avaliação da actividade electroquímica em cogumelos ... · cogumelos, pela sua boa disposição...

Soraia Isabel Domingues Marcos Falcão Licenciada em Química, Ramo Científico

Avaliação da actividade electroquímica em cogumelos

silvestres comestíveis

Departamento de Química Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Abril/2008

i

Á minha madrinha por todo o amor, carinho e apoio

pelo exemplo de coragem, força e alegria de viver Estarás sempre comigo…

ii

Agradecimentos

À minha orientadora, a Professora Ana Cristina Freire, por ter aceite orientar o

meu trabalho, pela dedicação na orientação deste trabalho, estando sempre disponível

para me ajudar.

Ao Doutor Miguel Vilas Boas, meu Co-orientador, que foi incansável na

orientação deste trabalho, sempre presente na resolução dos problemas. Um muito

obrigado pela sua dedicação na orientação e pela sua amizade.

À Doutora Isabel Ferreira por ter acolhido o meu trabalho no seu projecto de

investigação, por toda a amizade, simpatia e apoio demonstrado.

Aos meus colegas de Laboratório, pelos bons momentos passados tanto a trabalhar

como nas pausas para o cafezinho, que tornaram estes meses inesquecíveis. À Lillian,

pelos extractos de cogumelos, pelo apoio, conselhos e explicações acerca do mundo dos

cogumelos, pela sua boa disposição e amizade. À Daniela, por todo apoio e amizade,

sempre disponível a ajudar e a resolver qualquer problema, pelos bons momentos

passados nos almoços. Ao João, pelo sentido de humor e pela banda sonora do trabalho.

Aos restantes membros do Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada da

Escola Superior Agrária de Bragança, pelo bom acolhimento, pelo apoio e pelos bons

conselhos ao longo destes meses.

Aos meus amigos fora do mundo da química, presentes em todos os momentos,

que ouviram os meus problemas, ansiedades, alegrias e me apoiaram, ao longo destes

dois anos.

Por fim, os últimos são os primeiros, aos meus pais, ao Miguel, aos meus avós e

ao meu tio pelo constante apoio, amor e carinho dado durante esta fase. Se cheguei aqui

a vós o devo.

iii

Resumo

Este trabalho teve como objectivo a avaliação da capacidade antioxidante e a

quantificação da composição electroactiva em doze espécies de cogumelos silvestres

comestíveis provenientes da região de Trás-os-Montes, através de técnicas

electroquímicas. As diferentes amostras de cogumelos, sofreram um processo de

extracção com metanol, analisando-se posteriormente o extracto por voltametria cíclica

e por voltametria de impulso diferencial.

Numa primeira fase do trabalho procedeu-se à optimização das condições

experimentais a utilizar nos estudos voltamétricos: solução MeOH/tampão acetato 0,1

mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), sistema de três eléctrodos constituído por um

eléctrodo de referência de Ag/AgCl saturado com KCl 3 mol dm-3, eléctrodo auxiliar de

platina e eléctrodo de trabalho de carbono vítreo; como electrólito de suporte

seleccionou-se uma solução de perclorato de sódio a 0,1 mol dm-3. Os voltamogramas

foram traçados num intervalo de potencial de 0 V a um máximo de 1,8 V.

A voltametria cíclica permitiu a avaliação do perfil redox dos extractos

metanólicos de cogumelos, enquanto que a voltametria de impulso diferencial permitiu

a quantificação das espécies electroactivas totais existentes nos diferentes extractos

metanólicos de cogumelos. Ambas as técnicas permitiram verificar a existência de uma

onda anódica irreversível a 0,9 V comum a todos os extractos. Atendendo aos valores

de Ep/2, verificou-se que o extracto com maior poder redutor foi o de Sarcodon

imbricatus seguido do Macrolepiota procera> Leucopaxillus giganteus> Agaricus

silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius deliciosus.

No estudo de diferentes espécies do mesmo género, verificou-se que para os

Agaricus, os extractos de Agaricus silvaticus e Agaricus silvicola são os que apresentam

maior capacidade antioxidante, enquanto que o maior poder redutor foi apresentado pelo

Agaricus arvensis. Em relação aos Macrolepiota, o maior poder redutor é apresentado

pelo procera, enquanto que a maior capacidade antioxidante corresponde ao mastoideia.

Nos Lactarius, tanto o deliciosus como o piperatus, nas diferentes fases de maturação,

apresentam somente a onda comum a 0,9 V, embora o Lactarius deliciosus apresenta

uma maior densidade de corrente, logo maior capacidade antioxidante.

A avaliação da existência de outros processos de oxidação correspondentes a

flavonóides presentes nos extractos, realizado pH 7, demonstrou que no Sarcodon

iv

imbricatus, Macrolepiota procera e Leucopaxillus giganteus surgem ondas de oxidação

adicionais, a potenciais menos positivos, que foram atribuídos a existência de

flavonóides.

A quantificação de espécies electroactivas foi obtida em termos de equivalentes

de ácido gálico e ácido ascórbico. Verificou-se que os extractos Agaricus silvaticus,

Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus são os que apresentam

maiores destas espécies, seguidos dos Macrolepiota mastoidea~Agaricus arvensis>

Agaricus romagnesii> Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus

giganteus~Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.

Foi também optimizado um método de quantificação de tocoferóis por DPV; no

entanto, não foi possível detectar estas espécies antioxidantes nos extractos de

cogumelos utilizados.

v

Abstract

The aim of this work was the evaluation of the antioxidant capacity and the

quantification of the electroactive composition in twelve species of edible wild

mushrooms from the region of Trás-os-Montes, through electrochemical techniques.

The different samples of mushrooms were extracted with methanol, analyzing later the

extract by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry.

In the first stage the experimental conditions used in the voltammetric studies

were optimized: MeOH / acetate buffer 0.1 mol dm-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2)

solutions, a three-electrode cell incorporating Ag/AgCl (3 mol dm-3 KCl) as the

reference electrode, a Pt foil as counter electrode and a platinum or glassy carbon disk

as working electrode; sodium perchlorate 0.1 mol dm-3 was used as supporting

electrolyte. The voltammograms were acquired between 0 V and 1.8 V.

The cyclic voltammetry allowed the evaluation of the redox profile of the

methanolic extracts of mushrooms, while the differential pulse voltammetry, allowed

the quantification of total electroactive species present in the different methanolic

extracts of mushrooms. Both techniques showed the existence of an irreversible anodic

wave at 0.9 V, similar to all extracts. Based on the values of Ep / 2, it was found that the

extract with higher reducing power was Sarcodon imbricatus followed by Macrolepiota

procera> Leucopaxillus giganteus> = Agaricus silvaticus = Coprinus comatus =

Lactarius deliciosus.

In the study of different species of the same gender, for Agaricus it was found that

the extracts of Agaricus silvaticus and Agaricus silvicola are those with higher

antioxidant capacity, while Agaricus arvensis present higher reducing power. For

Macrolepiota the higher reducing power is shown in procera, while highest antioxidant

capacity corresponds to mastoideia. In Lactarius, both deliciosus and piperatus, in

different stages of maturation, have only a common wave at 0.9 V, although the

Lactarius deliciosus presents a greater current density, therefore greater antioxidant

capacity.

The evaluation of oxidation processes due to flavonoids present in extracts, carried

at pH 7, revealed that in Sarcodon imbricatus, Macrolepiota procera and Leucopaxillus

giganteus, at less positive potentials, there are additional oxidation waves, which

confirm the presence of flavonoids.

vi

The quantification of electroactive species was obtained in terms of the equivalent

of gallic and ascorbic acids. It was found that the extracts of Agaricus silvaticus,

Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus are those with higher content,

followed by Macrolepiota mastoidea ~ Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii>

Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus ~ Lactarius

deliciosus> Lactarius piperatus.

Finally, the presence of tocopherols in the extracts was evaluated using DPV,

however, under the experimental conditions it was not possible to detect these

antioxidants species in the analysed mushrooms extracts.

vii

Résumé

Ce travail a comme objectif l’évaluation de la capacité antioxydante et la

quantification de la composition électroactive sur douze espèces de champignons

champêtres comestibles qui proviennent de la région de Trás-os-Montes, à travers des

techniques électrochimiques. Les différents exemplaires de champignons ont subi un

processus d’extraction avec du méthanol, s’étant postérieurement analysé l’extrait par

voltamètre cyclique et para voltamètre d’impulsion différentiel.

Dans une première étape du travail, nous avons procédé à une optimisation des

conditions expérimentales a utiliser dans les études voltamétriques: solution

MeOH/tampon acétate 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), système de trois

électrodes constitués par un électrode de référence de Ag/AgCl saturé avec KCl 3 mol

dm-3, électrode auxiliaire de platine et électrode de travail de carbone vitré; comme

électrolyte de support nous avons sélectionné une solution de perchlorate de sodium a

0,1 mol dm-3. Les voltamogrames ont été tracé dans un intervalle de potentiel de 0 V à

un maximum de 1,8 V.

La voltamètrie cyclique a permis l’évaluation du profil du redox des extraits

méthanoïques des champignons, alors que la voltamètrie d’impulsion différentiel a

permis la quantification des espèces électroactives totales existantes dans les différents

extraits méthanoïques des champignons. Les deux techniques ont permis de vérifier

l’existence d’une onde anodique irréversible a 0,9 V commun a tout les extraits. Si nous

observons les valeurs de Ep/2, nous pouvons vérifier que l’extrait avec la plus grande

force réductrice a été le Sarcodon imbricatus suivi du Macrolepiota procera>

Leucopaxillus giganteus> Agaricus silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius

deliciosus.

Dans l’étude de différentes espèces du même genre, nous avons vérifié que pour

les Agaricus, les extraits de Agaricus silvaticus et de Agaricus silvicola sont ceux qui

représentent la plus grande capacité antioxydante, alors que la plus grande force

réductrice a été présentée par le Agaricus arvensis. En ce qui concerne les

Macrolepiota, la plus grande force réductrice a été présentée par le procera, alors que la

plus grande capacité antioxydante correspond au mastoideia. Dans les Lactarius, aussi

bien le deliciosus que le piperatus, dans les différentes phases de maturation,

représentent seulement la vague commune a 0,9 V, malgré que le Lactarius deliciosus

viii

représente une plus grande densité de courrant, donc une plus grande capacité

antioxydante.

L’évaluation de la présence d’autres processus d’oxydation correspondants a des

flavonoïdes présents dans les extraits, réalisé pH 7, a démontré que dans le Sarcodon

imbricatus, Macrolepiota procera e Leucopaxillus giganteus ont surgi des vagues

d’oxydation additionnelle, à des potentiels moins positifs, qui ont été attribués à la

présence de flavonoïdes.

La quantification des espèces électroactives a été obtenue avec des équivalents

d’acide gallique et d’acide ascorbique. Nous avons vérifié que les extraits d’Agaricus

silvaticus, Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus sont ceux qui

représentent les plus grandes valeurs de ces espèces, suivies des Macrolepiota

mastoidea~Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii> Macrolepiota procera> Sarcodon

imbricatus> Leucopaxillus giganteus~Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.

Nous avons aussi optimisé une méthode de quantification de tocoferoïdes par

DPV; néanmoins, il nous a été impossible de détecter ces espèces antioxydantes dans

les extraits de champignons utilisés.

ix

Índice geral

Agradecimentos ii Resumo iii Abstract v Résumé vii Índice geral ix Índice de figuras xi Índice de tabelas xiv Lista de abreviaturas e símbolos xv Capítulo I – Introdução 1 1.1 – Cogumelos 2 1.1.1 – Valor nutricional e medicinal dos cogumelos 4 1.3 – Processos de stress oxidativo 6 1.3 – Compostos fenólicos 8 1.3.1 – Propriedades electroquímicas de compostos fenólicos 10 1.3.2 – Metodologias de avaliação da capacidade antioxidante 12 1.3.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por técnicas electroquímicas 13 Capítulo II – Descrição das técnicas usadas 15 2.1 – Técnicas voltamétricas 16 2.1.1 – Voltametria cíclica 16 2.1.1.1 – Sistemas reversíveis 18 2.1.1.2 – Sistemas irreversíveis 19 2.1.2 – Voltametria de impulso diferencial 21 Capítulo III – Execução experimental 24 3.1 – Solventes e reagentes 25 3.2 – Instrumentação 26 3.2.1 – Instrumentação geral 26 3.2.2 – Electroquímica 26 3.3 – Procedimento 27 3.3.1 – Acondicionamento do eléctrodo 27 3.3.2 – Preparação dos extractos metanólicos 27 3.3.2.1 – Amostragem 27 3.3.2.2 – Extracção dos cogumelos 29 3.3.3 – Avaliação e quantificação da capacidade antioxidante 29 3.3.4 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos 30 Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão 31 4.1 – Optimização das condições experimentais 32 4.1.1 – Eléctrodo de trabalho 32 4.1.2 – Solução tampão 33 4.1.3 – Condições electroquímicas 35 4.2 – Caracterização electroquímica por voltametria cíclica 37 4.2.1 – Comportamento electroquímico das substâncias padrão 38 4.2.2 – Extractos de cogumelos 39 4.2.2.1 – Agaricus 42 4.2.2.2 – Macrolepiotas 43 4.2.2.3 – Lactarius 44 4.2.3 – Estudo a pH 7 46 4.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por voltametria de impulso diferencial 48 4.3.1 – Substâncias padrão 48 4.3.2 – Estudo do efeito da concentração da amostra 49 4.3.3 – Extractos de cogumelos 50 4.3.3.1 – Agaricus 52 4.3.3.2 – Macrolepiotas 53

x

4.3.3.3 – Lactarius 53 4.3.4 – Estudo a pH 7 56 4.4 – Quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos de cogumelos 58 4.5 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos 62 4.5.1 – Substâncias padrão 62 4.5.2 – Extractos de cogumelos 64 Capítulo 5 – Conclusões e perspectivas futuras 66 5.1 – Conclusões 67 5.2 – Perspectivas futuras 69 Bibliografia 70

xi

Índice de figuras Figura 1.1 Constituição do cogumelo.[3]

Figura 1.2 Estrutura de um Basidiomycota.[1] Figura 1.3 Esquema da formação de espécies reactivas de oxigénio.[32] Figura 1.4 Estruturas químicas para os ácidos fenólicos derivados do: (a) - ácido cinâmico e (b) -

ácido benzóico. Figura 1.5 Estrutura base para os flavonóides. Figura 1.6 Esquema reaccional da oxidação de compostos fenólicos, na presença de radicais livres,

com a formação do radical fenoxilo. Figura 2.1 Variação do potencial aplicado com o tempo, em voltametria cíclica. Figura 2.2 Voltamograma típico para um processo reversível O + ne – → R.[74] Figura 2.3 Voltamograma cíclico para um sistema irreversível.[75] Figura 2.4 Voltamogramas cíclicos de um sistema reversível (___) e quasi-reversível (- - -).[75] Figura 2.5 Voltametria de impulso diferencial: (a) - esquema de aplicação de potenciais; (b) - Perfil

de um voltamograma.[74,75] Figura 3.1 Montagem experimental. Figura 3.2 Cogumelos estudados neste trabalho: (a) Agaricus silvicola; (b) Agaricus silvaticus; (c)

Agaricus romagnesii; (d) Agaricus bisporus; (e) Agaricus arvensis; (f) Coprinus comatus; (g) Leucopaxillus giganteus; (h) Lactarius deliciosus; (i) Lactarius piperatus; (j) Macrolepiota procera; (k) Sarcodom imbricatus; (l) Macrolepiota mastoidea.

Figura 4.1 Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.2 Voltamograma relativo a um extracto metanólico de Agaricus arvensis 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.3 Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3). (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.4 Voltamograma obtido por DPV de uma solução do extracto de Leucopaxillus giganteus 1 mg cm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V, (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3).

Figura 4.5 Voltamogramas cíclicos consecutivos, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido ascórbico 1 mmol dm-3; (b) extracto de Agaricus arvensis a 10 mg cm-3.

Figura 4.6 Voltamograma cíclico do extracto metanólico de Leucopaxillus giganteus 1mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s-1, (i) eléctrodo após acondicionamento/limpeza e (ii) eléctrodo sem acondicionamento/limpeza.

Figura 4.7 Voltamograma por DPV de uma solução de ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com uma amplitude de impulso de (i) 0,05 V, (ii) 0,06 V e de (iii) 0,07 V.

Figura 4.8 Estrutura química do (a) ácido ascórbico, (b) ácido gálico e (c) rutina Figura 4.9 Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4

(70:28:2), com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido ascórbico 0,5 mmol dm-3; (b) ácido gálico 0,5 mmol dm-3.

Figura 4.10 Voltamograma cíclico da rutina a 0,5 mmol dm-3, ν = 0,1V s-1, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), até (i) 0,6 V e (ii) 1,2 V.

Figura 4.11 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1

xii

V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus (fase III).

Figura 4.12 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 Vs-1: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. romagnesii; (v) A. arvensis.

Figura 4.13 Voltamograma cíclico relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.

Figura 4.14 Voltamograma cíclico para os extractos de (i) L. deliciosus, fase III e (ii) L. piperatus, fase III, com uma concentração de 10 mg/cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.

Figura 4.15 Voltamograma cíclico para os extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 Vs-1.

Figura 4.16 Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido gálico, 1 mmol dm-3; (b) rutina, 0,5 mmol dm-3.

Figura 4.17 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em (i) tampão pH 7 e (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.

Figura 4.18 DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. (a) ácido ascórbico; (b) ácido gálico; (c) rutina.

Figura 4.19 Representação gráfica da densidade de corrente em função da concentração de extracto de Agaricus silvaticus, para um Ep=0,9 V.A voltametria de impulso diferencial foi realizada com ν=0,03 vs-1 e uma amplitude de modulação de 006 V.

Figura 4.20 DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.

Figura 4.21 DPV dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. arvensis; (v) A. romagnesii.

Figura 4.22 DPV relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.23 DPV relativo aos extractos de (i) Lactarius deliciosus e (ii) Lactarius piperatus, na fase de maturação III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.24 DPV relativo aos extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.25 DPV relativo aos extractos Lactarius piperatus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.26 DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4. (a) ácido gálico; (b) rutina. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.27 DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em tampão (i) pH 7 e (ii) pH 4: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.28 DPV para o ácido gálico em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), a várias concentrações: (i) 0,20 mg cm-3; (ii) 0,15 mg cm-3; (iii) 0,1 mg cm-3 (iv) 0,05 mg cm-3; (v) 0,02 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

xiii

Figura 4.29 DPV do extracto S. imbricatus em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2) a várias concentrações: (i) 15 mg cm-3; (ii) 10 mg cm-3; (iii) 5 mg cm-3; (iv) 1 mg cm-3; (v) 0,5 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.30 Variação da densidade de corrente em função da concentração, de 0,002 a 0,2 mg cm-3 obtida por DPV para o (a) e ácido gálico (b). ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.31 Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos, por voltametria de impulso diferencial. (a) A. silvicola, (b) A. bisporus, (c) A. silvaticus, (d) A. arvensis, (e) A. romagnesii, (f) C. comatus, (g) M. mastoidea, (h) M. procera, (i) S. imbricatus, (j) L. giganteus, (k) L. deliciosus, (l) L. piperatus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.32 Estruturas químicas dos diferentes tocoferóis. Figura 4.33 Voltamograma cíclico dos padrões numa solução contendo 0,2 cm-3 de H2SO4 0,1 mol

dm-3, 1,2 cm-3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm-3), com concentração de 0,01 mg cm-3. ν = 0,1V s-1.

Figura 4.34 DPV para diferentes concentrações de padrões, solução contendo 0,2 cm-3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm-3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm-3) . (i) 0,02 mg cm-3 (ii) 0,01 mg cm-3 (iii) 0,004 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.35 Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos para os padrões. (i) α-tocoferol; (ii) β- e γ-tocoferol; (iii) δ-tocoferol.

Figura 4.36 DPV dos diferentes extractos de Agaricus, com uma concentração de 10 mg cm-3, numa solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3), s. (a) A. silvicola; (b) A. silvaticus; (c) A. romagnesii; (d) A. arvensis; (e) A. bisporus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

xiv

Índice de tabelas Tabela 4.1 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos numa concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.2 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos de Agaricus com uma concentração de 10 mg

cm-3. Tabela 4.3 Valores de Ep/2 para os Lactarius em diferentes fases de maturação, com uma

concentração de 10 mg cm-3. Tabela 4.4 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.5 Valores de Ep para os diferentes extractos com uma concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.6 Valores de Ep para os extractos de Lactarius nas diferentes fases de maturação, com uma

concentração de 10 mg cm-3. Tabela 4.7 Valores de Ep para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.8 Resultados obtidos para os diferentes extractos por voltametria de impulso diferencial.

xv

Abreviaturas e símbolos

AA Ácido ascórbico AAPH Diidrocloreto de 2,2’-azobis (2-amino propano) ABTS Ácido 2’-azino-bis(3- etilbenzotiazoline-6-sulfónico AG Ácido gálico AMNV 2,2’-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo) DAD Detector diode-array DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo DPV Voltametria de impulso diferencial C.A. Capacidade antioxidante CV Voltametria cíclica ECD Detector electroquímico ESR Ressonância de spin electrónico EtOH Etanol GC-FID Cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de chama HPLC Cromatografia líquida de alta pressão LC-MS Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa MeOH Metanol MS-MS Espectrometria de massa acoplada a espectrometria de massa ORAC Capacidade de absorção do oxigénio radicalar PS Perclorato de sódio mono-hidratado RMN Ressonância magnética nuclear rpm Rotações por ,minuto TBAP Perclorato de tetrabutilamónio UV-Vis Ultravioleta-visível A Área do eléctrodo α Coeficiente de transferência C Concentração D Coeficiente de difusão ∆Ep Eº Potencial formal Ep/2 Potencial de onda a meia altura E1/2 Potencial de meia onda Ep Potencial de onda Epa Potencial de onda anódico Epc Potencial de onda catódico F Constante de Faraday kº Constante de velocidade padrão heterogénea ip Intensidade de corrente de pico ipa Intensidade de pico anódico ipc Intensidade de pico catódico j Densidade de corrente n número de electrões na número de electrões envolvidos no processo de transferência electrónica T Temperatura ν Velocidade de varrimento W1/2 Largura do pico a meia-altura

Capítulo I – Introdução

1

Capítulo I

Introdução


2

Neste capítulo apresenta-se a descrição das características dos cogumelos, no que

se refere aos aspectos constitucionais, nutricionais e as suas propriedades medicinais,

como o seu valor nutricional e medicinal, já que são uma fonte alimentar rica em

antioxidantes, moléculas bloqueadoras de radicais livres.

Os organismos estão expostos a vários tipos de ameaças, entre elas o stress

oxidativo, causador de um conjunto variado de patologias. Considerando os cogumelos

como uma fonte de compostos com propriedades farmacológicas com potencialidades

para a prevenção destas ameaças, efectua-se uma caracterização sucinta dos processos

de stress oxidativo, da importância dos compostos fenólicos na sua prevenção e

descrevem-se os métodos analíticos utilizados para a avaliação destes compostos em

matrizes alimentares.

1.1 – Cogumelos

Das 75 000 espécies classificadas como fungos, os cogumelos são os mais

conhecidos, constituindo um grupo de organismos bastante importante que durante

muito tempo foi considerado como plantas, mas que devido ás suas características tão

peculiares constituem agora um reino próprio – Reino Fungi.

Os fungos apresentam um conjunto de características próprias que permitem sua

diferenciação das plantas: não sintetizam clorofila, não possuem celulose na sua

parede celular, sendo esta constituída, na maioria das vezes, por quitina (polímero da

N-acetil-D-glicosamina) e também não armazenam amido como substância de reserva,

mas sim glicogénio.[1,2] São seres heterotróficos, obtendo o seu alimento por absorção.

Alguns, os saprófitas, produzem enzimas que hidrolisam a matéria orgânica morta que

os rodeia. Porém, podem também ser parasitas recebendo o alimento do corpo dos

hospedeiros, prejudicando-os, ou em simbiose com benefício para ambos.

Com excepção de algumas formas unicelulares, como as leveduras, os fungos

são constituídos por uma rede de filamentos ramificados chamados hifas, Figura 1.1.

Estas contêm citoplasma e núcleos, e podem apresentar diferentes formas. As hifas,

iniciam-se como formações tubulares a partir de esporos, ramificando-se

repetidamente. Constituem assim uma rede mais ou menos densa que forma o micélio.

O crescimento total do micélio pode exceder um quilómetro por dia e ficar organizado

num corpo muito elaborado, como acontece com os cogumelos.


3

Figura 1.1 – Constituição do cogumelo, retirado de [1].

A reprodução dos fungos é variada e por vezes complexa, envolvendo processos

sexuados e assexuados (por gemiparidade ou por formação de vários esporos). O tipo

de reprodução que apresentam é utilizado na sua classificação, considerando-se quatro

divisões: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota.

Os cogumelos são frutificações de alguns fungos e pertencem à divisão

Basidiomycota. São em grande parte saprófitas existindo também alguns parasitas. A

constituição de um cogumelo encontra-se representada na Figura 1.1 e 1.2.

Figura 1.2 – Estrutura de um Basidiomycota, retirado de [3].


4

A parte visível do fungo é constituída por um conjunto compacto de hifas que

formam uma estrutura reprodutora complexa, denominada basidiocarpo. Nas lâminas

radiais existentes na face interior do chapéu, formam-se hifas especializadas chamadas

basídios que originam esporos sexuados designados basidiósporos, Figura 1.2. A parte

subterrânea do micélio não visível, é constituída por hifas septadas, monocarióticas e é

a partir dela que se forma a região aérea, na altura da reprodução. Uma vez maduros

estes esporos, caem ao solo e germinam produzindo hifas que darão origem aos

micélios primários. Estas hifas têm sexos diferentes (+, -). Quando se encontram duas

hifas compatíveis juntam-se célula a célula e dão lugar aos micélios secundários (com

células binucleadas). Estes micélios são os que irão produzir novos cogumelos.[1,2]

1.1.1 - Valor nutricional e medicinal dos cogumelos

Os cogumelos estão presentes em áreas tão diversas como a alimentação, a

medicina, na obtenção de alguns medicamentos (o Leucopaxillus giganteus é usado na

indústria farmacêutica para extracção do antibiótico clitocibina[4]), na luta biológica de

pragas (Cordyceps militaris contra a processionária do pinheiro[2]) e até no artesanato

e ornamentação.

Existem mais de 45 mil espécies descritas de cogumelos, com cerca de duas mil

conhecidas como comestíveis, mas apenas 25 são cultivadas e aceites como alimento,

e somente 10 têm-se tornado populares entre os países consumidores destes fungos.[1]

Na alimentação, apresentam um valor gastronómico elevado já que possuem um

sabor, aroma e textura inegualáveis. Desde os tempos antigos que os cogumelos são

consumidos por humanos, fazendo parte da sua dieta alimentar.[2,5-9]

São um alimento de alto valor nutritivo, com uma quantidade de proteínas quase

equivalente à carne, ovos, leite e acima de alguns vegetais e frutas (19-35% em seco,

incluindo todos os aminoácidos essenciais),[9,10,] apresentando um teor de 80 a 90 % de

água relativamente ao peso total.[2] Contêm vitaminas como a tiamina, riboflavina,

ácido ascórbico, vitamina D2, uma percentagem elevada de minerais (cálcio, iodo,

fósforo) e também valores apreciáveis de fibras.[5,7-9,11]

Alguns estudos recentes[12] indicam que os cogumelos silvestres do nordeste de

Portugal são uma fonte rica em carbohidratos, manitol e trealose. São um alimento


5

com baixo teor de gorduras, encontrando-se em maior quantidade os ácidos gordos

insaturados, como os ácidos oleico e linoleico. Este aspecto faz deste alimento um

excelente componente para uma dieta alimentar pobre em calorias, já que uma porção

de 100g de cogumelo contém aproximadamente 28 Kcal (118KJ).

Ao longo da história da humanidade, os primeiros efeitos da acção dos

cogumelos na saúde humana foram as intoxicações, como os casos do ergotismo na

idade média e alucinogénios em rituais religiosos. Só mais tarde, no séc. XIX e XX se

descobriu uma acção benéfica para o ser humano.[2,13]

Hoje em dia os cogumelos são um alimento terapêutico útil na prevenção de

várias doenças, servindo como fonte para o desenvolvimento de fármacos e

nutricêuticos (alimentos com propriedades farmacêuticas).[14] Na literatura está

descrito a actividade de cogumelos em várias terapêuticas anti-tumorais, anti-

microbianas, anti-víricas, anti-alérgicas, anti-inflamatórias, tratamentos hematológicos

e imunomoduladores, em tratamento de diabetes, hipertensão e

hipercolestrolemia.[2,15,16] Em alguns países, como a China, o Japão, os EUA e o

Canadá, os cogumelos são utilizados no tratamento de casos de cancro

gastrointestinais, dos pulmões e da mama.[17,18] A importância do cogumelo chinês

Shiitake (Lentinus edodes), é bem conhecida,[16,19] além de possuir compostos com

actividade anti-tumoral, é utilizado para preparar antibióticos e anti-víricos.

Estas propriedades a nível medicinal, estão associadas com a sua composição

química rica em 1,3-β-D-glucanas, ergosterol, lecitina, crestina, importantes na

resposta imunitária e hematológica no cancro, em quitina, um polissacárido existente

nas paredes celulares, o quitosano, derivado di-acetilado, responsáveis pela

diminuição do colesterol fisiológico.[13,20] São, também uma importante fonte de

compostos bioactivos com valor medicinal, apresentando uma grande variedade de

metabolitos secundários, tais como compostos fenólicos, policetídeos, terpenos e

esteróides, reconhecidos como excelentes antioxidantes, destacando-se os compostos

fenólicos, que se apresentam em maior quantidade.[21,22]

Entre estes compostos com propriedades antioxidantes foi identificado e

quantificado, em vários géneros de cogumelos comestíveis, a ergotionina (2-mercapto-

Nα-trimetil-L-histidina),[23] que é um bloqueador de radicais livres não enzimático,

com capacidade de proteger as células do stress oxidativo. A biosíntese deste

composto efectua-se exclusivamente nos fungos e micobactérias, sendo capturado


6

pelas plantas através das raízes e chegando às nossas células através da cadeia

alimentar.[24]

Estudos recentes[9,25,26,27] descrevem, por técnicas cromatográficas, a presença de

nove ácidos orgânicos, em maior quantidade, os ácidos cítrico, cetoglucárico, málico,

succínico, fumárico e os ácidos oxálico, ascórbico, quínico e ácido xiquímico, em

menores proporções. Adicionalmente, também foram identificados ácidos fenólicos

como os ácido cafeoilquinico, nas posições 3-, 4- e 5-, cafeíco, p-cumárico, p-

hidroxibenzóico, rutina e quercetina. Estes compostos além de influenciarem as

propriedades organolépticas, também apresentam uma importante actividade

biológica, como se verifica pelos resultados obtidos sobre a capacidade antioxidante

dos cogumelos, que mostraram a existência de uma correlação entre a actividade e o

conteúdo em polifenóis: maior actividade antioxidante indica maior quantidade de

fenóis totais. [4,14,15,17,21,22,28,29]

1.2. – Processos de stress oxidativo As células vivas estão continuamente expostas a uma grande variedade de

ameaças, como o stress oxidativo que é causado por um número de factores internos e

externos, como os processos fisiológicos de respiração mitocondrial ou a exposição a

poluentes e radiação ionizante. O stress oxidativo surge nos sistemas biológicos como

resultado de exposição significativa a oxidantes, da diminuição da capacidade

antioxidante do sistema ou de ambos. Está muitas vezes associado com a formação de

espécies reactivas de oxigénio, incluindo os radicais livres, implicados nas

patofisiologias das doenças.[30]

O oxigénio, é um componente vital para a sobrevivência da espécie humana,

estando presente na atmosfera, no estado fundamental e na forma de um biradical

tripleto, 3O2. Após a entrada no corpo humano, pode ser transformado através de um

processo de redução envolvendo 4 electrões, formando-se água, Figura 1.3. Desta

transformação resulta a formação de espécies reactivas de oxigénio, como o radical

superóxido (O2.-), o radical hidroxilo (OH.), o peróxido de hidrogénio (H2O2) e outras

espécies reactivas. Alguns componentes celulares, entre os quais, as proteínas, enzimas,

DNA e RNA, reagem prontamente com estas espécies reactivas de oxigénio.[31]


7

O2 O

HO2

H

HO2

H2O2

HO

H H

H2O3O2

e

hν

1O2

e

O22

e e

Figura 1.3 – Esquema da formação de espécies reactivas de oxigénio.[31]

A oxidação dos lípidos existentes nas membranas celulares é um processo muito

frequente no corpo humano. Esta reacção é iniciada rapidamente pelo excesso de

espécies reactivas de oxigénio, em particular os radicais hidroxilos, através de um

mecanismo radicalar em cadeia, formando-se compostos tóxicos como os peróxidos

lipídicos, o malonaldéido, monohidiroxperóxidos ou 4-hidroxinonenal.[32] Tanto as

espécies envolvidas como as formadas estão relacionadas em muitos causas de doenças,

incluindo o cancro e o envelhecimento.

A peroxidação lipídica, além de causar sérios danos no corpo humano, é a

principal causa da deterioração dos alimentos afectando a cor, aroma (formação de

moléculas nocivas à saúde, voláteis e não voláteis), textura e valor nutricional.[32]

A natureza equipou os organismos contra os danos provocados pelos radicais

livres com vários mecanismos de defesa que actuam de diferentes formas. Os

antioxidantes são moléculas naturais que previnem a formação descontrolada de radicais

livres e espécies reactivas de oxigénio ou que inibem a sua reacção com as estruturas

biológicas, interrompendo a reacção em cadeia e formando radicais com baixa

reactividade que são facilmente removidos do organismo.

Podem ser classificados em dois grandes grupos: as enzimas antioxidantes e os

antioxidantes de baixo peso molecular, aos quais pertencem uma grande variedade de

compostos.[33] As enzimas são em menor número e incluem a superóxido dismutase, a

catalase e a peroxidase. O grupo dos compostos com baixo peso molecular é vasto,[30,34]

actuando directamente como bloqueadores neutralizando as espécies reactivas de

oxigénio, ou indirectamente, como agentes quelantes de metais de transição.[30,35] Nos

tecidos humanos, estes compostos, têm origens diferentes, por exemplo, a glutationa, a

nicotinamida adenina dinucleótido (na forma reduzida) e a carnosina são sintetizadas


8

pelas células. O ácido úrico e a bilirubina são produtos do metabolismo celular,

enquanto que o ácido ascórbico, α-tocoferol, β-caroteno e outros carotenóides, como o

licopeno e compostos fenólicos, são obtidos da alimentação.[31,36,37] Todavia, em certas

situações, como a toma de alguns fármacos ou radiação UV, ocorre uma maior

formação de espécies reactivas de oxigénio, excedendo as capacidades normais de

defesa do organismo, o que provoca danos nos tecidos.

As plantas constituem a maior fonte de antioxidantes para o homem. A uma dieta

alimentar saudável, rica em fruta e vegetais está associada a uma menor incidência de

mortes por cancro, doenças do coração, aterosclerose, doenças degenerativas e

envelhecimento.[30,31]

1.3 – Compostos fenólicos Os compostos fenólicos são um grupo extenso e complexo de fitoquímicos e são

encontrados em grandes quantidades nos vegetais e plantas. Além das suas propriedades

antioxidantes, a sua presença contribui para a parte sensorial dos alimentos, como a cor,

o sabor e o aroma.[38]

De uma maneira geral, o termo “antioxidante” é usado para classificar moléculas

que estão presentes em baixas quantidades relativamente ao substrato que é oxidável,

que reagem rapidamente de maneira a suprimir ou a prevenir a sua oxidação.[39]

Recentemente, devido ás restrições colocadas ao uso de antioxidantes sintéticos

como o BHA (2- e 3-terc-butil-4-metoxifenol) e o BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol),

cresceu o interesse por antioxidantes de origem natural. Muitas indústrias cosméticas,

farmacêuticas e alimentares usam-nos na formulação dos seus produtos, porque além de

possuírem valor medicinal, previnem o envelhecimento e degradação dos produtos.[40-42]

Este conjunto de compostos tem na sua constituição básica um ou mais anéis

benzénicos hidroxilados e as suas propriedades redox estão relacionadas com as suas

características estruturais: o número e posições dos grupos hidroxilo e metoxilo no anel,

a extensão da conjugação estrutural, a presença de grupos dadores ou aceitadores de

densidade electrónica no anel aromático, que lhe conferem características antioxidantes.

Nas reacções em que estão envolvidos como antioxidantes actuam como dadores de

densidade electrónica em meios aquosos e dadores de protões em meios não polares,


9

como no caso da peroxidação lipídica, na qual se vão ligar aos radicais alquilperoxilo

(ROO•), formando um radical estabilizado pela ressonância do anel aromático.[32,43]

Os dois grupos principais que constituem os compostos fenólicos são os ácidos

fenólicos e os flavonóides. Os ácidos fenólicos dividem-se em derivados do ácido

benzóico (ex.: ácido gálico) e derivados do ácido cinâmico (ex.: ácido cafeico, ácido

clorogénico), Figura 1.4.[44,45] Os ácidos fenólicos encontram-se frequentemente

esterificados, muitas das vezes com o ácido quínico, por exemplo o ácido caféico vai

dar origem ao ácido clorogénico. Também se podem esterificar com outros

componentes como os ácidos xiquímico, málico, tartárico, entre outros. Além de

esterificados podem encontrar-se também na forma glicosídica.[32,46]

HO

R

CH CHCOOH HO

R

R

R

COOH

(a) (b) Figura 1.4 – Estruturas químicas para os ácidos fenólicos derivados do: (a) - ácido cinâmico e (b) - ácido benzóico.

A actividade antioxidante dos ácidos fenólicos e dos seus ésteres depende do

número de grupos hidroxilo existentes na molécula. A presença do grupo carboxilato,

um aceitador de densidade electrónica por efeito mesomérico, confere aos derivados

hidroxilados do ácido benzóico uma menor tendência para se comportarem como

dadores de protões, comparativamente aos derivados hidroxilados do ácido cinâmico.[36]

Os flavonóides englobam uma classe muito importante de compostos encontrados

com grande frequência na natureza, unicamente em vegetais, que além de possuírem

propriedades antioxidantes são considerados pigmentos. Todos os flavonóides possuem

uma estrutura base C6-C3-C6, em que dois dos anéis da molécula são anéis

aromáticos.[44,47] Estes compostos possuem como estrutura base a flavona, Figura 1.5,

ou uma forma hidrogenada dessa estrutura.


10

O

O

12

345

67

8

2'3'

4'

5'

A B

C

Figura 1.5 – Estrutura base para os flavonóides. Podem ser agrupados em vários grupos como: flavonas (ex.: luteolina), flavonóis

(ex.: quercetina), flavanonas (ex.: naringina) e isoflavonas. Os flavonóis são um grupo

abundante e ocorrem geralmente esterificados com glicosídeos e/ou glicurónidos.

Normalmente, o glicosídeo encontra-se na posição 3, podendo também surgir na

posição 7. A glicose é o glicosídeo mais comum, mas também ocorrem a rutinose,

galactose, arabinose ou a xilose. A rutina (quercetina-3-o -rutinose) é um dos

flavonóides mais bioactivos, também conhecida por vitamina P, e já descrito como um

factor activador para a vitamina C.[48]

1.3.1 - Propriedades electroquímicas de compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são electroactivos, facilmente sujeitos a reacções de

transferência electrónica de oxidação e redução, podendo assim ser estudados por

métodos electroquímicos. Estes compostos têm em comum um ou mais grupos

hidroxilo ligados a um anel benzénico ou a uma estrutura cíclica.

A reacção inicial apresenta-se, muitas vezes, da seguinte forma:

R O + 2 H+ + 2e- (eq.1)

onde R é o antioxidante (redutor) e o O é o produto formado, que também pode ser

oxidante se o processo for reversível. Os grupos hidroxilo são oxidados pela

transferência de 2 electrões levando à formação, depois da libertação de 2H+, da

correspondente quinona. Está comprovado que, devido a efeitos de estabilização do

anel, quanto maior for o número de substituintes hidroxilo no anel aromático, menor

será o potencial de oxidação.[49]


11

De uma maneira geral, no passo inicial da oxidação dos compostos fenólicos há a

formação de um radical fenoxilo, mas também surge descrito na literatura o ião

fenoxónio como produto, Figura 1.6. Estes compostos intermédios podem participar em

reacções de acoplamento, perda de protões ou ataque nucleófilo.[34,50-52]

R O OR

R OH

R O

ROO

OR

Figura 1.6 – Esquema reaccional da oxidação de compostos fenólicos, na presença de radicais livres, com a formação do radical fenoxilo. No caso particular dos flavonóides, as reacções de oxidação dependem da sua

estrutura já que têm vários grupos fenoxilo livres, em particular o-fenoxilo. São estes

grupos hidroxilo presentes no anel C, Figura 1.5, que são os principais responsáveis

pelas propriedades antioxidantes, já que são os primeiros grupos a serem

oxidados.[43,48,53,54] A presença de diferentes substituintes nas estruturas vai alterar a sua

capacidade antioxidante, aumentando quando os substituintes são dadores de densidade

electrónica, já que estabilizam o anel aromático.[52]

O pH do meio reaccional é também um factor importante neste tipo de reacções,

pois o pH altera a fórmula de estrutura das espécies e por conseguinte terão valores de

potencias diferentes. Este factor permite diferenciar entre os ácidos fenólicos e

flavonóides. Estes últimos compostos vão apresentar reacções de oxidação susceptíveis

ao pH, tendo mais tendência a ocorrerem a pH neutro, isto é, são dadores de electrões

mais efectivos a este pH, enquanto que os ácidos fenólicos são mais activos a pH

ácidos.[43,53,55] Estudos efectuados por radioquímica revelam que a maioria dos

flavonóides ingeridos se encontram nos intestinos, antes de serem excretados na bílis,

onde a sua acção antioxidante será maior. Em contrapartida, os ácidos fenólicos são


12

mais electroactivos no estômago, estando de acordo com o pH em que são mais

electroactivos.[53,56]

1.3.2 - Metodologias de avaliação da capacidade antioxidante Na literatura, estão descritas várias metodologias para determinar a composição

fenólica e a capacidade antioxidante de compostos orgânicos. Estes métodos foram

desenvolvidos de acordo com as propriedades e os modos de acção apresentados pelos

compostos fenólicos.[33]

Genericamente, a avaliação da capacidade antioxidante de um composto ou de

uma amostra, independentemente da sua constituição, baseiam-se em estratégias de

inibição por competição, isto é, vão-se gerar/bloquear radicais, através de diversos

mecanismos, medindo-se a sua concentração em intervalo de tempo definidos.[33,57] A

maioria destes métodos avaliam a capacidade de bloquear radicais livres, alguns com

cor como os formados pelo DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazilo)[57,58], o ABTS•+ (ácido

2’-azino-bis(3- etilbenzotiazoline-6-sulfónico), o AAPH (diidrocloreto de 2,2’-azobis

(2-aminopropano)) e o AMNV (2,2’-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo)). Nestes casos é

possível a sua detecção e quantificação por UV-Vis. [33,57]

Outro método utilizado para descrever a capacidade bloqueadora e quelante de

radicais é através da avaliação da capacidade de absorção do oxigénio radicalar (ORAC)

com diferentes espécies reactivas (com um gerador de radicais peroxilo, hidroxilo,

superóxido ou um metal de transição), usando trolox como padrão.[23,39,59,60]

A actividade antioxidante pode também ser determinada directamente, avaliando o

poder redutor de uma amostra; estas metodologias baseiam-se na tendência que os

antioxidantes apresentam para reduzir o catião Fe3+ a Fe2+.[15,60]

A capacidade dos compostos fenólicos para promover ou inibir processos de

oxidação em lípidos levou ao desenvolvimento de uma série de metodologias,

enzimáticas e não enzimáticas, de inibição da peroxidação lipídica, usando o ácido

linolénico como sistema modelo.[52,61]

Para identificar e quantificar os vários compostos fenólicos, que apresentam

estruturas e polaridades muito semelhantes, utilizam-se técnicas espectrofotométricas de

UV-Vis, cromatográficos, HPLC (detectores de UV, fluorescência, DAD, ECD) ou GC-

FID, por espectroscopia de massa, por técnicas de ressonância magnética (RMN, ESR)

ou mesmo por técnicas hifenadas (LC-MS, MS-MS).[9,27,59,62-67]


13

Grande parte destas metodologias apresenta a desvantagem de usarem reagentes

específicos, dispendiosos e procedimentos elaborados, pelo que é recorrente a utilização

do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu para avaliar a quantidade de fenóis

totais. Este método é baseado na reacção dos compostos fenólicos com um reagente

colorimétrico, seguido de medição na região visível do espectro. A desvantagem deste

procedimento é que pode sobrestimar-se o conteúdo em fenóis totais, já que várias

substâncias como, o dióxido de enxofre, ácido ascórbico ou açucares redutores, podem

interferir na medição.[45]

1.3.3 - Avaliação da capacidade antioxidante por técnicas electroquímicas

A procura de metodologias alternativas para caracterizar e avaliar o perfil e

capacidade antioxidante de substâncias orgânicas, levou ao interesse pelas técnicas

electroquímicas, entre elas a voltametria cíclica, a voltametria de impulso diferencial e a

voltametria de onda quadrada.[33] Estas técnicas foram já aplicadas na caracterização de

uma variedade de antioxidantes incluindo ácidos fenólicos,[49,52,56] flavonóides,[45,55,67]

ácido ascórbico,[49,68] tocoferóis,[69] carotenóides[70] e antioxidantes sintéticos[71], tanto

em amostras biológicas como em extractos de plantas.[30,72]

A maioria dos compostos fenólicos é electroactiva, pelo que podem ser estudados

por métodos electroquímicos. Estes compostos, como foi referido anteriormente, vão

actuar como agentes redutores e, em solução, tendem a ser facilmente oxidados em

eléctrodos inertes. Foi já estabelecida uma importante relação entre comportamento

electroquímico e o poder antioxidante: um baixo potencial de oxidação está associado a

um elevado poder antioxidante.[39]

As técnicas voltamétricas oferecem vantagens em relação a outros métodos,

devido a rapidez e simplicidade da análise. O estudo electroquímico dos compostos

fenólicos oferece a possibilidade de investigar as suas características funcionais sem

usar reagentes específicos.[54]

Comparativamente com os métodos espectrofotométricos que são usados

habitualmente na avaliação dos diferentes compostos fenólicos, os electroquímicos

permitem uma maior selectividade.[30,39,45,72] Adicionalmente, as técnicas voltamétricas,

não requerem a caracterização intensiva de cada componente em relação a uma

determinada espécie reactiva de oxigénio para avaliarem a capacidade antioxidante.[30]


14

A maior desvantagem da determinação electroquímica é a possível desactivação

da superfície do eléctrodo, associada com a adsorção de substâncias orgânicas, o que

poderá limitar a reprodutibilidade do método.[37]

Sendo as técnicas voltamétricas rápidas e simples na avaliação da composição

fenólica e capacidade antioxidante, há uma janela de oportunidades para a sua utilização

de forma mais sistemática.

Desta maneira, estas técnicas apresentam-se como uma boa ferramenta tanto na

avaliação da capacidade antioxidante como na quantificação da composição

electroactiva de cogumelos silvestres comestíveis, encontrando-se alguns destes

resultados relativos aos extractos de Agaricus sp. já em publicação.[73]

Capítulo II – Descrição das técnicas usadas

15

Capítulo II

Descrição das técnicas usadas


16

Neste capítulo apresentam-se, sumariamente, os fundamentos teóricos subjacentes

às técnicas usadas na avaliação e quantificação da capacidade antioxidante em extractos

metanólicos de cogumelos. Utilizou-se a voltametria cíclica na caracterização do perfil

das espécies electroactivas e a voltametria de impulso diferencial para a quantificação

da capacidade antioxidante.

2.1 – Técnicas voltamétricas

As técnicas voltamétricas permitem a determinação de componentes

electroactivos, isto é, que podem ser oxidados ou reduzidos. A célula electroquímica, é

geralmente constituída pela solução, o eléctrodo de trabalho, onde ocorre a reacção, o

eléctrodo de referência, cujo potencial é fixo e constante e um eléctrodo auxiliar. O

eléctrodo de trabalho pode actuar como um dador (para a redução) ou receptor (para a

oxidação) de electrões transferidos para ou de espécies em solução, eq. 2,

O + ne- R (eq.2)

onde O é a espécie oxidada e R a reduzida.

O objectivo destas técnicas onde se controla o potencial ao longo do tempo é obter

uma resposta proporcional à concentração na solução. Esta reacção vai ocorrer numa

região de potencial que faz com que a transferência electrónica seja favorável

termodinâmica ou cinéticamente.[74]

2.1.1 – Voltametria cíclica

A voltametria cíclica é uma técnica muito utilizada para obter informação

qualitativa de uma reacção electroquímica, através do diagnóstico de mecanismos de

reacção electroquímicos, identificação de espécies electroactivas presentes em solução

ou análise semi-quantitativa da cinética das reacções. Quando se recorre ao estudo

electroanalítico de um novo sistema, é muitas das vezes a primeira técnica a ser


17

aplicada, dando uma rápida localização dos potenciais de oxidação-redução das espécies

electroactivas.

Esta técnica consiste na aplicação de um potencial ao eléctrodo de trabalho, que

varia com o tempo até a um determinado potencial limite, Efinal, e de seguida a direcção

de varrimento é invertida para o potencial inicial, Einicial, Figura 2.1, conduzindo a

reacções de oxidação/redução das espécies electroactivas (reacções faradaicas), à

adsorção de espécies de acordo com o potencial, e a uma corrente capacitiva associada à

carga da dupla camada.[74,75]

Figura 2.1 – Variação do potencial aplicado com o tempo, em voltametria cíclica.

Considere-se uma reacção de transferência electrónica de redução O + ne – → R,

Figura 2.2. A direcção de varrimento inicial, é portanto negativa. Quando o potencial

aplicado se aproxima do valor característico do potencial formal, Eº, onde a reacção de

eléctrodo começa, a corrente catódica começa a aumentar até atingir um máximo. A

criação de um gradiente de concentração e o consumo de espécies electroactivas, faz

com que a intensidade de corrente diminua, seguindo um perfil proporcional à raiz

quadrada do tempo, t1/2, semelhante ao que ocorre após a aplicação de um impulso de

potencial. Depois de ultrapassar esta região de potencial (~ 90/n mV após o pico), a

direcção do varrimento é invertida e as moléculas reduzidas são reoxidadas, resultando

uma onda anódica. A forma característica das ondas em voltametria cíclica é causada

pela formação de uma camada de difusão perto da superfície do eléctrodo.

Varrimento inverso

Varrimento directo Einicial

Efinal

Tempo

Ciclo 1

Pote

ncia

l


18

Figura 2.2 – Voltamograma típico para um processo reversível O + ne – → R.[74]

Com o aumento da velocidade de varrimento do potencial, o tempo para atingir o

equilíbrio na superfície do eléctrodo é menor, pelo que as reacções que aparecem como

reversíveis para velocidades de varrimento lentas podem ser quasi-reversíveis para

velocidades de varrimento elevadas. Este é um procedimento característico utilizado

para caracterizar a reversibilidade de sistemas electroquímicos.[74,75]

2.1.1.1 - Sistemas Reversíveis

Os voltamogramas cíclicos são caracterizados por vários parâmetros. Num sistema

reversível, a 25 ºC, a corrente é dada pela equação de Randles-Svecik:

( ) 2/12/12/351069,2 vACDnip ×= (eq.3)

onde n é o número de electrões, A é a área do eléctrodo (em cm2), C é a concentração

(mol cm-3), D é o coeficiente de difusão (cm2 s-1) e v é a velocidade de varrimento (V s-

1). De acordo com a equação, a corrente é directamente proporcional à concentração e

aumenta com a raíz quadrada da velocidade de varrimento. Para uma reacção reversível,


19

a razão entre as intensidades de corrente, ipc/ipa é um. Esta razão é afectada pelas

reacções químicas acopladas a processos de oxidação/redução.

O potencial da onda, Ep, está relacionado com o potencial formal destas reacções,

que para um sistema reversível é dado por:

2pcpao EE

E+

= (eq.4)

sendo a separação entre os potenciais catódico e anódico:

nEEE pcpap /059,0=−=∆ (eq.5)

Esta última equação é útil para a determinação do número de electrões transferidos e

aumenta com a irreversibilidade do sistema electroquímico. Um processo que apresente

uma transferência electrónica rápida, tem um ∆Ep de 59 mV, sendo a onda anódica e a

catódica independentes da velocidade de varrimento.[74,75]

2.1.1.2 - Sistemas irreversíveis e quasi-reversíveis

No caso de uma reacção irreversível do tipo O + ne – → R, o varrimento linear e a

voltametria cíclica conduzem ao mesmo perfil voltamétrico, pois não aparece nenhuma

onda anódica ao inverter a direcção de varrimento, Figura 2.3.

Figura 2.3 – Voltamograma cíclico para um sistema irreversível.[75]


20

Os sistemas totalmente irreversíveis são caracterizados pela seguinte equação:

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡⎟⎠⎞

⎜⎝⎛+−−=

2/1

2/1 lnln78,0RTnFv

Dk

nFRTEE

oo

pα

α (eq.6)

onde α é o coeficiente de transferência, n é o número de electrões envolvidos no

processo de transferência electrónica, kº é a constante de velocidade padrão heterogénea

e F a constante de Faraday. O potencial da onda, Ep, e o potencial de meia-onda diferem

de 48/αn mV. O Ep ocorre a potenciais superiores a Eº. A intensidade de corrente é dada

por:

( ) ( ) 2/12/12/151099,2 vACDnni ap α×= (eq.7)

. sendo na o número de electrões envolvidos no processo. Os picos tornam-se mais

alargados conforme αn diminui.

Para sistemas quasi-irreversíveis (com 10-1> ko> 10-5 cm s-1), a corrente é

controlada pela transferência de carga e transporte de massa. A forma do voltamograma

varia em função de ko / √πaD (em que a = nFv/RT): conforme este parâmetro aumenta,

o processo aproxima-se de um sistema reversível, verificando-se o contrário, quando o

valor diminui, isto é, a irreversibilidade aumenta quando aumenta a velocidade de

varrimento. Nestes sistemas verifica-se uma diminuição da onda anódica relativamente

ao caso reversível e uma maior separação entre as ondas anódicas e catódicas, Figura

2.4.[74,75]

Figura 2.4 – Voltamogramas cíclicos de um sistema reversível (___) e quasi-reversível (- - -).[75]


21

2.1.2 – Voltametria de impulso diferencial

As técnicas voltamétrica por impulsos baseiam-se na medida da corrente ao longo

do tempo após a aplicação de um degrau de potencial. A corrente não é medida de

forma contínua, mas em intervalos de tempo predefinidos.

Estas técnicas foram desenvolvidas inicialmente para eléctrodos de gota de

mercúrio, já que sincronizando o crescimento da gota com os impulsos iria reduzir-se a

contribuição da corrente capacitiva, por amostragem da corrente no fim de vida da gota.

Após a aplicação do impulso de potencial, a corrente capacitiva extingue-se mais

rapidamente do que a faradaica. Este tipo de amostragem tem a vantagem de aumentar a

sensibilidade da técnica. Em eléctrodos sólidos, há uma vantagem adicional de

discriminação contra o bloqueamento da reacção de eléctrodo por adsorção.[75] Entre as

diferentes técnicas de voltametria de impulso, a principal diferença reside na forma dos

picos e modo como se faz a análise da corrente.

A voltametria de impulso diferencial, DPV, é uma técnica muito útil na medição

de concentrações vestigiais de espécies orgânicas e inorgânicas. Nesta técnica os

impulsos de potencial de amplitude fixa (10-100 mV), ∆E, são sobrepostos a uma

rampa de potencial que aumenta de forma linear com o tempo. A corrente é medida

imediatamente antes, 1, da aplicação e no final do impulso, 2, Figura 2.5 (a).

O instrumento regista a diferença de intensidade de corrente, ∆i, em cada impulso,

como função do potencial aplicado. Sendo a DPV uma técnica diferencial, a resposta é

semelhante à primeira derivada de um voltamograma diferencial, isto é um pico, Figura

2.5 (b).[74-76]

(a) (b)

Figura 2.5 – Voltametria de impulso diferencial: (a) – perfil de aplicação de potenciais; (b) – voltamograma diferencial de impulso.[74,75]


22

A intensidade de corrente é directamente proporcional à concentração da espécie

electroactiva:

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+−

=σσ

π 112/1

mp t

CnFADi (eq.8)

em que o coeficiente σ = exp[(nF/RT)( ∆E/2)]. O termo (1-σ)/(1+σ) descreve o efeito de

∆E em ipmáx, aumentando quando ∆E aumenta, atingindo valor unitário quando ∆E é

muito grande.

O potencial do pico (Ep), usado para identificar espécies, é análogo com E1/2:

2/2/1 EEE p ∆±= (eq.9)

Quando o valor de ∆E é pequeno, o potencial do máximo de corrente é próximo de E1/2.

Conforme aumenta a irreversibilidade do sistema, Ep afasta-se de E1/2, ao mesmo tempo

que aumenta a largura do pico e a sua altura diminui, obtendo-se assim menor

sensibilidade e resolução.[90,101]

A forma do pico apresentada por esta técnica resulta numa melhoria na separação

entre duas espécies com potenciais próximos. Na maioria das vezes podem-se medir

picos separados entre si por 50 mV. Este tipo de resolução dos processos não só

depende do potencial, mas também da largura do pico. A largura do pico a meia-altura

está relacionada com o número de electrões envolvidos (eq.10).

nFRTW 52,3

2/1 = (eq.10)

Quando o valor de n = 1, o valor de W1/2 é igual a 30,1 mV (25ºC). Esta equação é

válida no limite quando ∆E tende para zero. A selecção da amplitude de impulso e da

velocidade de varrimento são dois parâmetros que requerem uma análise criteriosa, pois

amplitudes de impulso grandes originam picos mais alargados, devido ao aumento do

valor de W1/2, não sendo viável o uso de valores de ∆E superiores a 100 mV para não

ocorrer perda de resolução dos picos e consequentemente perda de selectividade.[74,77]


23

Para além das inúmeras vantagens apresentadas por esta técnica salientam-se, o

baixo limite de detecção, cerca de 10-8 mol dm-3 e a resposta na análise com eléctrodos

sólidos, especialmente envolvendo compostos orgânicos. Estes compostos adsorvem

fortemente à superfície do eléctrodo, logo, através de uma técnica diferencial pode-se

ultrapassar este problema, já que a técnica descrimina os efeitos que são mais ou menos

constantes antes e depois da aplicação do impulso.[74-76]

Devido a estas características, a DPV será utilizada na análise e quantificação da

capacidade antioxidante de extractos metanólicos de cogumelos silvestres comestíveis,

enquanto que através da CV será efectuado o estudo qualitativo do perfil electroquímico

destes extractos.

Capítulo III – Execução experimental

24

Capítulo III

Execução experimental


25

Neste capítulo estão descritos os solventes e reagentes utilizados na realização

deste trabalho, bem como a instrumentação usada e as condições experimentais

aplicadas. Descreve-se ainda os procedimentos seguidos na preparação dos extractos

metanólicos e análise da capacidade antioxidante.

3.1 – Solventes e reagentes

Na execução experimental, utilizou-se como solventes, o MeOH (Fluka, p.a),

MeOH (Fisher Scientific, qualidade HPLC), n-hexano (Lab-Scan, 95% qualidade

HPLC), etanol (Panreac, p.a.). Na preparação dos tampões usou-se o acetato de sódio

penta-hidratado (Panreac, p.a.), ácido acético glacial (Panreac, p.a.), ácido clorídrico

(Panreac, 37% p.a.), hidrogenofosfato de sódio e diidrogenofosfato de sódio (Panreac,

p.a.) e ácido sulfúrico (Fluka, 96% p.a.).

Na avaliação da capacidade antioxidante usaram-se os padrões de ácido ascórbico

(Panreac, p.a.), ácido gálico (Sigma) e rutina (Sigma). Na avaliação de tocoferóis

utilizou-se o (±)α-tocoferol (Fluka, ≥ 97%), (+)δ-tocoferol (Sigma, 90%) e o β- e γ-

tocoferol (Matreya, > 97% ).

Como electrólito de suporte usou-se, para a avaliação da capacidade antioxidante,

o perclorato de sódio mono-hidratado (PS) (Fluka, puriss p.a.) e o perclorato de

tetrabutilamónio (TBAP) (Acrós Organics, 99%) na avaliação de tocoferóis em

extractos de cogumelos. Ambos foram acondicionados a 30ºC antes de cada utilização.

A água utilizada nos trabalhos de electroquímica foi de tipo I, obtida através de

um sistema de purificação Mili-Q (TGI Pure Water Systems, USA).


26

3.2 – Instrumentação

3.2.1 – Instrumentação geral

A desidratação dos cogumelos foi efectuada num liofilizador modelo Ly-8-FM-

ULE, Snijders.

Para obter o resíduo seco dos extractos de cogumelos recorreu-se a um evaporador

rotativo Büchi RE 111, com condensador Heto CBN 8-30.

3.2.2 – Electroquímica

As medições voltamétricas foram efectuadas num potenciostato/galvanostato

Autolab® PGSTAT 302 controlado por um computador com software GPES (General

Purpose for Electrochemical Systems) da Autolab®.

Os estudos foram realizados numa célula electroquímica com uma configuração

para três eléctrodos, Figura 3.1, constituída por um eléctrodo de referência de Ag/AgCl

saturado com KCl 3 mol dm-3 (Methrom), um eléctrodo de trabalho de carbono vítreo

ou de platina, com uma área de φ = 0.314 cm2 (Bioanalytical Systems) e uma folha de

platina como contra-eléctrodo.

Figura 3.1 – Montagem experimental.


27

3.3 – Procedimento

3.3.1 – Acondicionamento do eléctrodo

Antes de cada utilização, o eléctrodo de trabalho foi polido numa suspensão

aquosa de alumina (0,3 µm, Beuhler) sob um disco de lixa fina Master-Tex (Beuhler) e

lavado com água desionizada. Seguidamente, aplicando um tratamento químico, o

eléctrodo foi sonicado numa solução de HCl 6 mol dm-3 (1 minuto) e depois em MeOH

(1 minuto). Este procedimento de limpeza foi efectuado, sempre, antes de cada medição.

3.3.2 - Preparação dos extractos metanólicos

3.3.2.1 – Amostragem

A recolha dos cogumelos e a sua identificação taxonómica foi efectuada por

pessoal qualificado da Escola Superior Agrária de Bragança, de acordo com os

procedimentos descritos na literatura[78-83], depositando-se os exemplares no Herbário da

Escola Superior Agrária de Bragança.

Para este trabalho foram estudadas 12 espécies diferentes de cogumelos, Figura

3.2, colhidas em Bragança (nordeste de Portugal) no Outono de 2006, exceptuando o

Lactarius piperatus (L.) Pers. que foi colhido na Primavera de 2006. As amostras de

Agaricus arvensis Schaeffer, Agaricus romagnesii Wasser, Sarcodon imbricatus (L.) P.

Karst, Lactarius deliciosus (L.) Gray, foram colhidas em zonas de pinhos (Pinus sp.). O

Agaricus bisporus (Lange) Imbach foi obtido, comercialmente, num supermercado

local. Os Agaricus silvaticus Schaeff., Agaricus silvicola (Vittadini) Peck, Macrolepiota

procera (Scop.) Singer, Macrolepiota mastoidea (Fr.) Singer, Lactarius piperatus (L.)

Pers. foram colhidos em zonas de carvalhos (Quercus pyrenaica). O Leucopaxillus

giganteus (Sowerby) Singer e Coprinus comatus (O. F. Müll.:Fr.) Pers. foram colhidos

em lameiros. Após a identificação, os cogumelos foram desidratados num liofilizador

antes de se proceder ao passo de extracção.


28

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

(i) (j)

(k) (l)

Figura 3.2 – Cogumelos estudados neste trabalho: (a) Agaricus silvicola; (b) Agaricus silvaticus; (c) Agaricus romagnesii; (d) Agaricus bisporus; (e) Agaricus arvensis; (f) Coprinus comatus; (g) Leucopaxillus giganteus; (h) Lactarius deliciosus; (i) Lactarius piperatus; (j) Macrolepiota procera; (k) Sarcodom imbricatus; (l) Macrolepiota mastoidea.


29

3.3.2.2 – Extracção dos cogumelos

Para a extracção, triturou-se cerca de 3 g de cogumelo desidratado. As amostras

foram mantidas em agitação com 100 cm3 de metanol a 25 ºC, a 150 rpm, durante 24h,

filtrando-se no final por gravidade. Após este processo, guardou-se o filtrado no

frigorífico, a 4ºC, e extraiu-se novamente o resíduo com100 cm3 de MeOH adicionais.

O procedimento de extracção foi repetido três vezes.

Os extractos metanólicos foram depois combinados e evaporados, até à secura, a

40ºC, num evaporador rotativo. O resíduo foi redissolvidos em metanol até à

concentração de 100 mg/cm-3, guardando-se no escuro, a uma temperatura de 4ºC para

os estudos posteriores.

3.3.3 – Avaliação e quantificação da capacidade antioxidante

Nestes ensaios electroquímicos os extractos metanólicos e os padrões foram

analisados em soluções de MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4)/NaClO4

(70:28:2) e MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 7)/NaClO4 (70:28:2), 300 mmol

dm-3 (pH 4)/HCl 0,02 mol dm-3 (10:2) e tampão fosfato (pH 7)/ 65% 50 mmol dm-3

Na2HPO4/ 35% 50 mmol dm-3 NaH2PO4. As soluções dos extractos metanólicos foram

preparadas com concentrações entre 0,5 e 15 mg cm-3, enquanto que para os padrões a

concentração foi compreendida entre 0,002 e 0,2 mg cm-3.

O estudo das soluções foi realizado imediatamente após a sua preparação e

colocação do eléctrodo de trabalho, para minimizar os efeitos de adsorção à superfície

do eléctrodo. O estado da superfície do eléctrodo foi monitorizado, previamente,

efectuando-se análises voltamétricas com uma solução electrólito de suporte. Para cada

solução efectuaram-se três repetições.

A avaliação do comportamento electroquímico foi realizada por voltametria

cíclica, entre os 0 V e um máximo de 1,8 V, com uma velocidade de varrimento de 0,1

V s-1.

Para a avaliação e quantificação do poder antioxidante por voltametria de

impulso diferencial, DPV, os voltamogramas foram traçados de 0 V a um máximo de

1,8 V, com uma velocidade de varrimento de 0,03 V s-1, amplitude de modulação de

0,06 V e um salto de potencial de 0,006 V.


30

Para cada extracto, a concentração foi representada em função da densidade de

corrente e comparada com os padrões.

3.3.4– Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos

Os parâmetros experimentais da voltametria cíclica e da voltametria de impulso

diferencial foram idênticos aos aplicados na avaliação e quantificação dos antioxidantes

totais.

Para avaliar a presença de α, β, γ e δ-tocoferol, dissolveram-se os extractos numa

solução contendo 0,5 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3 em etanol, 3 cm3 de electrólito de

suporte (perclorato de tetrabutilamónio) 0,06 mol dm-3 em etanol e completando o

volume (25 cm3) com hexano, obtendo-se uma proporção de hexano/etanol de 4:6. A

concentração dos extractos foi de 10 mg cm-3.

Para traçar a recta de calibração usaram-se os padrões mencionados,

efectuando-se o procedimento descrito, num intervalo de concentrações de 0,001 a

0,02 mg cm-3. As soluções foram guardadas no congelador em vial’s escuros.

Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão

31

Capítulo IV

Resultados obtidos e discussão


32

Neste capítulo descrevem-se os estudos de optimização das condições

experimentais, a análise dos padrões e traçado das respectivas rectas de calibração, a

avaliação e quantificação da capacidade antioxidante e a análise de tocoferóis para os

extractos metanólicos de cogumelos silvestres comestíveis.

4.1 – Optimização das condições experimentais

Com o objectivo de identificar as condições experimentais mais adequadas à

análise electroquímica dos extractos de cogumelos, optimizaram-se vários parâmetros,

utilizando-se o padrão de ácido ascórbico e um extracto de cogumelo.

Os parâmetros avaliados foram: o eléctrodo de trabalho a usar, o tipo de solução

tampão e as condições electroquímicas.

4.1.1 – Eléctrodo de trabalho

Para avaliar qual o tipo de eléctrodo mais adequado foram efectuados ensaios com

o eléctrodo de platina e o de carbono vítreo. Na Figura 4.1 e 4.2 apresentam-se os

voltamogramas para o padrão e para o extracto de cogumelo.

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

-30

-20

-10

0

10

20

30

(a)(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0

10

20

30

40

50(b)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.1 – Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.


33

Como se pode observar pela Figura 4.1, quer para a voltametria cíclica como para

a voltametria de impulso diferencial, para o ácido ascórbico, obtém-se uma onda

anódica mais definida e de maior intensidade com o eléctrodo de carbono vítreo. Para o

extracto de cogumelo, verifica-se também que o eléctrodo de carbono é o mais

recomendável, já que para o de platina se obtém uma resposta muito baixa. A possível

desvantagem de utilização do eléctrodo de carbono vítreo está relacionada com a maior

tendência de adsorção de substâncias orgânicas na sua superfície[75] comparativamente

com o eléctrodo de platina. Por esta razão irá utilizar-se este eléctrodo nos estudos

seguintes, aplicando-se um procedimento de limpeza (acondicionamento) entre cada

medição.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80 (a)

(i)(ii)

j/µA

cm-2

E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

(b)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.2 – Voltamograma relativo a um extracto metanólico de Agaricus arvensis 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

4.1.2 – Solução tampão

Para avaliar o efeito da solução tampão, foram estudadas três soluções diferentes

utilizadas regularmente no estudo de compostos fenólicos:[58,65,70]

(i) - Tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2);

(ii) - MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2);

(iii) - Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/35% 50 mmol dm-3

NaH2PO4).


34

Na Figura 4.3 apresentam-se os voltamogramas relativos ao ácido ascórbico em

cada um dos tampões anteriores.

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40 (a)

(iii)(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0

10

20

30

40

50

(iii)

(ii)(i)

(b)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.3 – Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3). (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Todos os voltamogramas apresentam um processo de oxidação irreversível, no

intervalo de potencial analisado, verificando-se uma maior intensidade de onda para o

tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2). Em DPV, o

comportamento do ácido ascórbico nas diversas soluções tampão é variável,

verificando-se a existência de dois processos de oxidação nos tampões (i) e (iii),

enquanto para o tampão (ii) observa-se um onda de maior intensidade. Este fenómeno

poderá ser explicado pela coexistência do ácido ascórbico em duas formas ácido-base

em equilíbrio quando na presença da soluções (i) e (iii), o que dá origem a dois

processos de oxidação com potenciais distintos. Na Figura 4.4 apresentam-se os

resultados obtidos para um extracto de cogumelo nos diferentes tampões. Como se pode

observar, o voltamograma está mais definido para o tampão (ii). Com base nos

resultados obtidos decidiu utilizar-se a solução tampão MeOH /tampão acetato 0,1 mol

dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2).


35

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

2

4

6

8

10

12

14

16

18

(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.4 – Voltamograma obtido por DPV de uma solução do extracto de Leucopaxillus giganteus 1 mg cm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V, (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3).

4.1.3 – Condições electroquímicas

Para maximizar o sinal electroquímico avaliou-se o comportamento dos

voltamogramas cíclicos ao longo de vários ciclos de varrimentos consecutivos. Como se

observa na Figura 4.5, a intensidade da onda anódica vai diminuindo ao longo de cada

varrimento acabando quase por desaparecer nos últimos. Este resultado é consequência

da adsorção de compostos orgânicos que fazem parte das amostras, à superfície do

eléctrodo. Assim a análise incidirá no 1º varrimento de cada medição.

Na sequência do decréscimo acentuado na intensidade de corrente do

voltamograma, avaliou-se a necessidade de efectuar, previamente a cada análise, um

acondicionamento/limpeza da superfície do eléctrodo. A diminuição de intensidade

verificado na Figura 4.6, correspondente a dois ciclos de varrimentos independentes,

sem efectuar qualquer limpeza do eléctrodo, é comprovativa da alteração da superfície

por adsorção de compostos orgânicos, pelo que a reprodutibilidade do ensaio só é obtida

recorrendo a uma limpeza do eléctrodo de trabalho antes de cada ensaio. Estes

fenómenos de adsorção são mais significativos em voltametria cíclica devido à escala de

tempo associada a esta técnica. Assim a CV será utilizada apenas para uma análise

qualitativa do comportamento electroquímico dos compostos e dos extractos, enquanto

a informação quantitativa será recolhida pelas técnicas voltamétricas de impulso


36

diferencial. Nestas técnicas a intensidade de corrente é medida no início e no fim de

cada impulso, logo o efeito associado ao bloqueamento da superfície de eléctrodos pela

adsorção de compostos presentes na soluções vai ser reduzidos, já que estes efeitos são

mais ou menos constantes antes e depois da aplicação dos impulso.[75]

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8-10

0

10

20

30

40

50

60 (a)

5º4º3º2º

1º

j/µA

.cm

-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40

50(b)

5º4º3º2º

1º

j/µA

.cm

-2E/V

Figura 4.5 – Voltamogramas cíclicos consecutivos, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 Vs-1. (a) ácido ascórbico 1 mmol dm-3; (b) extracto de Agaricus arvensis a 10 mg cm-3.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-4

-2

0

2

4

6

8

10

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.6 – Voltamograma cíclico do extracto metanólico de Leucopaxillus giganteus 1mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s-1, (i) eléctrodo após acondicionamento/limpeza e (ii) eléctrodo sem acondicionamento/limpeza.

Para optimizar as condições dos ensaios por DPV foram testados dois parâmetros

experimentais, a amplitude do impulso e o impulso de potencial. Na Figura 4.7

apresenta-se um exemplo da variação provocada pela aplicação de diferentes amplitudes

de impulso. Observando os voltamogramas pode verificar-se, que a amplitude de

impulso que gera uma maior densidade de corrente é de 0,06V. Assim, as condições

experimentais mais adequadas para a análise quantitativa dos ensaios por DPV são:


37

velocidade de varrimento de 0,03 Vs-1, amplitude de modulação de 0,06 V e um salto de

potencial de 0,006 V.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

0

5

10

15

20

25

30

35

40

(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.7 – Voltamograma por DPV de uma solução de ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com uma amplitude de impulso de (i) 0,05 V, (ii) 0,06 V e de (iii) 0,07 V.

4.2 – Caracterização electroquímica por voltametria cíclica

Na avaliação do comportamento electroquímico dos antioxidantes por voltametria

cíclica, através do voltamograma pode obter-se um número variado de informações

sobre a capacidade antioxidante, resultantes das características estruturais dos

componentes antioxidantes da amostra, neste caso particular dos antioxidantes de baixo

peso molecular. A corrente anódica formada é função do potencial de oxidação de um

componente ou de uma mistura de componentes numa amostra. A forma do

voltamograma indica a tendência do composto ou amostra para doar electrões à volta do

potencial da onda anódica. A capacidade antioxidante da amostra resulta assim da

combinação destes dois parâmetros, o potencial biológico de oxidação e a densidade de

corrente. O valor do potencial biológico, Ep/2, reflecte o poder redutor específico de um

determinado composto (ou compostos com potenciais semelhantes). A densidade de

corrente anódica, j, reflecte a concentração das espécies na amostra. A integração

resulta num valor equivalente à capacidade antioxidante total da amostra, sem que seja

necessário a determinação da actividade antioxidante de cada componente da

amostra.[30,33]


38

4.2.1 – Comportamento electroquímico das substâncias padrão

Como foi referido anteriormente, a estrutura peculiar dos compostos antioxidantes

permite que seja possível a sua determinação voltamétrica: estes compostos têm em

comum um ou mais grupos hidroxilo ligados a um anel benzénico ou a uma estrutura

cíclica.

Neste trabalho escolheram-se como substâncias padrão os ácidos ascórbico, gálico

(ácido fenólico), e a rutina (flavonóide), Figura 4.8, pois representam as estruturas dos

compostos antioxidantes mais utilizados na literatura, como referência das propriedades

antioxidantes de extractos de plantas.[55,67,68]

OHO

HO

H

OH

CH2OH

O HO

HO

HO

COOH

(a) (b)

(c)

Figura 4.8 – Estrutura química do (a) ácido ascórbico, (b) ácido gálico e (c) rutina.

Figura 4.9 – Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 Vs-1. (a) ácido ascórbico 0,5 mmol dm-3; (b) ácido gálico 0,5 mmol dm-3.

HO

OH

O

O

O rutinose

OH

OH

0,0 0,2 0,4 0,6

0

10

20

30

40

50(a)

E/V

j/µA

cm-2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10

0

10

20

30

40

50 (b)

j/µA

cm-2

E/V


39

Os ácidos ascórbico e gálico apresentam ondas anódicas irreversíveis a

Ep/2=0,26 V e E(I)p/2=0,39 V, E(II)p/2=0,65 V respectivamente, Figura 4.9, como está

descrito na literatura.[49,56,68]

Em relação à rutina, este compostos apresenta duas ondas de oxidação,

irreversíveis a E(I)p/2= 0,38 V e E(II)p/2= 1,05 V e um onda de redução, de baixa

intensidade que poderá estar relacionada com a onda anódica a potencial menos

positivo, a Ep/2=0,133 V, Figura 4.10.[9,10]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-50-40-30-20-10

010203040506070

(ii)(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.10 – Voltamograma cíclico da rutina a 0,5 mmol dm-3, ν = 0,1V s-1, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), até (i) 0,6 V e (ii) 1,2 V.

A irreversibilidade da 1ª onda é, no entanto, dependente dos limites de potencial

aplicado, pois quando se efectua o voltamograma até 0,6 V, verifica-se, quando o

varrimento vai até aos 1,2 V, surge um segundo processo de anódico irreversível, que

condiciona a reversibilidade do primeiro processo.

4.2.2 – Extractos de cogumelos

Os diferentes extractos metanólicos de cogumelos silvestres comestíveis foram

analisados por voltametria cíclica em tampão a pH 4. Começa-se por fazer uma

avaliação global do comportamento electroquímico, dos extractos que apresentam um

comportamento mais electroactivo, isto é, que apresentam ondas de oxidação mais

intensas. O estudo electroquímico dentro de cada variedade será discutido

posteriormente.


40

Os voltamogramas cíclicos dos extractos, Figura 4.11, apresentam todos ondas

anódicas irreversíveis, à semelhança das soluções padrão de ácido ascórbico e ácido

gálico.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40

50

60 (a)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-10

0

10

20

30

40(b)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40 (c)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-20

0

20

40

60

80(d)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40(e)

j/µA

cm-2

E/V -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-10

0

10

20

30

40

50

60 (f)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.11 – Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus (fase III). O potencial anódico de meia onda dos extractos é, aproximadamente, 0,9 V,

sendo mais positivos que as soluções padrão. Os valores dos potenciais, Ep/2,

correspondentes aos extractos apresentam-se na Tabela 4.1. Os extractos de Sarcodon

imbricatus, Macrolepiota procera surgem como excepções, já que apresentam um

segundo pico a potenciais menos positivos. O Lactarius deliciosus apresenta, para além

do processo anódico a 0,9 V uma inflexão a um potencial mais positivo, 1,1 V. O


41

extracto de Leucopaxillus giganteus, apresenta também uma segunda onda a 0,4 V, mas

apenas para concentrações superiores a 5 mg cm-3, o que corresponderá a substâncias

que se encontram em menores concentrações.

Tabela 4.1 – Valores de Ep/2 para os diferentes extractos numa concentração de 5 mg cm-3.

Extractos Ep/2 / V

Agaricus silvaticus 0,90

Macrolepiota procera 0,61; 0,91

Sarcodom imbricatus 0,40; 0,89

Coprinus comatus 0,91

Leucopaxillus giganteus 0,87

Lactarius deliciosus 0,91; 1,1

A comparação entre os voltamogramas dos extractos e das soluções padrão

analisados permite excluir, exceptuando para o Sarcodon imbricatus, a presença destas

substâncias nos extractos de cogumelos, pelo menos em quantidades detectáveis pelo

método. Por outro lado, a presença em todos os extractos de uma onda anódica a 0,9 V

indica que a composição em compostos electroactivos deverá ser aproximadamente

igual nos vários extractos.

Como já foi referido, o valor de Ep/2 reflecte o poder redutor específico de um

componente (ou de um conjunto de componentes com potenciais semelhantes) pelo que,

através da voltametria cíclica pode obter-se o poder redutor total da amostra.[30] Por

observação da Tabela 4.1 verifica-se que o extracto com menor potencial de oxidação é

o Sarcodon imbricatus, já que apresenta uma onda a aproximadamente 0,4 V, logo

possui maior poder redutor. Comparando os extractos relativamente ao seu poder

redutor, podem ordenar-se da seguinte maneira: Sarcodon imbricatus >Macrolepiota

procera >Leucopaxillus giganteus >Agaricus silvaticus = Coprinus comatus =

Lactarius deliciosus. No entanto, para comparar o potencial redutor entre as várias

espécies com a presença de um processo electroquímico a potenciais mais baixos (~ 0,4

V) pode ser muito mais significativo que as ligeiras diferenças de potencial observadas.

Considerando a existência de uma relação entre o comportamento electroquímico e o

poder antioxidante, onde baixo potencial de oxidação corresponde a um elevado poder


42

antioxidante,[39] pode concluir-se que o extracto de S. imbricatus é o que apresenta

maior poder antioxidante.

Seguidamente descreve-se o comportamento electroquímico para as diversas

espécies dos géneros Agaricus, Macrolepiota e Lactarius.

4.2.2.1 – Agaricus

Dentro do género Agaricus estudaram-se cinco espécies distintas, silvaticus,

silvicola, bisporus, arvensis, romagnesii. Observando os voltamogramas obtidos para

cada espécie, Figura 4.12, podemos constatar que têm o mesmo perfil voltamétrico, com

uma onda anódica irreversível próxima de 0,9 V. No A. bisporus observa-se,

adicionalmente, uma inflexão de baixa intensidade a 0,6 V, que deverá corresponder a

compostos electroactivos, que se encontram nesta espécie em menores quantidades.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

(iii)

(v)(iv)

(iii)(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.12 – Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s-1: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. romagnesii; (v) A. arvensis. Na tabela 4.2 apresentam-se os potenciais de oxidação correspondentes a todos

os extractos. Como se pode verificar, o potencial é semelhante, exceptuando para o A.

arvensis e o A. silvicola, que apresentam um valor ligeiramente inferior. No entanto,

essa pequena variação não deverá ser significativa para distinguir o poder redutor entre

as espécies.


43

Tabela 4.2 – Valores de Ep/2 para os diferentes extractos de Agaricus com uma concentração de 10 mg cm-3.

Extractos Ep/2 / V

A. silvicola 0,90

A. silvaticus 0,91

A. bisporus 0,91

A. romagnesii 0,91

A. arvensis 0,89

Relativamente à densidade de corrente da onda anódica a 0,9 V, verifica-se que o

sinal mais intenso ocorre, a uma concentração de 10 mg cm-3, no extracto metanólico de

A. silvicola. Uma vez que apresentam um potencial de oxidação semelhante, pode

estabelecer-se uma correlação entre a densidade de corrente e a concentração de

espécies antioxidantes se considerarmos que as espécies químicas presentes nos

extractos deste género deverão apresentar uma estrutura semelhante e

consequentemente processos electroquímicos semelhantes. Assim, os diferentes

extractos podem ordenar-se da seguinte forma: A. silvicola >A. silvaticus >A. bisporus >

A. arvensis >A. romagnesii

4.2.2.2 – Macrolepiotas

Para o género Macrolepiota caracterizaram-se as espécies mastoidea e procera.

Estes dois cogumelos têm também em comum uma onda anódica irreversível à volta de

0,9 V, Figura 4.13. O voltamograma cíclico do M. procera possui ainda outro processo

anódico irreversível a 0,59 V, equivalente à inflexão observada anteriormente para o A.

bisporus. Em relação à intensidade das ondas, a espécie mastoidea apresenta uma maior

densidade de corrente, para uma mesma concentração de extracto. Para estas duas

espécies, e considerando que o M. procera apresenta também um processo anódico a

um potencial menos positivo, o poder redutor será mais acentuado nesta espécie.


44

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40

50

60

70

(ii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.13 – Voltamograma cíclico relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.

4.2.2.3 – Lactarius

Neste género, para além da avaliação de duas espécies diferentes de Lactarius

(deliciosus e piperatus), também se efectuou um estudo para o cogumelo em diferentes

fases de maturação: I (imaturo, chapéu fechado com um diâmetro < 4,5 cm); II (maduro,

com esporos imaturos, chapéu aberto com um diâmetro entre 4,5 e 7 cm); III (maduro,

com esporos maduros, chapéu aberto com um diâmetro > 7 cm). Esta última fase

corresponde à fase habitual de consumo do cogumelo.

Figura 4.14 – Voltamograma cíclico para os extractos de (i) L. deliciosus, fase III e (ii) L. piperatus, fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V


45

Comprando os voltamogramas para os extractos de cogumelos de L. deliciosus e

L. piperatus na fase III, observam-se ondas anódicas irreversíveis, Figura 4.14, com

pouca intensidade, isto é, baixa densidade de corrente, logo fraca capacidade

antioxidante. O L. deliciosus apresenta duas ondas anódicas E(I)p/2=0,92 V, E(II)p/2=1,1

V, enquanto que o L. piperatus só apresenta um a Epa=0,92V, Tabela 4.3.

Tabela 4.3 – Valores de Ep/2 para os Lactarius em diferentes fases de maturação, com uma concentração de 10 mg cm-3.

Extractos Fases de

maturação Ep/2 / V

L. deliciosus I 0,93; 1,1

II 0,94; 1,2

III 0,92; 1,1

L. piperatus I -

II -

III 0,92

O L. deliciosus, no estudo das diferentes fases de maturação, apresenta um perfil

voltamétrico bastante idêntico, com pequenas oscilações nos potenciais, pouco

significativas, Tabela 4.3. Por observação do voltamograma, Figura 4.15, a fase I

apresenta menor densidade de corrente, o que limitará a sua capacidade antioxidante.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.15 – Voltamograma cíclico para os extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.


46

Para o L. piperatus não se consegue identificar processos de oxidação para as

fases I e II, apresentando apenas uma onda anódica pouco intensa a 0,92 V na fase III de

maturação.

4.2.3 – Estudo a pH 7

Como foi mencionado no capítulo 1, o comportamento dos compostos fenólicos e

dos flavonóides é dependente do pH. Assim, para avaliar a presença destes compostos

nos extractos dos cogumelos, efectuou-se também o estudo utilizando um tampão a pH

7. Escolheram-se como soluções padrão, um flavonóide (rutina), e um ácido fenólico

(ácido gálico). Na Figura 4.16 apresentam-se os voltamogramas para estas soluções

padrão, a pH 7 e 4.

Para ambas as substâncias padrão, a pH 7, há uma descida do potencial das ondas

anódicas. No caso do ácido gálico, as duas ondas anódicas apresentam uma densidade

de corrente mais baixa para pH 7, sendo o potencial de E(I)p/2= 0,35 e E(II)p/2= 0,58 V.

A rutina apresenta comportamento semelhante, com a excepção do segunda onda de

oxidação que decresce de intensidade a pH 7, Figura 4.16. Os potenciais das ondas, para

a rutina são de E(I)p/2=0,24 e E(II)p/2=0,91 V.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10

0

10

20

30

40

50(a)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80 (b)

(ii)(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.16 – Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1mol dm-3 /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido gálico, 1 mmol dm-3; (b) rutina, 0,5 mmol dm-3.

A análise comparativa dos voltamogramas dos extractos de cogumelos a pH 7 e a

pH 4, apresenta no geral, uma descida no potencial dos ondas, Figura 4.17. Para o

Agaricus silvaticus, a onda anódica apresenta uma maior área e intensidade a pH 7. Este


47

comportamento é semelhante para todas as espécies deste género. Também para o

Leucopaxillus giganteus, Coprinus comatus e para o Lactarius deliciosus existe um

aumento de intensidade da onda.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40

50

60 (a)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40 (b)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40(c)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-20

0

20

40

60

80

100

120 (d)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

40(e)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-10

0

10

20

30

40

50

60 (f)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.17 – Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em (i) tampão pH 7 e (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. Para o Sarcodon imbricatus, a pH 7, observa-se o aparecimento de um terceiro

processo de oxidação, Tabela 4.4, o qual poderá estar relacionado com compostos em

cuja oxidação é mais extensa a este pH, como os flavonóides. No Lactarius deliciosus, a

2ª onda a 1,1 V não é perceptível para estas condições experimentais, tendo esta onda,

muito provavelmente, origem em ácidos fenólicos.


48

Tabela 4.4 – Valores de Ep/2 para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3.

4.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por voltametria de impulso

diferencial

Após a caracterização por voltametria cíclica, efectuou-se o estudo, para as

substâncias padrão e para os diferentes extractos, por voltametria de impulso

diferencial. Nesta técnica os picos surgem mais definidos, ultrapassando assim o

problema de encontrar uma linha de base correcta. A maior definição dos processos

electroactivos, por DPV, resulta das características desta técnica voltamétrica que

permite minimizar o efeito da adsorção das espécies orgânicas à superfície do eléctrodo

através do uso de impulsos, embora o sinal de oxidação diminua, ligeiramente, entre

duas análises consecutivas.[48,75]

4.3.1 – Substâncias padrão

Em voltametria de impulso diferencial, o comportamento das três substâncias

padrão utilizadas é semelhante ao da voltametria cíclica, Figura 4.18.

Extractos Ep/2 / V


Macrolepiota procera 0,50; 0,88

Sarcodon imbricatus 0,25; 0,56; 0,87


Leucopaxillus

giganteus 0,87

L. deliciosus 0,85


49

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,60

5

10

15

20

25 (a)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0

5

10

15

20

25

30

35 (b)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

20

40

60

80

100

120 (c)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.18 – DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. (a) ácido ascórbico; (b) ácido gálico; (c) rutina.

O ácido ascórbico apresenta uma onda de oxidação a 0,18 V, enquanto que o ácido

gálico e a rutina apresentam duas ondas de oxidação a E(I) = 0,34 V e E(II) = 0,61 V e

E(I)= 0,21 V E(II)= 0,86 V respectivamente.

4.3.2 – Estudo do efeito da concentração da amostra

Na secção 4.1.3 verificou-se que nas condições experimentais aplicadas ocorrem

importantes fenómenos de adsorção de espécies na superfície do eléctrodo, pelo que

decidiu-se, antes de avaliar de uma forma quantitativa a capacidade antioxidante dos

extractos, estudar o efeito da concentração da amostra na superfície do eléctrodo. Para

isso, efectuou-se a análise a várias concentrações de extracto de Agaricus silvaticus,

num intervalo de 0,1 a 15 mg cm-3. A partir dos resultados obtidos avaliou-se o

comportamento da densidade de corrente em função da concentração de extracto

metanólico, para o processo de oxidação comum a 0,9 V. Como pode observar-se,


50

Figura 4.19, a densidade de corrente aumenta com a concentração, verificou-se que no

intervalo entre 0,1 a 1 mg cm-3 o aumento é mais acentuado.

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

2

4

6

8

10

12

14

j/µA

cm-2

c/mgcm-3

Figura 4.19 – Representação gráfica da densidade de corrente em função da concentração de extracto de Agaricus silvaticus, para um Ep=0,9 V. A voltametria de impulso diferencial foi realizada com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

4.3.3 – Extractos de cogumelos

Tal como se pode observar no estudo por CV, todos os extractos apresentam um

pico de oxidação a aproximadamente 0,9 V. O extracto metanólico de Sarcodon

imbricatus apresenta um processo de oxidação a potenciais mais baixos, perto de 0,4 V,

enquanto que o de Leucopaxillus giganteus apresenta dois processos, a 0,4 V e a 0,6 V

aproximadamente. O Lactarius deliciosus é o único cogumelo que apresenta um pico de

oxidação a valores mais positivos superiores a 0,9 V.

Com base na análise dos voltamogramas, Figura 4.20, e dos potenciais de

oxidação, Tabela 4.5, podem identificar-se três zonas de potencial comuns a quase todos

os extractos: a 0,4 V, 0,6 V e a 0,9 V; alguns destes processos de oxidação apresentam

uma densidade de corrente muito baixa, surgindo como pequenas inflexões.


51

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25 (a)j/µ

Acm

-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20 (b)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20 (c)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

30

35 (d)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

5

10

15

20

25 (e)

j/µA

cm-2

E/V-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

5

10

15

20

25

30 (f)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.20 – DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.

Para a densidade de corrente de pico anódico comum, a 0,9 V, o extracto que

apresenta um valor mais elevado é o de Agaricus silvaticus, seguindo-se o Coprinus

comatus <Macrolepiota procera <Sarcodon imbricatus <Leucopaxillus giganteus

<Lactarius deliciosus. Logo o Agaricus silvaticus é o que possui maior quantidade de

compostos electroactivos.


52

Tabela 4.5 – Valores de Ep para os diferentes extractos com uma concentração de 5 mg cm-3.

Extractos Ep/V


Macrolepiota procera 0,88

Sarcodon imbricatus 0,36; 0,86


Leucopaxillus

giganteus 0,40; 0,58; 0,86


4.3.3.1 – Agaricus

Como pode observar-se na Figura 4.21, os extractos de Agaricus reflectem os

resultados observados em voltametria cíclica, apresentando um pico comum a 0,9V,

exceptuando o A. bisporus que tem também uma ligeira inflexão a 0,6 V.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

30

(iii)

(v)(iv)(iii)(ii)(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.21 – DPV dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. arvensis; (v) A. romagnesii.

Considerando que uma maior intensidade de pico corresponde a uma maior

quantidade de compostos antioxidantes presentes no extracto, pode inferir-se que o


53

cogumelo com maior capacidade antioxidante é o A. silvicola seguido de A. silvaticus

<A. bisporus <A. arvensis <A. romagnesii.

4.3.3.2 – Macrolepiotas

As duas espécies de Macrolepiota apresentam nos voltamogramas, Figura 4.22,

um processo anódico a 0,88 e a 0,89 V para o mastoidea e procera, respectivamente,

sendo que este último apresenta outro processo de oxidação menos intenso a 0,53 V, tal

como se observava para a voltametria cíclica. O M. mastoidea apresenta uma maior

densidade de corrente em relação ao M. procera, o que corresponde a uma maior

quantidade de substâncias antioxidantes.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

30

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.22 – DPV relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. 4.3.3.3 – Lactarius

Comparando o L. deliciosus com o L. piperatus, na fase III de maturação, Figura

4.23, para uma mesma concentração, o primeiro apresenta dois picos a 0,89 V e a 1,1 V,

enquanto que o segundo só apresenta um pico a 0,88 V, Tabela 4.6. Esta diferença pode

ser utilizada para distinguir estas duas espécies, dentro do mesmo género.

No geral, os picos de oxidação correspondentes ao extracto de L. deliciosus são

mais intensas em relação ao outro extracto, pelo que este cogumelo possui maior

concentração em compostos electroactivos que o L. piperatus, embora este possua um

potencial menos positivo.


54

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

30

35

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.23 – DPV relativo aos extractos de (i) Lactarius deliciosus e (ii) Lactarius piperatus, na fase de maturação III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. Tabela 4.6 – Valores de Ep para os extractos de Lactarius nas diferentes fases de maturação, com uma concentração de 10 mg cm-3.

Extractos Fases de

maturação Ep/V

L. deliciosus I 0,88; 1,1

II 0,91; 1,2

III 0,89; 1,1

L. piperatus I 0,87

II 0,89

III 0,88

No estudo das fases de maturação do L. deliciosus por DPV, observam-se dois

picos de oxidação para as três fases, Figura 4.24, sendo que o 1º processo de oxidação é

mais intenso para a fase II, enquanto o segundo processo de oxidação é mais intenso na

fase III de maturação. Pode assim concluir-se que os compostos relacionados com o

segundo processo formam-se numa etapa final do crescimento do cogumelo.


55

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

5

10

15

20

25

30

35 (iii)

(ii)(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4. 24 – DPV relativo aos extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Ao contrário do que se verificou por CV, no L. piperatus detectou-se um processo

de oxidação a aproximadamente 0,9 V para as três fases, Figura 4.25, o que demonstra a

maior sensibilidade desta técnica em relação à voltametria cíclica. O extracto na fase III

apresenta uma maior densidade de corrente, no entanto as diferenças podem não ser

significativas.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

0

10

20

30

(iii)(ii) (i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.25 – DPV relativo aos extractos Lactarius piperatus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.


56

4.3.4 – Estudo a pH 7

As substâncias padrão ácido gálico e rutina, a pH 7, apresentam o mesmo

comportamento descrito anteriormente, a pH 4. Os potenciais de oxidação tornam-se

menos positivos e os picos menos intensos. No caso da rutina, o segundo processo,

próximo de 1,1 V, é bastante menos intenso e definido quando se efectua a análise a pH

7. Estes resultados não estão de acordo com o descrito na literatura,[55] pois o flavonóide

apresenta um voltamograma mais intenso a pH 4, idêntico ao comportamento do ácido

fenólico.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

15

30

45

60

75

90

105 (a)

(ii)

(i)

j/µAc

m-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

20

40

60

80

100

120 (b)(ii)

(i)j/µ

A.c

m-2

E/V

Figura 4.26 – DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4. (a) ácido gálico; (b) rutina. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

O extracto de Agaricus silvaticus, Coprinus comatus, Lactarius deliciosus

apresentam um perfil semelhante ao encontrado a pH 4, Figura 4.27, no entanto para o

Macrolepiota procera, surgem, para além do pico comum a 0,84 V, mais dois picos de

oxidação a 0,24 V, a 0,45 V. O mesmo se verifica para o Sarcodon imbricatus com três

picos de oxidação a 0,22 V, 0,53 V e a 0,85 V, Tabela 4.7.

Apesar de não se ter verificado um aumento de intensidade do pico a pH 7 para o

flavonóide estudado, a variabilidade observada nos processos de oxidação dos extractos

de cogumelos deverá estar relacionada com a presença de ácidos fenólicos e

flavonóides, como foi referido anteriormente.


57

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

30(a)

(ii)

(i)j/µ

Acm

-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

02468

10121416182022 (b)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

5

10

15

20(c)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

05

10152025303540455055 (d)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25 (e)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0

5

10

15

20

25

30 (f)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.27 – DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em tampão (i) pH 7 e (ii) pH 4: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Tabela 4.7 – Valores de Ep para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3.

Extractos Ep/V


Macrolepiota procera 0,24; 0,45; 0,84

Sarcodon imbricatus 0,22; 0,53; 0,85


Leucopaxillus

giganteus 0,43; 0,84



58

4.4 – Quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos dos

cogumelos

A quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos foi efectuada

através da voltametria de impulso diferencial, utilizando rectas de calibração de ácido

ascórbico e ácido gálico. Estas duas substâncias padrão foram escolhidas por serem

frequentemente descritas na literatura como termo de comparação, especialmente em

métodos espectroscópicos de análise de antioxidantes em amostras biológicas.[30,55,67,68]

Na Figura 4.28 está representado o voltamograma do ácido gálico a várias

concentrações. Pode constatar-se que com o aumento da concentração do composto, há

um aumento da densidade de corrente.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0

10

20

30

40

50

60

(v)

(iv)

(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.28 – DPV para o ácido gálico em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), a várias concentrações: (i) 0,20 mg cm-3; (ii) 0,15 mg cm-3; (iii) 0,1 mg cm-3; (iv) 0,05 mg cm-3; (v) 0,02 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V. Este comportamento também se verifica para o ácido ascórbico e para os

diferentes extractos, Figura 4.29, embora os declives das rectas da densidade de corrente

em função da concentração de extractos sejam diferentes, Figura 4.31.


59

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

10

20

(v)(iv)(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.29 – DPV do extracto S. imbricatus em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2) a várias concentrações: (i) 15 mg cm-3; (ii) 10 mg cm-3; (iii) 5 mg cm-3; (iv) 1 mg cm-3; (v) 0,5 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V. Na voltametria de impulso diferencial, a densidade de corrente, além de variar

com a concentração, depende também da cinética de transferência electrónica e do

coeficiente de difusão das diferentes espécies electroactivas.[75] Por este facto, não se

podem comparar directamente os voltamogramas dos extractos com as substâncias

padrão, pois estes parâmetros são diferentes para espécies distintas. Adicionalmente, as

substâncias padrão não foram detectadas nos extractos metanólicos, pelo menos a uma

concentração mensurável. A relação entre a densidade de corrente e a concentração para

os extractos será distinta para o ácido ascórbico ou ácido gálico. Na Figura 4.30 pode

observar-se a representação gráfica da variação da densidade de corrente em função da

concentração. Os valores dos respectivos declives das restas encontram-se resumidos na

Tabela 4.8.

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16

0

5

10

15

20

25

30 (a)

j/µA

cm-2

c/mgcm-3

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

0

10

20

30

40

50

(b)

j/µA

cm-2

c/mgcm-3

Figura 4.30 – Variação da densidade de corrente em função da concentração, de 0,002 a 0,2 mg cm-3 obtida por DPV para o ácido ascórbico (a) e ácido gálico (b). ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.


60

A diferença entre os declives dos padrões e os dos extractos reflecte, numa

primeira aproximação, a diferença entre os coeficientes de difusão das espécies

envolvidas e/ou parâmetros cinéticos dos respectivos processos electroquímicos.

A comparação dos declives para os diferentes extractos, Tabela 4.8, mostra que

existem diferenças, que não podem ser explicadas unicamente com base nos

coeficientes de difusão e parâmetros cinéticos. As diferentes espécies de cogumelos

silvestres comestíveis, vão ser semelhantes, apresentam um perfil voltamétrico muito

similar, indicando uma composição electroactiva semelhante (espécies pertencentes a

famílias de compostos fenólicos quimicamente semelhantes) e por conseguinte os

parâmetros cinéticos deverão não ser muito diferentes. Assim, a diferença poderá residir

na quantidade de massa electroactiva efectiva na composição dos extractos de

cogumelos. Pode assim concluir-se, através dos valores dos declives das rectas dos

extractos obtidos para o pico de oxidação em comum, Tabela 4.8, que a quantidade de

espécies electroactivas, é maior para os extractos de A. silvaticus, A. silvicola, A.

bisporus, sendo quase nula para o L. deliciosus.

0 2 4 6 8 10 12 14 160

2

4

6

8

10

12

14

(e)(b)

(a)

(d)

(c)

j / µ

Acm

-2

c/mgcm-3

0 2 4 6 8 10 12 14 160

1

2

3

4

5

6

7

(l)

(k)

(j)

(i)

(h)(g)

(f)

j/µA

cm-2

c/mgcm-3

Figura 4.31 – Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos, por voltametria de impulso diferencial. (a) A. silvicola, (b) A. bisporus, (c) A. silvaticus, (d) A. arvensis, (e) A. romagnesii, (f) C. comatus, (g) M. mastoidea, (h) M. procera, (i) S. imbricatus, (j) L. giganteus, (k) L. deliciosus, (l) L. piperatus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.


61

Tabela 4.8 – Resultados obtidos para os diferentes extractos por voltametria de impulso diferencial.

Extractos Declive

µAcm2mgcm-1

C. A. (AA)

mg/g

C. A. (AG)

mg/g

A. silvaticus 0,85 3,9 3,1

A. silvicola 0,85 2,9 2,2

A. bisporus 0,79 2,8 2,1

A. romagnesii 0,50 2,0 1,4

A. arvensis 0,55 2,2 1,7

M. procera 0,53 1,7 1,2

M. mastoidea 0,37 2,3 1,7

S. imbricatus 0,33 1,2 0,8

C. comatus 0,49 2,7 2,1

L. giganteus 0,21 1,0 0,6

L. deliciosus 0,04 1,0 0,6

L. piperatus 0,12 0,5 0,2

Ác. Ascórbico 204,75 1000 616

Ác. Gálico 245,84 1302 1000 C.A. (AA) – Capacidade antioxidante em termos de equivalentes de ácido ascórbico; C.A. (AG) – Capacidade antioxidante em termos de equivalentes de ácido gálico

Para expressar o poder antioxidante, calculou-se os equivalentes de cada espécie

em relação aos padrões, para uma determinada concentração. É de referir, que existem

desvios significativos à linearidade, para baixas e altas concentrações de extractos,

devido a fenómenos de adsorção e saturação na superfície do eléctrodo. Na Tabela 4.8

encontram-se os valores da capacidade antioxidantes (C. A.) em termos de equivalentes

de ácido ascórbico (AA) e ácido gálico (AG). A análise dos valores C.A. na Tabela 4.8

sugere que os extractos de A. silvaticus, A. silvicola, A. bisporus, Coprinus comatus,

tendo uma capacidade antioxidante maior, são os que apresentam um valor mais

elevado.


62

4.5 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos

Individualmente os tocoferóis têm um papel importante no combate aos processos

de oxidação, pelo que se investigou a sua existência, nos extractos de cogumelos

silvestres comestíveis, através das técnicas voltamétricas utilizadas.

4.5.1 – Substâncias padrão

Os padrões analisados foram o α-, β-, γ- e δ-tocoferol, Figura 4.32.

O

HO

Tocol

12

345

6

78

α-tocoferol = 5, 7, 8-trimetiltocol

β-tocoferol = 5, 8-trimetiltocol

γ-tocoferol = 7, 8-trimetiltocol

δ-tocoferol = 8-metiltocol

Figura 4.32 – Estruturas químicas dos diferentes tocoferóis.

O voltamograma cíclico de uma solução contendo as quatro substâncias padrão,

Figura 4.33, revelou a existência de 3 ondas de oxidação irreversíveis. Para o β- e γ-

tocoferol ocorrem a um potencial idêntico, de acordo com o descrito na literatura.[69] A

primeira onda de oxidação surge a 0,60 V e corresponde ao α-tocoferol, a segunda a

0,70 V corresponde ao β- e γ-tocoferol e a terceira a 0,77 V é resultante do δ-tocoferol.

O α-tocoferol apresenta um potencial menos positivo, logo um maior poder redutor[30], o

que confirma o facto de ser um antioxidante mais activo.[69]


63

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14δ

β + γ

α

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.33 – Voltamograma cíclico dos padrões numa solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3), com concentração de 0,01 mg cm-3. ν = 0,1V s-1.

Na Figura 4.34 apresenta-se o voltamograma obtido por DPV. O perfil

voltamétrico é semelhante ao verificado na voltametria cíclica, mostrando três picos de

oxidação, em que a segunda é devida aos processos de oxidação do conjunto β- e γ-

tocoferol. A densidade de corrente dos processos anódicos varia linearmente com a

concentração das substâncias padrão, Figura 4.3.5, permitindo assim efectuar estudos

quantitativos.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,02

4

6

8

10

12

14

16

18

(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.34 – DPV para diferentes concentrações de padrões, solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3) . (i) 0,02 mg cm-3 (ii) 0,01 mg cm-3 (iii) 0,004 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.


64

Como se pode ver na Figura 4.35, para os 4 padrões a linearidade apresenta uma

correlação bastante aceitável, >0,999, num intervalo de concentrações de 0,001 a

0,02 mg cm-3.

0 10 20 30 40 50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

(iii)

(ii)

(i)

j/µA

cm-2

c/mgcm-3

Figura 4.35 – Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos para os padrões. (i) α-tocoferol; (ii) β- e γ-tocoferol; (iii) δ-tocoferol.

4.5.2 – Extractos de cogumelos O estudo da presença de tocoferóis nos extractos de cogumelos foi efectuado nas

cinco espécies do género Agaricus, Figura 4.36.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

2

4

6

8

10

12

14

16

18 (a)

j/µA

cm-2

E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20(b)

j/µA

cm-2

E/V


65

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

2

4

6

8

10

12

14

16 (c)

j/µA

cm-2

E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18 (d)

j/µA

cm-2

E/V

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20 (e)

j/µA

cm-2

E/V

Figura 4.36 – DPV dos diferentes extractos de Agaricus, com uma concentração de 10 mg cm-3, numa solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3), s. (a) A. silvicola; (b) A. silvaticus; (c) A. romagnesii; (d) A. arvensis; (e) A. bisporus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

A análise de voltamogramas dos extractos mostra que apenas o α-tocoferol

poderia estar presente nos extractos que apresentam um processo de oxidação próximo

de 0,6 V. No entanto, através da adição de uma aliquota de solução padrão de α-

tocoferol ao extracto, verificou-se que não há coincidência do potencial dos picos, pelo

que se conclui que os extractos estudados não apresentam tocoferóis, pelo menos em

quantidades detectáveis.

Capítulo V – Conclusões e perspectivas futuras

66

Capítulo V

Conclusões e Perspectivas Futuras


67

Neste capítulo, resumem-se as conclusões deste trabalho e abordam-se

perspectivas de trabalho futuro.

5.1 – Conclusões

Através deste trabalho pretendeu-se explorar a voltametria cíclica e a voltametria

de impulso diferencial na caracterização das potencialidades antioxidantes de

cogumelos. Foi avaliada e quantificada a capacidade antioxidante de doze cogumelos

silvestres comestíveis provenientes da região de Trás-os-Montes, por voltametria cíclica

e voltametria de impulso diferencial.

Pelos estudos de voltametria cíclica, demonstrou-se que a electroactividade dos

extractos metanólicos de cogumelos é limitada, apresentando apenas ondas de

oxidações irreversíveis. No geral, os extractos evidenciam três regiões de actividade

electroquímica com processos anódicos irreversíveis, a 0,4 V, a 0,6 V e a 0,9V. A onda

a 0,9 V é a mais intensa e comum a todos, indicando uma composição em compostos

electroactivos semelhante. As ondas a 0,4 V e 0,6 V aparecem apenas em alguns

cogumelos e são indicativas de um poder redutor maior.

Através dos valores de Ep/2, o Sarcodon imbricatus é o que apresenta o menor

potencial de oxidação e assim maior poder redutor. Ordenando os extractos

relativamente ao seu poder redutor verifica-se que: Sarcodon imbricatus> Macrolepiota

procera> Leucopaxillus giganteus> Agaricus silvaticus = Coprinus comatus =

Lactarius deliciosus.

Os resultados para a voltametria de impulso diferencial corroboram os resultados

obtidos por voltametria cíclica, obtendo-se, no entanto, uma maior definição nos picos

de oxidação, já que esta técnica possui uma maior sensibilidade.

Dentro do género Agaricus, o maior poder redutor é encontrado no Agaricus

arvensis. No que diz respeito aos Macrolepiota, o procera é o que tem maior poder

redutor, enquanto que o mastoidea tem maior quantidade de substâncias electroactivas

(maior densidade de corrente). Para os Lactarius analisaram-se duas espécies em

diferentes fases de maturação. As duas espécies, deliciosus e piperatus, apresentam na

fase III, um perfil muito semelhante, com um pico comum irreversível, a 0,9 V,

apresentando o deliciosus um pico adicional a um potencial superior. Para o Lactarius

deliciosus, o perfil é idêntico nas três fases, sendo que a fase I apresenta menor


68

quantidade de espécies electroactivas. Para o piperatus, a intensidade dos processos

anódicos é praticamente indetectável nas fases iniciais de maturação, pelo que em CV

apenas se detecta electroactividade na fase final.

O estudo do efeito do pH [varia de pH de 4 para 7 (pH fisiológico)], feito na

tentativa de distinguir entre ácidos fenólicos e flavonóides, mostrou no geral, um efeito

da descida dos potenciais de oxidação. Para espécies como o Agaricus silvaticus,

Leucopaxillus giganteus, Coprinus comatus e Lactarius deliciosus houve um aumento

da densidade de corrente de pico. No caso do Sarcodon imbricatus, Macrolepiota

procera e Leucopaxillus giganteus houve o surgimento de novas ondas a potenciais

menos positivos, indicando a presença de flavonóides.

Em termos quantitativos, a análise foi obtida considerando o nº de equivalentes

de ácido gálico e ácido ascórbico, podendo afirmar-se que os extractos de A. silvaticus,

A. silvicola, A. bisporus, Coprinus comatus são os que apresentam um maior valor,

seguindo-se o Macrolepiota mastoidea ~ Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii>

Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus ~ Lactarius

deliciosus> Lactarius piperatus. Como se pode verificar ao longo deste estudo, o poder

redutor não coincide com a capacidade antioxidante, isto é, extractos que apresentam

um maior poder redutor, não apresentam uma maior capacidade antioxidante, como é o

caso do Sarcodon imbricatus. O poder redutor reflecte as características estruturais das

espécies químicas presentes nos extractos, enquanto que a capacidade antioxidante é o

resultado da quantidade de compostos electroactivos.

É de notar que não é possível comparar directamente os extractos com as

substâncias padrão, já que na DPV e CV, a densidade de corrente depende da

concentração, da cinética de transferência electrónica e coeficiente de difusão das

diferentes espécies electroactivas. Por esta razão, a diferença observada entre os

declives, resultantes da representação gráfica da variação da densidade de corrente em

função da concentração, para os diferentes extractos não pode ser explicada com base

nos coeficientes de difusão e parâmetros cinéticos. Apesar das espécies apresentarem

um perfil voltamétrico semelhante, que sugere uma composição química semelhante, e

parâmetros cinéticos aproximados, apresentam diferenças nos declives, que poderão

estar relacionadas com a quantidade de massa electroactiva efectiva na composição dos

extractos de cogumelos. Nesta perspectiva e tendo em conta o pico a 0,9 V que é

comum a todas as espécies, a quantidade de espécies electroactivas é maior para os


69

extractos de A. silvaticus, A. silvicola, A. bisporus, sendo quase nula para o L.

deliciosus.

Em relação à avaliação de tocoferóis nos extractos, não se conseguiram observar

processos de oxidação tanto em CV como em DPV, esta última técnica com um limite

de detecção de cerca de 10-8 mol dm-3,[75] querendo isto dizer que se existem, estes

compostos estão em quantidades não detectáveis pelo método.

5.2 - Perspectivas Futuras O futuro desenvolvimento deste trabalho, poderá passar pela optimização de

outras condições experimentais na tentativa de melhorar o perfil voltamétrico e

pesquisar outros processos de oxidação e diminuir os efeitos de matriz verificados. Para

isso vão-se estudar os efeitos da aplicação de outros métodos de extracção destes

compostos a partir dos cogumelos (como a extracção líquido-líquido) e melhorar a

análise através de um processo de pré concentração da amostra, utilizando colunas de

extracção em fase sólida, após o passo de extracção. Também para melhorar a análise e

após o passo de extracção, poderá avaliar-se o efeito da pré-concentração da amostra.

Considerando que a utilização das técnicas electroquímicas na caracterização e

quantificação dos compostos antioxidantes ainda está no início, será vantajoso efectuar

a comparação dos resultados electroquímicos com outras técnicas, como por exemplo,

espectrofotométricas e cromatográficas.

Para este trabalho em particular, os principais compostos antioxidantes dos

cogumelos serão identificados por LC-MS, comparando-se posteriormente a sua

actividade electroquímica com os compostos que dão origem aos processos de oxidação

observados.

Podem complementar-se os resultados obtidos recorrendo a outras técnicas

electroquímicas, como a voltametria de onda quadrada, ou com outras técnicas como

ESR ou RMN, para estudos de natureza estrutural.

Bibliografia

70

Bibliografia

Bibliografia

71

[1] – Trabulsi Microbiologia, Atheneu, 2a. Edição, São Paulo, 1991.

[2] – Martins, F. X. Cogumelos, João Azevedo Editor, Mirandela, 2004.

[3] – Kalac, P.; Svoboda, L. Food Chem. 2000, 69, 273.

[4] – Barros, L.; Baptista, P.; Estevinho, L. M.; Ferreira, I. C. F. R. Food Chem. 2007,

105, 179.

[5] – Mattilda, P.; Suonpää, K.; Piironen, V. Nutrition 2000, 16, 694.

[6] – Mattilda, P.; Könkö, K.; Eurola, M.; Pihlava, J.-M.; Astola, J.; Vahteristo, L.;

Hietaniemi, V.; Kumpulainen, J.; Valtonen, M.; Piironen, V. J. Agric. Food Chem.

2001, 49, 2343.

[7] – Manzi, P.; Gambelli, L.; Marconi, S.; Vivanti, V.; Pizzoferrato, L. Food Chem.

1999, 65, 477.

[8] – Manzi, P.; Marconi, S.; Aguzzi, A.; Pizzoferrato, L. Food Chem. 2004, 84, 201. [9] – Valentão, P.; Lopes, G.; Valente, M.; Barbosa, P.; Andrade, P. B.; Silva, B. M.;

Baptista, P.; Seabra, R. M. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 3626.

[10] – Mdachi, S. J. M.; Nkunya, M. H. H.; Nyigo, V. A.; Urasa, I. T. Food Chem.

2004, 86, 179.

[11] – Mattilda, P.; Salo-Väänänen, P.; Könkö, K.; Aro, H.; Jalava, T. J. Agric. Food

Chem. 2002, 50, 6419.

[12] – Barros, L., Baptista, P.; Correia, D. M.; Casal, S.; Oliveira, B.; Ferreira, I. C. F.

R. Food Chem. 2007, 105, 140.

[13] – Dias, E. S.; Abe, C.; Schwan, R. F. Sci. Agric. (Piracicaba, Braz.) 2004, 61(5),

545.

[14] – Barros, L., Baptista, P.; Correia, D. M.; Morais, J. S.; Ferreira, I. C. F. R. J.

Agric. Food Chem. 2007, 55, 4781.

[15] – Elmastas, M., Isildak, O., Turkekul, I.,Temur, N. J. Food Compos. Anal. 2007,

20, 337.

[16] – Barros, L.; Calhelha, R. C.; Vaz, J. A.; Ferreira I. C. F. R.;Baptista, P.; Estevinho,

L. M. Eur. Food Res. Technol.2007, 225, 151.

[17] – Ferreira, I. C. F. R.; Baptista, P.; Vilas-Boas, M.; Barros, L. Food Chem. 2007,

100, 1511.

[18] – Hong, S. A.; Kim, K.; Nam, S.-J.; Kong, G.; Kim, M. K. Int. J. Cancer 2007, in

press.

[19] – Jong, S. C.; Birmingham, J. M. Adv. Appl. Microbiol. 1993, 39, 153.

Bibliografia

72

[20] – Novaes, M. R. G.; Novaes, L. C. G.; Melo, A. L.; Recôva, V. L.; Rev. Bras. Nutr.

Clin. 2007, 22(2), 116.

[21] – Cheung, L. M.; Cheung, P. C. K.; Ooi, V. E. C. Food Chem. 2003, 81, 249.

[22] – Mau, J. L.; Lin, H. C.; Song, S. F. Food Res. Int.l 2002, 35, 519.

[23] – Dubost, N. J.; Ou, B.; Beelman, R. B. Food Chem. 2007, 105(2), 727.

[24] – Chaudière, J.; Ferrari-Iliou, R. Food Chem.l Toxicol. 1999, 37, 949.

[25] – Silva, B. M.; Andrade, P. B.; Valentão, P.; Ferreres, F.; Seabra, R. M.; Ferreira,

M. A. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4705.

[26] – Ribeiro, B.; Rangel, J.; Valentão, P.; Baptista, P.; Seabra, R. M.; Andrade, P. B.

J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 8530.

[27] – Valentão, P.; Andrade, P. B.; Rangel, J.; Ribeiro, B.; Silva, B. M.; Baptista, P.;

Seabra, R. M. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 4925.

[28] – Barros, L.; Ferreira, M. J.; Queirós, B.; Ferreira, I. C. F. R.; Baptista, P. Food

Chem. 2007, 103, 413.

[29] – Barros, L.; Baptista, P.; Ferreira, I. C. F. R. Food Chem. Toxicol. 2007, 45, 1731.

[30] – Chevion, S.; Roberts, M.A.; Chevion, M. Free Radical Bio. Med. 2000, 28, 860.

[31] – Ramarathanam, N.; Osawa, T.; Ochi, H.; Kawakishi, S. Trends Food Sci Tech.

1995, 6, 75.

[32] – Belitz, H. D.; Grosch, W. Food Chemistry, Springer Verlag, Berlin, 1987.

[33] – Chevion, S.; Berry, E. M.; Kitrossky, N.; Kohen, R. Free Radical Bio. Med.1997, 22, 411. [34] – Hotta, H; Ueda, M.; Nagano, S.; Tsvjino, Y.; Koyama, J. Anal. Biochem. 2002,

303, 66.

[35] – Korotkova, E. I.; Karbainov, Y. A.; Shevchuk, A. V. Journal Electroanal. Chem.

2002, 518, 56.

[36] – Rice-Evans, C.; Miller, N. J.; Paganga, G. Free Radical Bio. Med. 1996, 20(7),

933.

[37] – Romani, A,; Minunni, M.; Mulinacci, N.; Pinelli, P.; Vincieri, F., F. J. Agric.

Food Chem. 2000, 48, 1197.

[38] – Snapos, G.; Wrolstad, R. J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 1478.

[39] – Mannino, S.; Brenna, O.; Buratti, S.; Cosio, M. S. Electroanal. 1998, 908.

[40] – Ames, B.M. Science 1983, 221, 1256.

[41] – Branen, A. L. J. Am. Oil Chemists Soc. 1975, 52, 59.

[42] – Briante, R.; Febbraio, F.; Nucci, R. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6975.

Bibliografia

73

[43] – Jovanovic, S. V.; Steenken, S.; Hara, Y.; Simic, M. J. Chem. Soc., Perkin Trans.

2 1996, 2497.

[44] – Brett, A. M. O.; Ghica, M. E. Electroanal. 2003, 15(22), 1745.

[45] – Blasco, A. J.; Rogelio, M. C.; González, M. C.; Escarpa, A. Anal. Chim. Acta

2005, 539, 237.

[46] – Campos, L.S.; Mourato, M. Nomenclatura dos Compostos Orgânicos, Escolar

Editora, Lisboa, 1999.

[47] – Bobbio, F. O.; Bobbio, P. A. Introdução à Química de Alimentos, Livraria

Varela, 2ª edição, S. Paulo, 1989.

[48] – Ghica, M.-E.; Brett, A. M. O. Electroanal. 2005, 17(4), 313.

[49] – Sousa, W. R.; da Rocha, C.; Cardoso, C. L.; Silva, S. D. H.; Zanoni, B. M. N. J.

Food Comp. Anal. 2004, 17, 619.

[50] – Trabelsi, S.K.; Tahar N.B.; Abdlhedi, R. Electrochim. Acta 2004, 49, 1647.

[51] – Ferreira, M.; Varela, H.; Torrresi, R.M.; Tremiliosi-Filho, G. Electrochim Acta

2006, 52, 434.

[52] – Simić, A.; Manojlović, D.; Šegan, D.; Todorović, M. Molecules 2007, 12, 2327.

[53] – Jovanovic, S. V.; Steenken, S.; Tosic, M.; Marjanovic, B.; Simic, M. J. Am.

Chem. Soc. 1994, 116, 4846.

[54] – Carrasco-Pancorbo, A.; Cerretani, L.; Bendini, A.; Segura-Carretero, A.; Del

Carlo, M.; Gallina-Toshi, T.; Lercker, G.; Compagnone, D.; Fernández-Gutiérrez, A. J.

Agric. Food Chem. 2005, 53, 8918.

[55] – Blasco, A. J.; González, M. C.; Escarpa, A. Anal. Chim. Acta 2004, 511, 71.

[56] – Gunckel, S.; Santander, G. C.; Ferreira, J.; Munoz, S.; Nunez-Vergara, L. J.;

Squella, J. A. Chem-Biol. Interac. 1998, 114, 45.

[57] –Jasprica, I.; Bojic, M.; Mornar, A.; Basic, E.; Bucan, K.; Medic-Saric, M.

Molecules 2007, 12, 1006.

[58] – Hatano, T.; Kagawa, H.; Yasuhara, T.; Okuda, T. Chem. Pharm. Bull. 1988, 36,

2090.

[59] – Yang, B.; Kotani, A.; Arai, K.; Kusu, F. Anal. Sci. 2001, 17, 599.

[60] – Firuzi, O.; Lacanna, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Saso, L. Biochim. et Biophys

Acta 2005, 1721, 174.

[61] – Matkowski, A. ; Piotrowska, M. Fitoterapia 2006, 77, 346.

[62] – Bocchi, V.; Careri, M.; Groppi, F.; Mangia, A.; Manini, P.; Mori, G. J.

Chromatogr. A 1996, 753(2), 157.

Bibliografia

74

[63] – Escarpa, A.; Gonzalez, M. C. Anal. Chim. Acta 2001, 427(1), 119-127.

[64] – Inoue, K.; Murayama, S.; Seshimo, F.; Takeba, K.; Yoshimura, Y.; Nakazama,

H. J. Sci. Food Agric. 2005, 85, 872.

[65] – Gómez-Caravaca, A. M.; Gómez-Romero, M.; Arráez-Román, D.; Segura-

Carretero, A.; Fernández-Gutiérrez, A. J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 2006, 46, 1220.

[66] – Bendini, A.; Cerretani, L. ; Carrasco-Pancorbo, A.; Gómez-Caravaca, A. M.;

Segura-Carretero, A.; Fernández-Gutiérrez, A.; Lercker, G. Molecules 2007, 12, 1679.

[67] – Klimartin, P. A.; Hsu, C. F. Food Chem. 2003, 82, 501.

[68] – Kilmartin, P.A.; Zou, H.; Waterhouse, A.L. J. Agri. Food Chem. 2001, 49, 1957.

[69] – Galeano Diaz, T.; Merás, I. D.; Cabanillas, A. G.; Franco, M. F. A. Anal. Chim.

Acta 2004, 511, 231.

[70] – Liu, D.; Gao, Y.; Kispert, L. D. J. Electroanal. Chem.2000, 488, 140. [71] – Raymundo, M. S.; Paula, M. M. S.; Franco, C.; Fett, R. LWT 2007, 1133.

[72] – Cosio, M. S.; Buratti, S.; Mannino, S.; Benedetti, S. Food Chem. 2006, 97, 725.

[73] - Barros, L; Falcão, S.; Baptista P.; Freire, C.; Vilas-Boas, M.; Ferreira, I. C. F. R.

Food Chem., in press.

[74] – Wang, J. Analytical Electrochemistry, Wiley-VHC, second edition, Weinheim,

2000.

[75] – Brett, A. M.; Brett, C.M. Electroquímica- Princípios, Métodos, e Aplicações,

Livraria Almedina, Coimbra, 1996.

[76] – Kellner, R.; Mermet, J., -M.; Otto, M.; Widmer, H. M. (edited by); Analytical

Chemistry, Wiley-VHC, Weinheim, 1998.

[77] – Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods - Fundamentals and

Applications, John Wiley & Sons, inc., second edition, New York, 2001.

[78] – Marchand, A. Champignons du Nord et du Midi , Soc. Mycol. Pyrénées

Mediterranéenes, Tome 1–9, Persignan, 1971-1986.

[79] – Moser, M. Keys to Agarics and Boleti (Polyporales, Boletales, Agaricales,

Russulales), Roger Phillips, London, 1983.

[80] – Bon, M. Guia de campo de los Hongos de Europa, Ediciones Omega, Barcelona,

1988.

[81] – Courtecuisse, R.; Duhem, B. Mushrooms and Toadstools of Britain and Europe,

HarperCollins, London, 1995.

[82] – Courtecuisse, R. Mushrooms of Britain and Europe, Harper-Collins, London,

1999.

Bibliografia

75

[83] – Singleton, V.L.; Rossi, J.A.; Am J Enol Vitic. 1965 16, 144.

[84] – Born, M.; Carrupt, P. A.; Zini, R.; Bree, F.; Tillemant, J. P.; Hostettmann, K.;

Testa, B. Helv. Chim. Acta, 1996, 79, 1147.

[85] – Hendrickson, P. H.; Kaufman, D. A.; Lunte, E. C. J. Pharm. Biomed. Anal. 1994,

12, 325.

avaliação da actividade electroquímica em cogumelos ... · cogumelos, pela sua boa disposição...

Documents