Controle de Qualidade

de Injetáveis

Febre

• Estudos há + 2000 anos função terapêutica

• Séculos depois experimentos com material pútrido

IV em animais

Vacinas com S. typhosa

• Fim séc. XIX: Centanni estudos sobre pirogenia

• Início séc. XIX: Pelletier e Caventue quinina (início estudos pirexia e antipiréticos)

• 1884: GRAM

Febre

• 1912: Hort e Penfold esterilização térmica ou

filtração não eliminava a “febre das injeções”

• 1923: Seibert febre por IV advinha de substâncias

filtráveis, termoestáveis e produzidos por GRAM (-)

• 1952: Westphal e cols produção LPS purificados

febre em coelhos (1ng/Kg)

• 1942: USP XII 1º teste em coelhos

• Década de 70: reações biológicas e porção lipídica

Pirogênios

• Pirogênio exógeno (PEx): endotoxinas e outros de origem

microbiana ou não.

• Pirogênio endógeno (Pen):

produzido em resposta ao Pex

Mediador primário da febre (~15.000 daltons)

Produção de PGs

Endotoxina X LPS

LPS

LPS de Bactérias GRAM (-)

Estrutura da superfície cellular de uma bactéria GRAM (-)

Arquitetura geral de um lipolissacarídeo

LPS de Bactérias GRAM (-)

Arquitetura geral de um lipolissacarídeo

Estrutura geral do LPS de Salmonella :

Glc = glicose; Gal = galactose; Etn = etanolamina; GlcNac = N-acetil- glicosamina;

Hep = heptose; P = fosfsto; R1 and R2 = fosfoetanolamina ou aminoarabinose.

Ação biológica

Antigenicidade Dispersão

Endotoxinas • Ação biológica (Lipídio A):

Toxicidade letal

Leucopenia leucocitose

Necrose da medula óssea

↓ PA

Agregação plaquetária

Indução de resistência não específica à infecção

Atividade de macrófagos

Indução à produção de interferon

Indução à produção de fator necrótico

Hipotermia em camundongos

Gelificação do amebócito de Limulus

Etc. etc.

Endotoxinas • Mecanismo de indução:

Fagocitose lipídio A produção de PEn Travessia da BH-E

Ação hipotalâmica

Lipídio A tb. age no cérebro

Ratos e camundongos X Humanos e coelhos

Não hipertermia Lipídio A ou PEn não atravessam BH-E

Hipotermia ação vascular periférica

Outros Pirogênios

• Exotoxinas

• Enterotoxinas

• Outros mo.

• Substâncias em geral

DESPIROGENIZAÇÃO:

Por Inativação

1) Hidrólise ácido-base (HCl 0,05 N – 30 minutos – 100

ºC HAc 1% - 2 a 3 horas – 100 ºC)

3) Alquilação

2) Oxidação

4) Calor seco

6) Polimixina B

5) Radiação ionizante

DESPIROGENIZAÇÃO:

Por Remoção

1) Lavagem

3) Ultrafiltração

2) Destilação

4) Osmose Reversa

6) Atração (eletrostática / por membrana hidrofóbica)

5) Carvão ativado

Pirogênios • Coelhos: qualitativa e quantitativamente

semelhante ao ser humano.

• ~1,5 Kg (injeção de 10mL/Kg para gdes volumes

tempo excessivo)

• Fator de segurança

• Raças pequenas

• Triagem

• Reutilização dos animais

• Descanso

• Atenção para doses sub-pirogênicas

Teste de Pirogênios

• Requisitos animal:

Mesmo sexo

Adultos

Sadios

Mesma raça (preferencialmente)

Peso mínimo: 1,5 Kg

• Gaiolas individuais

• Temperatura 20 a 23°C (variação máxima de 3°C)

Teste de Pirogênios

• Condicionamento:

Ao menos 1 vez

Até 7 dias antes teste

Se temperatura ↑ ≥ 0,5°C X

• Teste:

Animais com T ≤ 39,8°C

Variação interindividual ≤ 1,0°C

Teste de Pirogênios

• Registro T:

Precisão ±0,1°C

Inserção retal (~6 cm)

• Procedimento prévio:

Suspensão alimentação 2 h antes

Ambiente: „No stress‟

(„Don‟t worry‟…. Pode piorar)

Registro T máx 40 min. antes (2 leituras a cada 30

min.) média é a T controle

Teste de Pirogênios

• Injeção:

Produto a 37,0 ± 2,0°C

Em 3 coelhos

Veia marginal

0,5mL ≤ Volume injetado ≥ 10 mL / Kg (ou de

acordo com monografia)

Não mais que 10 minutos (salvo indicação contrária

na monografia)

Registro a cada 30 min. por 3 horas.

Teste de Pirogênios

• Interpretação:

Decréscimos desconsiderados

↑ T = > T durante teste – T controle

1º estágio: Nenhum com ↑ T ≥ 0,5° APROVADO

2º estágio:

+ 5 coelhos

Até 3 com ↑ T ≥ 0,5°C e Σ(dos 8) ≤ 3,3°C

APROVADO

Teste de Pirogênios

LAL Limulus polyphemus

LAL Tachypleus tridentatus

LAL Limulus polyphemus

LAL Limulus polyphemus

Salvem os „ferradurinhas‟!!!!! The Lorch Foundation

Detection of Pyrogens

HORSESHOE CRABS FUTURE SECURED BY NEW INVENTION

NEW DETECTOR FOR PYROGENS IN ULTRA PURE WATER AND WATER FOR INJECTION SAVES USING BLOOD FROM

ENDANGERED HORSESHOE CRABS.

• Optical biosensor utilising Surface Plasmon Resonance technology.

• Detection of pyrogens (endotoxin) to below the FDA and Pharmacopoeia limits (0.25 EU/ml).

• European and United States Patents applied for (Priority date 29 July 1998).

• Potential to develop a continuous, real-time on line monitor.

• Eliminates the use of blood extracts from the rare and endangered horseshoe crab species, Limulus.

• Use in pharmaceutical and micro-electronic manufacturing as well as research and analytical laboratories.

• Obviates the need for batch testing.

• "The ideal solution to the problem of ensuring that water is apyrogenic would be an on-line monitor installed at the point of collection. The

discovery of such an instrument has been the holy grail of pharmaceutical and ultra pure water industries for several decades ."

Leonard Saunders, D.Sc., F.R.S.C., Emeritus Professor of Pharmaceutical Chemistry, University of London The Lorch Foundation in collaboration with Cranfield University's Institute of BioScience and Technology has developed a sensor for the detection of pyrogens in ultra

pure water. This sensor will supersede the existing LAL test, an assay utilising blood extract from the Limulus Horseshoe Crab. The new sensor can detect endotoxin down to the level of 0.01 EU/ml (Endotoxin units per millilitre), which is below the FDA requirements and those of the

United States and European Pharmacopoeias for Water for Injection.

• The existing LAL test has severe limitations in that it requires discreet batch sampling, must be carried out by trained technicians in a laboratory

environment and cannot provide instant results. In order to obtain the material, the rare and endangered horseshoe crabs are fished from the ocean and either bled and returned or crushed and their future is limited.

• The Lorch Foundation is now seeking an exclusive commercial licensee for the final development and marketing of this patented technology.

The new instrument will be developed to provide on-line continuous results utilising optical technology without the need for laboratory batch

testing. The product will be used in pharmaceutical and micro-electronic manufacturing as well as in research and testing laboratories.

• A paper: DETECTION OF PYROGENS IN ULTRA-PURE WATER BY A SURFACE PLASMON RESONANCE BIOSENSOR (Judith A Taylor, Gary Barrett, Walter Lorch, David C Cullen) was published in the peer reviewed journal Analytical Letters, volume 35 Issue 2, 22

February 2002. This can be accessed from: - http://www.dekker.com/servlet/product/DOI/101081AL120002525#abstract

Vantagens EB X Pirog.

• Rapidez - 60 min. X 180 min.

• Maior sensibilidade

• Menos variabilidade

• Menos falsos positivos

• Mais econômico

Teste LAL Preparação para o teste

• Padrão Endotoxina: 10000 UE (UI) / frasco

• Sol. Mãe: reconstituição com H2O grau LAL (5 mL)

– Agitação por 30 min.

– Conservação por no máx.14 dias (refrigeração)

• Validação por Testes de inibição e potencialização

• Controles negativos

• Sol. Amostra: diluições seriadas da sol. mãe após

agitação

– Ajuste de pH (6,0 a 8,0) com tampões.

Teste LAL Coagulação em tubo

Lisado do Amebócito de Limulus

Teste de formação de gel

Sequência reacional

1. Proenzima Enzima Ativa

Endotoxina

2. Proteína de coagulação Coágulo

Enzima Ativa

Teste LAL Métodos Fotométricos

LAL

Substrato Cromogênico

Seqüência Reacional

1. Proenzima Enzima Ativa

Endotoxina

2. Substrato cromogênico COR

Enzima

Ativa

Teste LAL

Método Cromogênico

Seqüência Reacional

1. Proenzima Enzima Ativa

Endotoxina

2. Proteína de coagulação TURBIDEZ

Enzima

Ativa

Teste LAL

Método turbidimétrico

Testes cinéticos

Testes Cinéticos

Slope = -0.204

Y-Int = 3.058

R = -0.998