Lucas Brandão

Biologia MolecularTécnicas Moleculares

CONCEITOS BÁSICOS

Núcleo - Célula Humana

DENTRO DO DNA SE ENCONTRAM OS GENE

Definição de Genes

n=23, X ou Y

A A

MãePai

Locus Gênico

a

Homozigoto SelvagemHeterozigotoHomozigoto Mutante

a

Estrutura Gênica

Promotor Exons

5’UTR3’UTR

1 23

Introns

A a

A T T G C A G T G C

Alelo AAlelo a

Porque é diferente ?

MUTAÇÃO

! É O PROCESSO PELO QUAL OS GENES MUDAM DE UMA FORMA

ALÉLICA PARA OUTRA. É UMA MUDANÇA PERMANENTE NUMA

SEQUÊNCIA DE BASES NO DNA.

É a origem da diversidade genética dos indivíduos

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

Histórico do DNA

Estrutura do DNA

A Dupla Hélice James Watson & Francis Crick (1953)

Estrutura das Bases nitrogenadas

Purínicas

Pirimidina

Estrutura das Bases nitrogenadas

Estrutura dos nucleotídeos mono-, di- e trifosfatados. Os desoxirribonucleotídeos correspondentes são abreviados dNMP, dNDP e dNTP. N = A, G, C, U ou T.

Estrutura dos Nucleotídeos

ou dA ou A ou dT ou T

ou dG ou G , ou dC ou C

Estrutura dos desoxirribonucleotídeos 5´-monofosfatados (dNMP)

Tipos de Nucleotídeos

Ligações fofosdiester

5´-terminal

3´-terminal

Polinucleotídeos

As fitas do DNA estão dispostas em direções

opostas

Estrutura Secundária

Antiparalelismo

Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita

Complementariedade

As duas fitas do DNA se torcem para formar uma dupla hélice (estrutura secundária do DNA)

A Dupla Hélice

Fatores que estabilizam a dupla hélice:

• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio

• interações iônicas

Entre as bases nitrogenadas

Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+)

presentes na solução fisiológica

A Dupla Hélice

Sulco menor

Sulco maior

A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas da

cromatina

A Dupla Hélice

A Dupla Hélice

Texto de Marcador de Posição Definido pelo Usuário

Origem do Material GenômicoExtração de DNA

DNA

Núcleo

Célula Humana Nucleada

Célula Humana Nucleada

Existem inúmeros materiais biológicos humanos que

apresentam células nucleadas

- Tecido- Excreção

Saliva, sangue, urina, escarro Lavagem broncoalveolar Fluido cerebroespinhal, Fluido pleural Secreção vaginal, esperma Cortes de tecidos (biópsias frescas ou

em blocos de parafina). Bulbo capilar, células aderida na unha

EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE PERIFÉRICO TOTAL

•

•

•

•

••

•

•••••••

1

Reação em Cadeia da Polimerase

Histórico MetodologiaComponentesAdaptações Utilizações Riscos

Professor: Lucas Brandãowww.lucasbrandao.org

4

! Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cópia de apenas segmentos específicos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na utilização de uma DNA polimerase termoestável.

Fig. 1: Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 (Nobel Academy)

MullisTaq DNA polimerase

Thermus aquaticus

P e r m i t e a mudança na temperatura

Primer

Especificidade da reação

Histórico

Mimetizar a replicação do DNA em regiões específicas do genoma

5

Estrutura do DNABases purínicas A e GBases pirimidínicas T e C

FosfatoAçucar desoxirriboseBases Nitrogenadas

Polaridade

Fendas

Conformações

6

Replicação do DNA

Um conjunto de enzimas irá atuar no DNA para permitir sua replicação. Resumidamente, o DNA deve ser “aberto”, para que sejam inseridos in ic iadores , e a enz ima DNA po l ime rase cons t rua uma f i t a complementar no sentido 5’ para 3’.

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’

Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos

FITA “LEADING” – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação

FITA “LAGGING” – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação

7

PCR

DNA

Aquecer

Inserir os Primers

Sintetizar um fita de DNA

Desnaturação

Anelamento

Extensão

Etapas

8

Primers

São pequenas seqüências oligonucleotídeos

DNA molde

Primer

Especificidade da Reação

9

T A A C G A C T T T C G CGCG

Genoma 5 mil genes

Gene A

A T T G C T G A A A G A ACGC

GCG 3’ OH

G C G3’ OH

3’

5’

3’5’

3’ 5’

5’ 3’

10

Taq polimerase

pH

Cofatores

Temperatura

IdeaisAtividade

A enzima "lê" a fita molde e faz a fita complementar incorporando deoxirribonucleotídeos tri-fosfatados

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dNTPs

Fosfato

Açucar

12

Componentes

Polymerase Chain Reaction

TaqGene A

3’

5’G C G3’ OH

GCG 3’ OH

dATP

dGTP

dTTPdCTP Tampão

MgCl2

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1. DNA molde;

2. Solução Tampão da Taq polimerase:

*Íons (Na, Cl e K, entre outros);

*Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas;

*Proteínas estabilizantes (BSA) e

*Algumas substâncias que agem na desnaturação da cadeia molde de DNA (DDT e ! -mercaptoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.

Reagentes Necessários para a Reação

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4. Primers Forward e Reverse

5. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP).

3. MgCl2, doador muito estável de íons Mg2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima..

6. Temperatura

15

Desnaturação

Anelamento

Extensão

Tempo

Etapas Ciclos

16

Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automático

17 Polymerase Chain Reaction

18

A quantidade de DNA final segue uma função exponencial,

onde: N = N0 . 2n

N = Número final de cadeias de DNAN0 = Número inicial de DNA molde (template)

n = Número de repetições do ciclo

Portanto, a concentração final do DNA molde na solução é muito maior (da ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificação.

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20

Utilidades

É amplamente usada numa variedade de aplicações na biologia molecular:

Mapeamento gênico, clonagem sequencimento de DNA expressão gênica Paternidade diagnóstico de doenças genéticas detecção e identificação de vírus, como HIV e HCV

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PORQUE OTIMIZAR A PCR?

• Otimiza-se a reação da PCR para:

• Aumentar o rendimento da reação (eficiência)

• Aumentar a especificidade

• Aumentar a reprodutibilidade (poço-poço, corrida-corrida)

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23

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29

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TIPOS DE REAÇÕES MAIS RECENTES:

1. RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): !

! Esta reação é composta de 2 partes: a transcrição reversa e a amplificação. Seu principal diferencial é que na verdade esta reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra; a amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar). Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o mRNA, podemos detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas.

31

! Além disso, também são utilizados primers, mais inespecíficos e nunca em pares. São oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são anelados às regiões Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo, obtém-se o cDNA que será utilizado na PCR. É importante ressaltar que o round de transcrição reversa não altera o número de fitas de RNA ou DNA.

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2. Multiplex PCR: !! Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados.

33

34

3. Nested PCR: ! Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.

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36

Fig. 5: Esquema de uma reação de Nested PCR. O produto da amplificação do 1º Round é utilizado com template no 2º round. No final das duas etapas, obtém-se um produto menor que o da primeira amplificação. Este tipo de reação tem como vantagem o ganho em especificidade e eficiência, uma vez que o DNA-molde do 2º round está em concentrações altíssimas, e os primers da segunda etapa têm menos chances de anelamento em seqüências inespecíficas, dada a redução do tamanho do molde.

DNA POLIMÓRFICO AMPLIFICADO AO ACASO

RAPD

37

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PCR

PRIMER Conhecimento da Seqüência do DNA

Produção de um fragmento específico

Construção

Dois Primers

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Genoma 5 mil genes

Gene A

3’

5’

1 pedaço genes

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Estringência x Especificidade

Temperatura Especificidade

Gene A

3’

5’

45oC

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T A A C G A C T T T T G CGCG

A T T G C T G A A A G A ATGC

ACG 3’ OH

A C G3’ OH

3’ 5’

5’ 3’

RAPD

A C G3’ OH Apenas um primerPequeno = 10-15pb

Randômico

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Foi descrita simultaneamente por Williams et al. (1990) e Welsh & McCleland. (1990).

amplificação de seqüências de DNA randômicas

utilizando iniciadores pequenos de seqüências arbitrárias

43

• Mapas genéticos,

• Diferenciação de espécies animais e vegetais e para

• Impressões de DNA, com especial utilidade nos estudos de genética de populações.

Utilidades :

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1º Indivíduo 2º Indivíduo

Surto Infecção Hospitalar

Kluyvera sp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Kb

6.3

3.2

1.5

4,5,6,7, Kluyvera sp

53

5. AFLP (polimorfismo de tamanho de fragmento

amplificado)

!! .

RFLP

54

Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

1

ANÁLISE DOS PRODUTOS DA PCR

IdéiaEquipamentos

Eletroforese Horizontal

Lucas Brandão

2

Produto da PCR

Gene A3’

5’

3

Baseada

Molécula de DNA

Carga

Agrupamentos fosfatos

Tamanho e peso

Negativa

4

Idéia

+-Diferença de potencial

DNA

Malha

Eletroforese

Geis

5

Gel

Agarose Poliacrilamida

6

Malha

Agarose“Derivado” do agár-agár

Rhodophytas

Subunidades de galactose

Insolúvel em agua fria

! ou "concentração

7

Concentração do Gel

Tamanho do Amplicon

0,6 % 2,5%1%

FinalidadePequenos

MédiosGrandes

8

Logística

9

Preparação do Gel:

Após o preparo os géis serão colados na cuba de eletroforese contendo o tampão de corrida TAE (Tris Acetato EDTA) ou TBE (Tris Borato EDTA) os quais também são os diluentes da agarose.

Em seguida, as amostras são adicionadas ao gel e correrão entre 70-100V durante 60 min.

10

Poços 10 a 150#L

Aplicar o produto da PCR

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Preparo da Amostra

Amostra Água Tampão de amostra+ +

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Eletroforese

13

Eletroforese

50 a 100mV

DNA Corante

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Coloração com BrometoDuas estratégias

Pré-corrida Pós-corrida

C21H2OBrN3 BROMETO DE ETÍDIO

G C A TTTA

C G T AAAT

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Visualização

Aparelho que emite raios UV.

As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes

16

Ladder

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18

Gel de poliacrilamida montado em cuba de eletroforese

e sendo submetido à uma voltagem de 69V.

19

A identificação dos produtos pode ser feita pela coloração com EtBr, porém o método mais utilizado é a impregnação do DNA contido no gel por nitrato de prata. Logo após a corrida, o gel é fixado com uma solução de etanol e ácido acético, para impedir a eluição (formar borrões no gel) das amostras.

A coloração por prata é de bem mais fácil visualização do que a oferecida pelo EtBr, além de ser mais segura, levando-se em conta o fato de que este é altamente carcinogênico.

COLORAÇÃO COM PRATA

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Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido à alta sensibilidade do método de coloração, observa-se bandas inespecíficas e DNA não amplificado no pé da foto. A seta indica a corrida do Ladder.

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InterpretaçãoCaso : Diagnóstico viral

1 2 3

____________ _____________ _____________

22

Interpretação