i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE

AVALIAÇÃO DOS ASPECTOS BIOLÓGICOS ASSOCIADOS A

EXPOSIÇÃO POR PESTICIDAS EM SOJICULTORES DE

MUNICÍPIOS GOIANOS

Doutoranda: Fernanda Ribeiro Godoy

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Carlos da Silva

Co-orientadora: Profa. Dra. Daniela de Melo e Silva

GOIÂNIA

© 2018

ii

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade

Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), regulamentada pela Resolução CEPEC nº 832/2007, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões

assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação Nome completo do autor: Fernanda Ribeiro Godoy Título do trabalho: Avaliação dos aspectos biológicos associados a

exposição por pesticidas em sojicultores de municípios goianos 3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se

imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF da tese ou

dissertação.

________________________________________

Assinatura do (a) autor (a)

________________________________________ Data: 22 /11

/ 2018 Assinatura do (a) Orientador (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo

suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o

período de embargo.

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE

AVALIAÇÃO DOS ASPECTOS BIOLÓGICOS ASSOCIADOS A

EXPOSIÇÃO POR PESTICIDAS EM SOJICULTORES DE

MUNICÍPIOS GOIANOS

Doutoranda: Fernanda Ribeiro Godoy

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Carlos da Silva

Co-orientadora: Profa. Dra. Daniela de Melo e Silva

GOIÂNIA

©2018

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Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.

CDU 575

Ribeiro Godoy, Fernand AVALIAÇÃO DOS ASPECTOS BIOLÓGICOS ASSOCIADOS AEXPOSIÇÃO POR PESTICIDAS EM SOJICULTORES DEMUNICÍPIOS GOIANOS [manuscrito] / Fernand Ribeiro Godoy. -2018. XII, 78 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Claudo Carlos d da Silva; co-orientador Dr.Danilela de Melo e Silva. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto deCiências Biológicas (ICB), Programa de Pós-graduação em Biotecnologiae Biodiversidade, Goiânia, 2018. Bibliografia. Anexos. Apêndice. Inclui gráfico, tabelas, lista de figuras, lista de tabelas.

1. SNP. 2. Ensaio cometa. 3. Genotoxicidade. 4. Susceptibilidade.5. Trabalhador Rural. I. da Silva, Claudo Carlos d, orient. II. Título.

v

vi

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus por considerá-lo como fonte de todo

conhecimento e inspiração e na figura de seu filho Jesus “àquele quem inspira a minha vida”

agradeço por minha vida e por minhas conquistas, sendo elas pequenas ou grandiosas foram

importantes para compor o meu ser.

Ao amor e o cuidado do meu pai, Roberto de Godoy e da minha mãe Eliane do Carmo Ribeiro

Godoy, por se dedicarem à minha criação e educação, desde o maternal até o dia de hoje,

expresso o meu mais profundo agradecimento. Eles sempre estiveram presentes com seu apoio,

carinho e amor incondicional. Ensinaram-me que é na educação, no convívio honesto e

solidário, e não no gasto financeiro, que se investe em formação pessoal e acadêmica.

Ao amor da minha vida Alex Silva da Cruz, pelo seu constante amor, apoio, carinho, amizade

e companherismo pessoal e de sua família. Expresso com carinho e ternura meus sentimentos

de agradecimento. Com vocês dividimos momentos de alegria, carinho, mas também ausência,

luto e angústia. Estes momentos foram importantes por fortalecer nossos laços, além de serem

importantes para o meu crescimento como pessoa.

Aos queridos professores, Doutor Aparecido Divino da Cruz, Doutor Claudio Carlos da Silva

e Doutor Rogério Pereira Bastos expresso meus singelos agradecimentos e principalmente

minha admiração. Vocês são fontes de inspiração pessoal e profissional além de serem pessoas

maravilhosas.

A minha querida Professora, Doutora Daniela de Melo e Silva, agradeço do fundo do meu

coração, por todo amor e carinho depositado na minha formação acadêmica e pessoal. Nossa

história iniciou com a minha entrada no Programa de Iniciação Científica, passando pelo

Mestrado e agora sendo acresentada o meu doutoramento. Adicionalmente, acradeço pelo

amor recíproco, honesto e singelo, além de uma grande e importante amizade. É você Daniela

quem eu considero como espelho que, quem sabe um dia eu irei refletir.

À banca examinadora, Prof. Aparecido D. da Cruz, Profa. Cintia Brito, Profa. Emilia Costa e

Profa. Lysa Minasi, pela participação na minha defesa.

Aos amigos de uma vida inteira: Ana Julia da Cunha, Danilo Conrado Silva, Nathylla

Nazareth Freire Guedes e Raphael Silva da Cruz pelo constante apoio, carinho e pela valiosa

amizade, sendo este um sentimento que eu considero tão importante como o amor. O constante

incentivo e participação de vocês em minha vida foi e sempre será fundamental para a

manutenção da minha felicidade.

vii

Aos amigos dos laboratórios REPLICON e LGBIO, agradeço profundamente pelo apoio e

carinho. Nesse momento tão importante de minha vida não posso deixar passar a oportunidade

de acradecer a participação como co-produtores deste trabalho, pela parceria indispensável

na sua elaboração. Como não posso nomear cada um de vocês eu personifico estes

agradecimentos a você meu querido amigo Aldaires Vieira de Melo.

As queridas parceiras e amigas: Fernanda Craveiro Franco, Lílian Teodoro de Sousa

Wanessa Fernandes Carvalho divido este momento de alegria e de conquista. Voces foram

minhas parceiras diárias nos momentos de luta e de descontração fundamentais para a

realização deste trabalho. Além da ajuda de bancada, vocês me ofereceram uma sincera e

valiosa amizade. Adicionalmente, estendo meus agradecimentos aos amigos do LABMUT:

Alessandro Arruda Alves, Alice Tâmara Carvalho Lopes, Camila Provasio Figueredo,

Daiany Folador Sotero, Jheneffer Sonara Aguiar Ramos, Juliana Boaventura Avelar,

Macks Wendell Gonçalves, Marcos de Oliveira Cunha, Rodrigo Roncato Pereira e Thays

Millena Alves Pedroso.

Às Agências: FAPEG, CAPES e CNPq pelo auxilio financeiro a esta pesquisa. É um privilégio,

embora não poderia ser, contar com os escassos recursos financeiros destinados à pesquisa

acadêmica, pois sem ela ficamos reféns do improviso e do acaso, inviabilizado o

desenvolvimento científico. O Brasil precisa de pesquisa científica!

A oportunidade de convivência com os trabalhadores rurais, parceiros e destinatários finais

desta pesquisa. Fiquei surpreendida e triste com o ambiente de trabalho árduo e insalubre a

eles impostos. Mas, apesar dos pesares, afirmam sua liberdade de existir e expressar suas

necessidades e seus sonhos.

viii

SUMÁRIO

Lista de tabelas …………...……………......................................................................... vii

Lista de figuras ................................................................................................................ xiii

Resumo ........................................................................................................................... ix

Abstract ........................................................................................................................... x

1. Introdução ................................................................................................................... 11

2. Referencial teórico ...................................................................................................... 15

2. 1 Historia da Agricultura .................................................................................. 15

2.2 Historia da Agricultura no Brasil …............................................................... 16

2.3 Uso de pesticidas na Agricultura Brasileira ................................................... 17

2.4 Classificação dos pesticidas ........................................................................... 18

2.4.1 Classe de pesticidas, segundo sua: .................................................. 18

2.4.1.1 Ação ................................................................................ 18

2.4.1.2 Grupo químico: .................................................................. 19

2.4.1.3 À toxicidade ....................................................................... 20

2.5 Pesticidas e seus impactos a saúde humana e ao meio ambiente .................... 21

2.5.1 Intoxicação ..................................................................................... 21

2.6 Características dos Cultivos da Soja .............................................................. 22

2.7 Estudo da Genética em exposição .................................................................. 25

2.7.1 Analise de polimorfismos de nucleotídeos únicos – SNPs .............. 26

3. Objetivos ..................................................................................................................... 26

3.1 Objetivo geral ........................................................................................... 26

3.2 Objetivos específicos ................................................................................ 26

4. Metodologia ……………............................................................................................ 27

4.1 Amostras biológicas dos trabalhadores rurais ................................................ 27

4.2 Local da realização do estudo ........................................................................ 28

4.3 Extração DNA e quantificação das amostras de Sangue .............................. 28

ix

4.4 Ensaio Cometa ............................................................................................... 28

4.5 Analise molecular dos SNPs …...................................................................... 29

4.5.1 Obtenção dos Primers …................................................................. 29

4.5.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) …........................................ 29

4.5.3 Reação de Sequenciamento ……....................................................... 30

4.6 Análises Estatísticas ………….................................................................... 31

5. Resultados e discussão ................................................................................................ 32

5.1 Analise estatística descritiva do estilo de vida dos grupos exposto e não

exposto .............................................................................................................. 32

5.2 Tipos de pesticidas e formas de contato, EPI’s e caso de intoxicação

relatadas pelos trabalhadores rurais ................................................................... 33

5.3 Avaliação dos dados bioquímicos e hematológicos dos sojicultores ........... 38

5.4 Polimorfismos ............................................................................................. 55

6. Conclusão .................................................................................................................... 61

7. Referencias bibliográficas .......................................................................................... 59

Anexo I. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido …............................................ 81

Apêndice II. Questionário ............................................................................................... 81

Anexo I. Aprovação no comite de ética ........................................................................... 81

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação segundo formulações sólidas que apresentam DL50 oral para

ratos. ............................................................................................................... 23

Tabela 2. Classificação e efeitos e/ou sintomas agudos e crônicos dos agrotoxicos

...................................................................................................................... 25

Tabela 3. Tabela 3: Descrição dos primers utilizados nas reações de sequenciamento

dos genes CYP2E1 e OGG1............................................................................................ 34

Tabela 4. Protocolo para a PCR do gene OGG1. …….................................................... 35

Tabela 5. Protocolo para a PCR do gene …....................................……........................ 35

Tabela 6. Dados de estilo de vida dos grupos exposto e não exposto ocupacionalmente

a pesticidas ....................................................................................................................... 38

Tabela 7 Pesticidas relatados pelos sojicultores classificados de acordo com a classe

toxicológica, grupo químico, e respectivas funções ...................................................... 40

Tabela 1 Valores de referência fornecidos pelos Laboratorios LACES e Sigma ........... 46

Tabela 9. Distribuição dos Genótipos entre o Grupo exposto e não exposto ................ 52

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Tendência na produção agrícola e produtividade no Brasil de 1975- 2013 ........ 21

Figura 2. Preparo da área para a produção de soja ......................................... 27

Figura 3. Procedimentos realizados neste estudo para avaliação dos sojicultores em

comparação com o grupo controle .................................................................................. 32

Figura 4: Distribiuição dos pesticidas utilizados no cultivo de soja, de acordo com a

quantidade de pesticidas (A); Porcentagem de acordo com a classe toxicológica (B) e

Porcentagem de acordo com a função dos pesticidas mais relatados ............................. 42

Figura 5. Formas de contato dos sojicultores expostos diretamente a pesticidas ........... 43

Figura 6. Principais sintomas relatados pelos sojicultores associados com a exposição a

pesticidas ...................................................................................................................... 44

Figura 8. Leucograma dos Sojicultores .......................................................................... 46

Figura 2 Hemograma - Serie vermelha dos Sojicultores ................................................ 47

Figura 10. Alterações dos perfis lipídicos e glicêmicos detectados em sojicultores de

municípios goianos. ........................................................................................................ 48

Figura 11. Distribuição das dosagens da enzima acetilcolinesterase em sojicultores de

municípios goianos ......................................................................................................... 49

Figura 12. Distribuição dos valores alterados de ALAT e ASAT, nos sojicultores, de

acordo com o sexo. ..........................................................................................................

51

Figura 13. Análise de componentes principais das variáveis: Comprimento da cauda (TL,

do inglês Tail lengh), Momento da cauda de Olive (OTM, do ingle olive tail moment) e

porcentagem de DNA na cauda (%DNA) nos grupos exposto e não

exposto.............................................................................................................................

54

Figura 14. Frequência de danos ao DNA nos grupos caso e controle. P<0,05; Nexp: Grupo

não exposto; Exp: Grupo Exposto; %DNA. A: Porcentagem de DNA na cauda (%DNA),

B: Momento da cauda de Olive (OTM) e C: Comprimento do comprimento da cauda

(TL)....................................................................................................................................

55

xii

Resumo

O Brasil, desde 2008, lidera o ranking mundial de consumo de pesticidas, sendo que a região

Centro-Oeste é responsável pelo consumo de 25% destes produtos. Neste contexto, o presente

estudo constituiu uma pesquisa transversal (análises bioquímicos e hematológnas) e do tipo

caso-controle (ensaio cometa) qual foram avaliados 163 indivíduos, sendo 74 sojicultores,

expostos ocupacionalmente a pesticidas, constituindo o grupo exposto e 89 indivíduos, também

de municípios goianos, que apresentaram condições similares aos sojicultores, perfazendo o

grupo controle. Dos 74 sojicultores, 43 estão diretamente expostos a pesticidas e 31 são

expostos indiretamente. Os participantes pertenciam a 8 municípios do Estado de Goiás,

produtores de soja: Leopoldo de Bulhões, Silvânia, Rio Verde, Santa Terezinha, Goiânia,

Rosalândia, Bela Vista e Piracanjuba. Foram realizadas coletas de material biológico, tabulação

dos dados, análises bioquímicas e hematológicas, extração de DNA, PCR, sequenciamento,

para a análise de polimorfismos dos genes CYP2E1 e OGG 1, além do ensaio cometa. O grupo

exposto foi composto por indivíduos de 19 a 63 anos, sendo 21 mulheres e 53 homens e o grupo

controle possuiu idades variando de 18 a 64 anos, sendo 36 mulheres e 53 homens, O tempo

médio de atividade agrícola do grupo exposto variou de 8 meses a 32 anos (média de 10 anos).

Todos os trabalhadores expostos diretamente relataram fazer uso de EPI. No entanto, 18,9%

dos sojicultores relataram terem sofrido intoxicação por pesticidas e os sintomas mais comuns

foram dor de cabeça e problemas gastrointestinais. Foram realizados os seguintes exames

laboratoriais: hemograma, dosagens de ALAT, ASAT, acetilcolinesterrase, glicemia e perfil

lipídico. Quanto aos resultados destes exames, foram detectadas poucas alterações e em geral,

os valores estavam de acordo com as referências. Quanto à distribuição das frequências do

polimorfismo rs2031920, no gene CYP2E1, houve diferenças significativas entre os grupos

exposto e não exposto (p =0.002), demonstrando que 24,3% dos sojicultores tem o alelo mutado

(T). Quanto ao gene OGG1 foram avaliados 2 SNPs, o rs1052133 e o rs293795, e as frequências

de distribuição destes dois polimorfismos não foram distintas entre os grupos exposto e não

exposto. Para o ensaio cometa, as análises de dano no DNA, na comparação dos grupos de

estudo, demonstraram diferenças estatisticamente significativas (p<0.05) nos três parâmetros

analisados (TL, OTM, %DNA). Vale ressaltar que quando os dados de estilo de vida dos grupos

exposto e não exposto foram avaliados, foram observadas diferenças significativas, em relação

ao consumo de álcool e faixa etária. Porém, quando esses dados foram analisados, associados

com os polimorfismos nos genes CYP2E1 e OGG1 e os achados do ensaio cometa, não

observou nenhuma influência dessa diferença (idade e consumo de álcool), entre os grupos, nas

duas variáveis. Assim, este estudo pioneiro no Estado de Goiás realizou um panorama da saúde

xiii

de sojicultores de municípios goianos, com o uso de análises laboratoriais clássicas, associadas

com marcadores de exposição (ensaio cometa) e de susceptibilidade (polimorfismos genéticos),

ressaltando a necessidade de ampliar o protocolo de avaliação da saúde do trabalhador, visando

a prevenção de doenças reconhecidamente associadas à exposição a pesticidas.

Palavras-chave: SNP. Genotoxicidade. Suscpetibilidade. Ensaio Cometa. Sojicultores.

xiv

Abstract

Since 2008, Brazil has been leading the world ranking of pesticide consumption, with the

Central Brazil responsible for the consumption of 25% of these products. In this context, the

present study was a cross-sectional study in which 163 individuals were evaluated, 74 of which

were soybeans, occupationally exposed to pesticides, and 89 individuals, also from Goias

municipalities, who presented similar conditions to soybean, making up the group control. Of

the 74 soy farmers, 43 are directly exposed to pesticides and 31 are exposed indirectly. The

participants belonged to eight municipalities in the state of Goiás: Leopoldo de Bulhões,

Silvânia, Rio Verde, Santa Terezinha, Goiânia, Rosalândia, Bela Vista and Piracanjuba.

Biological material collections, data tabulation, biochemical and hematological analyzes, DNA

extraction, PCR, sequencing, were performed for the analysis of CYP2E1 and OGG1 gene

polymorphisms, in addition to the comet assay. The exposed group consisted of individuals

aged 19 to 63 years, 21 women and 53 men, and the control group had ages ranging from 18 to

64 years, being 36 women and 53 men. The average time of agricultural activity of the exposed

group ranged from 8 months to 32 years (mean of 10 years). All workers exposed directly

reported using PPE. However, 18.9% of soybean farmers reported having been poisoned by

pesticides and the most common symptoms were headache and gastrointestinal problems. The

following laboratory tests were performed: blood count, ALAT, ASAT, acetylcholinesterase,

glycaemia and lipid profile. As for the results of these tests, few changes were detected and in

general, the values were in agreement with the references. According to the frequency of the

rs2031920 polymorphism in the CYP2E1 gene, there were significant differences between the

exposed and non-exposed groups (p = 0.002), showing that 24.3% of soybean farmers had the

mutated allele (T). For the OGG1 gene, two SNPs, rs1052133 and rs293795, were evaluated,

and the frequencies of these two polymorphisms were not different between the exposed and

non-exposed groups. For the comet assay, DNA damage analyzes, in the comparison of the

study groups, showed statistically significant differences (p <0.05) in the three analyzed

parameters (TL, OTM, % DNA). It is worth noting that when the lifestyle data of the exposed

and non-exposed groups were evaluated, significant differences were observed in relation to

alcohol consumption and age group. However, when these data were analyzed, associated with

the polymorphisms in the CYP2E1 and OGG1 genes and the findings of the comet assay, there

was no influence of this difference (age and alcohol consumption) between the groups on the

two variables. Thus, this pioneer study in the State of Goiás, carried out an overview of the

health of soybeans from municipalities in Goiás, using classic laboratory analyzes, associated

with exposure markers (comet assay) and susceptibility (genetic polymorphisms), emphasizing

xv

the need to expand the worker health assessment protocol, aiming at the prevention of diseases

known to be associated with pesticide exposure.

Keywords: SNP. Genotoxicity. Susceptibility. Comet Assay. Soybean farmers.

16

1. Introdução

Os pesticidas são substâncias químicas especificamente desenvolvidas para uso no

controle de pragas e doenças de plantas (TRIVELLAT, 1998; PERES, 2003), utilizados em

atividades agrícolas, pastagens, pecuária, florestas nativas e plantadas, ambientes hídricos

urbanos e industriais e nas atividades de vigilância sanitária para o controle de doenças vetoriais

(AUGUSTO, 2012; CARNEIRO, 2012)

No Brasil, esos pesticida eram reconhecidos, pela Constituição de 1988, erroneamente

como “defensivos agrícolas”, o que excluía seu uso nas atividades de vigilância sanitária, além

de mascarar os efeitos negativos à saúde humana e ambiental (BOMBARD, 2011). O termo

“pesticida” foi introduzido no Brasil pela Lei Federal n° 7.802 de 11 de julho de 1989

regulamentada pelo Decreto 98.816 de 11 janeiro de 1990. Atualmente o termo foi revogado

pelo Decreto 4.074 de 4 de janeiro de 2002. De acordo com o Artigo 2, Inciso I da Lei Federal

n° 7.802, o termo “pesticida” ficou definido como:

“Pesticidas e afins são os produtos e componentes de processos físicos,

químicos ou biológicos destinados ao uso nos setores de produção,

armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na

proteção de florestas nativas ou implantadas e de outros ecossistemas e

também em ambientes urbanos hídricos e industriais, cuja finalidade seja

alterar a composição da flora e da fauna a fim de preservá-la da ação danosa

de seres vivos considerados nocivos, bem como substâncias e produtos

empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores do

crescimento”

(MARQUES 2010).

Na literatura de língua inglesa, os agrotóxicos são denominados “pesticidas” (Aspelin,

2003), termo que foi adotado para esta pesquisa, uma vez que também denota a larga gama de

substâncias químicas usadas no controle de pragas, além de conotar seu caráter prejudicial, sem

remeter apenas à utilização agrícola.

Os pesticidas tem sido alvo de preocupação por parte dos diversos segmentos da

sociedade, devido a seu potencial risco ao ambiente (CUNHA et al., 2003), uma vez que o uso

indiscriminado (regido por fatores como: uso inadequado, alta toxicidade, falta do uso de

equipamentos de proteção e precariedade dos mecanismos de vigilância) pode gerar danos à

saúde humana, animal e ambiental (DA SILVA et al., 2005; DOMINGUES et al., 2004). No

entanto, o uso de pesticidas não gera somente impacto ambiental, mas também impactos sociais

17

e sanitários, os quais são agravados pela ampla utilização destes produtos, pelo

desconhecimento dos riscos associados a sua utilização, pelo desrespeito às normas de

segurança, pela livre comercialização, pela pressão comercial por parte das empresas

produtoras e distribuidoras, e os problemas sociais presentes principalmente no meio rural (foco

de seu maior emprego) (HOSHI, 2009; RIBEIRO et al., 2009).

Neste contexto, a exposição ocupacional a pesticidas é particularmente preocupante nos

países em desenvolvimento. O consumo de pesticidas tem crescido rapidamente no Terceiro

Mundo e em países emergentes, mas na maioria dos casos não existe controle eficaz sobre a

venda e o uso destes produtos, bem como os equipamentos de proteção individual (EPI) não

são utilizados rotineiramente, não havendo monitoramento da exposição ocupacional

(PAUMARGARTTEN, 2012; DA SILVA et al., 2008).

Estimativas feitas pelas agências internacionais de saúde, incluindo a Organisação das

Nações Unidas para alimentação e agricultura (FAO) e a Organisação Mundial da Saúde

(OMS) são preocupantes e suas atenções se voltam para ocorrências de intoxicações agudas

resultantes do contato direto com produtos altamente tóxicos. As intoxicações humanas podem

acarretar consequências imediatas, inclusive levando o indivíduo à morte ou a problemas

crônicos tais como o câncer (CARNEIRO, 2012).

Em geral, a exposição ocupacional de trabalhadores agrícolas ocorre por falta de

informação ou recursos técnicos qualificados. Desta forma, equipamentos de proteção

individual (EPI’s) tendem a não ser utilizados no momento do preparo e aplicação dos

pesticidas, sobretudo por nem sempre estarem adequados à realidade e ao clima das regiões

agrícolas brasileiras (PERES e MOREIRA, 2007).

Os possíveis efeitos tóxicos da exposição a pesticidas são conhecidos. Porém, as

informações da toxicidade relacionada aos ingredientes ativos não são suficientes para avaliar

o risco dos efeitos adversos dos pesticidas sobre a saúde humana e ambiental (RIBEIRO et al.,

2009).

No setor produtivo, a genética molecular tem se tornado uma ferramenta indispensável

para alcançar o sucesso econômico. A investigação genética dos possíveis danos a saúde dos

trabalhadores rurais, adquiridos pela exposição ocupacional a pesticidas, elevaria a capacidade

de investigação dos efeitos e causas que está conduta vem trazendo para a saúde dos

trabalhadores, como demosntrado no universo academico.

E possível realizar estudos de investigação genética e molecular para a identificação

de danos no DNA dos trabalhadores ocupacionalmente expostos a pesticidas. O emprego da

biologia molecular como uma ferramenta de investigação permite a identificação de eventos

18

presentes no DNA que estão relacionados à saúde genética dos trabalhadores rurais, apontando

os danos potencialmente envolvidas com doenças genéticas. A identificação destes danos no

DNA auxiliará na compreensão dos mecanismos biológicos e fisiológicos subjacentes às

características estudadas.

No estado de Goiás, até o momento, estudos para se correlacionar o uso indiscriminado

de pesticidas com a saúde dos trabalhadores rurais, utilizando uma abordagem genético

molecular estão escassos (KHAYAT et al., 2013; GODOY et al., 2014; FRANCO et al., 2016).

Além da falta de estrutura no âmbito de saúde publica, por motivos como difícil acesso a

unidades de saúde, o diagnostico incorreto, por falta de laboratórios, ou por mal preparo dos

profissionais da saúde, sejam médicos, enfermeiros e técnicos que não relacionam o sintoma

com a exposição ocupacional, e devido não se ter um parâmetro, um bioindicador que permita

uma avaliação prematura. Portanto, os dados obtidos, a partir do presente estudo, poderão

contribuir para promover informações que venham a colaborar para a determinação de

parâmetros e condutas que poderão servir para orientar os trabalhadores rurais em prol da sua

saúde. Assim, o presente estudo contribuirá para estimular a formação de recursos humanos e

consolidar os padrões de excelência regional imprescindíveis nas áreas de biotecnologia e

biodiversidade, abrindo caminho para novas vertentes para a aplicação da biologia molecular

como uma ferramenta em estudos de genômica.

19

2. Referencial Teórico

2. 1 História da Agricultura

A agricultura surgiu há mais de 10.000 anos e com o passar do tempo, houve inúmeras

mudanças nos processos e nas formas do trabalho agrícola, como a utilização de novas

tecnologias e maneiras organizacionais que vêem contribuindo com o desenvolvimento no

campo (MAZOYER e ROUDART, 2008; MAGALHÃES, 2010). Há milhares de anos, as

pragas têm afetado a vida da humanidade como mostrado por relátos bíblicos, gregos, romanos,

macedônios, chineses e mesopotâmicos que reportaram grandes pragas como desafios cruciais

para a sobrevivência dessas sociedades (BRAIBANTE, 2012). Desde o início da agricultura, a

humanidade sempre buscou maneiras de combater as pragas que variam desde rituais religiosos,

utilização de animais, espantalhos, barreiras físicas, utilização de produtos químicos, levando

ao desenvolvimento dos pesticidas (MAZOYER; ROUDART, 2008). O primeiro relato de um

produto químico utilizado para o combate de pragas foi dos sumérios, há mais de 2500 a.c que

usavam enxofre para combater insetos (BRAIBANTE, 2012).

Com o passar do tempo, a estruturação da sociedade como conhecemos nos dias de hoje

e o aumento da densidade populacional levaram às revoluções agrícolas. As revoluções

determinaram a agricultura atual, a primeira revolução aconteceu na era neolítica há 10.000 a.c.

A revolução neolítica se caracterizou pelo início do cultivo, quando os nômades passaram a

cultivar plantas, seguidas pela revolução agrícola antiga, marcada pelo alqueive, que consiste

em, deixar a terra descansar de um plantio para outro, e utilização de tração leve. A revolução

agrícola da Idade Média no século X, que foi caracterizada pelo uso de alqueive e tração pesada

(MAZOYER e ROUDART, 2008; HOBSBAWM et al., 2006).

A primeira revolução agrícola dos tempos modernos ocorreu nos séculos XVIII a XIX

em decorrência da primeira revolução industrial, marcada pela mecanização do campo com a

introdução de tratores, colheitadeiras e semeadeiras, e uso de energia a vapor e energia elétrica,

o que levou a plantações regulares, surgimento de novos pesticidas e implementos agrícolas,

aumentando consideravelmente a produção agrícola (NODARI & GUERRA, 2015; DA

VEIGA, 2007). A partir desta revolução, os impactos ambientais gerados pela degradação

ambiental desenfreada, assim como os impactos na saúde humana, desencadeados,

principalmente, pelo uso dos pesticidas, sem o conhecimento dos compostos químicos para a

saúde humana, repercutem até os dias de hoje (NODARI & GUERRA, 2015; FERREIRA,

2010).

A segunda grande revolução agrícola dos tempos modernos iniciou no século XX e foi

caracterizada pela modernização e desenvolvimento de novos equipamentos agrícolas que

20

incluíram processos de motorização, mecanização, quimificação, esatbelecimento das vias de

escoamento e transporte da produção, além da seleção de variedades de plantas pela qualidade

genética e alteração de seu material genético (MAZOYER & ROUDART, 2008). Dentro desta

revolução, houve a Revolução Verde, que se iniciou em 1960, sendo caracterizada pela seleção

de sementes com alto rendimento e a utilização e desenvolvimento de pesticidas e fertilizantes

sintéticos (MATOS, 2011; DA VEIGA, 2007). A soma do uso intensivo de pesticidas e

fertilizantes, com o advento da genética molecular e utilização da engenharia genética, no

desenvolvimento de sementes e cultivares geneticamente modificadas, proporcionaram o

aumento da produção mundial de alimentos (MACHADO, 2014; MATOS, 2011;

ALBERGONI & PELAEZ, 2007).

No final da Segunda Guerra Mundial e o advento da era nuclear, a discussão sobre o

impacto ambiental da agricultura, da indústria e consumo desmedido de recursos naturais se

tornaram internacionais com o livro “Primavera Silenciosa”, da escritora Rachel Carson que

faz uma critica da modernização da agricultura. (DE LIMA, 2015; ALBERGONI& PELAEZ,

2007) A partir da publicação deste livro, a sociedade cientifica começou a avaliar o impacto

dessas revoluções e calcular o dano ao ambiente. Em 1972, em Estocolmo, a Organização das

Naçoes Unidas promoveu a Conferencia das Naçoes Unidas sobre Meio Ambiente e os Direitos

Humanos, discutindo pela primeira vez o impacto ambiental do desenvolvimento humano e

social (DE LIMA, 2015; ALBERGONI& PELAEZ, 2007)

2.2 História da Agricultura no Brasil

Existem achados arqueológicos que a agricultura brasileira se iniciou juntamente com a

agricultura mundial por volta de 10.000 a.c e na época da chegada dos portugueses em 1500,

os índios cultivavam mandioca, milho, abóboras, batata-doce, cará, banana, mamão e abacaxi,

ainda de forma primitiva (REIFSCHNEIDER, 2010). O Brasil desde 1.500 até a proclamação

da República em 1889, foi um pais de economia extrativista e agrário pela exportação do pau-

brasil, café, algodão, borracha, cacau, cana de açúcar e minério (ABREU, 2010;

REIFSCHNEIDER, 2010).

A agricultura brasileira sofreu uma grande mudança em 1960 com a Revolução Verde

pela modernização agrícola baseada em novas tecnologias, criação de produtos químicos,

biológicos e novos equipamentos mecânicos, ligados a agricultura (ALBERGONI & PELAEZ,

2007). Nesse período houve formação dos complexos agroindustriais e a internacionalização

dos processos, ocorrendo uma padronização dos sistemas produtivos, por exemplo, a maneira

de produção de soja no Brasil é a mesma em todo mundo (AGRA, 2001).

21

Na década de 70, a Revolução Verde timpulsionou a partica agrícola no Brasil com a

criação do Sistema Nacional de Crédito Rural, onde uma parte do recurso concedido era

obrigatoriamente destinado a compra de pesticida, além da criação do Programa Nacional de

Defensivos Agrícolas, no âmbito do II Plano Nacional de Desenvolvimento que disponibilizou

recursos para a criação de empresas nacionais e incentivos para a produção de insumos

agrícolas no Brasil, estimulando também a produção e o consumo dos pesticidas em todo

território nacional. (DE LIMA, 2015; LONDRES, 2011).

2.3 Uso de pesticidas na Agricultura Brasileira

O impacto do uso de pesticidas no Brasil começou a ser discutido na mesma época em

que o mundo discutia pela primeira vez o impacto do desenvolvimento econômico no meio

ambiente, juntamente com a Revolução Verde de 1960, que aumentou consideravelmente e

indiscriminadamente o uso dos pesticidas no Brasil (PORTO, 2012; ALBERGONI & PELAEZ,

2007). Com incentivos financeiros, o governo brasileiro subsidiou e incentivou o uso de

pesticidas e de criação de fábricas brasileiras e multinacionais voltadas ao desenvolvimento e

distribuição de pesticidas (DE LIMA, 2015; LONDRES, 2011).

Em 1975 o Plano Nacional de Desenvolvimento que incentivava e exigia o uso de

pesticidas por meio de investimentos para financiar estes “insumos”, alem de incentivar a

ampliação da indústria de síntese e formulação no pais, passando de 14 fábricas em 1974, para

73 em 1985 (RIGOTTO, 2011). Esta política possibilitou não só ao grande produtor, mas

também ao produtor familiar, utilizar pesticidas de maneira indiscriminada. Apenas em 1989,

foi aprovada a lei 7.802 (TERRA & PELAEZ, 2008). Assim, com a aprovação desta lei, os

“defensivos agrícolas” passam a ser tratados como pesticidas, deixando em evidência a

toxicidade destes produtos tanto para o meio ambiente, quanto a saúde humana (DE JONAS,

2015; MOURA, 2005).

Após a regulamentação dos pesticidas, o uso destes compostos no Brasil foi

normatizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e pelo Conselho

Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), que controlam e regulam a presença dos pesticidas

no meio ambiente (BORSOI et al., 2014).

A agricultura brasileira sofreu uma estagnada na década de 90 e voltou a crescer na

década seguinte e segundo um relatório da Organização das Nações Unidas para a Alimentação

e a Agricultura (FAO) e da Organização para a Cooperação e o Desenvolvimento Econômico

(OCDE), o Brasil é o segundo país que mais exporta produtos agrícolas em todo mundo (FAO;

OCDE, 2015), possuindo um dos melhores desempenhos na produtividade agrícola,

denominada de produtividade de fator total (PFT) Gasques et al. (2014) mostraram que o

22

crescimento do PFT na agricultura brasileira aumentou 35% ao ano entre 1975 e 2013 (FAO;

OCDE, 2015) (Figura 1). No entanto, vale ressaltar que o Brasil se encontra na contramão

mundial quanto ao consumo de pesticidas, pois, enquanto o mundo reduz o consumo, o Brasil

vem aumentando e ocupa o primeiro lugar mundial de consumo de pesticidas, desde 2009

(PELAZ, 2015).

Figura 1: Tendência na produção agrícola e produtividade no Brasil 1975- 2013.

Fonte: Apud Gasques et al. 2014

2.4 Classificação dos pesticidas

Existem uma grande diversidade de pesticidas, com cerca de 300 princípios ativos e 2

mil formulações diferentes disponíveis no mercado (YAMASHITA, 2008). Os pesticidas são

classificados quanto à sua ação, grupo químico e toxidade.

2.4.1 Classe de pesticidas, segundo sua:

2.4.1.1 Ação

De acordo com Peres et al. (2013), a ação é classificada conforme a praga que controlam.

• Inseticidas: controlam insetos;

• Fungicidas: destroem ou inibem fungos;

• Herbicidas: combatem plantas invasoras;

• Desfolhantes: eliminam folhas indesejadas;

• Fumigantes: combatem bacterias do solo;

• Raticidas: combatem ratos e outros roedores;

• Moluscocidas: combatem moluscos;

• Nematicidas: combatem nematoides;

23

• Acaricidas: utilizados no combate a ácaros.

• Escorpionicidas: utilizado no combate aos escorpiões.

• Vampiricidas: ação de combate aos morcegos.

2.4.1.2 Grupo químico:

• Organoclorados: São compostos químicos sintéticos com baixa solubilidade em água e

elevada solubilidade em solventes orgânicos e tem alta estabilidade química, sendo o motivo

para a lenta biodegradação (SÁ et al., 2012). Tem afinidade por lipídios podendo se acumular

no organismo e aumentar a sua concentração em cada nível da cadeia alimentar evento chamado

de biomagnificação (SÁ et al., 2012; CAMPOS et al., 2015). Os organoclorados podem ser

detectados tanto no parâmetro ambiental como em populações, mesmo após décadas da

suspensão do uso. A maioria são poluentes orgânicos persistentes, se caracterizam por longos

ciclos de vida no ambiente e por serem transportados a longas distâncias (CAMPOS et al.,

2015). Os organoclorados têm efeito no sistema endócrino e podem afetar atividade dos

hormônios tiroidianos a triiodotironina (T3) Tiroxina (T4) e TSH, que tem um papel importante

na formação do sistema neural, controlando batimentos cardíacos, peristaltismo intestinal,

temperatura corporal, memória, agindo nos ossos, tecidos musculares e adiposos, podendo

causar danos em qualquer um desses sistemas e na mulher a alteração dos hormônios

tireoidianos podem afetar ciclo reprodutivo (FREIRE et al. 2013). Exemplos: aldrín, DDT,

lindano, toxafeno e BHC (TREZZI et al. 2001).

• Organofosforados: são compostos sintéticos formados basicamente de esteres do ácido

fosforico, possuem um amplo espectro de uso e um alto grau de toxicidade (DA SILVA et. al,

2008). A absorção dos organofosforados pode ocorrer por via digestiva pulmonar e dermica,

sendo esta última a via mais importante, principalmente sob o aspecto ocupacional (DA SILVA

et. al, 2008). Após a absorção, os organofosforados são biotransformados no fígado e começam

a ter afinidade por tecido adiposo, do fígado, rins, pulmões, tireoide, pâncreas e paredes do

intestino (COLASSO et al., 2015). Tais compostos se decompõem dentro de dias ou semanas

e por esta razão são raramente encontrados na cadeia alimentar (VALENTE, 2012). Os

organofosforados são inibidores da enzima acetilcolinesterase responsável pela finalização da

transmissão dos impulsos nervosos. Esta enzima hidrolisa a acetilcolina que quando acumulada,

causa um colapso no sistema nervoso central, ocasionando perda do controle muscular,

convulsoes, podendo levar à morte por parada cardiorrespiratoria (PETRONILHO et al., 2011).

24

• Carbamatos: Também são conhecidos como uretanos são derivados do ácido carbâmico.

Podem contaminar água e solo e como os organofosforados sofrem decomposição em pouco

tempo não são bioacumulativos (QUERINO, 2000; HORTELLANI, 2012). Sua toxicidade é

aguda e também agem no sistema nervoso central, inibindo a enzima acetilcolinesterase,

levando ao acúmulo da acetilcolina (QUERINO, 2000; HORTELLANI, 2012). Alguns

exemplos são Aldicarb, Carbaril, Carbofuram, Metomil e Propoxur (TREZZI et al., 2001).

• Piretróides: Os piretroides são os derivados do crisântemo dos gêneros Chrysanthemum

cineraiaefolium e Chrysanthemum cocineum, atualmente são produzidos sinteticamente das

piretrinas, adicionando átomos de nitrogênio, enxofre e de halogenio, o que deixou a

composição mais estável. Tais compostos são fotoestáveis, de fácil desintegração e pela cadeia

alimentar podem acarretar a bioacumulação nos organismos (QUERINO, 2000; ROMANINI,

et al., 2011). São considerados poucos tóxicos e são utilizados como uma alternativa aos

organoclorados e organofosforados (SANTOS et al., 2008).

• Triazinas: São compostos sintéticos heterocíclicos aromáticos de 6 membros possuindo

3 átomos de hidrogênio (CUNHA et al., 2006) São agentes tóxicos que contaminam água e

solo, possuem lenta degradação, de acordo com a formulação do composto os efeitos tóxicos

relatados em estudos são a incidência de defeitos congênitos, problemas respiratórios e

potencialmente carcinogênicas para o homem (BESPLUG et al., 2004 PATUSSI et al., 2013)

Exemplos são Ametrex, Atrazina, Blast, Coyote, Gesagard, Herbipak, Metrimex (TREZZI et

al., 2001).

2.4.1.3 Quanto a sua toxicidade

Os pesticidas são classificados como toxicológicos, quando estes produtos

comprovarem, por dados validados, serem teratogênicos, mutagênicos, carcinogênicos ou

genotóxico, além de levarem à corrosão, ulceração ou opacidade na córnea, dos animais

testados pela ANVISA, (ANVISA, 2016). Na Tabela 1, está demonstrado como a ANVISA

classifica os pesticidas, de acordo com as formulações sólidas, que apresentam DL50

administrada por via oral em ratos.

Tabela 1: Classificação toxicológica segundo formulações sólidas que apresentam DL50 oral

para ratos.

Classe Embalagem Grupos DL50 (mg/l)

I Faixa Vermelha Extremamente Tóxico 50

II Faixa Amarela Altamente Tóxico 5-50

III Faixa Azul Medianamente Tóxico 50-500

IV Faixa Verde Pouco Tóxico > 500

25

Fonte: ANVISA,2016

2.5 Pesticidas e seus impactos a saúde humana e ao meio ambiente

O Brasil é um dos maiores produtores de alimentos, madeira, biocombustível e algodão,

é o maior consumidor de pesticidas no mundo. Comparando a produção agrícola de 2012 com

uma área total de 95 milhões de hectares foram usadas cerca de 105 bilhões de litros de

pesticidas, principalmente para o cultivo de soja, milho, cana de açúcar, algodão, cítricos, café

e hortaliça (CARNEIRO et al., 2012 e 2015)

Os impactos gerados pelo agronegócio com a utilização dos pesticidas ocorrem quando

se pulverizarem o veneno com objetivo de eliminar as pragas da lavoura, o que leva a

contaminação da lavoura, do solo e do produto, atingindo os lençóis freáticos, rios e todo meio

ambiente. Além disso, os pesticidas são capazes de contaminar os trabalhadores rurais, a

população do entorno das áreas cultivadas e os consumidores dos produtos, levando a

intoxicações agudas e crônicas (AUGUSTO et al., 2012 e 2015).

2.5.1 Intoxicação

Intoxicação por pesticidas ocorrem pincipalmente por serem agentes xenobióticos, que

são substâncias químicas, físicas ou biológicos diferentes das produzidas pelos organismos, que

podem causar dano ao sistema biológico e podem levar a desregulação da produção de enzimas,

mutações do material genético e até a morte, lembrando que a ação é proporcional à dose e

tempo de exposição, portanto, a intoxicação é a manifestação de sintomas de desequilíbrio

gerado pelo agente tóxico interagindo com o organismo (BUSCHINELLI & KATO, 2011;

RUPPENTHA, 2013). Os agentes xenobióticos no ambiente oferecem risco ocupacional a

saúde dos trabalhadores rurais, mas não significa que a exposição a esses agentes tóxicos irá

levar ao desenvolvimento de doenças (RUPPENTHA, 2013)

A intoxicação dos trabalhadores rurais ocorre principalmente por duas vias: dérmica e

digestiva, e como mencionado anteriormente, depende da dose (quantidade) e tempo de

exposição, levando a intoxicações agudas e crônicas. A Tabela 4 demonstra os sintomas da

intoxicação, de acordo com a ação e grupo químico.

26

Tabela 1: Classificação e efeitos e/ou sintomas agudos e crônicos dos agrotoxicos

Natureza Grupo quimico Sintomas de

intoxicacao aguda

Sintomas de intoxicacao

cronica

Inseticidas

Organofosforados e

Carbamatos

Fraqueza, colicas

abdominais, vomitos,

espasmos musculares e

convulsoes

Efeitos neurotóxicos,

retardados, alterações

cromossomiais e

dermatites de contato

Organoclorados

Náuseas, vomitos e

contraçoes musculares

involuntárias

Lesoes hepáticas,

arritmias cardíacas, lesoes

renais e neuropatias

perifericas

Piretroides

Sinteticos

Irritaçoes das

conjuntivas, espirros,

excitação e convulsoes

Alergias, asma bronquica,

irritaçoes nas mucosas e

hipersensibilidade

Fungicidas

Ditiocarbamatos

Tonteiras, vomitos,

tremores musculares e

dor de cabeça

Alergias respiratorias,

dermatites, mal de

Parkinson e cancer

Fentalamidas – Teratogeneses

Herbicidas

Dinitrofenois

e Pentaclorofenol

Dificuldade respiratoria,

hipertermia e

convulsoes

Canceres e cloroacnes

Fenoxiaceticos

Perda do apetite,

náuseas, vomitos e

fasciculação muscular

Indução da produção de

enzimas hepáticas,

canceres e teratogenese

Glicina substituída

Irritação nos olhos e

pele, dor de cabeça

náuseas,

entorpecimento,

elevação da pressão

arterial, palpitaçoes e

alergias.

Lesoes em glandulas

salivares, inflamaçoes nas

mucosas do estomago,

danos geneticos (em

celulas sanguíneas do

corpo humano) e outros.

Dipiridilos

Sangramento nasal,

fraqueza, desmaios e

conjuntivites

Lesoes hepáticas,

dermatites de contato e

fibrose pulmonar

Fonte: Adaptado de OPAS/OMS 1996

2.6 Cultivo da Soja

A soja foi introduzida no Brasil na década de 30, mas ganhou destaque na década de 70,

quando começou a ser produzida no Centro-Oeste, devido à demanda do mercado mundial

(PIROLLA, 2008). Desde então, o país começou a investir em tecnologias, como no ano de

1973, que foi criada a Embrapa e em 1975, a Embrapa Soja e a Embrapa Cerrados, que

27

desenvolveram sementes adaptadas, viabilizando a produção nas regioes Centro-Oeste, Norte

e Nordeste (PIROLLA, 2008). Somente em 2003, a soja transgênica foi autorizada e hoje

representa 60% da produção. Porém, o pequeno número de empresas que controlam o

fornecimento de sementes e insumos vem elevando o preço da produção e dos pesticidas

utilizados no cultivo (SCHLESINGER, 2008).

Segundo o CONAB (2017), a área plantada no Brasil em 2015/16 é de 585 milhões de

hectares, um aumento de 1% em relação ao ano anterior, com estimativa da produção de grãos

em atingir em 2030, 2135 milhões de toneladas. Com crescimento de 17%, a cultura de soja é

responsável por 56,8 % da área cultivada do pais, representando um crescimento de 36% em

relação ao ano anterior. A soja é produzida, pincipalmente, na região Centro Oeste e Sul do

Brasil.

Como consequência de ser a maior produção de grãos do Brasil, o cultivo da soja é o

que mais emprega o uso de pesticidas no Brasil. A Figura 2 contém as etapas do fluxograma do

plantio da soja em todo o território nacional, demonstrando a utilização de agrotóxico desde o

preparo da semente para o plantio até a desfoliação para a colheitas das sementes.

28

Figura 2. Preparo da área para a produção de soja. Fonte: Adaptado de Câmara 2012.

Os pesticidas mais utilizados no cultivo da soja são:

Dessecação pré-semadura e pós-semeadura: Diquat Glyphosate 24-D com Glyphosate

Paraquat Amônio-glufosinato Trinexapac-ethyl (EMBRAPA, 2006).

• Pré-emergentes: Alachlor, Clomazone, Cyanazine, Diclosulam, Dimethenamid, Flumetsulam,

Flumioxazin, Imazaquin, Linuron, Metolachlor, Metribuzin, Pendimethalin, Sulfentrazone,

Trifluralin (MARCHEZAN, 2013);

• Pós-emergentes: Imazethapyr com Lactofen e Bentazon, Imazethapyr com Lactofen e

Chlorimuron, Ethyl, Imazethapyr com Fomesafen e Clorimuron Ethyl Fomesafen com

Bentazon e Fomesafen Lactofen com Bentazon Fomesafen e Imazethapyr (MARCHEZAN,

2013);

Pré-

Semeadura

Preparo do solo: Convencional ou Reduzido (Correção do

solo)

Aplicação de herbicida pos-emergente

Semeadura-adubação + Aplicação de herbicida pre-emergente

Dessecação da vegetação (Herbicida) + Semeadura-plantio

direto (Semente tratada com fungicida inseticida

micronutriente nematicida e polimeeros)

Semeadura

Aplicação foliar de micronutrientes

Aplicação de inseticidas para mastigadores e sugadores

Aplicação de fungicidas para doenças foliares

Aplicação de dessecante (pre-colheita) -Herbicidas

Colheita Automotriz

29

• Tratamento das sementes: Tiametoxam Metalaxil-m Comfludioxonil e Tiabendazol Florite

Carbendazin Com Thiram Imidacloprid Aldicarb (CASTRO et al., 2008).

Além desses pesticidas usados rotineiramente no cultivo de soja, alguns, inseticidas e

acaricidas específicos podem ser aplicados para combater pragas e doenças que podem se

desenvolver durante o cultivo do grão soja (MOREIRA & ARAGÃO, 2009). A soja pode ser

atacada por mais de 49 pragas e doenças. Em cada estação de plantio pode ser necessária a

aplicação de, mas de 50 tipos de pesticidas, para o combate às pragas da soja (MOREIRA &

ARAGÃO, 2009).

2.7 Genética em exposição

Os organismos estão expostos diariamente a agentes físicos, químicos e

microbiológicos que podem levar à modificação do material genético (LEWIN, 2008;

ALBERTS, 2007). A exposição individual pode causar mutações em células somáticas e na

linhagem germinativa do genoma parental, portanto, é possível que gerações seguintes herdem

a mutação (LEWIN, 2008; ALBERTS, 2007).

Todos os seres vivos sofrem mutações espontâneas, que contribuem para a evolução

dos organismos, permitido a variabilidade genética entre indivíduos de uma população,

favorecendo adaptações ao meio ambiente. (GU et al., 2012). Além das mutações espontâneas,

as mutações podem ser induzidas, ou seja, geradas por um agente causador, levando ao

surgimento de estudos que tentam entender e caracterizar o papel dos agentes causadores de

tais mutações, assim como suas consequências biológicas (LEWIN, 2008).

Os pesticidas são caracterizados como xenobióticos, genotóxicos e mutagênicos por

serem compostos químicos capazes de acarretar danos ao material genético (MAURICE, 2013).

A maior parte destes agentes mutagênicos apresentam mecanismos específicos de dano,

causando mutações distintas e que depedem de vários fatores, incluindo a natureza das

alteraçoes primárias no DNA como: modificaçoes de base, quebras dos resíduos de açucar ou

fosfato, quebras de filamentos, ou modificações de bases nitrogenadas (ZAHA et al., 2014;

ALBERTS, 2007).

As modificações no DNA são sujeitas a formas de reparo do material genético

(MAURICE, 2013; ZAHA et al., 2014). Uma vez presentes no DNA a duplicação de filamentos

filhos sobre moldes modificados resultam na fixação da mutação no genoma descendente

(ZAHA et al., 2014). Essas mutações podem desencadear e/ou desequilibrar qualquer

mecanismo de regulação celular, podendo levar ao aparecimento de doenças como o câncer

(ZAHA et al. 2014).

30

2.7.1 Analise de polimorfismos de nucleotídeos únicos – SNPs

Polimorfismos são caracterizados pela variação de locos em cromossomos homólogos,

devido à variação da sequência de DNA. Para uma região ser considerada polimórfica, ela tem

que estar presente com uma frequência superior a 1% na população (ALASUBRAMANIAN et

al., 2004; LEWIN, 2008; ALBERTS, 2007).

Grande parte da variabilidade do genoma humano ocorre pelos polimorfismos de base

única, ou seja, os SNPs. Em média, há 1 SNP a cada 100 a 2000pb, sendo que 99% deles estão

silenciados, e seu efeitos com significados biológicos podem variar de acordo com sua posição

no genoma, tais como: (a) SNPs presentes na região codificadora de um gene, podem originar

proteínas truncadas, o que altera atividade e a integridade da função proteica; (b) um SNP em

uma região reguladora, que pode alterar o nível de expressão gênica; (c) SNPs que estão na

região de junção (intron e exon), podem alterar o splicing do mRNA (ORPHANIDES E

KIMBER 2003; SACHIDANANDAM et al., 2001).

Neste contexto, a associação de SNPs e susceptibilidade genética tem importância na

resposta à exposição a pesticidas, tanto para a determinação do aparecimento ou devido a

ausência de sintomas clínicos, causados pela intoxicação (ADAD et al., 2016). Esta

sensibilidade está diretamente associada com polimorfismos de enzimas chave do metabolismo

celular, tais como a paraoxonase 1 (PON 1), OGG1 (8-oxoguanine glicosilase) e NAT 2

(Hernández-Jerez, 2006). Os polimorfismos que podem reduzir a capacidade de reparo de DNA

são associados a efeitos mutagênicos possibilitando compreender as diferenças na

susceptibilidade a exposição a pesticidas (WINKINSONZ E CLAPPER, 1997).

O gene OGG1 (8-oxoguanine glicosilase) está localizado no cromossomo 3p26.2 possui

11exons, e participa do sistema de reparo do DNA, codificando uma enzima chamada

oxoguanina DNA glicosilase, responsável pela excisão de 8-oxoguanina, uma base mutagênica

que ocorre em resposta à exposição do DNA a espécies reativas de oxigênio. Existem relatados

25 SNPs no gene OGG1 capazes de ocasionar mudanças de aminoácidos na proteína, mas

somente o polimorfismo rs1052133 (Ser326Cys) tem sido investigado em relação ao risco de

câncer, em particular câncer no pulmão (KARAHALIL et al., 2008; LI et al., 2008;. LI et al.,

2011; DUAN et al., 2012)

O Gene CYP2E1 está localizado no cromossomo 10, na região q26.3, sendo constituído

por 9 exons, o qual codifica uma enzima que atua no metabolismo de xenobióticos (ALVES,

2017). Existem mais de 100 SNPs presentes nesse gene e alguns estudos evidenciaram que o

polimorfismo rs2031920, localizado na região promotora, é capaz de aumentar a atividade

31

transcricional, podendo causar um incremento no risco de alguns tipos de câncer (PENG et al.,

2013; HABENSCHUS et al., 2014; XU et al., 2016; SUTRISNA, 2016; ALVES, 2017)

32

3. Objetivos

3.1. Objetivo geral

• Avaliar o impacto da exposição a pesticidas, em sojicultores de municípios goianos com

avaliações do estilo de vida, hematológicas, bioquímicas, moleculares e de danos ao

DNA.

3.2. Objetivos específicos

• Analisar, com o auxílio de um questionário de estilo de vida, a história ocupacional dos

sojicultores e a repercussão na saúde destes trabalhadores.

• Avaliar os resultados das análises hematológicas e bioquímicas dos sojicultores.

• Avaliar a distribuição e frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos dos genes

CYP2E1 e OGG1 nos sojicultores e grupo controle.

• Realizar o ensaio cometa nos sojicultores e comparar com os danos encontrados no

grupo controle.

33

4. Metodologia

4.1 Amostras biológicas dos trabalhadores rurais

O presente estudo constitui uma pesquisa transversal (análises bioquímicas e o

hemograma) e do tipo caso/controle (ensaio cometa), na qual foram avaliados 163 participantes,

sendo 74 sojicultores, expostos ocupacionalmente a pesticidas, constituindo o grupo exposto e

89 indivíduos, também de municípios goianos, que apresentaram condições similares aos

trabalhadores rurais, sem histórico prévio de exposição ocupacional a pesticidas.

Dos 74 sojicultores, 43 estão diretamente expostos a pesticidas e lidam na

manipulação, descarte e aplicação destes produtos e 31 são expostos indiretamente, ou seja,

moram nas terras e que muitas vezes são arrendadas por grandes produtores rurais, e acabam

sendo expostos aos pesticidas de maneira indireta. Os participantes pertenciam a 8 municípios

do Estado de Goiás, produtores de soja: Leopoldo de Bulhões, Silvânia, Rio Verde, Santa

Terezinha, Goiânia, Rosalândia, Bela Vista e Piracanjuba.

Os participantes foram escolhidos aleatoriamente e as amostras de sangue foram

obtidas voluntariamente de acordo com o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)

(Apendice I). Dados como idade, hábitos sociais, tempo de exposição e tipos de pesticidas

utilizados, foram anotados em um questionário de estilo de vida para a realização dos dados

estatísticos (Apendice II). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas da

Pontifícia Universidade Católica de Goiás com o protocolo de número 1978/2011(Anexo I). A

Figura 3 ilustra os procedimentos metodológicos realizados nesse estudo.

Figura 3. Procedimentos realizados neste estudo para avaliação dos sojicultores em comparação

com o grupo controle

34

4.2 Local da realização do estudo

As coletas, tabulação dos dados, manipulação de amostras, extração de DNA, PCR e

ensaio cometa foram realizados no Laboratório de Mutagênese (LabMut), Departamento de

Genética, da UFG. Os géis de eletroforese e a reação de sequenciamento foram realizadas no

Laboratório Genética e Biodiversidade, Departamento de Genética, da UFG (LGBIO). A

captura das lâminas referentes ao ensaio cometa foram efetuadas no Núcleo de Pesquisas

Replicon, Escola de Ciências Agrárias e Biológicas, da PUCGO. Os exames laboratoriais de

bioquímica e hematologia foram realizados no LACES, da UFG e no Laboratório Clínico

Sigma, sob a responsabilidade técnica da biomédica Christiane Maria do Valle, como

prestadores de serviço.

4.3 ExtrAnalises Bioquimicas e Hematologicas

As amostras biológicas para analise de bioquímica e hemograma foram obtidas a partir

da coleta de 10mL de sangue periférico dos trabalhadores rurais, sendo armazenadas em isopor

com gelo e encaminhadas imediatamente ao laboratório. As coletas foram realizadas nas

fazendas de cada município visitado, por um biomédico especialista em flebotomia. Os exames

de TGP, TGO foram feitos pelos Metodo Automatizado A15 – Biosyntems, Os exames de perfil

lipídico e glicemia foi realizado pelo método enzimático automatizado A15- Biosystems, os

exames de Hematologia pleo método hemograma automatizado ABX PENTRA 60 e o exame

de Colinesterase foi realizado por espectofotometria .

4.4 Extração DNA e quantificação das amostras de Sangue

As amostras biológicas foram obtidas a partir da coleta de 10mL de sangue periférico

dos trabalhadores rurais, sendo armazenadas em isopor com gelo e encaminhadas

imediatamente ao laboratório. As coletas foram realizadas nas fazendas de cada município

visitado, por um biomédico especialista em flebotomia. A extração de DNA foi realizada com

o kit de extração Ilustra Genomic Blood MS® (GE, EUA) de acordo com o protocolo do

fabricante. Em seguida, as amostras extraídas foram quantificadas utilizando-se o equipamento

NanoVue Plus TM (GE, EUA) seguindo as recomendações do fabricante.

4.5 Ensaio Cometa

Para a realização do ensaio cometa, as lâminas foram preparadas com uma pré-

cobertura de agarose “Normal Melting” a 1,5%. Utilizou-se 10μL de sangue o qual foi

embebido em 120μL de agarose “LowMelting Point”a 0,5% a qual estava em banho maria a

35

37ºC. Esta mistura foi colocada na lâmina de pré-cobertura de agarose e coberta com uma

lamínula. Após a solidificação do material, as lamínulas foram retiradas e as lâminas imersas

em tampão de lise por 24 horas.

Após o período determinado, as lâminas foram retiradas da lise e colocadas em uma

cuba horizontal de eletroforese incubadas em tampão alcalino, deixando descansar por 30

minutos. A corrida eletroforética foi realizada por 25 minutos a 25 volts e 300 Amps. A

neutralização foi feita com uma solução Tampão Tris a 04M (pH 75) por três vezes durante 5

minutos.

A fixação foi realizada com etanol absoluto por 5 minutos e o DNA foi corado com

20μL da solução de brometo de etídio a 10ng. Após a fixação, a lamínula foi colocada

novamente sobre a lâmina, deixando descansar por aproximadamente 5 minutos. Após esse

tempo, as lâminas foram analisadas sob microscopia de epifluorescência, utilizando um

conjunto de filtros de excitação 515-560nm, para fluorescência vermelha. Os núcleos das

células foram visualizados utilizando-se a objetiva de 10X e a imagem fluorescente capturada

utilizando o software ZEN.

Foram analisadas duas lâminas para cada indivíduo e contadas ao todo 300 células por

indivíduo as quais foram analisadas com o auxílio do programa Open Comet V1.3.1. Para a

análise dos cometas, foram estimados três parâmetros relacionados a danos no DNA:

Comprimento da Cauda (TL, do inglês, Tail Length), porecentagem de DNA na cauda (% DNA)

e Momento de Olive (OTM, do inglês, Olive Moment).

4.6 Análise molecular dos SNPs

4.6.1 Obtenção dos Primers

Para a análise dos fragmentos dos genes OGG1 e CYP2E1 os DNAs das amostras

foram amplificados pela reação em cadeia da polimerase e então foram submetidos à reação de

sequenciamento. Os primers (iniciadores ou oligonucleotídeos) foram desenhados para uma

região especifica dos genes OGG1 e CYP2E1, conforme demonstrado na tabela 3.

Tabela 3: Descrição dos primers utilizados nas reações de sequenciamento dos genes CYP2E1

e OGG1

Gene Primer

Tamanho

em pares de

base do

fragmento

(pb)

Polimorfismo

ID

36

CYP2E1 F:CCGTGAGCCAGTCGAGTCTA

R:AACAGAGATTAACTTTCTCAGAATT 767 pb

rs2031922

OGG1 F:CCTGTGGGGACCTTATGCTG

R:AGAGGATCATGACCCGAGGT 748 pb

rs1052133

rs293795

4.6.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para a reação de PCR foi utilizado o volume total de 25 µL, sendo 5 µL de DNA a

20ng/µL, 0,5 µL de primer forward e reverse a 1 mM, 2,5 µL de Buffer 10X, 0,5 µL de dNTP

a 10 mM, Taq Platinum 0,2 µL a 1U e 15,3 µL de H2O. Neste caso cada gene teve uma

especificação durante a PCR, como, o primer utilizado, a concentração de MgCl2, ciclos de

alongamento e temperaturas de anelamento como demonstrado nas tabelas 4 e 5.

Tabela4. Protocolo para a PCR do gene OGG1.

Reagentes Termociclagem

Volume Concentração final Ciclos Temperatura Tempo

Template (20ng/µL) 5µL 100ng 1 95°C 5’

Buffer (10X) 2.5µL 1X

40 X

95°C 10''

MgCl2(50mM) 0.5µL 1.5mM 61°C 20’’

dNTP (10mM) 0.5µL 0.2mM 72°C 25’’

Primer F (10mM) 0.5µL 1mM 1 72°C 5'

Primer R (10mM) 0.5µL 1mM 1 4°C ∞

Taq Platinum (5U/µL) 0.2µL 1U

H2O 15.3µL

Tabela 5. Protocolo para a PCR do gene CYP2E1

Reagentes Termociclagem

Volume Concentração final Ciclos Temperatura Tempo

Template (20ng/µL) 5µL 100ng 1 95°C 5’

Buffer (10X) 2.5µL 1X 40 X 95°C 10''

MgCl2(50mM) 0.75µL 1.5mM 61°C 20’’

dNTP (10mM) 0.5µL 0.2mM 72°C 25’’

Primer F (10mM) 0.5µL 1mM 1 72°C 5'

Primer R (10mM) 0.5µL 1mM 1 4°C ∞

Taq Platinum (5U/µL) 0.2µL 1U 1 95°C 5’

H2O 15.05 µL

4.6.3 Reação de Sequenciamento

Após as amplificações dos fragmentos pela PCR e a verificação no gel de agarose, o

produto de PCR dos genes OGG1 e CYP2E1 passam pelas etapas de purificação, reação de

sequenciamento e precipitação, para realizar o sequenciamento desses fragmentos. Para

purificação foi utilizado kit o ExoSAP-ITTM PCR Product Cleanup (Applied BiosystemsTM,

Foster City, CA, USA), onde se utiliza as enzimas Exonuclease I e Fosfatase Alcalina, no

37

produto de PCR (5 μL de produto da PCR e 1μL de solução Exo/Sap), depois a solução é

incubada no termociclador a 37oC por 90 minutos e a 80oC por 20 minutos.

A reação de sequenciamento é feita com o produto purificado utilizando o Kit BigDye®

Terminator Cycle Sequencing Standart (Applied BiosystemsTM, Foster City, CA, USA),

seguindo recomendações do fabricante, sendo utilizado, 1μL de BigDye®, 2 μL de solução

tampão 5X (fornecido pelo fabricante), 2,5 μL de primer (F/R)[1mM], 1 μL do produto de PCR

purificado por ExoSAP e ajustados com 3,5 μL de H2O DNAse e RNAse free, para um volume

final de 10 μL. A amplificação ocorre com a segunte ciclagem: 25 ciclos de 95oC por 20

segundos, 50oC por 15 segundos e 60oC por 1 minuto.

Esse produto passa pela reação de precipitação, na qual, é adicionado 40 µL de

isopropanol nos produtos de PCR (Big Dye). Os produtos de PCR foram submetidos ao vortex

por 30 segundos e deixados em temperatura ambiente por 20 minutos. Após essa etapa os

produtos de PCR foram centrifugados a 2000 forças centrífugas relativas (rcf), por 45 minutos.

Posteriormente, os sobrenadantes das amostras foram descartados.

Os produtos de PCR foram centrifugados novamente por 1 minuto por 3000 rotações

por minuto (rpm), posteriormente foram adicionados 250 µL de etanol a 60%, centrifugados

novamente por 10 minutos a 2000 rcf, os sobrenadantes foram descartados, centrifugados por

1 minuto por 4000 rpm, adicionados 100 µL de etanol a 60%, centrifugados por 10 minutos a

2000 rcf, os sobrenadantes foram descartados, centrifugados por 1 minuto por 500 rpm e,

finalmente, as amostras foram deixadas a temperatura ambiente por 25 minutos.

Após a reação de precipitação, as amostras foram preparadas com a adição de 10 µL

de formidamida Hi-Di, submetidas ao vortex e centrifugação, após essa etapa as amostras foram

desnaturadas no termociclador à 95ºC por 5 minutos, e deixadas no gelo por 1 minuto. As placas

foram colocadas no sequenciador DNA ABI PRISM® 3500 Genetic Analyzer (Applied

BiosystemsTM, CA). As reaçoes de sequenciamento ocorreram nos dois sentidos “Forward” e

“Reverse” para a motagem da fita consenso.

O controle de qualidade do produto sequenciado foi feito pelo software fornecido pela

empresa, o programa Sequence Analyzer versão 6 (Applied Biosystems), seguindo a orientação

na qual nucleotideos com valores PHRED abaixo de 25 foram descartados e depois revaliados.

Após a avaliação do controle de qualidade, os dados fornecidos pelo sequenciador foram

alinhados e editados no programa SeqSacpe Software da Applied Biosystems® manualmente.

Finalmente, para a correção de possíveis erros de sequenciamento, foi utilizado o programa

Bioedit Sequence Alignment Editor versão 7.2.5 (HALL, et al. 1999).

A anotação dos SNPs detectados foi feita individualmente e comparada com as

38

variações já descritas para a o fragmento genômico dos genes estudados (CYP2E1, OGG1), por

meio do software CLC Sequence Viewer versão 7.6.1 (CLC bio, Aarhus, Dinamarca).

Tanto no gene CYP2E1 como no gene OGG1 foram identificados vários polimorfismos

presentes em ambos os grupos (exposto e não exposto), porém só os polimorfismos rs2031902

(CYP2E1), rs 1052133 e rs293795 (OGG1) foram considerados no presente estudo, pois são os

mais relatados pela literatura, apresentando significado clinico.

4.7 Análises Estatísticas

Os dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais foram arquivados em um banco de

dados criado no software Excel 2016 (MICROSOFT®). As frequências, médias e desvios

padrão foram calculados com o software Excel. As populações expostas e não expostas foram

comparadas quanto à idade, sexo, fumo, uso de álcool, com a utilização do teste t de Student.

Para as variáveis qualitativas, foi utilizado o teste do X2. A distribuição dos genótipos nas

populações foi calculada utilizando o software STATISTICA 7 (StatSoft, Inc.) e o Equilíbrio

de Hardy-Weinberg foi calculado utilizando o software GENEPOP (RAYMOND e ROUSSET,

1995). A avaliação da influência das variáveis (idade, fumo, bebida, genótipos) ao efeito

genotóxico, avaliado pelo ensaio cometa, nas populações expostas e não expostas, foi realizada

por uma GLMM (General Linear Mixed Model), assim como a influência das variáveis

ocupacionais na população exposta, e em ambos, foi utilizado o software STATISTICA 7

(StatSoft, Inc.).

39

5. Resultados e discussão

5.1 Análise estatística descritiva do estilo de vida dos grupos exposto e não exposto

O grupo exposto foi composto por indivíduos de 19 a 63 anos, sendo 21 mulheres e 53

homens, dos quais 20,6% relataram hábitos de fumar e 56,8% relataram o ato de consumir

bebidas alcoólicas. O grupo controle possui idades variando de 18 a 64 anos, sendo 36 mulheres

e 53 homens, dos quais 11,2% relataram hábitos de fumar e 8,9% relataram o ato de consumir

bebidas alcoólicas. Quanto às variáveis idade e consumo de álcool, houve diferenças entre os

grupos (Tabela 6).

Fávero et al. (2016) analisaram o consumo de álcool em trabalhadores rurais de cultivo

de tabaco e observaram que 81,8% dos homens e 36.7% das mulheres, tinham o hábito de beber,

os autores evidenciaram que o consumo de bebidas alcoólicas, é prevalente entre os

trabalhadores rurais. De modo semelhante entre os sojicultores do presente estudo, o uso de

bebias alcoolicasé cerca de 6 vezes mais frequente entre os trabalhadores que os controles..

Outras pesquisas (BECK-FILHO et al., 2016; FIORI et al., 2016, FERREIRA, 2016) também

demonstraram que o alto consumo de álcool parece estar associado com o estresse e a

insatisfação com o trabalho, a baixa remuneração, o cansaço físico e mental, além do fato de

muitos trabalhadores morarem no mesmo local que trabalham.

Tabela 6 Dados de estilo de vida dos grupos exposto e não exposto ocupacionalmente a

pesticidas.

Grupos

Exposto Não exposto

Faixa Etária Média Média

< 38 anos 36 (48.64%) 38.55 anos

57 (64.04%) 34.30 anos

> 38 anos 38 (51.36%) 32 (35.95%)

Sexo

Feminino 21 (28.38%) 36(40.45%)

Masculino 53 (71.62%) 53 (59.55%)

Tabagismo

Sim 15 (20.55%) 10 (11.24%)

Não 58 (79.45%) 79 (88.76%)

Etilismo

Sim 42 (56.76%) 8 (8.99%)

Não 32 (43.24%) 81 (91,99%)

5.2 Tipos de pesticidas e formas de contato, EPI’s e caso de intoxicação relatadas pelos

trabalhadores rurais.

40

Para o cultivo da soja, o uso de pesticidas ocorre desde do preparo da terra, até após a

colheita, sendo recomendado um total de 6 a 10 pesticidas diferentes para cada cultivo

(EMBRAPA, 2006 e 2010). O pesticida que será utilizado varia de acordo com o tempo do

cultivo, condição do solo, o tipo das pragas que possam vir a aparecer, frequência das chuvas,

incidência do sol ou simplesmente por diferenças climáticas que podem acontecer durante todo

o período do plantio (EMBRAPA, 2010).

Segundo o CONAB (2017), o Estado de Goiás nos anos de 2016 e 2017, bateu recorde

na safra de soja, comparado aos anos anteriores, sendo o município de Rio Verde o maior

produtor de soja do estado de Goiás. Segundo o IBGE (2017), o Estado de Goiás em 2006,

possuía cerca de 3.900 propriedades produtoras de soja de um total de 153.629 propriedades

agrícolas. Provavelmente, a quantidade de propriedades produtores deve ter aumentado,

sobretudo considerando os dados do CONAB (2016), que indicam 56,8% da área cultivada no

Brasil é destinada para o cultivo de soja.

Neste estudo, foram visitadas 20 propriedades nos municípios goianos de Leopoldo de

Bulhões, Silvânia, Rio Verde, Santa Terezinha, Goiânia, Roselândia, Bela Vista e Piracanjuba,

todas as propriedades visitadas faziam plantio de soja, e no período de entre safra as

propriedades plantavam outro tipo de cultura podendo ser milho (76%), sorgo (22%), feijão

(6,7%), tomate (4.05%) e outros (5.3%). Vale ressaltar que o tempo médio de atividade agrícola

variou de 8 meses a 32 anos (média de 10 anos),

Dos 74 sojicultores expostos ocupacionalmente a pesticidas, 43 tinham contato direto

com pesticidas e relataram o uso de 48 pesticidas no total (Tabela 7), sendo que, os mais

frequentes foram o glifosato com 14%, extra priori 11% e o 2,4 D com 10% (Figura 4A). A

média de pesticidas por propriedade é de 6 pesticidas diferentes, sendo que a maioria são

pertencentes à classe toxicológica III, correspondendo a 52% do total (Figura 4B) e 44% são

inseticidas (Figura 4C).

41

Tabela 7 Pesticidas relatados pelos sojicultores classificados de acordo com a classe

toxicológica, grupo químico, e respectivas funções.

Toxicologica Grupo quimico Classe

I Mistura Ectoparasita

I Estrobilurina Fungicida

I Organofosforado Inseticida

I Bipiridílio Herbicida

I Triazol Fungicida

I Triazol Fungicida

I Estrobilurina / triazol Fungicida

I Pirazol Inseticida

I Avermectina Inceticida/acaricida

I Pirazol Inseticida

I Metilcarbamato de Oxima Inseticida

II Benzimidazol Fungicida

II Organofosforado Inseticida

II Estrobilurina Fungicida

II Pirazol Inseticida

II Estrobilurina / triazol Fungicida

II Dicarboximida Fungicida

II Piretroide / Metilcarbamato de benzofuranila Inseticida

II Carboxanilida / dimetilditiocarbamato Fungicida

II Triazol / estrobilurina Fungicida

II Benzoilureia Inseticida

III Glycolates Herbicida

III Organofosforado Inseticida

III Triazol Fungicida

III Fenilpirrol Fungicida

III Triazina Herbicida

III Piretroide Carrapaticida

III Diamida do ácido ftálico Inseticida

III Sulfonilureias Herbicida

III Benzoilureia Inseticida

III Acido Ariloxialcanoico Herbicida

III Dupont Inseticida

III Ciclihexanodicarboximida Herbicida

III Neonicotinóide Inseticida

III Glicina Herbicida

III Neonicotinoide Inseticida

III Benzoilureia / piretoide Inseticida

III Diacilhidrazina Inseticida

III Cetoenol Inseticida

III Organofosforado Inseticida

42

III Diamida antranílica Inseticida

III Benzoilureia Inseticida

III Sulfoniluréia Herbicida

III Benzoilciclohexanodiona. Herbicida

III Acido Ariloxifenoxipropionico Herbicida

IV Organofosforado Fertilizante

IV Deltrametrina Carrapaticida

IV Sulfonilureia Herbicida

43

Figura 4: Distribiuição dos pesticidas utilizados no cultivo de soja, de acordo com a quantidade

de pesticidas (A); Porcentagem de acordo com a classe toxicológica (B) e Porcentagem de

acordo com a função dos pesticidas mais relatados (C).

Os sojicultores podem entrar em contato de várias maneiras com os pesticidas, no

momento da aplicação, no armazenamento, no descarte das embalagens, limpeza dos

equipamentos como tratores e pulverizadores e no transporte dos pesticidas e quanto mais

funções o trabalhador exercer, maiores são suaas chances de ser ocupacionalmete exposto ao

pesticida usados na propriedade rural.

A

B C

44

Neste estudo, os 43 trabalhadores são diretamente expostos, entravam em contato com

o pesticida por pelo menos duas maneiras diferentes, sendo os contatos mais relatado o que

acontecia durante o preparo e a diluição dos pesticidas (41.9%), e 40.5% faziam o

armazenamento (Figura 5). Das 20 propriedades analisadas, 4 faziam o armazenamento

incorreto das embalagens, em uma o armazenamento era feito ao ar livre, somente com um

telhado para cobrir e nas outras 3, eram armazenados em casinhas, onde não tinha ventilação

correta e as embalagens estavam em contato com o chão. Finalmente, 3 propriedades não

armazenavam as embalagens nas próprias fazendas.

Figura 5. Formas de contato dos sojicultores expostos diretamente a pesticidas

Todos os trabalhadores expostos diretamente relataram fazer uso de EPIs, (Figura 6).

Como há a necessidade do uso de pesticidas no cultivo de soja, é essencial que o sojicultor

tenha a compreensão do quanto são expostos, da periculosidade dos pesticidas que manipula, a

maneira correta de manipular, aplicar e descartar os pesticidas, assim, como o entendimento da

importancia do uso dos EPI’s sendo que a educação e um fator decisivo para essa compreensão

(IWAMI, 2003; SILVA et al., 2017). 20% da propriedades analisadas não armazenam os

produtos nas condições adequadas, segundo os órgãos de inteligência e controle do uso de

pesticidas no território brasileiro, aumentado a chande ce contaminação de resevas naturais, de

animas e humana.

31.00%33.80%

36.48% 37.80% 37.83% 37.83%40.50% 41.90%

45

Figura 6. Frequência dos tipos de EPIs utilizados pelos sojicultores. *No quwationário foi

arguido se os trabalhadores intendiam a importacio do uso de EPI’s

Um dos maiores problemas enfrentados nesse tipo de trabalho, além da resistência do

trabalhador rural em participar da pesquisa, além da credibilidade das informações inexadas

ou incompletas relatadas peltos trabalhadores rurais por meio do questionário/ entevista, E qual,

isso ocorre devido a preocupação dos trabalhadores com as cosnequencias da divulgação da

informação, da reação do empregado, pela inesistecia do acesso a postos de saúde nas

proximidades das propriedades e por não receberem instruções da importância de se protegerem

da exposição aos pesticidas. Muitas das respostas do questionário são dadas por acharem

corretas e não por condizer com sua real situação no trabalho. Todo esse contexto dificultouo a

análise verossímil da realidade dos sojicultores.

As intoxicações por pesticidas são um problema de saúde pública visto que as

intoxicações agudas e crônicas podem acarretar a morte e são relacionadas ao surgimento de

doenças crônicas, câncer e infertilidade, entre outras doenças descritas em diversos trabalhos

(SILVA et al., 2006; FARIA et al., 2009; FIGUEIREDO et al., 2011; FIORI et al., 2016;

MURAKAMI, 2017, CARVALHO et al., 2017). As intoxicações agudas causam sintomas

imediatos, sendo facilmente associados à exposição, diferente dos sintomas tardios e da

intoxicação crônica, às quais são dificilmente associadas a exposição a pesticidas (FARIA et

al., 2009; FIGUEIREDO et al., 2011).

2.63%

52.50% 55.26% 57.89%

71.05%

92.10% 92.10% 92.10%97.36% 100%

46

Desde de 2004, a portaria Nº 777 do Ministério Público, publicada em 28 de abril, define

que as intoxicações têm que ser notificadas compulsoriamente, e essa notificação compulsória

se dá através de uma ficha padronizada pelo Ministério da Saúde, seguindo especificações do

Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) (BRASIL, 2004). Além da

dificuldade em associar os sintomas com a exposição do trabalho ocupacional, diversos fatores

como a falta de acesso dos trabalhadores rurais a rede de saúde, a falta de preparo dos

profissionais da saúde, a falta de laboratórios de biomonitoramento, fazem com haja a

subnotificação da exposição aos pesticidas, fazendo com que os dados de intoxicação não

retratem o real cenário brasileiro, referente aos impactos da exposição a pesticidas,

especialmente em grupos ocupacionalmente expostos (FIGUEIREDO et al., 2011; MOREIRA

et al. 2002).

No presente estudo, 18,9% dos sojicultores relataram já terem sofrido intoxicação por

pesticidas e os sintomas mais comuns foram dor de cabeça e problemas gastrointestinais. 57%

dos sojicultores relataram terem recebido atendimento hospitalar, após a intoxicação.

Finalmente, 22% relataram ausência de sintomas associados com a exposição a pesticidas.Um

em cada cinco sojicultores relata, intoxcaçnao ocupacional aos pesticidas nos minicipios

goianos, sendo que apenas a metade deles receberam atendimento a saúde.

Figura 7. Principais sintomas relatados pelos sojicultores associados com a exposição a

pesticidas

0%1%1%3%4%5%5%5%7%7%7%7%8%8%8%9%9%9%9%9%11%12%12%12%12%12%14%15%16%16%18%18%20%22%

53%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Alu

cin

ação

Inco

nti

nen

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tos

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ento

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Do

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e ca

beç

a

47

5.3 Avaliação dos dados bioquímicos e hematológicos dos sojicultores

Segundo o Ministério da Saúde (SILVA et al., 2006), no protocolo de atenção à saúde,

dos trabalhadores rurais expostos a pesticidas, estão listados os exames laboratoriais que

facilitam o diagnóstico de agravos à saúde desta classe de trabalhadores. Dentre os exames

listados estão o hemograma, que avalia o funcionamento da medula óssea, o perfil hepático,

com a análise das enzimas transaminase asparto aminotransferase (ASAT) e a transaminase

alanina aminotransferase (ALAT), gama-GT, acetil transferase, responsável por hidrolisar o

excesso do neurotransmissor acetil-colina (SILVA, 2017), a glicemia, o perfil lipídico,

dosagens de ureia e cretinina, além de exames de imagem, que auxiliem no diagnósstico de

contaminação dos trabalhadores rurais por pesticidas.

No presente estudo foram realizados os seguintes exames laboratorais: hemograma,

dosagens de ALAT, ASAT, acetil colinesterrase, glicemia e perfil lipídico. Os resultados destes

exames foram avaliados de acordo com os valores de referência fornecidos pelos laboratórios

Tabela 2 Valores de referência fornecidos pelos Laboratorios LACES e Sigma

Feminino Masculino

Média V.R* Média (DP) V.R*

Hemácia 4,92 tera/L (±1.27) 4,6 tera/ L (4,0 – 5,2) 4,87 tera/L 9(±1,28) 4,9 tera/L (4,5 – 5,3

Hematócrito 42.52% (±13,13) 41% (36 – 46) 42.49% (±12) 47% (41 – 53)

Hemoglobina 14,69 g/dL (±18,69) 14,0 g/dL (12,0 – 16,0) 17,070g/dL (±18,89) 4,9 g/dL (4,5 – 5,3)

VCM 83,59 fL (±10,0) 90 fL (80 – 100) 95,29 fL (±10,1) 88 fL (78- 98)

HCM 28,47 pg (±11) 30 pg (26 – 34) 30,29 pg (±11) 30 pg(25 – 35)

CHCM 31,32 g/dL (±7,74) 34 g/dL (31 – 37) 31,15 g/dL (±7,84) 34 g/dL (31 – 37)

RDW 12.95% (±4.43) 10 a 15 % 12.84% (±3.87) 10 a 15 %

Leucocitos 6.543/mmm3 (±3.75) 3.500 a 10.000/mmm3 6.588/mmm3 (±3.798) 3.500 a 10.000/mmm3

Linfócitos 1.928/mmm3 (±1.025) 900 a 3.300/mmm3 2.024/mmm3 (±1.039) 900 a 3.300/mmm3

Monócitos 322/mmm3 (±133) 90 a 800/mmm3 319/mmm3 (±134) 90 a 800/mmm3

Plaquetas 203.967/mmm3 (±73) 150.000 a

450.000/mmm3 202/mmm3 (±74)

150.000 a

450.000/mmm3

Colesterol 183,06 mg/lL (±58,36) > 239 mg/lL 181,53 mg/lL (±58,84) > 239 mg/lL

Triglicérides 143,121 mg/lL (±105) > 200 mg/dL 142,19 mg/lL (±106) > 200 mg/dL

HDL 44,58 mg/lL (±13.19) < 40 mg/dL 44,18 mg/lL (±13,35) < 40 mg/dL

LDL 112,59 mg/lL (±53.6) > 150 mg/dL 111,82 mg/lL (±53,91) > 150 mg/dL

VLDL 28,89 mg/lL (±20.79) < 30 mg/dL 28,72 mg/lL (±20,94) < 30 mg/dL

Colinesterase 7192 U/L (±2784) 4.200 a 10.800 U/L 7142 U/L (±2815) 4.200 a 10.800 U/L

AST 21 U/L (±16.13) > 31 U/L 20 U/L (±16) > 31 U/L

ALT 21 U/L (±23.43) > 32 U/L 21 U/L (±16) > 32 U/L

Glicemia 92 mg/lL (±33.59) >99 mg/dL 91,47 mg/lL (±33) >99 mg/dL

Quanto aos resultados do hemograma, houve poucas alterações, destacando leucopenia,

anemia leve e plaquetopenia (Figuras 7 e 8), corroborando com o estudo de Cattelan (2017) que

48

analisou 152 trabalhadores rurais do município de Santiago, no Rio Grande do Sul, que além

das alterações citadas acima, encontraram leucocitose e monocitose.

Figura 8. Hemograma dos Sojicultores

49

Figura 9. Leucograma – Série branca dos Sojicultores

Em uma análise geral, o presente estudo detectou que os valores hematológicos dos

sojicultores estão dento da normalidade (Tabela 8 anteriormente descrita), também como

demonstrado por Cattelan (2017) e Alves (2016). O hemograma é um dos exames mais úteis

para auxiliar o diagnóstico médico, pois consegue avaliar casos de desnutrição, anemias,

leucemias, parte imunológica, pela série branca, sendo considerado um exame pouco invasivo,

além de ser o exame mais pedido pelo SUS (FAILACE, 2015).

O pefil lipídico e glicemia ds sojicultores goianoas forma apresentados na figura 10

Quanto ao perfil lipídico dos sojicultores, foram obtidas mais informações sobre o hábito de

vida destes trabalhadores. Neste contexto, 10,8% dos sojicultores possuíam o colesterol

alterado, 18% possuíam triglicérides alterados, 9% possuíam o colesterol HDL alterado, 18 %

possuíam o LDL alterado, 35% possuíam o VLDL alterado e 23% apresentaram o aumento da

glicemia, caracterizando o pré-diabetes, sendo que somente um sojicultor tinha conhecimento

de se ter a doença (Figura10). Em uma análise geral, o presente estudo demonstrou que os

valores do perfil lipídico dos sojicultores estão dento do normal (Tabela 8), corroborando com

os dados de Cattelan (2017), Addad (2015) e Matos & Ladeia (2003). Cattelan (2017)

demonstraram que 16% dos trabalhadores rurais estavam com o colesterol alterado e 36%

possuíam triglicérides alterados.

50

Figura 10. Alterações dos perfis lipídicos e glicêmicos detectados em sojicultores de municípios

goianos.

Pesticidas das classes organofosforados e carbamatos tem a capacidade de inibir a

enzima acetilcolinesterase (AChE). Portanto, a dosagem dessa enzima, pode indicar

intoxicação a esses pesticidas (CREMONESE, 2014). A enzima AChE, tem a função de

hidrolisar o neurotransmissor acetil-colina que transmite a mensagem sináptica colinérgica e

está presente no sistema nervoso central e periférico, assim, o pesticida age como um

anticolinesterásico, o que retarda a hidrólise da acetil-colina, fazendo com que ela permaneça

mais tepo na fenda sináptica (CREMONESE, 2014; ARAUJO et al., 2016).

No presente estudo, 2,7% dos sojicultores apresentaram aumento da enzima

acetilcolinesterase (Figura 11). Em uma análise geral, o presente estudo demonstrou que os

valores da AChE dos sojicultores também estão dentro da normalidade (Tabela 8). No entanto,

no estudo de Cremonese (2014), que avaliou 275 trabalhadores rurais, do município de

Farroupilha, no Rio Grande do Sul, 26,5% apresentaram a inibição da enzima AChE, o que

difere do resultado apresentado nesse trabalho.

1.35% 1.35%0.00%

2.70%

6.76%

9.57%9.46%

16.21%

14.86%

28.37%

13.40%

Colesterol Triglicérides HDL LDL VLDL Glicemia

Feminino % Masculino % Ambos Total

51

Figura 11. Distribuição das dosagens da enzima acetilcolinesterase (AChE) 441 em sojicultores

de municípios goianos

Neste estudo foram obtidos resultados satisfatórios das dosagens de ASAT e ALAT

em 57 sojicultores. Sabe-se que estas enzimas são utilizadas para análise da função hepática,

em uma análise geral foi demonstrado que os valores destes marcadores de função hepática

também estão dentro da normalidade (Figura 12). Vale ressaltar que o metabolismo dos

pesticidas ocorre principalmente no fígado, e vários estudos demosntraram que a o excesso da

ingestão de drogas, produtos químicos ou pesticidas pode levar ao aparecimento de alterações

nos exames bioquímicos e histopatológicos do fígado, achados não detectados neste estudo.

Raddi, Dayanand & Anikethana (2015) relataram que 85% dos sojicultores que

sofreram envenenamento por pesticidas possuíam ASAT < 40 IU/L e ALAT < 40 IU/L, e outros

estudos, não focados no envenenamento a pesticidas, também, relataram o aumento dos niveis

sericos de ASAT e ALAT em trabalhadores rurais (AL-SARAR et al., 2009; DAYANAND et

al., 2015; RICHARD et al., 2016; GOYAL et al., 2017). No entanto, neste estudo, somente 11

(14,86%) sojicultores tiveram aumento da ASAT e 15 (20,27%) sojicultores tiveram aumento

da ALAT (Figura 9).

52

Figura 12. Distribuição dos valores alterados de ALAT e ASAT, nos sojicultores, de acordo

com o sexo.

5.4. Análises moleculares dos polimorfismos nos genes CYP2E1 e OGG nos gupos

exposto e não exposto

O gene CYP2E1 pertencente à família do citocromo P450, codifica uma enzima que é

fundamental para o metabolismo do álcool, atuando na fase I do metabolismo (LU et al., 2017).

Um dos polimorfismos mais estudados desse gene é o rs2031902 que está associado ao aumento

do risco para o desenvolvimento de cânceres colo retal, mama, pulmão e cabeça e pescoço, em

diversos estudos (ROSSINI et al., 2007; PENG et al., 2013; HABENSCHUS et al., 2014; XU

et al., 2016; SUTRISNA, 2016).

No presente estudo houve diferenças significativas na distribuição das frequências do

polimorfismo rs2031920, entre os grupos exposto e não exposto (p =0.002) (Tabela 9),

demostrando que 24,3% dos sojicultores tem o alelo mutado. A alta prevalência de consumo de

bebidas alcoólicas entres os sojicultores (56,8%), associadas à exposição a pesticidas, pode

aumentar a suscetibilidade para o desenvolvimento de determinadas doenças, uma vez que o

polimorfismo rs2031920, tem grande importância na metabolização do álcool e também atua,

na metabolização de componentes químicos, como os pesticidas. Isso ocorre, pois, o

polimorfismo rs2031920 é capaz de aumentar a atividade transicional da enzima CYP2E1,

influenciando a carcinogênese, estando associado ao aumento da susceptibilidade para o

desenvolvimento de alguns tipos de cânceres, especialmente os tumores de cabeça e pescoço

(PENG et al., 2013; HABENSCHUS et al., 2014; XU et al., 2016; SUTRISNA, 2016; ALVES,

2017).

1.35%

13.51%14.86%

0.00%

20.27% 20.27%

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

Feminino Masculino Total

AST ALT

53

Embora os níveis de CYP2E1 sejam parcialmente determinados por fatores genéticos,

esta enzima é altamente induzível pelo álcool e outros fatores, e sua síntese pode ser inibida por

constituintes alimentares como descrito por Oneta et al. (2002) e Perocco et al. (2006), não

sendo possível controlar esses efeitos neste estudo. A baixa prevalência do alelo mutado (T)

identificado nesse estudo, corrobora com a distribuição da frequência deste polimorfismo na

população de Goiás, como demonstrado por Alves, 2017 e Ramos et al., 2016.

Nos trabalhos de Jiménez-Garza et al. (2017) e de Fang et al. (2017) que analisaram o

polimorfismo rs2031920 em indivíduos expostos ao benzeno, em um estudo do tipo caso

controle, demonstraram resultados similares aos encontrados neste estudo, sendo a distribuição

desse polimorfismo distinta entre os grupos exposto e não exposto.

Tabela 9. Frequência dos SNPs encontrados nos genes CYP1E2 e OGG1 nos grupos exposto e

não exposto. Grupo Genótipo X2 p EHW p

rs2031920 (CYP2E1)

CC CT TT

Exposto 75,7% (56) 24,3% (6) 0% 9,9 0,002 1

Não exposto 93,2% (83) 6,7% (18) 0%

rs1052133 (OGG1)

CC CG GG

Exposto 77.02% (57) 18,9% (14) 4,1% (3) 2,3 0,32 0,09

Não exposto 66.29 (22) % 28,1% (61) 5,6% (6)

rs293795 (OGG1)

CC CT TT

Exposto 72,9% (54) 22,9% (17) 4,1% (3) 0,7 0,71 0,005

Não exposto 68,5% (61) 24,7% (22) 6,7% (6)

Teste Qui-Quadrado

A exposição a pesticidas pode acarretar lesões no DNA, podendo resultar em mutações

que podem desencadear diversas doenças, como o câncer (FRANCO 2016; ÇAYIR et al.,

2017). O sistema de reparo do DNA tem a função de corrigir esses erros, além de ter um papel

crucial na integridade, estabilidade e manutenção do DNA genômico (DUAN et al., 2012,

ÇAYIR et al., 2017). Existem mais de 130 genes envolvidos nas cinco principais vias de reparo

de DNA, entre eles o OGG1, que está entre os principais genes da via de reparo por excisão de

nucleotídeos (REN) (DUAN et al., 2012). Essa via repara danos por excisão de nucleotídeos,

incorporados erroneamente, que podem ser causadas por espécies reativas de oxigênios

(EROS), resultantes das transformações de componentes químicos, incluindo os pesticidas

54

(DUAN et al., 2012 CAMPALANS, 2015), uma vez que o OGG1 codifica uma enzima

chamada oxoguanina DNA glicosilase, responsável pela excisão de 8-oxoguanina, uma base

que surge como resposta à exposição do DNA a espécies reativas de oxigênio (KARAHALIL

et al., 2008; LI et al., 2008; Z. LI et al., 2011; DUAN et al., 2012 CAMPALANS, 2015).

Existem relatados 25 SNPs no gene OGG1 capazes de ocasionar mudanças de

aminoácidos na proteína, mas somente o polimorfismo rs1052133 tem sido investigado em

relação ao risco de câncer, em particular o câncer no pulmão (KARAHALIL et al., 2008; LI et

al., 2008; Z. LI et al., 2011; DUAN et al., 2012).

Neste estudo forma avaliados 2 SNPs em OGG1, o rs1052133 e o rs293795. As

frequências de distribuição destes dois polimorfismos não foram distintas entre os grupos

exposto e não exposto (Tabela 9). No estudo de Lupo et al. (2012), no qual avaliaram a interação

dos poluentes do ar, em 98 crianças expostas a solventes clorados, foi constatado que o

polimorfismo rs293795 aumentou consideravelmente o risco do desenvolvimento de

meduloblastoma (LUPO et al., 2012).

No nosso estudo foi constatado que os sojicultores estão expostos a uma complexa

mistura de pesticidas, o que os tornam um grupo susceptível a sofrem lesões no DNA, podendo

acarretar no surgimento de doenças como o câncer, e a avaliação dos polimorfismos capazes de

alterar o produto de genes, como os de de metabolização e de reparo de DNA, são de grande

importância para a proteção da saúde dos trabalhadores ocupacionalmente expostos a

pesticidas.

5.4 Avaliação do dano genômico pelo ensaio cometa nos grupos exposto e não exposto

Para avaliação dos danos genômicos nos grupos de sojicultores e grupo controle

foram considerados os seguintes parâmetros do ensaio cometa: Comprimento da cauda (TL, do

inglês Tail lengh), Momento da cauda de Olive (OTM, do ingle Olive tail moment) e

porcentagem de DNA na cauda (%DNA). Estes parâmetros foram submetidos a uma Análise

de Componentes Principais (PCA, do ingles Principal Component Analysis) (Figura 13) o que

demonstrou que estas variáveis não estão sobrepostas, o que permitiu a análise individual de

cada uma delas, indicando as lesões ao DNA dos grupos analisados neste estudo.

55

Figura 13. Análise de componentes principais das variáveis: Comprimento da cauda (TL, do

inglês Tail lengh), Momento da cauda de Olive (OTM, do ingle olive tail moment) e

porcentagem de DNA na cauda (%DNA) nos grupos exposto e não exposto

As análises de dano no DNA, na comparação dos grupos de estudo, demonstraram

diferenças estatisticamente significativas (p<0.05) nos três parâmetros analisados do ensaio

cometa (TL, OTM, %DNA). Os parâmetros demonstram que existem mais danos no grupo

exposto do que no grupo controle (Figura 14).

56

Figura 14. Frequência de danos ao DNA nos grupos caso e controle. P<0,05; Nexp: Grupo não

exposto; Exp: Grupo Exposto; %DNA. A: Porcentagem de DNA na cauda (%DNA), B:

Momento da cauda de Olive (OTM) e C: Comprimento do comprimento da cauda (TL).

A

B

C

57

Vale ressaltar que os danos ao DNA associados com a exposição a diversas classes de

pesticidas, como os encontrados neste estudo, também foram demonstrados por diversos

estudos, tais como Jacobsen-Perreita et al. (2018) que avaliaram 50 trabalhadores rurais do

município de Antônio Carlo em Santa Catarina, no qual foi demonstrado que o dano no DNA

dos trabalhadores rurais foi maior no grupo exposto do que no grupo não exposto (p=0.0001).

No estudo de Sutris et al. (2016) no qual analisaram 180 crianças que habitavam uma ilha

agrícola na Malásia, expostas a pesticidas; Fischer et al. (2015) ao comparar em um estudo

caso/controle, a exposição ocupacional a diferentes tipos de pesticidas, dos indivíduos

expostos; Benedetti et al. (2013) que analisaram 127 sojicultores de Espumoso, Rio Grande do

Sul, Brasil; na pesquisa de Khayat et al. (2013) na qual avaliaram 41 trabalhadores rurais que

atuavam em vários tipos de culturas, em municípios do Estado de Goiás; Kaur et al. (2011) que

analisaram 210 trabalhadores rurais do leste da Índia. Em todos esses estudos se observou dano

ao DNA bastante significativo, estando associado com a exposição, ocupacional ou não, a

pesticidas.

Em outro estudo (CABRAL, 2014) foi apresentado o alto potencial genotóxico ligado

à exposição ocupacional a uma mistura de pesticidas em trabalhadores rurais produtores de

melancia do município de Vitória de Santo Antão – Pernambuco. Naquele trabalho, o autor

reportou a prática de 64 trabalhadores em burlar a ANVISA (órgão brasileiro competente por

avaliar os resíduos de pesticidas na alimentação humana) que impede o uso de pesticidas com

classificação toxicológica IV, em frutas e verduras destinadas para consumo in natura. Os

produtores, impossibilitados de usar pesticidas nível IV optavam por uma mistura de 10 a 18

pesticidas diferentes com classificação I e II e, portanto, não acusados pelos testes de controle

de qualidade aplicados pela ANVISA. Ainda no trabalho de Cabral (2014), o potencial

altamente genotóxico foi revelado pelo ensaio cometa e o autor apontou um risco de exposição

ainda maior para populações humanas expostas indiretamente devido ao consumo destes

alimentos. Outro fator importante apresentado por Cabral (2014), foi que os testes ligados a

segurança alimentar aplicados pela ANVISA leva a detecção de pesticidas com classificação

toxicológica III e IV para frutas e verduras destinadas para consumo in natura para a concessão

do selo DIPOV (Inspeção de Produtos de Origem Vegetal), de responsabilidade do MAPA

(Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). Dessa forma, as melancias produzidas

pelos 64 trabalhadores apresentavam o selo DIPOV de qualidade, atestando estarem livres do

uso de pesticidas.

58

Quando foram associadas as variáveis idade, consumo de álcool, uso de cigarro,

polimorfismos em CYP2E1 e OGG1, com os resultados dos danos no DNA, nos grupos exposto

e não exposto, observou que nehuma das variáveis influenciou as lesões encontradas no DNA.

Rohr et al. (2011) avaliaram trabalhadores rurais da cidade de Caxias do Sul no Rio Grande do

Sul, comparando o polimorfismo rs1052133 do gene OGG1 de 108 trabalhadores rurais (grupo

exposto) e 65 controles, com os resuldados do ensaio cometa e encontrou uma associação

estatisticamente significativa (p=0.032), o que não corrobora com os achados do nosso estudo.

Quando os dados de estilo de vida dos grupos exposto e não exposto foram avaliados,

foram observadas diferenças significativas, em relação ao consumo de álcool e faixa etária

(Tabela 6). Porém, quando esses dados foram analisados, associados com os polimorfismos nos

genes CYP2E1 e OGG1, além dos achados do ensaio cometa, não observou nenhuma influência

dessa diferença, entre os grupos, nas duas variáveis.

Portanto, no presente estudo foi observado que os pestividas aos quais os sojicultores

estão expostos foram capazes de induzir danos ao DNA detectados pelo ensaio cometa em

sangue periférico, observados pelo aumento de TL, OTM, %DNA. Desta forma, foi possível

verificar o efeito genotóxico da exposição ocupacional nos sojicultores deste estudo.

59

Conclusão

Nesta pesquisa, os sojicultores estudados foram expostos aos pesticidas nos municípios

de Goiânia e entorno, pelo contato direto com herbicidas, fungicidas, carbamatos, e

organofosforados, pelas práticas de preparo de mistura, aplicação por pulverização, limpeza

e/ou manutenção dos equipamentos e apresentaram riscos de instabilidade genética, avaliados

pelo ensaio cometa e alterações em suas avaliações bioquímica e hematológica. Assim, com

este estudo, foi concluído que:

• Os sojicultores avaliados apresentaram idade de 19 a 63 anos, sendo 21 mulheres

e 53 homens, dos quais 20,6% relataram hábitos de fumar e 56,8% relataram o

ato de consumir bebidas alcoólicas;

• O tempo médio de atividade agrícola variou de 8 meses a 32 anos (média de 10

anos);

• Dos 74 sojicultores expostos ocupacionalmente a pesticidas, 43 tinham contato

direto com pesticidas e relataram o uso de 48 pesticidas;

• Os pesticidas mais frequentes foram o glifosato com 14%, extra priori 11% e o

2,4 D com 10%;

• As formas de contato mais relatadas foram pelo preparo e a diluição dos

pesticidas (41.9%) e no armazenamento (40.5%);

• 100% dos sojicultores que sao expostos diretamente aos pesticidas relatam fazer

uso de luvas;

• 18,9% dos sojicultores relataram já terem sofrido intoxicação por pesticidas;

• Foram encontradas algumas alterações nos parâmetros bioquímicos e

hematológicos dos sojicultores que podem estar associados com o uso de

pesticidas;

• As frequências do polimorfismo do gene CYP2E1 (rs2031920) foram distintas

entre o grupo exposto ao não exposto (p =0.0016);

• As frequências do polimorfismo do gene OGG1 (rs1052133 e rs293795) não

foram distintas entre os grupos exposto e não exposto;

• Todos os parâmetros do cometa avaliados (%DNA, OTM e TL) foram

significativos entre o grupo exposto e não exposto (p>0.05), e não sofreram

influência da idade e consumo de bebidas alcoólicas;

60

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71

APÊNDICE I

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Título do Projeto: : Avaliação dos aspectos biológicos e ambientais da exposição a

agrotóxicos por trabalhadores rurais em municípios goianos.

Pesquisadores reesposáveis pelo projeto:

Doutoranda (pesquisadora responsável) : Fernanda Ribeiro Godoy M.Sc.

Orientador: Prof. Rogerio Pereira Bastos Dr.

Telefones: (62) 9829-8828 (Fernanda)

E-mail: Fernanda.rgodoy@gmail.com

A agricultura Brasileira vem crescendo com o decorrer dos anos e com isso a uso de

agrotóxico vem acompanhado esse crescimento para que se atende a demanda de produtos

agrícolas em quantidade e qualidade exigidas pelo mercado consumidor. Contudo esse aumento

do uso de agrotóxico exige muitos cuidados e informações para e minimização de riscos tanto

para o meio ambiente como para trabalhadores rurais que estão ocupacionalmente expostos ao

agrotóxicos.

O objetivo do estudo e científico e se baseia em realizar um estudo molecular de

trabalhadores agrícolas de municípios goianos expostos ocupacionalmente a pesticidas

avaliando os efeitos biológicos dessa exposição a fim de verificar prováveis alterações

genéticas analisando também o tempo e os tipos de agrotóxicos mais utilizados pelos

trabalhadores. O presente estudo contribuirá para se compreender os riscos de agravos a saúde

humana decorrente da exposição individual fornecendo subsídio para reforçar a necessidade de

adesão do trabalhador as condições de segurança ocupacional que visam a manutenção da saúde

física e a proteção contra o desenvolvimento de doenças ocupacionais. Assim compreender os

aspectos biológico subjacentes a exposição do sistema celular humano aos agrotóxicos

permitira uma maior proteção da saúde de trabalhadores agrícolas.

Prezado (a) senhor (a)

Por este documento você esta sendo convidado (a) a participar desse estudo. E também

informado (a) e esclarecido (a) sobre como se dará seu desenvolvimento para que então possa

decidir sobre a participação.

A participação e voluntaria e gratuita e implica basicamente em:

- Aplicação de questionário de estilo de vida;

72

- Coleta sanguínea

O questionário de estilo de vida ira abordar individualmente perguntas sobre fatores da

usa vida que possam estar correlacionados com o uso de agrotóxico e/ ou que possam colaborar

no entendimento dos resultados obtidos no seu exame laboratorial. A aplicação deste será

acompanhada pela equipe de pesquisa a qual auxiliará a compreensão. Contudo se durante a

aplicação o participante sentir qualquer desconforto lhe e garantida total liberdade para

interromper parcial ou totalmente o preenchimento do mesmo sem obrigações em justificar essa

decisão.

Sua entrevista – contendo dados que permitam sua identificação informações pessoais

e de trabalho – não serão conduzidas (sem sua autorização) a indivíduos não integrante da

equipe de pesquisa. Suas informações relatos e opiniões ficarão em segredo. O uso dessas

respostas será realizado diante de analise e enquadramento estatístico e/ou com conversão dos

seus dados identificatórios em códigos (que impeçam sua identificação). A partir de então os

resultados obtidos poderão ser apresentados e publicados desde que respeitada a garantia de

sigilo que lhe foi dada.

A coleta de sangue será realizada para obtenção do seu perfil bioquímico e hematológico

( baseado nas diretrizes para Atenção integral a Saúde do Trabalhador de complexidade

Diferenciada do Ministério da saúde agosto de 2006). Será realizada a coleta endovenosa de 20

mL de sangue.

Nenhuma pesquisa com seres humanos e livre de riscos. Contudo os procedimentos

envolvidos no presente estudo oferecem riscos mínimos aos participantes sendo eles:

possibilidade de aparecimento de hematoma pós-coleta e formação de edema. Mas caso ocorra

qualquer intercorrência devido a coleta os pacientes serão encaminhados ao serviço de

Atendimento Médico da Universidade Federal de Goiás.

Solicita-se para obtenção de resultados clinicamente fidedignos que o participante se

apresente: em jejum alimentar (de 10 a 13 horas não excedendo 14 horas de jejum) e que

informe o uso de medicamento ou presença de alguma doença.

As entrevistas e analise laboratoriais ficarão sob guarda da pesquisadora responsável

por 5 (cinco) anos e não será permitido acesso de terceiros (além da equipe de pesquisa) a ele.

Ressalta que todos os dados que permitam sua identificação pessoal serão mantidos em sigilo

profissional e cientifico. Sendo-lhe garantido que todos os resultados aqui obtidos serão

utilizados somente para estudo cientifico e não irão prejudicar em algum tratamento que o

participante já esteja submetido (a) nem tão pouco na sua condição profissional.

73

Sua participação no estudo não sujeita a equipe de pesquisa te fornecer tratamento a

qualquer enfermidade que possa vir a ser identificada.

Com relação a indenização diante de eventuais danos decorrente da pesquisa você

poderá buscar a justiça e o que foi decidido judicialmente será acatado pelo pesquisador.

Mesmo após a assinatura desse termo você tem total liberdade de desistir ou de

interromper sua colaboração nesse estudo no momento em que desejar (até dada a publicação)

sem precisar se justificar. Em que a desistência do participante não trará prejuízo algum ao seu

trabalho nem a seu bem-estar.

Sua colaboração será de extrema importância para o êxito desta pesquisa pela qual

agradecemos de antemão.

Declaro verdadeiras as informações supra citadas

________________________________________________

Fernanda Ribeiro Godoy

Doutoranda

Pesquisadora Responsável

________________________________________________

Assinatura do participante

Eu_________________________________________________________________________

______RG no _____________________ Nacionalidade _________________________ Idade

___________

Endereço

__________________________________________________________________________

Declaro ter recebido e compreendido todas as informações sobre o estudo Avaliação dos

aspectos biológicos e ambientais da exposição a agrotóxicos por trabalhadores rurais em

municípios goianos. E por esta com concordo de livre espontânea vontade em participar do

estudo - Declaro que foram dadas todas as informações necessárias e que foram esclarecido

todas as duvidas por mim apresentadas

_____________________________________________

Assinatura do participante

74

APÊNDICE II

Questionário

Título do projeto: Avaliação dos aspectos biológicos e ambientais da exposição a agrotóxicos

por trabalhadores rurais em municípios goianos.

IDENTIFICAÇÃO

Data de Nascimento:___/___/____|Idade: __________anos| Peso:_________ Kg|

Altura:_________ m

Endereço:___________________________________________________________________

No_____

Bairro:________________________________Cidade:______________________Estado:___

________

Telefone:( )__________________________ Celular:( ) _________________________

Email:

___________________________________________________________________________

Estado Civil:

|___| Solteiro |___| Casado |___| Viúvo |___| Separado |___|

Outro:_____________________________

Escolaridade:

|___| E. Fundamental |___| E. Médio |___| E. Superior |___| E. Técnico |___|

Outros:_______________

Profissão: |___| Agricultor |___| Outros: _____________________

Região de atuação:____________________________________________________________

ESTILO DE VIDA

1-Possui Alguma Doença?: |___| Sim |___| Não.

Quais?:____________________________________ ___________________________

2-Faz uso de algum medicamento? |___| Sim |___| Não.

Quais?:______________________________

3- Tem ou já teve Câncer?: |___| Sim |___| Não.

Tipo?:_______________________________________

75

Quimioterapia?: |___| Sim |___| Não. No de sessões?: ___________Radioterapia?: |___| Sim

|___| Não. No de sessões?: ___________. Faz uso de algum

medicamento?:_______________________________________________________________

4-Possui algum defeito de nascimento/ desordem genética hereditária?: |___|Sim |___|Não

Quais:______________________________________________________________________

5-Histórico Familiar de: |___|Diabetes |___|Alergias |___| Hipertensão |___| Câncer |___|

Aborto |___| Alterações Congênitas|___|

Outros:__________________________________________________

6-Você e/ou sua esposa possui (em) dificuldade para engravidar?: |___|Sim|___|Não.

Se sim

qual(is):____________________________________________________________________

7-Possui Filho(s)?: |___| Sim |___| Não.

Se sim quantos?: ____________________________________

Se sim algum apresenta problemas de saúde?: |___| Sim |___| Não.

Se sim qual(is): _______________________________________________________

8-Teve algum filho com nascimento prematuro: |___| Sim |___| Não

9-O (A) Sr. (a) fuma ou já fumou em média 1 cigarro charuto ou cachimbo diariamente pelo

menos por 1 ano?|___|Sim|___|Não. Se sim quantos por dia?: ____

10-Já fumou?: |___|Sim |___|Não. Se sim quantos fumava por dia?:____Parou faz quanto

tempo?:___

11-Faz consumo de bebidas alcoólicas?: |___| Sim |___| Não.

Se sim com qual frequência em números (1X2X3X):

|___| Diariamente; |___|dias na semana; |___|dias no mês; |___| Sazonalmente(datas especiais).

Quantidade em copos latas garrafas:_____

12-Ex-etilista (alcoólatra)?: |___| Sim |___| Não

Se sim fazia uso de bebida? :|___| Diariamente; |___|dias na semana; |___|dias no mês;

|___| Sazonalmente(datas especiais). Quantidade em copos latas garrafas:_____

13-Pratica exercícios físicos?: |___| Sempre |___| As vezes |___| Nunca

14-Possui dependência Química? (Uso de algum tipo de Drogas ilícitas): |___| Sim |___| Não.

Se Sim qual(is)?:______ ______________________________________________________

15-Possui histórico de dependência Química na Família?: |___| Sim |___| Não.

76

MANUSEIO DE PESTICIDAS

16-Atividade agrícola principal?: |___| Plantação |___| Trato com animais |___|

Outros_____________

17-Tempo de atividade agrícola:

________________________________________________________

18-Tipo de culturas produzidas: |___| Soja |___|Milho |___| Cana |___| Sorgo |___| Tomate |___|

Arroz |___| Feijão |___|Horta |___|

Outros:______________________________________________________

19-Faz Uso de Pesticidas (Agrotóxico):? |___| Sim |___| Não

Se sim Qual (is)?:

___________________________________________________________________

20-Como se da o seu contato com os Pesticidas (agrotóxicos)?:

|___| Preparo (diluição) |___| Armazenamento |___| Carga/Descarga do

produto

|___| Aplicação/Pulverização |___| descarte de embalagens |___|Transporte

|___| Acompanha/auxilia a aplicação |___|Limpeza/manutenção dos equipamentos utilizados

|___|

Outros:_____________________________________________________________________

21-Qual a frequência do seu contato com o pesticida (agrotóxico)?:

|___| Uma vez na semana |___| A cada 15 dias |___| Uma vez por mês |___|

Outros________________

22-Quando foi seu ultimo contato com pesticidas (agrotóxico)?:

_______________________________

23-Qual tipo de equipamento utilizado para a manipulação e ou aplicação de pesticidas

(agrotóxico)?:

___________________________________________________________________________

24- Como são armazenados os pesticidas (agrotóxico)?: ________________________

25-Como são descartados as embalagens dos pesticidas

(agrotóxicos)?:__________________________

26-Faz uso de EPI’s durante a manipulação e ou aplicação de pesticidas (agrotoxico)?:

|__|Sim|___|Não

Se sim quais EPI’s e com qual frequencia voce faz o uso:

77

EPI’s Frequência

EPI’s Frequência

As vezes Sempre As vezes Sempre

|___| Luvas |___| Boné ou Chapéu

|___| Botas |___| Calças

|___| Mascara |___| Camisa de Manga

|___| Óculos Outros:

|___| Macacão Outros:

Se não Porque?

_____________________________________________________________________

27- Tem conhecimento sobre a importancia do uso de EPI’s? |___|Sim|___|Não

28- Com qual frequência tem apresentado os sintomas abaixo?

Sintomas

Frequência

Sintomas

Frequência

Nunca As

vezes Sempre

Apos

Contato Nunca

As

vezes Sempre

Apos

Contato

Assintomático Alteração de memoria

Alteração de Sonos Alteração da vida Sexual

Alucinação Cansaço fácil nas pernas

Chiadeira torácica Bradicardia

Confusão Mental Diarreias

Dor de Cabeça Falta de apetite

Formigamento MS Formigamento MI

Fotofobia Irritação da pele

Fraqueza muscular Irritação de mucosa

Hipertensão Náusea/ Vômito

Incontinência fecal Salivação

Incontinência urinaria Sangramento

Irritabilidade Suor excessivo

Lacrimejamento Taquicardia

Tontura Tosse

Visão turva Convulsões

Tremor Falta de ar

Outros:

Percebe alguma relação entre o aparecimento dos sintomas e o contato com pesticida (agrotóxico)?: |____| Sim |____| Não

29- Você já sofreu intoxicação?: |____| Sim |____| Não. Se sim quanto

tempo?:_________________

Se sim quais sintomas você apresentou?: |____| Gastrointestinais |____| Cardiovasculares |____|

Neurológicos |____| Respiratórios |____| Alterações na pele |____|

Outros:_______________________

78

Se sim onde foi o dia o diagnóstico?: |____|Hospitalar |____|Ambulatorial |____|

Outros:___________

Se sim qual o tratamento

adotado:_______________________________________________________

79

Anexo I