avaliaÇÃo da perda Óssea e atividade …2015... · o experimento de doença periodontal foi...
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!UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE - UFRN
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE - CSS
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA - DOD
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
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LORENA DE SOUZA ARAÚJO
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AVALIAÇÃO DA PERDA ÓSSEA E ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DA
AZILZARTANA EM MODELO DE DOENÇA PERIODONTAL
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NATAL/RN
2015
LORENA DE SOUZA ARAÚJO
!!!!!!
AVALIAÇÃO DA PERDA ÓSSEA E ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DA
AZILZARTANA EM MODELO DE DOENÇA PERIODONTAL
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!!
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
curso de graduação de Odontologia UFRN como
parte integrante dos requisitos para obtenção do grau
de Cirurgião-dentista.
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Orientador(a): Aurigena Antunes de Araújo
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NATAL/RN
2015
LORENA DE SOUZA ARAÚJO
!!!
AVALIAÇÃO DA PERDA ÓSSEA E ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DA
AZILZARTANA EM MODELO DE DOENÇA PERIODONTAL
!!!
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de graduação de Odontologia UFRN
como parte integrante dos requisitos para obtenção do grau de Cirurgião-dentista.
Aprovado em: __/__/____
!!
____________________________________
Prof. Dra. Aurigena Antunes de Araújo
Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN
Orientadora
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____________________________________
Prof. Dr. Bruno Cesar de Vasconcelos Gurgel
Departamento de Odontologia - UFRN
Membro
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____________________________________
Prof. Dr. Euler Maciel Dantas
Departamento de Odontologia - UFRN
Membro
SUMÁRIO
!Título e autores ………………………………………………………………… 04
Resumo ………………………………………………………………………… 05
Introdução ……………………………………………………………………… 06
Materiais e métodos ……………………………………………………………. 07
Resultados ……………………………………………………………………… 10
Discussão ……………………………………………………………………….. 11
Referências ……………………………………………………….…………….. 13
Figuras……………………………………………………………………………16
Anexos ………………………………………………………………………….. 20
Protocolo CEUA
Diretrizes PLOS ONE
Artigo PLOS ONE
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Avaliação da perda óssea e atividade antiinflamatória da Azilsartana em modelo de
doença periodontal.
!Aurigena Antunes de [Araújo]1*, Hugo Varela2, Gerly Anne de Castro [Brito]3, Caroline
Addison Carvalho Xavier de [Medeiros]4, Lorena de Souza [Araújo]5, José Heriberto Oliveira
do Nascimento6, Raimundo Fernandes de Araújo Júnior7
!1 Programa de Pós Graduação em Saúde Pública / Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas / Departamento de Biofísica e Farmacologia, UFRN, Natal, Rio Grande do
Norte, Brasil;
2 Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva / Departamento de Odontologia da UFRN,
Natal, Rio Grande do Norte, Brasil;
3 Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Departamento de Morfologia da UFC,
Fortaleza, Ceará, Brasil;
4 Departamento de Biofísica e Farmacologia, UFRN / Programa de Pós-Graduação em Saúde
e Sociedade, UERN, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil;
5 Departamento de Odontologia da UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil;
6 Departamento de Engenharia Têxtil, UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil;
7 Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Estrutural / Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde / Departamento de Morfologia da UFRN, Natal, Rio Grande
do Norte, Brasil;
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Abstract:
Aims: The aim of this study was to evaluate the effects of azilsartan (AZT) on bone loss,
inflammation.
Materials and Methods: Male Wistar albino rats were randomly divided into 5 groups of 10
rats each: (1) nonligated, water; (2) ligated, water; (3) ligated, 1 mg/kg AZT; (4) ligated, 5
mg/kg AZT; and (5) ligated, 10 mg/kg AZT. All groups were treated with saline or AZT for 10
days. Levels of IL-1β, IL-10, TNF-α, myeloperoxidase (MPO), and glutathione (GSH) were
determined by ELISA.
Results: Treatment with 5 mg/kg AZT resulted in reduced MPO (p <0.05) and IL-1β (p
<0.05), increased levels of IL-10 (p <0.05).
Conclusions: These findings reveal that AZT increases anti-inflammatory cytokines and GSH
and decreases bone loss in ligature-induced periodontitis in rats.
!Resumo:
Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de azilsartan (AZT) sobre a perda
óssea, inflamação.
Materiais e Métodos: ratos albinos Wistar machos foram divididos aleatoriamente em 5
grupos de 10 ratos cada: (1) não ligado, água; (2) ligado, a água; (3) ligado, de 1 mg/kg de
AZT; (4) ligado, de 5 mg/kg de AZT; e (5) ligado, de 10 mg/kg de AZT. Todos os grupos
foram tratados com solução salina ou com AZT durante 10 dias. Os níveis de IL-1β, IL-10,
TNF-α, mieloperoxidase (MPO) e glutationa (GSH) foram determinados por ELISA.
Resultados: O tratamento com 5 mg/kg de AZT resultou numa diminuição dos níveis de
MPO e IL- 1β e aumento dos níveis de IL-10 (p <0,05) MPO (p <0,05) e IL-1β (p <0,05),.
Conclusões: Estes resultados revelam que AZT aumenta citocina anti-inflamatórias e GSH e
diminui a perda óssea em periodontite induzida por ligadura em ratos.
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INTRODUÇÃO
! A doença periodontal é uma doença infecciosa crônica inflamatória da gengiva e
tecidos de suporte dos elementos dentais. A inflamação gengival que acompanha a doença
periodontal pode danificar os tecidos conjuntivos de suporte e a ancoragem dos dentes ao
maxilar. Vários agentes moduladores têm sido investigados como potenciais terapias para a
doença periodontal, incluindo antiproteinases, drogas anti-inflamatórias, drogas poupadoras
de osso (bone-sparing) [1].
Um melhor conhecimento dos mecanismos implicados na patogénese da doença
periodontal levou à utilização de novos agentes para modular a resposta do hospedeiro ao
inibir mediadores inflamatórios. Estudos com drogas anti-hipertensivas têm demonstrado que
tais drogas possuem uma atividade antiinflamatória em doenças periodontais com redução na
perda de óssea [2-5]. Um exemplo é o bloqueador do receptor da angiotensina II (ARB), que
tem sido implicado como um agente anti-inflamatório que suprime o fator de necrose tumoral
(TNF) induzido por ativação do fator nuclear (NF-α-κB) em células endoteliais vasculares [6].
O tratamento de periodontite com Telmisartan, bloqueador do receptor da angiotensina II
(ARB), reduziu os marcadores de inflamação, proteases e mudou proteínas envolvidas na
remodelação óssea [2]. Resultados semelhantes foram obtidos em um estudo utilizando outro
ARB, Olmesartan [3].
Azilsartan medoxomil (AZT) é um ARB, aprovado em 25 de fevereiro de 2011 nos
EUA, pela Food and Drug Administration, para o controle da hipertensão. De acordo com o
fabricante, 4814 pacientes incluídos nos estudos de segurança foram tratados com 20 a 80 mg
diárias, a droga foi geralmente bem tolerada, com uma incidência global de reações adversas
semelhante ao placebo [7]. Alguns estudos tem trabalhado com anti-hipertensivos,
bloqueadores do receptor de angiotensina II (ARB), e como pacientes com doença
periodontal, normalmente, são pacientes que possuem também doenças sistêmicas, como a
hipertensão, o estudo tem como objetivo investigar se esses medicamentos anti-hipertensivos
podem interferir na progressão da doença periodontal, avaliado por meio da perda óssea e
análises por ELISA.
O objetivo do presente estudo foi determinar a eficácia da Azilzartana na prevenção e
tratamento da doença periodontal.
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MATERIAIS E MÉTODOS
!Animais
As experiências foram realizadas em ratos Wistar, machos (180-220 g), alojados em
condições normais (ciclos de luz/escuridão de 12 horas; 22 +/- 1 ° C), com acesso ad libitum a
comida e água. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética animal
(nº 28/2012 - anexo), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil.
O experimento de doença periodontal foi induzido em ratos, sob anestesia induzida
pela administração intraperitonial de cetamina 10% (70 mg/kg) (Quetamina, Vetnil, SP,
Brasil) e xilazina 2%, (10 mg/kg) (Calmium, SP, Brasil), pela colocação de uma ligadura com
fio de nylon estéril (3-0; Polysuture, NP45330, São Paulo) em torno do colo do segundo
molar, no maxilar esquerdo [8]. Onze dias após o tratamento inicial, os animais foram
sacrificados com 80 mg/kg de tiopental (Cristália, São Paulo, Brasil).
!Os tratamentos medicamentosos
AZT (Edarbi, Takeda Pharmaceuticals América, EUA) foi dissolvido em água
destilada (veículo) e administrada por via oral, por gavagem, 1 hora antes da indução da
doença periodontal e uma vez por dia, durante 10 dias, até à eutanásia. Os animais (n = 100)
foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: (1) não ligado, água (NL), (2) ligado, de
água (L), (3) ligado, tratado com 1 mg/kg de AZT, (4) ligado, tratado com 5 mg/kg de AZT, e
(5) ligado, tratado com 10 mg/kg de AZT.
As dosagens dos medicamentos para os animais não foram baseadas em dosagens de
humanos, porque as diferentes características genéticas afetam a farmacocinética dos
medicamentos. Em vez disso, a dose foi baseada em estudos in vivo, em ratos, que
examinaram os efeitos de AZT na pressão sanguínea [9,10].
!A medição da perda de osso alveolar (ABL)
Maxilas extraídas foram fixadas em formalina neutra a 10% durante 24 horas e as
metades superiores foram coradas com 1% de azul de metileno aquosa para diferenciar o
tecido ósseo, dos dentes. A perda óssea foi medida ao longo do comprimento das superfícies
das raízes de cada molar. ABL foi medido em todos os cinco grupos experimentais. Três
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medições foram realizadas sobre os primeiros molares (3 raízes cada) e duas medições foram
realizadas sobre os segundos e terceiros molares (duas raízes cada). A perda óssea alveolar
total foi determinada tomando a soma das medições das superfícies dos dentes e subtraindo os
valores da maxila direita (controle, não ligado) dos da maxila esquerda, em milímetros [11].
Análises morfométricas do osso alveolar foram realizadas utilizando a fotografia
digital padronizada (Olympus SC30), e as distâncias (em milímetros) foram medidas com
software de imagens (análise GetIt 5.1).
!Ensaio da Mieloperoxidase (MPO)
O grau de acumulação de neutrófilos em amostras gengivais foi medido pelo ensaio de
atividade de MPO. Amostras gengivais (5 por grupo) foram recolhidas e armazenadas a -70°C
até à sua utilização. As amostras foram homogeneizadas e centrifugadas (2000x g durante 20
minutos), e a atividade da MPO foi determinada usando um método colorimétrico, utilizando
um kit de detecção colorimétrica seguindo as instruções do fabricante (TrekAvi- din-HRP
etiqueta + kit, Biocare médicos, Dako, USA) [12]. Os resultados foram relatados como
unidades de MPO por miligrama de tecido.
!Ensaio da Glutationa (GSH)
Níveis de GSH nos tecidos gengivais foram medidas para analisar a atividade
antioxidante. Amostras gengivais (5 por grupo) foram armazenados a -70°C até à sua
utilização. Homogeneizados de tecido gengival (0,25 µL de uma solução 5% tecido preparado
em 0,02 M de EDTA) foram adicionados a 320 µL de água destilada e 80 µL de TCA a 50%.
As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante (400
µL) foi adicionado a 800 µL de 0,4 M de tampão Tris pH 8,9 e 20 µL de 0,01 M (ácido 5,5’-
ditiobis-(2- ácido nitrobenzóico) DTNB. A absorvância foi medida a 420 nm e os resultados
foram relatados como unidades de MPO por miligrama de tecido.
!Ensaio da IL-1β, IL-10, e TNF-α
Tecidos gengivais, armazenados a -70°C, foram homogeneizados e processados [13].
Os níveis de IL-1β (intervalo de detecção: 62,5-4000 pg/ml; limite inferior de detecção: 12,5
ng/mL “mouse” IL-1β), IL-10 (intervalo de detecção: 62,5-4000 pg/ml; limite de detecção
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inferior: 12,5 ng/mL “mouse” IL-10), e TNF-α (intervalo de detecção: 62,5-4000 pg/ml;
limite inferior de detecção: 50 ng/ml “mouse” TNF-α) foram determinadas usando kits de
ELISA comercial (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) [14]. A absorbância foi medida a
490 nm.
Resumidamente, placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 4°C com
anticorpos contra TNF-α, IL-1β, e Il-10. Depois as placas foram bloqueadas, amostras e
padrões foram adicionados em várias diluições em duplicata e incubadas a 4°C durante 24
horas. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão e os anticorpos foram adicionados aos
poços (biotinilado policlonal de ovelha anti-TNF-α, anti-IL-1β, ou anti-IL-10 diluído 1:1000
com tampão de ensaio de BSA a 1%). As placas foram incubadas à temperatura ambiente
durante 1 hora, lavadas, e 50 µl de avidina-HRP (1:5000) foram adicionados. O reagente de
cor o-fenilenodiamina (50 µL) foi adicionado 15 minutos mais tarde, e as placas foram
incubadas no escuro a 37°C durante 15-20 minutos. A reação enzimática foi interrompida com
H2SO4 e a absorvância foi medida a 490 nm. Os valores foram expressos em pg/mL.
!As análises estatísticas
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão, ou como medianas, quando
apropriado. As análises de variância e testes de Bonferroni foram utilizados para o cálculo da
média e os testes de Dunn e de Kruskal-Wallis foram usados para comparar medianas
(GraphPad Prism 5.0 Software, La Jolla, CA, EUA). Um valor-p <0,05 indicou significância
estatística.
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RESULTADOS
! Efeitos do tratamento com AZT sobre a perda óssea alveolar em ratos com
Experimental Doença Periodontal.
Os ratos com periodontite induzida por ligadura (L) mostraram perda significativa de
osso alveolar em comparação com animais não-ligados (NL) (NL = 0,22 + 0,41mm, L = 4,6 +
1,4mm; p<0,001). Tratamento com AZT (5 mg/kg) reduziu a perda do osso alveolar causada
pela periodontite em comparação com animais ligados não tratados (AZT 5 mg/kg = 2,5 +
1,9, L = 4,6 + 1,4 mm, de p <0,05) (Figura 1). As aspecto macroscópico do grupo NL sem
reabsorção do osso alveolar em comparação com o grupo L com reabsorção óssea severa e
exposição da raiz pode ser visto na (Figura 2B). A Figura 2C mostra a aparência macroscópica
do periodonto após a ligadura e o tratamento com AZT a 5 mg/kg, o que levou a uma
diminuição da perda óssea em comparação com animais com ligadura. Os ratos tratados com
1 mg/kg e 10 mg/kg de AZT mostraram também diferenças na perda de osso alveolar, em
comparação com animais NL (AZT 1 mg/kg = 3,2 + 0,8 mm, AZT a 10 mg/kg = 4,9 + 1,9
mm, de p <0,001 e p <0,05, respectivamente) (Figura 1).
!Efeitos de AZT sobre a atividade inflamatória e GSH
Atividade de MPO foi aumentada no grupo L em comparação com o grupo de NL (p
<0,05). O grupo submetido a ligadura e tratados com 5 mg/kg de AZT apresentou menores
concentrações de MPO, em comparação com o grupo L (p <0,05) (Figura 3). Os níveis de
citocina pro-inflamatória IL-1β foram diminuídos em animais tratados com 5mg/kg de AZT
em comparação com os animais do grupo L (p <0,05). Os níveis de citocina antiinflamatória
IL-10 foram aumentados em animais tratados com 5 mg/kg de AZT em comparação com os
animais do grupo L (p <0,05) (Figura 4). O tratamento com AZT não reduziu os níveis de
GSH (p> 0,05) em comparação com o do grupo L (Figura 3).
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DISCUSSÃO
! A periodontite é uma doença crônica inflamatória resultante da perturbação da
homeostase entre a microbiota oral e as defesas subgengivais do hospedeiro [15]. Dada a
extensa utilização de fármacos anti-hipertensivos pela população, combinada com o fato de
que a doença periodontal afeta adultos e idosos, decidimos investigar o efeito de drogas anti-
hipertensivas na progressão da doença periodontal. Neste estudo, o tratamento Azilsartan
reproduziu alguns resultados de pesquisas anteriores, realizadas pelo nosso grupo, com outros
anti-hipertensivos. O telmisartan e olmesartan reduziram significativamente as citocinas pró-
inflamatórias, tais como IL-1β e TNF-α, o que resultou na preservação significativa de osso
em doenças periodontais [2,3]. No periodonto, a ativação de IL-1β e TNF-α é conhecida por
estimular a degradação da matriz de tecido conjuntivo, a ativação dos osteoclastos, e a
reabsorção de osso [16,17]. IL-1 induz a liberação de TNF-α, que está presente no tecido
gengival inflamado, envolvido na destruição de tecido. Neste estudo, MPO e os níveis de
IL-1β foram significativamente reduzidas pelo tratamento com AZT (5 mg/kg).
De acordo com um estudo realizado por Gaddis et al. (2013), a IL-10 desempenha um
papel importante no controle da infecção e da progressão da doença periodontal [18].
Componentes de superfície de P. gingivalis, tais como LPS, lipoproteinas e fímbrias
interagem com receptores expressos pelo hospedeiro de tipo Toll (TLRs), elementos chave de
controle da resposta imune inata. A ativação de TLR leva a translocação nuclear de NF-kB e
indução de genes relacionados com a inflamação, sugerindo que a inflamação exagerada
mediada por TLR é um fator determinante na doença periodontal [19]. Um dos mais eficazes
supressores de produção de citocina inflamatória induzida por TLR é a IL-10, que inibe as
células imunológicas inatas por inibição direta da transcrição de citocinas [20].
O principal problema relacionado com a doença periodontal é a perda de osso, que é
causada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β e TNF-α, e podem ser
mediados por aumentos significativos nos níveis de IL-10. IL-10 pode mediar a perda óssea
diretamente inibindo a formação de osteoclastos [22].
Estes resultados são corroborados por estudos que mostram que a inibição da
formação de osteoclastos por IL-10 é mediada através de ações diretas sobre precursores de
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osteoclastos [22,23]. Um estudo realizado por Liu et al. (2006) sugeriram que a IL-10 inibe a
reabsorção óssea [21].
Um estudo de Gallet et al. (2006) mostrou que a expressão de IL-1β, TNF-α, e
interferon-gama está relacionada à reações inflamatórias e perda de osso alveolar. Por outro
lado, a IL-4 e IL-10 foram associados taxas reduzidas de infiltração celular em tecidos
gengivais e periodontais e redução da perda de osso alveolar [24].
Em conclusão, este estudo revelou que o tratamento com 5 mg/kg doses de AZT
resultou na redução da perda de óssea alveolar, diminuição de IL-1β, aumento na produção de
IL-10 e diminuição dos níveis de MPO. Tomados em conjunto, estes dados indicam que o
AZT atua na redução da perda óssea e atividade inflamatória, se mostrando eficaz na
prevenção e tratamento da periodontite induzida por ligadura em ratos.
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!Figuras:
Figura 1. Efeito do tratamento com AZT sobre a perda óssea alveolar associada a periodontite
experimental (EP) em ratos. Os valores são expressos como médias ± SEM (Comparado com
NL *** p <0,001, * p <0,05; Comparado com L #p <0,05).
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�17
Figura 2. A) Superior: Esquerda / Inferior: Direita, grupo NL, não mostrando nenhuma
reabsorção do osso alveolar. B) Superior: Esquerda / Inferior: Direita, grupo L, mostrando
reabsorção óssea grave, com exposição da raiz (setas). C) Superior: Esquerda / Inferior:
Direita, grupo ligado tratado com azilsartan 5 mg/kg, demonstrando declínio na reabsorção
óssea (setas). As imagens foram obtidas a uma ampliação original de 1,7 ×.
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!!!!!!!!!Figura 3. MPO e de GSH nos
NL, L, e os grupos tratados com
1 mg / kg, 5 mg / kg, e 10 mg /
kg de AZT (* p <0,05, ** p
<0,01).
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!!Figura 4. A) Níveis de IL-1β, B) IL-10, e C) o TNF- α, em NL, L, e os animais tratados com
AZT (1 mg / kg, 5 mg / kg, e 10 mg / kg ) (* p <0,05).
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