efeitos da fluoxetina na periodontogÊnese: anÁlise … · vença assim mesmo. se você é honesto...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA
EFEITOS DA FLUOXETINA NA PERIODONTOGÊNESE: ANÁLISE
HISTOLÓGICA E HISTOMORFOMÉTRICA EM RATOS
Luciana Silva Regueira
Recife – PE
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA
EFEITOS DA FLUOXETINA NA PERIODONTOGÊNESE: ANÁLISE
HISTOLÓGICA E HISTOMORFOMÉTRICA EM RATOS
LUCIANA SILVA REGUEIRA
Dissertação apresentada ao Colegiado do programa de Pós-
Graduação em Clínica Integrada do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como
requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Clínica
Odontológica Integrada.
Orientadora: Profa. Dra. Liriane Baratella Evêncio
Co-orientador: Prof. Dr.: Danyel Elias Cruz Perez
Recife –PE
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITOR
Prof. Dr. Sílvio Romero Marques
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DIRETOR
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
COLEGIADO
Profa. Dra. Alessandra Albuquerque Tavares de Carvalho
Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes
Prof.Dr. Arnaldo de França Caldas Júnior
Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar
Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva
Prof.Dr. Danyel Elias da Cruz Perez
Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues de Almeida
Profa.Dra. Flavia Maria de Moraes Ramos Perez
Prof. Dr. Jair Carneiro Leão
Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
Profa. Dra. Liriane Baratella Evêncio
Profa. Dra. Lucia Carneiro de Souza Beatrice
Prof.Dr. Luiz Alcino Monteiro Gueiros
Profa. Dra. Maria Luiza dos Anjos Pontual
Prof. Dr. Paulo Sávio Angeiras Goes
Profa. Dra. Renata Cimões Jovino Silveira
Profa. Dra. Silvia Regina Jamelli
Profa. Dra. Simone Guimarães Farias Gomes
Prof. Dr. Tibério Cesar Uchoa Matheus
SECRETARIA
Oziclere Sena de Araújo
Recife, 15 de Fevereiro de 2013
Profa. Dra. SILVIA REGINA JAMELLI
Presidente
Profa. Dra. LUCIANA MARIA SILVA DE SEIXAS MAIA
1° examinador Orientador:
Prof. Dr. JOAQUIM EVÊNCIO NETO
2° examinador Mestranda:
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho aos meus pais Rose Regueira e Luiz Carlos Regueira.
“Muitas vezes as pessoas
são egocêntricas, ilógicas e insensatas.
Perdoe-as assim mesmo.
Se você é gentil,
as pessoas podem acusá-lo de interesseiro.
Seja gentil assim mesmo.
Se você é um vencedor,
terá alguns falsos amigos e alguns inimigos verdadeiros. Vença assim mesmo.
Se você é honesto e franco,
as pessoas podem enganá-lo.
Seja honesto e franco assim mesmo.
O que você levou anos para construir,
alguém pode destruir de uma hora para outra.
Construa assim mesmo.
Se você tem paz e é feliz,
as pessoas podem sentir inveja.
Seja feliz assim mesmo.
O bem que você faz hoje,
pode ser esquecido amanhã.
Faça o bem assim mesmo.
Dê ao mundo o melhor de você,
mas isso pode não ser o bastante.
Dê o melhor de você assim mesmo.
Veja você que, no final das contas,
é tudo entre você e Deus.
Nunca foi entre você e os outros.”
(Madre Tereza de Calcutá)
RESUMO
Objetivo: O objetivo do estudo foi analisar a periodontogênese de ratos cujas mães
foram tratadas com fluoxetina, durante a gestação e lactação. Metodologia: Ratas
prenhes da linhagem Wistar foram distribuídas em quatro grupos de estudo. Nos grupos
controle foi administrada solução de cloreto de sódio a 0,9% por via oral durante todo o
período de gestação (CG, n=6) e durante a gestação e lactação no grupo CGL (n=6).
Durante o mesmo período, foi administrada fluoxetina na dose de 20mg/kg por via oral
nos grupos tratados durante apenas a gestação (grupo FG, n=6) e durante a gestação e
lactação (FGL, n=6). Aos 25 dias de vida, foi realizada a anestesia seguida da perfusão
e coleta da região do primeiro molar superior. As peças foram processadas para
microscopia de luz, coradas pela hematoxilina/eosina, picrosirius red e tricrômico de
Masson, e analisadas ao microscópio óptico para a realização de análises histológicas e
histomorfométricas. Sob microscópio de luz polarizada avaliou-se qualitativamente o
colágeno periodontal. Resultados: A administração da fluoxetina apenas no período de
gestação não foi relacionada a alterações na periodontogênese dos animais avaliados.
No entanto houve uma diminuição da quantidade de fibroblastos (p=0,006),
osteoblastos (p=0,027) e cementoblastos (p=0,001) dos animais do grupo FGL. Foi
detectada a presença concomitante do colágeno tipo I e tipo III no ligamento periodontal
e osso alveolar de todas as amostras. Conclusão: Esses achados sugerem a sensibilidade
dos tecidos periodontais à fluoxetina, sendo a interferência dessa droga sob a
periodontogênese de ratos dependente do tempo de exposição.
Palavras chave: Periodonto. Fluoxetina. Serotonina. Rato. Germe de dente.
ABSTRACT
Objective: The aim of this study was to assess the periodontogenesis of rats whose
mothers were treated with fluoxetine, a selective inhibitor of serotonin reuptake, during
pregnancy and breastfeeding. Design: Pregnant Wistar rats of the control groups
received orally sodium chloride solution 0,9% during pregnancy (CG) and during
pregnancy and breastfeeding (CGL) while in the same period the experimental groups
(FG and FGL) received orally fluoxetine hydrochloride 20mg/kg. In the 25 day of life,
the offspring were anaesthetized for removal of the maxilla in the region of the first
molar. The pieces were processed for conventional paraffin protocol, stained in HE,
picrosirius red and trichromy of Masson and were observed on optic microscopy to
perform the histological and histometric analysis. Under polarized light microscopy,
periodontal collagen was evaluated by picrosirius stained sections. Results: The
findings shows a decrease on the number of fibroblasts (p=0,006), osteoblasts (p=
0,027) and cementoblasts (p=0,001) in the periodontal ligament of the FGL group. No
changes were found on the animals treated with fluoxetine just during pregnancy (FG).
Conclusions: Conclusions: Fluoxetine caused changes in the periodontium cells of
animals exposed to the drug only during pregnancy and lactation. These findings
suggest the interference of fluoxetine in the cells of the periodontium is reversible and
time exposure dependent.
Key words: Periodontium. Fluoxetine. Serotonin. Rat. Tooth germ.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pelas graças e oportunidades concedidas e por
ser sempre meu guia.
Aos meus pais, minha irmã e toda família pelo apoio constante, conselhos e pelo
mais puro amor que eu sempre recebi e que foram fundamentais nas minhas conquistas.
Ao meu namorado Gabriel Perrusi e sua família pelo carinho, torcida e ajuda em
todo momento.
Agradeço à Universidade Federal de Pernambuco, na pessoa do reitor Anísio
Brasileiro de Freitas Dourado pela oportunidade e incentivo na área acadêmica.
A FACEPE e ao CNPq pelo apoio financeiro para a realização da pesquisa.
A minha orientadora Liriane Baratella Evêncio por ser um exemplo de pessoa,
professora e amiga. Muito obrigada por compartilhar sua sabedoria acadêmica e seus
ensinamentos da vida.
Ao meu co-orientador Prof. Danyel Elias da Cruz Perez e a Profa. Flávia Maria
de Morais Ramos-Perez pela dedicação e imensa contribuição no projeto, o trabalho em
equipe enriqueceu ainda mais minha experiência, muito obrigada.
Aos professores Joaquim Evêncio Neto, Adriana Fontes, Pedro Rolim, Mário
Ribeiro de Melo-Júnior, Luciana Maia, Belmira Lara da Silveira Andrade, Marcelo Reis
por disponibilizarem equipamentos e laboratórios para os procedimentos experimentais
da pesquisa, a ajuda de cada um agregou conhecimento técnico e científico e foi
fundamental para o andamento do projeto.
A Silvania Paz pela paciência na confecção das lâminas.
A toda equipe do biotério de cirurgia experimental da UFPE em especial a Sr.
Paulo pela atenção e dedicação no tratamento dos animais.
As minhas companheiras do dia a dia Priscylla Correia e Isabela Santiago por
todos os sufocos e alegrias que passamos juntas em prol das nossas pesquisas. Aos
alunos de iniciação científica Carlos Enrique de Holanda e Priscilla Suelen Carvalho.
Aos meus colegas do mestrado pela amizade que construímos e ajuda constante.
As minhas amigas pelos conselhos, apoio e carinho que dão forças para seguir em
frente.
A todos que participaram dessa conquista, meu sincero agradecimento.
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Figura 1: Fotomicrografias do periodonto correspondente ao terço médio da raiz
palatina de primeiros molares superiores de ratos com 25 dias de vida correspondentes
aos grupos controle na gestação (CG), fluoxetina na gestação (FG), controle na gestação
e lactação (CGL) e fluoxetina na gestação e lactação (FGL). Imagens coradas com HE,
tricrômico de Masson e picrosirius red. Observa-se as células que compõem as
estruturas do periodonto e os feixes de fibras do ligamento periodontal inserindo-se no
cemento e no osso alveolar. O: osso. LP: Ligamento Periodontal. D: Dentina. Barra de
aumento= 56µm.
Figura 2: Fotomicrografias do periodonto correspondente ao terço médio da raiz
palatina de primeiros molares superiores de ratos com 25 dias de vida correspondentes
aos grupos controle na gestação (CG), fluoxetina na gestação (FG), controle na gestação
e lactação (CGL) e fluoxetina na gestação e lactação (FGL). Cortes corados com
picrosirius red e analisados sob microscópio de polarização. Observa-se a
predominância das cores verde e amarela nas fibras colágenas do ligamento periodontal,
indicando a presença dos colágenos tipo III e tipo I respectivamente. No osso alveolar,
verificou-se a predominancia do colágeno tipo I (coloração vermelha). O: osso alveolar.
LP: Ligamento Periodontal. C: Cemento. Barra equivalente a 0.2mm.
Tabela 1: Avaliação da espessura do ligamento periodontal e da quantidade dos tipos
celulares do periodonto dos grupos CG e FG.
Tabela 2: Avaliação da espessura do ligamento periodontal e da quantidade dos tipos
celulares do periodonto dos grupos CGL e FGL.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 13
OBJETIVOS 20
REFERÊNCIAS 21
ARTIGO 26
RESUMO 27
INTRODUÇÃO 28
MATERIAIS E MÉTODOS 30
RESULTADOS 33
DISCUSSÃO 36
AGRADECIMENTOS 39
CONFLITO DE INTERESSE 39
APÊNDICE 40
REFERÊNCIAS 43
LEGENDA DAS FIGURAS 48
TABELAS 49
ANEXOS 51
13
INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA
Depressão gestacional X fármacos antidepressivos
Razões fisiológicas e psicológicas explicam por que as mulheres e,
principalmente as gestantes, estão inseridas no grupo de alto risco para o
desenvolvimento da depressão. 1, 2
Apesar das peculiaridades da mulher na gestação, o
não tratamento da depressão nesse período traz graves consequências à mãe e ao bebê,
como maior risco para pré-eclâmpsia, aborto espontâneo e prematuridade, retardo do
crescimento, além de alterações neuroquímicas, mentais e comportamentais nas
crianças. 3-5
Nesse contexto, riscos e benefícios do uso de drogas antidepressivas durante
a gestação e o aleitamento vêm sendo analisadas a fim de estabelecer os fármacos com
menor potencial teratogênico e causadores de efeitos adversos na gestação. Atualmente
os Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina (ISRS) compreendem a classe de
fármacos de primeira escolha, sendo os antidepressivos tricíclicos considerados de
segunda linha6. A fluoxetina, um ISRS, compreende uma das drogas mais utilizadas
tanto no tratamento de desordens psíquicas como para fins de emagrecimento.
Amostras de sangue do cordão umbilical foram obtidas de neonatos expostos à
fluoxetina no útero e mostraram um nível da droga equivalente a 60% do valor da mãe,
o que dá margens à realização de pesquisas que visem detectar possíveis efeitos
teratogênicos nos bebês expostos a essa droga. 7
A fluoxetina provoca o aumento plasmático do nível de serotonina e a redução
do fluxo sanguíneo uterino, o que causa uma menor oferta de oxigênio e nutrientes ao
bebê, prejudicando seu desenvolvimento.8 Segundo Chambers et al.
9 o maior risco à
anormalidades fetais e complicações perinatais pela exposição à fluoxetina acontece no
14
terceiro trimestre de gestação e inclui como uma das consequências desse tratamento o
baixo peso ao nascer.
Estudos experimentais mostraram que a administração da fluoxetina no período
gestacional provocou redução da contagem de neurônios do lobo frontal do bebê,
sugerindo uma possível indução de depressão nos fetos por alterações em seu
neurodesenvolvimento10
, além de prejuízo nos neurônios serotoninérgico. 11
Devido a sua longa meia vida, níveis plasmáticos relevantes de fluoxetina tem
sido reportado em neonatos expostos à droga na amamentação. 12, 13
Um estudo
prospectivo realizado em 2007 no Rio Grande do Sul mostrou que mulheres em
tratamento com a fluoxetina apresentaram um aumento significativo de prolactina. Este
aumento foi maior em mulheres com até 29 anos, que chegou a níveis considerados
patológicos, diminuindo de uma maneira inversamente proporcional com o aumento da
faixa etária. 14
Estudos prévios relacionam a fluoxetina com a fisiologia óssea de seus usuários
15 uma vez que a serotonina mostrou regular a diferenciação de osteoclastos
16 aumentar
a quantidade de osteoprotegerina (OPG) e diminuir o fator ativador de osteoclastos
RANKL 17
, enquanto que a fluoxetina obteve o oposto desse efeito. A administração
subcutânea de fluoxetina 10mg/ml durante a gestação de ratas provocou um reduzido
crescimento ponderal dos filhotes, bem como de sua massa corporal, massa femoral e
área de secção do disco. Os autores atribuem às alterações morfológicas observadas a
possível interferência da serotonina no metabolismo dos condrócitos. 18
Pouco há descrito na literatura sobre os efeitos dos inibidores seletivos da
recaptação da serotonina fluoxetina em estruturas orais. Cavalcanti et al.19
não
encontraram alteração no desenvolvimento da articulação têmporo-mandibular da prole
de ratas tradadas com fluoxetina a 10mg/ml, via subcutânea, durante a gestação. A
15
avaliação de possíveis interferências da administração dessa mesma dosagem de
fluoxetina na formação do esmalte dentário de ratos também não revelou nenhuma
diferença entre os grupos tratados e controle. 20
Papel da serotonina na morfogênese
As interferências no desenvolvimento fetal ocasionadas pelos ISRS são
embasadas pela influência da serotonina na embriogênese de diversos tecidos do corpo.
A serotonina 5-HT ou 5-hidroxitriptamina é uma indolamina, produto da hidroxilação e
carboxilação do aminoácido triptofano, produzida nos núcleos da rafe e lançada em todo
o cérebro. 21
Os níveis de serotonina cerebrais desempenham importantes papéis na
regulação do comportamento, humor, ansiedade, agressividade, depressão, sono, fadiga
e supressão de apetite. 22
A serotonina também é descrita como um sinal para o desenvolvimento
embrionário devido à sua ação indutora na proliferação e morfogênese tecidual,
diferenciação neuronal, migração celular, expressão de fatores de crescimento, adesão
celular e extracelular. 23, 24
Todos esses efeitos foram expressos em diversas áreas do
corpo inclusive no epitélio e mesênquima da região craniofacial.
A revisão de literatura realizada por Moiseiwitsch 25
permite postular que a
serotonina facilita a modulação da migração celular importante na formação da crista
neural, bem como na elevação do palato, na invaginação do dente no estágio de botão e
condensação da papila dental, por meio da ativação do citoesqueleto e da proliferação e
diferenciação realizada por receptores de superfície celular e sua transdução de
sinal associados. Através de cultura de células, foi possível detectar a presença de
receptores de absorção e possível síntese serotoninérgica em tecidos como linha do
palato, língua, proeminências maxilares e mandibulares e septo nasal, bem como na
16
papila dental durante o período ativo de morfogênese, podendo atuar como moduladores
desse evento. Ainda nesse estudo, verificou-se que a adição de fluoxetina ao meio de
cultura inibiu os sítios serotoninérgicos, comprovando que existe absorção de serotonina
nessas estruturas. 26
Epitélio da face, cavidade oral, arcos branquiais, porções oculares e cerebrais
também expressaram in vitro receptores serotoninérgicos com características
semelhantes àqueles encontrados em neurônios maduros. 27
Ao investigar o padrão de expressão dos receptores 5-HT para o
desenvolvimento do embrião do rato, Lauder et al. 28
verificaram malformações que
envolviam defeitos no tubo neural e no processo frontonasal advindas da exposição a
antagonistas do 5-HT. Os autores concluíram que o uso de antagonistas da serotonina
modula o papel desse neurotransmissor na morfogênese de diversas regiões
craniofaciais e podem exercer o mesmo efeito quando essas drogas são administradas
durante a gestação. No mesmo estudo, foram detectados receptores 5-HT em germes
dentários e mesênquima mandibular, além de endocárdio, músculo estriado e crista
neural.
Outro estudo in vitro verificou que a ausência de serotonina em meio de cultura
promoveu um desenvolvimento do germe dentário apenas até a fase de botão. Já a
adição de serotonina a esse mesmo meio estimulou o germe a se desenvolver para a fase
de sino de maneira dose dependente. Esse último efeito pôde ser revertido pela adição
de fluoxetina ao meio. 29
Os estudos de Bliziotes et al. 30, 31
demonstraram que tanto os osteoblastos como
os osteócitos de ratos são capazes de sintetizar a 5-HT, bem com expressam
componentes funcionais de receptores e transportadores serotoninérgicos. Estudo
recente realizado in vitro confirma o envolvimento da serotonina com as células ósseas,
17
mostrando que tanto os osteoclastos quanto os osteoblastos expressam triptofano
hidroxilase, enzima que catalisa o triptofano para a formação de serotonina. Essas
células também expressam o transportador de serotonina e o receptor serotoninérgico 5-
HTR1B. A fluoxetina mostrou inibir de forma dose-dependente a formação de
osteoclastos e a reabsorção, bem como inibir a mineralização pelos osteoblastos.
Entretanto, a droga não alterou a morfologia das células. 32
Entre os diversos receptores serotoninérgicos, o 5-HT2B é um dos mediadores
chaves da ação da serotonina durante o desenvolvimento. 33
Experimentos com o ganho
e a perda de função de genes que transcrevem o receptor serotoninérgico 5-HT2B
revelaram que a sinalização do5-HT2B é necessária para modular a forma e a função de
diversos elementos esqueléticos da mandíbula incluindo a sua articulação. 34
Antagonistas de alta afinidade desse subtipo de receptor serotoninérgico induziram
defeitos morfológicos na região do coração e no tubo neural. Esses tratamentos
antagônicos interferem na migração de células da crista neural craniana e induzem sua
apoptose. 35
A serotonina inibiu in vitro a expressão das proteínas extracelulares S-100B e
tenascina, moléculas importantes no desenvolvimento crânio-facial e que também
compõem diversas áreas do periodonto. A utilização de antagonistas da serotonina, no
entanto, não foi capaz de reverter esse efeito, exceto pela introdução da fluoxetina. 36
Utilizando a imunoistoquímica com anticorpos contra 5-HT e tirosina
hidroxilase, Noreval et al. 37
buscaram detectar a presença de 5-HT em fibras nervosas
simpáticas na cavidade oral. Os resultados desse estudo mostraram a co-existência da
serotonina e da tirosina hidroxilase na inervação do ligamento periodontal e no sulco
18
vestibular, estabelecendo uma correlação dos efeitos da serotonina e a morfogênese de
estruturas orais.
Periodontogênese
O periodonto de sustentação é composto por três tecidos: o cemento, que cobre a
dentina radicular; o osso alveolar, que envolve e suporta a raiz do dente; e o ligamento
periodontal, que abrange esses dois tecidos duros e funciona como uma espécie de rede
em que o dente está aninhado. 38 O folículo dentário, um fino tecido conectivo derivado
de tecidos ectomesenquimais, é o responsável pelas células indiferenciadas que dão
origem ao periodonto. 39
O ligamento periodontal é um tecido conectivo fibroso,
ricamente vascularizado e inervado, que possui populações heterogêneas de células e
serve para a fixação do dente na cavidade óssea e absorção de forças resultantes do
movimento do dente ou da mastigação.
Além disso, o ligamento periodonto exibe uma importante função
atuando como fonte de moléculas de sinalização e de células pluripotenciais que
contribuem para a homeostasia periodontal e sua regeneração. 40, 41
O cemento tem sua
matriz orgânica secretada pelos cementoblastos e contêm também matriz e fibrilas
depositadas pelos fibroblastos, ambas as células originadas de células
ectomesenquimais do folículo. 42
Existem dois tipos de cemento, o acelular encontrado
nos terços coronais e médios da raiz e o celular situado nas porções apical e
intrarradicular. 43
Kameyama 44
descreve o osso alveolar em ratos com 28 dias de vida e
encontrando formados a crista e a porção oclusal da superfície do osso alveolar,
enquanto que não foi verificada a formação do terço ósseo apical, uma vez que a raiz
não completou seu desenvolvimento, nesta idade, e encontra-se com o ápice
amplamente aberto.
19
Sabe-se que a gênese dos tecidos periodontais constitui um complexo evento do
qual fazem parte trocas de sinais seqüenciais e recíprocos entre os tecidos epiteliais e
mesenquimais. Substâncias como Proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs), fatores de
crescimentos de fibroblastos (FGF), folistatina, entre outras, integram uma rede de
sinais que regulam a proliferação de células tronco na alça cervical do germe dentário45
.
Conhecendo o processo de formação do periodonto e dos mecanismos que o
influenciam, o presente estudo teve o objetivo de expandir a literatura sobre os efeitos
da fluoxetina na formação do periodonto, utilizando para isso, análises histológicas e
histométricas do periodonto de ratos cujas mães foram tratadas com essa droga durante
a gestação e lactação.
20
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar, por meio dos aspectos morfológicos e histométricos, o periodonto de
sustentação de primeiros molares superiores de filhotes de ratas tratadas com a
fluoxetina durante a gestação e lactação.
Objetivos específicos
Observar aspectos relativos à morfologia celular, histoquímica e disposição
dos componentes do periodonto de inserção da prole de ratas tratadas com
fluoxetina durante a gestação e lactação.
Medir a quantidade de fibroblastos, cementoblastos, osteoblastos e
osteoclastos, bem como a espessura do ligamento periodontal da prole de
ratas tratadas com fluoxetina durante a gestação e lactação.
Identificar, através de microscópio de polarização, os tipos de colágenos que
constituem os tecidos do periodonto de sustentação da prole de ratas tratadas
com fluoxetina durante a gestação e lactação.
21
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26
ARTIGO
EFEITOS DA FLUOXETINA NA PERIODONTOGÊNESE: ANÁLISE
HISTOLÓGICA E HISTOMORFOMÉTRICA EM RATOS
Título abreviado: EFEITO DA FLUOXETINA NA PERIODONTOGÊNESE
LUCIANA SILVA REGUEIRA
Mestranda do programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal de
Pernambuco, Recife – Brasil.
PRISCYLLA GONÇALVES CORREIA
Mestranda do programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal de
Pernambuco, Recife – Brasil.
ISABELA MARIA SANTIAGO-JAEGGER,
Doutoranda do programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal
de Pernambuco, Recife – Brasil.
PRISCYLLA GONÇALVES CORREIA
Mestranda do programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal de
Pernambuco, Recife – Brasil.
DANYEL ELIAS DA CRUZ PEREZ
Professor do Departamento de Clínica e Odontologia Preventiva da Universidade
Federal de Pernambuco, Recife – Brasil.
JOAQUIM EVÊNCIO NETO
Professor do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal
Rural de Pernambuco, Recife – Brasil.
LIRIANE BARATELLA-EVÊNCIO*
Professora do Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal de
Pernambuco, Recife – Brasil.
Autor para correspondência:
Prof. Dra. Liriane Baratella Evêncio
Address: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901
Fone/Fax: + 81 21268515 / + 81 99468546
e-mail: [email protected]
27
RESUMO
Objetivo: O objetivo do estudo foi analisar a periodontogênese de ratos cujas mães
foram tratadas com fluoxetina, durante a gestação e lactação. Metodologia: Ratas
prenhes da linhagem Wistar foram distribuídas em quatro grupos de estudo. Nos grupos
controle foi administrada solução de cloreto de sódio a 0,9% por via oral durante todo o
período de gestação (CG, n=6) e durante a gestação e lactação no grupo CGL (n=6).
Durante o mesmo período, foi administrada fluoxetina na dose de 20mg/kg por via oral
nos grupos tratados durante apenas a gestação (grupo FG, n=6) e durante a gestação e
lactação (FGL, n=6). Aos 25 dias de vida, foi realizada a anestesia seguida da perfusão
e coleta da região do primeiro molar superior. As peças foram processadas para
microscopia de luz, coradas pela hematoxilina/eosina, picrosirius red e tricrômico de
Masson, e analisadas ao microscópio óptico para a realização de análises histológicas e
histomorfométricas. Sob microscópio de luz polarizada avaliou-se qualitativamente o
colágeno periodontal. Resultados: A administração da fluoxetina apenas no período de
gestação não foi relacionada a alterações na periodontogênese dos animais avaliados.
No entanto houve uma diminuição da quantidade de fibroblastos (p=0,006),
osteoblastos (p=0,027) e cementoblastos (p=0,001) dos animais do grupo FGL. Foi
detectada a presença concomitante do colágeno tipo I e tipo III no ligamento periodontal
e osso alveolar de todas as amostras. Conclusão: Esses achados sugerem a sensibilidade
dos tecidos periodontais à fluoxetina, sendo a interferência dessa droga sob a
periodontogênese de ratos dependente do tempo de exposição.
Palavras chave: Periodonto. Fluoxetina. Serotonina. Rato. Germe de dente.
28
INTRODUÇÃO
O número de prescrições de antidepressivos vem aumentando desde 1990,
principalmente após a introdução de Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina
(ISRS) cujas indicações compreendem situações clínicas como depressão, transtorno
obsessivo compulsivo e transtorno bipolar. 1 Nesse contexto, a fluoxetina, um ISRS, é
um dos fármacos mais prescritos para o tratamento de transtornos depressivos, inclusive
no período gestacional e durante a amamentação 2 mesmo diante da sua capacidade de
atravessar a barreira placentária e distribuir-se dentro do embrião/feto durante os
períodos de organogênese e pós organogênese. 3
Em geral, os antidepressivos são
compatíveis com a amamentação 4 no entanto, a fluoxetina é uma exceção, pois devido
a sua longa meia vida e seus metabólitos ativos, clinicamente, níveis plásmáticos
significativos da droga tem sido reportado em neonatos. 5
A inibição seletiva da recaptação da serotonina (5HT), provocada pelo uso da
fluoxetina, aumenta a concentração extracelular desse neurotransmissor, o qual
desempenha importantes papéis na regulação do comportamento, humor, ansiedade,
agressividade, depressão, sono, fadiga e supressão de apetite. 6 A serotonina também é
descrita como um sinal para o desenvolvimento devido à sua ação indutora na
proliferação e morfogênese tecidual, diferenciação neuronal, migração celular,
expressão de fatores de crescimento, adesão celular e extracelular. 7, 8
Ao investigar o padrão de expressão dos receptores 5HT para o desenvolvimento
do embrião do rato, Lauder et al.9 verificaram malformações que envolviam defeitos no
tubo neural e no processo frontonasal advindas da exposição à antagonistas do 5HT. Os
autores concluíram que o uso de antagonistas da serotonina modula o papel desse
neurotransmissor na morfogênese de diversas regiões craniofaciais, e podem exercer o
29
mesmo efeito quando essas drogas são administradas durante a gestação. No mesmo
estudo, foram detectados receptores 5HT em germes dentários e mesênquima
mandibular, além de endocárdio, músculo estriado e crista neural.
Evidências mostram a atuação da serotonina na fisiologia óssea, uma vez que ela
regula a diferenciação de osteoclastos 10
, aumenta a quantidade de osteoprotegerina
(OPG) e diminui o fator ativador de osteoclastos RANKL 11
, enquanto a fluoxetina
causa efeitos opostos. Além disso, tanto os osteoblastos como os osteócitos de ratos são
capazes de sintetizar a 5-HT, bem como expressam componentes funcionais de
receptores e transportadores serotoninérgicos. 12
A serotonina também foi relacionada como uma possível moduladora de sinais
sensoriais dos músculos da mastigação e de mecanoreceptores do ligamento
periodontal. 13
A presença da serotonina em fibras nervosas simpáticas do ligamento
periodontal reforça a relação desse neurotransmissor com a morfogênese e homeostase
de estruturais orais. 14
Diante da presença de sítios de absorção da serotonina em estruturas dentais
embrionárias 15
, a hipótese da influência desse neurotransmissor na formação do
periodonto é plausível. Entretanto, não há estudos na literatura que avaliaram tal
hipótese. Assim, este estudo teve o objetivo de investigar a influência da fluoxetina na
formação do periodonto de sustentação do primeiro molar superior de ratos cujas mães
foram tratadas com a fluoxetina (20 mg/kg) durante a gestação e lactação.
30
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Foi realizado um estudo experimental cego randomizado, na Universidade
Federal de Pernambuco.
A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do
Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (CCB – UFPE)
sob o processo nº 23076.017680/2011-83.
Foram utilizadas 12 ratas albinas da linhagem Wistar, mantidas em sala com
temperatura de 23 +/- 2ºC e ciclo de claro e escuro de 12/12 horas (claro das 06 às 18
horas e escuro das 18 às 06 horas), recebendo a dieta padrão do biotério (Presence ratos
e camudongos – Presence, Paulínia, SP, Brasil) e água ad libitum. Foram realizados
acasalamentos entre os animais adultos e testes diários de esfregaço vaginal para a
comprovação da gravidez. O dia da comprovação da gravidez configurou o primeiro dia
de gestação e o início dos tratamentos dos animais.
Tratamento
Quatro grupos com 6 filhotes compuseram a pesquisa: o grupo controle de
gestação (grupo CG) onde os filhotes eram provenientes de ratas que receberam cloreto
de sódio a 0,9% via oral (gavagem) durante todo o período de gestação; grupo controle
de gestação e lactação onde as ratas prenhes receberam solução de cloreto de sódio a
0,9% durante a gestação e lactação (grupo CGL); grupo tratado com Cloridrato de
Fluoxetina (Pharma Nostra, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil) na dose de 20mg/kg
de peso animal via oral (por gavagem) administrada até o término da gestação (grupo
FG) e o grupo FGL tratado com a fluoxetina durante a gestação até o fim da
31
amamentação, ou seja, 21 dias após o nascimento. De cada ninhada, foram selecionados
aleatoriamente e sem distinção de sexo, 2 filhotes para compor o n de 6 animais por
grupo de estudo.
Aos 25 dias de vida, os filhotes de todos os grupos foram anestesiados com
Xilazina a 20mg/kg de peso (i.m.) e Quetamina a 50mg/kg de peso (i.m.) e em seguida
perfundidos por via intracardíaca com solução de formaldeído a 4% (obtido a partir do
paraformaldeído). Os espécimes foram obtidos realizando-se corte frontal no maxilar
tangencialmente a face mesial do primeiro molar a fim de analisar o periodonto da raiz
palatina dos primeiros molares superiores.
Processamento histológico e análises morfológicas
As peças foram fixadas em solução neutra de formaldeído a 4% (obtido a partir
do paraformaldeído) durante 24 horas à temperatura ambiente. A seguir, foram
descalcificados durante 15 dias em solução de EDTA (Vetec Química Fina Ltda,,
Duque de Caxias, RJ, Brasil) a 5% em cloreto de sódio a 0,9%. Após a descalcificação,
os espécimes foram submetidos a processamento histológico convencional para inclusão
em parafina. Cortes histológicos semi seriados de 5 μm foram obtidos com micrótomo
(LEICA RM 2125 RT, Leica Biosystems Nussloch GmbH , Nussloch, Alemanha),
corados pela hematoxilina-eosina (HE), tricrômico de Masson (TM) e picrosirius red,
montados em Entellan®
(Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha).
Para a análise do colágeno, as preparações coradas por picrosirius red foram
observadas através da fluorescência emitida pelo tecido, utilizando um microscópio
petrográfico polarizado (Olympus BX40, Olympus Corporation, Tokyo, Japão).
Para análise histomorfométrica das preparações coradas em HE foi utilizado
microscópio de luz (Nikon Corporation modelo Eclypse 51, Tokyo, Japão), acoplado
32
em uma microcâmera, conectado a um computador contendo uma placa de captura de
imagem (ATI) e o software para histomorfometria (IMAGE J, Macintosh
computers, Maryland, USA). De cada animal foram obtidos dez campos do terço médio
da raiz palatina, sob a objetiva de 20x, para mensurar espessura do ligamento
periodontal, e quantidade de osteoblastos, osteoclastos, cementoblastos e fibroblastos
por campo. Para a contagem de célula por campo, foi considerado osteoblasto, a célula
disposta adjacente e com o eixo paralelo à matriz óssea; para osteoclasto considerou-se
a célula multinucleada, acidófila adjacente ao osso; cementoblatos foram identificados
como células dispostas paralelamente e bem adjacentes a dentina e os fibroblastos como
células fusiformes dispostas obliquamente seguindo o sentido das fibras colágenas.
Estatística
Para a tabulação dos dados quantitativos foram utilizados os Softwares SPSS
13.0 para Windows e o Excel 2007. Foi aplicado o teste de Normalidade de
Kolmogorov-Smirnove e realizada a comparação entre dois grupos utilizando o teste de
Mann-Whitney, uma vez excluída a hipótese de normalidade dos dados. Todos os testes
foram aplicados considerando o intervalo de confiança de 95%.
33
RESULTADOS
Cada rata prenhe gerava por ninhada uma média de 8 filhotes, conferindo um
padrão de normalidade nutricional dos animais submetidos às intervenções do estudo.
Análise histológica e histoquímica
A análise histológica não evidenciou nenhuma diferença na morfologia
periodontal entre os grupos controles e experimentais do estudo (Fig.1). Em todos os
grupos, o primeiro molar superior encontrava-se na fase de rizogênese com
aproximadamente metade da raiz formada, sendo a coroa já irrompida. Nesse estágio, o
ápice radicular encontrava-se aberto e uma fina camada de dentina e restos da bainha
epitelial de Hertwig foram evidenciados nessa região.
O periodonto na região apical apresentou grande quantidade de células
indiferenciadas e de osteoclastos, caracterizando os processos fisiológicos da erupção
dentária. A porção cervical da raiz mostrou um tecido periodontal mais frouxo devido à
remodelação e redirecionamento dos feixes de fibras periodontais para a erupção do
dente. Já na porção média da raiz, as fibras conjuntivas apresentavam-se mais maduras e
organizadas, mostrando feixes inserindo-se tanto no cemento quanto no osso alveolar.
Em toda extensão do ligamento, as fibras colágenas se encontravam entremeadas por
substância intercelular, vasos sanguíneos, fibroblastos e fibrócitos. Também foram
encontrados cementoblastos e osteoblastos adjacentes às superfícies do cemento e do
osso alveolar respectivamente. Próximo ao osso, osteoclastos com morfologia normal
também foram observados.
Em todos os grupos estudados, o trabeculado ósseo alveolar mostrou-se fino,
descontínuo e com amplos espaços medulares. Osteoblastos na margem do osso
alveolar foram observados, bem como, osteócitos engolfados no interior do trabeculado
34
em desenvolvimento. Ainda com relação às estruturas ósseas, foi observada a presença
de vasos sanguíneos pertencentes ao sistema Haversiano no osso alveolar de suporte.
A deposição de cemento foi observada na forma de uma camada fina, acelular,
acompanhando o processo de dentinogênese, sobre a dentina radicular. Cementoblastos
mostraram-se ovalados, com longo eixo paralelo a superfície da raiz.
Tanto o osso alveolar como o cemento apresentava forte cor vermelha nas
preparações coradas pelo picrosirius red. Nas porções periféricas do ligamento
periodontal, verificou-se a presença de feixes de fibras colágenas maduras e portanto
com a coloração vermelha mais intensa, referentes às fibras de Sharpey. Os feixes de
fibras colágenas da porção central do ligamento apresentavam-se mais frouxos e
imaturos, evidenciado no tricrômico de Masson por uma coloração azul clara e no
picrosirius red pelo vermelho menos intenso.
Análise sob microscopia de polarização
As amostras avaliadas não apresentaram alterações quanto ao tipo e a disposição
do colágeno no periodonto dos animais submetidos ou não a fluoxetina durante o seu
desenvolvimento (figura 2). Sob a análise de microscopia de polarização com
preparações coradas pelo picrosirius red, o ligamento periodontal dos animais de ambos
os grupos estudados evidenciaram a presença maior de fibras colágenas do tipo I,
entremeadas por fibras colágenas tipo III. Percebe-se também a presença de moléculas
de colágeno na lâmina basal e no cemento acelular. O osso alveolar apresentou a
predominância do colágeno tipo I em todos os grupos de estudo.
A técnica de polarização permitiu avaliar a direção bem como o tipo de feixes de
fibras colágenas, os quais estão dispostos obliquamente e ascendente no sentido
cemento-osso alveolar.
35
Análise Histomorfométrica
As mensurações realizadas não revelaram diferença estatística entre os grupos
CG e FG, em nenhuma das variáveis analisadas (Tabela 1).
Nos animais submetidos à fluoxetina durante a gestação e lactação, foram
identificadas alterações no número de células que compõem o periodonto. O grupo FGL
mostrou uma diminuição estatisticamente significante de fibroblastos (p=0,006),
osteoblastos (p=0,027) e cementoblastos (p=0,001), quando comparado ao seu
respectivo grupo controle (CGL). As medidas de espessura do ligamento periodontal e
quantidade de osteoclastos entre os grupos CGL e FGL não mostraram diferenças
estatisticamente significantes (Tabela 2).
36
DISCUSSÃO
A serotonina, neurotransmissor alvo dos medicamentos antidepressivos, foi
expressa em embriões de ratos e apontada como participante de eventos
morfogenéticos.16
Nesse contexto, o uso de Inibidores Seletivos da Recaptação da
Serotonina (ISRS), como a fluoxetina, durante a gestação e lactação, altera os níveis e o
papel desse neurotransmissor na embriogênese. 17
Amostras de sangue do cordão
umbilical obtidas de neonatos expostos à fluoxetina no útero mostraram um significante
nível sérico equivalente a 60% da dose da mãe 18
, o que justifica e dá suporte à
realização de pesquisas que visem detectar possíveis efeitos teratogênicos nos bebês
expostos a essa droga. A morfogênese das estruturas orais é um processo complexo do
qual fazem parte trocas de sinais sequenciais e recíprocos entre os tecidos epiteliais e
mesenquimais. 19
Uma vez que o sistema serotoninérgico possui uma função reguladora
sob processos morfogenéticos de tecidos neurais e não neurais 20
e sendo detectada a
sensibilidade dos tecidos periodontais à fluoxetina 21
, é possível que a exposição
precoce a essa droga interfira na periodontogênese.
No presente estudo, os achados histológicos relativos ao estágio de
desenvolvimento dentário e à morfologia das estruturas presentes no periodonto dos
animais estão em conformidade com a descrição do periodonto de ratos da literatura
prévia 22-24
conferindo um padrão de normalidade morfológica aos grupos experimentais
e controle.
A análise histomorfométrica revelou diminuição significativa do número de
cementoblastos, osteoblastos e fibroblastos no periodonto de filhotes do grupo FGL,
cujas mães receberam fluoxetina durante a gestação e amamentação. Entretanto, não
houve alterações no grupo de animais expostos a fluoxetina apenas durante a gestação
37
(grupo FG). Desse fato, pode-se presumir que o efeito da fluoxetina nos tecidos
periodontais possivelmente depende do tempo de exposição ao fármaco. Além de
provocar galactorréia 25
, o uso da fluoxetina durante a amamentação expõe os neonatos
à droga 26
, sendo assim, os animais do grupo FGL tiveram um somatório da exposição
intrauterina à fluoxetina com a da lactação, fator apontado como responsável pela
diminuição de fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos no ligamento periodontal.
Embora a interferência direta da fluoxetina nas células do periodonto não seja
relatada na literatura, alguns estudos reforçam a fundamentação dessa hipótese. O
folículo dentário, responsável pela formação do periodonto, é derivado das células da
crista neural. 27
Moiseiwitsch e Lauder 28
mostraram que a serotonina é responsável por
regular de forma dose-dependente a migração das células da crista neural durante a
neurulação. Portanto, os efeitos da recaptação seletiva da serotonina podem afetar
estruturas derivadas desse anexo, como o periodonto.
Estudos realizados previamente por nosso grupo de pesquisa, não revelaram
alterações na formação e morfologia da articulação temporomandibular (ATM) 29
e do
esmalte dentário 30
de filhotes de ratas tratadas com fluoxetina (10mg/kg) durante a
gestação. Tendo em vista tais resultados e por ser mais utilizada a dose de 20mg/kg em
humanos, optamos realizar nosso estudo utilizando a dose de 20mg/kg e estendendo o
período de administração até o fim da amamentação em um dos grupos. Ao serem
detectadas alterações na dose de 20mg/kg é possível que a ação da fluoxetina na
morfogênese do periodonto siga o padrão dose dependente descrito por Moiseiwitsch e
Lauder 31
ao analisar in vitro o desenvolvimento do germe dental. Por outro lado, sabe-
se que a dose da droga transferida via placenta da droga ocorre em maior concentração
quando relacionada à dose exposta ao bebê durante a amamentação 18, 32
, portanto, ao
mostrar-se presente alterações apenas no grupo exposto durante a gestação e lactação, a
38
ação da fluoxetina nos periodontais pode não ter sido influenciada pela diminuição da
dose após o nascimento.
Hodge et al. 33
demostraram o envolvimento da fluoxetina com o metabolismo
ósseo. Em um estudo in vitro, os autores detectaram que tanto osteoblastos como
osteoclastos, além de expressarem o transportador de serotonina (5-HTT) e o receptor
serotoninérgico 5-HTR1B, também apresentam a triptofano hidroxilase, enzima que
cataliza o triptofano para a formação de serotonina. Nesse mesmo estudo a fluoxetina
mostrou inibir de forma dose-dependente a quantidade de osteoclastos e a reabsorção.
Em alta dose a fluoxetina também inibiu a mineralização pelos osteoblastos, mas não
alterou o parâmetro morfológico das células em cultura. Em contrapartida, no presente
estudo não foram encontradas alterações significantivas no número de osteoclastos.
Também foi descrito que o receptor 5-HT2BR facilita o recrutamento de
osteoblastos e sua proliferação. 34
Com relação aos fibroblastos, foi estabelecido que
essas células expressam cadeias de sinais intercelulares ativadas pelo receptor
serotoninérgico 5HT lc. 35
Não há estudos que correlacionem os efeitos da serotonina e
de seus inibidores sobre os cementoblastos. Entretanto, como essas células são
originadas do mesmo tecido embrionário que os fibroblastos e os osteoblastos, o
folículo dental, sugere-se que essas células sejam moduladas de forma semelhante pelos
estímulos serotoninérgicos.
O picrosirius red é um corante ácido que reage com o colágeno e promove um
aprimoramento da sua birrefrigencia normal 36
. A análise sob microscópio de
polarização de preparações coradas com picrosirius red mostra uma variedade de cores
dependendo da espessura da fibra colágena. O colágeno tipo I apresenta-se espesso,
fortemente birrefrigente e visto como fibras amarelas ou vermelhas. O colágeno tipo III
aparece sob uma forma mais fina, fracamente birrefrigente evidenciando a cor verde e
39
podem ser identificadas como fibras reticulares. 37
O colágeno tipo II, presente em
cartilagens elásticas e hialinas, não forma fibras e se apresenta de várias cores.
O Colágeno tipo I é o maior componente do ligamento periodontal. Ao contrário
do colágeno tipo I, uma parte do colágeno tipo III retém seu peptídeo amino terminal na
superfície de fibras em desenvolvimentos após serem excretadas das células. 38
O
procolágeno e colágeno tipo III são componentes dos feixes de fibras do ligamento
periodontal e foi sugerida a sua colocalização com o colágeno tipo I na mesma fibra. 39
No presente estudo, os tipos de fibras colágenas encontradas no ligamento periodontal
não apresentaram diferenças entre os grupos controles e experimentais e estão em
conformidade com a descrição do periodonto sob polarização feita por Foster 40
e por
Marques et al. 41
.
Os resultados obtidos sugerem que a periodontogênese é sensível à ação da
fluoxetina e que a presença de alterações na morfogênese do periodonto parecer ser
dependente do tempo de exposição, uma vez que apenas o grupo exposto durante a
gestação e lactação apresentou diminuição da quantidade de fibroblastos,
cementoblastos e osteoblastos periodontais. Entretanto, estudos adicionais devem ser
realizados para determinar se as alterações morfológicas na periodontogênese
permanecem após serem estabelecidas, além de verificar um provável distúrbio
funcional no periodonto de sustentação.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à FACEPE/ CNPq pelo apoio financeiro a pesquisa.
CONFLITO DE INTERESSE
Não houve conflito de interesse na presente pesquisa.
40
APÊNDICE
FIGURAS
Figura 1
41
Figura 2
42
CARTA DO COMITÊ DE ÉTICA
43
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48
LEGENDA DAS FIGURAS
Figura 1: Fotomicrografias do periodonto correspondente ao terço médio da raiz
palatina de primeiros molares superiores de ratos com 25 dias de vida correspondentes
aos grupos controle na gestação (CG), fluoxetina na gestação (FG), controle na gestação
e lactação (CGL) e fluoxetina na gestação e lactação (FGL). Imagens coradas com HE,
tricrômico de Masson e picrosirius red. Observa-se as células que compõem as
estruturas do periodonto e os feixes de fibras do ligamento periodontal inserindo-se no
cemento e no osso alveolar. O: osso. LP: Ligamento Periodontal. D: Dentina. Barra de
aumento= 56µm.
Figura 2: Fotomicrografias do periodonto correspondente ao terço médio da raiz
palatina de primeiros molares superiores de ratos com 25 dias de vida correspondentes
aos grupos controle na gestação (CG), fluoxetina na gestação (FG), controle na gestação
e lactação (CGL) e fluoxetina na gestação e lactação (FGL). Cortes corados com
picrosirius red e analisados sob microscópio de polarização. Observa-se a
predominância das cores verde e amarela nas fibras colágenas do ligamento periodontal,
indicando a presença dos colágenos tipo III e tipo I respectivamente. No osso alveolar,
verificou-se a predominancia do colágeno tipo I (coloração vermelha). O: osso alveolar.
LP: Ligamento Periodontal. C: Cemento. Barra equivalente a 0.2mm.
49
TABELAS
Tabela 1: Avaliação da espessura do ligamento periodontal e da quantidade dos tipos
celulares do periodonto dos grupos CG e FG.
Grupo
Variáveis Grupo CG Grupo FG p-valor *
Média ± DP Média ± DP
Espessura_do ligamento
periodontal 290,17 ± 26,68 287,03 ± 21,45 0,447
Fibroblasto 57,35 ± 13,86 61,88 ± 9,66 0,091
Osteoblasto 8,28 ± 2,69 7,23 ± 2,23 0,081
Osteoclasto 0,67 ± 0,77 0,45 ± 0,65 0,105
Cementoblasto 9,15 ± 2,91 10,23 ± 2,81 0,073
(*) Teste de Mann-Whitney
50
Tabela 2 – Avaliação da espessura do ligamento periodontal e da quantidade dos tipos
celulares do periodonto dos grupos CGL e FGL.
Grupo
Variáveis Grupo CGL Grupo FGL p-valor *
Média ± DP Média ± DP
Espessura do ligamento
periodontal 287,21 ± 29,63 294,04 ± 37,93 0,445
Fibroblasto 58,68 ± 13,98 51,68 ± 11,66 0,006**
Osteoblasto 7,30 ± 2,47 6,33 ± 2,43 0,027**
Osteoclasto 0,40 ± 0,56 0,32 ± 0,57 0,292
Cementoblasto 10,95 ± 2,09 9,75 ± 2,49 0,001**
(*) Teste de Mann-Whitney
(**) p< 0,05
51
ANEXO
NORMAS DA REVISTA ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY
Guide for Authors
Editors-in-Chief:
Dr G R Holland, Ann Arbor, MI, USA
Professor G B Proctor, London, UK
Archives of Oral Biology is an international journal which aims to publish papers of the highest scientific quality reporting
new knowledge from the orofacial region including: • developmental biology
• cell and molecular biology
• molecular genetics
• immunology
• pathogenesis
• microbiology
• biology of dental caries and periodontal disease
• forensic dentistry
• neuroscience
• comparative anatomy
• paeleodontology
Archives of Oral Biology will also publish expert reviews and articles concerned with advancement in relevant
methodologies. The journal will only consider clinical papers where they make a significant contribution to the
understanding of a disease process.
These guidelines generally follow the Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals.
Online submission of papers
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manuscript for peer review, revision and proofing. All correspondence, including the editors' decision and request for
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Submission of a paper implies that it has not been published previously, that it is not under consideration for publication
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authors that the manuscript in its submitted form has been read and approved by them. Authors must supply details of
related papers submitted or recently published elsewhere. Submissions lacking this documentation will not be reviewed
until it is supplied.
Authors are invited to suggest up to three referees they consider suitable to review their submission. The suggested
reviewers should not have collaborated with the authors in the last 5 years. Full postal and email addresses should be
included. The editors may or may not, at their discretion, utilize these suggestions.
Authorship All authors should have made substantial and material contributions to the paper. These would include the individuals
responsible for the conception and design of the experiments and the interpretation of data. If the work was conducted
using non-institutional grant funds the Principal Investigator on the funded grant should be included in the authorship.
Individuals who gave purely technical help or advise, for example, on statistical tests or provided materials such as cell
lines and antibodies should be included in the Acknowledgements. 'Guest' authors are unacceptable. The
Acknowledgements should also include the source of the funds used and the Principal Investigator to whom they were
awarded. If the manuscript has four or more authors listed, a letter describing the contribution of each should be
included. Submissions lacking this documentation will not be reviewed until they are supplied.
52
Conflict of interest The potential for conflict of interest exists when an author (or the author's institution), has financial or personal
relationships that may influence his or her actions. Authors are specifically asked to reflect on financial conflicts of
interest (such as employment, consultancy, stock ownership, honoraria and paid expert testimony) as well as other
forms of conflict of interest, including personal, academic and intellectual issues.At the end of the text, under a
subheading "Conflict of interest statement" all authors must disclose any financial and personal relationships that could
influence their work. Examples of potential conflicts of interest include employment, consultancies, stock ownership,
honoraria, paid expert testimony, patent applications/registrations, and grants or other funding. If there are no conflicts
of interest a statement confirming such should be included
Ethics
Studies on human beings. Such studies submitted to Archives of Oral Biology should comply with the principles laid down in the Declaration of
Helsinki; Recommendations guiding physicians in biomedical research involving human subjects. The declaration was
adopted by the 18th World Medical Assembly, Helsinki, Finland, June 1964, amended by the 29th World Medical
Assembly, Tokyo, Japan, October 1975, the 35th World Medical Assembly, Venice, Italy, October 1983, and the 41st
World Medical Assembly, Hong Kong, September 1989 (www.wma.net/e/policy/b3.htm). The manuscript should contain
a statement that the work has been approved by the appropriate ethical committees related to the institution(s) in which
it was performed and that subjects gave informed consent to the work. A copy of the institutional approval should be
included. Submissions lacking these documents will not be reviewed until they are supplied. Patients' and volunteers'
names, initials, and hospital numbers should not be used.
Studies on animals. The experimental procedures and care of animals should be in accordance with the European Convention for the
Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes
(http://conventions.coe.int/Treaty/en/Treaties/Html/123.htm). The authors must state that animal care was in accordance
with both these and institution guidelines. Signed documents of approval by institutional committees should be included
as well as a statement from the authors that the study met the standards described in the European Convention.
Submissions lacking these documents will not be reviewed until they are supplied.
Copyright Accepted papers become the copyright of the Journal and are accepted on the understanding that they have not been
published, are not being considered for publication elsewhere and are subject to editorial revision. If papers closely
related to the submitted manuscript have been published or submitted for publication elsewhere, the author must state
this in their cover letter. Upon acceptance of an article, authors will be asked to sign a 'Journal Publishing Agreement'
(for more information on this and copyright see http://www.elsevier.com/authors). Acceptance of the agreement will
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Scientific Standards
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assessed by two referees selected by the Editor, and decisions regarding acceptance are based mainly upon the advice
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tense and use the present tense where reference is made to existing knowledge, or where the author is stating what is
known or concluded. Original papers should follow the pattern of: Introduction, Materials and Methods, Results or
Findings, Discussion.
53
Authors will gain much assistance by consulting: Council of Biology Editors Style Manual Committee. Scientific Style
and Format: The CBE Manual for Authors, Editors, and Publishers, 6th edition. New York: Cambridge University Press,
1994.
We suggest that authors consider using a language editing service to improve the English language usage and quality
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The editors reserve the right to revise the wording of papers in the interest of the Journal's standards of clarity and
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Text Follow this order when typing manuscripts: Title, Authors, Affiliations, Abstract, Keywords, Main text (Introduction,
Materials & Methods, Results, Discussion for an original paper), Acknowledgments, Appendix, References, Figure
Captions and then Tables. Do not import the Figures or Tables into your text. The corresponding author should be
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superscript Arabic numbers.
Title page As titles frequently stand alone in indexes, bibliographic journals etc., and indexing of papers is, to an increasing extent,
becoming computerized from key words in the titles, it is important that titles should be as concise and informative as
possible. Thus the animal species to which the observations refer should always be given and it is desirable to indicate
the type of method on which the observations are based, e.g. chemical, bacteriological, electron-microscopic,
histochemical, etc. A "running title" of not more than 40 letters and spaces must also be supplied. A keyword index must
be supplied for each paper.
Structured abstract The paper should be prefaced by an abstract aimed at giving the entire paper in miniature. Abstracts should be no
longer than 250 words and should be structured as per the guidelines published in the Journal of the American Medical
Association (JAMA 1995; 273: 27-34). In brief, the abstract should be divided into the following sections: (1) Objective;
(2) Design - if clinical, to include setting, selection of patients, details on the intervention, outcome measures, etc.; if
laboratory research, to include details on methods; (3) Results; (4) Conclusions.
Received/accepted dates A received date will be added to all papers when they are received by the Accepting Editor. An accepted date will also
be added when the papers are received at the publishing office.
Introduction This should be a succinct statement of the problem investigated within the context of a brief review of the relevant
literature. Literature directly relevant to any inferences or argument presented in the Discussion should in general be
reserved for that section. The introduction may conclude with the reason for doing the work but should not state what
was done nor the findings.
Materials and Methods Enough detail must be given here so that another worker can repeat the procedures exactly. Where the materials and
methods were exactly as in a previous paper, it is not necessary to repeat all the details but sufficient information must
be given for the reader to comprehend what was done without having to consult the earlier work.
Authors are requested to make plain that the conditions of animal and human experimentation are as outlined in the
"Ethics" and "Studies on Animals" sections above.
Results or Findings These should be given clearly and concisely. Care should be taken to avoid drawing inferences that belong to the
54
Discussion. Data may be presented in various forms such as histograms or tables but, in view of pressure on space,
presentation of the same data in more than one form is unacceptable.
Statistical analysis
Authors should ensure that the presentation and statistical testing of data are appropriate and should seek the advice of
a statistician if necessary. A number of common errors should be avoided, e.g.: -
• Use of parametric tests when non-parametric tests are required
• Inconsistencies between summary statistics and statistical tests such as giving means and standard deviations for
data which were analysed with non-parametric tests.
• Multiple comparisons undertaken with multiple t tests or non-parametric equivalents rather than with analysis of
variance (ANOVA) or non-parametric equivalents.
• Post hoc tests being used following an ANOVA which has yielded a non-significant result.
• Incomplete names for tests (e.g. stating "Student's t test" without qualifying it by stating "single sample", "paired" or
"independent sample")
• N values being given in a way which obscures how many independent samples there were (e.g. stating simply n=50
when 10 samples/measurements were obtained from each of 5 animals/human subjects).
• Stating that P=0.000 (a figure which is generated by some computer packages). The correct statement (in this case) is
P<0.0005.
Discussion This section presents the inferences drawn from the Results: these should be recapitulated only sparingly, sufficient to
make the argument clear.
References
All manuscripts should use the 'Vancouver' style for references, which should be numbered consecutively in
the order in which they are first cited in the text and listed at the end of the paper.
For journal references, all authors should be included when there are six or fewer (first six followed by 'et al.' when
seven or more), followed by the title of article, name of journal abbreviated according to Index Medicus, or left in full,
year, volume with part number in brackets, and first and last pages. For example:
1. Walsh NP, Montague JC,Callow N and Rowlands AV. Saliva flow rate, total protein concentrationand osmolality as
potential markers of whole body hydration statusduring progressive acute dehydration in humans. Arch Oral
Biol2004;49(2):149-154.
For book references, the author(s) should be followed by the chapter title (if appropriate), editor(s) (if applicable), book
title, place of publication, publisher, year and page numbers. For example:
Nanci A. Ten Cate's Oral Histology: Development, Structure and Function. 6th ed. St. Louis: Mosby; 2003.
Papers in the course of publication should only be entered in the references if the paper has been accepted by a
journal, and then given in the standard manner in the text and list of references but with the words "In press" following
the name of the journal.
Units and symbols In general, Archives of Oral Biology will use the recommended SI (Systeme Internationale) units and symbols. The use
of the litre, usually better written in full, in place of SI dm3 and ml3 in place of SI cm, will continue to be accepted. For
details of the SI symbols, authors are referred to: Symbols, Signs and Abbreviations (1969) by the Royal Society of
Metric and Decimal Systems in Council of Biology
Abbreviations As Archives of Oral Biology is a journal with a multidisciplinary readership, abbreviations, except those universally
understood such as mm, g, min. u.v., w/v and those listed below, should be avoided if possible. Examples of
abbreviations which may be used without definition: ADP, AMP, ATP, DEAE-cellulose, DNA, RNA, EDTA, EMG, tris. Other abbreviations used to improve legibility should be listed as a footnote on the title page. Chemical symbols may be
used for elements, groups and simple compounds, but excessive use should be avoided. Abbreviations other than the
above should not be used in titles.
Bacterial nomenclature
Organisms should be referred to by their scientific names according to the binomial system. When first mentioned the
55
name should be spelt in full and in italics. Afterwards the genus should be abbreviated to its initial letter, e.g. 'S. aureus'
not 'Staph. aureus'. If abbreviation is likely to cause confusion or render the intended meaning unclear, the names of
microbes should be spelt in full. Only those names which were included in the Approved List of Bacterial Names, Int J
Syst Bacteriol 1980; 30: 225?420 and those which have been validly published in the Int J Syst Bacteriol since 1
January 1980 have standing in nomenclature. If there is good reason to use a name that does not have standing in
nomenclature, the names should be enclosed in quotation marks and an appropriate statement concerning the
nomenclatural status of the name should be made in the text (for an example see Int J Syst Bacteriol 1980; 30:
547?556). When the genus alone is used as a noun or adjective, use lower case Roman not italic, e.g.'organisms were
staphylococci' and 'streptococcal infection'. If the genus is specifically referred to use italics e.g. 'organisms of the
genus Staphylococcus'. For genus in plural, use lower case roman e.g. 'salmonellae'; plurals may be anglicized
e.g.'salmonellas'. For trivial names, use lower case Roman e.g. 'meningococcus'.
Numbers, measurements and statistics. Numbers one to nine are spelled out unless they are measurements (e.g.5 ml). Numbers greater than nine are spelled
out if they begin a sentence, or when clarity requires it. Numbers above and including 10 000 have a space, not a
comma. A decimal point is preceded by a number or cypher e.g. '0.5'. Decimal points in columns should be aligned
vertically. Dates are usually provided in full: 14 April 1949. Measurements may be expressed in SI or non-metric units.
Use 10 ml/h rather than ml.h-1 or ml per h.
Drugs
These should be referred to by their approved and not proprietary names; for guidance, see the British National
Formulary. Where it is desirable to indicate a particular brand of preparation, the proprietary name and source should be
given in parentheses after the proper name, e.g. testicular hyaluronidase (Testovase, Bovine Enterprises Ltd, London,
UK).
Illustrations In the initial online submission and review stage, authors are required to provide electronic versions of their illustrations.
When an article has been accepted, authors must be prepared to provide all illustrations in electronic and camera-ready
format, (suitable for reproduction, which may include reduction, without retouching).
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high-quality artwork early in the process, this tool checks the submitted artwork and other file types against the artwork
requirements outlined in the Artwork Instructions to Authors on www.elsevier.com/artworkinstructions. The Artwork
Quality Control Tool automatically checks all artwork files when they are first uploaded. Each figure/file is checked only
once, so further along in the process only new uploaded files will be checked.
General: Information relating to the preferred formats for artwork and illustrations may be found
atwww.elsevier.com/authors. Photographs, charts and diagrams are all to be referred to as "Figure(s)" and should be
numbered consecutively in the order to which they are referred. They should accompany the manuscript, but should not
be included within the text. All figures are to have a caption. Captions should be supplied on a separate page.
Line drawings: All lettering, graph lines and points on graphs should be sufficiently large and bold to permit
reproduction when the diagram has been reduced to a size suitable for inclusion in the journal. Dye-line prints or
photocopies are not suitable for reproduction. Do not use any type of shading on computer-generated illustrations.
Photographs: Original photographs must be supplied as they are to be reproduced (e.g. black and white or colour). If
necessary, a scale should be marked on the photograph. Please note that photocopies of photographs are not
acceptable.
Colour: Certain illustrations will be approved for publication in colour but only if, in the opinion of the Editors, the figures
convey information not apparent in monochrome. Please note that figures supplied in colour will appear online in colour
at no extra charge, even if the print version is monochrome.
Tables: Tables should be numbered consecutively and given a suitable caption. Begin each table on a separate page.
Footnotes to tables should be typed below the table and referred to by superscript lowercase letters. No vertical rules
should be used. Tables should not duplicate results presented elsewhere in the manuscript (e.g. in graphs).
Revised manuscripts
Frequently authors are required to submit revised versions of manuscripts in the light of reports from expert reviewers
and editorial comments. Revised manuscripts must clearly show revisions and authors must clearly indicate the
positions of revisions in a covering letter that addresses the concerns of reviewers/ editors.
Proofs One set of page proofs in PDF format will be sent by e-mail to the corresponding author which they are requested to
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