MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE - UFRN

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL – PPGA

AVALIAÇÃO DO CULTIVO MIXOTRÓFICO DA Spirulina

platensis (ARTHROSPIRA PLATENSIS) UTILIZANDO SORO

DE QUEIJO MOZARELLA DE BÚFALA COMO FONTE

DE CARBONO ORGÂNICO

MARIA IZABEL BATISTA PEREIRA

MACAÍBA/RN – BRASIL

AGOSTO/2017

ii

MARIA IZABEL BATISTA PEREIRA

AVALIAÇÃO DO CULTIVO MIXOTRÓFICO DA Spirulina

platensis (ARTHROSPIRA PLATENSIS) UTILIZANDO

SORO DE QUEIJO MOZZARELLA DE BÚFALA COMO

FONTE DE CARBONO ORGÂNICO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós Graduação em Produção Animal da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito para obtenção do

título de mestre em Produção Animal.

Orientador: Prof. Dr. Adriano Henrique do

Nascimento Rangel

Co-Orientadora: Dra Bruna Maria

Emerenciano Chagas

MACAÍBA/RN – BRASIL

AGOSTO/2017

iii

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Pereira, Maria Izabel Batista.

Avaliação do cultivo mixotrófico da spirulina platensis (arthrospira platensis) utilizando soro de queijo mozarella de

búfala como fonte de carbono orgânico / Maria Izabel Batista Pereira. - 2017.

75 f.: il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Programa de Pós Graduação em Produção Animal. Macaíba, RN, 2017.

Orientador: Prof. Dr. Adriano Henrique do Nascimento Rangel.

Coorientadora: Drª Bruna Maria Emerenciano Chagas.

1. Microalga - Dissertação. 2. Biomassa - Dissertação. 3. Soro

de leite - Dissertação. I. Rangel, Adriano Henrique do

Nascimento. II. Chagas, Bruna Maria Emerenciano. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 639.64

iii

MARIA IZABEL BATISTA PEREIRA

AVALIAÇÃO DO CULTIVO MIXOTRÓFICO DA Spirulina

platensis (ARTHROSPIRA PLATENSIS) UTILIZANDO

SORO DE QUEIJO MOZZARELLA DE BÚFALA COMO

FONTE DE CARBONO ORGÂNICO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós Graduação em Produção Animal da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito para obtenção do

título de mestre em Produção Animal.

APROVADA EM 18/08/2017

BANCA EXAMINADORA:

______________________________________________________________

Prof. Dr. Adriano Henrique do Nascimento Rangel (UFRN)

(Orientador)

______________________________________________________________

Dra. Bruna Maria Emerenciano Chagas (UFRN)

(Co- Orientadora)

____________________________________________________________

Prof. Dr. Guilherme Fulgêncio (UFRN)

(Examinador)

________________________________________________________________

Prof. Dr. Roberto Sassi (UFPB)

(Examinador)

iv

A DEUS, Aos meus amados Pais, Manoel & Ana

e irmãos, Paulo Emanuel & Maria Estela

Dedico!

v

“O impossível só torna-se impossível, para aqueles que não

enxergam neles a possibilidade da mudança, do recomeço, do

acreditar. Acreditar sempre, até torná-lo possível”

vi

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus pela oportunidade de simplesmente existir e

por me tornar uma pessoa mais forte em momentos difíceis;

Aos meus amados pais Ana Lúcia & Manoel Pereira por sempre, sem ao

mesmo entender muitas decisões tomadas, pelo apoio, paciência, amor, carinho e

incentivo a tornar-me sempre uma pessoa de bem.

Aos meus irmãos Paulo Emanuel & Maria Estela, pelo amor incondicional.

As minhas tias Rita, Carmen e “Pequena”, pelo carinho, apoio e amor.

A família Marinho, Tia Edneuza, Andreza, Artur, Seu Lula (in memorian),

Katara e Biro, por me acolherem como filha e amiga, pelos puxões de orelha

quando necessários, por tantos momentos de alegria compartilhados, pelo amor e

carinho a mim cedida e por nunca medir esforços para comigo, serei eternamente

grata todos vocês, muito obrigado, levarei vocês em meu coração.

A Jeska e família (seu Bôsco, dona Cida, Juan, Marialdo e Maria Alice),

pelo carinho e acolhimento.

Ao meu orientador, Adriano Rangel, pela oportunidade a mim concedida,

confiança e apoio para com a pesquisa.

A Bruna Maria, minha co-orientadora, muito obrigado pelo imenso apoio,

dedicação, paciência, entusiasmo e incentivo durante todo o trabalho de

dissertação, não tenho palavras para agradecer tamanha gratidão para contigo,

imensamente obrigada Bruna.

Ao querido professor Guilherme, pelo apoio para comigo durante o período

inicial da minha pesquisa acadêmica, sempre gentil, o meu muito obrigado.

Ao professor Emerson pelo apoio durante todo o trabalho de dissertação e

disponibilidade do laboratório para a condução do experimento e análises.

Ao professor Rodrigo pelo apoio durante a execução do experimento e pela

disponibilidade do liofilizador.

Ao querido professor Roberto Sassi, pelo apoio para comigo durante todo o

período de minha pesquisa acadêmica, imensamente grata ao senhor.

As professoras Stela Urbano e Andreza Marinho, pelo apoio de sempre e por

nunca medir esforços para comigo, muito obrigada.

Ao grupo de pesquisa LABOLEITE, Stela, Emanuelle, Edine, Araina,

Joadilza, Yhêlda e Gustavo, muito obrigado por tornar os dias mais agradáveis,

vii

pelo apoio, carinho, brincadeiras e tantos momentos de descontração, muito obrigado a

todos vocês.

Aos que fazem parte do Laboratório de Nutrição Animal, Luís, Chico, Lourdes,

Jéssica, Maximila, Aninha, Joedson muito obrigada pelos momentos de descontração,

alegrias e tantos bons momentos compartilhados.

As amigas e integrantes da melhor república “PERNAMBUCANA”, Edine,

Andreza, Joelma, Claudiana, Aline “Guedes”. Serei grata eternamente a todos vocês

pelo acolhimento, alegrias e tantos bons momentos compartilhados durante esses dois

anos de mestrado, mais acima de tudo pelos bons momentos vividos. Sem esquecer a

“Juju” (síndica) por sempre torcer pelo crescimento de todas as meninas, sempre alegre

para com todas, muito obrigada.

Aos amigos da turma de mestrado, Edine, Claudiana, Aline, Aninha, Nathália e

Marcel, foi muito bom conhecer e conviver com vocês.

As minhas amigas do coração, Cydianne & Brenna, que mesmo distante

fisicamente, sempre estiveram presente, me apoiando, dando força, pelo

companheirismo, carinho e por tantos momentos de alegria.

A todos que de forma direta e/ou indiretamente, contribuíram para este momento,

muito obrigado.

viii

SUMÁRIO

CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................................... 12

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 16

CAPITULO I ............................................................................................................................... 19

CULTIVO DE MICROALGAS EM RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS:

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................................. 19

RESUMO .................................................................................................................................... 20

ABSTRACT ................................................................................................................................ 21

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 22

2. MICROALGAS .................................................................................................................. 24

3. APLICAÇÕES DAS MICROALGAS ................................................................................ 25

3.1. Biotecnológicas ........................................................................................................... 26

3.2. Ambientais .................................................................................................................. 28

4. CULTIVOS DE MICROALGAS ....................................................................................... 29

4.1. Sistemas de cultivo ...................................................................................................... 29

4.2. Metabolismos .............................................................................................................. 30

5. CULTIVOS DE MICROALGAS UTILIZANDO RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA . 31

5.1. Soro de leite ................................................................................................................. 32

6. DESAFIOS E PERSPESCTIVAS ...................................................................................... 33

8. REFERÊNCIA .................................................................................................................... 35

CAPÍTULO II ............................................................................................................................. 41

CULTIVO MIXOTRÓFICO DA SPIRULINA PLATENSIS COM SORO DE QUEIJO

BUBALINO: EFEITO NA PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COMPOSTOS BIOATIVOS .... 41

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 44

2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 45

2.1 Micro-organismo e meio de cultura ............................................................................ 46

2.3 Determinação da concentração celular ........................................................................ 48

2.4 Parâmetros do crescimento .......................................................................................... 49

2.5 ANÁLISES QUÍMICAS ............................................................................................. 49

2.5.1 Matéria seca......................................................................................................... 49

2.5.2 Cinzas .................................................................................................................. 49

2.5.3 Proteínas totais .................................................................................................... 50

2.6 Atividade antioxidante ................................................................................................ 52

2.6.1 Compostos fenólicos ........................................................................................... 52

2.6.4 Análise estatística .................................................................................................... 53

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 53

ix

3.1 Curva de crescimento das Spirulina platensis ............................................................. 55

3.2 Controle de pH ............................................................................................................ 58

3.3 Composição bioquímica .............................................................................................. 59

4. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 67

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 68

ANEXO 1 .................................................................................................................................... 73

ANEXO 2 .................................................................................................................................... 75

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fluxograma do preparo do soro de queijo bubalino para utilização em

cultivos.

Figura 2. Período de adaptação dos cultivos iniciais.

Figura 3. Distribuição experimental dos cultivos adaptados.

Figura 4. Curva de Crescimento da S.platensis cultivada em meio autotrófico Zarrouk e

meio mixotrófico complementado com soro de queijo bubalino (Desvio

padrão da triplicata).

Figura 5. Produtividade da S.platensis cultivada em meio autotrófico Zarrouk e meio

mixotrófico complementado com soro de queijo bubalino (Desvio padrão da

triplicata) no 4° dia de crescimento.

Figura 6. Controle de pH, monitorado a cada 24h nos cultivos de S.platensis cultivada

em meio autotrófico Zarrouk e meio mixotrófico complementado com soro de

queijo bubalino (Desvio padrão da triplicata).

Figura 7. Influência do percentual do soro na síntese de carboidratos e proteínas pela

S.platensis.

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição química do meio Zarrouk (1966).

Tabela 2.Distribuição e descrição dos tratamentos utilizados.

Tabela 3.Concentração de biomassa máxima (Xmáx), produtividade maxima (Pmáx) e

velocidade especifica maxima de crescimento (µmáx) da cianobactéria

S.platensis cultivada em meio autotrófico Zarrouk e meio mixotrófico

complementado com soro de queijo bubalino.

Tabela 4. Influência do percentual do soro na síntese de carboidratos e proteínas pela

S.platensis.

Tabela 5. Perfil dos ésteres metílicos de ácidos graxos presentes na biomassa da

S.platensis cultivada em meio controle e meio mixotrófico com adição de

soro de queijo bubalino.

Tabela 6.Teores de fenólicos extraíveis totais.

Tabela 7.Atividade antioxidante da S.platensis pelo método de Captura do Radical

Livre - ABST•+ (ácido 2,2´-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico) e

Redução do Ferro FRAP.

12

CONSIDERAÇÕES INICIAIS 1

2

O cultivo de microalgas é uma atividade consolidada devido a grande 3

importância socioeconômica que representa. Atrelado ao elevado potencial de produção 4

de biomassa e biocompostos oriundos dessa matéria-prima, a cadeia produtiva ainda 5

carece de maior viabilização dos processos inseridos dentro do sistema, principalmente 6

relacionados aos custos operacionais elevados, o que limita maior expansão das plantas 7

produtoras, otimização de produção e consequente reflexo nos preços de mercado. 8

Estima-se que a produção mundial das microalgas Spirulina e Chlorella 9

desidratada supere 5000 e 2000 toneladas respectivamente, e a valorização seja em 10

torno de $ 40 milhões/ano (Milledge, 2012; Spolare et al, 2006). Apesar do mercado 11

cada vez mais aquecido pela produção e comercialização desses organismos, os custos 12

inseridos nesses processos são altos, o que leva as indústrias a buscarem soluções para 13

reduzi-los e viabilizar o processo industrial . A utilização de resíduos como precursor de 14

substratos de baixo custo e de acesso livre, se destaca como alternativa para os cultivos 15

microalgais, o que tem levado o desenvolvimento de muitas pesquisas a esse respeito 16

nos últimos anos (ZHOU et al, 2014; WU et al, 2014; LI et al, 2011) 17

A utilização de efluentes de diversos segmentos industriais na produção de 18

microalgas vem crescendo e tornando uma interessante ferramenta disponível para 19

otimizar os índices produtivos, minimizando os custos operacionais, além da 20

importância para abordagem de questões de caráter econômico e ambiental 21

(CHRISTENSON, L.; SIMS, R., 2011). 22

Estão em andamento pesquisas sobre o uso de resíduos agroindustriais de vários 23

segmentos, entre eles, resíduos lácteos (Hena et al., 2015 ), resíduos da suinocultura 24

( Zhu et al., 2013 ), resíduos e efluentes do processamento da cana-de-açúcar ( Ramirez 25

et al. , 2014 ), esgoto doméstico ( Kligerman e Bouwer, 2015 ), resíduos de cervejarias 26

( Farooq et al., 2013 ) fabricação de tapetes ( Chinnasamy et al., 2010 ) e processamento 27

de óleo de palma ( Lam e Lee, 2011 ), os quais podem ser utilizados pelas microalgas 28

para produção de biomassa de qualidade, acarretando na diminuição dos custos, 29

mantendo a qualidade dos produtos obtidos. Apesar disso, há um aumento considerável 30

na procura por fontes residuais alternativas de nutrientes devido os custos de aquisição 31

serem inferiores aos usualmente utilizados na escala de produção, falta de aplicação 32

13

destes resíduos pelas próprias indústrias, as quais em sua maioria não dispõem de 33

tratamento e descarte adequado, ocasionando problemas de cunho ambiental. 34

O próprio reuso da água oriunda dos cultivos já contribuiria para a minimização 35

dos custos por representar um ponto importante no sistema de produção. A produção 36

microalgal detém de um processo de elevada exigência de corpos d’água, devido a 37

densidade de material algáceo ser baixa. Estima-se que para produção de 1 Kg de 38

microalga, necessite de aproximadamente 1000 Kg de água, podendo haver variações 39

devido as concentração de biomassa no raceway, bem como nas etapas subsequentes do 40

processo industrial (TU et al, 2016; MURPHY, C. F.; ALLEN, D. T., 2011; 41

SUBHADRA, B. G.; EDWARDS, M., 2011). Contudo, a reciclagem da água oriunda 42

de cultivos microalgais possibilita reduções em 84% nos custos com novas demandas de 43

água e em 55% os custos com nutrientes (YANG et al, 2011). 44

A inserção dos resíduos agroindustriais nos sistemas de produção enaltece a 45

possibilidade de redução dos custos operacionais do setor, considerado elevado. Por 46

outro lado, os investimentos feitos em prol de pesquisas com o intuito de estudar a 47

aplicabilidade destes resíduos, domínio das tecnologias empregadas nos processos, e a 48

viabilidade destes dentro do segmento produtivo, são fundamentais para o sucesso da 49

produção, bem como para a qualidade dos produtos obtidos. 50

A geração de efluentes pelas indústrias laticinistas apresentam elevadas 51

concentrações de demanda bioquímica de oxigênio (DBO), demanda química de 52

oxigênio (DQO), amônia, fosfatos, compostos tóxicos ao meio ambiente e componentes 53

(lactose, gordura e proteínas) com elevada contribuição com a poluição ambiental 54

(MARKOU & GEORGAKAKIS, 2011). 55

Inserido na gama de produtos lácteos oriundos do processamento do leite 56

bubalino, destaca-se o queijo tipo mozzarela, o qual possui mercado estabelecido e 57

futuro promissor no Brasil, devido à possibilidade de acrescentar maior valorização em 58

comparação com o queijo oriundo do leite bovino. Portanto, é crescente o número de 59

indústrias que fazem uso do leite de búfalo para processamento e fabricação de produtos 60

lácteos, sendo o queijo mozzarella o de maior destaque entre os produtos gerados 61

(Associação Brasileira de criadores de búfalos, 2014; TONHATI et al, 2011). 62

Sendo um importante resíduo gerado pelas indústrias laticinistas, o soro de leite 63

obtido através da precipitação e remoção das caseínas do leite durante o processamento 64

do queijo tem suas características variadas de acordo com o a qualidade do leite obtido, 65

14

tipo de processamento adotado e tecnologia empregada (MARSHALL, 2004; 66

SMITHERS, 2008; MURARI et al., 2011). 67

O leite de búfalo se destaca por apresentar características importantes que atribuem 68

maior rendimento ao processamento do leite para fabricação de queijos em geral. O 69

quantitativo de leite utilizado para produzir 1Kg de queijo mozzarela equivale a 10 70

litros de leite bovino, já em relação ao leite bubalino, seriam necessários 71

aproximadamente 5 litros, evidenciando a rentabilidade no sistema de produção. 72

O quantitativo de resíduos gerados pela produção de queijos varia em relação ao 73

volume utilizado, função e forma das técnicas inseridas no processo. Em média gera-se 74

aproximadamente 10 litros de soro para cada quilo de queijo produzido (ALMEIDA; 75

TAMINE; OLIVEIRA, 2008; BARBOSA et al., 2010). 76

De acordo com departamento de agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2012) 77

a produção de queijos no Brasil foi de 670.000 toneladas em 2011, sem levar em 78

consideração a produção oriunda de indústrias ilegais que, segundo a Associação 79

Brasileira de Indústrias de Queijo (ABIQ, 2012), representa 40% do total produzido no 80

Brasil. 81

Possuindo uma elevada DBO, cerca de 175 vezes maior que o esgoto 82

doméstico, o soro de queijo caracteriza-se como potencial poluente e que em um 83

passado recente, levou os órgãos governamentais e outras autoridades reguladoras à 84

estabelecer restrições e /ou proibir o escoamento desse resíduo não tratado. Mesmo o 85

soro apresentando características potenciais como precursor para elaboração de outros 86

produtos, muitas indústrias laticinistas ignoram essa característica e acabam por 87

descartá-lo. No Brasil, ainda há resistência no uso do soro na alimentação humana, 88

sendo muitas vezes utilizado para alimentação animal e/ou adulteração de produtos, ao 89

contrário do que ocorre na Europa e América do Norte ( BALDISSERA et al, 2011). 90

Embora o soro seja considerado um alimento rico em nutrientes e cerca de 91

quatro vezes mais barato do que o leite, ainda é tido como resíduo por parte das 92

indústrias lácteas, caracterizando-se como um problema ambiental, visto a elevada DBO 93

que possui (NEELIMA et al., 2013). 94

CHAVES et al, 2012, utilizando Spirulina platensis como alternativa para o 95

tratamento de resíduos oriundos de laticínios, observaram reduções de até 93,6% de 96

DQO, além de demonstrar ser uma alternativa viável para o tratamento dos efluentes 97

gerados bem como produção de biomassa e seus derivados com valor comercial. 98

15

A produção de microalgas no Brasil está em crescente expansão, porém não 99

possui competitividade quando comparada com a produção de outros países. Entretanto 100

o país possui características favoráveis á produção em larga escala e consequente 101

expansão destes cultivos, podendo tornar-se competitivo no mercado internacional. 102

O Brasil possui potencial e condições favoráveis ao desenvolvimento 103

tecnológico para exploração de microalgas, com destaque para o nordeste brasileiro, 104

pela tendência a apresentar custos produtivos inferiores em relação a outras regiões do 105

país, devido ás condições geográficas e climáticas favoráveis. Entretanto, a falta de 106

financiamento e subsídios por parte de órgãos governamentais, agências de fomento 107

entre outros órgãos, impõe barreiras na adoção e ampliação deste segmento (ADENLE 108

et al, 2013; LUTHRA, S. et al, 2015; BRASIL, B. S. A. F; SILVA, F. C. P.; 109

SIQUEIRA, F. G, 2016). 110

Por mais que a geração dos efluentes agroindustriais seja uma preocupação 111

recorrente por parte desses setores, se faz necessário pesquisas que avaliem a inserção 112

deste resíduo na geração de co-produtos. A escassez de pesquisas que avaliem a 113

aplicação de efluentes advindos das diversas etapas de processamento dessa matéria-114

prima para o cultivo de microalgas é uma oportunidade de investigação do potencial de 115

recuperação desses nutrientes, produção de compostos valiosos, bem como a aplicação 116

comercial como matéria-prima para produção de compostos bioativos, nutracêuticos, 117

cosméticos, farmacêuticos, geração de bio-óleo, bioetanol e produção de 118

biocombustíveis a partir do cultivo da biomassa. 119

Portanto a importância do uso alternativo de resíduos agroindústrias com 120

destaque para o soro de queijo bubalino pode contribuir como meio alternativo de 121

cultivo para produção de S.platensis, auxiliando na redução dos custos produtivos desta 122

microalga, bem como na viabilização dos produtos oriundos deste cultivo, aliado aos 123

benefícios ambientais em função da diminuição dos resíduos gerados pelo setor , 124

contribuindo positivamente para o controle e melhoria do meio ambiente, e 125

possibilidade de agregar valor comercial aos resíduos de forma geral. 126

Apesar da S.platensis poder ser denominada como microalga e/ou cianobactéria, 127

neste trabalho a mesma será referenciada apenas como microalga. 128

129

130

16

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 131

132

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BALDISSERA, A. C.; DELLA B. F.; BARRETTO P. A. L.; LINDNER, J. D. D. 145

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262

CAPITULO I 263

CULTIVO DE MICROALGAS EM RESÍDUOS 264

AGROINDUSTRIAIS: FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 265

266

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292

20

RESUMO 293

294

A demanda por novas fontes de alimentos vem crescendo aceleradamente ao 295

longo dos anos. Pesquisas têm sido desenvolvidas em busca de alimentos funcionais 296

com alto valor nutricional e tecnologia de produção de baixo custo. Atualmente, as 297

microalga vêm sendo muito estudadas em virtude das vantagens oferecidas por esses 298

organismos, sendo uma alternativa viável para elaboração de novos produtos, além de 299

agregar valor comercial. A Spirulina platensis (Arthopsira platensis) é uma microalga 300

que apresenta alta eficiência fotossintética quando comparada a plantas tradicionais, 301

sendo capaz de produzir grande quantidade de biomassa em curto intervalo de tempo. 302

Apesar destas vantagens, o custo de produção da biomassa de Spirulina ainda é muito 303

alto, em virtude disto, pesquisas envolvendo fontes alternativas de cultivo tem mostrado 304

que é possível cultivar a Spirulina platensis em diversos efluentes industriais tornando 305

possível a redução dos custos de produção. Diante deste cenário, os resíduos 306

agroindustriais se inserem como alternativa por apresentarem entre outros componentes, 307

alto teor de carbono em sua composição podendo ser aproveitados nos cultivo de algas e 308

microalgas. Esses organismos promovem a biofixação deste carbono disponível no 309

meio, transformando-o em metabólitos valiosos que podem ser utilizados na indústria 310

de alimentos, química e farmacêutica. A utilização dos resíduos agroindustriais também 311

contribui com a redução de impactos ambientais causados pelo seu descarte de forma 312

incorreta. Portanto, a utilização desses resíduos para o cultivo de microalgas é um 313

processo sustentável capaz de agregar valor aos processos industriais e originar 314

produtos de alto valor de mercado. 315

316

Palavras-chaves: Agroindústria, composição bioquímica, microalgas, resíduo alternativo 317

318

319

320

321

322

323

324

21

ABSTRACT 325

326

The requirement of functional foods by the population has been accelerating 327

over the years, which makes significant the incentive of companies and research organs 328

in the development of technologies capable of enabling the formulation of foods with 329

high nutritional value, bringing health benefits and improving the quality of life. 330

Nowadays, algae and microalgae have been greatly studied because of the advantages 331

offered by these organisms, being a viable alternative to the elaboration of new 332

products, In addition to aggregating business value. Spirulina (Arthopsira platensis) is a 333

microalgae that features high efficiency photosynthetic when compared to traditional 334

plants, being able to produce biomass in a short time interval. Despite these advantages, 335

the cost of producing the biomass of Spirulina platensis is still very high, because of 336

this, research involving alternative sources of cultivation has shown that it is possible to 337

cultivate the Sprulina platensis in various industrial effluents making it possible to 338

reduce production costs. In the face of this scenario, the residues agroindustrial are 339

inserted as an alternative to presenting among other components, high carbon content in 340

their composition can be used in the cultivation of algae and algae. These organisms 341

promote biofixation of this available carbon in the middle, transforming it into valuable 342

metabolites that can be used in the food, chemical and pharmaceutical industry. The use 343

of agroindustrial waste also contributes to the reduction of environmental impacts 344

caused by its disposal in an incorrect way. Therefore, the use of these residues to 345

cultivate microalgae is a sustainable process capable of aggregating value to industrial 346

processes and originating high market value products. 347

Keywords: Agribusiness, biochemistry composition microalgae, alternative residue 348

349

350

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355 356 357 358 359 360

22

1. INTRODUÇÃO 361

362

A exigência de alimentos funcionais pela população vem crescendo 363

aceleradamente ao longo dos anos, o que torna significativo o incentivo de empresas e 364

órgãos de pesquisas no desenvolvimento de tecnologias capazes de viabilizar a 365

formulação de alimentos com alto valor nutricional, trazendo benefícios à saúde e 366

melhorando a qualidade de vida. Além disso, é de suma importância que os produtos 367

tenham alta aceitabilidade pelos consumidores, baixo custo produtivo e retorno 368

financeiro satisfatório. Neste sentido, muitas pesquisas vêm sendo realizadas com o 369

objetivo de produzir, de forma economicamente viável, alimentos funcionais aplicados à 370

nutrição animal e humana. Nesta vertente, destaca-se o aproveitamento de subprodutos 371

agroindustriais agregando valor aos processos produtivos e reduzindo os custos. As 372

características nutricionais, a disponibilidade e o baixo custo de obtenção evidenciam a 373

possibilidade de utilização dos subprodutos nas linhas de produção. 374

As microalgas vêm sendo muito pesquisadas em virtude dos benefícios que 375

oferecem, portanto podem ser inseridas com destaque no contexto da alimentação 376

funcional por possuir em sua composição compostos que proporcionam benefícios a 377

saúde, bem como aplicações nutricionais, farmacêutica, ampla diversidade terapêutica, 378

redução dos riscos a problemas de saúde, além de possibilitar valorização comercial dos 379

resíduos. 380

As microalgas consistem em uma variedade de organismos autotróficos, 381

procarióticos ou eucarióticos, onde sua estrutura unicelular permite que a energia solar 382

seja facilmente convertida em energia química. Essa conversão bioquímica está sendo 383

aproveitada comercialmente para a obtenção de biomassa de microalgas e, 384

consequentemente, de produtos com aplicação comercial. As técnicas de cultivo de 385

microalgas mais utilizadas atualmente são as lagoas aeradas abertas e os 386

fotobiorreatores fechados (BRENNAN & OWENDE 2010, HARUN et al. 2010, Chen 387

et al. 2011, SINGH et al. 2011). 388

O sucesso do cultivo é influenciado pelas diferentes formas de metabolismo 389

energetico, destacando-se o fotoautotrofico, heterotrofico, mixotrofico e 390

fotoheterotrofico. A compreensao destas formas de metabolismo permite aplicar as 391

microalgas, estrategias de cultivos visando o aumento da producao de biomassa 392

microalgal e seus coprodutos em grandes escalas. 393

23

Uma das espécies mais utilizadas é a Spirulina (A. Platensis) como fonte 394

alternativa na alimentação humana e animal por apresentar alto teor de proteínas que 395

usualmente varia de 40 a 70% a depender das condições de cultivo. Esta microalga 396

caracteriza-se pela versatilidade, podendo oferecer aplicações nutricionais, terapêuticas, 397

farmacológicas, compostos de alto valor agregado como, por exemplo, formulação de 398

medicamentos, produção de pigmentos naturais, marcadores fluorescentes, probióticos e 399

prebióticos, além de ser fonte de nutrientes como vitaminas, proteínas e carboidratos. 400

Estudos mostram que o consumo de microalgas, além de resultar em atributos 401

terapêuticos significativos, como efeito redutivo nos teores de lipídeos no sangue, 402

redução de peso e consequentemente diminuição dos efeitos da obesidade, diabetes, 403

auxilia no combate a doenças intestinais, hipertensão, osteoporose, inibição da anemia e 404

melhoria do quadro imunológico de pacientes portadores do vírus HIV/AIDS (NGO-405

MATIP et al, 2015). 406

Apesar dos cultivos microalgais apresentarem vantagens em relação a não 407

competição por terras produtivas como a produção de alimentos e por poder ser 408

cultivada em diversos locais com características adversas, os custos operacionais 409

produtivos e tecnológicos ainda são considerados onerosos. Contudo, se faz necessário 410

o aprimoramento e domínio de tecnologias capazes de viabilizar os processos industriais 411

inseridos na produção de microalgas, a fim de aumentar os índices produtivos atuais 412

(TAHER, 2013). 413

Há diversas formas de obtenção de cultivos microalgais, dentre os usualmente 414

utilizados destaca-se o autotrófico, principal sistema utilizado para cultivos em larga 415

escala. Entretanto, existem outros sistemas que são utilizados, bem como os cultivos em 416

sistemas autotróficos, heterotróficos e mixotróficos (VIEIRA et al., 2014). 417

Os resíduos gerados pelas indústrias laticinistas além de apresentam elevadas 418

concentrações de DBO, DQO, amônia, fosfatos, sólidos suspensos nocivos ao meio 419

ambiente, como também os componentes dissolvidos como lactose, gordura e proteínas 420

originadas do leite, possuem contribuindo com a poluição do meio ambiente 421

(MARKOU ; GEORGAKAKIS, 2011). 422

A utilização de resíduo no cultivo de microalgas vem se consolidando ao longo 423

dos anos com o intuito de ampliar e diversificar de forma alternativa o controle e 424

combate ao descarte inadequado destes resíduos nas respectivas indústrias aliado a 425

perspectiva de minimização dos custos operacionais de microalgas em larga escala, os 426

quais são considerados elevados. Segundo CHAVES et al, 2012, utilizando S. platensis 427

24

como alternativa para o tratamento de resíduos oriundos de laticínios, observaram 428

reduções de até 93,6% de DQO, além de demonstrar ser uma alternativa viável para o 429

tratamento dos efluentes gerados, bem como produção de biomassa e derivados, 430

agregando valor comercial aos produtos gerados.. 431

Nesse contexto, os resíduos agroindústrias, com destaque para o soro de queijo 432

bubalino, se inserem como viés alternativo de minimizar os custos produtivos 433

microalgais, além de contribuir para produção de qualidade de biomassas e co-produtos 434

diversos, os quais podem ser inseridos nos mais diferentes segmentos industriais, 435

contribuindo para a valorização dos resíduos gerados e diversificando as possibilidades 436

de utilização. 437

438

2. MICROALGAS 439

Microalgas é um termo genérico comumente utilizado, que se refere a um grupo 440

amplamente diverso de microrganismos fotossintéticos (Sanchez-Silva et al., 2013). 441

Existem diversas espécies de microalgas, as quais são encontradas em diversos 442

ambientes aquáticos de água doce, salobra e salina (Scott et al. 2010). As microalgas em 443

geral possuem tamanhos microscópicos variados, realizam fotossíntese, utilizam o 444

dióxido de carbono como fonte de nutriente para o crescimento, além de desempenhar 445

papel fundamental nos ecossistemas (Suganya et al. 2016; Guedes et al 2011a, Guedes 446

et al 2011b). 447

Estima-se que existam cerca de 800 mil espécies de microalgas, das quais cerca 448

de 40 a 50 mil são de conhecimento científico, o que torna um recurso quase que 449

inexplorado, demonstrando a grande biodiversidade dessas algas (Oncel, 2013, Hu et 450

al., 2008). Além da maioria dessas microalgas não são conhecidas e dentre estas, 451

pouquíssimas são utilizadas para alguma finalidade. 452

Segundo Parmar et al, (2011), na estrutura celular desses organismos existe, 453

além da clorofila, outros pigmentos acessórios de proteção e captação de luz que 454

proporcionam elevada capacidade fotossintética que permitem a conversão de até 10% 455

da energia solar em biomassa, percentual mais elevado quando comparado com outras 456

plantas convencionais, cujos percentuais de conversão limitam-se a 1 e 5%, 457

respectivamente. A eficiência na utilização de luz solar, águas salinas e residuais, bem 458

como a adaptabilidade para terras improdutivas, torna-se um potencial a mais na 459

utilização de cultivo de microalgas para produção de alimentos, compostos de valores 460

25

comerciais e outros produtos finais (Draaisma et al. 2013). 461

As divergências existentes em relação à denominação “exata” da classificação 462

de microalgas e cianobactérias são bastante discutidas, uma vez que, esses 463

organismos fotossintéricos integram o grupo das bactérias pertencentes ao reino 464

Procaryotae com denominação de cianobactéria, que tem sido também considerada 465

como microalga (Carvajal, 2009). 466

Entre as espécies de microalgas muito estudadas, destaca-se a S.platensis, 467

pertencente ao grupo das cianobactérias, que teve origem há cerca de 3,5 bilhões de 468

anos, possuindo estrutura multicelular e filamentosa (Gershwin &Belay, 2007). São 469

organismos foto-autotróficos, crescem naturalmente em água salobra e salina, em 470

diferentes ambientes das regiões tropical e semi-tropical do mundo (Ciferri & Tiboni, 471

1985). 472

A produção de Spirulina tem sido realizada em diversos países do mundo, 473

além de suas propriedades de interesse comercial e outros fins, essa expressividade é 474

devido, em sua grande parte, pela flexibilidade que essas microalgas possuem em se 475

adaptar as adversidades de diferentes regiões, quanto a temperatura, alcalinidade, 476

nutrientes, expressando assim maior resistência quando comparadas a outras algas. 477

Fonte de luz, nutrientes abundantes e temperatura elevada são variáveis exigidas para 478

que ocorra uma produção significativa e de qualidade de Spirulina. As faixas de 479

temperatura ótima para o crescimento dessa espécie oscilam entre 35-38˚C, porém a 480

faixa mínima necessária para sustentar o crescimento é de aproximadamente 15-20˚C 481

(Gershwin & Belay, 2007). 482

Spirulina é conhecida mundialmente por utilizar luz solar como principal fonte 483

de energia através da realização de fotossíntese, apresentando crescimento rápido, alta 484

produtividade, elevado teor de proteínas variando de 40 a 70%, dependendo das 485

condições de cultivo, sendo geralmente utilizada na formulação de suplementos 486

nutricionais (Neofotis et al., 2016). 487

488

3. APLICAÇÕES DAS MICROALGAS 489

As microalgas englobam uma ampla diversidade de espécies, as quais se 490

distinguem umas das outras quanto as suas peculiaridades, contribuindo para melhoria 491

do meio ambiente, possuindo diversas aplicações, seja no tratamento de efluentes, no 492

em indústrias alimentícias, farmacêuticas, produção de biocombustíveis, nutrição 493

animal e humana, etc. 494

26

A crescente expansão dos produtos oriundos da produção de microalgas e o 495

destaque adquirido pelos inúmeros atributos existentes em sua composição e sua 496

aplicabilidade fazem parte de um amplo leque de utilidades inserida nos mais diferentes 497

nichos comerciais, ampliando as possibilidades de uso e agregando valor para o 498

mercado. 499

Segundo Brasil & Garcia (2016), a produção mundial anual de biomassas 500

microalgais triplicou entre os anos de 2004 a 2013, atingindo cerca de 15 mil 501

toneladas/ano (peso seco). Os gêneros Arthrospira (Spirulina) e Chlorella foram as 502

microalgas mais utilizadas na indústria de cosméticos na forma de pigmentos,na 503

aquicultura ou para a alimentação humana como suplementos protéicos. 504

Nos últimos anos diversas pesquisas foram feitas em busca de desenvolvimento 505

de tecnologias para elaboração e diversificação de produtos a base de microalgas, a fim 506

de ampliar e inovar as possíveis formas de aplicações desses produtos, como também 507

agregar valor e investimentos nesse setor.A aplicabilidade dessa biomassa é inserida no 508

preparo de inúmeros produtos, como, por exemplo, na forma de pigmentos (astaxantina, 509

ficcocianina) na nutrição humana e animal, como também na forma de cápsulas e/ou 510

comprimidos, como emulsificantes no preparo de sorvetes e cremes, carboidratos para 511

produção de etanol, bioplásticos, e outros químicos, lipídeos para serem aplicados para 512

produção de bio-óleo, bioquerosene, lubrificantes, etc, além de participar no combate e 513

tratamento de efluentes, aplicabilidade na aqüicultura e entre outros (Brasil e Garcia, 514

2016). 515

3.1. Biotecnológicas 516

517

O potencial biotecnológico que as microalgas possuem é gigantesco e cada vez 518

mais pesquisas estão sendo realizadas a fim de desenvolver e dominar tecnologias que 519

permitam conhecer e produzir microalgas de forma viável e eficaz, obtendo compostos 520

valiosos que possam ser aplicados em diversos segmentos da indústria (nutrição animal, 521

farmacêutica, cosméticos, uso terapêutico, biocombustíveis, materiais). 522

Quando comparadas com outras fontes de matérias-primas de origem agrícola, as 523

biomassas microalgais possuem importantes vantagens: possuem elevada produtividade, 524

realizam fotossíntese e seqüestro de CO2, boa adaptação a ambientes lacustres e 525

adversos, terras aráveis , independe da qualidade nutricional dos solos, fontes hídricas 526

não potáveis, podem ser produzidas durante todo o ano, não competem com produções 527

agrícolas, dependendo da espécie cultivada, as biomassas podem apresentar elevados 528

27

teores de proteína, carboidratos, lipídeos, ácidos graxos e outros compostos de elevado 529

valor agregado. Contudo, apesar dessas microalgas possuírem amplo potencial de 530

produção e aplicações, existe muitos obstáculos frente á biodiversidade dessas algas, 531

como domínio de tecnologias para produção, pesquisas de melhoramento genético de 532

cepas mais resistentes a patógenos, viabilidade econômica na produção em larga escala, 533

como também disponibilidade industrial que possa competir com produtos existentes no 534

mercado (Lam, M.K & Lee KT, 2012 ; Chen H et al, 2015). 535

Segundo Georgianna e Mayfield, (2012), apesar de promissora, o sucesso de 536

inserção de microalgas na elaboração de vários produtos depende principalmente de 537

dois fatores importantes: elevada produtividade e qualidade de biomassa, como também 538

custo- benefício de produção. 539

Estudos vêm sendo feitos utilizando diversos meios alternativos de cultivo como, 540

por exemplo, resíduos industriais provenientes de laticínios, cervejarias, sucroalcoleira, 541

pecuária com a finalidade de ampliar as formas de melhor utilizar esses resíduos, 542

evitando sua contribuição para poluição ambiental. O gás de combustão industrial, em 543

particular quando utilizado gás de cervejarias, fábricas de cimento e usinas a gás, tem 544

demonstrado ser eficientes no cultivo de microalgas, devido estes gases possuírem 545

baixos de níveis de óxidos de nitrogênio, SOx e o NOx, também conhecido como 546

dióxido de enxofre, é um gás proveniente de vulcões e processos industriais, os quais 547

são nocivos para o sistema respiratório, contrinuem para a ocorrência de chuvas ácidas e 548

eutrofização de rios ( Moreira e Pires, 2016). No caso do gás de conduto oriundo de 549

indústrias de carvão, o mesmo tem-se mostrado adequado para cultivo de microalgas, 550

quando primeiramente diluído com ar, ou inserido em pequenas proporções e 551

adicionado ao cultivo (Van Den Hende et al, 2012; Kao et al, 2014; Moheimani, 2015). 552

Devido o crescimento econômico, populacional e aumento da demanda por energias, é 553

cada vez maior a busca por combustíveis fósseis e derivados, o que acarreta problemas 554

mais agravantes com a crise energética e coincidentemente problemas de cunho 555

ambiental. Paralelamente, os processos oriundos de combustão para produção de 556

energia, proporcionam a formação de gases tóxicos, os quais contribuem para o 557

aumento do efeito estufa e consequente aquecimento global (Saratala et al, 2015). Uma 558

maneira de minimizar os impactos ambientais causados pelas energias usualmente 559

utilizadas seria a produção em larga escala e adoção de energias renováveis “limpas”, 560

contribuindo para a melhoria do meio ambiente e saúde global. 561

Frente a este cenário as diversas possibilidades de utilização de ferramentas 562

28

biotecnológicas para o aprimoramento de tecnologias com uso de biomassas 563

microalgais são necessárias para alavancar a produção de microalgas, ampliar o leque 564

de utilidades que, a curto ou longo prazo, possam contribuir para melhoria de processos 565

industriais em larga escala, como também para redução da poluição ambiental gerados 566

pelas matérias-prima atualmente utilizadas. Porém é necessário cada vez mais 567

investimentos, desenvolvimento bem como o maior conhecimento dessas microalgas e 568

eficácia na sua utilização e geração de novos bioprodutos a partir de determinada 569

matéria-prima. 570

571

3.2.Ambientais 572

573

Atualmente o aquecimento global é um agravante que vem preocupando 574

ambientalistas em todo o planeta. As principais fontes de mudanças climáticas globais 575

são as concentrações crescentes de gases de efeito estufa, com destaque para o CO2 576

provenientes principalmente de atividades humanas e operações de usinas de energia. 577

Embora existam diferentes formas de captura de CO2, o método biológico se destaca 578

como uma alternativa potencialmente atrativa. As exigências para produção e obtenção 579

de biomassas oriundas de microalgas são basicamente CO2 e alguma fonte de luz seja 580

ela, natural ou artificial (Chen et al., 2011). O dióxido de carbono pode ser convertido 581

em matéria orgânica através da realização da fotossíntese utilizando a luz solar como 582

fonte de energia. Em se tratando de algas e microalgas a utilização de luz solar para 583

conversão de CO2 gera metabolitos orgânicos e oxigênio. Quando a disponibilidade de 584

luz é interrompida, esses organismos tendem a utilizar o oxigênio juntamente com a 585

matéria orgânica para produzir energia (Commault et al, 2014; Wu et al, 2013a; Wu 586

et al, 2013b). 587

As microalgas e cianobactérias apresentam uma maior eficiência para a fixação 588

de CO2 e maior taxa de produtividade (ton/ha/ano) quando comparadas ás plantas 589

terrestres. Além disso, a biofixação biológica de CO2 por microalgas pode ser 590

combinada com outros processos, como o tratamento de resíduos orgânicos, sendo 591

vantajoso em termos de viabilidade econômica e sustentabilidade ambiental. As 592

microalgas podem ser cultivadas em efluentes orgânicos rico em nutrientes, água 593

salgada e salobra diminuindo o uso de terra fértil e de água potável doce (Razzak et al., 594

2017). 595

29

A biomassa resultante pode ser utilizada como matéria-prima para a produção de 596

diversos produtos alimentícios e fármacos (Razzak et al. 2017). Outra vantagem 597

relevante é que as algas não seguem regime de safras, podendo ser produzidas durante o 598

ano todo, e o fator “tempo” para obtenção dessa biomassa é relativamente rápido 599

quando comparados ás plantas terrestres. Geralmente para obtenção de biomassa 600

microalgais são necessários aproximadamente de 7 a 10 dias, dependendo das condições 601

oferecidas para o crescimento e consequente produção de biomassa enquanto que para 602

biomassas oriundas da agricultura esse intervalo de tempo pode demorar meses para que 603

as plantas atinjam o ponto de corte ideal para serem utilizadas, como é o caso da soja, 604

milho e cana de açúcar por exemplo. 605

O setor industrial de cimento corresponde a cerca de 6% das emissões de CO2 606

no planeta, além dos gases de chaminés e águas residuais de origem industrial também 607

contribuem para os problemas ambientais, porém estes componentes podem tornar-se 608

ferramentas alternativas para produção de microalgas, uma vez que apresentam elevadas 609

concentrações de CO2 e nutrientes essenciais ao crescimento de microalgas, sendo, 610

portanto de relevância os estudos sobre os efeitos destas alternativas no sistema de 611

microalgas (Javier et al, 2016; Van oss, H. G. e Padovani, A , 2003; WBCSD, 2012). 612

Pesquisas buscam cada vez mais alternativas viáveis de utilização de resíduos 613

da agroindústria com o objetivo de reduzir os impactos causados pelo descarte incorreto 614

dos mesmos e consequentemente sanar problemas ambientais, além de contribuir para 615

redução dos custos operacionais os quais oneram bastante a produção e comercialização 616

de biomassa e bioprodutos. 617

618

4. CULTIVOS DE MICROALGAS 619

620

4.1.Sistemas de cultivo 621

622

Há uma diversidade nas formas de obtenção de cultivos, sejam eles oriundos 623

de sistemas abertos ou fechados, os quais são mais usualmente utilizados. A decisão de 624

escolha por qual sistema utilizar varia muito em função de diversos fatores, dentre eles 625

estão relacionados a espécie de microalga selecionada para o cultivo, forma de 626

metabolismo adotado, temperatura e tipo de biomassa de interesse (BRENNAN, L.; 627

OWENDE, P., 2010). 628

30

O tipo de sistema adotado dentro do próprio sistema de produção microalgal 629

em larga escala ainda é bastante discutido, uma vez em que ambos os sistemas 630

apresentam suas vantagens e desvantagens, cabendo ao pesquisador analisar as 631

características dos componentes envolvidos, direcionar e definir como será feito, se 632

baseando no objetivo do estudo (ANGELO et al. 2014). 633

A diferença existente entre os sistemas apesar das vantagens e desvantagens 634

está relacionada entre outros fatores, aos custos, além da facilidade de construção e 635

manutenção dos sistemas. Os cultivos abertos acabam sendo mais econômicos que os 636

fechados. Entretanto, apresentam algumas desvantagens quanto à exposição dos cultivos 637

a possíveis contaminações por outras microalgas ou organismos competidores de 638

substrato, influenciando os índices produtivos, perca de água e substrato por 639

evaporação. Já para os sistemas fechados, o isolamento dos cultivos devido ao tipo de 640

estrutura adotada, permite maior controle de produção, índice produtivo elevado, bem 641

como, disponibilidade de água e nutriente, além de exigir pequenas extensões de terras. 642

Em contrapartida, os custos de produção e manutenção destes sistemas são elevados, 643

elevando conseqüentemente os custos final de produção KLEIN, B. C.; BONOMI, A.; 644

FILHO, R. M.,2017). 645

O déficit de água perdido nos sistemas de cultivos fechados é inferior ao perdido 646

pelo sistema aberto, correspondendo a menos da metade do total utilizado (DAVIS, R.; 647

ADEN, A.; PIENKOS, P. T., 2011). 648

Existem também os sistemas denominados híbridos, o qual possui tanto 649

característica de sistema fechado quanto aberto. Existem ainda sistemas abertos 650

cobertos por membrana, permitindo a passagem de luz, tornando os custos operacionais 651

mais econômicos aos sistemas fechados ( KUMAR et al, 2015; LI, S.; LUO, S.; GUO, 652

R., 2013). 653

654

4.2.Metabolismos 655

656

As biomassas microalgais, dependendo das condições de cultivo e da espécie a 657

ser cultivada, podem ser ricas em proteinas, carboidratos, pigmentos e oleos com perfil 658

contendo diversos acidos graxos de interesse industrial. Esses organismos apresentam 659

diferentes formas de metabolismo energetico, destacando-se o fotoautotrofico, 660

heterotrofico, mixotrofico e fotoheterotrofico. A compreensao destes metabolismos 661

permite diversificar o sistema de cultivo visando o aumento da producao de biomassa e 662

31

de determinados metabólitos específicos. Usualmente os cultivos das microalgas são 663

fotoautotróficos, porém a produção de biomassa é baixa quando comparada aos sistemas 664

fotoheterotroficos e mixotroficos, tornando os custos produtivos muito elevados 665

(YANG et al., 2014). 666

As microalgas possuem diferentes formas metabólicas de crescimento, o que as 667

possibilitam tornar-se um microorganismo versátil. O metabolismo autotrófico ocorre 668

basicamente através da fotossíntese, onde os organismos fotossintéticos absorvem luz e 669

transforma essa energia em nutriente para realizar suas atividades metabólicas, de 670

crescimento e produção de biomassa. Diferentemente do autotrófico, os cultivos 671

heterotróficos ocorrem além da absorção de luz, a absorção de compostos orgânicos que 672

estão dissolvidos no meio de cultivo, tendo como principal destaque, os carboidratos, 673

acetato, glicerol e outros ácidos orgânicos disponíveis. Os cultivos microalgais oriundos 674

do metabolismo mixotrófico, o modelo de obtenção tanto de luz quanto de substrato são 675

semelhantes ao autotrófico e heterotrófico além de apresentarem produtividade de 676

biomassa superior em relação aos cultivos fotoheterotróficos (CHOJNACKA; 677

MARQUEZROCHA, 2004; YANG et al., 2014). Acontece que o metabolismo 678

mixotrófico caracteriza-se por unir os dois tipos de metabolismo anteriores, tanto o uso 679

de CO2 oriundo de fonte luminosa quanto substrato disponível de outro composto 680

utilizado em sistema de luz e escuro ( KLEIN, B. C.; BONOMI, A.; FILHO, R. 681

M.,2017). 682

683

5. CULTIVOS DE MICROALGAS UTILIZANDO RESÍDUOS DA 684

AGROINDÚSTRIA 685

686

Os resíduos gerados pelo setor agroindustrial são oriundos do processamento e 687

fabricação de vários produtos (alimentos, indústrias lácteas, sucroalcoleira, 688

biocombustíveis, vinícolas, agropecuária, etc.) o quem têm refletido em vários 689

problemas de cunho ambiental (contaminação de rios, lagos, lençóis freáticos, solos, ar, 690

atmosfera, etc.), uma vez que em sua grande maioria, as empresas não realizam 691

tratamento e/ou destinação correta desse material, o que contribui para o aumento da 692

poluição ambiental. A poluição causada por esses resíduos em sua grande parte é devido 693

possuírem elevadas concentrações de matéria orgânica e metais pesados e quando em 694

contato com o meio ambiente por exemplo, contribuem para poluição, contaminação, 695

eutrofização de corpos hídricos, morte de organismos aquáticos, vegetação local, 696

32

problemas de saúde para população, entre outros fatores. 697

Uma alternativa que vem sendo estudada e bastante discutida é o aproveitamento 698

dos resíduos agroindustriais para produção de microalgas, por possuírem elevada 699

concentração de nutrientes a fim de também contribuir para a redução dos custos de 700

produção desses organismos. Segundo KANG et al, 2015, existem diversos resíduos 701

derivados de processos industriais, que são propostas para o cultivo de microalgas como 702

estratégias de redução dos custos de produção de microalgas, como também diminuição 703

dos impactos ambientais. 704

705

5.1.Soro de leite 706

707

Dentre o leque de atividades agroindustriais, as indústrias lácteas se destacam, 708

possuindo um amplo leque de produtos derivados do leite: leite desnatado, integral, 709

iogurte, bebidas fermentadas, sorvetes, queijos entre outros, tendo contribuição 710

significativa para a economia (JERÔNIMO et al.,2012). 711

A produção nacional de leite em 2013 superou a marca de 33 bilhões de litros 712

produzidos, ocupando o 2° lugar na produção nacional, o leite bubalino vem ganhando 713

cada vez mais espaço no mercado (EMBRAPA, 2015). Cerca de 32% da produção 714

nacional de leites (aproximadamente 10,56 bilhões de litros) foram destinados a 715

fabricação de queijos, alcançando a marca de 1.032 mil toneladas, movimentando cerca 716

de R$ 18 bilhões de reais, e até o ano de 2020 a estimativa é que sejam produzidos 717

1.560 mil toneladas ( ABIQ, 2013). 718

A empresa Tapuio LTDA sediada no estado do Rio Grande do Norte, é pioneira 719

no setor de derivados lácteos bubalino, apresentando produção mensal de 720

aproximadamente 30 toneladas de queijo e tem como principal destaque, o queijo tipo 721

mozzarela. Levando em consideração o quantitativo de resíduo gerado para cada quilo 722

de queijo produzido, o montante de soro produzido ultrapassa os 104 milhões de litros. 723

Porém, a produção de queijos acarreta na geração de diversos resíduos, dentre eles, o 724

soro, que em sua maioria, não é aproveitado pelas indústrias, sendo descartado sem 725

tratamento correto, aumentando os problemas de cunho ambiental. 726

O soro de leite é um resíduo oriundo da fabricação de queijos, possui uma 727

coloração amarelada, representando cerca de 85-90% o volume do leite (SÁNCHEZ, et 728

al. 2011). Componente rico em nutrientes, e em sua maioria é descartado sem 729

tratamento adequado, tornando-se uma importante fonte poluente devido sua elevada 730

33

teor de demanda bioquímica de oxigênio (DBO), contribuindo de forma significativa 731

para o impacto ambiental (FAO, 2013). Nas indústrias lácteas parte do soro produzido é 732

utilizada para produção de derivados (bebidas láteas, iorgutes, coalhadas, etc.) e 733

utilizado na alimentação animal, entretanto, a maior parte desse resíduo não é tratado de 734

forma adequada e acaba sendo descartado no meio ambiente. 735

A composição do soro pode variar em função da qualidade do leite obtido, tipo 736

de queijo produzido e tecnologia adotada. Para cada Kg de queijo produzido, em média 737

9 Kg de soro são gerados (ALVES et al, 2014). Apesar de ser considerado um resíduo 738

pouco utilizado, o soro possui características nutricionais importantes, o qual pode ser 739

utilizado para desenvolvimento de novos produtos como suplementos, alimentos 740

funcionais, alimentação animal, entre outros. O soro de queijo incorpora cerca de 70 a 741

90% do volume do leite e compõe cerca de 50% dos sólidos presentes, tornando assim 742

uma importante ferramenta nutricional (FOX et al 2017; WALSTRA, WOUTERS, & 743

GEURTS, 2006). 744

Com o aumento crescente na produção de queijos e o elevado teor de material 745

orgânico que este possui, é importante a adoção de alternativas que reduzam os 746

impactos ambientais e de saúde causados (YADAV et al, 2015). Diversos estudos vêm 747

sendo realizados em prol de alternativas que possibilitem o desenvolvimento e 748

elaboração de tecnologias viáveis, aplicações de propriedades biológicas e nutricionais 749

do soro, ampliando os produtos gerados a partir dessa matéria-prima (GUYOMARC'H 750

et al., 2015; YADAV et al., 2015). 751

Uma alternativa promissora que vem sendo estudada é a utilização do soro de leite 752

como fonte de nutrientes para produção de microalgas, tendo em vista a quantidade de 753

material gerado, danos causados, com possibilidade de agregar subsídios devido às 754

características presente nesse resíduo, como elevado teor de matéria orgânica, 755

especificamente o carbono, o qual é utilizado como substrato pelas microalgas para 756

produção de biomassa de alto valor comercial. 757

758

6. DESAFIOS E PERSPESCTIVAS 759

Diante de todo cenário e dos investimentos realizados em pesquisas para produção 760

de biocompostos e viabilização dos processos alternativos a partir de microalgas, ainda 761

existem muitos caminhos a serem percorridos, tanto na parte de melhoramento genético, 762

quanto na estrutura de produção viável dessas microalgas, a fim de obter, em um futuro 763

próximo, produções mais significativas e potencial competidor de mercado, além de 764

34

alternativas mais econômicas e com menores impactos ao meio ambiente. Contudo é 765

crescente a busca e incentivo de órgãos e empresas em pesquisas para domínio de 766

tecnologias com microalgas, que, a longo prazo possam ser de grande valia para a 767

adequação dos sistemas produtivos atuais, possibilitando o aproveitamento dos resíduos 768

gerados, englobando todo o ciclo de produção, tornando as atividades mais sustentáveis, 769

minimizando os impactos causados ao meio ambiente e consequentemente os custos de 770

produção. 771

772

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 773

Contudo, estudos devem ser realizados a fim de melhorar o manejo destes 774

resíduos, bem como aperfeiçoar a produção em larga escala, explorando melhor o 775

potencial tecnológico e nutricional da biomassa obtida em meio a soro de queijo 776

bubalino. Além disso, a pesquisa realizada, incentiva, de forma direta, um melhor 777

aproveitamento do soro, contribuindo para a melhoria no desenvolvimento de 778

tecnologias viáveis em prol de melhor aproveitamento e aplicações deste e os demais 779

resíduos agroindustriais, enaltecendo a importância do tratamento e o respaldo positivo 780

na cadeia produtiva, agregando valor aos mesmos, diversificando as utilidades de 781

produtos derivados oferecidos ao mercado produtor e consumidor. 782

783

784

785

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1062

CAPÍTULO II 1063

CULTIVO MIXOTRÓFICO DA SPIRULINA PLATENSIS 1064

COM SORO DE QUEIJO BUBALINO: EFEITO NA 1065

PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COMPOSTOS BIOATIVOS 1066

1067

1068 1069 1070 1071 1072

1073 1074

1075 1076 1077 1078 1079 1080 1081 1082 1083 1084 1085

42

RESUMO 1086

Parâmetros de crescimento, composição bioquímica e capacidade antioxidante 1087

da S.platensis cultivada em meio mixotrófico com 2,5%, 5,0 e 10% de soro de queijo 1088

Mozarella de búfala como fonte de carbono orgânica, foram determinados e 1089

comparados com os dados obtidos no cultivo autotrófico (controle). A S.platensis em 1090

condições mixotrófica apresentou taxas de crescimento específica, produtividade de 1091

biomassa superior as condições autotróficas. A produção de biomassa máxima foi 2,98 1092

g/L no cultivo com 5,0% de soro. Além disso, quando o meio inorgânico foi 1093

suplementado com soro em todas as concentrações houve um aumento significativo do 1094

teor de carboidratos e uma queda no teor de proteínas e lipídios em relação ao controle. 1095

A concentração de compostos fenólicos foi a mesma para as biomassa obtidas nos 1096

cultivos controle e com 2,5% e 5,0% de soro (30,60-33,23mg ácido gálico/g) porém 1097

diminui quando o teor foi aumentado para 10% (22,37 mg ácido gálico/g). A atividade 1098

antioxidante foi avaliada pelos métodos ABST.+ e FRAP e foi observado que as 1099

biomassas obtidas nos cultivos mixotróficos apresentaram atividade antioxidante menor 1100

quando comparadas a obtida no meio autotrófico. O cultivo mixotrófico de S.platensis 1101

utilizando o soro, um subproduto da indústria de laticínios pode ser considerado uma 1102

alternativa viável para reduzir os custos da produção de biomassa de microalgas, 1103

diminuir o tempo de cultivo e produzir carboidratos, uma vez que não requer a adição 1104

de substratos caros ao meio de cultura ao mesmo tempo que trata o efluente considerado 1105

poluente, porém essa não é uma boa estratégia para induzir a síntese de compostos 1106

antioxidantes. 1107

1108

Palavras chave: Spirulina platensis, soro de queijo, mixotrófico, biomassa, Compostos 1109

bioativos 1110

1111

1112

1113

1114

1115

1116

1117

1118

1119

43

ABSTRACT 1120

Growth parameters and biochemical composition of Spirulina platensis 1121

cultivated under different mixotrophic conditions with 2.5%, 5.0% and 10% of buffalo 1122

mozzarella cheese whey production as organic carbon source were determined and 1123

compared to those obtained from a photoautotrophic culture (control).S.platensis under 1124

mixotrophic conditions presented specific growth rates, biomass productivity higher 1125

than autotrophic conditions. In the medium supplemented with 10% of chesee whey, the 1126

growth rate of S.platensis was the highest (2.04 d-1) reaching the stationary phase on 1127

the 4th day of growth. The maximum biomass production was 2.98 g / L in the culture 1128

with 5.0% of cheese whey. Furthermore, when the inorganic medium was supplemented 1129

with cheese whey at all concentrations there was a significant increase in carbohydrate 1130

content and a drop in protein and lipid content relative to control. The concentration of 1131

phenolic compounds was the same for the biomass obtained in control cultures and with 1132

2.5% and 5.0% of cheese whey (30,60-33,23 mg gallic acid/g ), but decreased when the 1133

concentration was increased to 10% (22.37 mg gallic acid/g). The antioxidant activity 1134

was evaluated by the ABST,+ and FRAP methods and it was observed that in all the 1135

mixotrophic cultures the antioxidant activity was lower when compared to the control 1136

culture. Mixotrophic cultivation of S.platensis using cheese whey, a pollutant by-1137

product of the dairy industry can be considered a viable alternative to reduce the costs 1138

of producing microalgae biomass, shorten cultivation time and produce carbohydrates 1139

since it does not require the addition Of expensive substrates to the culture medium in 1140

the same time the effluent is treated, but this is not a good strategy to induce the 1141

synthesis of antioxidant compounds. 1142

1143

Key words: S.platensis, cheese whey, mixotrophic, bioactive compounds 1144

1145

1146

1147

1148

1149

1150

1151

1152

1153

44

1. INTRODUÇÃO 1154

1155

Recentemente as microalgas têm sido muito estudadas por ser uma das fontes mais 1156

promissora de compostos bioativos funcionais. Esses seres estão inseridos em uma vasta 1157

diversidade e apresenta um grande potencial biotecnológico podendo ser aplicados em 1158

diversos seguimentos da indústria química, alimentícia, farmacêutica e de cosméticos 1159

(BRASIL et al., 2017). A biomassa das microalgas pode ser rica em proteínas, lipídios, 1160

carboidratos, vitaminas, pigmentos e enzimas, onde sua composição bioquímica 1161

depende da espécie e das condições de cultivo (SALLA et al. 2016, GOIRIS et al, 1162

2015). 1163

Recentemente, um grande interesse tem sido focado nos alimentos enriquecidos com 1164

compostos bioativos, geralmente, derivados de microalgas em virtude da segurança e 1165

eficácia no tratamento de muitas doenças humanas. Na verdade, a atividade antioxidante 1166

das microalgas provém de sua riqueza em inúmeras moléculas capazes de eliminar 1167

radicais livres (BARKALLAH et al. 2017) 1168

O alto custo do cultivo de microalgas tem sido um grande obstáculo para 1169

comercialização dos seus produtos. Uma das soluções viáveis para a redução de custos 1170

é acoplar o sistema de produção de biomassa rica em biomoléculas de alto valor para 1171

indústria ao tratamento de resíduos da agroindústria, uma vez que as microalgas são 1172

conhecidas por efetivamente eliminar uma variedade de poluentes em águas residuais, 1173

como nitrogênio, fosfatos, carbonos orgânicos, dentre outros (WANG et al., 2016) 1174

Um subproduto da indústria de laticínios no Brasil que tem repercussão é o 1175

soro,resíduo oriundo da fabricação de diversos tipos de queijo, iogurte, sorvete, 1176

manteiga, por meio de diferentes processos, tais como pasteurização, coagulação, 1177

filtração, centrifugação, refrigeração e etc. De acordo com a FAO (Food and 1178

Agricultural Organization), queijo é um dos principais produtos agrícolas do mundo, 1179

onde a geração de águas residuais de soro de queijo é cerca de quatro vezes o volume de 1180

leite processado (CARVALHO et al. 2013). 1181

Tem-se demonstrado que é possível à produção de biomassa de microalgas em 1182

cultivos mixotróficos com soro lácteo, uma vez que este resíduo proporciona substratos 1183

importantes como açúcares e dióxido de carbono para as microalgas que são capazes de 1184

auxiliar na eliminação de fósforo, nitrogênio e açúcares de diferentes efluentes 1185

industriais e produzir biomassa rica em carboidratos, lipídios, proteínas e compostos 1186

bioativos de alto valor comercial na indústria. 1187

45

GIRARD et al. 2014 cultivaram a Scenedesmus. obliquus com o soro de queijo e 1188

demonstraram que substituindo 40% (v/v) do meio de cultura padrão “Bold's basal 1189

medium (BBM)” por soro, a S. obliquus apresentou taxas de crescimento específicas e 1190

rendimentos de biomassa em condições mixotróficas maiores que os cultivos 1191

heterotróficos e fotoautotróficos. 1192

SALLA et al. 2016 estudaram o cultivo mixotrófico da cianobactéria Spirulina 1193

platensis em meio diluído Zarrouk com adição de resíduos de proteína concentrada do 1194

soro e altos teores de lactose. Eles observaram que houve um aumento na produtividade 1195

da biomassa e de carboidratos pela espécie em estudo. 1196

A Spirulina platensis é uma cianobactéria rica em proteínas (cerca de 60% 1197

proteínas digeríveis) sendo muito utilizada em todo o mundo na nutrição animal e 1198

humana por apresentar baixo teor de óleo e vitaminas e não conter colesterol, além 1199

disso, a Spirulina platensis pode apresentar elevados teores em biocompostos 1200

antioxidantes sendo de grande interesse para indústria farmacêutica e alimentícia 1201

(PATIL et al., 2015, EL-TANTAWY, 2016), porém seu custo de produção no Brasil 1202

ainda é muito alto. 1203

Foi comprovado cientificamente que a Spirulina platensis apresenta vários 1204

benefícios para a saúde, incluindo a prevenção e tratamento de várias doenças devido à 1205

sua composição bioquímica que inclui aminoácidos essenciais, ácidos graxos, 1206

vitaminas, minerais e enzimas essenciais. Além do seu valor nutricional, a Spirulina 1207

platensis apresenta exibe atividades antibacterianas e antifúngicas contra alguns 1208

patógenos humanos (BARKALLAH et al. 2017, AHSAN et al., 2015). 1209

O grande potencial da Spirulina platensis motiva o desenvolvimento de pesquisas 1210

para produzir biomassa rica em metabólitos de alto valor comercial com meios de 1211

cultivos alternativos, com o objetivo de reduzir custos em um sistema de produção 1212

sustentável. Uma vez que, o soro de queijo é um poluente potencial produzido em 1213

grandes volumes pelas indústrias de laticínios no Brasil, o objetivo deste trabalho é 1214

aproveitar o soro de queijo do tipo mozarela de búfala em cultivos mixotróficos da 1215

Spirulina platensis a fim de estudar a sua influência na produção de biomassa, 1216

velocidade de crescimento, composição bioquímica e atividade antioxidante por esta 1217

espécie. 1218

1219

2. MATERIAL E MÉTODOS 1220

1221

46

2.1 Micro-organismo e meio de cultura 1222

1223

Foi utilizada a cepa Spirulina platensis D9Z cedida pelo Banco de Microalgas da 1224

Universidade Federal da Paraíba – UFPB, Nordeste do Brasil. A espécie foi mantida em 1225

condições estéril, em tubos de ensaio com temperatura e irradiância (238 μmol m-2 s-1) 1226

com fotoperíodo (12 h claro/escuro) em meio de cultivo padrão Zarrouk (1966) (Tabela 1227

2.1): 1228

1229

Tabela 1. Composição química do meio Zarrouk (1966) 1230

Reagente g/L

NaHCO3. 16,8

K2HPO4 0,5

NaNO3 2,5

K2SO4 1

NaCl 1

CaCl2 0,2

MgSO4.7H2O 0,04

EDTA 0,08

ml/L

Solução aA5 1,0

Solução bB6 1,0 aSoluçãoA5– Composição em mg/L: H3BO3-2,86; MnCl2..4H2O-1,81; ZnSO4..7H2O-0,222; CuCO4.5H2O-1231 0,0395; MnO3-0,0150. bSoluçãoB6 – Composição em mg/L: BH4VO3-22,86; K2Cr2O7-75,35; 1232 NiSO4.6H2O-44,8;Na2WO4.2H2O-17,94; Co(NO3)2.6H2O-43,98). 1233 1234

Para os cultivos mixotróficos, foi utilizado o meio Zarrouk complementado com 1235

2,5%, 5,0%, 10% de soro de queijo mozzarela de búfala cedido pela indústria de 1236

produção de queijos, TAPUIO Agropecuária Ltda localizada no Rio Grande do Norte, 1237

Nordeste do Brasil. O soro foi coletado e armazenado em garrafas de plástico em 1238

freezer a temperatura de -20° até o preparo prévio antes do inóculo. Para a utilização 1239

nos cultivos, o soro foi clarificado, conforme etapas descritas na Figura 1: 1240

47

1241 Figura 1. Etapas de clarificação do soro de queijo para utilização nos cultivos 1242

mixotróficos de Spirulina platensis. 1243

1244

O soro foi descongelado em geladeira a 5°C e depois autoclavado (121°C, 15 1245

min), em seguida foi filtrado em tela de 20μm e centrifugado em centrífuga simplex II 1246

24 BT por 15 min a 1500 rpm para a remoção do material precipitado. Antes da adição 1247

nos cultivos, o soro foi esterilizado em autoclave para evitar possíveis contaminações. 1248

1249

2.2 Delineamento experimental 1250

O inoculo foi obtido através do cultivo em meio Zarrouk (1966). Foram feitos 1251

pré-cultivos de 1 L (Figura 2.2) em erlenmeyer nas mesmas condições dos cultivos para 1252

obter a quantidade de célula necessária para o inicio dos experimentos. Os cultivos 1253

foram realizados assepticamente em um dispositivo desenvolvido no Laboratório com 5 1254

lâmpadas fluorescentes de 45 W (Figura 2.3) com uma intensidade luminosa de 17 Klux 1255

medido na superfície externa do frascos usando um radiômetro quântico Q201 (Macam 1256

Photo-Metrics Ltd., Livingston, Escócia) com fotoperíodo de 12h claro/escuro sob 1257

aeração estéril constante promovida por bombas (JAD Air Pump S-510) a uma vazão 1258

específica de 0,5 vvm (volume de ar por/volume de meio por minuto). A concentração 1259

inicial de S. platensis variou de 0,2 a 0,3 g/L. Todos os ensaios foram realizados em 1260

48

triplicata. Quando os cultivos atingiram a fase estacionária, as biomassas foram colhidas 1261

por filtração em telas de 20 μm e lavadas em água destilada para retirar resquícios de 1262

sal, em seguida as biomassa foram liofilizadas em liofilizador e congeladas a -20°C em 1263

freezer até o momento das análises químicas. O pH dos cultivos foram monitorados a 1264

cada 24 horas até o final do experimento em pHmetro previamente calibrado 1265

1266

1267

Figura 2. Inoculo da S.platensis utilizados nos cultivos realizados neste trabalho (Fonte: 1268

Autor) 1269

1270

1271 Figura 3. Sistema dos cultivos autotróficos e mixotróficos da S. platensis realizados 1272 neste trabalho (Fonte: Autor). 1273

1274

2.3 Determinação da concentração celular 1275

A concentração celular foi monitorada diariamente até os cultivos atingirem a 1276

fase estacionária por um período de aproximadamente 17 dias. O crescimento da 1277

S.platensis nos cultivos foi feito por densidade ótica das culturas a 670 nm em 1278

espectrofotômetro (SP-22 biospectro) através de uma curva padrão relacionando peso 1279

49

seco e densidade óptica. Para quantificar a biomassa, um volume conhecido de cultura 1280

era filtrado em filtros de fibra de vidro de 40 μm de poro (Sartorius) e a biomassa obtida 1281

era seca em estufa a 80°C e quantificada por diferença de peso, conforme recomenda 1282

Lourenço, 2006. Os filtros utilizados foram previamente tratados em forno mufla a 400 1283

°C por 4h. 1284

1285

2.4 Parâmetros do crescimento 1286

1287

A taxa de crescimento máxima (µ) da S.platensis na fase exponencial do 1288

crescimento foi determinada de acordo com a Equação 2.1(MONOD, 1942): 1289

1290

1291

µ𝑥 =dX

dt (2.1) 1292

1293

ondeX é a concentração celular (gramas/L), t é o tempo (dias) e µ(d-1) é a taxa específica 1294

de crescimento. 1295

1296

Foram avaliadas a concentração máxima de biomassa (Xmáx, g/L) e a produtividade 1297

máxima (Pmáx, g/L.dia), obtida segundo a equação 2.2: 1298

1299

Pmáx = Xt−Xo

t−to ( 2.2) 1300

1301

1302

Onde Xt é a concentração de biomassa (g/L) no tempo t (dia), e X0 é a concentração de 1303

biomassa (g/L) no tempo t0(dia). 1304

1305

2.5 ANÁLISES QUÍMICAS 1306

1307

2.5.1 Matéria seca 1308

1309

A matéria seca foi determinada por secagem das amostras em estufa a 105°C até 1310

peso constante conforme AOAC (2005). 1311

1312

2.5.2 Cinzas 1313 1314

Determinada conforme recomenda AOAC (2005). Para determinação das cinzas, 1315

foram utilizados filtros de fibra de vidro previamente tratados descrito no item 2.3. Os 1316

50

filtros contendo a biomassa foram mantidos em forno mufla 1317

( GP Científica ) 500° por 24 horas. 1318

1319

2.5.3 Proteínas totais 1320

1321

O teor de proteína total foi determinado pelo método de Kjeldahl (AOAC, 1322

2005). Para as determinações foram utilizadas 200 mg de biomassa, que foi digerida em 1323

solução de ácido sulfúrico em bloco digestor e destilada em destilador de nitrogênio . 1324

Em seguida, as amostras foram tituladas com HCl 0,1 N. O teor total de proteína foi 1325

calculado multiplicando o valor para o nitrogênio total pelo fator de 4,78 de conversão, 1326

que é o fator recomendado para a conversão Nitrogênio-Proteína em microalgas 1327

(LOURENÇO et al., 2004). 1328

1329

2.5.4 Proteínas hidrossolúveis 1330

1331

A quantificação das proteínas hidrossolúveis foi determinada de acordo com LOWRY 1332

et al., (1951), adaptado por (DERNER, 2006). As determinações foram feitas utilizando 1333

5,0 mg de biomassa liofilizada submetidas à hidrólise alcalina com 2,0 mL de NaOH 1334

1,0 N a ±100 ºC em banho-Maria durante 1 hora. Depois as amostras foram 1335

centrifugadas a 3000 rpm durante 30 minutos. Retirou-se 1,0 mL do extrato alcalino e 1336

foram adicionadas 5,0 mL da Solução C* e 0,5 mL da Solução D*(ambas descritas no 1337

Anexo C), agitou-se em vortex e depois de 30 min de repouso as leituras foram feitas 1338

em espectrofotômetro (SP-22 biospectro) com absorbância de 750 nm. Soluções padrão 1339

de Soro Albumina Bovina (BSA, Sigma) com gradiente de concentração de 0-1340

400μg/mL foram utilizadas para construção da curva padrão. Para a elaboração da 1341

curva, foi realizado o mesmo procedimento analítico utilizado com as amostras. 1342

1343

2.5.5 Carboidratos totais 1344

A determinação de carboidratos totais foi realizada pelo método de KORCHET 1345

(1978) e adaptado por DERNER (2006). Foram utilizadas 5,0 mg de amostra liofilizada 1346

submetidas à hidrólise alcalina com 4 mL de NaOH1,0N a ± 100 °C em banho-maria 1347

por 1 h, em seguida as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 10 min. Após 1348

a centrifugação, retirou-se 0,5 mL do extrato e foram adicionados 1,0 mL de NaOH1N e 1349

0,5 mL de fenol a 4 %. Após trinta minutos em repouso foram acrescentados 2,5 mL de 1350

51

H2SO4e depois que as amostras esfriaram foram feitas as leituras em espectrofotômetro 1351

(Spectrum - Série SP 2100) a 485 nm de absorbância. A curva padrão foi preparada a 1352

partir de uma solução de glicose anidra com gradiente de concentração de 0 a 1353

450μg/mL. 1354

1355

2.5.6 Lipídios totais 1356

O teor de lipídios totais foi determinado de acordo com Bligh and Dyer (1959). 1357

Foram pesadas 50mg de biomassa seca e adicionados 3,0 mL de mistura de 1358

clorofórmio:metanol (1:2 v/v) e 2,0 mL de água destilada. Após a homogeneização em 1359

vortex, adicionou-se 1,0 mL de clorofórmio e 1,0 mL de HCl. O conteúdo foi 1360

centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos, as fases(aquosa e orgânica) foram separadas 1361

por filtração sendo a fase orgânica depositada em recipiente previamente pesado. O 1362

solvente existente no recipiente foi evaporado em estufa a 100°C por 1 h e em seguida 1363

resfriado em dessecador por 1h. O teor de lipídios foi determinado por diferença de 1364

peso. 1365

1366

2.5.7 Perfil de ácidos graxos 1367

A extração e esterificação dos ácidos graxos presentes na biomassa foram 1368

realizadas de acordo com Menezes et al., 2013. Foram pesados cerca de 200,0 mg da 1369

biomassa de microalgas e adicionado 3,0 mL de uma solução de hidróxido de sódio 0,5 1370

M em metanol seco. A mistura foi aquecida em banho-maria a 90 °C por 10 min, depois 1371

de resfriada adicionou-se 9,0 mL da mistura esterificante (descrita no Anexo C).As 1372

amostras foram aquecidas novamente em banho-maria a 90 °C por 10 min. Depois de 1373

resfriadas, adicionou-se 5,0 mL de n-heptano e 2,0 mL de água destilada. Depois de 1374

agitação vigorosa, as amostras foram mantidas em repouso até a separação das fases. A 1375

fase orgânica foi removida e mantida em vidro âmbar em freezer a -20 °C até o 1376

momento da injeção no cromatógrafo gasoso. 1377

Para determinação do perfil de ácidos graxos foi usado um cromatógrafo gasoso 1378

(Thermo Scientific - CG/FID – FOCUS) com detector de ionização de chama (FID) e 1379

coluna capilar Supelco SP2560 (100m x 0,25mm x 0,2μm). Foi utilizado o nitrogênio 1380

como gás de arraste (1,2 mL/min). As temperaturas do injetor e detector foram 230 °C e 1381

270 °C, respectivamente. A programação da temperatura da coluna foi a seguinte: 1382

40°Cpor 3 min, em seguida foi aquecida a 180°C por 5min com uma taxa de 10°C/min, 1383

sendo novamente aquecida a 220°C por 3min com taxa de 10°C/min e por fim a 1384

52

temperatura chegou a 240 °C mantida por 25 min com taxa de 20°C/min. Nitrogênio foi 1385

usado como gás de arraste a 0,9 mL/min. O volume de amostra injetada foi de 1μL com 1386

razão Split de 10:1.Os picos foram integrados e comparados com um padrão de ácidos 1387

graxos SupelcoTM37 componente FAME MIX. 1388

1389

2.6 Atividade antioxidante 1390

As biomassas das microalgas liofilizadas foram submetidas a uma extração com 1391

metanol para a obtenção dos extratos de antioxidantes. Foram pesados 1,0 g de cada 1392

amostra, adicionado 40,0 mL de metanol e em seguida foram sonicadas em banho de 1393

gelo (Unique, modelo USC-1400A) por 20 min. Para a extração, a amostra foi agitada 1394

por três horas a 25 °C e centrifugada a 8000 rpm por 10 min. Os extratos foram secos 1395

em estufa de circulação de ar (SOLAB, modelo SL102) a 35 °C e armazenados, ao 1396

abrigo da luz, à temperatura ambiente até o momento de sua utilização. Cada extrato foi 1397

preparado com água destilada na concentração de 5,0 mg/mL e armazenados em frascos 1398

âmbar, sob refrigeração até à sua utilização. Todo o procedimento de extração foi 1399

executado em iluminação de 4,8 lux para evitar a fotodegradação. 1400

1401

2.6.1 Compostos fenólicos 1402

1403

Os teores de fenólicos extraíveis totais foram determinados pelo método 1404

colorimétrico Folin-Ciocalteau (SLINKARD AND SINGLETON, 1977). A 1405

concentração de compostos fenólicos foi estimada utilizando uma curva de calibração 1406

padrão com ácido gálico (Ver Anexo A). Os resultados foram expressos em mgEAG/g 1407

(miligrama de equivalente de ácido gálico por grama do extrato). 1408

1409

2.6.2 Capacidade antioxidante pelo método ABTS 1410

A capacidade antioxidante pelo método ABTS•+(2,2′-Azino-bis(3-ethyl 1411

benzothiazoline-6-sulfonicacid)), foi determinada conforme a metodologia descrita por 1412

RUFINO et al., (2007). A curva padrão foi preparada utilizando Trolox em 1413

concentrações de μM. Os resultados da capacidade antioxidante foram expressos em 1414

μMTrolox/g de extrato (capacidade antioxidante equivalente ao Trolox). 1415

1416

2.6.3 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE PELO ENSAIO DO FRAP 1417

53

A capacidade antioxidante dos extratos de microalgas foi estimada pelo Método 1418

de Redução do Ferro (FRAP), que é baseado na capacidade de um antioxidante em 1419

reduzir o Fe3+ para oFe2+, seguindo a metodologia descrita por BENZIE & STRAIN 1420

(1996). Foram preparadas duas curvas padrão, uma utilizando Trolox e outra com 1421

Sulfato ferroso. Os resultados da capacidade antioxidante foram expressos em μM 1422

Trolox/g de extrato (capacidade antioxidante equivalente ao Trolox) ou μM sulfato 1423

ferroso/g de extrato (capacidade antioxidante equivalente ao Sulfato ferroso). 1424

1425

2.6.4 Análise estatística 1426

1427

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o procedimento do 1428

programa Statistical Analysis System SAS® versão 9,0. Os resultados experimentais 1429

foram avaliados usando a análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para 1430

comparar os meios dos parâmetros cinéticos. O estudo estatístico das variáveis, 1431

concentração máxima celular (Xmáx), produtividade (Px), velocidade específica de 1432

crescimento (µmáx) foi realizado pela técnica de análise de variância (ANOVA). A 1433

comparação entre os diferentes tratamentos foi conduzida utilizando o teste de tukey a 1434

5% de significância. 1435

1436

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1437

1438

A composição do soro pode variar em função de diversos fatores, dentre eles a 1439

qualidade e composição do próprio leite, tecnologia inserida no processo de fabricação 1440

de queijos, além da manipulação da massa do queijo, sua eficiência e/ou rendimento 1441

fornecendo características específicas para o soro (SALES et al 2016). 1442

Segundo SERPA et al 2009, o soro de queijo representa cerca de 85 a 90% do 1443

volume de leite, contendo cerca de 55% dos nutrientes presentes no leite, com destaque 1444

para a lactose com valores em torno de 4 a 5% e proteínas com valores em torno de 0,6 1445

– 0,7%. A composição do soro residual da produção da mozzarella encontra-se na 1446

Tabela 1. 1447

As variações existentes os componentes do soro cru e soro clarificado podem ser 1448

explicados pela reação de Maillard, no qual ocorre desnaturação das características que 1449

pode ocorrer em alimentos e em organismos. 1450

54

Tabela 1 Composição do soro de queijo bubalino cru e clarificado utilizados para o 1451

cultivo de Spirulina platensis. 1452

Variáveis Soro Clarificado

Gordura (mg/ml) 0,02

Proteina total (mg/ml) 0,60

Lactose (mg/ml) 5,07

Sólidos totais (%) 6,77

Extrato seco desengordurado (%) 6,84

Umidade (%) 93,23

1453

SALES et al, 2016 , avaliando a composição percentual do soro de queijo 1454

mozzarela, observou valores para os componentes: gordura (0,36%), proteína (1,33), 1455

sólidos totais (4,87), extrato seco desengordurado (7,15) e lactose ( 6,78) para o leite 1456

cru, valores bem acima do observado neste trabalho. Para a variável lactose, apesar do 1457

processo térmico adotado, a variação desse componente foi menor quando comparado 1458

com gordura e proteína. 1459

As Proteínas do soro correspondem a 20% do total de proteínas presentes no 1460

leite de vaca e de búfala (AKHAVAN, et al. 2010) incluídas nesse total as β-1461

lactoglobulina (55%), α-lactoalbumina, imunoglobulinas (15%) e soro albumina (5%), e 1462

várias outras proteínas em menor proporção (lactoferrina, lactoperoxidase, lisozima, 1463

entre outras), se destacam de acordo com sua funcionalidade (EL-SALAM, et al. 2009), 1464

caracterizando-se pelo elevado valor nutricional, biológico e funcional (CONTRERAS, 1465

et al. 2011). SALES et al 2016, avaliando os constituintes do soro cru de queijo 1466

mozzarela, encontrou valores semelhantes ao encontrados neste estudo. 1467

SILVEIRA et al, 2013 avaliando três tipos de tratamento térmico, A (soro sem 1468

tratamento), B (soro pasteurizado) e C (soro tratado por vapor fluente) observou 1469

reduções de 17% nos teores de proteína em função do tratamento térmico adotado, 1470

variando de 0,84 (A), 0,67 (B) e 0,72 (C). Valores bem acima dos encontrados neste 1471

trabalho. Já para a lactose foram encontrados teores em torno de 3,04, 3,58,e 3,52 1472

respectivamente, valores inferiores aos encontrados neste trabalho que foi de 5,07.. As 1473

microalgas tendem a seqüestrar o CO2 disponível no meio e convertê-la em matéria-1474

prima para realização de fotossíntese e conversão em biomassa. 1475

As proteínas do soro possuem características funcionais e são muito utilizadas 1476

pela indústria de alimentos, para produção de leites fermentados, bebidas lácteas, 1477

sorvetes, fórmulas infantis, panificação, embutidos, e outras aplicações (HARAGUCHI 1478

et al., 2009; LIRA et al., 2009; XU, et al. 2011). 1479

55

3.1 Curva de crescimento das Spirulina platensis 1480

Os cultivos da Spirulina platensis controle (autotrófico) e mixotróficos com 1481

2,5%, 5,0% e 10,0% de soro realizados nesta pesquisa foram acompanhados durante 17 1482

dias consecutivos, quando todos atingiram a fase estacionária do crescimento a fim de 1483

avaliar os parâmetros cinéticos importantes tais como concentração máxima de 1484

biomassa, produtividade máxima e velocidade específica máxima de crescimento. 1485

A escolha das concentrações de soro nos cultivos foi baseada em estudos 1486

anteriores envolvendo o cultivo desta espécie em soro lácteo. Foi demonstrado que não 1487

há altos rendimentos de biomassa da S.platensis em concentrações de soro mais altas 1488

que 6% de acordo com MOURTHÉ (2010). Foi avaliado também o cultivo heterotrófico 1489

da S.platensis em ausência de luz, porém não houve crescimento possivelmente devido 1490

a toxidade e baixo pH do meio. 1491

A Figura 4 apresenta as curvas de crescimento da S.platensis nos cultivos 1492

realizados nesta pesquisa: 1493

1494 Figura 4 – Curva de Crescimento da S.platensis cultivada em meio autotrófico Zarrouk 1495

e meio mixotrófico complementado com soro de queijo bubalino (Desvio 1496

padrão da triplicata). 1497

1498

A produção de biomassa máxima para todos os cultivos foi obtida na fase 1499

estacionária do crescimento. O cultivo controle apresentou uma concentração de 1500

biomassa máxima de 1,75 g/L, sendo o menor valor de toda as condições estudadas 1501

(Tabela 3.2). Comparando com outros estudos, observa-se que Xmáx foi similar aos 1502

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

0 5 10 15 20

Co

nce

ntr

ação

de

Bio

mas

sa (

g/L)

Tempo (dias)

Meio Zarrouk2,5% de Soro5,0% de Soro10% de Soro

56

valores encontrados por KUMARI et al. 2014 (1,87 g/L) e superior aos valores 1503

encontrados por ANDRADE & COSTA (2007), (1,44 g/L), MOURTHÉ (2010), (1,01 1504

g/L). As condições de cultivo utilizadas neste trabalho tais como, temperatura, 1505

irradiância e aeração foram baseadas em estudos prévios que descrevem as condições 1506

ótimas de cultivo da S.platensis (SHI et al. 2016; LANLAN et al. 2015) 1507

Nos cultivos mixotróficos de S.platensis com 2,5%, 5,0% e 10%de soro de 1508

queijo aumentaram na produção da biomassa, onde o valor máximo foi obtido no 1509

cultivo com adição de 5% de soro chegando a 2,98 g/L. Valores similares foram 1510

observado por SALLA et al. 2016 em cultivos da S.platensis utilizando concentrado de 1511

soro de queijo. Apesar das diferenças nas condições de cultivo, esse valor também foi 1512

similar ao encontrado por Andrade & Costa (2007) (2,8g/L) quando cultivaram a 1513

S.platensis em meio Zarrouk diluído com adição de melaço líquido, um subproduto da 1514

indústria sucroalcoleira, e sutilmente superior aos valores encontrados por Marquez et 1515

al. 1993 (2,5 g/L) e Chen & Zhang (1997) (2,4 g/L) quando utilizaram glucose, 1516

respectivamente, como substrato orgânico. 1517

1518

Tabela 2 - Concentração de biomassa máxima (Xmáx), produtividade maxima (Pmáx) e 1519

velocidade especifica maxima de crescimento (µmáx) da cianobactéria 1520

Spirulina platensis cultivada em meio autotrófico Zarrouk e meio 1521

mixotrófico complementado com soro de queijo bubalino. 1522

% Soro Xmáx(g.L-1) Pmáx(g.L-1.dia-1) µmáx(dia1)

0,0 1,75 0,101 0,183

2,5 2,16 0,120 0,258

5,0 2,98 0,179 1,024

10,0 2,18 0,158 2,048

1523

Observa-se que, as fases de crescimento da Spirulina platensis no cultivo com 1524

2,5% foram similares ao controle, porém a velocidade de crescimento e a produção de 1525

biomassa foram sutilmente maiores. Apesar da taxa específica de crescimento depender 1526

principalmente das condições de cultivo, trabalhos prévios publicados envolvendo o 1527

cultivo de Spirulina platensis mostraram resultados similares (Xue et al. 2011; 1528

Ravelonandro et al., 2011; Wuang et al. 2016; Rodríguez et al. 2017). 1529

Para todos os cultivos a fase lag ocorreu nas primeiras 24 horas, isto é 1530

esperando, uma vez que, utilizou-se inoculo em meio padrão. Para os cultivos com 1531

percentuais de soro acima de 2,5%, as taxas de crescimento foram muito altas nas 1532

57

primeiras 48 h, porém a Spirulina platensis no cultivo com 5,0% de soro continuou 1533

crescendo de forma mais lenta que os primeiros dias chegando ao maior rendimento de 1534

biomassa. O cultivo com 10% de soro apresentou o dobro da velocidade específica de 1535

crescimento do cultivo com 5% e atingiu a fase estacionária em 14° dia produzindo a 1536

maior quantidade de biomassa neste tempo, embora a partir daí não houve crescimento 1537

tão expressivo quanto os demais, o que pode ter sofrido limitação pela baixa penetração 1538

de luz devido à alta densidade e opacidade do cultivo. Porém, uma vez que, nos 1539

sistemas mixotróficos se utiliza carbono orgânico, então a energia da luz não é um fator 1540

limitante para o crescimento da cultura (Chang et al., 2011). As culturas mixotróficas 1541

mostram uma foto-inibição reduzida e taxas de crescimento maiores em relação às 1542

culturas autotrófica e heterotróficas, tendo como vantagem a independência em 1543

assimilar tanto substratos de crescimento e realizar a fotossíntese, pois o pool de acetil-1544

CoA será mantido tanto para fonte de carbono de fixação de CO2 (ciclo de Calvin) 1545

como também para o carbono orgânico extracelular. (Mohan et al. 2015). 1546

Mourthé (2010) cultivou a S.platensis com soro lácteo reconstituído nas 1547

concentrações de 3% e 6% e obteve um valor máximo de produção de biomassa de 1,7 1548

g/L quando utilizou 3% de soro, valor abaixo do encontrado neste trabalho. O cultivo 1549

com adição de 6% de soro apresentou valores de biomassa máxima de 1,22 g/L. 1550

A produtividade dos cultivos com 5% de soro foi maior que com 10%, porém 1551

no 4° dia o cultivo com 10% apresentou a maior produtividade em virtude da alta taxa 1552

de crescimento da S.platensis, conforme mostra Figura 5: 1553

1554

Figura 5 – Produtividade da S.platensis cultivada em meio autotrófico Zarrouk e meio 1555

mixotrófico complementado com soro de queijo bubalino (Desvio padrão da triplicata) 1556

no 4° dia de crescimento. 1557

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0 2.5 5 10

Pro

du

tiv

ida

de

do

4°

dia

de

Cre

scim

ento

(g

/L.d

ia)

% Soro adicionado

58

A utilização do soro com concentrações de 2,5% e 5,0% nos cultivos foi muito 1558

favorável a produção de biomassa, mostrando que esse seria um processo viável de 1559

aproveitamento deste soro, um resíduo altamente poluente produzido em larga escala 1560

pela indústria de laticínios no Brasil. A utilização de soro nos cultivos da S. Platensis 1561

diminui o custo de produção de microalgas ao mesmo tempo consome um efluente que 1562

é descartado ao meio ambiente produzindo quantidades de biomassa mais elevadas. 1563

Em um processo industrial seria relevante o cultivo com 10%, uma vez que o 1564

mesmo atinge a fase estacionária em curto intervalo de tempo produzindo a maior 1565

quantidade de biomassa. Neste período, é muito importante avaliar a composição 1566

bioquímica da biomassa para ver a viabilidade de produção de algum metabólito de 1567

interesse para indústria. Isto será feito em uma etapa posterior. 1568

1569

3.2 Controle de pH 1570

1571

O pH influência a solubilidade do CO2 e dos minerais no meio de cultivo 1572

interferindo diretamente ou indiretamente no metabolismo das algas sendo um dos 1573

parâmetros mais importantes do crescimento. O pH dos cultivos foi monitorado a cada 1574

24 h conforme mostra Figura 6: 1575

1576 Figura 6 – Controle de pH, monitorado a cada 24h nos cultivos de S.platensis cultivada 1577

em meio autotrófico Zarrouk e meio mixotrófico complementado com soro de queijo 1578

bubalino (Desvio padrão da triplicata) 1579

1580

Os cultivos mixotróficos apresentaram faixas de pH mais baixas que o cultivo 1581

controle, isto é esperado, uma vez que o soro é ácido. Nestes cultivos, os valores de pH 1582

8.50

9.00

9.50

10.00

10.50

11.00

11.50

12.00

12.50

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

pH

Tempo (dias)

Meio

Zarrouk2,5% Soro

5,0% Soro

10% Soro

59

do início ao fim do experimento apresentaram faixas similares, onde a mais baixa foi 1583

observada para o com 10% se soro. De forma geral a variação de pH foi mais 1584

pronunciada para o cultivo controle (9.3 – 11.8) com um aumento relevante nos 3 1585

últimos dias. Nos metabolismos autotróficos geralmente os meios são ricos em 1586

bicarbonato, onde o carbono inorgânico pode estar na forma CO2, H2CO3, HCO3-

1587

(bicarbonato) ou CO3- (carbonato) e suas proporções dependem do pH. Em pH básico, 1588

as proporções de HCO3- ou CO2

- aumentam, porém em meios com pH baixo predomina 1589

o CO2 que é a fonte de carbono utilizada pelas algas. 1590

A elevação gradativa do pH no meio de cultura indica o crescimento da cultura e 1591

esse aumento é justificado pelo consumo do carbono inorgânico pelas microalgas para o 1592

crescimento celular, reduzindo a sua concentração no meio, desta forma força o 1593

deslocamento do equilíbrio carbonato-bicarbonato no sistema tampão (Berenguelet al., 1594

2004). 1595

A faixa de temperatura ótima de crescimento de S. platensis é de 9,5 a 10,5 (Pelizer 1596

et al., 2003; Richmond & Grobbelaar, 1986). Comparando a variação de pH com o 1597

crescimento da S.platensis observa-se que apesar do pH não está na faixa de trabalho 1598

ótima, não houve limitação do crescimento quando se compara a produção de biomassa 1599

e taxa de crescimento da S.platensis cultivada neste trabalho com outras pesquisas 1600

reportadas na literatura discutidos no item 3.1. 1601

1602

3.3 Composição bioquímica 1603

1604

A S.platensis é uma das espécies de microalgas mais estudadas sendo muito 1605

utilizada como produto alimentar e suplemento dietético em virtude do seu perfil 1606

nutricional de qualidade e alta biodisponibilidade de nutrientes. De acordo com Habib et 1607

al., 2008, composição química básica da S.platensis é constituída por proteínas (50 - 1608

70%), carboidratos (15 – 25%), lipídios (6 – 8%) e minerais (7 – 13%), onde esses 1609

percentuais podem variar dependendo do tipo de cultivo. 1610

Observa-se que a biomassa obtida no cultivo padrão apresentou alto teor 1611

proteínas totais e percentuais mais baixos para os carboidratos, lipídios e cinzas sendo 1612

similar aos estudos encontrados por Madkour et al. (2012); Salla et al. 2016, porém 1613

esses estudos mostram teores de proteínas e carboidratos mais baixos que os 1614

encontrados neste trabalho. 1615

60

Madkour et al. (2012) mostraram que para S.platensis cultivada em Meio 1616

Zarrouk, os teores de proteínas e carboidratos foram 52.95% e 13.20%, 1617

respectivamente. Já Salla et al. 2016 encontram teores de 20 e 60%(carboidratos) e 1618

45.40%(proteínas). A composição bioquímica de microalgas sofre forte influência do 1619

meio de cultura, além da temperatura, aeração, irradiância, volume de cultivo, dentre 1620

outros (Salla et al. 2016)Como neste estudo, todas as variáveis foram mantidas 1621

constantes e apenas a composição do meio de cultura sofreu alterações, pode-se 1622

observar que esse parâmetro foi o responsável pelas mudanças nas composições 1623

bioquímicas das biomassa. 1624

1625

Tabela 3 – Composição bioquímica da biomassa da S.platensis cultivada em meio 1626 controle e meio mixotrófico com adição de soro de queijo bubalino. 1627

1628

Soro (%) Rep. MS (%) Pt (%) PH (%) EE (%) CHO (%) Cinzas (%)

0,0 1 95,47 64,38 39,21A 5,18A 27,94 5,89

0,0 2 92,48 67,71

25,36 5,75

0,0 3 93,00 64,55

28,21 6,47

Média

93,65 BA 65,55A

27,17C 6,04B

DP

1,60 1,88

1,57 0,38

2,5 1 91,17 60,94 37,78A 2,04D 22,81 14,24

2,5 2 91,81 60,58

25,01 14,18

2,5 3 92,32 60,34

22,04 14,21

Média

91,77 BA 60,62B

23,29C 14,21A

DP

0,58 0,30

1,54 0,03

5,0 1 90,21 44,73 30,13A 2,56C 48,70 13,96

5,0 2 90,34 43,75

47,18 13,94

5,0 3 91,16 45,21

47,60 14,20

Média

90,57 BA 44,56C

47,83A 14,03A

DP

0,52 0,74

0,78 0,14

10,0 1 96,01 39,41 51,57A 3,40B 44,17 6,40

10,0 2 94,65 39,41

36,87 6,23

10,0 3 94,09 40,04

40,90 6,45

Média

94,92A 39,62C

40,65B 6,36B

DP 0,99 0,36 3,66 0,12

Letras maiúsculas iguais na linha não diferem entre si. 1629

1630

Observa-se que devido a adição do soro aos cultivos, não somente a produção de 1631

biomassa foi maior, como também o percentual de carboidratos. É possível notar 1632

claramente uma relação direta, que à medida que o percentual do soro aumentou a 1633

síntese de proteínas totais, houve diminuição para todas as condições estudadas, 1634

enquanto o teor de carboidratos aumentou nos cultivos com adição de soro acima de 1635

2,5% conforme Figura 3.4. 1636

61

1637 1638

Figura 7 - Influência do percentual do soro na síntese de carboidratos e proteínas pela 1639

S.platensis. 1640

1641

É bem conhecido que a S.platensis produz altos teores de proteínas, o que 1642

justifica sua vasta aplicação comercial na atualidade e isto ocorre principalmente 1643

quando o meio de crescimento é rico em nutrientes, principalmente com nitrogênio 1644

disponível (Dismukes et al., 2008). Tem sido demonstrado que alguns tipos de 1645

microalgas acumulam carboidratos e outros biocompostos não nitrogenados quando 1646

uma fonte orgânica é adicionada ao meio de crescimento, então estes resultados são 1647

esperados. Vieira Salla et al. 2016 cultivaram a S.platensis utilizando resíduos 1648

concentrados de soro de queijo com concentração de 1,5% e 2,5% em meio Zarrouk 1649

diluído (20% e 30%). Eles observaram que a houve um aumento no teor de carboidratos 1650

de 20.60% (condição padrão – meio Zarrouk) para (21,82 – 44,02%) enquanto o teor de 1651

proteínas diminui de 45.40% para 18,96-41,30%dependendo da concentração de soro 1652

e/ou diluição do Zarrouk. Eles observaram que não houve aumento do teor de 1653

carboidratos quando eles cultivaram a S.platensis com meio Zarrouk 100% adicionado 1654

de 1,5% e 2,5% de concentrado de soro, porém o teor de proteínas diminuiu. Neste 1655

trabalho, mesmo com meio Zarrouk sem diluição e adição do soro houve aumento dos 1656

carboidratos e decréscimo do teor de proteínas. O teor de cinzas aumentou nos cultivos 1657

com 2,5% e 5,0% de soro. 1658

A S.platensis é uma espécie com baixo teor de lipídios quando cultivada em 1659

condições padrão, porém pode haver aumento deste percentual em função das condições 1660

de cultivo. 1661

15.00

25.00

35.00

45.00

55.00

65.00

75.00

0 2 4 6 8 10 12

% M

eta

bó

lito

s

% Soro nos cultivos

% Carboidratos

% Proteínas totais

62

Observa-se que nos cultivos mixotróficos da S.platensis houve um decréscimo 1662

na síntese de lipídios quando se compara ao cultivo controle, porém não houve 1663

diferenças significativas em função do percentual de soro adicionado. O perfil dos 1664

ésteres metílicos de ácidos graxos da S.platensis são listados na Tabela 3. Observa-se 1665

que não houve mudanças significativas no perfil, com exceção do cultivo com 10% de 1666

soro, em que o percentual do C18:1n9c diminuiu 70%. O éster de ácido graxo 1667

encontrado em maior percentual foi o C16:0(40,60 – 45,75%), seguido por C20:0, 1668

C18:2n6c e C18:1n9c. 1669

1670

Tabela 4 – Perfil dos ésteres metílicos de ácidos graxos presentes na biomassa da 1671

S.platensis cultivada em meio controle e meio mixotrófico com adição de soro de queijo 1672

bubalino 1673

Ácido graxo % Soro bubalino

0,0 2,5 5,0 10,0

C10:01 nd nd 0,70 - 0,73 0,62 - 0,69

C12:02 0,97 - 1,11 0,73 - 0,75 0,60 - 0,64 0,62 - 0,65

C13:03 1,43 - 1,51 1,01 - 1,03 0,74 - 0,92 0,92 - 0,93

C14:04 0,62 - 1,39 0,71 - 0,72 0,59 - 0,59 0,23 - 0,24

C14:15 0,89 - 0,96 0,69 - 0,69 0,48 - 0,48 0,50 - 0,51

C15:06 0,23 - 0,55 0,32 - 0,33 0,28 - 0,30 0,30 - 0,31

C15:17 0,66 - 0,68 0,62 - 0,63 0,58 - 0,60 0,50 - 0,67

C16:08 40,60 - 42,15 45,72 - 45,75 44,87 - 44,91 44,29 - 43,68

C16:19 1,67 - 1,76 2,04 - 2,23 2,29 - 2,31 2,82 - 2,87

C17:010 0,16 - 0,27 0,49 - 0,49 0,18 - 0,35 0,16 - 0,35

C17:111 0,25 - 0,28 0,22 - 0,23 nd 2,41 - 2,51

C18:012 2,31 - 4,42 2,28 - 2,39 2,45 - 2,55 0,24 - 0,25

C18:113 nd 0,63 - 0,67 0,69 - 0,74 0,68 - 5,53

C18:1n9c14 9,78 - 11,38 10,92 - 10,92 12,00 - 12,06 3,25 - 3,26

C18:1n9t15 nd 0,34 - 0,36 nd nd

C18:2n6c16 10,99 - 11,59 10,46 - 10,45 8,84 - 8,87 10,68 - 11,24

C18:2n617 nd nd nd nd

C20:018 14,54 - 15,15 16,09 - 16,13 17,25 -17,29 19,88 - 19,89

C20:219 0,16 - 0,19 nd nd Nd

C20:3n620 0,57 - 0,60 0,26 - 0,21 0,43 - 0,44 nd

1 – ácido capróico; 2 – ácido láurico; 3 – ácido tridecanóico; 4- ácido merístico; 5- ácido miristoléico; 6- 1674 ácido pentadecanóico; 7- ácido cis-10-pentadecanoico; 8- ácido palmítico; 9- ácido palmitoléico; 10- 1675 ácido heptadecanóico; 11- ácido cis-10- heptadecanóico; 12- ácido esteárico; 13- ácido eláidico; 14- ácido 1676 oléico; 15- ácido elaidico; 16- ácido linoleidico; 16- ácido linoléico; 17- ácido 9, 12 – octadecadienóico; 1677 18- ácido araquidônico; 19- ácido 11, 14- eicosadienoico 20- ácido y- linoléico. 1678 1679

Prates et al., 2015; Morais & Costa, 2008; Collaet al., 2004 reportaram que o 1680

ácido palmítico foi predominante no perfil de ácidos graxos da S.platensis. Esse ácido é 1681

uma importante fonte de energia na alimentação infantil, pois o leite materno contém de 1682

63

20 a 30% desse ácido graxo. No entanto, em adultos, ácidos graxos saturados têm sido 1683

associados com o aumento do risco de doenças cardiovasculares (Williset al., 1998). 1684

Além disso, ele é muito utilizado na indústria farmacêutica, de cosméticos e de 1685

surfactantes (Garlapati & Madras, 2010) 1686

1687

3.4 Atividade antioxidante 1688

1689

Os antioxidantes são compostos químicos capazes de inibir ou retardar a 1690

oxidação de um substrato oxidável tendo um papel relevante na saúde humana, uma vez 1691

que, essas biomoléculas protegem as células sadias do organismo contra a ação oxidante 1692

dos radicais livres (Barkallah et al., 2017). As espécies reativas de oxigênio atacam e 1693

danificam as moléculas nos sistemas biológicos levando a vários distúrbios e doenças. 1694

Assim, o estresse oxidativo desempenha um papel em muitas doenças, incluindo 1695

hipertensão, diabetes mellitus, esclerose e doença isquêmica (Wu et al. 2016). 1696

Microalgas têm sido apontadas como uma nova fonte sustentável de 1697

antioxidantes naturais apresentando várias aplicações. Atualmente, as principais 1698

espécies utilizadas comercialmente para a produção de antioxidante, a salina que é fonte 1699

de beta-caroteno e a pluviais para a produção de Astaxantina (Goiriset al., 2015). 1700

Nos últimos anos, a S.platensis vem atraindo cada vez mais interesse como fonte 1701

potencial de compostos farmacêuticos. Muitos estudos de pesquisa mostram que essa 1702

microalga possui numerosos benefícios para a saúde, incluindo antioxidantes, 1703

imunomoduladores, antiinflamatórios, anticancerígenos, anti-virais e atividades anti-1704

bacterianas, bem como efeitos positivos contra hiperlipidemia, desnutrição, obesidade, 1705

diabetes, toxicidade química induzida por metais pesados e anemia (Lee et al., 1998; 1706

Lorenz 1999; Hoseini et al.2013; Kulshreshtha et al. 2008, Wu et al. 2016). 1707

Recentemente vem sendo muito estudado a atividade antioxidante da S.platensis, 1708

muitos estudos in-vivo mostram que o tratamento com essa biomassa reduz 1709

significativamente o estresse oxidativo (Abdel-Daimet al. 2013; Wu et al. 2016). Os 1710

compostos fenólicos das microalgas têm sido reportados como potencial candidato para 1711

combater os radicais livres, que são prejudiciais a saúde e alimentação (Hanna et al., 1712

2009), sendo metabólitos secundários com atividade antioxidante que desempenham 1713

um papel fundamental na saúde humana atuando contra as espécies reativas de oxigênio 1714

e nitrogênio (Casazza et al. 2015). A atividade antioxidante dos compostos fenólicos é 1715

principalmente devido as suas propriedades redox. Eles agem como agentes redutores 1716

(terminadores de radicais livres), doadores de hidrogênio, neutralizadores de oxigênio 1717

64

singlete e quelantes de metais (Cook &Samman, 1996)Os compostos fenólicos, 1718

incluindo fenóis simples, flavonóides, fenilproponóides, taninos, ligninas, ácidos 1719

fenólicos e seus derivados, são partes de um mecanismo de defesa complexo contra uma 1720

ampla gama de estresses nas plantas e, portanto, acumulam-se em resposta a esses 1721

estresses(Dixon e Paiva, 1995 ). 1722

Como a S.platensis é uma das espécies de algas mais estudadas como fonte de 1723

antioxidantes, neste trabalho o teor de fenólicos totais e atividade antioxidante das 1724

biomassas foram quantificados em todas as biomassas obtidas nos cultivos, conforme 1725

mostram as Tabelas 5 e 6: 1726

1727

Tabela 5 - Teores de fenólicos extraíveis totais 1728

Amostra % Soro

0,0 2,5 5,0 10,0

Fenólicos (mg Ácido gálico/g)

32,16 30,85 32,87 22,51

33,53 30,85 33,58 22,39

33,90 30,10 33,24 22,22

Média 33,20a 30,60a 33,23a 22,37a

Desvio padrão 0,92 0,43 0,36 0,14

1729

Observa-se que a S.platensis apresentou um alto teor de compostos fenólicos 1730

chegando a no máximo 33,23 mg Ácido gálico/g. As concentrações de fenólicos totais e 1731

atividade antioxidante da biomassa de microalgas pode variar em função das condições 1732

de cultivo. Nos cultivos controle e mixotróficos com 2,5% e 5,0% de soro não houve 1733

diferenças significativas (< 0,0001) na concentração de compostos fenólicos, porém no 1734

cultivo com 10% houve uma redução de 33%. Goiris et al. 2015 investigaram a 1735

influência do estresse nutricional no teor de antioxidante das microalgas Phaeodactylum 1736

tricornutum, Tetraselmis suecica e Chlorella vulgaris. Eles observaram que quando o 1737

meio foi limitado com Nitrogênio, houve redução de antioxidantes. Os teores de 1738

compostos fenólicos e os carotenóides foram significativamente reduzidos, em contraste 1739

os níveis de ácido ascórbico e tocoferóis foram maiores em culturas com limitação de 1740

nutrientes (estresse), particularmente sob a limitação de P. Eles concluiram que o 1741

estresse nutricional não é uma estratégia efetiva para melhorar o conteúdo antioxidante 1742

geral em microalgas, embora possa ser útil aumentar a produção de alguns antioxidantes 1743

vitamínicos, como tocoferóis ou ácido ascórbico. 1744

No presente estudo, é provável que algum componentepresente no soro tenha 1745

inibido o estresseoxidativo responsável pela síntese de compostos antioxidantes, 1746

65

incluindofenólico sendo o efeito potencializado no cultivo com 10% de soro. Esse 1747

fundamento é embasado pelo estudo de Goiris et al. 2015b que descrevem o 1748

fundamento biológico 1749

Avaliando a atividade antioxidante das biomassas obtidas no presente estudo, 1750

pode-se observar que diferente da concentração de compostos fenólicos, a atividade 1751

antioxidante das culturas diminuiu quando o soro foi utilizado nos cultivos 1752

independente do percentual. A inibição do estresse oxidativo resultou na geração de 1753

algumas espécies de radicais livres nas células que reagiram e diminuiram a síntese dos 1754

antioxidantes, possivelmente, devido o meio proporcionar condições favoráveis aos 1755

organismos, não tendo influência em promover a produção de antioxidantes (Goiris et 1756

al., 2015). 1757

Em plantas terrestres, o aumento de compostso fenólicos é observado quando as 1758

espécies são expostas a várias formas de estresse oxidativo (Kovacik et al. 2010) já para 1759

as microalgas os compostos fenólicos até agora tem recebido pouca atenção. Embora 1760

não tenha estudos prévios reportando a influência do cultivo mixotrófico na sintése de 1761

oxidantes por microalgas, alguns trabalhos reportam que estresses ambientais tais como 1762

exposição a metais (Rico et al., 2013), estresse por exposição à luz uv (Kovacik et al. 1763

2010) aumentaram a síntese de compostos fenólicos enquanto Goiris et al. 2015 1764

demostraram que o estresse nutricional induziu a redução da síntese de fenólicos nas 1765

biomassas de microalgas. 1766

Comparando a concentração de compostos fenólicos das biomassas obtidas nesta 1767

pesquisa com outros trabalhos reportados na literatura, observa-se que a S.platensis 1768

cultivadanesta pesquisa apresentou elevada concentração de compostos fenólicos (22,37 1769

– 33,23mg/g) em relação aos estudos de Sousa e Silva et al. (2017) (1,65mg/g), Parisi 1770

et al. 2010 (4,22 - 4,41 mg/g), Colla et al. 2007 (0,0024 – 0,0049 mg/g). 1771

É importante ressaltar que a produção de antioxidantes depende das condições 1772

de cultivo e do método de extração para quantificação e neste estudo a produção de 1773

compostos fenólicos foi potencializada provavelmente em função da irradiância dos 1774

cultivos que foi muito alta (17 Klux). Um estudo realizado Kepekçi & Saygideger 1775

(2012) avaliou a influência da irradiância na síntese de compostos fenólicos pela 1776

S.platensis. Foi observado que a quantidade de compostos fenólicos aumentou de 6,32 1777

mg/g (60μ mol photons m−2s−1) para 49.83mg/g (120μ mol photons m−2s−1). 1778

1779

66

Tabela 6 – Atividade antioxidante da S.platensis pelo método de Captura do Radical 1780

Livre - ABST•+ (ácido 2,2´-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico) e Redução 1781

do Ferro FRAP. 1782

1783

% Soro Repetição FRAPsf (µmol

SF/g)

FRAPtx (µmol

Tx/g)

ABTS•+

(µmol Tx/g)

0,0 1 35,35 20,68 18,10

0,0 2 34,48 20,17 17,09

0,0 3 36,23 21,19 17,83

Média

35,35 20,68 17,67

Desvio padrão

0,87 0,51 0,52

2,5 1 15,25 8,95 14,73

2,5 2 15,32 8,99 14,80

2,5 3 15,17 8,90 15,00

Média

15,25 8,95 14,84

Desvio padrão

0,08 0,05 0,14

5,0 1 15,39 9,03 14,73

5,0 2 15,49 9,09 14,13

5,0 3 15,28 8,97 15,00

Média

15,39 9,03 14,62

Desvio padrão

0,1 0,06 0,45

10,0 1 14,54 8,54 11,64

10,0 2 14,68 8,62 11,57

10,0 3 14,40 8,45 11,84

Média

14,54 8,54 11,68

Desvio padrão 0,14 0,08 0,14

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; ABTS (2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido 1784 sulfônico). 1785

A Atividade antioxidante das biomassas foram avaliadas pelo método de captura 1786

do radical ABTS•+ (2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) e o ensaio que 1787

avalia o poder de redução do íon ferro, FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), 1788

que se baseia na produção do íon Fe+2(forma ferrosa) a partir da redução do íon Fe+3 1789

(forma férrica) presente no complexo 2,4,6- tripiridil-s-triazina (TPTZ). Foi utilizado 1790

também o trolox com o padrão para o método FRAP. Para o cultivo controle, a 1791

atividade oxidante cresceu na seguinte ordem FRAPsf>FRAPTx> ABTS•+. Já para as 1792

culturas mixotróficas, observa-se a mesma performance para todas independente do 1793

percentual de soro de forma que a atividade antioxidante foi similar quando avaliadas 1794

pelos métodos ABTS•+ e FRAPsf com e menor para o FRAPtx. 1795

Não foram identificados quais os compostos antioxidantes que foram limitados 1796

sofrendo redução ficando como sugestão a investigação em trabalho futuro. De acordo 1797

com Halliwell (1996), os efeitos defensivos de antioxidantes naturais estão relacionados 1798

67

a três grandes grupos: ácido ascórbico e fenólicos como antioxidantes hidrofílicos e 1799

carotenóides como antioxidantes lipofílicos. 1800

Observa-se que a atividade antioxidante da S.platensis obtida neste estudo pelo 1801

método ABTS•+(11,68 – 17,67 µmol Tx/g)foi menor do que valores encontrados por 1802

Kepekçi & Saygideger, (2012)(31,41- 54,16μ mol Trolox g−1). A Atividade antioxidante 1803

pelo método FRAPtx do cultivo controle (20,68 µmol Tx/g) foi maior que o encontrado 1804

por Ibarz, 2016 (8,81 µmol Tx/g). 1805

Não foi encontrado na literatura dados de atividade antioxidante em condições 1806

de cultura similares aos estudos realizados nesta pesquisa. Muitos trabalhos tem 1807

avaliado a capacidade antioxidante de alimentos suplementados com S.platensis, tais 1808

como, iogurte (Barkallah et al. 2017), massa de trigo de pão (Rodríguez de Marco et al. 1809

2014), biscoito (Batista et al. 2017), dentre outros. Eles observaram que a capacidade 1810

antioxidante de todos os alimentos foi maior quando suplementados com a S.platensis. 1811

1812

4. CONCLUSÃO 1813

1814

Quando comparadas com a cultura fotoautotrópica, as microalgas mixotróficas 1815

cresceram mais rapidamente, proporcionando em um curto intervalo de tempo, maior 1816

produtividade de biomassa e maior teor de carboidratos, porém houve um decréscimo 1817

na produtividade de proteínas e lipídios. A concentração de compostos fenólicos não 1818

sofreu variações quando se comparou o cultivo autotrófico com os mixotróficos com 1819

2,5% e 5,0% de soro, porém quando houve adição de 10% de soro, a concentração dos 1820

compostos fenólicos diminui 37%. A atividade antioxidante avaliada pelos métodos 1821

FRAP e ABTS.+ foi reduzida em todas as biomassas obtidas nos cultivos mixotróficos 1822

em relação ao controle, porém não sofreu variações significativas em função do 1823

percentual de soro no meio. O cultivo mixotrófico de S.platensis utilizando soro de 1824

queijo mozarella de búfala pode ser considerado como uma estratégia viável para 1825

reduzir os custos da produção de biomassa de microalgas e carboidratos, ao mesmo 1826

tempo em que contribui para a solução do problema ambiental causado pela eliminação 1827

de soro nas indústrias leiteiras, embora não seja uma boa estratégia para induzir a 1828

síntese de compostos antioxidantes. 1829

1830

1831

1832

68

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1833

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73

ANEXO 1 2043

2044

Curvas padrão de crescimento 2045

2046

Curvas padrão das análises bioquímicas 2047

2048

2049 2050

Figura A1 – Curva padrão de Glicose para quantificação de carboidratos totais 2051

2052

2053

2054 2055

Figura A2 – Curva padrão de Ácido Gálico para quantificação de compostos 2056

fenólicos totais 2057

2058

2059

y = 0.0041x + 0.0071R² = 0.9965

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 100 200 300 400 500

Ab

sorb

ân

cia

(n

m)

Concentração de glicose (mg/mL)

Curva padrão de glicose

y = 0.0927x - 0.0055R² = 0.9984

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

Ab

sorb

ân

cia

(n

m)

Concentração (µg/mL)

Curva Padrão de Ácido Gálico

74

2060 2061

Figura A3 – Curva padrão de Trolox para quantificação da atividade antioxidade 2062

(pelo método ABTS•+ (2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6ácido sulfônico)) 2063

2064

2065

2066 2067

Figura A4 – Curva padrão de Trolox para quantificação da atividade antioxidante 2068

pelo ensaio do FRAP 2069

2070

2071

2072 2073

y = -0.0003x + 0.6528R² = 0.9995

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 500 1000 1500 2000 2500

Ab

sorb

ân

cia

(n

m)

Concentração µM (µmol/L)

Curva Padrão de Trolox

y = 0.0012x - 0.1058

R² = 0.9992

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

0 500 1000 1500 2000 2500

Ab

sorb

ân

cia

(n

m)

Concentração µM (µmol/L)

Curva padrão de Trolox (Tx)

y = 0.0007x - 0.0964

R² = 0.9995

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

0 500 1000 1500 2000 2500

Ab

sorb

ân

cia

(n

m)

Concentração µM (µmol/L)

Curva padrão de Sulfato ferroso

75

Figura A5 – Curva padrão de Sulfato Ferroso para quantificação da atividade 2074

antioxidante pelo ensaio do FRAP 2075

2076

2077

ANEXO 2 2078

2079

* Soluções utilizadas na determinação das Proteínas 2080

2081

Solução A: Na2CO3a 2% em NaOH 0,1 N; 2082

Solução B1: CuSO4. 5H2O a 0,5%; 2083

Solução B2: Tartarato de Sódio e Potássio a 1%; 2084

Solução C: Soluções A, B1eB2 em proporção igual a 100:1:1, respectivamente. 2085

Solução D: Folin-Ciocalteau comercial e água destilada na proporção de 1:1. 2086

2087

Mistura Esterificante 2088 2089

Adicionar 2,0 g de cloreto de amônio a 60 mL de metanol seguido da adição de 2090

3,0 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura, contida em balão de fundo redondo, 2091

deve ser levada um condensador e mantida em refluxo sob agitação por 15 min. O 2092

reagente obtido deve ser estocado em balão de vidro com tampa de vidro. 2093