após o PQM com e sem a medicação intracanal, sem diferença entre

substância química auxiliar utilizada, clorexidina 2% gel ou NaOCl 6%, portanto

podemos observar que uma sessão única poderia ser instaurada, já que houve

crescimento bacteriano com o canal vazio. A instrumentação foi realizada com o

sistema lima rotatória reciprocante Reciproc, possibilitando um menor tempo de

preparo, efetiva desobturação e preparo do canal radicular. Com a utilização desta

lima rotatória reciprocante Reciproc, podemos observar redução dos micro-

organismos, sem diferença nesta redução, conforme observado em estudos

anteriores (Basmaci et al, 2013; Marinho et al, 2014).

A utilização de aparatos durante o PQM visou a geração de um fluxo

dinâmico, de inserção da substância química e sua aspiração, e agitação da

substância para promover a inserção desta em áreas não atingidas pelo preparo e

maior remoção de debris. Para isso foram utilizados o EndoVac, o qual gera maior

segurança principalmente na utilização de hipoclorito de sódio (Yost et al, 2015) e

irrigação ultrassônica passiva, esta auxilia na remoção da smear layer dos túbulos

dentinários (Prado et al, 2016). Ambos os aparatos foram complementares durante o

PQM com resultados satisfatórios, pois nosso resultado final foi de zero na

contagem de micro-organismos finais.

Na literatura há uma predominância da espécie Enterococcus faecalis nos

casos de insucesso do tratamento endodôntico (Wang et al, 2012; Endo et al, 2012,

2013; Ribeiro, 2015; Barbosa-Ribeiro et al, 2016). Partindo desta premissa

pretendeu-se no presente estudo verificar se nos casos em que não há evidência

radiográfica de lesão periapical, esta espécie também estaria presente.

Foi iniciada a identificação do micro-organismo E. faecalis através do

plaqueamento em meio de cultura seletivo m-Enterococcus, visto que este inibe o

crescimento de bactérias de outros gêneros. Utilizando o método de cultura em meio

específico, observamos a presença de Enterococcus spp em 60% (12/20) das

48

amostras. Trabalhos anteriores de Pinheiro et al 2003, Endo et al, 2013 e Barbosa-

Ribeiro et al, 2016b, mostraram a presença deste gênero em 36,7%, 20% e 100%

das amostras, respectivamente, os quais se tratavam de dentes relacionados ao

insucesso do tratamento endodôntico.

Para a identificação genotípica da espécie de E. faecalis, foram realizados

testes com métodos moleculares, sendo estes, PCR e sequenciamento. Os métodos

moleculares permitem uma maior especificidade e eficiência. No entanto, a

associação entre os métodos de cultura e moleculares é importante para sabermos

os micro-organismos viáveis. Associação de técnicas foram utilizadas por Gomes et

al., 2006; Di Santi et al, 2015; Barbosa-Ribeiro et al 2016b; Cardoso et al, 2016. No

presente estudo houve alta concordância entre as técnicas de identificação, sendo

que entre o PCR e o sequenciamento foram de 100%, e entre a cultura e método

molecular de 95,34%.

O teste de suscetibilidade antibiótica é amplamente utilizado em diversas

áreas da saúde, com a finalidade de saber a resistência e sensibilidade dos

antibióticos às bactérias testadas. Os valores de referência utilizados são descritos

pelo CLSI.

A importância da espécie E. faecalis ultrapassa a área da odontologia, pois

está associada a infecções em outras partes do corpo como é o caso de infecções

urinárias. Além disso, há uma dificuldade de removê-la quando se apresenta

resistente à vancomicina, especialmente em âmbito hospital. No presente estudo os

antibióticos mais efetivos contra E. faecalis foram amoxicilina, amoxicilina + ácido

clavulânico e ampicilina, corroborando com os de Pinheiro et al, em 2003.

A suscetibilidade à amoxicilina associada ao ácido clavulânico e a resistência

à gentamicina e clindamicina foram descritos por Lins et al., 2013; Al-Ahmad et al.,

2013; Barbosa-Ribeiro et. al., em 2016b; suscetibilidade esta também encontrada

em todas as cepas por Delboni em 2009. Um dado adicional é que no presente

estudo as cepas foram suscetíveis à amoxicilina na concentração de (100%) do que

à associação da amoxicilina a com ácido clavulânico (92%), possivelmente resultado

das diferentes concentrações dos antibióticos, sendo que no primeiro, a

concentração utilizada na indústria farmacêutica, é de 25g e quando a amoxicilina

utilizada estava na concentração de 20g.

49

A mudança do perfil de resistência antibiótica tem aumentado pelo uso

exacerbado, principalmente em casos sem indicação precisa ou auto-prescrição. Em

pacientes alérgicos à penicilina, vem sendo utilizada a clindamicina. Entretanto no

presente estudo, assim como no de Barbosa-Ribeiro et. al (2016b), este

medicamento mostrou baixa eficiência contra E. faecalis. Nesses casos, o antibiótico

que se mostrou ser a melhor alternativa de escolha é a doxiciclina e fosfomicina,

demonstrando ser eficiente em cerca de, 80,5% das amostras. Entretanto, apesar

dos resultados obtidos, de acordo com o guia CLSI, os trabalhos in vitro não devem

ser a única fonte de avaliação dos antibióticos.

Outro achado interessante deste estudo foi que 17 cepas apresentaram

resistentes à vancomicina. Essa resistência observada poderia justificar a

permanência destes micro-organismos nos casos de retratamento endodôntico. São

cepas de difícil tratamento, e que geram resistência a maioria das substâncias

químicas e medicações. Estas cepas, quando encontradas em âmbito hospitalar,

geram grande problema pela sua difícil erradicação.

O presente trabalho demonstrou a presença de micro-organismos em dentes

tratados endodonticamente, mas indicados para retratamento endodôntico por

motivo protético, devido a algum grau de inadequação do tratamento anterior ou ao

tempo do tratamento endodôntico inicial. Entretanto, tal presença não significa

insucesso do tratamento, a não ser que exista uma via de comunicação com o meio

externo. A permanência de E. faecalis em dentes tratados endodonticamente e o

desenvolvimento de resistência dos mesmos aos antibióticos prescritos na clínica

odontológica, ou por automedicação, indica a necessidade de um tratamento

endodôntico mais eficaz e do monitoramento periódico da suscetibilidade deste

micro-organismo aos agentes antimicrobianos sistêmicos.

50

7 CONCLUSÃO

Baseado nos resultados obtidos do presente estudo pode-se concluir que:

1 Foram encontrados micro-organismos em todos os canais radiculares, nas

amostras iniciais, indicados para retratamento endodôntico por motivos

protéticos, sem evidencia de lesão periapical.

2 Todas as etapas de instrumentação durante o retratamento endodôntico tiveram

efeito na redução na carga bacteriana.

3 O meio de cultura seletivo m-Enterococcus mostrou boa seletividade para o

gênero Enterococcus, apresentando valores semelhantes ao PCR e ao

sequenciamento parcial do gene 16S rRNA.

4 As cepas identificadas como Enterococcus faecalis apresentaram variados graus

de resistência aos agentes antimicrobianos, sendo mais suscetíveis à

amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e ampicilina.

51

Referências

Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE. Defining the normal bacteria

flora of the oral cavity. J Clin Microbiol. 2005; 43: 5721-32.

Akcay M, Arslan H, Durmus N, Mese M, Capar ID. Dentinal tubule penetration of AH

Plus, iRoot SP, MTA fillapex, and guttaflow bioseal root canal sealers after different

final irrigation procedures: A confocal microscopic study. Lasers Surg Med. 2016; 48:

70-6.

Al-Ahmad A, Ameen H, Pelz K, Karygianni L, Wittmer A, Anderson AC, et al.

Antibiotic resistance and capacity for biofilm formation of different bacteria isolated

from endodontic infections associated with root-filled teeth. J Endod. 2014; 40: 223-

30.

Al-Maswary AA, Alhadainy HAH, Al-Maweri SA. Coronal microleakage of the resilon

and gutta-percha obturation materials with epiphany SE sealer: An in-vitro study. J

Clin Diagn Res. 2016; 10: ZC39-42.

Alfouzan K, Baskaradoss JK, Geevarghese A, Alzahrani M, Alhezaini K.

Radiographic diagnosis of periapical status and quality of root canal fillings in a Saudi

Arabian subpopulation. Oral Health Prev Dent. 2016; 14: 241-8.

Alley BS, Kitchens GG, Alley LW, Eleazer PD. A comparison of survival of teeth

following endodontic treatment performed by general dentists or by specialists. Oral

Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004; 98: 115-8.

Alvanforoush N, Palamara J, Wong R, Burrow MF. A comparison between published

clinical success of direct resin composite restorations in vital posterior teeth in 1995-

2005 and 2006-2016. Aust Dent J. 2016. In press.

American Association of Endodontists. Antibiotics and the Treatment of Endodontic

Infections. Endodontics: Colleagues for Excellence. Summer 2006.

52

Aminsobhani M, Ghorbanzadeh A, Bolhari B, Shokouhinejad N, Ghabraei S,

Assadian H, et al. Coronal microleakage in root canals obturated with lateral

compaction, warm vertical compaction and guttaflow system. Iran Endod J. 2010; 5:

83-7.

Anderson AC, Jonas D, Huber I, Karygianni L, Wölber J, Hellwig E, et al.

Enterococcus faecalis from food, clinical specimens and oral sites: Prevalence of

virulence factors in association with biofilm formation. Front Microbiol. 2016; 6: 1534.

Andrade ED. Terapêutica Medicamentosa em Odontologia. Editora Artes Médicas. 3ª

Edição. 2014.

Aquilino SA, Caplan DJ. Relationship between crown placement and the survival of

endodontically treated teeth. J Prosthet Dent. 2002; 87: 256-63.

Attur K, Joy MT, Karim R, Anil Kumar VJ, Deepika C, Ahmed H. Comparative

analysis of endodontic smear layer removal efficacy of 17%

ethylenediaminetetraacetic acid, 7% maleic acid, and 2% chlorhexidine using

scanning electron microscope: an in vitro study. J Int Soc Prev Community Dent.

2016; 6: S160-5.

Barbosa-Ribeiro, M, De-Jesus-Soares A, Zaia, AA, Ferraz CCR, Almeida JFA,

Gomes BPFA. Quantification of lipoteichoic acid contents and cultivable bacteria at

the different phases of the endodontic retreatment. J Endod. 2016a; 42: 552-6.

Barbosa-Ribeiro M, De-Jesus-Soares A, Zaia AA, Ferraz CCR, Almeida JFA, Gomes

BPFA. Antimicrobial susceptibility and characterization of virulence genes of

enterococcus faecalis isolates from teeth with failure of the endodontic treatment. J

Endod. 2016b; 42: 1022-80.

Bernardes RA, Duarte MA, Vivian RR, Alcalde MP, Vasconcelos BC, Bramante CM.

Comparison of three retreatment techniques with ultrasonic activation in flattened

53

canals using micro-computed tomography and scanning electron microscopy. Int

Endod J. 2015. In press.

Blome B, Braun A, Sobarzo V, Jepsen S. Molecular identification and quantification

of bacteria from endodontic infections using real-time polymerase chain reaction.

Oral Microbiol Immunol. 2008; 23: 384-90.

Bowman GA. History of dentistry in Missouri. The Ovid Press Inc. 1938.

Bueno CE, Delboni MG, de Araújo RA, Carrara HJ, Cunha RS. Effectiveness of

Rotary and hand files in gutta-percha and sealer removal using chloroform or

chlorhexidine gel. Braz Dent J. 2006; 17: 139-43.

Burry JC, Stover S, Eichmiller F, Bhagavatula P. Outcomes of primary endodontic

therapy provided by endodontic specialists compared with other providers. J Endod.

2016; 42: 702-5.

Cai H, Chen J, Liu J, Zeng M, Ming F, Lu Z, et al. CRIP1, a novel immune-related

protein, activated by Enterococcus faecalis in porcine gastrointestinal epithelial cells.

Gene. 2017; 598: 84-96.

Cardoso FG, Chung A, Martinho FC, Camargo CH, Carvalho CA, Gomes BPFA, et

al. Investigation of bacterial contents from persistent endodontic infection and

evaluation of their inflammatory potential. Braz Dent J. 2016; 27: 412-8.

Carrigan PJ, Morse DR, Furst ML, Sinai IH. A scanning electron microscopic

evaluation of human dentinal tubules according to age and location. J Endod. 1984;

10: 359-63.

Chutich MJ, Kaminski EJ, Miller DA, Lautenschlager EP. Risk assessment of the

toxicity of solvents of gutta-percha used in endodontic retreatment. J Endod. 1998;

24: 213-6.

54

Conde AJ, Estevez R, Loroño G, Valencia de Pablo Ó, Rossi-Fedele G, Cisneros R.

Effect of sonic and ultrasonic activation on organic tissue dissolution from simulated

grooves in root canals using sodium hypochlorite and EDTA. Int Endod J. 2016. In

press.

Cope AL, Barnes E, Howells EP, Rockey AM, Karki AJ, Wilson MJ, et al.

Antimicrobial prescribing by dentists in Wales, UK: findings of the first cycle of a

clinical audit. Br Dent J. 2016; 221: 25-30.

Crozeta BM, Sousa-Neto MD, Leoni GB, Mazzi-Chaves JF, Silva-Sousa YT, Baratto-

Filho J. A micro-computed tomography assessment of the efficacy of rotary and

reciprocating techniques for filling material removal in root canal retreatment. Clin

Oral Investig. 2016; 20: 2235-40.

Çanakçi BC, Ustun Y, Er O, Genc OS. Evaluation of apically extruded debris from

curved root canal filling removal using 5 Nickel-Titanium systems. J Endod. 2016; 42:

1101-4.

Çiçek E, Özsezer-Demiryürek E, Özerol-Keskin NB, Murat N. Comparison of

treatment choices among endodontists, postgraduate studentes, undergraduate

students and general dentists for endodontically treated teeth. Int Dent J. 2016; 66:

201-7.

Dahlén G, Pipattanagovit P, Rosling B, Möller AJ. A comparison of two transport

media for saliva and subgingival samples. Oral Microbiol Immunol. 1993; 8: 375-82.

Dale JL, Cagnazzo J, Phan CQ, Barnes AM, Dunny GM. Multiple roles for

Enterococcus faecalis glycosyltransferases in biofilm-associated antibiotic resistance,

cell envelope integrity, and conjugative transfer. Antimicrob Agents Chemother.

2015; 59: 4094-105.

Delboni MG. Identificação dos microrganismos presentes na saliva, na coroa dental

e no canal radicular de dentes indicados ao retratamento endodôntico e análise da

55

suscetibilidade antimicrobiana, dos fatores de virulência e das impressões

genômicas dos Enterococcus faecalis isolados. Tese de Doutorado. FOP-Unicamp.

2009.

Del Fabbro M, Corbella S, Sequeira-Byron P, Tsesis I, Rosen E, Lolato A, et al.

Endodontic procedures for retreatment of periapical lesions. Cochrane Database

Syst Rev. 2016; 10: CD005511.

Demirbuga S, Pala K, Topçuoğlu HS, Çayabatmaz M, Topçuoğlu G, Uçar EN. Effect

of different gutta-percha solvents on the microtensile bond strength of various

adhesive systems to pulp chamber dentin. Clin Oral Investig. 2016. In press.

De-Paula KB, Silveira LS, Fagundes GX, Ferreira GX, Ferreira MB, Montagner F.

Patient automedication and professional prescription pattern in an urgency service in

Brazil. Braz Oral Res. 2014; 28: 1-6.

DHA. National clinical guideline on the use of antibiotics in connection with dental

treatment. https://sundhedsstyrelsen.dk/en/national-clinical-guidelines. Danish Health

Authority. 2016

Di Santi BT, Ribeiro MB, Endo MS, Gomes BPFA. Evaluation of antimicrobial

susceptibility of facultative anaerobic bacteria isolated in root-filled teeth with

persistent infection front to use of systemic antibiotics. Rev Odontol UNESP. 2015;

44: 200-6.

Donyavi Z, Ghahari P, Esmaeilzadeh M, Kharazifard M, Yousefi-Mashouf R.

Antibacterial efficacy of calcium-hydroxide and chlorhexidine mixture for treatment of

teeth with primary endodontic lesions: A randomized clinical trial. Iran Endod J. 2016;

11: 255-60.

Dornelles-Morgental R, Guerreiro-Tonomaru JM, de Faria-Júnior NB, Hungaro-

Duarte MA, Kuga MC, Tonomaru-Filho M. Antibacterial efficacy of Endodontic

irrigating solutions and their combinations in root canals contamined with

56

Enterococcus faecalis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2011;

112: 396-400.

Elouafkaoui P, Young L, Newlands R, Duncan EM, Elders A, Clarkson JE, Ramsay

C.R. An audit and feedback intervention for reducing antibiotic prescribing in general

dental practice: The RAPiD Cluster Randomised controlled trial. PLoD Med. 2016;

13: e1002115.

Endo MS. Investigação de microorganismos e endotoxinas em infecções

intrarradiculares associadas ao insucesso do tratamento endodôntico antes e após o

preparo químico-mecânico. Tese de doutorado. FOP Unicamp. 2012.

Endo MS, Ferraz CC, Zaia AA, Almeida JF, Gomes BPFA. Quantitative and

qualitative analysis of microorganisms in root-filled teeth with persistent infection:

Monitoring of the endodontic retreatment. Eur J Dent. 2013; 7: 302-9.

Endo MS, Signoretti FG, Kitayama VS, Marinho AC, Martinho FC, Gomes BPFA.

Culture and molecular detection of Enterococcus faecalis from patients with failure

endodontic treatment and antimicrobial susceptibility of clinical isolates. Braz Dent

Sci. 2014; 17: 83-91.

European Society of Endodontology. Quality guidelines for endodontic treatment:

consensus report of the European Society of Endodontology. Int Endod J. 2006; 39:

921-30.

Eyuboglu TF, Olcay K, Özcan M. A clinical study on single-visit root canal

retreatments on consecutive 173 patients: frequency of periapical complications and

clinical success rate. Clin Oral Invest. 2016. In press.

Fedorowicz Z, van Zuuren EJ, Farman AG, Agnihotry A, Al-Langawi JH. Antibiotic

use for irreversible pulpitis. Cochrane Database Syst Rev. 2013; 12: CD004969.

57

Ferrer M, Méndez-García C, Rojo D, Barbas C, Moya A. Antibiotic use and

microbiome function. Biochem Pharmacol. 2016. In press.

Forbes GM, Collins BJ, McCullough CA, Coombs GW, Robins PD. Short duration

therapy for Helicobacter pylori in Western Australia: the impact of metronidazole

resistance. Aust N Z J Med. 1998; 28: 13-7.

Ford TRP, Rhodes JS. Root canal retreatment: I. Case assessment and treatment

planning. Dent Update. 2004; 31:34-9.

Foschi F, Cavrini F, Montebugnoli L, Stashenko P, Sambri V, Prati C. Detection of

bacteria in endodontic samples by polymerase chain reaction assays and association

with defined clinical signs in Italian patients. Oral Microbiol Immunol. 2005; 20: 289-

95.

Franklin M, Wailoo A, Dayer MJ, Jones S, Prendergast B, Baddour LM, et al. The

cost-effectiveness of antibiotic prophylaxis for patients at risk of infective

endocarditis. Circulation. 2016; 15: 1568-78.

Fráter M, Braunitzer G, Urbán E, Bereczki L, Antal M, Nagy K. In vitro efficacy of

different irrigating solutions against polymicrobial human root canal bacterial biofilms.

Acta Microbiol Immunol Hung. 2013; 60: 187-99.

Friedman S, Stabholz A. Endodontic retreatment case selection and technique. Part

1: Criteria for case selection. J Endod. 1986; 12: 28-33.

Gadê Neto CR. Influência do selamento coronário na obturação endodôntica. Tese

de Doutorado. FOP-Unicamp. 2004.

Gomes BPFA, Berber VB, Kokaras AS, Chen T, Paster BJ. Microbiomes of

endodontic-periodontal lesions before and after chemomechanical preparation. J

Endod. 2015; 41: 1975-84.

58

Gomes BPFA, Drucker DB, Lilley JD. Associations of specific bacteria with some

endodontic signs and symptoms. Int Endod J. 1994; 27:291-8.

Gomes BPFA, Jacinto RC, Pinheiro ET, Sousa ELR, Zaia AA, Ferraz CCR, et al.

Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia and

Prevotella nigrescens in endodontic lesions detected by culture and by PCR. Oral

Microbiol Immunol. 2005; 20: 211-5.

Gomes BPFA, Lilley JD, Drucker DB. Variations in the susceptibilities of components

of the endodontic microflora to biomechanical procedures. Int Endod J.

1996; 29:235-41.

Gomes BPFA, Montagner F, Martinho F. Aspectos microbiológicos das infecções

endodônticas: conceitos e aplicações. In: Microbiologia e Imunologia geral e

Odontológica. Spolidorio DM, Duque C. São Paulo: Artes Médica., 2013b. vol 1, cap

8, pag 100-11.

Gomes, BPFA, Pinheiro, ET, Sousa, ELR, Jacinto, RC, Zaia AA, Ferraz, CCR, et al.

Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and by polymerase

chain reaction analysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006;

102: 247-53.

Gomes BPFA, Vianna ME, Zaia AA, Almeida JF, Souza-Filho FJ, Ferraz CC.

Chlorhexidine in endodontics Braz Dent J. 2013a; 24: 89-102.

Gonçalves LS, Rodrigues RC, Andrade Junior CV, Soares RG, Vettore MV. The

effect of sodium hypochlorite and chlorhexidine as irrigant solutions for root canal

disinfection: A systematic review of clinical trials. J Endod. 2016; 42: 527-32.

Gorni FG, Gagliani MM. The outcome of endodontic retreatment: a 2-yr follow-up. J

Endod. 2004; 30: 1-4.

59

Grande NM, Ahmed HM, Cohen S, Bukiet F, Plotino G. Current assessment of

reciprocation in endodontic preparation: A comprehensive review-Part I: Historic

perspectives and current applications. J Endod. 2015; 41: 1778-83.

Hawkey PM. The growing burden of antimicrobial resistance. J Antimicrob

Chemother. 2008; 62 suppl 1: i1-9.

Herrera DR, Martinho FC, de-Jesus-Soares A, Zaia AA, Ferraz CC, Almeida JF, et al.

Clinical efficacy of EDTA ultrasonic activation in the reduction of endotoxins and

cultivable bacteria. Int Endod J. 2016; In press.

Hertel M, Sommer K, Kostka E, Imiolczyk SM, Ballout H, Preissner S. Outcomes of

endodontic therapy comparing conventional sodium hypochlorite irrigation with

passive ultrasonic irrigation using sodium hypochlorite and

ethylenediaminetetraacetate. A retrospective analysis. Open Dent J. 2016; 10: 375-

81.

Holmstrup P, Klausen B. The growing problem of antimicrobial resistance. Oral Dis.

2016. In press.

Horvath SD, Altenburger MJ, Naumann M, Wolkewitz M, Schirrmeister JF.

Cleanliness of dentinal tubules following gutta-percha removal with and without

solvents: a scanning electron microscopic study. Int Endod J. 2009; 42: 1032-8.

Hoskin E, Veitz-Keenan A. Antibiotics are not useful to reduce pain associated with

irreversible pulpitis. Evid Based Dent. 2016; 17: 81-2.

Huumonen S, Suominen AL, Vehkalahti MM. Prevalence of apical periodontitis in

root filled teeth: findings from nationwide survey in Finland. Int Endod J. 2016. In

press.

60

Iqbal A. The attitudes of dentists toward the prescription of antibiotics during

endodontic treatment in north of Saudi Arabia. J Clin Diagn Res. 2015; 9: ZC82-4.

Imura N, Pinheiro ET, Gomes BPFA, Zaia AA, Ferraz CC, Souza-Filho FJ. The

outcome of endodontic treatment: a retrospective study of 2000 cases performed by

a specialist. J Endod. 2007; 33: 1278-82.

Inan U, Aydin C. Comparison of cyclic fatigue resistance of three different rotary

nickel-titanium instruments designed for retreatment. J Endod. 2012; 38 (1): 108-11.

Isenman H., Fisher D. Advances in prevention and treatment of vancomycin-resistant

Enterococcus infection. Curr Opin Infect Dis. 2016; 29: 577-82.

Jakovac S, Ferić Bojić E, Avdić Ibrišimović M, Tutiš B, Ostojić M, Hukić M.

Characteristics of vancomycin-resistant Enterococcus strains in the West Balkans: A

first report. Microb Drug Resist. 2016. In press.

Jain M, Singhal A, Gurtu A, Vinayak V. Influence of ultrasonic irrigation and

chloroform on cleanliness of dentinal tubules during endodontic retreatment-an vitro

SEM study. J Clin Diagn Res. 2015; 9: ZC11-5.

Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ. The effects of surgical exposures of dental

pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol.

1965; 20: 340-9.

Kara Tuncer A, Unal B. Comparison of sealer penetration using the EndoVac

irrigation system and conventional needle root canal irrigation. J Endod. 2014; 40:

613-7.

Karataş E, Kol E, Bayrakdar IŞ, Arslan H. The effect of chloroform, orange oil and

eucalyptol on root canal transportation in endodontic retreatment. Aust Endod J.

2016; 42: 37-40.

61

Kaşıkçi IB, Köseler I, Güneri P, Hülsmann M, Çalışkan MK. Efficiency and apical

extrusion of debris: a comparative ex vivo study of four retreatment techniques in

severely curved root canals. Int Endod J. 2016. In press.

Keles A, Kamalak A, Keskin C, Akçay M, Uzun I. The efficacy of laser, ultrasound

and self-adjustable file in removing smear layer debris from oval root canals following

retreatment: A scanning electron microscopy study. Aust Endod J. 2016; 42: 104-11.

Khalifa L, Shlezinger M, Beyth S, Houri-Haddad Y, Coppenhagen-Glazer S, Beyth N,

et al. Phage therapy against Enterococcus faecalis in dental root canals. J Oral

Microbiol. 2016; 8: 32157.

Khayat A, Lee SJ, Torabinejad M. Human saliva penetration of coronally unsealed

obturated root canal. J Endod. 1993; 19: 458-61.

Kim JJ, Alapati S, Knoernschild KL, Jeong YH, Kim DG, Lee DJ. Micro-computed

tomography of tooth volume changes following post removal. J Prosthodont. 2016. In

press.

Kirkevang L-L, Ørstavik D, Hörsted-Bindslev P, Wenzel A. Periapical status and

quality of root fillings and coronal restorations in a Danish population. Int Endod J.

2000; 33: 509-15.

Komiyama EY, Lepesqueur LS, Yassuda CG, Samaranayake LP, Parahitiyawa NB,

Balducci I, et al. Enterococcus species in the oral cavity: prevalence, virulence

factors and antimicrobial susceptibility. PLoS One. 2016; 11: e0163001.

Konstantinidi E, Psimma Z, Chávez de Paz LE, Boutsioukis C. Apical negative

pressure irrigation versus syringe irrigation: a systematic review of cleaning and

disinfection of the root canal system. Int Endod J. 2016. In press.

62

Koo H, Gomes BPFA, Rosalen PL, Ambrosano GM, Park YK, Cury JA. In

vitroantimicrobial activity of propolis and Arnica montana against oral pathogens.

Arch Oral Biol. 2000;45:141-8.

Krishnan N. We avoid antibiotic lock solutions due to fear of antibiotic resistance.

Semin Sial. 2016; 29: 289-91.

Landys Borén D, Jonasson P, Kvist T. Long-term survival of endodontically treated

teeth at a public dental specialist clinic. J Endod. 2015; 41: 176-81.

Leoni GB, Versiani MA, Silva-Sousa YT, Bruniera JF, Pécora JD, Sousa-Neto MD.

Ex vivo evaluation of four final irrigation protocols on the removal of hard-tissue

debris from the mesial root canal system of mandibular first molars. Int Endod J.

2016. In press.

Lewis MAO. Why we must reduce dental prescription of antibiotics: European Union

Antibiotic Awareness Day. Br Den J. 2008; 205: 537-38.

Łysakowska ME, Ciebiada-Adamiec A, Sienkiewicz M, Sokolowski J, Banaszek K.

The cultivable microbiota of primary and secondary infected root canals, their

susceptibility to antibiocs and association with signs and symptoms of infection. Int

Endod J. 2016; 49: 422-30.

Magura ME, Kafrawy AH, Brown Jr. CE, Newton CW. Human Saliva Coronal

Microleakage in Obturated Root Canals: An In Vitro Study. J Endod. 1991; 17: 324-

31.

Maniglia-Ferreira C, Silva Jr. JB, Paula RC, Feitosa JP, Cortez DG, Zaia AA, et al.

Brazilian gutta-percha points. Part I: chemical composition and X-ray diffraction

analysis. Braz Oral Res. 2005; 19: 193-7.

63

Maniglia-Ferreira C, Valverde GB, Silva Jr. JB, de Paula RC, Feitosa JP, de Souza-

Filho FJ. Clinical relevance of trans 1,4-polyisoprene aging degradation on the

longevity of root canal treatment. Braz Dent J. 2007; 18: 97-101.

Markose A, Krishnan R, Ramesh M, Singh S. A comparison of sealing ability of

various temporary restorative materials to seal the access cavity: an in vitro study. J

Pharm Bioallied Sci. 2016; 8: S42-S44.

Marinho AC, Martinho FC, Gonçalves LM, Rabang HR, Gomes BP. Does the

Reciproc file remove root canal bacteria and endotoxins as effectively as multifile

rotary systems? Int Endod J. 2015; 48: 542-8.

Marinho AC, Martinho FC, Zaia AA, Ferraz CC, Gomes BPFA. Monitoring the

effectiveness of root canal procedures on endotoxin levels found in teeth with chronic

apical periodontitis. J Appl Oral Sci. 2014; 22: 490-5.

Marinho AC, Martinho FC, Zaia AA, Ferraz CC, Gomes BP. Influence of the apical

enlargement size on the endotoxin level reduction of dental root canals. J Appl Oral

Sci. 2012; 20: 661-6.

Marra F, George D, Chong M, Sutherland S, Patrick DM. Antibiotic prescribing by

dentists has increased: Why? J Am Dent Assoc. 2016; 147: 320-7.

Marroquín BB, Wolf TG, Schürger D, Willershausen B. Thermoplastic properties of

endodontic gutta-percha: a thermographic in vitro study. J Endod. 2015; 41: 79-82.

Martinho FC, Freitas LF, Nascimento GG, Fernandes AM, Leite FRM, Gomes APM,

et al. Endodontic retreatment: clinical comparison on reciprocating systems versus

rotary system in disinfecting root canals. Clin Oral Invest. 2015; 19: 1411-7.

Mathur R, Sharma M, Sharma D, Raisingani D, Vishnoi S, Singhal D, et al.

Evaluation of coronal leakage following different obturation techniques and in-vitro

evaluation using methylene blue dye preparation. J Clin Diagn Res. 2015; 9: ZC13-7.

64

Mohammadzadeh Akhlaghi N, Baradan Mohajeri L, Fazlyab M. Tissue necrosis due

to chloroform: a case report. Iran Endod J. 2013; 8: 208-9.

Mohmmed SA, Vianna ME, Penny MR, Hilton ST, Mordan N, Knowles JC. A novel

experimental approach to investigate the effect of different agitation methods using

sodium hypochlorite as an irrigant on the rate of bacterial biofilm removal from the

wall of a simulated root canal model. Dent Mater. 2016; 32: 1289-300.

Molander A, Reit C, Dahlén G, Kvist T. Microbiological status of root-filled teeth with

apical periodontitis. Int Endod J. 1998; 31: 1-7.

Morrison D, Woodford N, Cookson B. Enterococci as emerging pathogens of

humans. Soc Appl Bacteriol Symp Ser. 1997; 26: 89S-99S.

Muliyar S, Shameem KA, Thankachan RP, Francis PG, Jayapalan CS, Hafiz KA.

Microleakage in endodontics. J Int Oral Health. 2014; 6: 99-104.

Mundy LM, Sahm DF, Gilmore M. Relationships between enterococcal virulence and

antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev. 2000; 13: 513-22.

Murad CF, Sassone LM, Faveri M, Hirata Jr. R, Figuiredo L, Feres M. Microbial

diversity in persistente root canal infections investigated by checkerboard DNA-DNA

hybridization. J Endod. 2014; 40: 899-906.

Murray BE. The life and times of the Enterococcus. Clin Microbiol Rev. 1990; 3: 46-

65.

Nóbrega LM, Delboni MG, Martinho FC, Zaia AA, Ferraz CC, Gomes BP. Treponema

diversity in root canals with endodontic failure. Eur J Dent. 2013; 7: 61-8.

65

Ng YL, Mann V, Gulabivala K. A prospective study of the factors affecting outcomes

of nonsurgical root canal treatment: part 1: periapical health. Int Endod J. 2011; 44:

583-609.

Oliveira DP. Avaliação “in vitro” da remoção de material obturador empregando

diferentes técnicas durante o retratamento endodôntico. Dissertação de Mestrado.

FOP-Unicamp. 2002.

Oliveira SGD, Gomes DJ, Costa MHN, Sousa ER, Lund RG. Coronal microleakage

of endodontically treated teeth with intracanal post exposed to fresh human saliva. J

Appl Oral Sci. 2013; 1: 403-8.

Owens Jr RC. Antimicrobial stewardship: concepts and strategies in the 21st century.

Diagn Microbial Infect Dis. 2008; 61: 110-28.

Pasricha SK, Makkar S, Gupta P. Pressure alteration techniques in endodontics – A

review of literature. J Clin Diagn Res. 2015; 9: ZE01-6.

Pawar R, Alqaied A, Safavi K, Boyoko J, Kaufman B. Influence of an apical negative

pressure irrigation system on bacterial elimination during endodontic therapy: a

prospective randomized clinical study. J Endod. 2012; 38: 1177-81.

Pedro FM, Marques A, Pereira TM, Bandeca MC, Lima S, Kuga MC, et al. Status of

endodontic treatment and the correlations to the quality of root canal filling and

coronal restoration. J Contemp Dent Pract. 2016; 17: 830-6.

Pinheiro ET, Gomes BP, Drucker DB, Zaia AA, Ferraz CC, Souza-Filho FJ.

Antimicrobial susceptibility of Enterococcus faecalis isolated from canals of root filled

teeth with periapical lesions. Int Endod J. 2004; 37: 756-63.

Pinheiro ET, Gomes BPFA, Ferraz CC, Teixeira FB, Zaia AA, Souza Filho FJ.

Evaluation of root canal microorganisms isolated from teeth with endodontic failure

and their antimicrobial susceptibility. Oral Microbiol Immunol. 2003; 18: 100-3.

66

Prado MC, Leal F, Gusman H, Simão RA, Prado M. Effects of auxiliary device use on

smear layer removal. J Oral Sci. 2016; 58: 561-7.

Poeschl PW, Spusta L, Russmueller G, Seemann R, Hirschl A, Poeschl E, et al.

Antibiotic susceptibility and resistance of the odontogenic microbiological spectrum

and its clinical impact on severe deep space head and neck infections. Oral Surg

Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010; 110: 151-6.

Quadros I. Avaliação dos tratamentos endodônticos realizados na Faculdade de

Odontologia de Piracicaba – Unicamp de 1998 a 2000. Dissertação de Mestrado.

FOP-Unicamp. 2003.

Rahimi S, Janani M, Lotfi M, Shasi S, Aghbali A, Vahid Pakdel M, et al. A review of

antibacterial agents in endodontic treatment. Iran Endod J. 2014; 9: 161-8.

Ray HA, Trope M. Periapical status of endodontically treated teeth in relation to the

technical quality of the root filling and the coronal restoration. Int Endod J. 1995; 28:

12-8.

Ribeiro AC, Matarazzo F, Faveri M, Zezell DM, Mayer MP. Exporing bacterial

diversity of endodontic microbiota by cloning and sequencing 16S rRNA. J Endod.

2011; 37: 922-6.

Ribeiro MB. Caracterização da microbiota e efeito do prepare químico-mecânico e

da medicação intracanal na redução de microrganismos, endotoxinas e citocinas

pró-inflamatórias em dentes com insucesso do tratamento endodôntico e presença

de lesão periapical. Dissertação de Mestrado. FOP-Unicamp. 2015.

Rico-Romano C, Zubizarreta-Macho Á, Baquero-Artigao MR, Mena-Álvarez J. Na

analysis in vivo of intracanal bacterial load before and after chemo-mechanical

preparation: A comparative analysis of two irrigants and two activation techniques. J

Clin Exp Dent. 2016; 8: e9-e13.

67

Rios MA, Villela AM, Cunha RS, Velasco RC, De Martin AS, Kato AS, et al. Efficacy

of 2 reciprocating systems compared with rotary retreatment system for gutta-percha

removal. J Endod. 2014; 40: 543-6.

Rodrigues RC, Antunes HS, Neves MAS, Siqueira Jr JF, Rôças IN. Infection control

in retreatment cases: In vivo antibacterial effects of 2 instrumentation systems. J

Endod. 2015; 14: 1600-5.

Rôças IN, Provenzano JC, Neves MA, Siqueira Jr. JF. Disinfection effects of rotary

instrumentation with either 2.5% sodium hypochlorite or 2% chlorhexidine as the

main irrigant: A randomized clinical study. J Endod. 2016; 42: 943-7.

Rôças IN, Hülsmann M, Siqueira Jr JF. Microorganisms in root canal-treated teeth

from a German population. J Endod. 2008; 34: 926-31.

Rolph HJ, Lennon A, Riggio MP, Saunders WP, MacKenzie D, Coldero L, et al

Molecular identification of microorganisms from endodontic infections. J Clin

Microbiol. 2001; 39: 3282–9.

Salim AM, Elgizoli B. Exploring the reasons why pharmacists dispense antibiotics

without prescriptions in Khartoum state, Sudam. Int J Pharm Pract. 2016. In press

Schilder H. Cleaning and shaping the root canal. D Clin N Amer. 1974; 18: 269-96.

Schirrmeister JF, Liebenow AL, Braun G, Wittmer A, Hellwig E, Al-Ahmad A.

Detection and eradication of microorganisms in root-filled teeth associated with

periradicular lesions: an in vivo study. J Endod. 2007; 33: 536–40.

Schmidt TF, Teixeira CS, Felippe MC, Felippe WT, Pashley DH, Bortoluzzi EA. Effect

of ultrasonic activation of irrigants on smear layer removal. J Endod. 2015; 41: 1359-

63.

68

Skucaite N, Peciuliene V, Vitkauskiene A, Machiulskiene V. Susceptibility of

endodontic pathogens to antibiotics in patients with symptomatic apical periodontitis.

J Endod. 2010; 36: 1611-6.

Skupien JA, Cenci MS, Opdam NJ, Kreulen CM, Huysmans MC, Pereira-Cenci T.

Crown vs. composite for post-retained restorations: A randomized clinical trial. J

Dent. 2016; 48: 34-9.

Shenoi PR, Morey ES, Makade CS, Gunwal MK, Khode RT, Wanmali SS. In vitro

evaluation of antimicrobial efficacy of chitosan and other endodontic irrigants against

Enterococcus faecalis. Gen Dent. 2016; 64: 60-3.

Shepard BD, Gilmore MS. Antibiotic-resistant enterococci: the mechanisms and

dynamics of drug introduction and resistance. Microbes Infect. 2002; 4: 214-24.

Silva EJNL, Sá L, Belladonna FG, Neves AA, Accorsi-Mendonça T, Vieira VTL, De-

Deus G, Moreira EJ. Reciprocating versus rotary systems for rott filling removal:

assessment of the apically extruded material. J Endod. 2014; 40: 2077-80.

Singh H, Kapoor P. A comparative evaluation of antibacterial efficacy of ‘Activ points’

and ‘Combi points’ as intra-canal medicaments against Enterococcus faecalis: an ex

vivo study. Oral Health Dent Manag. 2014; 13: 610-3.

Siqueira Jr JF, Rôças IN, Ricucci D, Hülsmann M. Causes and management of post-

treatment apical periodontitis. Br Dent J. 2014; 216: 305-12.

Siqueira Jr JF, Rôças IN. Exploiting molecular methods to explore endodontic

infections: part 1- current molecular technologies for microbiological diagnosis. J

Endod. 2005a; 31: 411-23.

Siqueira Jr JF, Rôças IN. Exploiting molecular methods to explore endodontic

infections: part 2: redefining the endodontic microbiota. J Endod. 2005b, 31:488-98.

69

Siqueira Jr JF, Rôças IN, Alves FR, Campos LC. Periradicular status related to the

quality of coronal restorations and root canal fillings in a Brazilian population. Oral


Siqueira Jr JF, Rôças IN. Polymerase chain reaction-based analysis of

microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral Med

Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004; 97: 85-94.

Siqueira Jr JF, Rôças IN, Favieri A, Abad EC, Castro AJR, Gahyva SM. Bacterial

leakage in coronally unsealed root canals obturated with 3 different techniques. Oral


Sjogren U, Hagglund B, Sundqvist G, Wing K. Factors affecting the long-term results

of endodontic treatment. J Endod. 1990; 16: 498-504.

Song M, Park M, Lee CY, Kim E. Periapical status related to the quality of coronal

restorations and root fillings in a Korean population. J Endod. 2014; 40: 182-6.

Souza PF, Gonçalves LCO, Marques AAF, Junior ECS, Garcia LFR, Carvalho FMA.

Root canal retreatment using reciprocating and continuous rotary nickel-titanium

instruments. Eur J Dent. 2015; 9: 234-9.

Stabholz A, Friedman S. Endodontic retreatment-Case selection and technique. Part

2: treatment planning for retreatment. J Endod. 1988; 14: 607-14.

Stauffacher S, Lussi A, Nietzsche S, Neuhaus KW, Eick S. Bacterial invasion into

radicular dentine-an in vitro study. Clin Oral Investig. 2016. In press.

Stavropoulou AF, Koidis PT. A systematic review of single crowns on endodontically

treated teeth. J Endod. 2007; 35: 761-7.

70

Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjögren U. Microbiologic analysis of teeth with

failed endodontic treatment and the outcome of conservative re-treatment. Oral Surg

Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1998; 85: 86-93.

Swanson K, Madison S. An evaluation of coronal microleakage in endodontically

treated teeth. Part I. Time Periods. J Endod. 1987; 13: 56-9.

Takahashi CM, Cunha RS, de Martin AS, Fontana CE, Silveira CF, da Silveira Bueno

CE. In vitro evaluation of the effectiveness of ProTaper universal rotary retreatment

system for gutta-percha removal with or without a solvent. J Endod. 2009; 35: 1580-

3.

Taschieri S, Del Fabbro M, Samaranayake L, Chang JW, Corbella S. Microbial

invasion of dentinal tubules: a literature review and a new perspective. J Investig Clin

Dent. 2014; 5: 163-70.

Taylor C, Roudsari RV, Jawad S, Darcey J, Qualtrough A. Modern endodontic

principles. Part 6: Managing complex situations. Dent Update. 2016; 43: 218-20, 223-

6, 229-32.

Tennert C, Fuhrmann M, Wittmer A, Karygianni L, Altenburger MJ, Pelz K., et al. New

bacterial composition in primary and persistent/secondary endodontic infections with

respect to clinical and radiographic findings. J Endod. 2014; 40: 670-7.

Torabinejad M, White SN. Endodontic treatment options after unsuccessful initial root

canal treatment: Alternatives to single-tooth implants. J Am Dent Assoc. 2016; 147:

214-20.

Torabinejad M, Corr R, Handysides R, Shahahang S. Outcomes of nonsurgical

retreatment and endodontic surgery: a systematic review. J Endod. 2009; 35: 930-7.

Uzunoglu E, Turker SA. Impact of different file systems on the amount of apically

extruded debirs during endodontic retreatment. Eur J Dent. 2016; 10: 210-4.

71

Valera MC, Oliveira SA, Maekawa LE, Cardoso FG, Chung A, Silva SF, Carvalho

CA. Action of chlorhexidine, zingiber officinale, and calcium hydroxide on Candida

albicans, Enterococcus faecalis, Escherichia coli and endotoxin in the root canals. J

Contemp Dent Pract. 2016; 17: 114-8.

van der Sluis L.W. Endodontic in motion: new concepts, materials and techniques 3.

The role of irrigants during root canal treatment. Ned Tijdschr Tandheelkd 2015; 122:

533-8.

van der Sluis LW, Shemesh H, Wu MK, Wesselink PR. An evaluation of the influence

of passive ultrasonic irrigation on the seal of root canal fillings. Int Endod J. 2007; 40:

356-61.

Vieira AR, Siqueira Jr. JR, Ricucci D, Lopes WS. Dentinal tubule infection as the

cause of recurrent disease and late endodontic treatment failure: a case report. J

Endod. 2012; 38: 250-4.

Vranakis I, Goniotakis I, Psaroulaki A, Sandalakis V, Tselentis Y, Gevaert K, et al.

Proteome studies of bacterial antibiotic resistance mechanisms. J Proteomics. 2014;

97: 88-99.

Zandi H, Rodrigues RC, Kristoffersen AK, Enersen M, Mdala I, Ørstavik D, Rôças IN,

Siqueira Jr JF. Antibacterial effectiveness of 2 root canal irrigants in root-filled teeth

with infection: A randomized clinical trial. J Endod. 2016; 42: 1307-13.

Zaura E, Brandt BW, Teixeira de Mattos MJ, Buijs MJ, Caspers MP, Rasid MU, et al.

Same exposure but two radically different responses to antibiotics: Resilience of the

salivary microbiome versus long-term microbial shifts in feces. MBio. 2015; 6: 1-11.

Zhang C, Du J, Peng Z. Correlation between Enterococcus faecalis and persistent

intraradicular infection compared with primary intraradicular infection: A systematic

review. J Endod. 2015, 41: 1207-13.

72

Zhu X, Wang Q, Zhang C, Cheung GS, Shen Y. Prevalence, phenotype, and

genotype of Enterococcus faecalis isolated from saliva and root canals in patients

with persistent apical periodontitis. J Endod. 2010; 36: 1950-5.

Zuolo AS, Mello Jr. JE, Cunha RS, Zuolo ML, Bueno CE. Efficacy of reciprocating

and Rotary techniques for removing filling material during root canal retreatment. Int

Endod J. 2013; 46: 947-53.

Yap B, Zilm PS, Briggs N, Rogers AH, Cathro PC. The effect of sodium hypochlorite

on Enterococcus faecalis when grown on dentine as a single- and multi-species

biofilm. Aust Endod J. 2014; 40: 101-10.

Yildirim A, Lübbers HT, Yildirim V. Endodontic filling points with gutta-percha –

requirements, composition and properties. Swiss Dent J. 2016; 126: 40-1.

Yost RA, Bergeron BE, Kirkpatrick TC, Roberts MD, Roberts HW, Himel VT, et al.

Evaluation of 4 different irrigating systems for apical extrusion of sodium

hypochlorite. J Endod. 2015; 41: 1530-4.

Wang QQ, Zhang CF, Chu CH, Zhu XF. Prevalence of Enterococcus faecalis in

saliva and filled root canals of teeth associated with apical periodontitis. Int J Oral

Sci. 2012; 4: 19-23.

Wenteler GL, Sathorn C, Parashos P. Factors influencing root canal retreatment

strategies by general practitioners and specialists in Australia. Int Endod J. 2015; 48:

417-27.

Wilcox LR. Endodontic retreatment: ultrasonics and chloroform as the final step in

reinstrumentation. J Endod. 1989; 15: 125-8.

73

ANEXO 1

Aspectos clínicos e radiográficos dos dentes submetidos ao retratamento endodôntico por motivos protéticos

Caso Dente

Dor Prévia e/ou Atual

Sensibilidade à Palpação

Dor à Percussão

Edema e/ou Fístula

Tempo do tratamento (anos)

Tipo de selamento coronário

Obturação Limite Apical (mm)

Espaços radiolúcidos

Deficiência no alargamento

1 11 - - - - 2 NMF+Coroa Ruim 0 X X

2 24 - - - - 20 RC Boa -1,5

3 45 - - - - 22 RC Boa -1

4 24 - - - - 5 RC Ruim -5

X

5 32 - - - - 6 RC Boa -1

6 16 - - - - 7 RC Ruim -4 X X

7 23 - - - - 5 RC Ruim -3 X X

8 22 - - - - 10 NMF+Coroa Ruim -3

X

9 35 - - - - 3 RC Ruim -3 X

10 46 - - - - 3 RC Ruim -2 X X

11 21 - - - - 10 RC Boa -1

12 12 - - - - 5 NMF+Coroa Ruim -2,5 X X

13 12 - - - - 15 NMF+Coroa Ruim -6 X X

14 27 - - - - 6 RC Boa -2

15 36 - - - - 11 RC Ruim -2 X X

16 47 - - - - 4 RC Boa -2

17 34 - - - - 2,5 NMF+Coroa Boa -1

18 24 - - - - 20 RC Ruim -3 X

19 37 - - - - 12 RC Boa -1

20 45 - - - - 3 RC Ruim 0 X

74

ANEXO 2



Contagem das UFC/mL em Meio de cultura FAA

Caso Dente GC GM GAP A1 D1 A2 D2 DMIC D3

1 11 10 4 1 7 0 5 1 0 0

2 24 104 192 53 356 3 15 0 0 0

3 45 160 49 0 82 0 9 1 0 0

4 24 176 84 0 126 0 1 0 5 0

5 32 5 1 0 14 0 0 0 3 0

6 16 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7 23 160 124 11 208 3 5 0 0 0

8 22 84 4 7 158 0 0 0 0 0

9 35 0 0 1 2 0 0 0 4 0

10 46 124 76 39 61 0 2 0 0 0

11 21 134 6 11 87 0 0 0 0 0

12 12 7 1 0 0 13 1 0 0 0

13 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 27 0 0 3 192 12 16 2 10 0

15 36 35 0 0 98 0 23 0 0 0

16 47 40 14 7 70 0 3 0 0 0

17 34 158 75 14 131 18 31 0 0 0

18 24 0 0 0 70 0 9 0 0 0

19 37 96 21 5 54 0 14 0 0 0

20 45 3 5 0 29 0 0 0 0 0

75

ANEXO 3



Presença de Enterococcus através do crescimento em meio M-Enterococcus

Caso Dente GC GM GAP A1 D1 A2 D2 DMIC D3

1 11 X 0 0 X 0 0 0 0 0

2 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 45 X X 0 0 0 0 0 0 0

4 24 X 0 0 0 0 X 0 0 0

5 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 16 X 0 0 0 0 X 0 0 0

7 23 X X 0 X 0 0 0 0 0

8 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 21 X X 0 0 0 0 0 0 0

12 12 0 0 X 0 0 0 0 0 0

13 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 27 X X X X X 0 0 0 0

15 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16 47 X X X X 0 X 0 0 0

17 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 24 X X 0 0 0 X 0 0 0

19 37 X X X X 0 0 0 0 0

20 45 0 X 0 0 0 X 0 0 0

76

ANEXO 4 – Ficha clínica utilizada na pesquisa

80

ANEXO 5. Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP-UNICAMP.

avaliação da presença de micro-organismos e...

Documents