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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Biologia

Vanessa Ayumi Ueno

Comparação dos compostos voláteis de duas espécies de

guaco (Mikania glomerata Sprenguel e Mikania laevigata

Sch.Bip. ex Baker) e os potenciais biológicos de seus óleos

essenciais

CAMPINAS

2018

Vanessa Ayumi Ueno

Comparação dos compostos voláteis de duas espécies de guaco (Mikania glomerata

Sprenguel e Mikania laevigata Sch.Bip. ex Baker) e os potenciais biológicos de seus óleos

essenciais

Orientadora: Profª. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya

CAMPINAS

2018

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biologia da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do título de Mestra em Biologia

Vegetal.

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA

VANESSA AYUMI UENO E ORIENTADA PELA PROF.ª

DRA. ALEXANDRA CHISTINE HELENA FRANKLAND

SAWAYA.

Campinas, 05 de março de 2018.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profª. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya

Profª. Dra. Vera Lúcia Garcia

Profª. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra

no processo de vida acadêmica da aluna.

AGRADECIMENTOS

A Deus.

A meus pais que sempre me apoiaram durante toda minha vida. À minha irmã, que apesar da

distância, sempre esteve presente e também me deu uma ajudinha na bancada. Ao Leon pelo

companheirismo, incentivos e apoio.

À professora Dra. Alexandra Sawaya por toda orientação, ensinamentos, paciência e dedicação.

À CAPES/CNPq pelo apoio financeiro. À UNICAMP por toda infraestrutura, em especial ao

Instituto de Biologia e ao Instituto de Química.

Ao laboratório ThoMSon do professor Dr. Marcos Eberlin pelo GC-MS com injetor

automático, pois sem esse equipamento, estaria injetando minhas amostras até agora. Ao David

por ter me ensinado tudo sobre GC-MS.

Ao professor Dr. Sodek por me permitir utilizar o GC-MS para as análises preliminares.

Ao professor Dr. Marcelo Lancellotti pelas análises antimicrobianas e ao professor Dr. Marcelo

Menossi e ao Pedro pelas análises antioxidantes.

À CEPAGRI-UNICAMP (Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas aplicada à

Agricultura) pelo fornecimento dos dados meteorológicos.

Aos colegas de laboratório Alexandre, Begoña, Elisa, João, e em especial, Mara e Bel por toda

ajuda, todas as conversas, idas a congressos e por toda essa amizade, que será eterna. Aos

amigos que fiz na Fisiologia Vegetal pelas conversas e pelos cafés. À Simone pela ajuda no

GC-MS. Ao Luciano pela ajuda na parte experimental dos tratamentos. Ao Carlão pelo auxílio

prestado no campo.

À todos que direta e indiretamente me ajudaram ao longo do meu mestrado, meu muito

obrigada!

RESUMO

Mikania laevigata e Mikania glomerata são plantas medicinais utilizadas na forma de chás e

xaropes para problemas inflamatórios do trato respiratório. Ambas constam no 1º Formulário

de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira (2011), aparentemente podendo ser utilizadas

indistintamente. Contudo, diversos estudos mostram que a composição química entre essas

espécies difere. Também há diferenças quando as plantas são submetidas a diferentes estresses

ambientais. Poucos estudos foram realizados com os compostos voláteis do guaco, menos ainda

sobre a alteração das substâncias voláteis frente à variação de fatores abióticos. O objetivo desse

trabalho foi avaliar como os compostos voláteis variam de acordo com as estações do ano e nos

diferentes horários do dia; se esses compostos são influenciados por variações nas condições

de cultivo como: temperatura, luminosidade e água; e se óleo essencial dessas espécies

apresenta ação antimicrobiana e antioxidante. O perfil químico dos voláteis indica que M.

laevigata e M. glomerata apresentam composição distinta, sendo claramente separadas nas

análises exploratórias de agrupamento (PCA). Apenas M. laevigata apresentou o composto

cumarina, considerado pela ANVISA o marcador químico da espécie e aparentemente o

composto responsável pelas atividades terapêuticas. Não houve diferença significativa entre as

coletas realizadas nos períodos da manhã e da tarde. Cumarina, α-pineno e biciclogermacreno

foram responsáveis pelo agrupamento das amostras de M. laevigata na maioria dos tratamentos

e estão em maiores concentrações nos voláteis desta espécie ao longo do ano. Para M.

glomerata, hexanal e 2-hexenal foram responsáveis pelo agrupamento das amostras em todos

os tratamentos e mais intensos em todos os meses. Quanto ao tratamento temperatura, alguns

compostos têm sua intensidade diminuída com o aumento da temperatura. O mesmo ocorre

com a luminosidade, as plantas submetidas à luz plena tiveram alguns de seus compostos

diminuídos se comparada com as condições de 50% e 75% de luz. No tratamento de déficit

hídrico, alguns compostos voláteis – como, por exemplo, os pinenos - tiveram sua intensidade

aumentada quando submetidos a seca. Em relação aos óleos essenciais, foi observado que M.

laevigata apresentou maiores rendimentos se comparado com M. glomerata. O mês de junho,

o mais frio, apresentou o maior rendimento. Os óleos das duas espécies apresentaram ação

antimicrobiana contra Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.

Também foi observada uma fraca ação antioxidante dos óleos.

Palavra-chave: Mikania laevigata; Mikania glomerata voláteis; óleo essencial; GC-MS;

atividade biológica.

ABSTRACT

Mikania laevigata and Mikania glomerata are medicinal plants used for inflammatory diseases

of the respiratory system. Both are included in the 1st Brazilian Phytotherapic Formulary

(2011), apparently being used without distinction. However, several studies show that the

chemical composition varies between these species. There are also differences when plants are

subjected to different environmental stresses. Few studies have been carried out with the

volatile compounds of guaco, even less about changes in aromas versus abiotic variation. The

objective of this work was to evaluate how volatile compounds vary according to the seasons

and at different times of the day; if these compounds are influenced by the variations in the

growth conditions such as: temperature, luminosity and water; and if essential oil of these

species show antimicrobial and antioxidant activity. The chemical profile of the volatiles

indicates that Mikania laevigata and Mikania glomerata have different composition; being

clearly separated in the exploratory grouping analyzes (PCA). Only M. laevigata presented the

compound coumarin, considered by ANVISA the chemical marker of the species and

apparently the compound responsible for the therapeutic activities. There was no significant

difference between the morning and afternoon collections. Coumarin, α-pinene and

bicyclogermacrene were responsible for grouping the samples of M. laevigata in most

treatments and were more intense in the volatiles of this species throughout the year. For M.

glomerata, hexanal and 2-hexenal were responsible for grouping the samples in all treatments

and were more intense in this species in all months. As for the temperature treatment, some

compounds were less intense with the increase of the temperature. The same occurred with

light, the plants subjected to full sunlight had some of their compounds reduced compared to

the conditions of 50% and 75% sunlight. In the treatment of water, some volatile compounds -

such as pinenes - had their intensity increased when subjected to drought. Regarding to essential

oils, it was observed that M. laevigata exhibited higher yields when compared to M. glomerata.

In June, the coldest month, the highest yield was observed. The oils of both species showed

antimicrobial action against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus

aureus. A weak antioxidant action of the oils was also observed.

Key-words: Mikania laevigata; Mikania glomerata; volatiles; essential oil; GC-MS; biological

activities.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Distribuição da família Asteraceae pelo mundo (Fonte: PIRANI; PRADO, 2015). 20

Figura 2. (A) Mikania glomerata Spreng. (B) Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker. (Foto:

própria autora). ......................................................................................................................... 22

Figura 3. Distribuição de Mikania laevigata e Mikania glomerata pelo Brasil (Fonte: FLORA,

2017). ........................................................................................................................................ 23

Figura 4. Esquema de um tricoma glandular. (FONTE: https://pt.slideshare.net/roci-

pantheraleo/tema-6-7148731). .................................................................................................. 26

Figura 5. (A) Esquema de uma seringa de SPME. (B) Esquema do processo de adsorção e

dessorção dos voláteis da fibra de SPME (Adaptado de Labsphere). ...................................... 31

Figura 6. (A) Estaca de Mikania laevigata utilizada na confecção de vasos para os tratamentos

de luminosidade, irrigação e temperatura. (B) Vaso de 1,0 L com muda após o enraizamento.

.................................................................................................................................................. 41

Figura 7. Fluxograma representando os tratamentos realizados com suas respectivas condições

e repetições. .............................................................................................................................. 43

Figura 8. Imagem das plantas submetidas ao tratamento de temperatura em câmara de

crescimento com luz LED controlada. ..................................................................................... 44

Figura 9. Tratamento de luminosidade a céu aberto. (1) condição de 50 % de luz. (2) 75 % de

luz. (3) luz plena. ...................................................................................................................... 45

Figura 10. Tratamento de irrigação em casa de vegetação. À direita é possível observar a

condição do excesso em bandejas cheias d´água. À esquerda encontram-se os vasos do controle

e da seca de modo aleatorizado. ............................................................................................... 46

Figura 11. Fluxograma das atividades desenvolvidas durante o projeto. ................................ 48

Figura 12. Extração dos óleos essenciais por hidrodestilação em aparelho de Clevenger

modificado. (Foto: própria autora). .......................................................................................... 50

Figura 13. Programação de temperatura utilizada nas análises cromatográficas em GC-MS.

Tempo total de corrida: 24 minutos. ......................................................................................... 52

Figura 14. Reação de oxirredução do DPPH na presença de quercetina................................. 54

Figura 15. Cromatograma dos compostos voláteis de uma (A) QC (mistura de todas amostras),

(B) Mikania laevigata e (C) Mikania glomerata capturadas por SPME e analisada em GC-MS.

Espécies coletadas em maio de 2017. ....................................................................................... 56

Figura 16. Análise de Componentes Principais (PCA) dos compostos voláteis de todos os

tratamentos. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (azul), M. glomerata (vermelho).

(B) gráfico de loadings. ............................................................................................................ 59

Figura 17. Análise de Componentes Principais (PCA) dos principais picos encontrados por

GC-MS do tratamento de temperatura. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (ML),

M. glomerata (MG) e Controle de Qualidade (QC). Os números representam a temperatura no

qual a amostra estava submetida seguida de sua repetição. (B) gráfico de loadings. .............. 60

Figura 18. Compostos voláteis de (A) M. laevigata e (B) M. glomerata nas diferentes condições

de temperatura. As barras indicam a intensidade média dos compostos e seus respectivos

desvios padrões: azul - planta submetidas a 15 °C, vermelho 25 °C e verde 35 °C. Letras

diferentes acima das barras indicam diferenças significativas (teste t de Tukey com p <0,05).

.................................................................................................................................................. 62


GC-MS do tratamento de luminosidade. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (ML),

M. glomerata (MG) e Controle de Qualidade (QC). Os números representam a porcentagem de

luminosidade das condições na qual a amostra estava submetida seguida de sua repetição. (B)

gráfico de loadings.................................................................................................................... 65

Figura 20. Compostos voláteis de M. laevigata dos tratamentos de luminosidade. Barras

indicam intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas

submetidas a 50 % de luminosidade, vermelho 75 % de luminosidade e verde a luz plena. Letras

diferentes acima das barras indicam diferenças significativas entre grupos pelo teste de Tukey

(p <0,05). .................................................................................................................................. 67

Figura 21. Compostos voláteis de M. glomerata dos tratamentos de luminosidade. Barras

indicam intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas

submetidas a 50 % de luminosidade, vermelho 75 % de luminosidade e verde a luz plena. Letras


(p <0,05). .................................................................................................................................. 68


GC-MS do tratamento de irrigação. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (ML), M.

glomerata (MG) e Controle de Qualidade (QC). E = plantas submetidas ao excesso de água. C

= plantas controle. S = plantas em déficit Hídrico. Os números em seguida representam as

repetições. (B) gráfico de loadings. .......................................................................................... 70

Figura 23. Compostos voláteis de M. laevigata dos tratamentos de irrigação. Barras indicam

intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas controle,

vermelho plantas submetidas ao déficit hídrico e verde plantas em excesso de água. Letras


(p <0,05). .................................................................................................................................. 71

Figura 24. Compostos voláteis de M. glomerata dos tratamentos de água. Barras indicam

intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas controle,

vermelho plantas submetidas a seca e verde plantas em excesso de água. Letras diferentes acima

das barras indicam diferenças significativas entre grupos pelo teste de Tukey (p <0,05). ...... 72

Figura 25. Variação média de temperatura e precipitação no período de desenvolvimento do

projeto (Fonte: CEPAGRI, 2017). T. min.: temperatura mínima; T. máx.: temperatura máxima.

.................................................................................................................................................. 74

Figura 26. Análise de Componentes Principais (PCA) dos principais compostos voláteis das

coletas mensais de guaco capturadaos por SPME. (A) Gráfico de escores ou amostras: M.

laevigata (ML), M. glomerata (MG) e Controle de Qualidade (QC). Cada cor representa um

mês do ano. (B) gráfico de loadings. ........................................................................................ 76


coletas mensais de M. laevigata capturadaos por SPME. (A) Gráfico de escores ou amostras.

Cada cor representa um mês do ano. (B) gráfico de loadings. ................................................. 77


coletas mensais de M. glomerata capturadaos por SPME. (A) Gráfico de escores ou amostras.

Cada cor representa um mês do ano. (B) gráfico de loadings. ................................................. 79

Figura 29. Porcentagem da área dos compostos voláteis de guaco durante o período de

desenvolvimento do projeto. Barra azul: M. laevigata, barra vermelha: M. glomerata com seus

respectivos desvios padrões. Letras maiúsculas diferentes em cima das barras indicam diferença

significativa (p<0,05) entre resultados de M. laevigata e letras minúsculas para M. glomerata.

.................................................................................................................................................. 81

Figura 30. Relação entre temperatura média do ar no dia da coleta e porcentagem da área dos

compostos voláteis encontrados em Mikania laevigata (azul) e Mikania glomerata (vermelho)

no período de desenvolvimento do projeto............................................................................... 84

Figura 31. Cromatograma dos óleos essenciais de (A) Mikania laevigata e (B) Mikania

glomerata analisados por GC-MS. Ambos os óleos foram extraídos no mês de maio de 2017

através da hidrodestilação. ........................................................................................................ 86

Figura 32. PCA dos resultados das análises dos óleos essenciais de guaco realizado por GC-

MS. (A) gráfico de loadings, em azul M. laevigata (ML) e em vermelho M. glomerata (MG)

(B) scores. ................................................................................................................................. 89

Figura 33. Rendimento (massa/massa) dos óleos essenciais de Mikania laevigata (azul) e

Mikania glomerata (vermelho) nos diferentes meses. A linha amarela representa a média de

temperatura no dia da coleta das folhas. ................................................................................... 91

Figura 34. Atividade antioxidante dos óleos essenciais de M. glomerata e M. laevigata testada

em placa de sílica. ..................................................................................................................... 95

Figura 35. Porcentagem de redução do DPPH do óleo essencial de guaco em diferentes

concentrações. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística para M.

laevigata e as letras minúsculas para M. glomerata. ................................................................ 96

Figura 36. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos de M. laevigata submetidos ao déficit

hídrico. Fotos tiradas no primeiro, quinto, oitavo, nono, décimo e último dia de experimento,

mostrando o comportamento da planta frente a condição de escassez de água. .................... 114

Figura 37. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos do grupo controle de M. laevigata. Fotos

tiradas no primeiro, quinto, oitavo, nono, décimo e último dia de experimento, mostrando o

comportamento da planta ao longo do período do tratamento. .............................................. 115

Figura 38. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos de M. glomerata submetidos ao déficit

hídrico. Fotos tiradas no primeiro, quinto, oitavo, nono, décimo e último dia de experimento,

mostrando o comportamento da planta frente a condição de escassez de água. .................... 116

Figura 39. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos do grupo controle de M. glomerata. Fotos


comportamento da planta ao longo do período do tratamento. .............................................. 117

Figura 40. Peso dos vasos ao longo dos dias. Pré-teste do tratamento de água para verificar o

comportamento das espécies frente às condições de déficit hídrico, excesso e o grupo controle.

Cada curva representa uma repetição. .................................................................................... 118

Figura 41. Potencial hídrico foliar medido através do aparelho de IRGA. Barras azuis

representam M. laevigata e vermelhas M. glomerata. Letras maiúsculas acima das barras

indicam diferenças estatísticas pelo tesde de Tukey (p<0,05) para M. laevigata e letras

minúsculas para M. glomerata................................................................................................ 119

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Compostos voláteis de guaco identificados de acordo com dados da literatura e seus

respectivos teores em %. ML = Mikania laevigata. MG = Mikania glomerata. OE = Óleo

Essencial. DVB/PDMS = Fibra de microextração de Divinilbenzeno/polidimetilsiloxano.

PDMS = Fibra de microextração de Polidimetilsiloxano. ........................................................ 34

Tabela 2. Propriedades físico-químicas dos solos utilizados nos ensaios. M.O.: Matéria

Orgânica. CTC: Capacidade de Troca de Cátions. ................................................................... 41

Tabela 3. Compostos voláteis das QCs identificados pelas análises em GC-MS utilizando a

fibra de microextração. Número do sinal refere-se ao cromatograma da Figura 14. Tempo de

retenção (em minutos), índice de retenção e % de área............................................................ 57

Tabela 4. Compostos dos óleos essenciais identificados pelas análises em GC-MS. Número do

sinal de acordo com o cromatograma da Figura 30. Tempo de retenção (em minutos), índice de

retenção e % área dos picos. ..................................................................................................... 87

Tabela 5. Massas dos óleos essencias (OE’s) e das folhas frescas (gramas) e rendimento dos

OE’s de Mikania laevigata e Mikania glomerata em porcentagem de massa/massa nos

diferentes meses do ano. Média da porcentagem do rendimento indicando diferença estatística

entre as espécies (ANOVA p<0,05). ........................................................................................ 90

Tabela 6. Ação antimicrobiana dos óleos essenciais de guaco em diferentes concentrações (+

= ativo). ..................................................................................................................................... 93

Tabela 7. Medidas do potencial hídrico foliar. ..................................................................... 119

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ANOVA: Análise de Variância

CE50: Concentração efetiva 50 %

CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

CTC: Capacidade de Troca de Cátions

DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

GC-MS: Cromatografia a Gás acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês: Gas

Chromatography with Mass Spectrometry)

IRGA: Analisador de Gás por Infravermelho (do inglês: Infrared Gas Analyzer)

M.O: Matéria Orgânica

m/z = Massa carga

N. sinal = Número do sinal

NIST = National Institute of Standards and Technology

PAR: Porcentagem de Radiação fotossinteticamente Ativa (do inglês: Percentage of

photosynthetically Active Radiation)

PCA: Análise de Componentes Principais (do inglês: Principal Components Analysis)

PC: Componente Principal (do inglês: Principal Component)

QC: Controle de Qualidade (do inglês: Quality Control)

SPME: Microextração em Fase Sólida (do inglês: Solid Phase Micro Extraction)

T. min.: Temperatura mínima

T. máx.: Temperatura máxima

Tr = Tempo de retenção

UFC = Unidade Formadora de Colônia

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ............................................................................................................... 5

RESUMO ................................................................................................................................... 6

ABSTRACT ............................................................................................................................... 8

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. 14

SUMÁRIO................................................................................................................................ 16

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 18

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 19

2.1 Família Asteraceae (Compositae) ........................................................................ .19

2.2 Gênero Mikania .................................................................................................... 20

2.2.1 Mikania laevigata e Mikania glomerata ............................................................ 21

2.3 Óleos Essenciais e Compostos Voláteis ............................................................... 24

2.3.1 Importância dos óleos essenciais para o reino vegetal ..................................... 26

2.3.2 Importância econômica dos óleos essenciais ..................................................... 27

2.3.3 Modos de extração dos óleos essenciais ............................................................ 28

2.3.4 Ações biológicas dos óleos essenciais................................................................ 29

2.4 Microextração em Fase Sólida (SPME) ................................................................ 30

2.5 Voláteis de Mikania laevigata e Mikania glomerata ............................................ 32

2.5.1 Variação dos compostos voláteis ....................................................................... 36

3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 39

3.1 Objetivo geral ........................................................................................................ 39

3.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 40

4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 40

4.1 Material vegetal .................................................................................................... 40

4.2 Produção de mudas ............................................................................................... 40

4.3 Tratamentos ........................................................................................................... 42

4.4 Variação mensal .................................................................................................... 47

4.5 Extração dos óleos essenciais ............................................................................... 49

4.6 Compostos voláteis capturados por microextração em fase sólida (SPME) ......... 50

4.7 Controle de Qualidade (QC) ................................................................................. 51

4.8 Análises Cromatográficas ..................................................................................... 51

Equação 1: Fórmula utilizada para cálculo do índice de retenção dos compostos voláteis.52

4.9 Atividades biológicas dos óleos essenciais ........................................................... 53

4.9.1 Atividade antimicrobiana ................................................................................... 53

4.9.2 Atividade antioxidante ........................................................................................ 53

4.10 Análises Estatísticas .............................................................................................. 55

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 55

5.1 Compostos voláteis capturados por fibra de microextração em fase sólida (SPME)55

5.2 Tratamentos ........................................................................................................... 59

5.2.1 Tratamento Temperatura ................................................................................... 59

5.2.2 Tratamento luminosidade ................................................................................... 64

5.2.3 Tratamento irrigação ......................................................................................... 69

5.3 Variação mensal dos voláteis por SPME .............................................................. 73

5.3.1 Condições climáticas durante o estudo .............................................................. 74

5.3.2 Análise dos voláteis ............................................................................................ 75

5.4 Óleos essenciais .................................................................................................... 85

5.4.1 Composição química .......................................................................................... 85

5.4.2 Rendimento dos óleos essenciais ........................................................................ 90

5.4.3 Atividade Antimicrobiana................................................................................... 92

5.4.4 Atividade Antioxidante ....................................................................................... 94

6. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 97

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 99

Anexo I – Análise Prévia do Solo .......................................................................................... 113

Anexo II – Pré-teste para o tratamento de irrigação ............................................................... 114

Anexo III – Declaração Bioética e Biossegurança ................................................................. 120

Anexo IV – Declaração de Direitos Autorais ......................................................................... 121

18

1. INTRODUÇÃO

As plantas medicinais sempre foram muito utilizadas pela população,

principalmente no passado em que essa era a única forma de tratamento terapêutico disponível.

Com o passar dos anos e com auxílio de pesquisas e tecnologia criaram-se moléculas sintéticas

que vieram a substituir as plantas medicinais (VEIGA; PINTO; MACIEL, 2005). Contudo,

hoje observa-se um resgate dos conhecimentos tradicionais e o aumento pela procura de

produtos de origem natural. Esse aumento no consumo de fitoterápicos está relacionado com

os elevados preços dos medicamentos alopáticos, com as dificuldades por parte da população

ao acesso de um serviço público de saúde, à facilidade de obtenção do material vegetal e pela

procura cada vez maior de terapias alternativas, decorrente de uma “consciência ecológica”

estabelecida pela sociedade (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008). A crença de que

produto natural é seguro por se tratar de uma fonte natural também é incentivada por

propagandas. Entretanto, em alguns casos, a ação farmacológica do produto não é

cientificamente comprovada (NICOLETTI et al., 2007).

Além disso, erros na identificação da espécie vegetal, o equivocado preparo do

fitoterápico e superdose podem ser perigosas, levando à reações adversas ou à ineficiência

terapêutica (WHO, 2004). Portanto, um estudo multidisciplinar para obtenção dos

medicamentos fitoterápicos é necessário, sendo importantes o desenvolvimento de pesquisa

desde o cultivo da espécie até a avaliação clínica do produto final (MACIEL et al., 2002).

Como uma forma de regulamentar os fitoterápicos brasileiros, a ANVISA

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária) emitiu em 2004 duas resoluções: a RDC 48 que

define os parâmetros para registro de medicamentos fitoterápicos, bem como determina a

forma como devem ser comprovadas sua eficácia, segurança e boas práticas de fabricação

(ANVISA, 2004a). A RE 89 define uma lista de 34 espécies de plantas medicinais cuja

segurança já fora comprovada (ANVISA, 2004b), nela consta Mikania glomerata, com

indicação expectorante e broncodilatadora.

Em 2011 foi lançado o 1º Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira

(ANVISA, 2011), no qual são catalogadas 47 espécies de plantas medicinais com suas

respectivas formulações oficiais. Nessa lista aparecem Mikania glomerata e Mikania laevigata

com instruções para preparo de tintura exatamente na mesma proporção de folhas secas para

solvente. O formulário também define a cumarina como marcador químico para ambas as

19

espécies. Porém, vários trabalhos divergem sobre sua presença nos extratos e xaropes feitos à

base de guaco (BERTOLUCCI et al., 2009; BOLINA; GARCIA; DUARTE, 2009; DE MELO;

SAWAYA, 2015; DOS SANTOS et al., 2006).

Além da variação do marcador cumarina entre as duas espécies, estudos indicam

que ocorre variação da composição química quando as plantas são submetidas a diferentes

condições ambientais (BERTOLUCCI et al., 2013; DE LAZZARI ALMEIDA et al., 2017) e

em diferentes estações do ano (XAVIER, 2015). Estas incongruências entre os resultados de

diversos estudos das duas principais espécies de guaco, M. laevigata e M. glomerata, podem

ser o resultado de erros na identificação botânica das amostras, variabilidade genética das

espécies com diferentes quimiotipos, diferenças nas condições de cultivo e, finalmente,

diferenças no modo de secagem e extração (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Por conta disso, um dos objetivos desse trabalho é verificar se há diferença entre

os compostos voláteis de Mikania laevigata e Mikania glomerata quando submetidas a

diferentes condições ambientais. Também será observada se essa composição se altera com a

sazonalidade. Por fim, os óleos essenciais dessas espécies serão testados contra algumas

bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, assim como será avaliada sua atividade

antioxidante.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Família Asteraceae (Compositae)

Asteraceae (Compositae) é uma das maiores famílias de angiospermas

compreendendo 25.000 espécies pertencentes a 1.600 gêneros dispostos em 17 tribos e três

subfamílias, o que representa cerca de 10% da flora mundial (BREMER, 1994). No Brasil, a

família está representada por aproximadamente 196 gêneros e cerca de 1.900 espécies

(BARROSO, et al. 1991), ocorrendo em quase todas as formações vegetais. É considera

cosmopolita, sendo encontrada em todos os continentes, com exceção da Antártida (Figura 1),

sendo mais amplamente disseminada na região tropical, subtropical e na zona temperada

(NAKAJIMA; SEMIR, 2001).

20

Muitas espécies da família Asteraceae possuem elevado valor econômico e

ornamental, sendo alguns representantes dessa família o absinto (Artemisia absinthium), a

alface (Lactuca sativa), o girassol (Helianthus sp.), o crisântemo (Chrysanthemum sp.), a

margarida (Bellis perenis), entre muitas outras (JUDD, et al. 2009). Como característica

principal da família tem-se a inflorescência em capítulo formado de flores sésseis, 1-500 ou

mais por capítulo, maturação indeterminada. São ervas anuais, bianuais ou perenes, arbustos,

subarbustos. Plantas glabras ou com tricomas tectores e/ou glandulares. Caule geralmente

cilíndrico. Folhas em roseta, alternas, opostas, alterno-opostas, estípulas ausentes (ROQUE;

BAUTISTA, 2008).

2.2 Gênero Mikania

O gênero Mikania Willd. apresenta cerca de 450 espécies distribuídas

principalmente nas regiões tropicais e subtropicais das américas, sendo sua maior riqueza

concentrada na região andina e principalmente no Brasil, nas regiões sul e sudeste (HOLMES,

1996). No Brasil já foram listadas 201 espécies (RITTER, 2017), que ocorrem principalmente

em regiões de mata atlântica, geralmente habitando suas orlas e, menos frequente, seu interior

(KING & ROBINSON, 1987).

O gênero é facilmente reconhecido por apresentar capítulos com quatro flores e

quatro brácteas involucrais, porém, as plantas apresentam alta plasticidade fenotípica, o que

dificulta a identificação das espécies. Ocorre uma grande variação morfológica de suas

estruturas vegetativas, tipos de florescências, formato da corola, presença de indumento e

Figura 1. Distribuição da família Asteraceae pelo mundo (Fonte: PIRANI; PRADO, 2015).

21

tamanho dos lobos da corola (RITTER & MIOTTO, 2005). Devido a essas variações muitas

espécies do gênero são identificadas erroneamente.

2.2.1 Mikania laevigata e Mikania glomerata

Mikania laevigata Sch. Bip. ex Baker. (Figura 2B), também chamada

popularmente de guaco-cheiroso, guaco-de-casa e guaco-do-mato, é uma trepadeira volúvel

com folhas ovais, oblongas e lanceoladas, margem não lobada, base arredondada, ápice

acuminado, trinérvea e consistência coriácea. As inflorescências são do tipo capítulo dispostas

em ramos ou glomérulos. Os frutos são do tipo aquênio glabro (OLIVEIRA et al., 1986). A

floração da espécie ocorre entre agosto a outubro, durante a primavera (MORAES, 1997).

Mikania glomerata Spreng. (Figura 2A) é conhecida popularmente como guaco,

coração-de-jesus, cipó-caatinga, erva-de-cobra e uaco (LORENZI & MATOS, 2008). É

considerada uma trepadeira volúvel com ramos cilíndricos, estriados e glabros (RITTER &

MIOTTO, 2005). Suas folhas possuem forma deltoide a oval, margem pronunciadamente

lobada, base cordada, ápice agudo, consistência subcoriácea com entre três e cinco nervuras.

As inflorescências são do tipo capítulo e os frutos são aquênio glabro (LORENZI &MATOS,

2008; OLIVEIRA et al., 1986). A floração ocorre em julho, no inverno (MORAES, 1997).

22

Poucos trabalhos a respeito da polinização e dispersão dos frutos foram publicados.

Holmes (1996) descreve as espécies como anemófilas, uma vez que suas flores são do tipo

glomérulo e leves suficientes para serem levadas pelo vento. Já Gentry (1991) sugere que as

plantas seriam polinizadas por pequenos insetos, como abelhas e borboletas. A dispersão dos

frutos e sementes parece ser por anemocoria ou, menos frequentemente por hidrocoria

(HOLMES, 1996).

M. laevigata e M. glomerata são consideradas espécies próximas, portanto, são

muitas vezes confundidas entre si. Além disso, a morfologia de suas folhas possuem grande

(A)

(B)

Figura 2. (A) Mikania glomerata Spreng. (B) Mikania laevigata Sch. Bip. ex Baker. (Foto: própria

autora).

23

plasticidade, sendo encontrado na literatura descrições desde folhas ovais, lanceoladas,

deltoides a cordiformes e bases foliares arredondadas, truncadas, cordadas, obtusas,

cordiformes ou subcordiformes (BRASIL, 2011; GASPARETTO et al., 2010; MORAES,

1997; OLIVEIRA et al., 1986). Em um trabalho realizado anteriormente pelo grupo de

pesquisa, Costa (2016) diferenciou as espécies utilizando-se de caracteres anatômicos,

morfológicos e químicos. Chegou à conclusão de que o perfil químico foi crucial na separação

das espécies. A estrutura anatômica e a morfologia das folhas cultivadas em campo aberto não

foram parâmetros decisivos na diferenciação entre as espécies, uma vez que essas plantas

apresentam plasticidade fenotípica.

Outro fator que leva à identificação equivocada entre M. laevigata e M. glomerata

é que as duas ocorrem na mesma área do território brasileiro, sendo sua presença confirmada

no nordeste (Bahia), sudeste (Espirito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo) e Sul

(Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina) (Figura 3). Ambas também habitam os mesmos

domínios fitogeográficos, sendo eles o cerrado e a mata atlântica, preferindo as florestas

ciliares, ombrófilas e ombrófilas mistas (RITTER, 2017).

A principal diferença morfológica que se observa entre as espécies é que as folhas

de M. glomerata apresentam dois lóbulos em sua base desde seus primórdios foliares, já as

Figura 3. Distribuição de Mikania laevigata e Mikania glomerata pelo Brasil (Fonte: FLORA, 2017).

24

folhas jovens de M. laevigata são oblongas e lanceoladas e quando adultas são mais duras

(coriáceas) e de cor verde mais escuro que as de M. glomerata (COSTA, 2016). Além disso,

ao amassar as folhas de M. laevigata é possível sentir um cheio adocicado, devido à presença

de cumarina nas folhas (THEZOLIN, 2002).

A cumarina (1-2-benzopirona) é considerada pela ANVISA o marcador químico

para ambas as espécies de guaco (BRASIL, 2011). Entretanto, vários trabalhos divergem sobre

sua presença nos extratos e xaropes. Santos (2005) relataram que o extrato de M. glomerata

tinha aproximadamente o dobro de cumarina do extrato de M. laevigata. Bolina et al. (2009)

concluíram que, embora a M. laevigata tenha apresentado maior teor de cumarina (0,43%) que

a M. glomerata (0,30%), as duas poderiam ser usadas indistintamente. Já Bertolucci et al,

(2009) observaram marcantes diferenças na composição dos extratos das duas espécies, o que

contrasta com o estudo de Bolina et al. (2009). Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa

também relataram uma marcante diferença na composição dos extratos das duas espécies, com

baixos teores de cumarina em M. glomerata (DE MELO & SAWAYA, 2015).

A cumarina também é considerada como sendo o composto responsável por

algumas atividades terapêuticas, como por exemplo, as ações antiespasmódica e

broncodilatadora (LEITE et al., 1993). Portanto, se faz necessária a correta identificação das

espécies para que se garanta que o princípio ativo esteja presente nos medicamentos

fitoterápicos comercializados. Além dessas principais ações, foram descritas efeitos anti-

inflamatórios (SANTOS, 2005; SUYENAGA et al., 2002), antialérgicos (FIERRO et al.,

1999), antifúngicos (MAIZA et al., 2013), antibacterianos (ARAÚJO et al., 2004), ação tônica,

depurativa, antipirética, estimulante do apetite e antigripal (LORENZI; MATOS, 2008) para

estas espécies.

2.3 Óleos Essenciais e Compostos Voláteis

Óleos essenciais ou óleos voláteis são definidos como produtos obtidos através da

destilação por arraste a vapor d´água proveniente de algum material vegetal. Também é

considerado óleo essencial o produto obtido ao espremer o pericarpo de frutos cítricos (ISO,

2003). Eles recebem essa denominação devido a algumas de suas características físico-

químicas, como por exemplo, a de se manter líquida a temperatura ambiente, com um aspecto

oleoso. São apolares, solúveis em solventes orgânicos e pouco solúveis em água. Entretanto, a

25

principal característica é sua volatilidade, o que confere o intenso aroma ou essência da maioria

das plantas (SIMÕES & SPITZER, 2007, cap. 18).

Simões & Spitzer (2007) atribuem ainda outras características dos óleos essenciais,

como seu sabor ácido, coloração levemente amarelada ou incolor, pouca estabilidade na

presença de luz, calor, ar, umidade e metais; e apresentam índice de refração, sendo

opticamente ativos. Essas últimas propriedades são utilizadas na sua identificação e no controle

de qualidade desses produtos.

Os constituintes dos óleos essenciais variam muito, sendo considerada uma

mistura complexa, podendo existir desde hidrocarbonetos a álcoois, terpenos, aldeídos, cetonas,

fenóis, ésteres, éteres, óxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas e cumarinas. Dentre estes, os

terpenóides são encontrados com maior frequência, sendo que os monoterpenos chegam a

compor até 90 % de um óleo essencial. Na maioria dos óleos voláteis há sempre um composto

em maior concentração, também chamado de composto majoritário, os outros compostos

apresentam quantidades variadas e podendo existir também traços, que são os compostos

encontrados em baixíssimas concentrações (SIMÕES; SPITZER, 2007).

Os óleos essenciais são produtos do metabolismo secundário das plantas,

encontrados principalmente em tricomas glandulares onde são armazenados em um espaço

extracelular modificado na parede celular (Figura 4). Acredita-se que o óleo seja sintetizado

em uma das células do tricoma que depois é armazenado na cabeça esférica no topo (TAIZ;

ZEIGER, 2013). Além dos tricomas, os óleos voláteis podem ser encontrados em outras

estruturas secretoras especializadas, dependendo da família à qual a planta pertence. Podem

ocorrer em pelos glandulares no caso das Lamiaceae, em células parenquimáticas diferenciadas

em Lauraceae, Piperaceae e Poaceae, ou em canais oleíferos, característico de Pinaceae,

Rutaceae e Apiaceae. Essas estruturas secretoras estão presentes em praticamente todos os

órgãos vegetais, como flores, folhas, caules, raízes, rizomas, frutos e sementes (SIMÕES;

SPITZER, 2007).

26

2.3.1 Importância dos óleos essenciais para o reino vegetal

Para as plantas, os óleos voláteis são utilizados na atração de polinizadores, na

defesa contra o ataque de predadores, na proteção contra perda de água e aumento de

temperatura e na inibição de germinação (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). Flores como a

Dama da Noite (Cestrum nocturnum) exalam um forte aroma durante a noite, quando o estímulo

visual não é muito empregado para atrair polinizadores devido à ausência de luz. Desse modo,

a flor consegue atrair polinizadores, como mariposas (HEATH et al., 1992). Abelhas e

borboletas também são guiadas através das essências exaladas pelas plantas.

Os voláteis liberados pelas plantas também funcionam como uma forma de

comunicação entre elas, tema bastante estudado atualmente pela Ecologia Química. Em uma

revisão da literatura, Pinto-Zevallos et al. (2013) descrevem a interação planta-planta e planta-

inseto através dos aromas emitidos pelos vegetais. Ao sofrer um ataque de herbivoria, a planta

pode liberar voláteis que atraem os inimigos naturais desse inseto, o que é vantajoso tanto para

planta como para o predador. O volátil também pode alertar as plantas vizinhas, que se

“preparam” para um ataque de herbivoria, seja ativando genes de defesa ou produzindo

proteínas impalatáveis (TON et al., 2007).

Voláteis como o isopreno e os terpenóides também participam da proteção da planta

contra oxidação. Esses compostos interagem com o ozônio da atmosfera e com espécies reativas

de oxigênio, diminuindo suas concentrações dentro da planta até um nível que não seja

Figura 4. Esquema de um tricoma glandular. (FONTE: https://pt.slideshare.net/roci-pantheraleo/tema-

6-7148731).

27

prejudicial ou tóxico (LORETO et al., 2001). Os monoterpenos parecem estar relacionados com

a proteção da planta contra altas temperaturas. Copolovici (2005) observou que esses

compostos são responsáveis por reduzirem a condutância estomática e diminuírem o transporte

fotossintético de elétrons, o que ajuda na manutenção da temperatura dentro da planta.

Por fim, os compostos voláteis podem inibir ou estimular a germinação de sementes

ou influenciar o desenvolvimento de outras plantas relativamente próximas. Esse fenômeno é

chamado de alelopatia e foi primeiramente descrito por Molisch (1937). Um exemplo clássico

de alelopatia é a inibição da germinação em espécies de Eucalyptus sp. (GOETZE; THOMÉ,

2004). Terpenóides voláteis e outros compostos aleloquímicos são encontrados em suas folhas,

podendo ser eliminados rapidamente para o ambiente ou acumulados no solo por vários

períodos (PEREIRA; COSTA; BORÉM, 2003).

2.3.2 Importância econômica dos óleos essenciais

A história da produção de óleos essenciais data de 3500 a.C., quando foi encontrado

o mais antigo equipamento de destilação à água. A Índia, China e Egito eram os locais de

maiores produções de óleos essenciais e eram amplamente utilizados como medicamentos e

como fragrâncias (BASER; BUCHBAUER, 2010).

Atualmente, os óleos essenciais são largamente utilizados nas indústrias de

perfumaria, cosméticos, farmacêuticas, maquiagens, produtos de limpeza, odontologia e no

agronegócio. Isso se deve a algumas propriedades dos óleos essenciais, como suas fragrâncias

e algumas propriedades terapêuticas, analgésicas, sedativas, anti-inflamatórias e

antimicrobianas (BAKKALI et al., 2008).

Mais recentemente, tem-se estudado a utilização dos óleos na aromaterapia. Esse

tipo de tratamento faz parte das “terapias complementares” também conhecidas como “terapias

naturais” ou ”alternativas”, que são definidas pela Lei Municipal de São Paulo 13.717,

implementada em 2004 (SÃO PAULO, 2004). Os óleos são empregados com a finalidade de

equilibrar emoções, melhorar o bem-estar físico e mental, diminuindo assim a ansiedade, o

estresse e aumentando a concentração dos pacientes (GNATTA; DORNELLAS; DA SILVA,

2011; LYRA et al., 2010). Deste modo, os óleos essenciais das plantas medicinais podem

contribuir para sua atividade terapêutica.

28

2.3.3 Modos de extração dos óleos essenciais

O método mais clássico para obtenção dos óleos essenciais é a destilação por arraste

a vapor. Ele consiste em submeter o material vegetal à ação do vapor d´água, fazendo com que

o vapor atravesse o vegetal e leve consigo o óleo volátil. Após a condensação, o óleo e a água

retornam ao seu estado líquido e são separados de acordo com sua densidade (KOKETSU;

GONÇALVES, 1991). A única desvantagem desse método é a necessidade de grande

quantidade de material vegetal.

A hidrodestilação (Figura 5) assemelha-se a destilação por arraste a vapor. A

diferença é que neste caso, o material vegetal é imerso em água. Esse método consiste em

colocar uma quantidade de material vegetal em um balão e adicionar água, após acoplado ao

condensador, é deixado ferver por 2 a 5 horas, até a obtenção do óleo (MING et al., 1996).

Apesar desse processo ser simples e barato pode apresenta algumas desvantagens dependendo

da espécie utilizada na extração. Como exemplos de inconveniências podemos citar o baixo

rendimento e a perda ou oxidação de alguns compostos, devido a necessidade da fervura do

material em altas temperaturas por um longo período de tempo (DREW et al., 2012; JELEŃ;

GRACKA, 2015).

Outro método para extrair óleos essenciais é através da extração com solvente

orgânico. Porém, esse processo também apresenta alguns problemas, como a possibilidade de

extração de compostos indesejáveis (gordura, ceras, pigmentos, etc.), o que diminui a qualidade

do produto, e, portanto, seu valor comercial. E a utilização de solventes orgânicos que não é

muito benéfico para o meio ambiente, uma vez que se não descartado corretamente, pode haver

contaminações. Também podem ficar resíduos destes solventes no óleo essencial extraído,

impedindo seu uso em medicamentos.

A prensagem a frio é muito utilizada na extração de óleos de frutos críticos e de

sementes. O material é despejado diretamente em uma prensa hidráulica que esmaga o produto,

fazendo com que o óleo essencial seja expelido. Esse método necessita de várias etapas

posteriormente, para que o óleo seja refinado e isolado.

Mais recentemente, tem-se empregado a extração por fluídos supercríticos,

utilizando-se o CO2 supercrítico como solvente. O CO2 passa através do material vegetal e

dissolve os óleos, extraindo até um nível de solubilidade de equilíbrio. Após essa etapa, a

29

solução gasosa passa por uma válvula de pressão, que precipita os componentes, separando o

óleo do gás. Apesar dessa tecnologia ser considerada limpa e atóxica, o maior obstáculo para

seu uso é o alto custo de instalação do equipamento (MEIRELES, 2003).

2.3.4 Ações biológicas dos óleos essenciais

Dentre as principais atividades biológicas dos óleos essenciais de origem vegetal

destacam-se sua atividade antimicrobiana e antioxidante. São inúmeros trabalhos que relatam

essas ações utilizando-se diferentes espécies vegetais contra diferentes cepas de bactérias

(ARAÚJO et al., 2004; BERTINI et al., 2005; LIMA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2006;

SANTOS PEREIRA et al., 2004). Ainda, tem sido estabelecido em estudos científicos que cerca

de 60 % dos óleos essenciais possuem propriedades antifúngicas e 35 % exibem propriedades

antibacterianas (BHAVANANI; BALLOW, 2000 apud OLIVEIRA et al., 2006).

Em relação à atividade antimicrobiana do guaco, Duarte et al. (2007) detectaram

uma fraca ação do óleo essencial de M. laevigata contra Escherichia coli, em contrapartida, o

óleo essencial de M. glomerata não apresentou atividade nas mesmas concentrações. Os

mesmos pesquisadores, em 2005, detectaram uma forte ação antifúngica do óleo essencial de

M. glomerata contra Candida albicans, enquanto que óleo de M. laevigata não surtiu efeito

(DUARTE et al., 2005).

Também é descrita na literatura a ação antioxidante de alguns óleos essenciais de

plantas (BESSADA; BARREIRA; OLIVEIRA, 2015). Contudo, nenhum artigo relata essa

atividade biológica nas espécies de M. glomerata ou M. laevigata. Em uma revisão, Bessada et

al. (2015) descrevem a ação antioxidante de algumas espécies de Asteraceae, dentre elas, o óleo

essencial de Bidens pilosa L. (picão preto) é reportada como tendo uma alta capacidade

antioxidante por reduzir o radical livre de DPPH, comparando sua eficácia aos típicos

antioxidantes sintéticos. Guimarães (2010) testando a atividade antioxidante contra diversos

óleos, também constatou atividade positiva para diversas espécies como Lippia sidoides,

Alomia fastigiata, Ocotea odorifera, Cordia verbenace e também uma espécie do gênero

Mikania (M. glauca).

30

2.4 Microextração em Fase Sólida (SPME)

A extração de óleos essenciais pelos métodos descritos acima pode ser custosa, de

baixo rendimento e até mesmo tóxica para o meio ambiente. Por conta disso, procurou-se por

técnicas alternativas para análise dos compostos voláteis, como por exemplo a microextração

em fase sólida (SPME – do inglês, Solid Phase MicroExtraction). Inicialmente ela foi

desenvolvida para determinar os voláteis orgânicos de amostras do ambiente (ARTHUR;

PAWLISZYN, 1990), porém, hoje é utilizada em vários campos e para análise de vários

analitos. A microextração em fase sólida pode ser utilizada, por exemplo, na análise de

piretróides e outros herbicidas em águas (BARRIONUEVO; LAÇAS, 2001; COSTA et al.,

2008); na determinação de medicamentos no plasma sanguíneo (CANTÚ, 2004); na

identificação de álcool e drogas em amostras de saliva humana (YONAMINE, 2004); entre

outras aplicações.

Trata-se de uma fibra óptica de sílica fundida com 1 cm de comprimento e 100 μm

de diâmetro, revestida com uma fase estacionária adsorvente (Figura 5A). O material dessa

fase estacionária varia de acordo com a polaridade e com as propriedades físico-químicas dos

componentes da amostra a ser analisada. O material mais empregado nesse revestimento é um

polímero líquido de polidimetilsiloxano, mas também podem ser empregadas fibras com

revestimento de uma mistura de polímeros líquidos e sólidos (ex: Carboxen©). A fibra então é

exposta à amostra, que pode ser líquida ou gasosa e os compostos voláteis se adsorvem à fibra.

A dessorção ocorre por calor quando a fibra é inserida no cromatógrafo a gás, onde o injetor

costuma ter uma temperatura de 250 °C (BASER; BUCHBAUER, 2010) . Um esquema desse

processo é ilustrado na Figura 5B.

31

Figura 5. (A) Esquema de uma seringa de SPME. (B) Esquema do processo de adsorção e dessorção

dos voláteis da fibra de SPME (Adaptado de Labsphere).

Diversas aplicações da fibra de SPME são encontradas no campo das análises dos

óleos essenciais (MARRIOTT; SHELLIE; CORNWELL, 2001; TOMOVA; WATERHOUSE;

DOBERSKI, 2005). As principais vantagens da utilização desse método são sua fácil e rápida

aplicação, o tempo de preparo de amostra é pequeno, requer pouca quantidade de amostra

(miligramas) e não há utilização de solventes orgânicos. É também considerada um método

econômico e reutilizável, uma vez que cada fibra pode ser utilizada por 100 extrações, em média

(SUPELCO-SIGMA, 2017).

Comparado com extração do óleo essencial por hidrodestilação em Clevenger, a

microextração é mais sensível e preserva melhor os compostos voláteis originais da planta

(PRAKASH et al., 2012). Como a hidrodestilação necessita da fervura do vegetal durante horas,

os compostos voláteis podem sofrer modificações, principalmente por oxidação (DREW et al.,

2012).

Adsorção dos compostos

da amostra na fibra Dessorção dos

compostos no sistema

cromatográfico

(B) (A)

32

2.5 Voláteis de Mikania laevigata e Mikania glomerata

Os principais constituintes do óleo essencial de guaco são os mono- e

sesquiterpenos, destes, o germacreno D parece ser o componente majoritário. Realizando um

levantamento bibliográfico, apesar de vários autores realizarem a extração do óleo essencial por

hidrodestilação em Clevenger e analisar por GC-MS, a composição química difere entre os

autores, bem como a porcentagem dos teores de cada composto. A Tabela 1 traz os compostos

identificados por cada autor e seu teor (%) ou sua presença nos óleos.

Limberg et al. (1998) coletaram M. laevigata em Viamão, RS na Estação

Experimental Fitotécnica da Secretaria de Agricultura e extraíram o óleo essencial por

hidrodestilação em aparelho de Clevenger durante 5 horas. Os compostos foram identificados

por GC-MS com uma coluna DB-1. Os compostos mais abundantes do óleo foram os

hidrocarbonetos sesquiterpenos, sendo que o germacreno D foi o composto majoritário,

apresentando 29,8 % da composição total do óleo, seguido do beta-cariofileno (20,9 %). Dentre

os sesquiterpenos oxigenados, o espatulenol foi o mais abundante (3,3 %).

Os mesmos autores em 2001 (LIMBERG et al., 2001) extraíram o óleo essencial de

M. glomerata coletada em Viamão, RS e obtiveram um rendimento de 0,1% (mL /100 g). A

extração se deu por hidrodestilação em Clevenger por 5 horas. As análises foram realizadas em

GC-MS com uma coluna DB-5 e ionização por chamas. A porcentagem da composição química

foi de 1,7% de hidrocarbonetos monoterpenos, 0,3% de monoterpenos oxigenados, 22,6 % de

hidrocarbonetos sesquiterpenos e 22,4 % de sesquiterpenos oxigenados, sendo que o composto

majoritário do óleo foi o óxido de cariofileno, apresentando 24,8 % da composição total,

seguido do espatulenol (23,7 %).

Duarte e colaboradores (2005) extraíram o óleo essencial de M. glomerata cultivada

em Campinas, SP. O óleo foi obtido por hidrodestilação em Clevenger por 3 horas e a

identificação dos compostos se deu por GC-MS com uma coluna HP-5. O composto majoritário

foi o germacreno D, apresentando 41,45 % da composição do óleo. Em seguida tem-se o trans-

cariofileno com 14,53 % e o biciclogermacreno com 9,81 %. Os demais constituintes do óleo

apresentam menos de 5 % de participação da composição.

Oliveira (1999 apud RADUNZ, 2004) analisou o óleo essencial de M. glomerata

proveniente de Bragança Paulista, SP. O rendimento do óleo com a planta fresca foi de 0,26 %

(massa/volume) e os principais compostos identificados foram os mono- e o os sesquiterpenos.

33

O β-cubebeno foi com composto com maior percentual de presença no óleo (17,94 %), seguido

do mirceno (11,35 %), biciclogermacreno (9,17 %) e α-pineno (7,97 %).

Rehder et al. (2006) analisaram o óleo essencial de M. laevigata e M. glomerata,

ambas cultivadas em Paulínia, SP. O óleo foi obtido por hidrodestilação em Clevenger durante

3 horas e as análises foram conduzidas em GC-MS com uma coluna HP-5. Utilizando-se folhas

frescas de M. laevigata, obtiveram um rendimento de 0,34 % de óleo e 0,30 % para M.

glomerata. Para M. laevigata, a composição do óleo foi de 65,1 % de sesquiterpenos e 14,1 %

de monoterpenos, sendo que o composto majoritário foi o germacreno D. Para M. glomerata,

81,5 % do óleo era constituído de sesquiterpenos e apenas 0,8 % de monoterpeno (sabineno).

O composto majoritário também foi o germacreno D (23,4 %), seguido do β-cariofileno (21,3

%).

Radunz (2004) estudou o óleo essencial de M. glomerata extraído por

hidrodestilação em Clevenger por 6 horas. As análises dos constituintes foram realizadas em

GC-MS com uma coluna DB-5. O teor de óleo essencial variou de acordo com o período da

coleta, sendo que o maior rendimento se deu entre 20 e 21 de maio (0,69 % - massa/massa). O

autor relata ter identificado 35 compostos no óleo, porém, só descreve a porcentagem de dois

compostos majoritários: o germacreno D, representando cerca de 32,5 % do total

cromatográfico e o biciclogermacreno com 17,8 %.

Cappelaro & Yariwake (2015) analisaram os voláteis de M. glomerata coletadas

em Ribeirão Preto por microextração em fase sólida (SPME). Utilizaram fibras de SPME com

diferentes composições: poliacrilato (PA), polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB),

polidimetilsiloxano (PDMS). As folhas foram secas em temperatura ambiente e picadas com

tesoura para depois serem analisada por GC-MS com uma coluna HP-5. Concluíram que a

maioria dos compostos identificados foram os mono- e sesquiterpenos, e todas as fibras foram

capazes de identificar os mesmos compostos, porém, com porcentagem relativa diferentes. Para

a fibra de PA, o composto majoritário foi a cumarina (28,37 %) seguida do espatulenol (20,79

%), já para as fibras de PMMS/DVB e PDMS, ocorreu o inverso: o composto majoritário foi o

espatulenol com 20,41 e 17,33 % respectivamente e em seguida aparece a cumarina com 18,11

e 7,27 % da composição dos voláteis.

34

Tabela 1. Compostos voláteis de guaco identificados de acordo com dados da literatura e seus

respectivos teores em %. ML = Mikania laevigata. MG = Mikania glomerata. OE = Óleo Essencial.

DVB/PDMS = Fibra de microextração de Divinilbenzeno/polidimetilsiloxano. PDMS = Fibra de

microextração de Polidimetilsiloxano.

Limberg

, et al.,

1998

Oliveira,

et al.

1999

(apud

Radünz,

2004)

Limberg

, et al.,

2001

Radünz,

2004

Duarte,

et al.,

2005

Rehder, et al.,

2006

Cappelaro &

Yariwake, 2015

Compostos ML

(OE)

MG

(OE)

MG

(OE)

MG

(OE)

MG

(OE)

ML

(OE)

MG

(OE)

MG

(DVB/PD

MS)

MG

(PDMS)

Teor

(%)

Teor

(%)

Teor

(%) Presença

Teor

(%)

Teor

(%)

Teor

(%) Teor (%)

Teor

(%)

α-pineno 7,97 1,7 x 2,2 3,8 5,97

Sabineno 0,9 0,5 0,8

Thuja-2,4(10)-

dienoi 0,33 0,1

β-pineno 5,18 0,5 x 2,3 1,17 1,7

Mirceno 11,35 x 9,2 0,75 0,46

Limoneno 1,02 0,3 x 0,47 0,07 0,03

p-ocimeno x 0,14 0,07

Perileno 0,1 0,13

α-canfolenal 0,22 0,13

Trans-

pinocarveol 0,7 0,38

Trans-verbenol 0,85 0,47

Pinocarvono 0,87 0,42

p-cimen-8-ol 0,17

Mirtenol 1,14 0,51

Verbenona 1,53 0,72

Trans-carveol 0,33 0,04

1,8-cineol 0,3

Linalol 0,36 x

cumarina x 5,4 18,11 7,27

Terpinen-4-ol 0,39

α-elemeno 2,24

Δ-elemeno 1,78 x 8,7 9,9 0,33 0,41

α-cubebeno 2,3 x 1,45 1,25

α -ylangeno 2,1 0,15 0,11

α -copaeno 0,51 x 0,88 1,36 1,26

β-buorboreno 1,1 0,4 x 4,13 3,52

β -cubebeno 17,94 x 0,47 0,7

β -elemeno 3,6 0,99 0,6 x 0,79 0,59 0,52

35

β -cariofileno 20,9 5,62 4,2 x 14,53 7,6 21,3 1,98 2,43

Trans-alfa-

bergamoteno 0,9

γ-elemeno 1 1,2

Aromadendreno 0,91 x

α-humuleno 2,3 1,17 0,4 x 1,87 1,1 1,8 1,13 0,94

β-farneseno x

γ-muuroleno 1,1

Aloaromadendre

no 0,28 0,3

Germacreno D 29,8 7,5 x 41,45 23,6 23,4 1,72 2,99

Biciclogermacre

no 13,4 9,17 1,8 x 9,81 11,2 11,4 0,56 0,85

Germacreno A x

α-muuroleno 0,74 0,31 0,25

γ-cadineno 2,2 0,86 2,8 x 1,42 0,54 0,36

Δ-cadineno 2,57 1,5 x 0,54 0,36

α-calacoreno 0,6 0,12

Elemol x 1,97 2,5 3,3

Germacreno B 1,8 2,02 0,3 x 4,14

1,5-epoxy

salvial-4(14)-eno 0,5 0,63

Espatulenol 3,3 5,27 x 2,97 7,3 3,3 20,41 17,33

Globulol 1,2 x

Veridiflorol x

Vidrol x

α-acorenol x

TAU-cadinol x

α-muurolol x

Óxido de

cariofileno 2,2 3,48 1,9 5,9

epi-α-muurolol 2,06 0,4

α-cadinol x 3,03

Guaiol 1,6

Óxido de

humuleno 0,5

β-eudesmol 0,6

Tal-cadinol 0,5

Tal-muurolol 1,2

α-cadinol 2,1

α-eudesmol 0,4

Bulnesol 0,5

Epóxido de

humuleno II 0,29 2,13

Nor-copanona 0,25 0,35

Cariofile-4(14),

8(13)-dien-5P-ol 2,8 2,93

36

14-oxi-α-

muurolene 0,26 0,55

10-oxo-isodauc-

3-en-15-ol 0,77 1,47

Beyereno 0,38 0,72

Hexahidrofarnesi

l acetone 0,1 0,22

Kauran-16-ol 0,08 1,54

2.5.1 Variação dos compostos voláteis

A composição química dos voláteis de uma planta pode variar significativamente,

mesmo sendo extraída do mesmo órgão. Vários fatores podem causar diferenças em seus

componentes, como a genética da planta, seu estágio de desenvolvimento, época e horário da

colheita, fontes geográficas, o modo de secagem do material vegetal e fatores ambientais, como

umidade, água, solo e herbivoria (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; MORAIS, 2009;

SILVEIRA; CARDOSO; FERREIRA, 2013).

Essa grande variação decorrente de estímulos ambientais, pode estar relacionada

com a rota metabólica e ocasionar a biossíntese de diferentes compostos. Geralmente, esses

fatores ambientais não atuam isoladamente, apresentando correlações entre si e atuando de

maneira conjunta no metabolismo da planta (MORAIS, 2009). Haja visto que uma planta no

campo sofre diferentes estímulos ao mesmo tempo, tendo que se modular de maneira rápida e

eficiente.

Em relação às variações ambientais no rendimento e composição de voláteis de M.

laevigata e M. glomerata poucos trabalhos foram encontrados até o momento. Diante disso,

mostra-se a importância desse trabalho para elucidação dessas questões.

2.5.1.1 Variação sazonal e horário de coleta

Vários trabalhos relacionam o teor e a composição química do óleo essencial

produzido por plantas com a sazonalidade e o horário de coleta do material vegetal. Em um

estudo, Lopes et al. (1997) avaliaram o teor e composição dos óleos essenciais de Virola

surinamensis coletada as 6 da manhã, meio-dia, 6 da noite e 9 da noite, durante os meses de

fevereiro, junho e outubro. Observou que o teor não variou entre os meses e nem entre os

37

horários de coleta. Quando a composição do óleo, observou que os monoterpenos diminuem ao

entardecer e voltam à mesma concentração as 9 da manhã. Em junho, na época de floração, a

concentração dos monoterpenos aumentou em 50%.

Santos & Innecco (2005) estudando os óleos essenciais da erva-cidreira brasileira

(Lippia alba), observaram que os maiores rendimentos se deram na estação de seca e no horário

das 15h. Os compostos majoritários do óleo são o limoneno e a carvona e seus teores variam

de acordo com a época do ano e com o horário do dia. Por outro lado, Silva e colaboradores

(2003) observaram que a composição do óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum L.)

não apresentou mudanças nas épocas e nos horários de colheita. Porém, o teor foi maior no mês

de janeiro pela manhã se comparado com agosto.

Analisando o óleo essencial de Hyptis marrubioides durante as quatro estações do

ano, Botrel et al. (2010) observaram que o maior teor no verão, porém, no inverno, o óleo

apresentou a maior concentração relativa (%) dos compostos majoritários. Santana (2013)

também observou que os maiores teores de óleo essencial de Baccharis reticularia DC. se

deram em fevereiro (verão chuvoso) e que os compostos variaram significativamente entre as

épocas do ano. Já Cunha (2011) comparando o rendimento do óleo essencial de Aniba duckei

entre as épocas de seca e chuva encontrou os maiores rendimentos nos períodos de seca (abril

a junho), e observou que o linalol – composto majoritário – variou ao longo das coletas.

Nascimento et al. (2006) avaliaram a influência do horário de corte sobre a

produção de óleo essencial de campim-santo (Andropogum sp.). Foram extraídos e analisados

óleos essenciais em 6 horários diferentes do dia (7, 9, 11, 13, 15 e 17 horas). Observou-se que

houveram variações na composição ao longo do dia e que o rendimento também foi diferente.

O maior rendimento foi às 7 h e o menor às 13 h, porém, nesse horário a concentração de citral

(composto majoritário) foi maior.

Em relação à variação sazonal e horário de coleta de óleos essenciais ou voláteis de

guaco não foi encontrado nenhum trabalho. Apenas estudos utilizando extratos aquoso e hidro

alcoólico de M. laevigata e M. glomerata foram encontrados. Xavier (2015) analisou os extratos

mensalmente em três horários diferentes do dia e chegou à conclusão de que os maiores teores

de cumarina em M. laevigata foram encontrados nos períodos mais frios. Para M. glomerata os

períodos chuvosos e a temperatura parecem ter mais influência na produção de metabólitos

secundários.

38

2.5.1.2 Temperatura

No campo, intensidade luminosa e temperatura estão quase sempre diretamente

correlacionadas. É descrito na literatura que esses fatores influenciam na concentração bem

como a composição dos óleos essenciais. Geralmente quando as plantas são submetidas a altas

temperaturas, observa-se um aumento no teor dos óleos essenciais, contudo, quando a

temperatura é muito elevada, pode-se notar um decréscimo acentuado em seus teores (LIMA;

KAPLAN; CRUZ, 2003). Isso ocorre, pois, os voláteis são perdidos para o ambiente.

São poucos os trabalhos que relacionam isoladamente o efeito da temperatura sobre

a produção e composição dos óleos essenciais. A maioria dos estudos correlacionam a

temperatura média da data da coleta com os parâmetros dos voláteis. Palá-Paúl et al. (2001)

observaram que as concentrações de alguns compostos do óleo essencial de Santolina

rosmarinifolia possuem uma correlação negativa com a temperatura. Já Cerqueira et al. (2009)

notaram que os principais constituintes do óleo de Myrcia salzmannii Berg. não sofreram

diferenças entre as épocas frias e quentes, porém, alguns compostos não identificados tiveram

suas concentrações relativas dobradas quando em temperaturas mais elevadas.

2.5.1.3 Luminosidade

Existe uma correlação positiva bem estabelecida entre intensidade de radiação solar

e produção de compostos fenólicos, tais como flavonoides, taninos e antocianinas. As diferentes

espécies de plantas estão adaptadas a uma enorme variação na intensidade e quantidade de

incidência luminosa (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Souza et al. (2011) em um experimento

com M. glomerata, mantiveram as mudas sob diferentes sombreamentos e diferentes cores de

malhas. Chegaram à conclusão de que o teor de óleo essencial das plantas crescidas sob malha

azul foi de 0,14%, o que correspondeu a um acréscimo de 142% em relação aos teores

verificados em plantas cultivadas a pleno sol.

Pegoraro et al. (2010) submeteram mudas de hortelã-pimenta (Mentha x piperita L.

var. piperita) a diferentes níveis de luminosidade: 100%, 70% e 50% da luz solar total.

Observaram que a alta intensidade de luz favoreceu o crescimento em biomassa, influenciando

no rendimento do óleo essencial. As plantas em luz plena também apresentaram maiores

39

concentrações de mentol, considerado o composto majoritário e o composto de maior interesse

comercial.

2.5.1.4 Água

Outro fator que está relacionado com mudanças no rendimento e composição dos

óleos essenciais é a irrigação. O excesso de água pode resultar na perda de substâncias

hidrossolúveis para o solo. Além disso, a disponibilidade de água também afeta alguns fatores

fisiológicos da planta, como abertura e fechamento de estômatos, fotossíntese, crescimento e

expansão foliar (MORAIS, 2009).

Lopes et al. (2001) avaliou a influência de três regimes hídricos – ambiente úmido,

moderadamente úmido e seco – na produção dos óleos essenciais de Polygonum punctatum Ell.

Observou que a maior produção de óleo essencial ocorreu em ambiente seco, porém a

concentração relativa dos compostos parece não ter variado entre os tratamentos.

Bahreininejad e coladoradores (2014) conduziram um experimento de campo com

Thymus carmanicus Jalas, avaliando os efeitos da depleção de água no solo. Para tanto,

reduziram a oferta de água em 20 %, 50 % e 80 % e observaram que diminuindo a irrigação, o

rendimento do óleo era reduzido, assim como a porcentagem de carvacol, composto esse que

define a qualidade do óleo essencial da espécie. Em um trabalho semelhante, Omidbaigi et al.

(2003) submeteram indivíduos de Ocimum basilicum a diferentes regimes de irrigação (100 %,

85%, 70 % e 55 % da capacidade de campo). Notaram que quanto menor a oferta de água, maior

era o rendimento do óleo essencial que também apresentava maior número de compostos.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Este estudo teve como objetivo comparar os compostos voláteis de M. laevigata e

M. glomerata cultivados em condições variadas de temperatura, luminosidade e irrigação, bem

como verificar se há variação mensal na sua composição ao longo de um ano; e também as

atividades antimicrobiana e antioxidante de seus óleos essenciais.

40

3.2 Objetivos específicos

A. Avaliar se os compostos voláteis de M. laevigata e M. glomerata variam ao longo do ano,

e se também variam em dois períodos de um mesmo dia.

B. Avaliar se os voláteis de M. laevigata e M. glomerata variam quando submetidos a

diferentes condições temperatura, luminosidade e irrigação.

C. Avaliar a ação antimicrobiana dos óleos essenciais de M. laevigata e M. glomerata.

D. Avaliar a ação antioxidante dos óleos essenciais de M. laevigata e M. glomerata.

E. Definir se a composição química das espécies permite que sejam usadas indistintamente

ou não.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material vegetal

Matrizes de plantas adultas de guaco, das espécies M. glomerata e M. laevigata,

obtidas do CPQBA-UNICAMP, já estão adaptadas e crescendo no campo experimental do

Instituto de Biologia, UNICAMP desde 2010. As exsicatas de M. glomerata e M. laevigata

foram depositadas no herbário do Instituto de Biologia, UNICAMP sob número de registro

UEC 102047 e UEC 102046, respectivamente. Estes dois indivíduos adultos foram utilizados

para as coletas sazonais das folhas ao longo de um ano e também serviram como matrizes para

geração de clones para os tratamentos de luminosidade, irrigação e temperatura.

4.2 Produção de mudas

Para evitar que as variações genéticas entre indivíduos da mesma espécie afetem

os resultados, todas as mudas da mesma espécie foram obtidas por estaqueamento a partir das

matrizes acima, produzindo clones. Foram coletadas estacas de cada espécie de Mikania, da

parte mediana dos ramos, onde foram selecionados conforme a maturidade do tecido. O

material foi preparado de acordo com a técnica usual de estaquia, no qual o corte na porção

superior foi reto e na extremidade inferior em forma de bisel (LIMA, 2002; LIMA et al., 2003)

41

(Figura 6A). As estacas foram retiradas da porção semilenhosa das matrizes, ambas com

aproximadamente 12 cm de comprimento (cada estaca teve cerca de dois nós), e foram

cultivadas em substrato de vermiculita de granulação média como substrato em casa de

vegetação. A irrigação foi automática por nebulização, quatro vezes ao dia durante dois

minutos cada. Foi deixado na região superior da estaca um par de folhas inteiras (BOEGER;

ALQUINI; NEGRELLE, 2004; GIACOBBO et al., 2003). Após o período de enraizamento de

45-60 dias, as estacas produzidas foram avaliadas de acordo com o número de estacas vivas e

mortas, número de estacas enraizadas, condições das raízes adventícias e brotações (BRUM;

SILVA; PASQUAL, 2002). Somente mudas saudáveis e com um padrão de tamanho foram

utilizadas. As mudas obtidas foram repassadas para vasos de 1,0 L contendo matéria orgânica,

areia de barranco e vermiculita na proporção de 1:1:1 (v:v:v) (Figura 6B), com composição

previamente analisada (Anexo I), conforme a Tabela 2. Esses vasos foram mantidos por 15-

20 dias para que as mudas se adaptem ao novo substrato e após esse período seguiram para

seus respectivos tratamentos.

Tabela 2. Propriedades físico-químicas dos solos utilizados nos ensaios. M.O.: Matéria Orgânica. CTC:

Capacidade de Troca de Cátions.

Substrato Conteúdo

de argila

Conteúdo

de silte

Conteúdo de

areia total M.O.

pH

(CaCl2) CTC

(A) (B)

Figura 6. (A) Estaca de Mikania laevigata utilizada na confecção de vasos para os tratamentos de

luminosidade, irrigação e temperatura. (B) Vaso de 1,0 L com muda após o enraizamento.

42

---------------------(%)--------------------- (g/dm³) (mmolc/dm3)

Areia 19,7 4,0 76,3 8 4,2 41,3

Terra Vegetal 20,2 9,9 69,9 268 5,3 317,6

Substrato Ca Mg K Fe Mn Zn Cu P

-------(mmolc/dm3)-------- --------------------(mg/dm3)----------------

---

Areia 15 4 2,0 7 2,0 0,7 0,2 6,0

Terra Vegetal 223 38 13,0 44 6,5 2,3 0,5 130,0

4.3 Tratamentos

A fim de verificar se os fatores abióticos interferem nos compostos voláteis de M.

laevigata e M. glomerata foram estabelecidos três tratamentos: temperatura, luminosidade e

irrigação. Em cada um dos tratamentos tentou-se minimizar ao máximo a variabilidade de

outros fatores e variar apenas a condição de interesse em cada tratamento. Para cada um dos

tratamentos foram estabelecidos três níveis. Por exemplo, no tratamento de luminosidade

havia as condições de luz plena, 50% de luminosidade e 75% de luminosidade. O delineamento

foi inteiramente casualizado com 10 repetições de cada espécie (BOEGER; ALQUINI;

NEGRELLE, 2004). O fluxograma abaixo ilustra os tratamentos realizados (Figura 7):

43

Ao final dos experimentos, todas as folhas foram coletadas e imediatamente

congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80 °C até as análises. Os tratamentos serão

descritos mais detalhadamente a seguir:

Temperatura

15°C10 M. laevigata

10 M. glomerata

25 °C10 M. laevigata

10 M. glomerata

35 °C10 M. laevigata

10 M. glomerata

Luminosidade

50 % luz10 M. laevigata

10 M. glomerata

75 % luz10 M. laevigata

10 M. glomerata

Luz plena10 M. laevigata

10 M. glomerata

Irrigação

Déficit hídrico

10 M. laevigata

10 M. glomerata

Excesso10 M. laevigata

10 M. glomerata

Controle10 M. laevigata

10 M. glomerata

Tratamentos Condições Repetições

Figura 7. Fluxograma representando os tratamentos realizados com suas respectivas condições e

repetições.

44

a. Temperatura

O tratamento de temperatura foi realizado dentro da câmara de crescimento no

departamento de fisiologia vegetal do Instituto de Biologia da Unicamp. O tratamento teve

início no dia 26 de setembro de 2016 e se estendeu até o dia 28 de novembro de 2016.

As plantas foram mantidas em temperaturas de 15°C, 25°C e 35°C, por três

semanas em câmara de crescimento com intensidade de luz e fotoperíodo controlados. As

temperaturas de 15°C e 25°C foram proporcionadas pelo próprio ar condicionado instalado

dentro da câmara de crescimento, enquanto que para a condição de 35°C foi necessário a

utilização de aquecedores térmicos. A temperatura foi monitorada diariamente por um

termômetro deixado entre os vasos. A intensidade de luz da câmara a 10 cm de altura foi de

180 µmols fótons m2 s1 usando-se luzes LED vermelha e azul, com fotoperíodo de 12 horas

(Figura 8). A irrigação foi manual de 200 mL de água para cada vaso, regados diariamente.

b. Intensidade luminosa:

O tratamento de luminosidade foi realizado a céu aberto no campo experimental

do Instituto de Biologia da Unicamp. O experimento foi realizado entre os dias 7 a 27 de março

de 2017. A temperatura média do ar durante o desenvolvimento do tratamento foi de 24,3 °C

e o total de chuva acumulada foi de 61,72 mm de água (dados do CEPAGRI-Unicamp).

Figura 8. Imagem das plantas submetidas ao tratamento de temperatura em câmara de crescimento

com luz LED controlada.

45

Cada vaso foi encaminhado a diferentes condições, onde permaneceram por três

semanas em (1) 50% de luminosidade, (2) 75% de luz e (3) luz plena (controle). O tratamento

foi realizado a céu aberto, fora da estufa e os diferentes graus de luminosidade solar foram

viabilizados através de sombrites 25%. Sendo que a condição de luz plena não recebeu

nenhuma cobertura e a de 50 % de luz foi proporcionado por duas camadas do sombrite 25%

(Figura 9). Os vasos foram colocados aleatoriamente em cima de suportes de plásticos a 10

cm do solo para que não ficassem em contato direto com a terra. A irrigação foi manual

colocando diariamente 200 mL de água para cada vaso.

Medidas de intensidade luminosa foram tomadas através do sensor para radiação

fotossinteticamente ativa (PAR, IRGA ADC LCpro+). Foram feitas medidas dentro e fora dos

sombrites a fim de determinar a porcentagem de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) que

atingia as mudas. As medidas foram tomadas em triplicata. Tendo como referência a luz plena

como sendo 100 % de luminosidade, a porcentagem de luz que passava com uma camada de

sombrite 25 % era de 78 % e na camada dupla de sombrite, a porcentagem de passagem de luz

era de 51 %.

c. Irrigação:

O tratamento de irrigação foi realizado na casa de vegetação do Instituto de Biologia

da Unicamp. O experimento foi realizado entre os dias 07 a 17 de março de 2017. A temperatura

média do ar durante o desenvolvimento do tratamento foi de 25,71 °C e o total de chuva

acumulada foi de 19,30 mm de água (dados do CEPAGRI-Unicamp).

Os vasos foram submetidos a diferentes condições de fornecimento de água, sendo

eles a deficiência de água ou seca, o excesso de irrigação e o grupo controle. O experimento foi

realizado em casa de vegetação, no Instituto de Biologia da UNICAMP, e os vasos foram

dispostos em cima de bancadas de grade de metal (Figura 10). No primeiro dia todos os vasos

Figura 9. Tratamento de luminosidade a céu aberto. (1) condição de 50 % de luz. (2) 75 % de luz.

(3) luz plena.

(1) (2)

(3)

46

foram regados com 200 mL de água, essa quantidade foi capaz de hidratar o substrato e o

excesso escoar pela base dos vasos. Apenas no dia seguinte os vasos foram subdivididos: déficit

hídrico, excesso de água e controle.

O grupo de déficit hídrico recebeu, no segundo dia de experimento, 100 mL de

água. No terceiro dia foi irrigado com 50 mL, no quarto com 25 mL e a partir do quinto dia não

foram mais irrigados. O grupo controle foi regado diariamente com 200 mL de água. Na

condição de excesso de água, os vasos foram colocados dentro de bandejas maiores, com 10

cm de altura. Essas bandejas permaneceram sempre com água até mais ou menos até a metade

da altura dos vasos, sendo trocada diariamente.

Antes do início do tratamento de irrigação foi realizado um teste visando observar

o comportamento das espécies frente à seca (Anexo II). Desse modo, foi possível determinar

qual momento ideal de coleta das folhas, tendo certeza que as plantas estariam em estresse

hídrico, porém não a ponto de morrerem. A realização desse teste também se fez necessária,

pois, a quantidade de folhas em cada vaso não seria suficiente para medição do potencial hídrico

e também para as análises dos voláteis.

O teste seguiu a metodologia exatamente como descrita a cima, porém com apenas

três vasos de cada espécie para as diversas condições. Os vasos foram pesados e fotografados

todos os dias até que sinais de murcha aparecessem nas plantas já nas horas iniciais do dia,

Figura 10. Tratamento de irrigação em casa de vegetação. À direita é possível observar a condição

do excesso em bandejas cheias d´água. À esquerda encontram-se os vasos do controle e da seca de

modo aleatorizado.

47

indicando falta de capacidade de recuperação do turgor hídrico. Quando nesse estágio de

murchamento, tomaram-se medidas de potencial hídrico ao meio dia utilizando-se uma câmara

de pressão de Scholander (SCHOLANDER et al., 1964).

Através dessa análise prévia definiu-se que quando as plantas apresentassem tal

grau de murchamento, o tratamento seria interrompido e as folhas coletadas para análise dos

voláteis. A coleta ocorreu após 10 dias do início do tratamento.

4.4 Variação mensal

Para análise da variação mensal dos compostos voláteis, amostras das folhas de M.

glomerata (UEC 102047) e M. laevigata (UEC 102046) foram coletadas das plantas matrizes

adultas que estão no canteiro experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. As coletas

ocorreram mensalmente ao longo de um ano, iniciando em agosto de 2016 até julho de 2017.

Foram realizadas duas coletas em um mesmo dia, às 8:00 h da manhã e às 14:00 h da tarde.

Aproximadamente 200 g de folhas foram colhidas de cada indivíduo e em cada horário,

totalizando quatro coletas por mês (M. laevigata manhã, M. glomerata manhã, M. laevigata

tarde e M. glomerata tarde).

Essa quantidade de folhas (200 g) foi suficiente para analisar os compostos voláteis

pela fibra de microextração com três repetições, porém, para extração dos óleos essenciais, foi

necessário juntar as coletas do dia (manhã e tarde). Em todos os casos, as folhas das duas

espécies de guaco coletadas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e mantidas

em freezer -80 °C até as análises por microextração em fase sólida e para extração dos óleos

essenciais. As análises no cromatógrafo a gás foram realizadas ao final das coletas para que a

calibração ou eventuais variações dos equipamentos não interferissem nos resultados.

Um fluxograma das atividades desenvolvidas durante o projeto está ilustrado na

Figura 11.

48

Produção de estacas

Coletas mensais

Vasos de 1l

Temperatura Luminosidade Irrigação

Matrizes de M. laevigata

e M. glomerata

Congelamento das folhas

a -80 ºC

Trituração das folhas

com almofariz e pistilo

Pesagem das folhas

(0,5 g/vial)

Análise dos voláteis por

GC-MS

Figura 11. Fluxograma das atividades desenvolvidas durante o projeto.

49

4.5 Extração dos óleos essenciais

A extração dos óleos essenciais teve como finalidade principal os ensaios de

atividade antimicrobiana e antioxidante. Foram realizadas as análises cromatográficas em GC-

MS para que os dados obtidos pela microextração em fase sólida das folhas também pudessem

ser comparados com a composição dos óleos.

Como a extração do óleo requer quantidades consideráveis de material vegetal, as

folhas coletadas mensalmente foram agrupadas para que a obtenção do óleo fosse viável.

Portanto, as coletas do mesmo dia (manhã e tarde) foram reunidas. Para extração do óleo

essencial foi utilizado o método de hidrodestilação em aparelho de Clevenger modificado

(MING et al., 1996) (Figura 12). Aproximadamente 200 g de folhas trituradas foram

submergidas em 600 mL de água deionizada em um balão de 1000 mL e deixadas ferver por 4

horas.

Para a retirada do óleo essencial do aparelho de Clevenger foi utilizada uma pipeta

Pasteur de vidro (22,9 cm) de ponta fina. O óleo foi diretamente retirado da coluna do aparelho

e armazenados em vials âmbar de 2 mL, o hidrolato e o restante do material foi descartado. Os

vials foram guardados em freezer a -5 °C até a realização dos testes de atividade biológica.

Quando a quantidade de óleo essencial era pequena, não sendo possível a retirada direta, foi

utilizado o diclorometano. Primeiramente era retirado o máximo possível de água e hidrolato

do aparelho de Clevenger, e depois eram adicionados cerca de 4 mL de diclorometano na

porção superior da coluna, fazendo com o solvente escorresse pelas laterais e “limpasse” a

coluna do aparelho. Feito isso, o óleo diluído no diclorometano era coletado em vials e

deixados na capela para que o diclorometano evaporasse. Quando a massa dentro do vial se

tornava constante, o vial era fechado e armazenado no freezer a -5 °C.

O teor (%) de óleo foi calculado com base no valor da massa do óleo dividido pela

massa da matéria fresca da amostra e o resultado multiplicado por 100.

50

4.6 Compostos voláteis capturados por microextração em fase sólida

(SPME)

Para a microextração em fase sólida (SPME) foi utilizada uma fibra de 10 mm

polidimetilsiloxano – divinilbenzeno da Supelco (Bellafont, PA, USA). Antes do uso, as fibras

foram condicionadas de acordo com as especificações do fabricante: as fibras foram inseridas

no injetor do cromatógrafo a gás com temperatura de injeção a 240 °C e mantidas durante 20

minutos. Em um vial de 20 mL foram colocadas 0,5 g de folhas maceradas em nitrogênio

líquido (CAPPELARO; YARIWAKE, 2015). Antes da exposição da fibra, esses vials foram

deixados durante cerca de 2 minutos em banho seco a 60 °C para que as folhas descongelassem

e para facilitar a liberação dos compostos voláteis. O tempo de exposição da fibra ao material

vegetal foi de 5 minutos. Após a exposição, o dispositivo de microextração foi imediatamente

inserido no injetor do cromatógrafo a gás para as análises cromatográficas. As condições de

SPME (tipo de fibra, tempo de descongelamento, tempo e temperatura de exposição) foram

otimizadas em análises preliminares.

Como essa técnica necessita de pouco material (miligramas), foram analisadas as

folhas de todos os tratamentos com suas 10 replicatas e também das coletas sazonais de manhã

e tarde com três repetições cada.

Figura 12. Extração dos óleos essenciais por hidrodestilação em aparelho de Clevenger modificado.

(Foto: própria autora).

51

4.7 Controle de Qualidade (QC)

Os controles de qualidades (QC – do inglês Quality Control) são amostras

empregadas para monitorar o desempenho do método analítico desenvolvido e também para

acompanhar a regularidade do cromatógrafo a gás. Essas amostras geralmente são inseridas no

início e ao final de cada sequência analisada, podendo também estar distribuídas

aleatoriamente entre a corrida analítica. A análise dos dados das QC ao final do experimento

permite ao analista decidir se deve ou não aceitar o lote examinado (SANGSTER et al., 2006).

Os controles também servem de referência para as análises estatísticas e de agrupamento.

As QCs foram compostas de uma mistura de alíquotas de todas as folhas dos

tratamentos, incluindo as replicatas e das duas espécies. No caso da sazonalidade foram

reunidas as coletas de todos os meses e das de manhã e de tarde. Foram pesados 0,3 g de folhas

maceradas de cada amostra para compor a QC.

4.8 Análises Cromatográficas

As análises cromatográficas foram realizadas no laboratório ThoMSon de

Espectrometria de Massas (Instituto de Química – UNICAMP), do professor Dr. Marcos

Eberlin. Foi utilizado o Cromatógrafo a Gás Agilent 7890 acoplado a Espectrômetro de Massa

5975 com injetor automático Gerstel.

Para as análises cromatográficas dos óleos essenciais, alíquotas de 10 μL de óleo

extraído foram diluídas 1:10 em diclorometano e 1 μL dessa solução foi injetada no

equipamento. Para as análises dos voláteis por fibra de microextração, a fibra foi inserida

diretamente no injetor. A ordem de injeções das amostras no GC-MS foi programada de modo

aleatório, utilizando-se o programa Microsoft Excel para randomizar as amostras.

Foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida HP-5 (30 m × 0.2 mm × 0.33

m diâmetro) e hélio (99,999% de pureza) como gás de arraste e fluxo de 1 mL.minˉ¹. O injetor

foi mantido a 250 °C, com divisão de fluxo (split) na razão de 1:35 no caso do óleo essencial

e de 1:8 quando utilizada a fibra de microextração. A programação de (1)

52

temperatura do forno começou em 100 °C, aumentando até 170 °C numa taxa de 3 °C. minˉ¹ e

depois de 170 °C a 250 °C a 20 °C. minˉ¹, com duração total de 24 minutos por corrida (Figura

13). A temperatura da interface foi mantida em 250 °C. O sistema foi operado em modo full

scan com ionização por elétrons de 70 eV, na faixa de m/z 29-289. Este método foi

desenvolvido e otimizado no início do estudo.

Figura 13. Programação de temperatura utilizada nas análises cromatográficas em GC-MS. Tempo

total de corrida: 24 minutos.

As substâncias foram identificadas por comparação com a biblioteca NIST (Mass

Spectral Library, 2008) acoplada ao equipamento, com a biblioteca NIST on-line (NIST, 2018)

de acordo com dados da literatura e também por comparação com dos seus índices de retenção

(IR) com um conjunto de hidrocarbonetos de n-alcanos (nC8-nC20) (ADAMS, 2007). O

padrão (1 µL) destes alcanos foi injetado no sistema GC-MS operando nas condições descritas

acima, e seus respectivos tempos de retenção foram usados como padrão externo de referência

para o cálculo do IR, juntamente com os tempos de retenção de cada composto de interesse. O

IR de cada componente foi calculado conforme a Equação 1.

𝐼𝑅 = 100(𝑛) + 100(𝑚 − 𝑛)𝑡𝑟𝑖 − 𝑡𝑟𝑛

𝑡𝑟𝑚 − 𝑡𝑟𝑛

Equação 1: Fórmula utilizada para cálculo do índice de retenção dos compostos voláteis.

Onde: IR é o índice de retenção do composto de interesse; i – composto volátil

analisado; n – número de carbono do alcano que elui antes de i; m - – número de carbono do

alcano que elui depois de “i’; tri – tempo de retenção de “i”; trn – tempo de retenção do carbono

que elui antes de “i”; trm – tempo de retenção do alcano que elui depois de “i”.

100120140160180200220240260

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Tem

per

atu

ra (

oC

)

Tempo (minutos)

Programação de Temperatura

53

4.9 Atividades biológicas dos óleos essenciais

Foi necessário preparar um “pool” de óleos essenciais, agrupando as extrações de

todos os meses do ano para que as análises das atividades biológicas fossem conduzidas, devido

ao baixo rendimento dos óleos essenciais extraídos por hidrodestilação em Clevenger

4.9.1 Atividade antimicrobiana

Foi efetuado um ensaio biológico in vitro frente às bactérias Gram-positivas:

Staphylococcus aureus Rib1, S. aureus ATCC25922, e S. aureus BEC9393, S. epidermidis

ATCC12228, e contra Gram-negativas: Escherichia coli ATCC25923, Klebsiella pneumoniae

KP230, K. pneumoniae ATCC4352, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 e P. aeruginosa

31NM.

A atividade antimicrobiana foi realizada no Departamento de Microbiologia do

Instituto de Biologia – UNICAMP, no laboratório do Prof. Dr. Marcelo Lancellotti. A análise

da atividade antimicrobiana foi realizada pelo método de difusão em ágar em camada dupla.

No plaqueamento, a camada base foi obtida pela adição de 5,0 mL de meio de cultura Müller

Hinton (Difco), em placas de 9,0 cm de diâmetro. Após a solidificação adicionou-se 1,0 mL de

caldo Müller Hinton contendo os micro-organismos na concentração de 1,5x108 UFC/mL (o

equivalente a 0,5 na escala McFarland), obtendo-se assim a camada seed. A seguir foram

confeccionados poços com 5,0 mm de diâmetro e em cada poço aplicados 20 µL das soluções

controle (positivo e negativo) e dos óleos essenciais, nas concentrações de 20 %, 10 %, 7,5 %

e 5 %, diluídas em etanol. Como controle positivo foi usada bacitracina e como controle

negativo o solvente usado (etanol). As placas foram incubadas durante 24 horas a 37 º C.

Decorrido o período de incubação, as zonas de inibição do desenvolvimento microbiano foram

observadas em termos de diâmetro (halo). Foram consideradas atividades antimicrobianas

positivas para halos com diâmetro maior do que 10 mm.

4.9.2 Atividade antioxidante

As análises da atividade antioxidante foram realizadas no Departamento de

Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biologia – UNICAMP, no laboratório do Prof.

Dr. Marcelo Menossi. A atividade antioxidante foi avaliada através do ensaio de DPPH (2,2-

54

difenil-1-picril-hidrazila). Esse ensaio se baseia na medida do decaimento da absorbância em

517 nm da solução de 2,2-difenil-1-picril-hidrazila contendo substâncias antirradicalares. O

DPPH é um radical livre estável que apresenta a coloração violeta e absorve luz no

comprimento de onda na faixa de 515 a 520 nm. Quando esse composto está na presença de

uma substância antioxidante, o elétron desemparelhado do átomo de nitrogênio do DPPH

recebe um elétron do hidrogênio do antioxidante. Essa reação provoca uma mudança na

coloração do DPPH, que passa a ser amarelo e sua absorbância nesses comprimentos de onda

diminui (BRAND-WILLIAMS; CUVELIER; BERSET, 1995). A figura abaixo ilustra a

reação de oxirredução do DPPH em presença da quercetina, substância utilizada como padrão

positivo (Figura 14).

Figura 14. Reação de oxirredução do DPPH na presença de quercetina.

O teste foi realizado em uma placa de micro diluição de 96 poços de acordo com a

metodologia descrita por Erkan et al. (2008) com algumas modificações. Para cada amostra de

óleo essencial foram feitas diluições seriadas para obter uma concentração final de amostra nos

poços de 600,0 μg/mL até 18,5 μg/mL. Em cada poço foram adicionados 100 μL de etanol, e

50 μL de uma solução etanólica de DPPH (0,56 mM). Foi realizada uma curva de calibração

usando quercetina como padrão. Esta substância também foi utilizada como controle positivo

da reação e como controle negativo, o solvente utilizado (etanol). O progresso da reação foi

medido pela absorbância (λ= 517 nm) usando um espectrofotômetro (Molecular Devices,

SpectraMax M3) realizando medidas a cada 10 minutos durante um total de 60 minutos. A

porcentagem de redução do DPPH foi calculada de acordo com a fórmula a seguir (ESPÍN;

SOLER-RIVAS; WICHERS, 2000):

% DPPH = 100 – [ (A amostra – A branco) x 100/A controle ]

55

Todos os experimentos foram realizados em quadruplicata. Como a redução de

absorbância (λ= 517 nm) não atingiu 50 %, nem na maior concentração analisada, os resultados

foram apresentados como % de redução.

4.10 Análises Estatísticas

Para os tratamentos de irrigação, luminosidade e temperatura foram feitas dez

replicatas biológicas de cada espécie, sendo cada vaso considerado uma repetição. Para

sazonalidade foram três repetições analíticas, ou seja, alíquotas diferentes da mesma amostra

foram injetadas no cromatógrafo a gás. Para transformação dos dados cromatográficos em uma

tabela numérica foi utilizado o software online XcMS, o software também foi utilizado para

correção de linha de base e alinhamento dos cromatogramas.

Para a análise estatística, primeiramente foi realizada uma análise multivariada dos

dados - Análise de Componentes Principais (PCA) - com o software Pirouette 3.11 (Infometrix).

Assim, foi possível ter uma noção geral de agrupamento das amostras. Em seguida, os

resultados foram submetidos à análise estatística de variância (ANOVA) seguido do Teste de

Tukey (p<0,05), realizados no software Graphpad Prism 6.01.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Compostos voláteis capturados por fibra de microextração em fase

sólida (SPME)

Através da fibra de microextração (SPME) foi possível identificar 16 compostos

voláteis das espécies de guaco. O cromatograma típico de uma QC analisada por GC-MS está

ilustrada na Figura 15A. Como a QC é uma mistura de todas as amostras, todos os compostos

são contemplados em seu cromatograma. A fim de comparar, o cromatograma de M. laevigata

(Figura 15B) e M. glomerata (Figura 15C) ambas coletadas em maio de 2017 também estão

ilustradas na mesma figura. No cromatograma, cada número representa um composto e sua

respectiva identificação se encontra na Tabela 3, acompanhado de seu tempo de retenção,

índice de retenção e porcentagem da área do cromatograma.

56

Figura 15. Cromatograma dos compostos voláteis de uma (A) QC (mistura de todas amostras), (B)

Mikania laevigata e (C) Mikania glomerata capturadas por SPME e analisada em GC-MS. Espécies

coletadas em maio de 2017.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

13

14

15

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

9

9

10

10

11 12

12

13

13

14

14

15

15

16

16

16

(A)

(B)

(C)

57

Tabela 3. Compostos voláteis das QCs identificados pelas análises em GC-MS utilizando a fibra de

microextração. Número do sinal refere-se ao cromatograma da Figura 14. Tempo de retenção (em

minutos), índice de retenção e % de área.

Nº sinal Composto

(Nome comum)

Tempo

retenção (min.)

Índice de

Retenção % de área

M. laevigata M. glomerata

Aldeídos

1 hexanal 1,78 815 0,9 1,21

2 trans-2-hexenal 1,96 857 2,04 1,68

Monoterpenos

3 α-pineno 2,43 942 7,91 0,77

4 β-pineno 2,75 991 8,1 4,86

5 limoneno 3,17 1032 1,43 4,15

Sesquiterpenos

6 β-elemeno 8,83 1339 1,57 2,32

7 α-copaeno 9,89 1379 2,26 4,86

8 β-bourboneno 10,15 1393 0,20 0,12

9 β-cubebeno 10,26 1397 1,76 1,91

10 β-cariofileno 11,19 1426 14,27 20,44

11 cumarina 11,64 1443 4,20 0

12 α-cariofileno 12,09 1457 0,10 0,23

13 germacreno D 13,06 1490 40,78 46,04

14 biciclogermacreno 13,43 1502 10,60 5,84

15 Δ-cadineno 14,11 1526 0,83 1,60

16 germacreno B 15,10 1562 1,22 2,10

O composto majoritário das QCs é o germacreno D, representando em média 43,41

% da área total do cromatograma. Ademais, são encontrados dois aldeídos (hexanal e trans-2-

hexenal), que juntos representam 2,97 % da composição dos voláteis dos guacos; três

monoterpenos – α-pineno, β-pineno e limoneno – compondo 13,60 % da área do cromatograma

e o grupo mais representativo são os sesquiterpenos (83 %).

Os resultados aqui encontrados coincidem com o trabalho de Cappelaro &

Yariwake (2015), os autores também utilizaram a fibra de microextração para análise dos

voláteis de M. glomerata. Encontraram que os sesquiterpenos são a classe predominante na

composição dos voláteis, compreendendo 54,91 % da área relativa do cromatograma. Fora isso,

também encontraram monoterpenos (12,17 %) e diterpenos (0,85 %) em menores

concentrações. Uma diferença notável foi que os autores conseguiram detectar 128 compostos

voláteis nas folhas do guaco. Tal diferença provavelmente é explicada pelo fato dos autores

terem utilizado folhas secas, além disso, o material da fibra foi diferente (poliacrilato) e tempo

de exposição da fibra na amostra foi de 2 h a uma temperatura de 50°C.

58

A única diferença qualitativa na composição entre as duas espécies de guaco é que

apenas M. laevigata apresentou a cumarina em todas as suas análises cromatográficas. Em

média, ela representa cerca de 3,17% da área do gráfico. Todos os demais compostos

identificados apareceram em ambas as espécies pelo menos em uma das análises, variando

apenas sua concentração de acordo com o tratamento recebido pelas plantas.

Apesar de diferir aparentemente apenas pela presença de cumarina, ao realizar uma

análise de agrupamento (PCA), as duas espécies são claramente separadas em dois grupos

distintos (Figura 16). Foram selecionados dados de todas as análises utilizando-se da captura

dos compostos voláteis pela fibra de microextração (SPME), juntando todos os tratamentos com

suas repetições e os dados da sazonalidade. Assim, quanto mais amostras, mais confiável fica

o agrupamento (FERREIRA, 2015).

59

5.2 Tratamentos

5.2.1 Tratamento Temperatura

Pelo gráfico de PCA (Figura 17) é possível observar que houve uma boa separação

entre M. laevigata e M. glomerata e os controles de qualidade (QC). Esse tipo de análise não

foi capaz de separar nitidamente os resultados obtidos em cada condição, provavelmente

porque a influência da temperatura dentro da espécie foi menor do que as diferenças entre

espécies.

Figura 16. Análise de Componentes Principais (PCA) dos compostos voláteis de todos os tratamentos.

(A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (azul), M. glomerata (vermelho). (B) gráfico de loadings.

(A)

(B)

60

Figura 17. Análise de Componentes Principais (PCA) dos principais picos encontrados por GC-MS do

tratamento de temperatura. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (ML), M. glomerata (MG) e

Controle de Qualidade (QC). Os números representam a temperatura no qual a amostra estava submetida

seguida de sua repetição. (B) gráfico de loadings.

A componente principal 1 (eixo x) explica 78,93 % da variação das amostras e a

componente principal 2 (eixo y) explica 8,32 %. M. laevigata encontra-se mais à direita do

gráfico de scores (Figura 17A), enquanto as amostras de M. glomerata estão à esquerda e as

QC estão bem no centro, coloridas de roxo. Pelo gráfico de loadings (Figura 17B) observa-se

que os compostos hexanal, trans-2-hexenal e Δ-cadineno são responsáveis pelo agrupamento

das amostras de M. glomerata, enquanto os outros compostos (limoneno, α-pineno, β-

(A)

(B)

61

filandreno, β-pineno, cumarina, germacreno D, γ-elemeno, biciclogermacreno e β-carifileno)

são responsáveis por discriminar M. laevigata. As QC bem no centro do gráfico indicam um

bom preparo da amostra, uma vez que são compostas da mistura de todos os tratamentos e suas

repetições, é de se esperar que sua composição química também seja intermediária entre duas

espécies.

Em relação aos ensaios de temperatura, pelo gráfico de PCA é possível observar

tendências de agrupamento entre as diferentes temperaturas em que foram submetidos os

vasos. Para M. glomerata a separação se dá de maneira mais nítida levando em consideração a

componente principal 2. Os vasos que foram submetidos a 15 °C tenderam a ter pesos mais

positivos, portanto, se concentram mais na porção superior do gráfico. Nos tratamentos a 25

°C e 35 °C não há uma separação tão nítida, apesar do tratamento a 35 °C parecer agrupar as

amostras de um modo mais concentrado.

Por outro lado, M. laevigata tende a separar-se melhor de acordo com a

componente principal 1. Os vasos submetidos a 15 °C apresentaram pesos mais positivos,

ficando mais à direita do gráfico. Enquanto que os vasos a 25 °C apresentaram pesos

intermediários e a 35 °C a separação se dá de maneira mais clara, formando um grupo mais

distante dos demais testes e mais próxima do centro do gráfico.

Além da análise de PCA também foi realizada uma análise de variância (ANOVA)

seguida do teste de Tukey (p<0,05), para verificar se houve diferença estatística dos compostos

voláteis nas diferentes condições. A Figura 18 traz os resultados dessas análises em forma de

gráfico de barras. No eixo x se encontram os compostos voláteis identificados nas amostras e

no eixo y a intensidade de cada composto (pico) com seu respectivo desvio padrão. As barras

coloridas em azul são referentes aos vasos que foram submetidos a 15 °C, os vermelhos a 25

°C e de verde estão os tratamentos a 35 °C. As letras acima das barras indicam as diferenças

significativas entre as condições: letras iguais indicam que não houve diferença significativa

(p <0,05).

62

Figura 18. Compostos voláteis de (A) M. laevigata e (B) M. glomerata nas diferentes condições de

temperatura. As barras indicam a intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões:

azul - planta submetidas a 15 °C, vermelho 25 °C e verde 35 °C. Letras diferentes acima das barras

indicam diferenças significativas (teste t de Tukey com p <0,05).

(A)

(B)

63

Para M. laevigata o primeiro pico na corrida cromatográfica e o mais leve (hexanal)

aumenta de intensidade quando a temperatura também aumenta. Para M. glomerata o segundo

pico (trans-2-hexenal) apresenta esse comportamento. Loreto et al. (2006), também

observaram um aumento de trans-2-hexenal nas plantas quando submetidas a altas

temperaturas (45 °C). Esses compostos foram descritos como resultantes de estresses

ambientais, como altas temperaturas e altas intensidades luminosas (MONSON, 2003).

Também foram relacionados com estresse a herbivoria e a exposição a ozônio (VANDER

HEIDEN et al., 2009).

Em M. laevigata a maioria dos compostos diminuíram em intensidade com o

aumento da temperatura. β-pineno, limoneno e biciclogermacreno tiveram uma diminuição

significativa de suas intensidades na condição de 35 °C em relação às condições de 15 °C e 25

°C. α-pineno, β-elemeno e germacreno D também tiveram diferenças estatísticas entre as

condições de 15 °C e 35 °C. Apenas trans-2-hexenal, β-cariofileno, cumarina e Δ-cadineno não

apresentaram diferenças de intensidade no tratamento de temperatura.

Observa-se que, para M. glomerata, as intensidades do limoneno, β-elemeno, β-

carifileno e germacreno D foram significativamente mais intensos em 15 °C, que em 25 °C e

35 °C. Embora as intensidades de β-pineno e biciclogermacreno também variaram, não se

observou relação direta com a temperatura. Enquanto que α-pineno e Δ-cadineno não

apresentaram diferenças estatísticas neste tratamento.

A temperatura tem um papel fundamental na emissão de terpenos, uma vez que os

compostos voláteis só são liberados de suas estruturas secretoras - por exemplo, os tricomas -

quando estas são expostas a altas temperaturas. O rompimento da membrana dos tricomas

ocorre quando há muita pressão de vapor dentro de sua célula, essa pressão é aumentada devido

à altas temperaturas (PAVARINI et al., 2012). Desse modo, a diminuição da intensidade dos

compostos voláteis parece fazer sentido, uma vez que aumentando a temperatura é esperado

que os voláteis se percam para o ambiente, e seu acúmulo na folha pode ser menor.

Wallaart et al. (2000) analisaram a variação sazonal da artemisinina, um

sesquiterpeno, em indivíduos de Artemisia annua L. (Asteraceae) e observaram que esses

compostos também diminuíam de intensidade em altas temperaturas. Inúmeros trabalhos

correlacionam as altas temperaturas com o decréscimo de antocianinas (CHRISTIE;

ALFENITO; WALBOT, 1994; OLSEN et al., 2008; SHAKED-SACHRAY et al., 2002). Em

64

um experimento utilizando uvas, Azuma et al. (2012) observaram que em altas temperaturas

(35 °C), o acúmulo de antocianinas nas cascas das uvas eram significativamente menor do que

em baixas temperaturas (15 °C). Isso interferia na coloração das uvas, o que importante para

comercialização desse produto.

Cna'Ani e colaboradores (2015) observaram uma forte redução da maioria dos

compostos voláteis quando as plantas de petúnias (Petunia × hybrida) foram submetidas a

elevadas temperaturas. Assumiram que a temperatura pode estar relacionada com a expressão

de genes envolvidos na biossíntese de fenilpropanoides. Analisando a expressão dos genes

relacionados aos aromas sob diferentes regimes de temperatura, os autores observaram que a

diminuição dos níveis de compostos aromáticos poderia ser atribuída ao acúmulo de transcritos

dos genes correspondentes. Foi encontrada uma relação positiva entre os níveis de genes que

codificam enzimas dos produtos finais e os correspondentes voláteis emitidos ou acumulados.

Notou-se que ao final do experimento, as folhas de todos os tratamentos

apresentavam-se danificadas, com algumas manchas vermelhas ou arroxeadas. Essa mesma

característica também foi observada no experimento de luz, apenas nas plantas que ficaram a

pleno sol. Provavelmente a luz artificial da câmara de crescimento, onde foi realizado o

tratamento de temperatura pode ter afetado as folhas. Como os clones eram jovens, portanto,

mais sensíveis, a luz pode ter causado um estresse nas plantas também.

5.2.2 Tratamento luminosidade

Assim como ocorreu na PCA do tratamento de temperatura, o de luminosidade

também foi capaz apenas de separar as espécies e os controles de qualidade, mas não separou

as amostras submetidas a diferentes condições (Figura 19). A componente principal (PC) 1

explica 51,17 % da variação dos dados, enquanto que a PC2 é responsável por 15,30 %.

Observa-se ainda que M. laevigata formou um grupo à esquerda, tendo como principais escores

o α-pineno, cumarina e biciclogermacreno. Já M. glomerata ficou à direita do gráfico, sendo

separada pela maior presença de limoneno, β-bourboneno, trans-2-hexenal, β-cariofileno,

germacreno D, hexanal e α-copaeno. Como é de se esperar, as QCs concentram-se no centro da

PCA, indicando um bom preparo da amostra e uma boa normalidade do equipamento.

65

Mesmo com a PCA não separando nitidamente as diferentes condições do

tratamento, foi realizada uma análise de variância para cada espécie e para cada composto

volátil identificado. Na Figura 20 observa-se que para M. laevigata o hexanal, trans- 2-hexenal,

α-pineno, β-pineno, α-copaeno e cumarina tiveram reduções significativas nas suas

intensidades com o aumento da luminosidade. Dentre eles, a cumarina a 50 % de luminosidade

se destaca, apresentando maiores teores nessa condição. O α-pineno a luz plena tem sua

(B)

(A)

Figura 19. Análise de Componentes Principais (PCA) dos principais picos encontrados por GC-MS do

tratamento de luminosidade. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (ML), M. glomerata (MG)

e Controle de Qualidade (QC). Os números representam a porcentagem de luminosidade das condições

na qual a amostra estava submetida seguida de sua repetição. (B) gráfico de loadings.

66

intensidade significantemente diminuída quando comparada com a condição de 100% de luz.

Para os demais voláteis não houveram diferenças significativas entre as condições estudadas.

Dados da literatura mostram diferentes resultados para os teores de cumarina em

extratos de guaco, quando essas plantas são submetidas a diferentes condições de luz. De Castro

et al. (2006), avaliaram o teor de cumarina em plantas jovens de M. glomerata cultivadas sobre

diferentes condições de luminosidade. Como resultado, observaram que as plantas cultivas a

pleno sol tinham os maiores teores de cumarina, sendo até o dobro do encontrado nas outras

condições de luminosidade. Souza et al. (2011) utilizando-se de malhas coloridas com 50% de

luminosidade e comparando com as plantas a pleno sol, observaram que o teor de cumarina não

variou entre essas condições. Já Almeida et al. (2017) encontraram maiores concentrações de

cumarina em plantas submetidas a 50 % de luminosidade, contudo, essa diferença não foi

significativa quando comparada com as plantas a luz plena ou a 25 % de luz.

A variação no teor de cumarina sob diferentes condições de luminosidade é

importante, pois, esse composto é considerado o marcador químico para o guaco (ANVISA,

2004), assim como é o responsável por alguma das atividades terapêuticas (CELEGHINI;

VILEGAS; LANÇAS, 2001). Portanto, condições ideais de cultivo devem ser estudadas para

que se haja uma padronização no teor deste princípio ativo de plantas medicinais.

67

Na Figura 21, para M. glomerata as intensidades de hexanal, β-cariofileno e α-

cariofileno foram significativamente diminuídas a luz plena, quando comparadas com as

demais condições. α-copaeno, germacreno D e biciclogermacreno também apresentaram

diferenças entres os diferentes ensaios, mas que não puderam ser correlacionados diretamente

ao fator de luminosidade. Para os demais compostos não houveram diferenças significativas

entre as condições.

Figura 20. Compostos voláteis de M. laevigata dos tratamentos de luminosidade. Barras indicam

intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas submetidas a 50 %

de luminosidade, vermelho 75 % de luminosidade e verde a luz plena. Letras diferentes acima das

barras indicam diferenças significativas entre grupos pelo teste de Tukey (p <0,05).

68

Através dos gráficos de barras, é possível observar que os compostos voláteis das

duas espécies de guaco diminuíram de intensidade com o aumento da luminosidade ou não

tiveram diferenças significativas entre as condições. Esses resultados contrastam com os da

literatura. Em um experimento com sálvia e alecrim, Li e Craker (1996) submeteram essas duas

espécies a diferentes graus de luminosidade e observaram que aumentando a incidência solar,

a concentração dos compostos dos óleos essenciais também aumentava. Clark e Menary (1980)

observaram os mesmos resultados com hortelã-pimenta e Pegoraro et al. (2010) com Mentha

piperita.

As maiores produções de metabólitos secundários sob altos níveis de radiação solar

são explicadas devido ao fato de que as reações biossintéticas são dependentes de suprimentos

de esqueletos carbônicos, realizados por processos fotossintéticos e de compostos energéticos

que participam da regulação dessas reações (TAIZ; ZEIGER, 2013). Algumas espécies como o

manjericão (O. basilicum) e o alecrim (T. vulgaris) dependem da luz para completar o

Figura 21. Compostos voláteis de M. glomerata dos tratamentos de luminosidade. Barras indicam

intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas submetidas a 50 % de

luminosidade, vermelho 75 % de luminosidade e verde a luz plena. Letras diferentes acima das barras

indicam diferenças significativas entre grupos pelo teste de Tukey (p <0,05).

69

desenvolvimento de tricomas glandulares – estruturas que sintetizam e armazenam os óleos

essenciais (MORAIS, 2009).

O tratamento de luminosidade foi realizado a céu aberto, porém, apesar de estarem

no mesmo ambiente, os vasos a pleno sol sofriam mais influência da temperatura, devido a

incidência direta do sol. Isso também levava a maior perda de água no solo. Mesmo todos os

vasos sendo regados com o mesmo volume diariamente, foi observado que as plantas mantidas

a 50 % de sombreamento tinham seu solo mais úmido do que os indivíduos a pleno sol. Isso

demonstra como é difícil controlar efeitos abióticos sobre o metabolismo das plantas, sendo que

todos esses fatores estão interligados entre si, assim como descreve Gobbo-Neto e Lopes

(2007).

Portanto, possivelmente houve efeito da temperatura sobre os voláteis do guaco

junto com o efeito da luminosidade, levando a uma diminuição dos compostos por evaporação,

assim como ocorreu no tratamento de temperatura. Além disso, o experimento foi mantido

durante três semanas, talvez esse tempo não tenha sido suficiente para provocar alterações no

desenvolvimento de tricomas glandulares. Experimentos realizados por outros autores

mantiveram as plantas durante 120 dias a um ano sob diferentes condições de luminosidade

para os estudos dos óleos essenciais (BRANT et al., 2011; MATTANA et al., 2010; PINTO et

al., 2007).

5.2.3 Tratamento irrigação

Através do gráfico de PCA (Figura 22), nota-se primeiramente a formação de três

principais agrupamentos: M. laevigata à direita, M. glomerata à esquerda e as QCs no centro.

A PC1 é responsável por explicar 45,98 % da variação dos dados, enquanto que a PC2 explica

18,24 %. Dentro do grupo de M. glomerata, a condição de déficit hídrico, colorido de verde na

figura, concentrou-se de maneira mais homogênea, com escores mais positivos e, portanto, na

porção superior do gráfico. Isso indica que essa condição afetou mais as plantas, formando um

grupo mais afastado. As demais condições não se separaram de maneira tão nítida no PCA.

Os compostos α-pineno, biciclogermacreno, cumarina, β-pineno e β-elemeno foram

responsáveis por discriminar as amostras de M. laevigata. Já o restante dos compostos

(limoneno, β-cariofileno, trans-2-hexenal, α-copaeno, β-bourboneno, Δ-cadineno, hexanal e

70

germacreno D) separaram as amostras de M. glomerata. As QCs encontram-se no centro da

PCA, pois sua composição é intermediária entre as duas espécies.

(B)

(A)

Figura 22. Análise de Componentes Principais (PCA) dos principais picos encontrados por GC-MS

do tratamento de irrigação. (A) Gráfico de scores ou amostras: M. laevigata (ML), M. glomerata (MG)

e Controle de Qualidade (QC). E = plantas submetidas ao excesso de água. C = plantas controle. S =

plantas em déficit Hídrico. Os números em seguida representam as repetições. (B) gráfico de loadings.

71

Como nos demais tratamentos, foi realizada uma ANOVA seguida do teste de

Tukey (p<0,05) para verificar as diferenças entre intensidades dos compostos voláteis nas

diferentes condições de irrigação. Os resultados são mostrados na forma de gráfico, no qual o

controle é representado pelas barras azuis, a condição de excesso de água pela cor verde e em

vermelho os vasos submetidos ao déficit hídrico.

Na Figura 23 é possível observar que para M. laevigata, cerca de 50 % dos

compostos tiveram sua intensidade aumentada na condição de déficit hídrico, e que para a

maioria o excesso de água apresentou resultados similares ao controle. Dentre esses compostos

podemos citar o trans-2-hexenal, α e β-pineno, limoneno, α-copaeno e β-cubebeno. A cumarina

e o germacreno D também aumentaram de intensidade na condição de déficit hídrico, porém,

essa diferença não foi significativamente diferente do grupo controle. Os demais compostos

não apresentaram diferenças significativas entre as condições do experimento.

Figura 23. Compostos voláteis de M. laevigata dos tratamentos de irrigação. Barras indicam

intensidade média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas controle, vermelho

plantas submetidas ao déficit hídrico e verde plantas em excesso de água. Letras diferentes acima das

barras indicam diferenças significativas entre grupos pelo teste de Tukey (p <0,05).

72

Em relação a Mikania glomerata (Figura 24), apenas os cinco primeiros

compostos da corrida cromatográfica apresentaram alguma diferença entre as condições

realizadas. O hexanal teve sua intensidade diminuída no déficit hídrico, contrário do que

ocorreu os outros compostos. Trans-2-hexenal, α-pineno, β-pineno e limoneno tiveram suas

intensidades aumentadas na condição de déficit hídrico, assim como ocorreu com M. laevigata.

Os demais compostos não apresentaram diferenças significativas entre as condições.

A maior intensidade dos compostos voláteis na condição de déficit hídrico poderia

ser explicada devido a menor quantidade de água nas folhas desse grupo, uma vez que as

plantas foram deixadas na condição de seca até apresentarem sinais de murcha permanente.

Era de se esperar que quanto menos água nas folhas, mais material seria necessário para

pesagem no momento das análises dos voláteis. Para tanto, foi realizado um teste para verificar

se a porcentagem de massa seca da planta não interferia nos resultados cromatográficos.

Porém, notou-se que a porcentagem de água nas folhas não teve diferença significativa entre

as três condições hídricas, assim, não foi realizada nenhuma correção nas intensidades dos

cromatogramas.

Figura 24. Compostos voláteis de M. glomerata dos tratamentos de água. Barras indicam intensidade

média dos compostos e seus respectivos desvios padrões: azul - plantas controle, vermelho plantas

submetidas a seca e verde plantas em excesso de água. Letras diferentes acima das barras indicam

diferenças significativas entre grupos pelo teste de Tukey (p <0,05).

73

Diversos trabalhos corroboram com os resultados aqui encontrados, parece haver

uma correlação positiva entre déficit hídrico e aumento da concentração dos constituintes dos

óleos essenciais. O estresse causado pela falta de água reduz consideravelmente a taxa

fotossintética, a condutância estomática e a emissão de isoprenóides, e também induz a uma

mudança na composição dos aromas das plantas (NOGUÉS et al., 2015).

Meira e colaboradores (2012) encontraram maiores produções e teores de óleo

essencial de Melissa officinalis quando as plantas estavam em situação de déficit hídrico.

Kainulainen et al. (1992) observaram um aumento dos níveis de monoterpenos em indivíduos

de pinheiros submetidos ao déficit hídrico. Para Ocimum basilicum, Anethum graveoleon e

Artemisia dracunculus, o aumento do estresse hídrico também correspondeu a um aumento do

rendimento e a alteração da composição de seus óleos essenciais (FIGUEIREDO; BARROSO;

PEDRO, 2007). Nogués et al. (2015) trabalharam com alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e

observaram que durante o déficit hídrico, a porcentagem de α-pineno e canfeno diminuíam

significativamente, porém outros monoterpenos como cineol e borneol aumentavam de

intensidade.

Ótimas condições ambientais favorecem o crescimento e desenvolvimento das

plantas, porém, condições adversas estimulam o metabolismo secundário das plantas. Quando

as plantas são submetidas a algum estresse ambiental, precisam modular seu metabolismo

como forma de defesa, propiciando melhores condições de sobrevivência (TAIZ; ZEIGER,

2013). Em situações de estresse, o carbono fixado fotossinteticamente é redirecionado para a

síntese de metabólitos secundários como os compostos fenólicos e terpenóides (DE ABREU;

MAZZAFERA, 2005). Parece que o estresse causado pelo déficit hídrico induz a biossíntese

de isopentenil pirofosfato, um precursor dos terpenos nas plantas (MILBORROW, 2001), o

que leva a maiores concentrações desses compostos na situação de déficit hídrico.

Ainda, alguns metabolitos secundários, principalmente isopropanoides e

fenilpropanoides, tem a capacidade de atuar como compostos antioxidantes “in planta” em

situações de estresse como seca, luz e temperatura. Esses compostos podem aliviar o estresse

foto-oxidativo sequestrando e eliminando espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, e

podem aumentar a tolerância das membranas dos tilacóides à altas temperaturas (TATTINI et

al., 2015).

5.3 Variação mensal dos voláteis por SPME

74

5.3.1 Condições climáticas durante o estudo

Segundo a classificação de Köppen, o clima na região de Campinas-SP é do tipo

Cwa, ou seja, clima mesotérmico com verões quentes e estações secas de inverno (PEEL;

FINLAYSON; MCMAHON, 2007). Janeiro é considerado o mês mais quente do ano e com

os maiores índices de precipitação. Junho costuma ter as menores temperaturas, com média

mensal inferior à 18 °C (CEPAGRI, 2017).

De acordo com os dados meteorológicos oferecidos pelo Centro de Pesquisas

Meteorológicas e Climáticas Aplicadas a Agricultura da UNICAMP (CEPAGRI, 2017), as

maiores temperaturas ocorreram em fevereiro de 2017, com média de 24,1 °C (Figura 25). O

mês de maior concentração de precipitação foi em janeiro, atingindo acumulado de 420,66 mm

de água. As temperaturas mais baixas foram registradas em julho de 2017, com média de 16,9

°C. Nesse mês não foi registrado nenhum dia de chuva, concordando com a classificação

climática de invernos secos em Campinas – SP.

Figura 25. Variação média de temperatura e precipitação no período de desenvolvimento do projeto

(Fonte: CEPAGRI, 2017). T. min.: temperatura mínima; T. máx.: temperatura máxima.

75

5.3.2 Análise dos voláteis

Primeiramente foi realizada uma análise exploratória dos dados (PCA) e foi

observado que não havia separação entre os cromatogramas dos compostos voláteis nas folhas

coletadas de manhã e à tarde. Mesmo analisando isoladamente cada espécie não houve

separação entre essas duas coletas. Realizando um teste de ANOVA seguida da do teste de

Tukey (p<0,05), também não houve diferença significativa entre os dados adquiridos na coleta

da manhã e na da tarde do mesmo dia. Pelo contrário, os testes estatísticos indicaram que as

amostras tinham alta correlação (p>0,999), o que significa que as amostras foram praticamente

iguais. Portanto, os dados dessas duas coletas (manhã e tarde) foram unidos para as análises

mensais, desse modo, o número de repetições aumentou para seis.

Em seguida foi realizada uma PCA (Figura 26) com os todos os dados adquiridos

ao longo do ano das duas espécies de guaco. Novamente foi possível observar a separação entre

os cromatogramas dos compostos voláteis de M. laevigata, M. glomerata e as QCs no centro

do gráfico. A componente principal 1 (PC1) conseguiu explicar 51,23 % das variações dos

dados e a PC2 14,91 %. As amostras de M. laevigata se concentraram à esquerda do gráfico

de escores (Figura 26A) devido a diferenças nas intensidades de α-pineno, cumarina e

biciclogermacreno. Por outro lado, as amostras de M. glomerata agruparam-se à direita.

Segundo o gráfico de loadings (Figura 26B) essa separação se correlaciona aos compostos β-

pineno, hexanal, trans-2-hexenal, limoneno, β-elemeno, β-cariofileno, α-copaeno e

germacreno D. As QCs situadas entre as duas espécies demonstra que suas características são

um intermediário entre as espécies.

76

A fim de se observar com mais clareza o efeito mensal sobre os compostos voláteis,

foi realizada uma PCA com cada espécie isoladamente. A Figura 27 traz o PCA dos resultados

das amostras de M. laevigata. No gráfico de escores (Figura 27A), cada cor representa um

mês do ano. A PC1 explica 37,47 % da variação dos dados e a PC2 explica 22,48 %. Em um

primeiro momento é possível observar que houve alguma sobreposição entre as amostras,

porém, as repetições dos meses encontram-se agrupadas.

As amostras do mês de janeiro agruparam-se mais ao centro do gráfico, juntamente

com os meses de dezembro e novembro, que ficaram um pouco mais à esquerda e a cima. Essa

Figura 26. Análise de Componentes Principais (PCA) dos principais compostos voláteis das coletas

mensais de guaco capturadaos por SPME. (A) Gráfico de escores ou amostras: M. laevigata (ML), M.

glomerata (MG) e Controle de Qualidade (QC). Cada cor representa um mês do ano. (B) gráfico de

loadings.

(A)

(B)

77

separação se deu por conta do β-cariofileno e β-elemeno. Também mais ao centro, porém com

escores mais positivos concentram-se os meses de fevereiro e o de maio mais na porção

inferior. As repetições dos meses de março e junho ficaram mais espaçadas, contudo, ambas à

direita do gráfico. Com escores mais negativos pela PC1, temos o mês de setembro na porção

superior do gráfico, sendo separada devido à cumarina. Mais ao centro observa-se o mês de

outubro e na parte de baixo do gráfico observa-se os meses de julho e agosto juntos. Apenas o

mês de abril não se agrupou de maneira homogênea, ficando três repetições em cada lado do

gráfico.


mensais de M. laevigata capturadaos por SPME. (A) Gráfico de escores ou amostras. Cada cor

representa um mês do ano. (B) gráfico de loadings.

(B)

(A)

78

Para as amostras de M. glomerata, a separação entre os meses não ficou tão clara

como na PCA de M. laevigata. A Figura 28 mostra o resultado dessa análise juntamente com

o gráfico de loadings. Observa-se que grande parte das amostras se concentram à esquerda do

gráfico, provavelmente porque uma única amostra de agosto está bem isolada à direita, que

poderia ser considerada uma outlier. Contudo, mesmo excluindo essa amostra, a aglomeração

à esquerda continua. E assim, sucessivamente, portanto, foi decido manter todas as amostras

na análise dos dados.

O agrupamento mais nítido é do mês de maio, no qual as amostras tenderam a ficar

na porção superior do gráfico, provavelmente devido aos teores de β-bourboneno. Logo abaixo,

mais à esquerda tem-se o agrupamento de julho em função do biciclogermacreno. O mês de

abril teve um espalhamento, formando um grupo do centro do gráfico e indo em direção à

direita inferior. Os dados dos demais meses apesar de agruparem-se de certa maneira à

esquerda do gráfico, apresentaram muita sobreposição, sendo difícil observar uma separação

mais clara.

79

Após a análise exploratória dos dados, foi realizada uma análise com cada

composto isoladamente, a fim de observar sua flutuação ao longo dos meses. Os resultados

encontram-se na Figura 29, no qual as barras representam a média da porcentagem da área do

composto em cada mês analisado. As barras em azul representam os dados das amostras de M.

laevigata e em vermelho estão os resultados das amostras de M. glomerata, ambas com seus

respectivos desvios padrões. Letras maiúsculas diferentes em cima das barras indicam

diferença significativa (p<0,05) entre resultados de M. laevigata e letras minúsculas para M.

glomerata.


mensais de M. glomerata capturadaos por SPME. (A) Gráfico de escores ou amostras. Cada cor

representa um mês do ano. (B) gráfico de loadings.

(A)

(B)

80

Hexanal Trans-2-hexenal

α-pineno

ABC

β-pineno

Limoneno β-elemeno

α-copaeno β-bourboneno

81

Figura 29. Porcentagem da área dos compostos voláteis de guaco durante o período de

desenvolvimento do projeto. Barra azul: M. laevigata, barra vermelha: M. glomerata com seus

respectivos desvios padrões. Letras maiúsculas diferentes em cima das barras indicam diferença

significativa (p<0,05) entre resultados de M. laevigata e letras minúsculas para M. glomerata.

O hexanal e trans-2-hexenal apresentam maiores intensidades nas amostras de M.

glomerata na grande maioria dos meses. Em abril é quando ocorre a maior produção de trans-

2-hexenal para essa espécie, contudo, essa diferença não é significava se comparada com todos

os outros meses. O hexanal apresenta maiores teores em março, maio e junho e a partir de julho

é notada uma grande baixa em sua concentração. Para M. glomerata, a maior intensidade de

hexanal se dá em fevereiro, março e abril, sendo que nos demais meses a produção decai e

parece se manter constante.

O limoneno, β-elemeno, α-copaeno e β-cariofileno foram mais intensos nos

cromatogramas de M. glomerata em todos os meses. Embora as intensidades de germacreno D

fossem próximas para as duas espécies, na maioria dos meses foi mais intenso em M. glomerata.

Em cerca de 65 % dos meses, β-pineno e β-bourbuneno foram mais intensos nos voláteis de M.

glomerata. A cumarina foi encontrada somente em voláteis de M. laevigata e α-pineno e

biciclogermacreno foram sempre mais intensos em voláteis dessa espécie.

β-cariofileno Cumarina

Germancreno D

82

Para M. glomerata, a maior produção de α-pineno se deu em maio, sendo essa

diferença significativamente diferente dos demais meses. Contudo, pelo gráfico de barras, o

teor desse composto parece ser constante ao longo do ano. Já para M. laevigata, a maior

concentração de α-pineno ocorre em março e há uma queda entre julho e outubro, quando

também ocorre a floração da espécie. O mesmo parece acontecer para o β-pineno, as maiores

concentrações se dão até o primeiro semestre do ano e em julho ocorreu uma queda em sua

produção. Para M. glomerata os maiores teores são observados entre março e agosto, sendo

que não há diferença estatística entre esses meses, porém, observa-se diferença quando

comparado com os demais meses do ano.

A produção do limoneno foi constante ao longo do ano para M. glomerata e M.

laevigata, somente foi observada diferença estatística entre os meses de maior produção e os

menores. O mesmo ocorre para o α-copaeno, M. laevigata pareceu manter as concentrações

desse composto sem grandes variações. Já para M. glomerata foi observada uma queda na

produção de α-copaeno entre os meses mais frios, que também coincide com sua floração.

O β-elemento não apresentou diferenças significativas ao longo do ano para as duas

espécies. Ou seja, o mês em que foi realizada a coleta não interferiu no teor desse volátil.

Para M. laevigata, β-bourboneno tem sua intensidade aumentada em agosto e uma

queda na produção ao final do ano, entre outubro, novembro e dezembro. Para M. glomerata a

maior produção se destaca em janeiro, maio, junho e julho, ao final do ano também ocorre uma

constância em sua produção e em abril é quando se observa o menor teor produzido.

O β-cariofileno parece ter sua produção constante ao longo do ano para M.

laevigata, sendo que seu maior teor foi encontrado em outubro e o menor em agosto, contudo,

não houve diferença significava entre os meses de análise. M. glomerata apresentou maiores

concentrações de β-cariofileno em todos os meses quando comparada com M. laevigata. A

maior produção se deu em janeiro e houve uma diminuição gradual até maio, quando foi

observado o menor teor de β-cariofileno.

Durante todos os meses de coleta, cumarina foi somente encontrada em M.

laevigata. Isso novamente indica que M. laevigata e M. glomerata possuem composição

química diferente, portanto, são espécies diferentes e não devem ser utilizadas indistintamente.

A maior produção de cumarina se deu em setembro, contudo é possível observar no gráfico

que as maiores concentrações desse volátil se dão do meio do ano para frente e entre janeiro e

junho sua produção decai.

83

Em relação ao germacreno D, para ambas as espécies, a intensidade do composto

se mantém constante, não havendo diferença significativa entre os meses estudos. Por fim, o

biciclogermacreno apresenta o mesmo padrão de constância para M. laevigata, porém,

observa-se que para M. glomerata, há um decaimento constante da intensidade de janeiro a

abril.

Fazendo uma correlação entre a proporção relativa dos compostos e os dados

meteorológicos, alguns compostos apresentam uma correlação entre a temperatura e a

intensidade de seus voláteis (Figura 30). O hexanal e trans-2-hexenal para M. glomerata tem

as maiores intensidades em abril e junho, meses em que foram observadas as menores

temperaturas. Para M. laevigata esses dois compostos apresentaram menores teores nas

maiores temperaturas do ano, o que fica bem visível no mês de janeiro. Comparando com o

tratamento realizado, ocorreu o contrário, os maiores teores de hexanal e trans-2-hexenal foram

encontrados nas maiores temperaturas (35°C).

A cumarina apresentou menores intensidades nos meses mais frios e seus maiores

teores foram observados da segunda metade do semestre para frente, em que a temperatura se

manteve constante, perto dos 20 °C. Contudo, em trabalhos estudando a variação mensal do

extrato de guaco observaram que o maior rendimento de cumarina se deu em meses quando

não houve incidência de chuvas e a temperatura foi baixa, entre junho e julho (ALMEIDA et

al., 2017; PEREIRA et al., 2000).

Para os demais compostos essa relação entre temperatura e intensidade não ficou

bem estabelecida, assim como quando foi comparado com a pluviosidade. O regime de chuvas

parece não ter influência sobre a produção dos compostos voláteis de guaco. As plantas do

campo sofrem uma somatória de fatores simultaneamente: luminosidade, irrigação e

temperatura; além de outros que não foram avaliados neste projeto como dano devido a vento

ou herbivoria e ataques de pragas. Desta maneira não foi possível concluir quais fatores se

correlacionaram com as variações observadas na composição dos voláteis de ambas espécies.

84

Figura 30. Relação entre temperatura média do ar no dia da coleta e porcentagem da área dos

compostos voláteis encontrados em Mikania laevigata (azul) e Mikania glomerata (vermelho) no

período de desenvolvimento do projeto.

0

5

10

15

20

25

30

0

2

4

6

8

jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez

% á

rea

do

cro

mat

ogr

ama

Período de desenvolvimento do projeto

HexanalMikania laevigata

Mikania glomerata

Tmédia

0

5

10

15

20

25

30

0

2

4

6

8

10


% á

rea

do

cro

mat

ogr

ama


Trans-2-hexenal Mikania laevigata

Mikania glomerata

Tmédia

0

5

10

15

20

25

30

0

5

10

15

20

25

30


% á

rea

do

cro

mat

ogr

ama


CumarinaMikania laevigata

Mikania glomerata

tmin

85

5.4 Óleos essenciais

5.4.1 Composição química

Foi possível avaliar o perfil químico dos voláteis de M. laevigata e M. glomerata

por duas técnicas diferentes. A primeira foi pela microextração em fase sólida (SPME) e a

segunda foi através da extração dos óleos essenciais por hidrodestilação em aparelho de

Clevenger. Após adquiridos esses voláteis, as análises foram realizadas em GC-MS, sendo

possível identificar a grande maioria dos compostos e suas porcentagens relativas.

Comparando esses dois métodos de extração dos voláteis, observa-se que não há

grandes diferenças entre os compostos identificados e sua porcentagem relativa. Em relação a

diferença entre as espécies, não foram observadas grandes diferenças entre os cromatogramas

de M. laevigata e M. glomerata, a única diferença visível é a presença da cumarina (1,2-

Benzopirona) apenas na composição de M. laevigata.

Os óleos essenciais obtidos pela hidrodestilação foram analisados por

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). A Figura 31 traz os

cromatogramas dessa análise das duas espécies de guaco extraídas em maio de 2017. Cada

número ao lado dos picos representa um composto diferente e sua respectiva identificação está

listada na Tabela 4, assim como seu tempo de retenção, índice de retenção e a média da

porcentagem da área dos picos.

86

(A)

(B)

1

2

3

4

5 10

17

11

15

12

14

13

16

18

19 20

1

2

4

5

6

7 10

11

12

13

14 15

16

17

18

19 20

Figura 31. Cromatograma dos óleos essenciais de (A) Mikania laevigata e (B) Mikania glomerata

analisados por GC-MS. Ambos os óleos foram extraídos no mês de maio de 2017 através da

hidrodestilação.

8

9

8

7 6

9

87

Tabela 4. Compostos dos óleos essenciais identificados pelas análises em GC-MS. Número do sinal de

acordo com o cromatograma da Figura 30. Tempo de retenção (em minutos), índice de retenção e %

área dos picos.

* Compostos não presentes na espécie.

Ao todo foram identificados 20 compostos voláteis nos óleos essenciais do guaco.

O composto majoritário foi o germacreno D, representando em média 31,50 % da área do

cromatograma. Os sesquiterpenos representaram em média 84,20 % da composição dos voláteis

e o restante foi composto pelos monoterpenos.

Comparando o método de extração utilizando a SPME e a hidrodestilação, observa-

se que os compostos hexanal e trans-2-hexenal estão ausentes nos óleos essenciais.

Provavelmente por serem compostos leves, são perdidos durante a hidrodestilação, pois a essa

técnica mantém altas temperaturas durante horas. Do mesmo modo, não foi possível identificar

a cumarina nos cromatogramas. Por esse composto apresentar alta volatilidade e baixa

estabilidade, provavelmente é perdido ou degradado durante a extração do óleo. Outra diferença

Nº do

sinal

Composto

(Nome comum)

Tempo de

Retenção

(min.)

Índice de

Retenção % Área dos picos

Monoterpenos M. laevigata M. glomerata

1 α-pineno 2,43 942 9,93 0,55

2 β-pinene 2,76 991 11,51 2,03

3 α-filandreno 2,94 1015 0,40 *

4 limoneno 3,16 1033 3,52 2,05

Sesquiterpenos

5 β-elemeno 8,75 1340 1,50 4,73

6 α-copaeno 9,83 1380 3,00 4,82

7 β-buorboneno 10,18 1394 2,37 2,38

8 β-cubebeno 10,24 1398 4,12 3,43

9 β-cariofileno 11,07 1426 11,94 15,79

10 α-cariofileno 11,98 1457 2,02 2,58

11 germacreno D 12,97 1490 34,93 26,95

12 biciclogermacreno 13,35 1503 12,78 7,65

13 γ-cadineno 13,53 1511 0,71 0,48

14 Δ-cadinene 13,99 1526 1,40 1,97

15 elemol 14,78 1552 2,18 1,18

16 germacreno B 15,06 1563 2,27 3,99

17 espatulenol 15,65 1581 1,77 1,83

18

óxido de

cariofileno 15,77

1587 0,82 2,88

19 γ-muuruleno 17,46 1642 0,84 1,43

20 α-cadinol 17,84 1657 0,86 1,80

88

é a presença de alguns compostos de maior massa molecular nos óleos essenciais, resultado da

oxidação de outros compostos, como o elemol, espatulenol, óxido de cariofileno e α-cadinol.

Os resultados da composição dos óleos essenciais de guaco coincidem com os

encontrados pela literatura (DUARTE et al., 2005; LIMBERGER et al., 1998; RADUNZ, 2004;

REHDER; SARTORATTO; RODRIGUES, 2006). Os autores também relatam que o óleo é

composto por mono e principalmente por sesquiterpenos. Também encontraram que o

componente principal para ambas as espécies é o germacreno D, porém cada trabalho encontrou

uma porcentagem diferente na composição dos óleos variando de 23,6 a 41,45 %. Simões e

Spitzer (2007) explicam que mesmo extraídos do mesmo órgão vegetal, a composição dos óleos

essenciais pode variar devido à genética, época de colheita, fatores ambientais, entre outros.

Ao comparar as duas espécies quanto a composição do óleo essencial, observa-se

que M. glomerata não apresenta α-filandreno. Os teores dos compostos também são diferentes

para as espécies, M. laevigata apresentou em geral maiores teores de α e β-pineno. Por outro

lado, M. glomerata exibiu maiores porcentagens de área dos compostos mais pesados – óxido

de cariofileno, γ-muuruleno e α-cadinol.

Pelo gráfico de PCA (Figura 32) fica clara a separação entre as espécies, indicando

que M. laevigata e M. glomerata apresentam composições diferentes dos óleos essenciais. E

essa diferença é explicada principalmente pelos maiores teores de α e β-pineno em M. laevigata,

observado no gráfico de scores do PCA (Figura 32B).

89

De modo geral, utilizando a fibra de microextração e analisando os óleos essenciais,

a composição química dos voláteis dos guacos não varia de maneira expressiva. Grande parte

dos compostos coincidem entre si, bem como seus teores relativos. Apesar da fibra SPME ter

adsorvido menos componentes, essa técnica se mostra muito eficaz, uma vez que requer pouca

quantidade de material e é muito mais rápida comparada à extração dos óleos essenciais. Drew

et al. (2012) comparando essas mesmas técnicas para análise dos voláteis de Thapsia spp.

chegaram a essa mesma conclusão.

(B)

(A)

Figura 32. PCA dos resultados das análises dos óleos essenciais de guaco realizado por GC-MS. (A)

gráfico de loadings, em azul M. laevigata (ML) e em vermelho M. glomerata (MG) (B) scores.

90

5.4.2 Rendimento dos óleos essenciais

Os óleos essenciais das duas espécies foram extraídos mensalmente através da

hidrodestilação em aparelho de Clevenger, para tal, utilizou-se folhas frescas. Apenas para as

amostras dos meses de junho, julho e agosto de M. glomerata não foi possível a extração dos

óleos, pois, nesses meses ocorre a floração da espécie, e com isso, a quantidade de folhas

diminui consideravelmente. Assim, não foi possível coletar material suficiente para extração

dos óleos essenciais.

A Tabela 5 a seguir traz, para cada mês, a massa (em gramas) das folhas frescas

utilizadas para extração dos óleos, bem como a massa (em gramas) dos óleos essenciais obtido

pela hidrodestilação. Com esses valores foram calculadas as porcentagens de rendimentos dos

óleos essenciais (massa/massa) ao longo do ano para cada uma das espécies de guaco. A média

do rendimento foi calculada e M. laevigata apresentou maiores rendimentos do que M.

glomerata. Essa diferença foi estatisticamente testada pela ANOVA ao nível de variância de

5% de probabilidade.

Tabela 5. Massas dos óleos essencias (OE’s) e das folhas frescas (gramas) e rendimento dos OE’s de

Mikania laevigata e Mikania glomerata em porcentagem de massa/massa nos diferentes meses do ano.

Média da porcentagem do rendimento indicando diferença estatística entre as espécies (ANOVA

p<0,05).


OE (g) Folhas (g)

Rendimento

(%) OE (g) Folhas (g)

Rendimento

(%)

Janeiro 0,2119 173,53 0,122 0,029 186,63 0,016

Fevereiro 0,1946 189,97 0,102 0,2066 188,87 0,109

Março 0,0881 179,22 0,049 0,0359 176,65 0,020

Abril 0,1952 157,57 0,124 0,0477 173,21 0,028

Maio 0,1313 175,17 0,075 0,0045 161,42 0,003

Junho 0,3712 171,55 0,216 - - -

Julho 0,1528 163,53 0,093 - - -

Agosto 0,2499 212,7 0,117 - - -

Setembro 0,1113 182,03 0,061 0,011 161,31 0,007

Outubro 0,1054 191,79 0,055 0,0247 201,21 0,012

Novembro 0,3384 200,66 0,169 0,1116 200,33 0,056

Dezembro 0,1499 203,81 0,074 0,1119 203,86 0,055

Média 0,105 A 0,034 B

91

Os rendimentos dos óleos essenciais também foram plotados sob a forma de gráfico

de barras (Figura 33), no qual a variação mensal pode ser mais nitidamente observada. No

gráfico também foi inserido a média de temperatura no dia da coleta das folhas (linha amarela).

De modo geral, o rendimento dos óleos foi maior para M. laevigata, com exceção apenas no

mês de fevereiro, no qual o rendimento de M. glomerata superou o de M. laevigata.

Observa-se que para M. laevigata, junho foi o mês em que houve o maior

rendimento dos óleos, e é o mês em que foi observada a menor temperatura. Contudo, o

contrário não é válido, o mês de menor rendimento (março) não apresentou a maior temperatura.

A floração da espécie ocorre na primavera, sendo que as flores começam a brotar no mês de

setembro (ANVISA, 2014). Nesse mês e no mês seguinte os rendimentos foram baixos,

provavelmente devido a realocação de recursos para as flores.

Em relação à M. glomerata, a temperatura parece não influenciar nos rendimentos

dos óleos essenciais. O rendimento está mais nitidamente relacionado com a época de floração

da espécie, que tem início em julho (MORAES, 1997). Os meses que antecedem e procedem

essa época apresentam os menores rendimentos, sendo que em junho, julho e agosto a planta

estava tão debilitada que não foi possível coletar suas folhas.

O menor rendimento dos óleos essenciais durante a época reprodutiva das plantas

pode ser explicado, pois durante esse período ocorre uma alocação de recursos proveniente de

0

5

10

15

20

25

30

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

Ren

dim

ento

(m

assa

/mas

sa)

Rendimento dos óleos essenciais

M. laevigata M. glomerata Temperatura

Tem

peratu

ra (°C)

Figura 33. Rendimento (massa/massa) dos óleos essenciais de Mikania laevigata (azul) e Mikania

glomerata (vermelho) nos diferentes meses. A linha amarela representa a média de temperatura no dia

da coleta das folhas.

92

órgãos fontes, como folhas e raízes para estruturas dreno, como flores e frutos. Isso pode ser

entendido como um investimento que a planta faz para poder perpetuar a espécie. O

desenvolvimento de estruturas reprodutivas é importante para o sucesso reprodutivo em

vegetais e demanda altos custos energéticos (REEKIE; BAZZAZ, 2005).

Comparando os rendimentos dos óleos essenciais ao longo dos meses com os dados

da literatura, observa-se que há uma variação muito grande de resultados, dependendo da

espécie estudada. Há autores que observaram maiores rendimentos no inverno, considerada

uma estação fria e seca (CUNHA, 2011; REIS et al., 2010; SANTOS; INNECCO, 2005).

Contudo, muitos trabalhos encontraram maiores rendimentos durante o verão (BOTREL et al.,

2010; CASTRO et al., 2008; SANTANA, 2013; SILVA et al., 2003).

Não foi encontrado nenhum estudo em relação a variação mensal do rendimento do

óleo essencial de guaco. Xavier (2015) trabalhando com extratos etanólicos de M. laevigata em

Campinas-SP, encontrou maiores teores de cumarina nos meses mais frios. Provavelmente essa

espécie tenha seu metabolismo aumentando nessas épocas do ano.

5.4.3 Atividade Antimicrobiana

A atividade antimicrobiana foi testada pelo método de difusão em ágar contra

bactérias Gram-positivas (S. aureus e S. epidermidis) e Gram-negativas (E. coli, K. pneumoniae

e P. aeruginosa). A tabela a seguir (Tabela 6) mostra onde houve a formação de halo com

diâmetro maior do que 10 mm. Espaços em branco indicam que não houve inibição microbiana

ou que o halo formado foi menor do que 10 mm.

93

Tabela 6. Ação antimicrobiana dos óleos essenciais de guaco em diferentes concentrações (+ = ativo).

Os óleos essenciais de M. laevigata e M. glomerata apresentaram atividade

antimicrobiana contra E. coli na concentração mais baixa de 5 %. Duarte et al. (2007) testaram

a atividade dos óleos das duas espécies contra 13 sorotipos diferentes de E. coli. Observaram

que o óleo essencial M. laevigata possui uma atividade considerada de moderada a forte, pois

inibiu 6 das 13 cepas em uma concentração que variou de 300 a 900 µg/mL. Em contrapartida,

o óleo essencial de M. glomerata não apresentou atividade antimicrobiana contra nenhuma das

cepas e em nenhuma das concentrações testadas.

Nenhum dos óleos essenciais óleo teve potencial antimicrobiano contra as cepas

de Klebsiella pneumoniae e nem contra Staphylococcus epidermidis. K. pneumoniae é

considerada uma bactéria multirresistente, apresentando até 95 % de resistência contra

antibióticos existentes no mercado farmacêutico, como penicilinas, cefalosporinas,

aminoglicosídeos e quinolonas (SPANU et al., 2002). S. epidermidis também vem apresentando

um aumento da resistência contra antimicrobianos, sendo que atualmente apresenta resistência

contra eritromicinas, clindamicinas, tetraciclinas e β–lactâmicos (SANTOS et al., 1977).

Em contrapartida, os óleos essenciais das duas espécies e em todas concentrações

tiveram efeito sobre Pseudomonas aeruginosa 31 NM, contudo, para cepa ATCC 27853 apenas

as maiores concentrações conseguiram inibir o crescimento bacteriano. Vários artigos na

literatura citam P. aeruginosa como sendo uma bactéria menos sensível à ação dos óleos

essenciais (DORMAN; DEANS, 2000; PINTORE et al., 2002; SENATORE; NAPOLITANO;

OZCAN, 2000; WILKINSON et al., 2003). Kubmawara et al. (2007) testaram o óleo essencial

de 50 espécies de plantas medicinais contra essa mesma cepa ATCC 27853 de P. aeruginosa

Microorganismos

Mikania laevigata

(concentração %)

Mikania glomerata

(concentração %)

20 % 10 % 7,5 % 5 % 20 % 10 % 7,5 % 5 %

Escherichia coli ATCC25923 + + + + + +

Klebsiella pneumoniae ATCC4352

Klebsiella pneumoniae KP230

Pseudomonas aeruginosa 31NM + + + + + + + +

Pseudomonas aeruginosa

ATCC27853 + +

Staphylococcus aureus ATCC25922 + + +

Staphylococcus aureus BEC9393 + + + + + +

Staphylococcus aureus Rib1 + + + + +

Staphylococcus epidermidis

ATCC12228

94

e observaram que apenas 10 espécies apresentaram atividade antimicrobiana, todas na

concentração de 2 mg/mL e apenas Acacia albida na concentração de 1 mg/mL. Mimica-Dukic

et al., (2003) analisaram o efeito do óleo essencial de três espécies de menta contra duas cepas

diferentes de P. aeruginosa, sendo uma delas a ATCC 27853. Observaram que nenhuma

espécie e nenhuma concentração foi capaz de formar halo de inibição. Isso demonstra a

importância do óleo essencial de guaco ter um grande potencial antimicrobiano contra P.

aeruginosa.

Em relação à Staphylococcus aureus, o óleo essencial de M. laevigata teve efeito

antibacteriano contra todas as cepas nas maiores concentrações de 20 % e 10 % e uma reação

positiva na concentração de 5 % contra cepa BEC9393. O óleo essencial de M. glomerata na

concentração de 10 % foi efetivo para todas as cepas de S. aureus e as menores concentrações

também conseguiram inibir duas das cepas.

O fato de alguns óleos terem inibido o crescimento bacteriano em concentrações

mais baixas e não terem surtido efeito nas concentrações mais elevadas pode ser explicado pela

difícil diluição dos óleos essenciais em etanol. A solução contendo as amostras pode não ter se

difundido de maneira homogênea no meio de cultura com as bactérias, uma vez que a natureza

dos óleos essenciais é apolar e o meio de cultura é constituído majoritariamente de água (RIOS;

RECIO; VILLAR, 1988).

Os resultados das atividades antimicrobianas dos óleos essenciais de M. laevigata

e M. glomerata frente às bactérias aqui testadas são inéditos. Nenhum trabalho foi realizado

com esses óleos frente a K. pneumoniae, S. epidermidis, S. aeruginosa e S. aureus.

Aparentemente, os óleos são igualmente eficientes contra microrganismos Gram-positivos e

Gram-negativos. Mais estudos com diferentes concentrações devem ser realizados para testar a

eficácia dos óleos em concentrações mais baixas, porém, tudo indica que os óleos essenciais de

guaco têm potencial antimicrobiano.

5.4.4 Atividade Antioxidante

As amostras de óleos essenciais das duas espécies de guaco foram avaliadas quanto

a suas capacidades antioxidantes. Para tanto, realizou-se o teste com DPPH (2,2-difenil-1-

picrilidazil), um reativo que age como doador de elétrons. Neste teste a atividade antioxidante

95

do composto está relacionada com sua capacidade em doar átomos de hidrogênio ao radical

livre.

Em um teste preliminar foi possível avaliar qualitativamente a capacidade redutora

de DPPH das amostras, para tal, aplicou-se em uma placa de sílica, primeiramente, 10 µL de

cada extrato, e depois 10 µL DPPH (0,17 µM) e observou-se o aparecimento de manchas

amareladas (Figura 34), indicando que o óleo essencial possui atividade antioxidante.

Posteriormente, foram realizados testes em placa de 96 poços para calcular o CE50,

que determina qual concentração é capaz de reduzir o DPPH em 50 %. Em um primeiro

momento, as amostras foram testadas em uma faixa de concentração de 200 a 6 µL/mL, de

acordo com o protocolo pré-estabelecido por nosso grupo de pesquisa. Porém, essa faixa de

concentração não foi capaz de reduzir em 50 % o DPPH. Portanto, foi necessário adaptar o

teste, aumentando a concentração inicial para 600 µL/mL, contudo, mesmo nessa concentração

não foi possível calcular o CE50 (Concentração efetiva 50 %).

A concentração não pode ser aumentada, pois, concentrações muito altas geravam

turbidez nos poços devido as características lipofílicas das amostras, interferindo na leitura da

absorbância. Além disso, aumentar a concentração do óleo para obter efeito antioxidante

tornaria o produto economicamente inviável e até mesmo tóxico, haja visto que alguns óleos

essenciais em concentrações muito altas podem apresentar alguma toxicidade e alergias

(WOLFFENBÜTTEL, 2011).

A Figura 35 traz a média da porcentagem de redução do DPPH, com seus

respectivos desvios padrões para cada concentração (µL/mL) de amostra testada. Observa-se

que mesmo a maior concentração (600 µL/mL) não foi capaz de reduzir 50 % do DPPH. Para

cada concentração não houve diferença significativa entre a atividade antioxidante do óleo

M. glomerata M. laevigata

Figura 34. Atividade antioxidante dos óleos essenciais de M. glomerata e M. laevigata testada em

placa de sílica.

96

essencial de M. laevigata e M. glomerata. Analisando isoladamente cada espécie, houve

diferença estatística (p < 0,05) quando comparada as concentrações de 37,5, 75 e 150 µL/mL

com 600 µL/mL para M. laevigata. No gráfico, as letras maiúsculas iguais indicam que não

houve diferença estatística. Em relação a M. glomerata só houve diferença significativa entre

150 µL/mL e 600 µL/mL. No gráfico, as letras minúsculas iguais indicam que não houve

diferença estatística.

Os óleos essenciais apresentam diversos compostos com diferentes proporções,

sendo considerados uma mistura complexa. Devido a essa propriedade, a atividade antioxidante

do óleo pode estar relacionada à um constituinte em menor proporção, e não necessariamente

ao composto majoritário. Da mesma forma, o efeito antioxidante pode ser atribuído pela ação

conjunta de vários compostos, atuando em sinergismo (WANG et al., 2008).

Observando a composição química dos óleos essenciais do guaco, observa-se que

estes são compostos por mono e sesquiterpenos. Esses compostos não possuem anéis fenólicos

e por conta dessa característica era de se esperar que os óleos não tivessem grande atividade

antioxidante. As mudanças de colorações, indicando atividade antioxidante pelo teste de DPPH,

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

18,75 37,5 75 150 300 600

% d

e re

du

ção

DP

PH

Concentração da amostra (µL/mL)

Atividade antioxidante

Mikania laevigata Mikania glomerata

A

A B DB

CB A

a

a a a

a b

Figura 35. Porcentagem de redução do DPPH do óleo essencial de guaco em diferentes concentrações.

Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística para M. laevigata e as letras

minúsculas para M. glomerata.

97

são mais observáveis em compostos que contém anéis fenólicos, como é o caso da quercetina

(Figura 36), utilizada como padrão para esse teste biológico.

As baixas atividades apresentadas pelos óleos essenciais podem ser explicadas pelo

fato dos mesmos serem pouco solúveis nas condições do experimento. Mata et al. (2007)

explica que por conta dessa propriedade, a metodologia utilizando-se de DPPH seria mais

aplicada para compostos hidrofílicos. Por conta disso, outras metodologias avaliadoras da

atividade antioxidante poderiam ser testadas, como por exemplo o ORAC (Capacidade de

Absorbância do Radical Oxigênio), método de captura do radical 2,2-azinobis (3-

etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS+), sistema β-caroteno/ácido linoleico, ensaio das

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ((MATA et al., 2007; KULISIC et al.,

2004), entre outras.

6. CONCLUSÃO

Os voláteis de Mikania laevigata e Mikania glomerata são qualitativamente

similares na amostragem por SPME, com exceção da cumarina, que está presente somente em

M. laevigata. O composto majoritário para ambas as espécies é o germacreno D, representando

cerca de 47,61% da composição química.

Cumarina, α-pineno e biciclogermacreno foram responsáveis pelo agrupamento das

amostras de M. laevigata na maioria dos tratamentos e são mais intensos nos voláteis desta

espécie ao longo do ano. Para M. glomerata, hexanal e trans-2-hexenal foram responsáveis pelo

agrupamento das amostras em todos os tratamentos e mais intensos em todos os meses. Em

relação à variação em dois períodos do dia, os voláteis não apresentaram diferença quando

comparadas as coletas das 8h e das 14h.

Figura 36. Estrutura química da quercetina com seus anéis aromáticos. (Fonte: NIST online, 2018).

98

De modo geral, os compostos tendem a diminuir em intensidade com o aumento da

temperatura do ar, provavelmente devido à volatilização para o ambiente. No tratamento de

luminosidade ocorre o mesmo com alguns compostos, contudo, para maioria não houve

diferença significativa entre as condições. Foi observado que o déficit hídrico ocasionou um

aumento da intensidade de grande parte dos compostos, principalmente para M. laevigata.

Os óleos essenciais de M. laevigata e M. glomerata apresentam um maior número

de compostos oxidados em relação aos voláteis capturados pela microextração em fase sólida

utilizando a fibra de polidimetilsiloxano/divinilbenzeno. Através da análise dos óleos essenciais

não foi possível identificar o hexanal e trans-2-hexenal nas duas espécies; a cumarina no caso

da M. laevigata; e alguns outros compostos. Desse modo, a fibra de SPME apresenta vantagens,

sendo uma técnica fácil, rápida, que necessita de pouca quantidade de amostra e que não

necessita da utilização de solventes orgânicos.

O rendimento de óleo essencial de M. laevigata foi significativamente maior que

de M. glomerata ao longo do ano. O maior rendimento de óleo essencial de M. laevigata foi em

junho, seguido de novembro. Para M. glomerata o maior rendimento foi em fevereiro. Portanto

estes rendimentos não se correlacionam claramente com a sazonalidade.

As amostras de óleo essencial de ambas as espécies apresentaram potencial

antimicrobiano contra E. coli, P. aeruginosa e S. aureus e fraca atividade antioxidante, medida

pelo método de DPPH.

Por conta da variação química dos voláteis ao longo dos meses e em resposta aos

diferentes tratamentos e principalmente devido à cumarina, conclui-se que M. laevigata e M.

glomerata não podem ser utilizadas indistintamente.

99

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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113

Anexo I – Análise Prévia do Solo

114

Anexo II – Pré-teste para o tratamento de irrigação

Figura 37. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos de M. laevigata submetidos ao déficit hídrico.

Fotos tiradas no primeiro, quinto, oitavo, nono, décimo e último dia de experimento, mostrando o

comportamento da planta frente a condição de escassez de água.

Dia 09 Dia 10 Dia 11


115

Figura 38. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos do grupo controle de M. laevigata. Fotos tiradas

no primeiro, quinto, oitavo, nono, décimo e último dia de experimento, mostrando o comportamento

da planta ao longo do período do tratamento.

Dia 01


Dia 05 Dia 08

116

Figura 39. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos de M. glomerata submetidos ao déficit hídrico.

Fotos tiradas no primeiro, quinto, oitavo, nono, décimo e último dia de experimento, mostrando o

comportamento da planta frente a condição de escassez de água.



117

Figura 40. Pré-teste do tratamento de irrigação, vasos do grupo controle de M. glomerata. Fotos


comportamento da planta ao longo do período do tratamento.



118

Figura 41. Peso dos vasos ao longo dos dias. Pré-teste do tratamento de água para verificar o

comportamento das espécies frente às condições de déficit hídrico, excesso e o grupo controle. Cada

curva representa uma repetição.

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

PES

O (

KG

)

DIAS

M. laevigata - Seca

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

PES

O (

KG

)

DIAS

M. glomerata - seca

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

PES

O (

KG

)

DIAS

M. laeviagata - excesso

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

PES

O (

KG

)

DIAS

M. glomerata - excesso

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

PES

O (

KG

)

DIAS

M. glomerata -controle

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

PES

O (

KG

)

DIAS

M. Laevigata - controle

119

Tabela 7. Medidas do potencial hídrico foliar.

Figura 42. Potencial hídrico foliar medido através do aparelho de IRGA. Barras azuis representam

M. laevigata e vermelhas M. glomerata. Letras maiúsculas acima das barras indicam diferenças

estatísticas pelo tesde de Tukey (p<0,05) para M. laevigata e letras minúsculas para M. glomerata.


Repetição

Déficit

Hídrico Excesso Controle

Déficit

Hídrico Excesso Controle

1 -1,4 -0,65 -0,45 -1,4 -0,4 -0,5

2 -1,7 -0,6 -0,5 -1,4 -0,4 -0,5

3 -1,6 -0,5 -0,6 -1,5 -0,8 -0,5

Média -1,57 -0,58 -0,52 -1,43 -0,53 -0,50

Desvio Padrão 0,15 0,08 0,08 0,06 0,23 0,00

A

B B

120

Anexo III – Declaração Bioética e Biossegurança

121

Anexo IV – Declaração de Direitos Autorais

instituto de biologia vanessa ayumi ueno -...

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